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Anordnung zum Zählen der in einem strömungsfähigen und lichtdurchlässigen
Medium mitgeführten, die Helligkeit eines auf sie gerichteten Lichtstrahles beeinflussenden
Teilchen Die Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zum Zählen der in einem strömungsfähigen
und lichtdurchlässigen Medium mitgeführten, die Helligkeit eines auf sie gerichteten
Lichtstrahles beeinflussenden Teilchen mit einer vom Medium durchflossenen Verengung,
einer die Verengung beleuchtenden Lichtquelle und einer das Licht nach Durchtritt
durch das Medium aufnehmenden Photozelle.
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Derartige Anordnungen werden verwendet, um die Teilchen einer Suspension
oder eines Aerosols nach Anzahl und Größe zu untersuchen, insbesondere um Erythrozyten
und Leukozyten zu zählen und ihre Größenverteilung zu ermitteln. Die bei der Untersuchung
der Blutzusammensetzung für Diagnosezwecke vorgenommene Zählung der in 1 mm3 des
Blutes enthaltenen Erythrozyten und Leukozyten erfolgt bislang in der Weise, daß
eine abgemessene Menge des Blutes in eine spezielle Zählkammer eingefüllt und unter
einem Mikroskop die Anzahl der Blutkörperchen unmittelbar ausgezählt wird. Dieses
Verfahren ist zeitraubend, mühsam und nicht sehr zuverlässig. Die Ermittlung der
Größenverteilung der Blutkörperchen (Price-Jones-Kurve) ist im Laborbetrieb mit
der Zählkammer praktisch nicht möglich, obwohl es erwünscht ist, diese jeweils für
gewisse Zustände charakteristische Kurve zu ermitteln.
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Es sind daher bereits verschiedene Anordnungen entwickelt worden,
mit welchen die von einem strömungsfähigen, lichtdurchlässigen Medium mitgeführten
Teilchen selbsttätig gezählt werden können und die hauptsächlich zur Blutuntersuchung
eingesetzt werden. Bei einer bekannten Anordnung fließt ein feiner Blutstrahl durch
klares Wasser und wird auf einer kurzen Strecke senkrecht zur Fließrichtung sehr
stark beleuchtet. Die jedesmal beim Durchgang eines Blutkörperchens durch die beleuchtete
Stelle entstehenden Lichtblitze werden photoelektrisch gezählt. In der praktischen
Ausführungsform dieser Anordnung sind eine Beleuchtung mit einem Dunkelfeldkondensator
sowie ein Mikroskop vorgesehen, das zwischen dem Blutstrahl und dem elektronischen
Lichtverstärker angeordnet ist, der unmittelbar hinter einem Spalt liegt. Ein solches
Gerät ist verhältnismäßig teuer und erfordert umfangreiche, regelmäßige Wartungsarbeiten,
so daß sich der Einsatz eines solchen Gerätes nur für große Laboratorien lohnt.
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Eine weitere bekannte Anordnung sieht vor, daß das stark verdünnte
Blut durch eine Glaskapillare fließt, die senkrecht zur Strömungsrichtung kräftig
beleuchtet und stark vergrößert auf einen in einer undurchsichtigen Platte vorgesehenen
Spalt abgebildet wird, hinter dem sich eine Photozelle befindet. Läuft ein Blutkörperchen
durch die Kapillare, so wird es auf den Spalt vergrößert abgebildet und schwächt
die Beleuchtung der Photozelle. Eine praktische Verwendung einer derartigen Anordnung
im größeren Umfange ist bisher nicht bekanntgeworden. Ferner ist es bekannt, Erythrozyten
und Leukozyten mit verschiedenen Farbstoffen selektiv anzufärben, um das von ihnen
durchgelassene Licht mit Hilfe von verschiedenfarbigen Lichtfiltern und halbdurchlässigen
Spiegeln auf zwei für Licht verschiedener Farbe empfindliche Photozellen und daran
angeschlossene Zähleinrichtungen einwirken zu lassen. Zur Ausnutzung dieses Verfahrens
ist vorgesehen, eine verdünnte Blutlösung dieser Art durch eine Verengung fließen
zu lassen, die senkrecht zur Strömungsrichtung beleuchtet und vergrößert auf einen
Spalt mit dahinter befindlicher Photozelle abgebildet wird.
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Der Verwendung der zuletzt besprochenen Anordnungen stehen erhebliche
Nachteile entgegen. Blutkörperchen weisen einen anderen Brechungsindex als die sie
umgebende Flüssigkeit auf, so daß die Blutkörperchen wie Kugellinsen wirken und
in dieser Eigenschaft das Licht zerstreuen. Werden natürlich gefärbte rote Blutkörperchen
im Mikroskop beobachtet, so sind sie bei großer Apertur fast nicht zu erkennen,
jedenfalls nicht an ihrer Färbung. Bei
kleinerer Apertur erscheint,
je nachdem, ob die Einstellebene, vom Mikroskop aus gerechnet, vor oder hinter dem
beobachteten Blutkörperchen liegt, ein dunkles Scheibchen mit einem hellen Fleck
in der Mitte oder ein helles Scheibchen.
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Da die Verengung oder Kapillare, durch die die Blutlösung hindurchfließt,
einen Mindestdurchmesser haben muß, damit der Strömungswiderstand für die Flüssigkeit
nicht zu groß wird, durchlaufen die Blutkörperchen die Kapillare zum Teil vor und
zum Teil hinter der Einstellebene des Mikroskops, wenn diese mit der Achse der Kapillare
zusammenfällt. Gleich große Blutkörperchen werden daher verschieden hell abgebildet
und liefern verschieden starke Lichtschwächungsimpulse. Dieser Umstand macht eine
Bestimmung der Größenverteilung auf Grund verschieden großer Lichtimpulse unmöglich
und beeinträchtigt außerdem die einfache Zählung. Dieser Nachteil wird auch dadurch
nicht beseitigt, daß die Teilchen gegebenenfalls angefärbt werden, da bisher kein
Verfahren bekannt ist, um in einer Lösung befindliche Blutkörperchen bis zur praktischen
Lichtundurchlässigkeit dauerhaft künstlich anzufärben.
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Bei einer weiteren bekannten Anordnung fließt stark verdünntes Blut
durch eine zwischen zwei Gefäßen angeordnete kurze Kapillare von etwa 0,07 mm Durchmesser,
wobei mittels zweier in die beiden Gefäße tauchender Elektroden der elektrische
Widerstand der durchströmten Kapillare gemessen wird. Die Erhöhung des elektrischen
Widerstandes, die jedesmal dann auftritt, wenn ein Blutkörperchen die Kapillare
durchläuft, wird gezählt. Ein in dieser Weise aufgebautes Gerät ist verhältnismäßig
teuer, so daß sich der Einsatz nur für große Laboratorien lohnt.
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Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zu schaffen,
mit welcher eine unmittelbare Zählung von Teilchen möglich ist, die von einem strömungsfähigen,
lichtdurchlässigen Medium mitgeführt werden, wobei die Nachteile vermieden werden
sollen, die sich bei den zuerst besprochenen bekannten Anordnungen dadurch ergeben,
daß im Falle von Blut z. B. die Blutkörperchen wie Kugellinsen wirken.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird eine Anordnung der eingangs erwähnten
Art erfindungsgemäß derart ausgestaltet, daß der Strahl der Lichtquelle im wesentlichen
senkrecht auf die Fläche des Durchtrittquerschnitts der Verengung gerichtet ist.
Die erfindungsgemäße Anordnung arbeitet demnach mit einer Schwächung von Licht.
Eine mikroskopische Abbildung, die bei den bekannten Anordnungen zu Schwierigkeiten
führt, ist nach der Erfindung grundsätzlich nicht erforderlich. Bau und Handhabung
der erfindungsgemäßen Anordnung werden dadurch wesentlich vereinfacht. Die Erfindung
liefert, da der Fehler der bekannten Anordnungen ausgeschaltet ist, sehr zuverlässige
Meßergebnisse und gestattet außerdem die Ermittlung der Verteilungskurve.
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Vorzugsweise wird bei der erfindungsgemäßen Anordnung als Verengung
ein Loch in einer undurchsichtigen Folie benutzt. Für die Untersuchung von Blut
kann das Loch z. B. einen Durchmesser von etwa 0,02 mm haben. Durch dieses Loch
läßt man die zu untersuchende Suspension oder das Aerosol oder das in einem bekannten
Verhältnis mit einer Stabilisierungslösung verdünnte Blut, eine fast farblose, leicht
trübe Flüssigkeit, hindurchfließen. Das Loch wird von einer Seite senkrecht zur
Folie stark beleuchtet. Auf der anderen Seite des Loches befindet sich die Photozelle,
auf die das durch das Loch hindurchgetretene Licht auftrifft und in der dadurch
ein Photostrom ausgelöst wird. Jedesmal, wenn ein Teilchen durch das Loch tritt,
wird das auf die Photozelle fallende Licht wie auch der Photostrom für kurze Zeit
ein wenig geschwächt. Die dabei entstehenden Stromimpulse werden verstärkt und können
in bekannter Weise entweder einem Untersetzer und einem mechanischen Zählwerk oder
einer Analogzähleinrichtung zugeführt werden.
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Die Größe der Stromimpulse hängt unter sonst gleichen Bedingungen
von der Größe der Körperchen ab, ein größeres erzeugt einen größeren Impuls als
ein kleineres. In den Verstärker kann ein Diskriminator eingebaut werden, der Impulse
unter einer einstellbaren Größe von der Zählung ausschließt, so daß nur Impulsgrößen,
also Körperchen, gezählt werden, deren Größe eine eingestellte Grenzgröße übersteigt.
Dadurch kann man zu Schlüssen über die Größenverteilung kommen.
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Wenn die roten Blutkörperchen mit einer geeigneten Verdünnungslösung
aufgelöst worden sind, können die in viel geringerer Anzahl vorhandenen weißen Blutkörperchen
gezählt werden.
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In der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen sind erfindungsgemäße
Anordnungen näher erläutert und dargestellt. Es zeigt A b b. 1 eine schematische
Darstellung der erfindungsgemäßen Anordnung, A b b. 2 eine vergrößerte und vervollständigte
Darstellung eines Teiles der A b b. 1, A b b. 3 eine der A b b. 1 entsprechende
erfindungsgemäße Anordnung, die zusätzlich eine Vorrichtung zur Beobachtung der
Verengung aufweist, und A b b. 4 die Anordnung nach A b b. 1 mit einer zusätzlichen
optischen Vorrichtung zur Verwendung kleinflächiger Photozellen.
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Die einfachste Ausführungsart zum Zählen ist für Suspensionen in A
b b. 1 schematisch dargestellt. Am unteren Ende eines unten geschlossenen Röhrchens
1, des Zählröhrchens, aus einem glasklaren Stoff befindet sich seitlich eine Öffnung,
die durch eine aufgekittete Folie 2 aus undurchsichtigem Material, z. B. 0,01 mm
starkem Platinblech, verschlossen ist. Die Folie hat auf der Mittellinie der Zeichnung
ein Loch 3, das Zählloch, von etwa 0,02 mm Durchmesser. Das untere Ende des Zählröhrchens
1 taucht mit dem Loch in die zu untersuchende Suspension oder Blutverdünnung 4 ein,
die sich in der optischen Küvette S befindet. Die Lichtquelle 6 wird mit der Linse
7 auf das Loch 3 abgebildet. Das durch das Loch 3 hindurchgetretene Licht fällt
auf die Photozelle 8, hier beispielsweise eine Alkalizelle, deren Elektrodenzuleitungen
mit A und K bezeichnet sind. Wird in dem Röhrchen 1 ein Unterdruck von wenigen Torr
erzeugt, so strömt die Suspension 4 durch das Loch 3 in das Zählröhrchen 1 hinein.
Jedes Korpuskel bewirkt beim Durchlaufen durch das Loch eine kurz dauernde Lichtschwächung,
die von der Photozelle als Stromschwankung angezeigt wird.
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Läßt man einen konstanten Unterdruck in dem Zählröhrchen wirken, so
strömt die Flüssigkeit oder das Gas mit konstanter Geschwindigkeit durch das Loch,
und man wird bis auf die statistischen Schwankungen
in jeder Sekunde
gleich viele Verdunkelungen bzw. Stromstöße erhalten. Mit Hilfe bekannter elektronischer
Schaltungen kann man die Anzahl je Sekunde in die Anzeige eines Strommessers umwandeln,
der für eine bestimmte Strömungsgeschwindigkeit unmittelbar in Teilchen je Kubikmillimeter
geeicht werden kann.
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Um automatisch die Größenverteilung der Korpuskeln zu bekommen, kann
man folgendermaßen vorgehen: Man steuert den Diskriminator nach einem bestimmten
Programm, schließt statt des Strommessers eine bekannte Schaltung an, die den Differentialquotienten
des Stromverlaufs nach der Zeit bildet, und führt den differentiierten Strom einem
schreibenden Meßgerät zu. Dieses zeichnet dann unmittelbar die Größenverteilungskurve
auf.
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Bei der Anzeige durch ein Zählwerk läßt man ein abgemessenes Volumen
der Suspension oder des in einem bekannten Verhältnis verdünnten Blutes durch das
Loch fließen. Das Zählwerk gibt dann die Anzahl der in diesem Volumen enthaltenen
Teilchen an, aus der man bei Blut unter Berücksichtigung der Verdünnung die Anzahl
je Kubikmillimeter des unverdünnten Blutes berechnen kann. Bei geeigneter Wahl der
Verdünnung und des Zählvolumens kann die Anzahl auch bis auf eine Zehnerpotenz richtig
unmittelbar am Zählwerk abgelesen werden.
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Das mit Flüssigkeit gefüllte Zählröhrchen 1 wirkt wie eine Zylinderlinse
für Licht und sammelt parallel einfallendes Licht in einer Brennlinie. Läßt man
(Ab b. 1) von rechts Licht in waagerechter Richtung einfallen, so steigt
mit der Flüssigkeit eine Brennlinie langsam hoch. Diese Erscheinung wird benutzt,
um das Zählvolumen selbsttätig abzumessen. über der Lichtquelle 6 ist ein
Planspiegel 11 angebracht, der ein Lichtbündel nach dem Zählröhrchen wirft.
Für das Licht hinter dem Zählröhrchen, in A b b. 1 neben dem Zählröhrchen
1, sind zwei kleine Photozellen 9 und 10 übereinander in einem bestimmten
Abstand so angebracht, daß sie nacheinander von der Brennlinie getroffen werden,
zu der das Lichtbündel vereinigt wird. Sie sind mit dem Verstärker für das mechanische
Zählwerk in einer Art Koinzidenzschaltung derart zusammengeschaltet, daß der Verstärker
nur arbeitet, wenn nur die untere Zelle von Licht getroffen wird, aber nicht arbeitet,
wenn entweder beide Zellen im Dunkeln oder beide Zellen im Hellen liegen.
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Nach einer Zählung ist das Zählröhrchen 1 (Ab b. 1) bis oberhalb
der oberen Photozelle 10 mit Flüssigkeit gefüllt und zum Zählen unbrauchbar
geworden. Um es wieder zählbereit zu machen, muß die Flüssigkeit bis unterhalb der
unteren Photozelle 9 entleert werden. Das geschieht mit einer besonders dafür eingebauten
Vorrichtung (Ab b. 2). In dem oberen Teil des Zählröhrchens befindet sich
ein verschiebbarer, axial durchbohrter Kolben 12, der durch eine Schraubenfeder
13 bis zum Anschlagen der Madenschraube 14 an das obere Ende der Führung
15 nach oben gedrückt wird. über die Schlaucholive 16 am oberen Ende des Kolbens
wird der Schlauch gezogen, durch den im Zählröhrchen der erforderliche Unterdruck
aufrechterhalten wird. Wenn eine Zählung beendet ist, wird der Kolben
12 von Hand so weit in das Zählröhrchen hineingedrückt, bis die Madenschraube
am unteren Ende der Führung anstößt. In dieser Stellung taucht das untere Ende des
durchbohrten Kolbens bis unterhalb der Photozelle 9 in die Flüssigkeit. Zugleich
ist das Innere des Zählröhrchens über den Kanal 18 im Kolben und die Bohrung
19 in der Außenwand mit der Außenluft in Verbindung gekommen. Die nun eindringende
Luft treibt die Flüssigkeit, soweit der Kolben eintaucht, durch die Bohrung
20 im Kolben und durch den aufgezogenen Schlauch in ein Auffanggefäß, das
hier nicht gezeichnet ist. Hat man den Kolben wieder hochgleiten lassen, dann kann
von neuem gezählt werden. Dabei stört es nicht, daß das Zählröhrchen noch einen
Rest von der vorher gemessenen Probe enthält; denn gezählt wird nur, was durch das
Zählloch kommt.
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Es kann vorkommen, daß Verunreinigungen oder zu große Teilchen das
Loch mehr oder weniger stark verstopfen. Der Einbau eines Mikroskops nach A b b.
3 ermöglicht die Beobachtung des Loches während des Zählens. 21 ist ein Mikroskopobjektiv,
22 eine planparallele, unter 45° zur Strahlrichtung aufgestellte Glasplatte, die
einen kleinen, für die Beobachtung ausreichenden Teil des Lichtes senkrecht nach
oben wirft, und 23 ist ein Mikroskopokular, durch das man das Loch in Vergrößerung
sehen und Verstopfungen erkennen kann.
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Mit dem Mikroskopobjektiv wird es weiterhin ohne Justierungsschwierigkeiten
möglich, eine kleinflächige Photozelle, z. B. einen Phototransistor, zu verwenden,
wenn man mit einer weiteren Linse (Okular) das Objektiv stark verkleinert in die
Photozelle abbildet (Ab b. 4: Mikroskopobjektiv 21, Linse 24, Photozelle
25). Durch diese Optik wird erreicht, daß die Photozelle 25 auch bei geringen
Verschiebungen des Zählröhrchens und damit des Loches immer voll ausgeleuchtet bleibt.