DK165713B

DK165713B - Fremgangsmaade til identificering af underklasser af leukocyter i en blodproeve og lyseringsreagens til anvendelse ved fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK165713B
Application number: DK429285A
Authority: DK
Inventors: John Francis Cremins; Joseph Louis Orlik
Original assignee: Technicon Instr
Priority date: 1984-09-24
Filing date: 1985-09-23
Publication date: 1993-01-04
Also published as: ES547094A0; US5518928A; DK165713C; EP0177137B1; DE3586159D1; DK429285A; AU4587985A; DK429285D0; JPH068817B2; DE3586159T2; JPS6188896A; CA1255197A; AU599005B2; ES8706263A1; EP0177137A3; EP0177137A2

Description

i

DK 165713B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til identificering af underklasser af leukocyter i en blodprøve. Endvidere angår opfindelsen et lyseringsreagens til anvendelse ved fremgangsmåden.

5

Humane leukocyter, dvs. hvide blodlegemer, klassificeres som lymfocyter, monocyter og polymorphonucleære celler (PMNs). PMNs under-klassificeres som neutrophiler, eosi-nophiler eller basophiler, baseret på farvningsegenskaber 10 for deres cytoplasmiske granuler.

Differentiering af leukocyter er hyppigt udført ved forskellige farvningsmetoder. Der kendes et antal phthalo-cyanin-forbindelser, der er egnede hertil. Den første af 15 disse, som blev opdaget, kaldes Alcian-blåt. Alcian-blåt har været anvendt til differentieret farvning af basophiler. Kobber-phthalocyanin-kationiske farvestoffer er ikke tilstrækkelig specifikke til opnåelse af selektiv farvning af basophiler, når de anvendes alene, fordi de også 20 farver andre celler, som har polynucleotider, f.eks. DNA og RNA. Desuden farves basophiler, fordi de specielt indeholder heparin, der er et sulfateret polysaccharid. En metode til at opnå den ønskede selektivitet er at kombinere med lanthanchlorid, som maskerer polynucleotid-phos-25 phat-gruppeme og derved forhindrer dem i at binde phthalocyanin-anionen.

Anvendelsen af Alcian-blåt kræver en nøje kontrolleret pH-værdi i det sure område, og dette farvestof er varme-30 labilt. Ved alkalisk pH og udsat for varme danner Alcian-blåt partikler (uopløselige farvestoffer). Denne tilbøjelighed til udfældning har længe været et problem ved anvendelsen af reagenser indeholdende Alcian-blåt. Automatiske analyseintrumenter indeholder hjælpemidler, såsom 35 filtre, til at opsamle disse bundfald. Dette kan få indflydelse på pålideligheden af det udførte bestemmelser samt på driften af instrumenterne, som anvendes til meto- 2

DK 165713B

dens gennemførelse. Alligevel har det været det foretrukne farvestof på grund af dets specificitet og kraftige farve. Yderligere oplysninger om Alcian-blåt fremgår af Gilbert, et al, "Basophil Counting With A New Staining 5 Method Using Alcian Blue", Blood, 46:279-286 (1975).

Senere har man udviklet andre phthalogcyanin-farvestoffer. F.eks. har Bloom et al vist, se Histokemi 2:48-57 (1960), at man kan anvende ikke-derivatiserede Astra-blåt 10 (fri base) til at farve biologiske væv indeholdende muco-polysaccharider, især mast-celler. Astra-blåt i form af fri base anvendes i 0,5 N HC1, der giver farvestoffet en positiv ladning. Den lave pH-værdi medfører selektivitet på grund af styrken af svovlsyre-derivaterne, f.eks. he-15 parin, som ioniseres ved en pH-værdi på 0,3, sammenlignes med svagheden af phosphorsyre-derivater, f.eks. DNA, som ikke ioniseres ved en lav pH-værdi.

Inagaki, Acta Hematologica Japonica, 32(4):642-647 20 (1969), beskriver en metode til farvning af basophil og mast-cellegranulater under anvendelse af Astra-blåt i form af fri base og en fiksativ opløsning af Acridin-Orange i methanol indeholdende 0,5 M NaCl. Inagaki undersøgte mættet pyridiniumchlorid i absolut methanol og mæt-25 tet Acridin i absolut methanol til fiksering udstryg-ningsprøver af perifert blod og benmarv. Cetylpyridinium-chlorid medførte en sikker præservering af basophil-gra-nulater og mast-celle-granulater, men Astra-blåt-farvningen havde tilbøjelighed til at forhindres. Aridin har ik-30 ke kunnet præservere disse celle-granulater tilfredsstillende ved den ovenfor beskrevne metode.

Sammenfattende kan det konstateres, at Alcian-blåt og Astra-blåt i form af fri base og de kvaternære derivater 35 deraf har været de eneste forbindelse af denne type, som har været kendt til differentiering af basophiler fra andre leukocyter. Instabiliteten af Alcian-blåt-reagens 3

DK 165713B

har længe været et problem. Forskere inden for dette område har til stadighed søgt efter forbindelser, som selektivt kunne farve basophiler i modsætning til andre leukocyter. Farveoptagningen er endvidere afhængig af 5 hver enkelt brugers farvningsteknik.

Da cellulær modning er en kontinuert proces, er de successive trin, der indgår heri, vanskelige at adskille. Separate trin kan dog forekomme ved udstrygningsprøver af 10 fuldblod, farvet med Wright's eller Giemsa-farver. Denne klassifikation er baseret på tilstedeværelsen, arten og antallet af granulater og de cytoplasmiske og nucleære egenskaber for hver celle. Disse klassifikationer af leukocyter og teknikken for deres differentiering er vel-15 kendt. Se f.eks. Ansley et al, USA patent nr. 3 741 875.

En klassifikation af farvede intakte celler baseret på cytoplasmisk og nucleær information er imidlertid afhængig af brugerens subjektive karakterisation.

20 Kim, USA patent nr. 4 099 917 har angivet en metode til fremstilling af en blodprøve for diskrimination mellem klasser af ikke farvede leukocyter ved deres cellestørrelse og granulære karakteristika. En blodprøve behandles med et detergent, som lyser erythrocyter, men ikke lyser 25 leukocyter, et fiksativt tilsættes, og præparatet inkube res. Den således opnåede cellesuspension siges at tillade differentiation af ikke-farvede, fikserede intakte leukocyter ved optiske systemer, der benytter lyssprednings-egenskaber med små og store vinkler. Dette kræver store 30 komplekse instrumenter, og der kan således ikke benyttes visuel observation.

Ledis et al., USA patent nr. 4 286 963 beskriver et reagens, der består af (a) mindst ét langkædet alkyltrime-35 thyl kvaternært ammoniumsalt, såsom hexadecyltrimethylam-moniumbromid, og (b) mindst ét additiv udvalgt af (i) en kortkædet alkanol, der er substitueret med phenyl eller 4

DK 165713B

phenoxy, såsom 2-phenoxyethanol og (ii) en polyhydroxy-forbindelse, såsom sorbitol, til at lysere erythrocyter, således at en differentiel bestemmelse af lymfoide og myeloide populationer af leukocyter kan udføres.

5

Hovedparten af den kendte teknik for denne differentiation kræver således præparationer og anvendelse af farvestoffer eller benytter lyse alene af erythrocyter. Nogle kræver komplekse instrumenter. I øvrigt er beskrevet dif-10 ferentiation af hele celler hvad enten de er farvede eller ufarvede, meget afhængig af subjektiv karakterisa-tion. I litteraturen beskrives ingen steder en pålidelig metode til samtidig bestemmelse af akkurat basophil-tæl-ning og en lobularitetsindeks af den samme prøve af be-15 handlet blod og i fraværelse af et farvestof.

Groner et al, Blood Cells, 6:141-157 (1980) behandler differentiation af underklasser af leukocyter under anvendelse af optisk spredning, farvningsegenskaber og 20 andre teknikker. Begrebet "venstre-forskydning" er nævnt, hvilket refererer til en tilbøjelighed af neutrophil population mod mere umodne og mindre lobulerede former. En skarp forandring af brydningsforhold blev skabt ved kernegrænsen ved behandling af fuldblodsprøver med et kraf-25 tigt kationisk detergent og maleinsyre. Som et resultat heraf blev erythrocyter lyseret, hovedparten af cytoplasma i leukocyterne blev udtrukket, og kernerne skrumpede noget. Fra diskussionen i denne reference fremgår det, at leukocyt-membranerne ikke er bristet eller lyseret (som 30 nævnt ved referencen for erythrocyter), leukocyt-cyto-plasma var ikke fuldstændig (kun hovedsageligt) strippet, idet der var efterladt enheder, som forringer den tilsyneladende form af kernen, og til slut er der ingen omtale af differentiation af effekten af denne behandling mellem 35 en leukocyt-underklasse og en hver anden.

5

DK 165713B

Den foreliggende opfindelse afviger fra den ovenfor beskrevne kendte teknik derved, at der tilvejebringes en præcis karakterisation af kerne-morphologien (lobulariteten) og at der differentieres blandt underklasser af 5 PMNs, baseret på cytoplasmisk-stripning af visse underklasser og ikke af andre. Reagenset fjerner selektivt cytoplasma fra visse klasser af hvide blodlegemer og ikke fra andre. Nærmere betegnet forårsager midlet ifølge opfindelsen fjernelse af cytoplasma fra lymfocyter, monocy-10 ter, eosinophiler og neutrophiler, men ikke fra basophi-ler. Således bliver basophiler differentieret fra andre PMN-underklasser ved deres tilbageholdelse af granuler og cytoplasmisk membran. Da de nucleerede røde blodlegemer detekteres, tillader opfindelsen yderligere deres kvanti-15 tative bestemmelse. Også isolerede kerner kan detekteres individuelt.

Den potentielle fejl, som stammer fra cytoplasmiske enheder, der er knyttet til kernerne i alle andre blodlege-20 mer end basophiler, således at den tilsyneladende form af kernen ændres, undgås ved fuldstændig stripning af cyto-plasma-materiale fra kernerne ved hjælp af reagenset ifølge opfindelsen. Således kan differentiering af bristede celler, nucleerede erythrocyter og de forskellige 25 modningstrin af neutrophiler, baseret på deres nucleære morfologi, udføres med sikkerhed. En væsentlig fordel består deri, at reagenset og metoden totalt undgår behovet for farvestof-fremstilling og de dermed følgende tilfældigheder af farvningsteknikken. Det omhandlede lyserings-30 reagens kan anvendes manuelt eller i forbindelse med instrumenter .

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til identificering af underklasser af leukocyter af den i indlednin-35 gen til krav 1 angivne art, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte. En blodprøve behandles til stripning af cellemembranerne og 6

DK 165713B

cytoplasma fra udvalgte underklasser af leukocyter, og disse underklasser differentieres derefter baseret på deres nucleære morfologi. Specielt bliver membranen og cytoplasma fuldstændigt strippet fra alle underklasser af 5 leukocyter, der er forskellig fra basophiler.

Lyseringsreagenset ifølge opfindelsen til differentiering af hvide blodlegemer i en blodprøve, således som angivet i krav 9, omfatter mindst ét vandopløseligt overfladeak- 10 tivt stof og mindst én fortyndet syre, der er effektiv til at strippe cellemembraner og cytoplasma for udvalgte underklasser af hvide blodlegemer og ikke af andre og har en pH-værdi mellem 1,8 og 2,3. Det overfladeaktive stof kan f.eks. være en C^-C,,-alifatisk alkoholether af en 6 16 15 polyalkylenglycol, en kvaternær ammoniumforbindelse med en Cg-C^g-alkylgruppe eller et alkylbenzensulfonat. Syren er fortrinsvis en sulfonsyre, en carboxylsyre eller saltsyre.

20 Opfindelsen skal i det efterfølgende beskrives nærmere ved hjælp af tegningen, hvor fig. ΙΑ - 1E er en to-dimensionel fordelingskurve af spredningsmønsteret for individuelle leukocyter i de ana-25 lyserede cellesuspensioner, idet der anvendes reagenset ifølge opfindelsen, i et strømningscytometer. Hver enkelt leukocyt er repræsenteret ved en sort prik, og hver kurve viser det observerede mønster ved successive trin af reaktionen, udført ved de i eksempel II beskrevne ekspe-30 rimenter, fig. 2 er en to-dimensionel fordelingskurve, som viser fordelingen af basophile tællinger (ikke individuelle celler) ved de i eksempel II beskrevne prøver, fig. 3 er en to-dimensionel fordelingskurve, som viser fordelingen af mononucleære celle-tællinger (ikke indivi- 35

DK 165713 B

7 duelle celler) i prøver, der er undersøgt som beskrevet i eksempel 11, fig. 4 er en to-dimensionel fordelingskurve, som viser 5 fordelingen af polymorfonucleære celle-tællinger (ikke individuelle celler) i prøver, der er undersøgt som beskrevet i eksempel II, fig. 5A - 5B er to-dimensionelle fordelingskurver for en 10 unormal fuldblodsprøve, som vides at indeholde umodne granulocyter, som er opnået under anvendelse af reagenset ifølge opfindelsen og en konventionel metodologi, respektivt, 15 fig. 6A - 6F er en to-dimensionel fordelingskurve, der illustrerer evnen af de angivne kemiske reaktioner til at vise venstre-forskydning sammenlignet med konventionel metodologi, 20 fig· 7A - 7C er to-dimensionelle fordelingskurver af individuelle blodprøver, der er analyseret under anvendelse af reagenset ifølge opfindelsen i et flow-cytometer. De illustrerer resultaterne, som er opnået ved de i fig. III omhandlede eksperimenter på prøver fra en donor med akut 25 myeloblastisk leukæmi, en normal donor og en donor med kronisk lymfocytisk leukæmi, respektivt, fig. 7D - 7F er to-dimensionelle fordelingskurver af de eksempel III udførte eksperimenter til konventionel meto-30 dologi, fig. 8A - 8B er to-dimensionelle fordelingskurver af spredningsmønstre af individuelle leukocyter i cellesuspensioner, der passerer gennem et flow-cytometer under 35 anvendelse af midlet ifølge opfindelsen og et konventio nelt peroxidase-reagens, respektivt, som beskrevet i eksempel IV.

8

DK 165713B

De i det efterfølgende angivne udtryk, som benyttes alene i forbindelse med en enkelt udførelsesform, er eksempler på alle udførelsesformer med mindre andet er angivet.

5 Som ovenfor anført vil lyseringsreagenset ifølge opfindelsen selektivt strippe cytoplasma af visse klasser af hvide blodlegemer og ikke af andre. Lymfocyter, monocy-ter, eosinophiler og neutrophiler strippes for cytoplasma. Dvs. deres membraner og cytoplasma-materialer strip-10 pes fra kernerne, som efterlades uberørt og fri for associeret cytoplasmisk materiale. Således bliver morfologien af deres kerner skarpt defineret. I modsætning til den således opnåede fjernelse af cytoplasma beholder basophi-lerne deres granuler og cytoplasmisk membran.

15

Det omhandlede reagens finder anvendelse ved manuel eller strømnings-cytometrisk identificering af forskellige typer leukocyter. Det beskrevne reagens består af et vandopløseligt overfladeaktivt stof og en fortyndet syre og 20 har en pH-værdi mellem 1,8 og 2,3. Det kan om ønsket også omfatte et antioxidant. Til udførelse af prøven må det overfladeaktive stof og fortyndede syrer være til stede.

Ved udeladelse af én af disse komponenter vil reagenset ikke fungere. Det kæde-afbrydende antioxidant forhindrer 25 oxidativ degradering af det overflade aktive stof, hvilket fører til forhindring af den cytoplasmiske strip-nings-funktion. I fravær af antioxidant vil holdbarheden af midlet være 2 måneder, når det opbevares ved 25 °C.

Når der er antioxidant til stede, vil holdbarheden, være 30 mindst 1 år ved 25 "C. Antioxidanten indvirker iøvrigt ikke på den korrekte funktion af reagenset.

Det vandopløselige overfladeaktive stof skal som nævnt være ikke-kationisk men kan iøvrigt være af vilkårlig 35 art. Ved tilstedeværelse af et sådant stof opnås den ønskede indvirkning på blodlegemerne: komplet lyse af erythrocyter, fjernelse af cytoplasma og celle-eytoplas- 9

DK 165713B

ma-membran for neutrophiler, eosinophiler, lymfocyter og tilbageholdelse af granuler og celle-membraner for baso-philer. Eksempler på egnende overfladeaktive stoffer er følgende: (i) C^-C^g-alifatiske alkoholer af en polyalky-5 lenglycol, fortrinsvis polyoxyethylen eller polyoxypropy-len, såsom brij-35 (ICI America, Wilmington, DE); (ii) Cg-C^g-alifatiske N,N-dialkyl-N-oxider, såsom dodecyl-N,N-dimethylamino-N-oxid; (iii) Cg-C^-alifatiske ammoniumsalte, såsom tetradecylammoniumbromid; (iv) kvaternæ-10 re ammonium-forbindelser med en Cg-C^g-alkylgruppe, såsom cetyltrimethylammoniumbromid eller cetylpyridiniumchlo-rid; (v) alkylbenzensulfonater, såsom natriumdodecylben-zensulfonat og (vi) blandinger deraf.

15 Opfindelsen forudsætter også tilstedeværelse af mindst én fortyndet syre. Eksempler er følgende: (i) organiske sul-fonsyrer, såsom methansulfonsyre eller ethansulfonsyre, (ii) carboxyliske syrer, såsom maleinsyre, phthalsyre, oxalsyre, malonsyre, glycin, dichloreddikesyre og mælke-20 syre, og (iii) blandinger deraf. Det kan også være hensigtsmæssigt at anvende mindst én fortyndet uorganisk syre. Eksempler herpå er saltsyre, hydrobromidsyre, svovlsyre og phosphorsyre. For det foreliggende formål refererer "fortyndet" til koncentrationer på 30 mM eller derun-25 der. Særlig egnet er kombinationer af mineralsyre og carboxylsyre, såsom phthalsyre-HCl.

Reagenset, der anvendes til at analysere prøverne, må have en pH-værdi mellem 1,8 og 2,3. Selv om dette er et 30 snævert pH-område er det en vigtig foranstaltning ifølge opfindelsen. Denne pH-værdi kan opnås alene ved hjælp af den tilsatte syre eller ved tilsætning af yderligere syre.

35 Det omhandlede reagens kan om ønsket yderligere indeholde et kæde-terminerende antioxidant, som vil tilbageholde nedbrydningen af det overfladeaktive middel, som et re- 10

DK 165713B

sultat af autoxidationen og derved forøge holdbarheden. Antioxidantet spalter peroxy-radikaler, som ellers ville deltage i kædereaktioner. Eksempler herpå er de-tert-bu-tyl-4-methylphenol (BHT), p-methoxyphenol (MEHQ) eller 5 di-tert-butyl-4-methoxyphenol (BHA).

Reagenset kan om ønsket omfatte et antimikrobielt præserveringsmiddel, som vil hæmme eller forhindre væksten af forurenende organismer, såsom mugsvampe.

10

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen består reagenset af følgende mængdeforhold: a) overfladeaktivt stof 10 - 20 g/1 15 b) fortyndet syre 0,020 - 0,024 M/l c) kæde-afsluttende antioxidant 0,1 - 0,2 g/1 d) antimikrobielt præserveringsmiddel 0,2 - 0,6 g/1

Det er ønskeligt at kunne kontrollere reaktionshastighe-20 den således, at metoden kan optimeres enten for manuel eller automatiseret drift. Til dette formål består reagenset hensigtsmæssigt af Brij-35, maleinsyre og BHT, som er særlig egnede. Maleinsyre kan benyttes i et koncentrationsområde på 0,025 % - 1 % (0,0022 - 0,085 M). Virknin-25 gen af at ændre maleinsyrekoncentrationen fører til en nettoforøgelse af hastigheden på omkring det ti-dobbelte.

Det nedre koncentrationsområde for maleinsyre er særlig egnet ved manuel mikroskopisk arbejde. Reaktionshastighe-30 den er tilstrækkelig langsom, således at proceduren kan udføres inden for 2 minutter. Derimod vil reaktionshastigheden i det øvre område være i det væsentlige momentan og velegnet til automatiseret instrumental teknik.

35 Ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen har det vist sig, at der ved blanding af fuldblod med en opløsning af overfladeaktivt stof og fortyndet syre vil 11

DK 165713B

ske en sekvens af destruktion af membran og cytoplasma, som begynder med lyse af erythrocyter, uden at efterlade nogen struktur fra erythrocyterne, lyse af plader, som heller ikke efterlader nogen struktur, og stripning af 5 cytoplasma fra leukocyterne, efterladende rene kerner af alle leukocyterne, medens basophile, der i hovedsagen forbliver intakte, er de eneste hele celler, som kan iagttages i den behandlede blodprøve. Leukocytkerner og basophilerne, som beholder deres cytoplasma-membran og 10 granularitet, kan differentieres ved visuel observation eller ved påvisning med instrumenter.

Det foretrækkes at indføre celle-prøven i en væske, der strømmer i et rør eller en analysekanal i et strømnings-15 cytometer. Dette fører fortrinsvis til at etablere en strøm af en overtræksvæske i røret eller analysekanalen, hvorefter prøven indføres i dette strømmende overtræk. En sådan strøm består sædvanligvis af væske med et brydningsforhold, der i det væsentlige er identisk med bryd-20 ningsforholdet for mediet, hvori celleprøven er suspende ret. Et sådant strømnings-cytometer, som benytter en bærevæske i form af en overtræksstrøm, benyttes i systemer af typen Technicon Hemalog D og H-6000, der kan benyttes til alle hematologiske rutineanalyser, detaljeret oplys-25 ning om systemerne af typen Hemalog D og H-6000 kan fås fra Technicon Instruments Corporation, Tarrytown, NY.

Opfindelsen skal i det efterfølgende beskrives nærmere ved hjælp af nogle eksempler, ved hvilke det er muligt at 30 vise, at midlet og metoden ifølge opfindelsen gør det muligt at (a) opnå nøjagtige basophil-tællinger, (b) tilvejebringe en indikation af middel-lap-tællingen eller mængden og styrken af venstre-forskydningen for en given prøve, (c) opnå nøjagtig differentiering af bristede cel-35 ler fra andre mononucleære celler, (d) angive mængde og identificering af nucleerede erythrocyter, og (e) opnå en total tælling af leukocyter. Ved prøverne blev anvendt 12

DK 165713B

kommercielt tilgængelige reagenser, når det var muligt. EKSEMPEL I

5 Manuel differentiering af tælling af leukocyter

En differentiel tælling af leukocyter (WBC) er én af de vigtigste påviselige parametre ved den differentielle diagnose af forskellige sygdomstilstande, især i relation 10 til infektioner og immunologiske forstyrrelser. Ved det i dette eksempel angivne eksperimenter blev det omhandlede middel fremstillet og anvendt til differentiering af ba-sophiler fra alle andre blodlegemer og mononucleære fra polymorfonucleære leukocyter.

15

Midlet ifølge opfindelsen blev fremstillet i 97 ml destilleret vand ved tilsætning af 0,20 g maleinsyre og 3 ml Brij-35 (fremstillet af 30 % vægt/volumen destilleret vand).

20

En 8,0 mikroliter prøve af frisk human fuldblod blev blandet med 500 ^ul af den ovenfor beskrevne komposition.

Efter 1 minut blev en aliquot af den omsatte fuldblodsprøve pipetteret på et rent mikroskopisk præparatglas for 25 observation gennem et mikroskop af typen Nikon ved 40 gange forstørrelse.

Ved mikroskopisk undersøgelse af denne aliquot iagttages, at de erythrocyterne og plader blev spaltet, og alle 30 andre leukocyter end basophiler i prøven blev fuldstændig strippet cytoplasmisk. Den cytoplasmiske membran og gra-nulerne for basophile PMNs var uberørt og forblev intakt.

Der blev også fremstillet præparater af samme art som 35 ovenfor angivet, men uden tilstedeværelse af maleinsyre.

Disse præparater blev anvendt til testning af blodprøver som beskrevet ovenfor, og der blev ikke iagttaget lyse af 13

DK 165713B

blod-komponenterne. Endvidere blev fremstillet kompositioner, hvori maleinsyren var til stede, medens det overfladeaktive stof, Brij-35, blev udeladt. Cellulær klump-ning blev iagttaget under tilsløret iagttagelse af baso-5 philer og af lobularitet af leukocyter. Intet af disse midler var effektive til at fremkalde samme differentiering, som det var muligt ved hjælp af reagenset ifølge opfindelsen.

10 EKSEMPEL II

Automatiseret differentiel tælling af leukocyter

De i dette eksempel omtalte eksperimenter viser anvendel-15 sen af reagenset ifølge opfindelsen til opnåelse af en nøjagtig basophil-tælling. Basophiler, mononucleære eller (umodne granulocyter, lymfocyter og monocyter) og PMNs (neutrophiler og eosinophiler) blev bestemt. De blev sammenlignet (korreleret) med de samme bestemmelser, der er 20 udført med eksisterende teknik under anvendelse af instrument-system af typen H-6000 (Technicon, supra). En bestemmelse af tilstedeværelsen af umodne granuloyter er illustreret. Midlet ifølge opfindelsen blev desuden anvendt til bestemmelse af venstre forskydning, f.eks. for-25 mindskelse af middelneutrophil-lap-tælling.

Der blev fremstillet et reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indeholdende 3,6 g phthal-syre, 10 g Brij-35; 0,1 g BHT; 1,0 ml 1 N HC1; og fortyn-30 des op til 1 liter med destilleret (pH=2,0).

Blodprøver fra hver af en stor gruppe patienter blev undersøgt ved samme prøve-procedure for hver. Hver blodprøve med et rumfang på 8 ^ul blev anbragt i et separat rea-35 gensglas sammen med 500 ^ul af ovennævnte reagens. Efter blanding i 50 sekunder blev reaktionen peristaltisk pumpet gennem et lag af strømmende celler med en strømnings- 14

DK 165713B

hastighed på 0,1 ml/min.

Til bestemmelse af den to-dimensionelle fordeling af celle- for-celle lysspredningsmønster anvendtes et optisk sy-5 stem, bestående af en modificeret RBC/PLT-kanal i et cy-tometrisk instrument af typen Technicon H-6000. Spredning med høj vinkel blev målt langs abscissen, og spredning med lav vinkel blev målt langs ordinal for systemets måleresultat dimarkationslinier for tærskelværdier blev an-10 givet med computer blev fastlagt ved klynge-analyse for at skelne mellem forskellige celletyper, og systemet blev programmeret til at se bort fra alle signaler, som skyldes celle-debris og lignende. En fuldstændig beskrivelse af det optiske system kan fås hos Technicon. Afgangssig-15 nalerne fra dette optiske system blev forstærket og omdannet til et to-dimensionelt fordelingsdiagram. Hver prik repræsenterer de målte koordinater af en enkelt celle.

20 Hver af prøverne, som er taget af en gruppe patienter, blev analyseret ved hjælp af ovennævnte reagens og procedure ifølge opfindelsen. Fig. ΙΑ - 1E repræsenterer reaktionstrin ved den ovennævnte analyseprocedure på en af sådanne prøver fra en normal donor ved forskellige 25 tidsintervaller fra reaktionens begyndelse. Fig. 1A (15 sekunder) viser RBCs og PLTs, som er blevet destrueret (R) og kvældet WBCs (W). Fig. IB (20 - 25 sekunder) viser lymfocyter (L), som har påbegyndt deres cytoplasma og bevæger sig langs Y-aksen mod originalen. I fig. 1C (30 -30 35 sekunder) er nogle granulocyter (G) begyndt at miste deres cytoplasma, og alle lymfocyter (L) er undergået fuldstændig cytoplasmisk stripning. I fig. ID (40 - 45 sekunder) er hovedparten af granulocyter (G) og alle lymfocyter (L) fuldstændig cytoplasmisk strippet og er såle-35 des bevæget til deres endelige X-Y-positioner. Nogle få WBCs (W), hovedsageligt monocyter, forbliver intakt. Fig.

1E (80 sekunder) viser, at alle leukocyter, bortset fra

DK 165713 B

15 basophiler (B), er strippet for deres cytoplasma, kun efterladende rene kerner, og er i deres endelige X-Y-posi-tion. Bestemte klumper af PMNs (P), mononucleære celler (MN), basophiler (B) og cellulært debris (R) er vist.

5

Prøver taget fra gruppen af patienter blev også prøvet ved hjælp af et konventionelt kommercielt tilgængeligt Technicon H-6000 system i overensstemmelse med producentens brugsanvisning. Korrelationen af resultaterne for 10 hver basophil, mononucleær celle (MN) og PMN-klynger er repræsenteret ved henholdsvis fig. 2-4.

Fig. 2 viser en Rumpke-oval placeret på data fra 98 prøver, normal og unormal, sammenlignende fremgangsmåden 15 ifølge opfindelsen over for Technicon H-6000 basophil-kemi for procent basophiler. Denne figur viser den udmærkede overensstemmelse sammen med det faktum, at mere end 95 % af punkterne falder inden for ovalen. En korrelationskoefficient på 0,81 blev observeret.

20

Fig. 3 viser den udmærkede nøjagtighed og korrelation for mononucleære celler (MN) under anvendelse af den angivne kemi for mononucleære celler, indbefattet lymfocyter (L), monocyter (M) og store ufarvede celler (LUC), under an-25 vendelse af Technicon H-6000 peroxidase-kemi. Antallet af prøver blev reduceret til eliminering af unormale (leukæmiske) prøver for at vise, hvor godt metoden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse med normale prøver. En korrelationskoefficient på 0,96 blev iagttaget.

30

Fig. 4 viser den udmærkede nøjagtighed og korrelation for PMNs på de samme rapporterede prøver, idet der anvendtes den angivne kemi (P) og H-6000-systemet, hvilket viser PMNs som neutrophiler (N) og eosinophiler (E). En korre-35 lationskoefficient på 0,97 blev iagttaget.

Fig. 5A og 5B er to-dimensionelle fordelingsdiagrammer

DK 165713 B

16 for en unormal prøve, der vides at indeholde umodne gra-nulocyter fra anvendelse af henholdsvis den angivne kemi og den konventionelle H-6000-system-peroxidasekemi. En tættere klyngepopulation af mononucleære celler er vist 5 på fig. 5A, end man ville vente udfra peroxidase-kemi-lymfocyter, monocyter plus store ikke-farvede celler. Procentmængden af celle-typer, rapporteret ved anvendelse ved hver af de ovennævnte metoder, og observeret manuelt, er angivet i tabel I.

10 TABEL 1

15 Mononucleær PMN Immatur G

Disci. Chem 39,6 % 57,9 % NA

H-6000 31,6 % 67,7 % NA

Manual 33,5 % 59,0 % 7,5 % 20

Den væsentlige forskel i antallet af mononucleære celler, observeret mellem den omhandlede metode og H-6000-meto-den, svarer til antallet af umodne granulocyter, observe-25 ret ved den manuelle metode. Derfor kan prøver indeholdende et væsentligt antal umodne granulocyter adskille fra normale prøver.

En anden fordel ved den angivne kemi, som følge af bevar-30 elsen af alene kernerne af neutrophil, er evnen til at angive tilstedeværelsen af en venstre forskydning (dvs. en formindskelse af den middel-neutrophile-nucleære lap-tælling, forårsaget ved tilstedeværelse af et større antal bånd-celler. Dette er vist ved det forhold, at efter-35 som middel-lap-tællingen mindskes, vil modus for PMN-klynger (P) formindskes. Fig. 6A - 6B viser H-6000-meto-den for tre prøver med stigende bånd-tællinger og falden- 17

DK 165713B

de middel-lap-tællinger. Det kan ses, at disse tre prøver ikke har nogen skelnelig karakteristik til at angive, hvilken prøve som har venstre-forskydning. Fig. 6D - 6F viser samme prøver under anvendelse af den angivne kemi.

5 Det kan ses, at efterhånden som middel-lap-tællingen formindskes er der en tilsvarende formindskelse i modus af PMN-klynge (P). Denne bevægelse til venstre for PMN-klyn-ge-modus tillader den angivne kemi at forudsige tilstedeværelsen af en venstre forskydning. Tabel II viser den 10 manuelle bånd-tælling og den manuelle middel-neutrophil-lap-tælling i forhold til modus for PMN-klynge (P) for disse prøver, der rangerer fra 0-20 bånd-celler og middel-lap-tællinger fra 3,38 ned til 2,31.

15

TABEL II

Manuel Bånd- Manuel middel- * PMN

20 tælling_ lap-tælling modus 0 % (fig. 6D) 3,38 30,5 5 % (fig. 6E) 3,06 27,0 20 % (fig. 6F) 2,31 24,5 25

EKSEMPEL III

De i dette eksempel rapporterede eksperimenter viser an-30 vendeisen af samme reagens og analysemetode ifølge opfindelsen som beskrevet i eksempel II til differentiering af bristede celler fra andre mononucleære celler. En betydningsfuld procentmængde af store ikke-farvede celler, som observeres ved hjælp af H-6000-system-peroxidase-ke-35 mi, har vist sig at skyldes tilstedeværelsen af unormale mononucleære celler. Sådanne metoder har ikke været i stand til at identificere disse som enten bristede celler 18

DK 165713B

eller atypiske lymfocyter.

Fuldblodsprøver blev opnået fra en donor med akut myelo-blastisk leukæmi (prøve A), en normal donor (prøve B) og 5 en donor med kronisk lyrafocytisk leukæmi (prøve C). Mønsteret for celle-klynger for hver ved analyse ved hjælp af reagenset ifølge opfindelsen er illustreret ved fig.

7A - 7C, respektivt.

10 Endnu en aliquot af hver af disse samme tre prøver blev farvet for peroxidase-aktivitet og analyseret under anvendelse af konventionelle peroxidase-reagenser og kanal på et H-6000-system. Resultaterne er illustreret i fig.

7D - 7F.

15

Fig. 7A og 7C viser begge en væsentlig population af store ikke-farvede celler (LUCs). De er i denne form typiske for tilstedeværelse af unormale mononucleære celler og kan differentieres fra fig. 7B, som angiver den normale 20 populationsfordeling. Fig. 7A og 7C forekommer imidlertid i det væsentlige identiske for hinanden, således at der ikke angives nogen metode til at bestemme, hvorvidt disse forøgede LUC-populationer skyldes en forøgelse af bristede celler, der er typisk for akut myeloblastisk leukæmi 25 eller atypisk lymfocyter, typisk for kronisk lymfocytisk leukæmi. Fig. 7D og 7F viser en væsentlig forskel i positionen af de mononuleære (MN) klynger, som de forekommer langs X-aksen. MN-klyngen i fig. 7D, der har bevæget sig til venstre, mod den oprindelige, indeholder de bristede 30 celler MN-klyngen i fig. 7F forblev derimod i samme position som MN-klyngen i fig. 7E, som stammer fra den normale donor. Ved at placere en fikseret, vertikal bristet tærskelværdi (BT) opnås en nøjagtig sidste procentmængde.

35 Procentmængderne af iagttagende rystede celler ved en manuel metode og den angivne kemi og procentmængde af store ikke-farvede celler ved H-6000-kemi er vist i tabel III.

19

DK 165713B

TABEL III

' % bristede % LUCs 5 Manuel Angivet H-6Q00 22,0 % 23,18 % (fig. 7D) 31,4 % (fig. 7A) 0 % 0,64 % (fig. 7E) 2,3 % (fig. 7B) 0 % 0,17 % (fig. 7F) 41,2 % (fig. 70 10

Det er således vist, at det ved hjælp af midlet ifølge opfindelsen er muligt at skelne mellem bristede celler og atypiske lymfocyter. Dette muliggør en differentiering 15 mellem væsentlige forskellige klasser af leukæmi.

EKSEMPEL IV

Ved det i dette eksempel rapporterede eksperiment anvend-20 tes samme reagens og analysemetode som beskrevet i eksempel II. Til kvantitativ bestemmelse af nucleerede ery-throcyter (NRBC) er tilstedeværelsen af umodne, nucleerede erythrocyter i det cirkulerende blod en væsentlig unormal iagttagelse, som hidtil ikke har kunnet bestemmes 25 instrumentelt.

En prøve af fuldblod indeholdende nucleerede erythrocyter blev blandet med reagenset ifølge opfindelsen og analyseret. Resultaterne er vist i fig. 8A. En tæt klynge af 30 celler fremkommer i PMN-regionen (P). Endnu en aliquot af samme prøve blev farvet for peroxidase-aktivitet og analyseret under anvendelse af de konventionelle peroxidase-reagenser og kanal i et H-6000-system. De opnåede resultater er vist i fig. 8B. Kun spredte celler viste sig i 35 det område, hvor neutrophiler, (N) og eeosinophiler (E) sædvanlig forekommer.

DK 165713B

20

Medens den konventionelle peroxidase-metodologi næsten ikke påviser PMNs, kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen påvises en betydelig PMN-population, som viste sig at være nucleerede røde celler, hvilket er bekræftet 5 ved visuel undersøgelse. Dette viste sig at være forskellen mellem de absolutte celler pr. lambda mellem PMN-tællingen under anvendelse af den konventionelle H-6000-systemmetodologi og PMN-tællingen under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10 15 20 25 30 35

Claims

21 DK 165713B Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til identificering af underklasser af 5 leukocyter, hvorved a) en prøve af fuldblod blandes med et lyseringsreagens, og 10 b) de optiske egenskaber af blandingen observeres til opnåelse af en differentiering af underklasser af leukocyter, baseret på deres observerede optiske egenskaber, kendetegnet ved, at der anvendes et lyserings-15 reagens, som består af en vandig opløsning indeholdende mindst ét vandopløseligt ikke-kationisk overfladeaktivt stof og mindst én fortyndet syre til indstilling af pH-værdien på 1,8 - 2,3, og at den optiske observering udføres efter at erythrocyterne er lyseret og cytoplasma og 20 celle-cytoplasmisk membran er strippet fra kerner af neu-trophiler, eosinophiler, lymphocyter og monocyter, medens granulater og celle-cytoplasmisk membran af basophiler er intakte.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den optiske observering består i en måling af lysspredningen fra kernerne og intakte mononucleære og polynucleære celler.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendeteg net ved, at blandingen af blodprøven og lyseringsreagenset føres gennem et begrænset område, hvor den belyses, og det fra hver enkelt celle eller kerne ad gangen tilbagekastede eller spredte lys iagttages. 35

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det ikke-kationiske overfladeaktive middel er en 22 DK 165713B Cg-C^g alifatisk alkohol-ether af en polyoxyethylengly-col.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet 5 ved, at den i lyseringsreagenset indeholdte syre til indstilling af pH-værdien til 1,8 - 2,3 er en mineralsyre, såsom saltsyre.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet 10 ved, at den i lyseringsreagenset indeholdte syre til indstilling af pH-værdien til 1,8 - 2,3 er maleinsyre, phthalsyre, oxalsyre, malonsyre, dichloreddikesyre, mælkesyre eller glycin.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at lyseringsreagenset yderligere indeholder en kæde-terminerende antioxidant.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 20 kendetegnet ved, at lyseringsreagenset yderligere indeholder et antimikrobielt præserveringsmiddel.

9. Lyseringsreagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1-8, kendetegnet ved, 25 at det består af en vandig opløsning indeholdende (i) en vandig opløsning indeholdende et vandopløseligt ikke-kationisk overfladeaktivt stof, fortrinsvis en Cc- 6 C^g alifatisk alkohol-ether af en polyoxyethylenglycol, 30 (ii) mindst én fortyndet syre til indstilling af pH-vær-dien på 1,8 - 2,3, fortrinsvis valgt blandt mineralsyrer, maleinsyre, phthalsyre, oxalsyre, malonsyre, dichloreddikesyre, mælkesyre og glycin, samt 35 (iii) en kædeterminerende antioxidant.