DE3586159T2

DE3586159T2 - Zusammensetzung und verfahren zur differenzierung von weissen blutzellen.

Info

Publication number: DE3586159T2
Application number: DE8585305467T
Authority: DE
Inventors: John Francis Cremins; Joseph Louis Orlik
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1984-09-24
Filing date: 1985-07-31
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2005-08-01
Also published as: US5518928A; ES547094A0; DK429285A; CA1255197A; DK165713B; DK429285D0; EP0177137A3; AU599005B2; EP0177137B1; AU4587985A; JPH068817B2; DK165713C; EP0177137A2; ES8706263A1; JPS6188896A; DE3586159D1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Hämatologie, insbesondere die Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen.
Menschliche weiße Blutkörperchen oder Blutzellen werden in Lymphocyten, Monocyten und polymorphkernige Zellen (PMN) eingeteilt. Die PMN-Zellen werden in Neutrophile, Eosinophile oder Basophile aufgrund der Färbeeigenschaften ihrer cytoplasmatischen Granula unterteilt.
Die Differenzierung vom weißen Blutzellen ist bisher üblicherweise durch verschiedene Färbeverfahren durchgeführt worden. Mehrere Phthalocyanin-Verbindungen sind hierfür bekannt. Die erste, die man davon gefunden hat, ist Alcian Blue. Alcian Blue ist schon zum differenzierenden Anfärben von Basophilen verwendet worden. Die kationischen Kupferphthalocyanin-Farbstoffe sind nicht hinreichend spezifisch, um das selektive Anfärben von Basophilen zu erzielen, wenn sie allein verwendet werden, weil sie auch andere Zellen anfärben, die Polynucleotide, wie beispielsweise DNA und RNA, enthalten. Außerdem werden Basophile wegen des in ihnen einzigartigerweise vorkommenden Heparins, eines sulfatierten Polysaccharids, angefärbt. Ein Weg zur Herstellung der erwünschten Selektivität besteht darin, es (Anmerkung des Übersetzers: gemeint ist wohl Alcian Blue) kombiniert mit Lanthanchlorid einzusetzen, das die Polynucleotidphosphatgruppen maskiert und sie dadurch daran hindert, das Phthalocyaninanion zu binden.
Die Verwendung von Alcian Blue erfordert einen genau kontrollierten, stark sauren pH-Wert, und Alcian Blue ist hitzelabil. Bei alkalischem pH-Wert und Wärmeeinwirkung bildet Alcian Blue teilchenförmiges Material (unlösliche Farbstoffe). Diese Neigung zum Ausfallen ist schon seit langem bei Reagenzien, die Alcian Blue enthalten, ein Problem. Gerätschaften für automatisierte Analysen enthalten Bestandteile, wie Filter, die diese Ausfällungen sammeln. Dies kann die Verläßlichkeit der Bestimmungen sowie selbst den Betrieb der Gerätschaften, mit denen diese Methode durchgeführt wird, stören. Nichtsdestoweniger wurde es wegen seiner Spezifizität und seiner eindeutigen Färbung als der Farbstoff der Wahl angesehen. Näheres über Alcian Blue siehe Gilbert et al, Basophil Counting With A New Staining Method Using Alcian Blue, Blood, 46:279-286 (1975).
Es sind auch schon andere Phthalocyanin-Farbstoffe entwickelt worden, beispielsweise zeigen Bloom et al, Histochemie, 2:48-57 (1960) die Verwendung von nicht derivatisiertem Astra Blue (freie Base) zum Anfärben von biologischen Geweben, die Mucopolysaccharide, insbesondere Mastzellen enthalten. Die freie Base Astra Blue wird in 0,5 N HCl verwendet, was ihr eine positive Ladung verleiht. Der niedrige pH-Wert erlaubt Selektivität wegen der damit zusammenhängenden- Stärke der Schwefelsäurederivate, wie beispielsweise von Heparin, das bei einem pH-Wert von 0,3 ionisiert wird, im Vergleich zu der Schwäche der Phosphorsäurederivate, wie beispielsweise von DNA, die bei niedrigem pH-Wert nicht ionisiert wird.
Inagaki, Acta, Hematologica Japonica, 32(4):642- 647 (1969) beschreibt ein Verfahren zum Anfärben von Basophilen- und Mastzellengranula unter Verwendung der freien Base Astra Blue und einer Fixierlösung von Acridin Orange in Methanol mit einem Gehalt von 0,5 M NaCl. Inagaki untersuchte gesättigtes Cetylpyridiniumchlorid in absolutem Methanol und gesättigtes Acridin in absolutem Methanol für die Fixierung von Ausstrichen aus peripherem Blut und Knochenmark. Cetylpyridinium chlorid konservierte die Basophilengranula sowie die Mastzellengranula sicher, jedoch wurde die Anfärbung durch Astra Blue leicht verhindert. Acridin konnte diese Zellgranula bei dem oben beschriebenen Verfahren nicht hinreichend gut konservieren.
Insgesamt waren Alcian Blue und Astra Blue (freie Base und ihre quartären Derivate) die einzigen Verbindungen dieser Art, die für die Differenzierung von Basophilen von anderen weißen Blutzellen bekannt waren. Die Instabilität des Alcian-Blue-Reagenzes stellt ein seit langem vorhandenes Problem dar. Somit hat man auf dem Gebiet kontinuierlich nach Verbindungen gesucht, die Basophile im Gegensatz zu anderen weißen Blutzellen selektiv anfärben. Außerdem ist die Aufnahme von Farbstoff von der Färbetechnik jedes einzelnen Anwenders abhängig.
Da die Zellreifung ein kontinuierlicher Prozeß ist, sind die aufeinanderfolgenden Stufen schwer zu differenzieren. Jedoch können getrennte Stufen in Ausstrichen von Gesamtblut, die mit Wright- oder Giemsa-Färbungen angefärbt sind, erkannt werden. Diese Klassifizierung beruht auf der Gegenwart, Art und Zahl von Granula und den cytoplasmatischen und Kerneigenschaften jeder Zelle. Diese Klsssifizierungen von weißen Blutzellen sowie Techniken für ihre Differenzierung sind wohlbekannt. Siehe beispielsweise Ansley et al, US-PS 3,741,875. Jedoch ist die Klassifizierung von angefärbten, intakten Zellen auf der Grundlage von cytoplasmatischer und Kerninformation sehr von der subjektiven Charakterisierung durch den Anwender abhangig.
Aus Kim, US-PS 4,099,917 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Blutprobe für die Unterscheidung zwischen Klassen von ungefärbten weißen Blutzellen aufgrund der Zellgröße und der Granula-Eigenschaften bekannt. Eine Blutprobe wird mit einem Detergens behandelt, das rote Blutzellen, jedoch nicht weiße Blutzellen lysiert, ein Fixierungsmittel wird zugesetzt, und die Präparation wird bebrütet. Die auf diese Weise erhaltene Zellsuspension soll die Differenzierung von ungefärbten,fixierten, intakten weißen Zellen durch optische Systeme erlauben, die Streueigenschaften für Licht mit kleinem und großem Winkel aufweisen. Dies erfordert ein großes, kompliziertes Instrumentarium und kann somit nicht durch visuelle Beobachtung durchgeführt werden.
Aus Ledis et al, US-PS 4,286,963 ist eine Zusammensetzung, die aus (a) mindstens einem quartären, Langkettig-Alkyltrimethylammoniumsalz, wie beispielsweise Hexadecyltrimethylammoniumbromid, und (b) mindestens einem Zusatzmittel besteht, das aus (I) einem phenyl- oder phenoxysubstituierten, kurzkettigen Alkanol, wie 2-Phenoxyethanol, und (II) einer Polyhydroxyverbindung, wie Sorbit, ausgewählt ist, zur Lyse von roten Blutkörperchen bekannt, so daß eine differentielle Bestimmung von lymphoiden und myeloiden Populationen von weißen Blutzellen vorgenommen werden kann.
Somit erfordern die meisten der bekannten Verfahren für diese Differenzierung die Herstellung und Verwendung von Farbstoffen, oder sie liefern lediglich die Lyse von roten Blutkörperchen. Einige Verfahren erfordern komplizierte Gerätschaften. Ansonsten hängt die beschriebene Differenzierung bei ganzen Zellen, ob angefärbt oder nicht angefärbt, stark von der subjektiven Charakterisierung ab. Eine verläßliche Methode zur gleichzeitigen Ermittlung einer genauen Zählung von Basophilen und eines Lobularitätsindexes in derselben Probe von behandeltem Blut und in Abwesenheit einer Färbung ist bisher in der Literatur nicht beschrieben.
In Groner et al, Blood Cells, 6:141-157 (1980) wird die Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen unter Anwendung von optischer Streuung, von Färbungseigenschaften und anderen Techniken erörtert. Das Konzept der "Linksverschiebung" wird erwähnt, das sich auf eine Neigung in den Neutrophilenpopulationen in Richtung auf unreifere oder weniger gelappte Formen bezieht. Eine scharfe Änderung im Brechungsindex wurde an der Kerngrenze geschaffen, indem man eine Gesamtblutprobe mit einem starken kationischen Detergens und Maleinsäure behandelte. Das Ergebnis war, daß die roten Blutzellen lysiert wurden, der größte Teil des Cytoplasmas der Leukocyten herausgelaugt wurde und der Kern leicht schrumpfte. Aus den Erörterungen in dieser Literaturstelle scheint sich zu ergeben, daß die Leukocytenmembranen nicht zerrissen oder lysiert wurden (wie im Hinblick auf die roten Blutzellen erwähnt), das Leukocytencytoplasma nicht vollständig (nur zum größten Teil) herausgezogen wurde, wobei Artefakte zurückblieben, die die scheinbare Gestalt des Kerns verformen, und daß schließlich keine Differenzierung der Wirkung dieser Behandlung zwischen einer Leukocytenunterklasse und einer anderen erwähnt wird.
Im Gegensatz zu den Verfahren gemäß dem Stand der Technik haben wir nun ein Verfahren zur Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen geschaffen, aufgrund dessen es möglich ist, eine genaue Charakterisierung der Kernmorphologie (Lobularität) zu liefern und zwischen den Unterklassen von polymorphkernigen Zellen auf der Grundlage des Heraus- oder Abziehens von Cytoplasma bestimmter Unterklassen und des Nichtabziehens bei anderen zu differenzieren. Die Erfindung verwendet eine Reagenzzusammensetzung, die selektiv Cytoplasma von bestimmten Klassen weißer Blutzellen entfernt und von anderen nicht entfernt. insbesondere verursacht die Zusammensetzung eine Entfernung des Cytoplasmas von Lymphocyten, Monocyten, Eosinophilen und Neutrophilen, jedoch nicht von Basophilen. Auf diese Weise lassen sich Basophile von anderen Unterklassen polymorphkerniger Zellen durch das Erhaltenbleiben ihrer Granula und ihrer Cytoplasmamembran unterscheiden. Da außerdem mit Kern versehene rote Blutkörperchen erfaßt werden. erlaubt die Erfindung auch ihre quantitative Bestimmung.
Die vorliegende Erfindung liefert somit ein Verfahren zur Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen, wobei man (a) eine Probe aus Gesamtblut mit einer Reagenzzusammensetzung vermischt und (b) die optischen Eigenschaften des Gemisches beobachtet und dadurch Unterklassen von Leukocyten mindestens zum Teil auf der Grundlage ihrer beobachteten optischen Eigenschaften differenziert, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzzusammensetzung eine wäßrige Lösung mindestens eines wasserlöslichen oberflächenaktiven Mittels sowie mindestens eine verdünnte Säure enthält, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf einen Wert von 1,8 bis 2,3 einzustellen, wodurch Erythrocyten lysiert sowie Cytoplasma und Cytoplasmamembran von den Kernen von Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten abgezogen werden, hingegen die Granula und Cytoplasmamembranen von Basophilen erhalten bleiben.
Die Erfindung umfaßt außerdem die Verwendung einer Zusammensetzung aus einer wäßrigen Lösung von mindestens einem wasserlöslichen oberflächenaktiven Mittel und mindestens einer (zu ergänzen: "verdünnten"; Anmerkung des Übersetzers) Säure zur Einstellung des pH-Wertes der Zusammensetzung auf 1,8 bis 2,3 zum Behandeln einer Gesamtblutprobe, um die darin befindlichen Erythrocyten zu lysieren und Cytoplasma und Cytoplasmamembran von den Kernen von darin befindlichen Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten abzuziehen, wobei andererseits die Granula und Cytoplasmamembranen von Basophilen erhalten bleiben, so daß eine Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen durchgeführt werden kann.
Weiter umfaßt die Erfindung eine besonders bevorzugte Reagenzzusammensetzung, die aus einer wäßrigen Lösung von (1) einem oberflächenaktiven Mittel, das ein Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;-Alkohols eines Polyoxyethylenglycols ist, (II) mindestens einer verdünnten Säure, um einen pH-Wert von 1,8 bis 2,3 einzustellen, wobei die Säure bzw. die Säuren aus der Gruppe Mineralsäuren sowie Malein-, Phthal-, Oxal-, Malon-, Dichloressig und Milchsäure und Glycin ausgewählt ist bzw. sind, und (III) einem kettenabbrechenden Antioxidans besteht.
Der mögliche Irrtum, der sich aus cytoplasmatiscnen Artefakten ergibt, die an den Kernen sämtlicher Blutzellen außer denen der Basophilen anhaften und auf diese Weise die scheinbare Gestalt der Kerne verändern, läßt sich gemäß der Erfindung durch das vollständige Abziehen des cytoplasmatischen Materials von den Kernen durch die Zusammensetzung gemäß der Erfindung vermeiden. Somit kann eine Differenzierung von Blastzellen, mit Kernen versehenen roten Zellen und der verschiedenen Reifestadien von Neutrophilen auf der Grundlage ihrer Kernmorphologie mit Sicherheit durchgeführt werden. Ein wichtiger Vorteil besteht darin, daß die Zusammensetzung und das Verfahren gemäß der Erfindung die Notwendigkeit einer Farbherstellung sowie der sich daraus ergebenden Unberechenbarkeiten der Anfärbetechniken gänzlich vermeidet. Die beschriebene Zusammensetzung kann manuell oder mit Apparaten verwendet werden.
Die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Reagenzzusammensetzungen besitzen einen pH-Wert von etwa 1,8 bis etwa 2,3. Das oberflächenaltive Mittel ist vorzugsweise ein Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;- Alkohols eines Polyalkylenglycols, insbesondere eines Polyoxyethylenglycols. Die Säure ist vorzugsweise eine Sulfon- oder Carbonsäure oder Salzsäure.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Differenzieren von Unterklassen von weißen Blutzellen, wobei eine Blutprobe derart behandelt wird, daß die Zellmembranen und das Cytoplasma von ausgewählten Unterklassen von weißen Blutzellen abgezogen werden und die Unterklassen danach auf der Grundlage ihrer Kernmorphologie differenziert werden. Insbesondere werden die Membran und das Cytoplasma von sämtlichen Unterklassen von Leukocyten außer den Basophilen vollständig abgezogen.
Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird auf die Zeichnungen verwiesen, worin:
FIG. 1A bis 1E zweidimensionale Verteilungsdiagramme für die Streuungsmuster einzelner weißer Blutzellen in Zellsuspensionen darstellen, die unter Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung in einem Durchfluß-Cytometer analysiert worden sind. Jede weiße Blutzelle ist durch einen schwarzen Punkt repräsentiert, und jedes Diagramm zeigt die beobachteten Muster in aufeinanderfolgenden Stufen der Umsetzungen, wie sie in den Versuchen ausgeführt worden sind, die in Beispiel II beschrieben sind.
FIG. 2 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, das die Verteilung von Basophilen-Auszählungen (nicht einzelnen Zellen) in Proben zeigt, die, wie in Beispiel II beschrieben, untersucht worden sind.
FIG. 3 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, das die Verteilung von Auszählungen von mononucleären Zellen (nicht einzelnen Zellen) in Proben zeigt, die, wie in Beispiel II beschrieben, untersucht worden sind.
FIG. 4 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, das die Verteilung von Auszählungen polymorphkerniger Zellen (nicht einzelner Zellen) in Proben zeigt, die, wie in Beispiel II beschrieben, untersucht worden sind.
FIG. 5A bis 5B sind zweidimensionale Verteilungsdiagramme einer abnormen Gesamtblutprobe, von der man wußte, daß sie unreife Granulocyten enthielt, erhalten unter Verwendung der Zusammensetzung gemäß der Erfindung bzw. einer herkömmlichen Bestimmungsmethode.
FIG. 6A bis 6F sind zweidimensionale Verteilungsdiagramme, die die Fähigkeit des offenbarten Chemismus zur Erfassung einer Linksverschiebung, verglichen mit einer herkömmlichen Bestimmungsmethode, erläutern.
FIG. 7A bis 7C sind zwei dimensionale Verteilungsdiagramme der Versuche, die gemäß Beispiel III unter Anwendung einer herkömmlichen Bestimmungsmethode durchgeführt wurden.
FIG. 7D bis 7F sind zweidimensionale Verteilungsdiagramme von einzelnen Blutproben, die unter Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung in einem Durchfluß-Cytometer analysiert worden sind. Sie erläutern die Ergebnisse, die in den Versuchen gemäß Beispiel III bei Proben von einem Donor mit akuter myeloblastischer Leukämie, einem normalen Donor bzw. einem Donor mit chronischer lymphocytischer Leukämie erhalten worden sind.
FIG. 8A bis 8B sind zweidimensionale Verteilungsdiagramme der Streuungsmuster von einzelnen weißen Blutzellen in Zellsuspensionen, die unter Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung bzw. eines herkömmlichen Peroxidasereagenzes durch ein Durchfluß-Cytometer hindurchströmen gelassen wurden, wie in Beispiel IV beschrieben.
Spezifische Ausdrücke in der folgender Beschreibung, die lediglich eine besondere Durchführungsform betreffen, gelten für alle Durchführungsformen, sofern nicht anders angegeben.
Gemäß der Erfindung wird das Cytoplasma bestimmter Klassen von weißen Blutzellen, nicht jedoch von anderen, abgezogen. Lymphocyten, Nonocyten, Eosinophile und Neutrophile werden cytoplasmatisch abgezogen. Das heißt, ihre Membran und ihr cytoplasmatisches Material werden von ihren Kernen abgezogen, die unangegriffen und frei von mit ihnen verbunden gewesenem cytoplasmatischem Material gelassen werden. Auf diese Weise ist die Morphologie ihrer Kerne scharf definiert. Im Gegensatz zu der Entfernung des Cytoplasmas, die auf diese Weise bewirkt (im englischen Text muß es offensichtlich "effected" heißen; Anmerkung des Übersetzers) wird, behalten die Basophilen ihre Granula und ihre Cytoplasmamembran.
Die Erfindung kann zur manuellen oder mittels Durchfluß-Cytometrie durchgeführten Bestimmung verschiedener Arten von Blutzellen angewandt werden. Die verwendeten Zusammensetzungen können gewünschtenfalls ein Antioxidans enthalten. Ein kettenabbrechendes Antioxidans verhindert den autoxidativen Abbau des oberflächenaktiven Mittels, der zu einer Verschlechterung des Abziehens des Cytoplasmas führt. In Abwesenheit des Antioxidans beträgt die Haltbarkeit der Zusammensetzung bei einer Aufbewahrung bei 25 ºC zwei Monate. Wenn das Antioxidans jedoch anwesend ist, beträgt die Haltbarkeit mindestens ein Jahr bei 25 ºC. Das Antioxidans stört die richtige Funktionsweise der Zusammensetzung nicht.
Das wasserlösliche oberflächenaktive Mittel kann jedes beliebige oberflächenaktive Mittel sein, das die erforderliche Wirkung auf die Blutzellen hervorruft: vollständige Lyse der roten Zellen Blutplättchen, Abziehen des Cytoplasmas und der Cytoplasmamembran von Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten sowie Erhaltung der Granula und Zellmembran für die Basophilen. Beispiele hierfür sind Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;-Alkohols eines Polyalkylenglycols, vorzugsweise eines Polyoxyethylenglycols.
Die wäßrigen Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß verwendet werden, enthalten mindestens eine verdünnte Säure. Beispiele sind: (I) organische Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure oder Ethansulfonsäure; (II) Carbonsäuren, wie Malein-, Phthal-, Oxal-, oder Malonsäure, Glycin, Dichloressigsäure und Milchsäure; und (III) Gemische daraus. Es kann außerdem vorteilhaft sein, mindestens eine verdünnte anorganische Säure zu verwenden. Beispiele hierfür sind Salz-. Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "verdünnt" Konzentrationen von etwa 30 mM oder darunter. Besonders wirksam sind Kombinationen von Mineralsäuren und Carbonsäuren, wie beispielsweise Phthalsäure/Salzsäure.
Die bevorzugten Reagenzzusammensetzungen gemäß der Erfindung müssen einen pH-Wert von etwa 1,8 bis etwa 2,3 aufweisen. Obgleich dies ein enger pH-Wert-Bereich ist, ist dies ein wichtiger Aspekt der Erfindung. Dieser pH- Wert kann durch Anwesenheit einer verdünnten Säure allein oder durch Einfluß zusätzlicher Säuren eingestellt werden.
Die Zusammensetzung kann gewünschtenfalls auch ein kettenabbrechendes Antioxidans enthalten, das den Abbau des oberflächenaktiven Nittels als Ergebnis von Autoxidation verzögert und auf diese Weise die Haltbarkeit erhöht. Das Antioxidans zerstört Peroxyradikale, die, wenn sie nicht inhibiert würden, an Kettenreaktionen teilnehmen wurden. Beispiele sind. Di-tert-butyl-4- methylphenol (BHT), p-Methoxy-phenol (MEHO) oder Di- tert-butyl-4-methoxyphenol (BHA).
Die Zusammensetzung kann gewünschtenfalls auch ein antimikrobielles Konservierungsmittel enthalten, das das Wachstum verunreinigender Organismen, wie beispielsweise von Schimmel, verzögert oder verhindert.
In den bevorzugten Durchführungsformen der Erfindung werden die Bestandteile in den folgenden Anteilsbereichen verwendet:
a) oberflächenaktives Mittel 10-20 g/l
b) verdünnte Säure 0,020-0,024 M/l
c) kettenabbrechendes Antioxidans 0,1-0,2 g/l
d) antimikrobielles Konservierungsmittel 0,2-0,6 g/l
Es ist zweckmäßig, in der Lage zu sein, die Reaktionsgeschwindigkeit zu steuern, so daß das Verfahren entweder für manuelle oder automatisierte Durchführungsformen optimiert werden kann. In dieser Hinsicht sind Zusammensetzungen, die "Brij-35", Maleinsäure und BHT enthalten, von besonderem Interesse. Maleinsäure kann innerhalb eines Konzentrationsbereiches von 0 025-1% (0,0022 - 0,086 M) verwendet werden. Die Wirkung der Veränderung der Maleinsäure-Konzentration ist eine Nettoerhöhung der Geschwindigkeit von etwa dem Zehnfachen.
Der untere Bereich der Maleinsäurekonzentration ist besonders für manuelles mikroskopisches Arbeiten nützlich. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist langsam genug, so daß das Verfahren innerhalb von 2 min durchgeführt werden kann. Im Gegensatz dazu erfolgt die Umsetzung am oberen Ende des Bereichs im wesentlichen momentan und eignet sich für automatisierte instrumentelle Techniken.
Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurde beobachtet, daß, wenn Gesamtblut mit einer Lösung aus oberflächenaktivem Mittel und verdünnten Säuren vermischt wird, eine Folge von Membran- und Cytoplasma-Zerstörung auftritt, die mit der Lyse der roten Blutzellen beginnt, wobei keine Struktur der roten Blutzellen übriggelassen wird, und sich über die Blutplättchen-Lyse, die ebenfalls keine Struktur übrigläßt und das Abziehen des Cytoplasmas von weißen Blutzellen fortsetzt, wobei die bloßen Kerne sämtlicher weißer Blutzellen übrigbleiben, ausgenommen die Basophilen, die im wesentlichen als einzige ganze Zellen, die in der behandelten Blutprobe beobachtbar sind, zurückbleiben. Die Kerne der weißen Blutzellen und die Basophilen, die ihre Cytoplasmamembran und ihre Granularität behalten, können durch visuelle Beobachtung oder durch ein instrumentelles Erfassungssystem differenziert werden.
Es ist bevorzugt, die Zellprobe in einen Fluidstrom einzubringen, der in einer Leitung oder in einem Analysekanal in einen Durchflußcytometer fließt. Dies umfaßt vorzugsweise die Einrichtung eines fließenden Stromes eines Umhüllungsfluids in der Leitung oder dem Analysekanal und die anschließende Einführung der Probe in den fließenden Umhüllungsstrom. Derartige Umhüllungsströme bestehen normalerweise aus Fluiden mit einem Brechungsindex, der im wesentlichen dem des Suspendiermediums für die Zellprobe identisch ist. Ein derartiges Durchflußcytometer, das einen Umhüllungsstrom als Trägerfluid verwendet, wird in den Technicon-Systemen Hemalog D und H-6000 verwendet, mit denen sämtliche routinemäßig durchzuführenden hämatologischen Tests durchgeführt werden können. Ins einzelne gehende Informationen über die Systeme Hemalog D und H-6000 ist von Technicon Instruments Corporation, Tarrytown, NY erhältlich.
Die folgenden Ausführungsbeispiele beschreiben Versuche, die bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Beispiele, daß die Zusammensetzung und die Methode gemäß der Erfindung es ermöglichen, (a) genaue Basophilen- Auszählungen zu erhalten; (b) eine Angabe für die mittlere Läppchenauszählung oder die Menge und den Grad der Linksverschiebung, die in einer gegebenen Probe auftritt, zu erhalten; (c) eine genaue Differenzierung von Blastzellen von anderen mononucleären Zellen zu erzielen; (d) mit Kern versehene rote Blutzellen zu identifizieren und zu bestimmen; und (e) eine Gesamtzählung der weißen Blutzellen zu erhalten. Wenn irgend möglich wurden im Handel erhältliche, reagenzreine Standardchemikalien verwendet.

Beispiel I

Manuelle differenzierende Auszählung weißer Blutzellen

Eine differerenzierende Äuszählung weißer Blutzellen stellt einen der wichtigsten unterscheidenden Parameter in der Differentialdiagnose verschiedener Krankheitszustände, insbesondere bezüglich infektiöser und immunologischer Krankheiten, dar. In dem durch das vorliegende Beispiel beschriebenen Versuch wurde die Zusammensetzung gemäß der Erfindung hergestellt und zur Unterscheidung von Basophilen von allen anderen Blutzellen und von einkernigen von polymorphkernigen weißen Blutzellen verwendet.
Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung wurde in 97 ml destilliertem Wasser durch Zugabe von 0,20 g Maleinsäure und 3 ml Brij-35 (30%ig (Gew./Vol.) in destilliertem Wasser) hergestellt. ("Brij" ist ein Warenzeichen).
Eine Probe von 8,0 ul frischem menschlichem Gesamtblut wurde mit 500 ul der wie oben beschrieben hergestellten Zusammensetzung vermischt. Nach 1 min wurde ein aliquoter Teil der umgesetzten Gesamtblutprobe auf einen sauberen Mikroskopobjektträger zur Beobachtung durch ein Nikon-Mikroskop mit 40facher Vergrößerung pipettiert.
Nach mikroskopischer Untersuchung dieses aliquoten Teils wurde festgestellt, daß die roten Blutzellen und Blutplättchen zerstört und die weißen Blutzellen der Probe außer den Basophilen vollständig vom Cytoplasma befreit waren. Die Cytoplasmamembran und die Granula der basophilen polymorphkernigen Zellen waren unbeeinträchtigt und intakt geblieben.
Es wurden auch Zusammensetzungen hergestellt, die gleich den oben beschriebenen waren, jedoch keine Maleinsäure enthielten. Diese Zusammensetzung wurde zur Untersuchung von Blutproben verwendet, wie oben beschrieben, und es wurde keine Lyse von Blutkomponenten beobachtet. Außerdem wurden Zusammensetzungen hergestellt, in denen Maleinsäure vorhanden war, jedoch das oberflächenaktive Mittel, "Brij-35", weggelassen war. Dabei wurde beobachtet, daß ein Zusammenklumpen von Zellen eintrat, das die Erkennung der Basophilen und der Lobularität der weißen Blutzellen verhinderte. Als solche war keine dieser Zusammensetzungen wirksam, um die Differenzierung zu liefern, die die Zusammensetzung gemäß der Erfindung ermöglicht.

Beispiel II

Automatisierte differenzierende Auszählung von weißen Blutzellen

Die Versuche, die in diesem Beispiel beschrieben werden, zeigen die Verwendung der Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Gewinnung einer genauen Auszählung von Basophilen. Basophile, mononucleäre Zellen (unreife Granulocyten, Lymphocyten und Monocyten) und polymorphkernige Zellen (Neutrophile und Eosinophile) wurden bestimmt. Sie wurden mit gleichen Bestimmungen verglichen (korreliert), die nach bereits bestehenden Techniken vorgenommen wurden, wie sie auf dem Instumentensystem H-6000 (Technicon a.a. O ) angewandt werden. Eine Bestimmung der Anwesenheit von unreifen Granulocyten wird erläutert. Außerdem wurde die Zusammensetzung gemäß der Erfindung dazu benutzt, um die Linksverschiebung zu bestimmen, beispielsweise die Verminderung in der mittleren Anzahl der Neutrophilenlappen.
Gemäß der Erfindung wurde eine Reagenzzusammensetzung hergestellt, die 3,6 g Phthalsäure, 10 g "Brij-35", 0,1 g BHT und 1,0 ml 1N HCl enthielt und auf 1 l mit destilliertem Wasser ergänzt wurde (pH 2,0).
Es wurden Blutproben von jeweils einer großen Anzahl von Patienten untersucht, wobei für jede Blutprobe das gleiche Testverfahren angewandet wurde. 8 ul jeder Blutprobe wurden in ein separates Reagenzglas zusammen mit 500 ul der oben erwähnten Reagenzzusammensetzung eingefüllt. Nach 50 s Vermischung wurde das Umsetzungsgemisch peristaltisch durch eine Durchflußzelle mit Umhüllungsstrom mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min gepumpt.
Das optische System, das zur Erzielung einer zweidimensionalen Verteilung von von jeder einzelnen Zelle hervorgerufenen Lichtstreuungsmarkierungen verwendet wurde, war das eines modifizierten RBC/PLT-Kanals eines H-6000-Durchflußcytometrie-Systems (Technicon, a.a.O.) Die Streuung mit großem Winkel wurde längs der Abszisse und die Streuung mit kleinem Winkel längs der Ordinate in der von dem System gelieferten Ausgabe gemessen. Mit Hilfe eines Rechners unter Anwendung von Cluster-Analyse wurden Schwellen-Begrenzungslinien gesetzt, um zwischen verschiedenen Zellarten zu unterscheiden, und das System wurde so programmiert, daß es sämtliche Signale, die auf Zelltrümmer und dergleichen zurückzuführen waren, ignorierte. Eine vollständige Beschreibung des verwendeten optischen Systems ist von Technicon, a.a.O. erhältlich. Die Ausgabesignale aus diesem optischen System wurden verstärkt und zu einem zweidimensionalen Verteilungsdiagramm umgewandelt. Jeder Punkt repräsentiert die gemessenen Koordinaten einer einzelnen Zelle.
Jede der Proben aus der Menge der Patienten wurde unter Verwendung der oben genannten Zusammensetzung und unter Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung analysiert. Die FIG. 1A bis 1E repräsentieren die Stufen der Umsetzung aus dem oben erwähnten Analyseverfahren für eine der Proben von einem normalen Donor bei unterschiedlichen Zeitintervallen, gemessen von dem Beginn der Umsetzung an. FIG. 1A (15 Sekunden) zeigt rote Blutzellen (RBC) und Blutplättchen (PLT), die zerstört worden sind (R) sowie gequollene weiße Blutzellen (WBC) (W). FIG. 1B (20 bis 25 Sekunden) zeigt Lymphocyten (L), die begonnen haben, ihr Cytoplasma zu verlieren und sich längs der Y-Achse auf den Nullpunkt zuzubewegen. In FIG. 1C (30 bis 35 Sekunden) haben einige Granulocyten (G) begonnen, ihr Cytoplasma zu verlieren, und sämtliche Lymphocyten (L) befinden sich im Zustand des vollständigen Abziehens des Cytoplasmas. In FIG. 1D (40 bis 45 Sekunden) sind die meisten Granulocyten (G) und sämtliche Lymphocyten (L) völlig vom Cytoplasma befreit und haben sich somit auf ihre endgültigen X-Y-Positionen begeben. Einige wenige weiße Blutzellen (W), zumeist Monocyten, bleiben intakt. FIG. 1E (80 Sekunden) zeigt, daß sämtliche weiße Blutzellen ausgenommen die Basophilen (B) von ihrem Cytoplasma befreit worden sind, wobei lediglich die nackten Kerne zurückgeblieben sind, und daß sie sich in ihrer endgültigen X-Y-Position befinden. Weiter sind klar umrissene Anhäufungen von polymorphkernigen Zellen (P), mononucleären Zellen(MN), Basophilen (B) und Zelltrümmern (R) zu sehen.
Die Proben, die von der Menge der Patienten genommen worden waren, wurden außerdem mit einem herkömmlichen, handelsüblichen Technicon-H-6000-System gemäß den Anleitungen des Herstellers untersucht. Die Korrelation der Ergebnisse für jede der Anhäufungen aus Basophilen, mononucleären Zellen (MN) und polymorphkernigen Zellen ist in den FIG. 2 bis 4 dargestellt.
FIG. 2 zeigt ein Rumpke Oval, das über die Daten von 98 Proben, normalen und abnormen gelegt ist, wobei die Methode gemäß der Erfindung mit der Basophilen-Bestimmung nach Technicon H-6000 zur Ermittlung des prozentualen Anteils an Basophilen verglichen wird. Diese Figur zeigt eine ausgezeichnete Übereinstimmung zusammen mit der Tatsache, daß mehr als 95% der Punkte innerhalb des Ovals fallen. Es wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,81 beobachtet.
FIG. 3 zeit eine ausgezeichnete Genauigkeit und Korrelation für mononucleäre Zellen (MN) unter Verwendung der offenbarten Zusammensetzung (eigentlich: offenbarten Chemie) sowie für mononucleäre Zellen einschließlich Lymphocyten (L), Monocyten (M) und große nicht angefärbte Zellen (LUC) unter Verwendung der Methodik (eigentlich: Chemie) mit Peroxidase gemäß Technicon H-6000. Die Anzahl von Proben wurde verringert, um abnorme (leukämische) Proben zu beseitigen , um zu zeigen, wie gut das erfindungsgemäße Verfahren bei normalen Proben übereinstimmt. Ein Korrelationskoeffizient von 0,96 wurde beobachtet.
FIG. 4 zeigt die ausgezeichnete Genauigkeit und Korrelation für polymorphkernige Zellen bei denselben Proben, wie erwähnt, unter Verwendung der offenbarten Methodik (P) und des Systems H-6000, das polymorphkernige Zellen als Neutrophile (N) und Eosinophile (E) wiedergibt. Ein Korrelationskoeffizient von 0,97 wurde beobachtet.
FIG. 5A und 5B sind zweidimensionale Verteilungsdiagramme einer abnormen Probe, von der man wußte, daß sie unreife Granulocyten enthielt, wobei die erfindungsgemäße Methode bzw. das herkömmliche System H-6000 mit Peroxidase angewandt wurde. In FIG. 5A ist eine dichtere Anhäufung von mononucleären Zellen zu beobachten, als von den Lymphocyten, Monocyten und den großen nicht angefärbten Zellen nach der Peroxidase-Methode erwartet worden wäre. Der Prozentsatz an Zellarten, der bei Verwendung jeder der beiden oben genannten Methoden und bei der manuellen Durchführung ermittelt worden ist, ist in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I Mononucleäre Zellen polyamorphkernige Zellen unreife Granulocyten Erfindungsgemäß H-6000-Methode Manuell
Der Hauptunterschied in der Anzahl der mononucleären Zellen, der zwischen der erfindungsgemäßen Methode und der Methode H-6000 beobachtet worden ist, entspricht der Zahl der unreifen Granulocyten, der nach dem manuellen Verfahren beobachtet worden ist. Daher können Proben, die eine signifikante Anzahl an unreifen Granulocyten enthalten, von normalen Proben unterschieden werden.
Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es wegen der Beibehaltung lediglich der Kerne der Neutrophilen in der Lage ist, das Vorhandensein einer Linksverschiebung, d.h. einer Abnahme in der mittleren Auszählung der Kernläppung der Neutrophilen, die durch das Vorhandensein einer größeren Anzahl von Bandzellen hervorgerufen ist, anzuzeigen. Dies wird durch die Tatsache demonstriert, daß in dem Maße, wie die mittlere Läppchen-Auszählung abnimmt, auch die Ausdehnung der Anhäufung der polymorphkernigen Zellen (P) abnimmt. Die FIG. 6A bis 6C zeigen die Ergebnisse der H-6000-Methode für drei Proben mit ansteigenden Bandzellen-Auszählungen und abnehmenden mittleren Läppchen-Auszählungen. Man kann sehen, daß diese drei Proben keine Unterscheidungsmerkmale aufweisen, die vermuten ließen, welche Probe die Linksverschiebung aufweist. FIG. 6D bis 6F zeigen dieselben Proben unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Man kann sehen, daß in dem Maße, wie die mittlere Läppchen-Auszählung abnimmt, eine entsprechende Abnahme in der Ausdehnung der Anhäufung der polymorphkernigen Zellen (P) auftritt. Diese Bewegung der Ausdehnung der Anhäufung der polymorphkernigen Zellen nach links gestattet es dem erfindungsgemäßen Verfahren, das Vorhandensein einer Linksverschiebung vorauszusagen. Die Tabelle II zeigt die manuelle Auszählung der Bandzellen und die manuelle mittlere Läppchen-Auszählung der Neutrophilen im Vergleich zu der Ausdehnung der Anhäufung der polymorphkernigen Zellen (P) für diese Proben, wobei die Bereiche für die Bandzellenauszählung von 0 bis 20 (zu ergänzen: %; Anmerkung des Übersetzers) und für die mittlere Läppchen-Auszählung von 3,38 bis hinunter zu 2,31 reichen. Tabelle II Manuelle Bandzellen-Auszählung Manuelle mittlere Läppchen-Zählung Ausdehnung der Anhäufung der polymorphkernigen Zellen

Beispiel III

Die Versuche, über die im vorliegenden Beispiel berichtet wird, zeigen die Verwendung derselben Zusammensetzung und die Anwendung derselben Analysenmethode gemäß der Erfindung, wie in Beispiel II beschrieben, zur Differenzierung von Blastzellen von anderen mononucleären Zellen. Signifikante Prozentsätze von großen, nicht angefärbten Zellen, die unter Anwendung des H-6000-Systems mit Peroxidase beobachtet worden waren, sind der Anwesenheit von abnormen mononucleären Zellen zugeschrieben worden. Derartige Methoden sind nicht in der Lage gewesen, diese als entweder Blastzellen oder als atypische Lymphocyten zu identifizieren.
Gesamtblutproben wurden von einem Donor mit akuter myeloblastischer Leukämie (Probe A), einem normalen Domor (Probe B) und einem Donor mit chronischer lymphocytischer Leukämie (Probe C) erhalten. Das Muster der Zellanhäufungen für jede dieser Proben nach Analyse unter Verwendung der Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist in den FIG. 7D bis 7F erläutert.
Ein anderer aliquoter Teil jeder dieser drei Proben wurde für die Peroxidaseaktivität angefärbt und unter Verwendung der herkömmlichen Peroxidase-Reagenzien und des Kanals auf einem H-6000-Svstem analysiert. Die erzielten Ergebnisse sind in den FIG. 7A bis 7C erläutert.
Die FIG. 7A und 7C zeigen beide eine beträchtliche Population an großen, nicht angefärbten Zellen. Als solche zeigen sie die Anwesenheit von abnormen mononucleären Zellen an und können von FIG. 7B, die die normale Populationsverteilung wiedergibt, unterschieden werden. Jedoch erscheinen die FIG. 7A und 7C als praktisch identisch miteinander, so daß sie keine Möglichkeit bieten, zu unterscheiden, ob diese erhöhten Populationen an großen, nicht angefärbten Zellen auf eine Erhöhung an Blastzellen, wie sie für die akute myeloblastische Leukämie charakteristisch sind, oder auf atypische Lymphocyten, wie sie für chronische lymphocytische Leukämie charakteristisch sind, zurückzuführen sind.
Die FIG. 7D und 7F zeigen einen signifikanten Unterschied in der Lage der Anhäufungen der mononucleären Zellen (MN), wie sie längs der X-Achse erscheinen. Die MN-Anhäufung in FIG. 7D, die sich nach links auf den. Nullpunkt zu bewegt hat, enthält die Blastzellen. Im Gegensatz dazu blieb die MN-Anhäufung in FIG. 7F in derselben Stellung wie diejenige der MN-Anhäufung von FIG. 7E, die diejenige des normalen Donors ist. Durch Anordnung einer fixen, vertikalen Blastschwelle (BT) kann man den genauen Prozentsatz an Blastzellen erhalten.
Die Prozentsätze an beobachteten Blastzellen bei Verwendung einer manuellen Methode sowie bei Anwendung des erfindungsgemäßen Vorgehens sowie der Prozentsatz an großen, nicht angefärbten Zellen und der Verwendung der H-6000-Methode sind in Tabelle III zusammengefaßt. Tabelle III % Blastzellen % große nicht-angefärbte Zellen Manuell erfindungsgemäß H-6000-Methode
Auf diese Weise ist gezeigt worden, daß es bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nunmehr möglich ist, zwischen Blastzellen und atypischen Lymphocyten zu unterscheiden. Dies führt zu einer Unterscheidungsmöglichkeit zwischen signifikant unterschiedlichen Klassen von Leukämien.

Beispiel IV

Der Versuch, über den in dem vorliegenden Beispiel berichtet wird, wurde unter Verwendung derselben Zusammensetzung und der Anwendung derselben Analyse durchgeführt, wie in Beispiel II beschrieben. Zur quantitativen Bestimmung von mit Kern versehenen roten Blutzellen (NRBC) ist die Anwesenheit von unreifen, mit Kernen versehenen roten Blutzellen im umlaufenden Blut eine signifikante abnorme Feststellung, die bisher nicht instrumentell erfaßt werden konnte.
Eine Probe von Gesamtblut mit einem Gehalt an mit Kern versehenen roten Blutzellen wurde mit der Zusammensetzung gemäß der Erfindung vermischt und analysiert. Die Ergebnisse sind in FIG. 8A dargestellt. Eine dichte Anhäufung von Zellen erscheint in dem Bereich für polymorphkernige Zellen (P). Eine weitere aliquote Menge derselben Probe wurde zur Peroxidaseaktivität angefärbt und unter Verwendung der herkömmlichen Peroxidasereagenzien und des Kanals eines H-6000-Systems analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in FIG. 8B dargestellt. Lediglich verstreute Zellen erscheinen in dem Bereich, in dem normalerweise Neutrophile (N) und Eosinophile (E) erscheinen.
Auf diese Weise erfaßt die herkömmliche Bestimmungsmethode mit Peroxidase fast keine polymorphkernigen Zellen, während die Methode gemäß der Erfindung eine signifikante Population von polymorphkernigen Zellen erfaßt, die sich als die mit Kern versehenen roten Zellen erwiesen, wie durch visuelle Untersuchung bestätigt wurde. Dies erwies sich als die Differenz in der Zahl der absoluten Zellen pro Lambda zwischen der Auszählung für polymorphkernige Zellen unter Verwendung des herkömmlichen H-6000-Systems und der Auszählung für polymorphkernige Zellen unter Anwendung der Methode gemäß der Erfindung.

Claims

1. Verfahren zur Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen, wobei man (a) eine Probe aus Gesamtblut mit einer Reagenzzusammensetzung vermischt und (b) die optischen Eigenschaften des Gemisches beobachtet und dadurch Unterklassen von Leukocyten mindestens zum Teil auf der Grundlage ihrer beobachteten optischen Eigenschaften differenziert, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzzusammensetzung eine wäßrige Lösung mindestens eines wasserlöslichen oberflächenaktiven Mittels sowie mindestens eine verdünnte Säure enthält, um den pH-Wert der Zusammensetzung auf einen Wert von 1,8 bis 2,3 einzustellen, wodurch Erythrocyten lysiert sowie Cytoplasma und Cytoplasmamembran von den Kernen von Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten abgezogen werden, hingegen die Granula und Cytoplasmamembranen von Basophilen erhalten bleiben.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung als oberflächenaktives Mittel einen Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;-Alkohols eines Polyoxyethylenglycols enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Zusammensetzung Salzsäure enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Zusammensetzung eine Carbonsäure aus der Gruppe Maleinsäure, Phthalsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Dichloressigsäure und Milchsäure und Glycin enthält.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Zusammensetzung ein Gemisch aus einer Dicarbonsäure und einer Mineralsäure enthält.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zusammensetzung außerdem ein kettenabbrechendes Antioxidans enthält.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Reagenz außerdem ein antimikrobielles Konservierungsmittel enthält.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, das durch Durchflußcytometrie auf der Grundlage der Messung der Streueigenschaften der Kerne der mononuklearen und polymophkernigen Zellen und der zu bestimmenden intakten Basophilen durchgeführt wird, wobei in Stufe (b) das Gemisch praktisch Teilchen für Teilchen durch einen Bereich fokussierter optischer Beleuchtung geführt und das durch die Teilchen gestreute Licht erfaßt wird.

9. Verwendung einer Zusammensetzung aus einer wäßrigen Lösung von mindestens einem wasserlöslichen oberflächenaktiven Mittel und mindestens einer verdünnten Säure zur Einstellung des pH-Wertes der Zusammensetzung auf 1,8 bis 2,3 zum Behandeln einer Gesamtblutprobe, um die darin befindlichen Erythrocyten zu lysieren und Cytoplasma und Cytoplasmamembran von den Kernen von darin befindlichen Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten abzuziehen, wobei andererseits die Granula und Cytoplasmamembranen von Basophilen erhalten bleiben, so daß eine Differenzierung von Unterklassen von weißen Blutzellen durchgeführt werden kann.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung als oberflächenaktives Mittel einen Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;-Alkohols eines Polyoxyethylenglycols enthält.

11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Zusammensetzung Salzsäure enthält.

12. Verwendung gemäß Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Zusammensetzung eine Carbonsäure aus der Gruppe Maleinsäure, Phthalsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Dichloressigsäure und Milchsäure und Glycin enthält.

13. Verwendung gemäß Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Zusammensetzung ein Gemisch aus einer Dicarbonsäure und einer Mineralsäure enthält.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Zusammensetzung außerdem ein kettenabbrechendes Antioxidans und bzw. oder ein antimikrobielles Konservierungsmittel enthält.

15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 bei einem Durchflußcytometrieverfahren.

16. Reagenzzusammensetzung zur Vermischung mit Gesamtblut, um darin befindliche Erythrocyten zu lysieren und das Cytoplasma und die Cytoplasmamembran von den Kernen von Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphocyten und Monocyten, jedoch nicht von Basophilen abzuziehen, aus einer wäßrigen Lösung von (I) einem oberflächenaktiven Mittel, das ein Ether eines aliphatischen C&sub6;- bis C&sub1;&sub6;-Alkohols eines Polyoxyethylenglycols ist, (II) mindestens einer verdünnten Säure, um einen pH-Wert von 1,8 bis 2,3 einzustellen, wobei die Säure bzw. die Säuren aus der Gruppe Mineralsäuren sowie Malein-, Phthal-, Oxal-, Malon-, Dichloressig- und Milchsäure und Glycin ausgewählt ist bzw. sind, und (III) einem kettenabbrechenden Antioxidans.