FI93658B - Reagenssi ja sitä käyttävä menetelmä vähintään yhden leukosyyttialapopulaation määrittämiseksi kokoverestä automaattisella virtaussolulaskennalla - Google Patents

Description

93658

Reagenssi ja sitä käyttävä menetelmä vähintään yhden leu-kosyyttialapopulaation määrittämiseksi kokoverestä automaattisella virtaussolulaskennalla 5 Keksintö koskee verenkuvan analyysiä laskemalla ja erottamalla leukosyyttialapopulaatiot toisistaan ja erityisemmin reagenssia ja sitä käyttävää menetelmää vähintään yhden leukosyyttialapopulaation määrittämiseksi vir-taussolulaskentaa käyttämällä.

10 Eri leukosyyttipopulaatioiden tarkan määrittämisen merkitys diagnoosin teossa on tunnustettu pitkään. Todellakin epänormaalien leukosyyttisuhteiden esiintyminen voi korreloida tiettyjen sairauksien (immuunivasteet, tulehdusreaktiot, kasvainten tai leukemioiden esiintyminen 15 jne.) esiintymisen kanssa.

Perinteiset manuaaliset analyysimenetelmät, mukaan lukien erytrosyyttien fysikaalinen erottaminen (sedimentaatiolla tai aggregaatiolla) ja sen jälkeen leukosyyttien sytoplasmojen ja tumien erittelevä värjääminen ja niiden 20 morfologian tarkkailu mikroskoopilla, tekivät jo mahdolliseksi kaiken tyyppisten leukosyyttien eli granulosyyttien (basofiilit, eosinofiilit ja neutrofiilit) ja agranulo-syyttien (monosyytti ja lymfosyytti) tunnistamisen. Nämä menetelmät antavat luotettavia tuloksia, mutta ne ovat 25 pitkiä, minkä vuoksi ne ovat harvoin tai vain vaivoin siirrettävissä automaattisia laitteita käyttäviin määrityksiin.

Markkinoilla on jo erilaisia laitteita, jotka tekevät mahdolliseksi leukosyyttipopulaatioiden automaattisen 30 laskemisen, ja erilaisia reagensseja ja värjäysaineita on kehitetty ja sovitettu tällaisten laitteiden toimintaperiaatteisiin soveltuviksi.

On mahdollista esimerkiksi mitata solujen koot (niiden sytoplasmojen differentiaalisen hajottamisen jäl-35 keen) joko mittaamalla ominaisvastuksen vaihtelut tai 93658 2 mittaamalla valon taipuminen; on mahdollista myös suorittaa eri tyyppisten solujen spesifinen värjäys (entsymaat-tinen tai muunlainen) ja mitata solujen koot ja optiset tiheydet eri aallonpituuksilla.

5 Yksi automaation aiheuttama ongelma on sekaannuksen mahdollisuus erytrosyyttien ja tiettyjen pienikokoisten leukosyyttien välillä, mitä ei esiintynyt mikroskooppitarkastelussa. Siten erytrosyttien täydellinen hajottaminen täytyy varmistaa ennen, kuin verinäyte laitetaan laittee-10 seen, säilyttäen samalla leukosyyttien eheys. Lisäksi re-aktioseoksen on sisällettävä yhtä tai useampaa reagenssia, joka helpottaa erottamista erityyppisten leukosyyttien välillä ja niiden ryhmittelyä selvästi erotettaviin vyöhykkeisiin histogrammilla.

15 W0-patenttijulkaisu 8 505 684 (Coulter Electronics

Inc. ) selittää siten ryhmän reagensseja, jotka varmistavat, kahdessa vaiheessa, erytrosyyttien spesifisen hajottamisen saponiinilla ja sen jälkeen leukosyyttien kiinnit-. tämisen (ja siten suojauksen) glutaraldehydillä. Lisäksi 20 eri leukosyyttityyppien välistä erottelua edistetään lisäämällä reagenssia kuten fenoksi-2-etanolia; tietyt populaatiot voidaan myös värjätä spesifisesti ja tunnistaa fluoresenssin avulla. Tämä tehokas, luotettava, mutta monimutkainen menetelmä on erityisen sopiva Coulter Counter" 25 -tyyppiselle laittelle, kuten on selitetty US-patentt i julkaisussa 3 502 974.

Muut menetelmät, joita on selitetty esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 3 740 143 ja jotka ovat erityisen sopivia TechniconR-laitteelle, käsittävät useita rinnakkain 30 suoritettuja reaktioita, jotka kukin ilmaisevat solutyypin, jolloin näitä erityisiä reaktioita edeltää tai seuraa lisäksi erytrosyyttien hajotuskäsittely ja mahdollisesti leukosyyttien kiinnityskäsittely. Nämä spesifiset reaktiot käsittävät tavanomaisen histologisen värjäyksen (kuten 35 "neutraali punainen" basofiilisille soluille) ja entsy- 93658 3 maattisen värjäyksen (kuten eosinofiili- ja neutrofiiliso-lujen peroksidaasipitoisuuden ilmaiseminen käyttämällä kloorinaftolia tai monosyyttien lipaasipitoisuuden ilmaiseminen naftolibutyraattia käyttämällä).

5 yleisesti ottaen yksityiskohtaiset, luotettavat analyysit voidaan suorittaa vain käyttämällä erittäin monimutkaisia laitteita ja menetelmiä, jotka käsittävät useita erilaisia vaiheita, jotka suoritetaan eri reagens-seja käyttämällä. Tällaisten analyysien monimutkaisuudesta 10 johtuen niiden hinta on erittäin korkea, ja rutiinidiag-nooseja varten on aina toivottavaa yksinkertaistaa menetelmä säilyttäen sama erotuskyky ja luotettavuusaste.

Hakija on siten kehittänyt koostumuksen, joka yhdessä reaktiossa tekee mahdolliseksi erytrosyyttien hajot-15 tamisen, leukosyyttien suojaavan kiinnittämisen ja eosino-fiilisten solujen värjäyksen samoin kuin erittäin tehokkaan eri leukosyyttialapopulaatioiden erottamisen histo-grammilla. Keksinnön mukaista koostumusta käyttävä mene-: telmä on erityisen nopea ja se soveltuu erityyppisille 20 automaattisille laskentalaitteille.

Erityisemmin keksinnön mukainen reagenssi sisältää toisaalta vähintään yhtä erytrosyyttiä hajottavaa ainetta, edullisesti saponiinia ja natriumdodekyylisulfaattia (SDS), ja toisaalta ainetta, joka kykenee erittelevästä 25 värjäämään erilaiset leukosyyttipopulaatiot, ja erityises ti kloratsolimustaa pitoisuuden 50 - 650 mg/1. Muita rea-genssin aineosia, jotka on tarkoitettu solujen luonnollisen eheyden ja morfologian säilyttämiseksi ja solujen optisella ilmaisemisella tapahtuvan erottamisen parantami-30 seksi, ovat vähintään yksi fysiologinen suola pH-arvon pitämiseksi välillä 7,0 - 12,0, tertiaarinen tai kvater-naarinen ammoniumsuola, primaarinen, sekundaarinen tai tertiaarinen alkoholi, pinta-aktiivinen aine, solun rakenteen säilyttävä aine ja alkyleeniglykoli. Kloratsolimusta 35 (tunnetaan myös nimillä "Eri£ black" tai "formic black") 4 93658 on tavanomainen reagenssi, jota on köytetty kasvihistolo-giassa vuodesta 1937 lähtien (Cannon, H.G., Nature 139 549), ja sitä käytetään spesifiseen eosinofiilisten solujen värjäykseen mikroskoopilla suoritettavaa tarkkai-5 lua varten. (Tämä reagenssi ja sen käyttömenetelmä on selitetty julkaisuissa M. Piette, Ann. Biol. Clin. 1961, 19, 729 - 734 ja K. Lawrence, Am. J. Clin. Pathol. 1981, 76, 810 - 812).

Tavalliset kloratsolimustan käyttöolosuhteet 10 (650 mg/1) eivät ole lainkaan sopivia automaattisella fo- todiodilaitteella tapahtuvaa ilmaisemista varten, jolloin eosinofiiliset solut ovat aivan liian mustia ja muut solut näyttävät täysin läpinäkyviltä. On kehitetty uudet käyttö-olosuhteet vähentäen samalla kertaa reagenssipitoisuutta 15 ja nostamalla lämpötilaa, jossa reaktio suoritetaan veri-näyttelle.

Siten keksinnön mukainen reagenssi sisältää edullisesti kloratsolimustapitoisuuden, joka on alle 100 mg/1.

; Hakija on havainnut, että näissä olosuhteissa eosinofiili- ? 20 set solut ovat selvästi värjäytyneitä ja lisäksi muut gra-nulosyytit ovat selvästi kiinnitettyjä ja selvästi erotettavissa. Kaikki leukosyyttipopulaatiot värjäytyvät hieman, mutta se katoaa, jos reaktion kestoa pitkitetään.

Etsiessään parasta tasapainoa reagenssin eri aine-25 osien välillä hakija on huomannut, että glutaraldehydin lisääminen vesiliuoksessa paransi erottelua solukokojen välillä, kun mittaus suoritetaan ominaisvastuksen avulla. Glutaraldehydi lisää kuitenkin erytrosyyttien hajotuksesta johtuvien stroomien kokoa. Tämä seikka voidaan edullisesti 30 korjata lisäämällä SDS:ää, joka nopeuttaa erytrosyyttien hajoamista, pitoisuus, joka ei vahingoita leukosyyttien morfologiaa. Lisäksi tertiaarisen tai kvaternaarisen ammo-niumsuolan lisääminen parantaa edelleen solujen alapopu-laatioiden välistä erottamista ja edistää myös erytrosyyt-35 tistroomien hajoamista. Edullisesti voidaan käyttää dode-

II

93658 5 kyylitrimetyyliammoniumkloridia. Samanlaisia tuloksia saadaan bromideilla ja jodideilla; samalla tavalla voidaan käyttää tertiaarisia tai kvaternaarisia suoloja, joiden edullisia alkyyliradikaaleja ovat C12- ja C14-radikaalit.

5 Siten valitaan dodekyylidimetyyliammoniumhalogeeni tai -trimetyyliammoniumhalogeeni (Cl, Br tai I) tai tetrade-kyylidimetyylianunoniumhalogeeni tai -trimetyyliammoniumhalogeeni, yksin tai yhdistelmänä.

Keksinnön mukainen reagenssi sisältää myös pinta-10 aktiivista ainetta, joka on valittu esimerkiksi polyoksi-etyleenisorbitanestereiden ryhmästä, erityisemmin polyok-sietyleenisorbitanmonolauraattia (Tween 20R) ja polyoksi-etyleenisorbitanmono-oleaattia (Tween 80").

Lisäksi alkyleeniglykolin lisäämisellä, jolla on 15 myös säilyttävä vaikutus solurakenteisiin, on ennen kaikkea edullinen vaikutus optisen mittauksen ollessa kyseessä, koska se rajoittaa väliaineen aiheuttamaa valon taipumista.

• Siten keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan : 20 reagenssi sisältää seuraavia aineosia: saponiinia pitoisuutena 100 - 700 mg/1, SDS:ää pitoisuutena 100 - 400 mg/1, kloratsolimustaa, edullisesti pitoisuutena alle 100 mg/1, 25 fysiologista suolaa tai fysiologisten suolojen seosta, joka sisältää 1,3 - 9,5 g/1 natriumkloridia, 15 -20 g/1 natriumsulfaattia, 400 - 700 mg/1 natriumkarbonaattia, vähintään yhtä tertiääristä tai kvaternaarista am-30 moniumsuolaa, lopullisessa suhteessa 0,03 - 0,10 tila-vuus%, • w primaarista, sekundaarista tai tertiääristä alkoholia ja edullisesti isopropyylialkoholia lopullisessa suhteessa 2-13 tilavuus-%, 93658 6 polyoksietyleenisorbitanesteriä vesiliuoksessa, lopullisessa suhteessa 0,2 - 2 tilavuus-%, glutaraldehydiä tai formaldehydiä vesiliuoksessa, lopullisessa suhteessa 0,1 - 0,8 tilavuus-%, 5 etyleeniglykolia tai propyleeniglykolia, lopulli sessa suhteessa 2-13 tilavuus-%.

Keksintö koskee myös tätä reagenssia käyttävää menetelmää vähintään yhden leukosyyttialapopulaation määrittämiseksi virtaussolulaskenta-analysaattorissa. Keksinnön 10 mukainen menetelmä käsittää tutkittavan verinäytteen saattamisen kosketuksiin reagenssin kanssa termostaatilla säädetyssä kammiossa lämpötilassa 20 - 80 °C ja edullisesti 40 - 65 °C alle 20 sekunnin ajaksi.

Sen jälkeen menetelmä käsittää leukosyyttien ilmai-15 semisen ja niiden välisen erottelun mittaamalla absorbans-sin tai ominaisvastuksen tai näiden kahden yhdistelmän vaihtelut sopivaa analysaattoria käyttäen ja tallettamalla nämä mittaukset matriisien tai histogrammien muodossa, mikä tekee mahdolliseksi leukosyyttialapopulaatioiden ja- 9 : 20 kaumaa edustavien ääriviivojen visuaalisen esittämisen.

Kuvio 1 on esimerkkihistogrammi, joka on saatu suorittamalla keksinnön mukainen menetelmä normaalille verinäytteelle. Alemmassa histogrammissa (identtinen ylemmän histogrammin kanssa) me olemme rajanneet eri populaatioita 25 vastaavat vyöhykkeet: 1) taustakohinaa (stroomat, verihiutaleet, orgaanisten aineiden jätteet) 2) lymfosyytit 3) basofiiliset monitumaiset solut 30 4) monosyytit 5) neutrofiiliset monitumaiset solut 6) eosinofiiliset monitumaiset solut (OD = optinen tiheys, DC = ominaisvastus tasavir- ralla) 93658 7

Seuraava esimerkki kuvaa keksinnön suoritusmuotoa rajoittamatta kuitenkaan sen suoja-alaa.

Esimerkki

Seuraavat eri aineosien pitoisuudet on laskettu 5 yhden reagenssilitran valmistamiseksi: saponiini 650 mg SDS 200 mg kloratsolimusta 65 mg natriumkloridi 5,144 g 10 natriumsulfaatti 17,4 g natriumkarbonaatti 650 mg ammoniumsuola 0,3 ml isopropyylialkoholi 130 ml

Tween 80 13 ml 15 glutaraldehydi 4 ml propyleeniglykoli 130 ml tislattua vettä lopputilavuuden säätämiseksi 1 litraksi.

Reagenssia käytetään esimerkiksi sellaisessa ana-- ; lysaattorissa, joka on selitetty ranskalaisessa patentti- ' 20 hakemuksessa nro 89.14120, joka on hakijan nimissä, mutta sitä voitaisiin käyttää samalla tavalla minkä tahansa muun tyyppisessä laitteessa leukosyyttipopulaatioiden laskemiseksi automaattisesti.

Laite säädetään siten, että 25 μ1:η kokoverinäyte 25 ja 1 ml reagenssia on kosketuksissa keskenään. Tämä seos muodostetaan termostaattisesti säädetyssä kammiossa, lämpötilassa, joka on välillä 40 - 65 eC.

Normaalia verinäytettä edustava histogrammi on esitetty kuviossa 1.

Claims (7)

93658

1. Reagenssi vähintään yhden leukosyyttialapopulaa-tion määrittämiseksi automaattisessa virtaussolulaskenta- 5 analysaattorissa, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavia aineosia: vähintään yhtä erytrosyyttiä hajottavaa ainetta, joka on saponiini tai natriumdodekyylisulfaatti, joko yksin tai yhdistelmänä, jolloin saponiinipitoisuus on 100 -10 700 mg litrassa reagenssia, ja/tai natriumdodekyylisul- faattipitoisuus on 100 - 400 mg litrassa reagenssia, kloratsolimustaa 50 - 650 mg litrassa reagenssia, vähintään yhtä fysiologista suolaa, kuten natrium-kloridi, natriumsulfaatti tai natriumkarbonaatti, yksin 15 tai yhdistelmänä, pH-arvon pitämiseksi välillä 7,0 - 12,0, vähintään yhtä tertiääristä tai kvaternaarista am-moniumsuolaa lopullisessa suhteessa 0,03 - 0,10 % reagens-sin tilavuudesta, : alkoholia, joka on valittu primaaristen, sekundaa- 20 risten tai tertiaaristen alkoholien joukosta ja jonka lopullinen suhde on 2 - 13 % reagenssin tilavuudesta, pinta-aktiivista ainetta, joka on polyoksietyleeni-sorbitanesteri vesiliuoksessa ja jonka lopullinen suhde on 0,2 - 2 % reagenssin tilavuudesta, 25 säilytysainetta, joka on valittu glutaraldehydistä ja formaldehydistä, vesiliuoksessa, ja jonka lopullinen suhde on 0,1 - 0,8 % reagenssin painosta, alkyleeniglykolia, joka on etyleeniglykoli tai pro-pyleeniglykoli ja jonka lopullinen suhde on 2 - 13 % rea-30 genssin painosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että kloratsolimustapitoisuus on alle 100 mg/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen reagenssi, 35 tunnettu siitä, että natriumkloridipitoisuus on 1,3 - 9,5 g litrassa reagenssia. g 2 £ c o /JUJU

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että natriumsulfaattipitoisuus on 15 - 20 g litrassa reagenssia.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen reagenssi, 5 tunnettu siitä, että natriumkarbonaattipitoisuus on 400 - 700 mg litrassa reagenssia.

6. Menetelmä vähintään yhden leukosyyttialapopulaa-tion määrittämiseksi automaattisessa virtaussolulaskenta-analysaattorissa, tunnettu siitä, että 10 verinäyte saatetaan kosketukseen jonkin patentti vaatimuksista 1-5 mukaisen reagenssin kanssa termostaatilla säädetyssä kammiossa, eri leukosyytit ilmaistaan ja erotellaan mittaamalla ominaisvastuksen tai absorbanssin tai näiden kahden 15 yhdistelmän vaihtelut, mittaukset talletetaan matriisien tai histogrammien muodossa, mikä tekee mahdolliseksi leukosyyttialapopulaa-tioiden jakaumaa edustavien ääriviivojen visuaalisen esit-: tämisen.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veri saatetaan kosketukseen reagenssin kanssa lämpötilassa 20 - 80 °C ja alle 20 sekunnin ajan. m 93658