PT95928B

PT95928B - Processo para a preparacao de um regente utilizado na determinacao automatica, em citometria de fluxo, de, pelo menos, uma subpopulacao leucocitaria a partir de sangue total

Info

Publication number: PT95928B
Application number: PT95928A
Authority: PT
Inventors: Didier Lefevre; Henri Champseix; Nadine Voltas
Original assignee: Abx Sa
Priority date: 1989-11-20
Filing date: 1990-11-19
Publication date: 1998-01-30
Also published as: ATE117803T1; DE69016377D1; NO180787C; NO180787B; JPH03266999A; US5232857A; JP2920690B2; GR3015847T3; NO904963D0; AU634600B2; PT95928A; DK0430750T3; FI905725A; DE69016377T2; ZA909212B; IE904163A1; IE65785B1; FR2654744A1; EP0430750A1; FR2654744B1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM REAGENTE UTILIZADO NA

DETERMINAÇÃO AUTOMÃTICA EM CITOMETRIA DE FLUXO, DE,

PELO MENOS, UMA SUBPOPULAÇÃO LEUCOCITÁRIA A PARTIR

DE SANGUE TOTAL

I

A presente invenção tem por objecto a análise de fórmulas sanguíneas para contagem e discriminação de subpopulações leucocitãrias e diz respeito, mais particularmente, a um reagente e a um método de utilização deste para a determinação, em citometria de fluxo, de pelo menos uma subpopulação leucocitãria.

A importância do diagnóstico na determinação exacta das diferentes populações leucocitãrias ê desde há muito reconhecida. Com efeito, o aparecimento de relatórios leucocitãrios anormais pode ser relacionado com o aparecimento de certas doenças (reacções imunitárias, reacções inflamatórias, aparecimento de neopla sias ou de leucémias...).

Os métodos tradicionais de análise manual incluem uma separação física dos eritrócitos (por sedimentação ou agregação) depois de colorações diferenciais dos citoplasmas e dos núcleos dos leucócitos e da sua observação morfológica ao microscópio, permitindo logo identificar todos os tipos de leucócitos, isto é, os granulõcitos (basõfilos, eosinófilos e neutrõfilos) e os agranulócitos (mo nócitos e linfõcitos). Os métodos dão resultados fiáveis mas a sua realização é morosa, o que os torna rara e dificilmente transponíveis para as determinações em aparelhos automáticos.

-2Estão jã comercializados os diferentes aparelhos que permitem a contagem automática das populações leucocitárias e foram aperfeiçoados diversos reagentes e corantes e adaptados aos princípios de funcionamento destes aparelhos.

Assim, pode-se medir as dimensões das células (após lise diferencial do seu citoplasma), quer por medida das variações da resistividade quer por medida de difracção õptica; podem-se também efectuar colorações (enzimáticas ou não) específicas dos dife rentes tipos de células e medir os seus tamanhos e densidades ópti, cas a diferentes comprimentos de onda.

Um dos problemas postos pela automatização é a possível confusão entre os eritrócitos; e certos leucócitos de pequena dimensão, situação que não aparece ã observação microscópica. É preciso pois assegurar a lise total dos eritrócitos antes da passagem da amostra de sangue no aparelho, preservando a integridade dos leucócitos. Além disso, a mistura reaccional deve conter um ou mais reagentes que facilitarão a discriminação dos diferentes tipos de leucócitos e seu reagrupamento em zonas bem distintas sobre um histograma.

Assim, a patente de invenção WO 8505684 (Coulter Electronics Inc.) descreve um conjunto de reagentes que garantem, em duas etapas, uma lise específica dos eritrócitos pela saponina, depois uma fixação (e devido a esta uma protecção) dos leucócitos pelo glutaraldeído. Além disso, a discriminação de diferentes tipos de leucócitos é favorecida pela adição de um reagente como o 2-fenoxi-etanol; certas populações podem ainda ser coradas específica3-/

mente e identificadas por fluorescência. Este processo eficaz é de confiança mas complexo está partieularmente adaptado a um apa relho do tipo Coulter Counter® tal como descrito na patente de invenção norte-americana n° 3 502 974.

Outros métodos, descritos, por exemplo, na patente de in venção norte-americana ns 3 740 143, partieularmente adaptados pa ra os aparelhos Technicorf', põem em jogo várias reacções efectuadas em paralelo, revelando cada uma um tipo celular, sendo estas reacções específicas, por outro lado, precedidas ou seguidas de tratamento de lise dos eritrócidos e, eventualmente, de um tratamento de fixação dos leucócitos. As reacções específicas incluem colorações histológicas clássicas (como o vermelho neutro para os basófilos) e colorações enzimãticas (como a revelação do teor de peroxidases dos eosinõfilos e dos neutrófilos pelo cloronaftol e do teor de lipases dos monõcitos pelo butirato de naftol).

De um modo geral, as análises pormenorizadas e de confian ça são realizadas apenas com o auxílio de aparelhos muito complexos e por métodos que incluem várias etapas sucessivas, efectuadas com reagentes diferentes.

A sua complexidade torna o custo destas análises muito alto e para os diagnósticos de rotina é sempre desejável simplifi car o processo, embora assegurando o mesmo poder de discriminação e o mesmo grau de fiabilidade.

Assim, a requerente estabeleceu uma composição que permite, numa única reacção, efectuar a lise dos eritrócitos, a fixação-pro tecção dos leucócitos e a coloração dos'eosinófilos e assegurar uma boa separação das diferentes subpopulações leucocitãrias so bre um histograma. 0 modo de utilização da composição de acordo com a presente invenção é particularmente rápido e adaptado a qual, quer aparelho de contagem automática.

Mais particularmente, o reagente de acordo com a presente invenção inclui, por um lado, pelo menos um agente de lise dos eri trócidos e, de preferência, uma saponina e dodecilsulfato de sódio (SDS), e, por outro lado, um agente capaz de corar diferencialmente as diversas populações leucocitãrias e, em particular, o negro de clorasol numa concentração compreendida entre 50 e 650 mg/1.

Os outros constituintes do reagente que são destinados a preservar a integridade da morfologia celular natural e aperfeiçoar a sua discriminação por detecção óptica, inclui pelo menos um sal fisiológico para manter o pH compreendido entre 7 e 12,0, um sal de amónio terciário ou quaternário, um álcool primário, secundário ou terciário, um agente tensioactivo, um agente que preserva as es truturas celulares e um alquilenoglicol.

negro de clorasol, também designado por negro de Erié ou negro fõrmico, ê um reagente clássico utilizado desde 1937 em histologia vegetal (Cannon, H. G., Nature, 139, 549) e utilizado para a coloração específica dos eosinófilos para observação micro_s cõpica (este reagente e a sua forma de utilização estãzo descritos por M. Piette, Ann. Biol. Clin., 19 (1961) 729-734, e por K. Lawrence, Am. J. Clin. Pathol., 76 (1981) 810-812.

As condições habituais de utilização do negro de clorasol (650 mg/1) não estão totalmente adaptadas a uma detecção em apare, lho automático com fotodiodo os eosinófilos ficando demasiado escuros e as outras células aparecendo totalmente transparentes. Es. tabeleceram-se novas condições de utilização, simultaneamente, di. minuindo a concentração do reagente e aumentando a temperatura à qual a reacção se efectua sobre aamostra de sangue.

Assim, o reagente de acordo com a presente invenção contém, de preferência, uma concentração de negro de clorasol inferior a 100 mg/1. A Requerente observou que, nestas condições, os eosinófilos ficam com uma coloração nítida e, por outro lado, os outros granulócitos são fixados e discriminados distintamente.

Uma coloração ligeira de todas as populações leucocitárias fixa-se mas desaparece se se prolongar o tempo de reacção.

Procurando um melhor equilíbrio dos diversos constituintes dos reagentes, a Requerente constactou que a adição de glutaraldei. do em solução aquosa melhorava a distinção dos tamanhos das células, quando se fazia a sua medição por resistividade. Todavia, o glutaraldeído aumenta o tamanho dos estromas resultando na lise dos eritrócitos. Esta situação é corrigida vantajosamente mediante a adição de SDS que acelera a destruição dos eritrócitos, em concentrações que não alteram a morfologia dos leucócitos. Por ou tro lado, a adição de um sal de amónio terciário ou quaternário melhora ainda a discriminação entre as subpopulações celulares e participa igualmente da destruição dos estromas eritrocitãrios. Utilizar-se-ã com vantagem o cloreto de dodeciltrimetilamónio. Obtêm-se resultados equivalentes com os brometos e os iodetos;

também se podem utilizar os sais terciários ou quaternários cujos radicais alquilo preferidos são C₁₂ e C₁₄· Assim, escolher-se-á um halogeneto (cloro, bromo ou iodo) de dodecildi(ou tri)metilamõnio ou um tetradecildi(ou tri)metilamónio só ou em associação.

reagente de acordo com a presente invenção contém igualmente um agente tensioactivo escolhido, por exemplo na família dos'ésteres de polioxietileno-sorbitano e, mais particularmente, o monolaurato de polioxietileno-sorbitano (Tween 20®) e o monooleato de poli^ oxietileno-sorbitano (Tween 80®) .

Por outro lado, a adição de um alquilenoglicol que exerce igualmente um efeito que preserva as estruturas celulares, deu um efeito favorável à leitura óptica, limitando a difracção do meio.

Assim, segundo um modo preferido de realização desta inven ção, o reagente inclui os componentes seguintes:

- uma saponina com uma concentração compreendida entre 100 e 700 mg/1 ;

SDS, com uma concentração compreendida entre 100 e 400 mg/1: negro de clorasol, de preferência numa concentração inferior a 100 mg/l;

um sal ou uma mistura de sais fisiológicos incluindo 1,3 a 9,5 g/1 de cloreto de sódio, 15 a 20 g/1 de sulfato de sódio, 400 a 700 mg/1 de carbonato de sódio;

- pelo menos um sal de amónio terciário ou quaternário, com uma relação final de 0,03 a 0,10% em volume;

- um álcool primário, secundário ou terciãrioe, de preferência,

um álcool isopropílico numa relação final entre 2 e 13% em vo lume;

um éster de polioxietileno-sorbitano em solução aquosa, numa re lação final compreendida entre 0,2 e 2% em volume; glutaraldeído ou formaldeído em solução aquosa numa relação fi nal compreendida entre 0,1 e 0,8% em volume;

etilenoglicol ou propilenoglicol numa relação final compreendi da entre 2 e 13% em volume..

A presente invenção também diz respeito a um método de utilização deste reagente para a determinação num aparelho de me dição automática de citometria de fluxo de pelo menos uma subpopu lação leucocitãria. O método de acordo com a presente invenção con siste em pôr em contacto a amostra de sangue a estudar e o reagente, num recinto termoestatizado, a uma temperatura compreendida entre 20° e 80°C e, de preferência, entre 40° e 65°C, durante um tempo inferior a 20 segundos.

método inclui em seguida a detecção e a discriminação dos leucócitos por medição das variações da abservância ou da resistência ou da associação destas duas, mediante um aparelho de detecção apropriado e registo destas medições sob a forma de matr_i zes ou de histogramas permitindo visualizar os contornos representativos da distribuição das subpopulações leucocitãrias.

A figura 1 representa um histograma obtido na execução do método da presente invenção, sobre uma amostra de sangue normal.

No histograma inferior (idêntico ao histograma inferior) delimitaram-se zonas correspondentes às diferentes populações:

- mancha de fundo (estromas, plaquetas e resíduos)

- linfócitos

- polinucleares basófilos

- monócitos

- polinucleares neutrófilos

- polinucleares eosinófilos (DO=densidade óptica; DC=resistividade em corrente contínua) exemplo seguinte ilustra um modo de realização da presen te invenção nem todavia restringir o seu âmbito.

Exemplo

As concentrações seguintes dos diversos componentes são calculadas para a preparação de 1 litro de reagente:

- saponina 650 mg

- SDS 200 mg

- negro de clorasol 65 mg

- cloreto de sódio 5,144 g

- sulfato de sódio 17,4 g

- carbonato de sódio 650 mg

- sal de amónio 0,3 ml

- álcool isopropílico 130 ml

- Tween 80 13 ml

- glutaraldeído 4 ml

- propilenoglicol 130 ml

- ãgua destilada, até perfazer o volume final de 1 litro.

reagente é utilizado, por exemplo, num aparelho de detecção como o descrito no pedido de patente de invenção francesa nQ 89.14120 em nome da Requerente mas pode, do mesmo modo, ser utilizado em qualquer tipo de contador automático de populações leucocitárias.

aparelho é regulado para pôr em contacto uma amostra de 25^il de sangue total e 1 ml de reagente. Esta mistura é realizada num recinto termoestatizado a uma temperatura compreendida en tre 40° e 65°C.

O histograma representativo de uma amostra de sangue normal apresenta-se na figura 1.

Z -10-

Claims

REIVINDICAÇÕES

1,- Processo para a preparação de um reagente utiliza do na determinação automática, em citometria de fluxo, de, pelo menos, uma subpopulação leucocitária, caracterizado pelo facto de se misturar:

pelo menos, um agente capaz de provocar a lise de eritrócitos;

negro de clorazol;

pelo menos um sal fisiológico;

- pelo menos um sal de amónio terciário ou quaternã rio;

um álcool;

,r
2 -11-

- um agente tensioactivo;

um agente conservante;

- um alquilenoglicol.

2. - Processo .de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente capaz de provocar a lise de eritrócitos ser um composto escolhido entre as.saponinas e o dodecilsulfato de sódio·, só .ou em associação.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se utilizar uma saponina em uma concen tração compreendida entre 100 e 700 mg por litro de reagente.
4. - Processo de acordo.com a reivindicação. 2, caracterizado pelo facto de se utilizar .o dodecilsulfato de sódio em uma concentração compreendida entre 100 e 400 mg por litro de reagente.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se utilizar o Negro de clorazol em uma concentração compreendida entre 50 e 650 mg por litro de reagente.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se utilizar o Negro de clorazol em uma

-12'^Γ- concentração inferior a 100 mg/1.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se utilizar um sal fisiológico escolhido entre o cloreto de sódio, o sulfato de sódio ou o carbonato de sódio, só ou em associação, para manter um pH compreendido entre 7,-0 e 12,0.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se utilizar o cloreto ..de sódio em uma concentração compreendida entre 1,3 e 9,5 g. por litro de rea gente.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se. utilizar o. sulfato de sódio em uma concentração compreendida, entre 15 e 20 g por litro de reagen te.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 7, carac terizado pelo facto de se utilizar o carbonato de sódio em uma concentração compreendida entre 400 e 700 mg por litro de rea gente.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de se utilizar, pe-13- lo menos, un sal de amónio terciário ou quaternário em uma pro porção final de 0,03 a 0,10% do volume do reagente.
12. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 11, caracterizado pelo facto de se utilizar um álcool escolhido entre álcoois primários, secundários ou terciários em uma proporção final de 2 a 13% do volume do reagente.
13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se utilizar como agente tensioactivo um éster de polioxietileno-sorbitano em so lução aquosa em uma proporção final de 0,2 a 2% do volume do reagente.
14.- Processo de acordo com uma. qualquer das reivindi cações 1 a 13, caracterizado pelo facto de se utilizar como agente conservante ou o glutaraldeído ou o formaldeído, em solução aquosa, em uma proporção final de 0,1 a 0,8% do volume do reagente.
15.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi. cações 1 a 14, caracterizado pelo facto de se escolher o alqui ienoglicol entre o etilenoglicol ou o propilenoglicol, em uma proporção final de 2 a 13% do volume do reagente.
16.- Método para a determinação automática, em citometria de fluxo, de, pelo menos, uma subpopulação leucocitãria, caracterizado pelo factor de se fazer reagir uma amostra de sangue com o rea gente preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, num recipiente termostatizado;

de se detectarem e discriminarem os leucócitos medindo as variações de resistividade ou de absorvência ou a associação dos dois parâmetros, e

- de se registarem os resultados obtidos sob a forma de matrizes ou de histogramas que permitem visualizar contornos representativos da distribuição de subpopulações leucocitárias.
17.- Método de acordo., com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se fazer contactar o sangue com o reagente a uma temperatura compreendida entre 20°. e 80°C durante menos de 20 segundos.
19 de Novembro de 1990