DE3806556A1 - Verfahren und vorrichtung zur schnellen bestimmung der spermienanzahl in spermaproben und/oder des anteiles der lebenden spermien sowie verwendung von propidiumjodid - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur schnellen bestimmung der spermienanzahl in spermaproben und/oder des anteiles der lebenden spermien sowie verwendung von propidiumjodid

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vor­ richtung zur schnellen Bestimmung der Spermienanzahl (An­ zahl der Samenzellen) in Spermaproben und/oder des Antei­ les der lebenden Spermien (Samenzellen) sowie die Verwen­ dung von Propidiumjodid.
Unter den Bedingungen der modernen Landwirtschaft hat für die Tierzucht unter dem Gesichtspunkt der künst­ lichen Befruchtung und der Spermaerzeugung die Forschungs­ arbeit in Zusammenhang mit Sperma stark an Bedeutung ge­ wonnen. Zahlreiche Forschungsprogramme befassen sich mit der Ausarbeitung objektiver Bewertungskriterien für Sper­ ma, darunter auch mit der Ausarbeitung von Verfahren, mit denen die biologische Verwendbarkeit des Spermas in der Praxis vorausgesagt werden kann.
Neben den klassischen Färbetechniken stehen heute be­ reits zahlreiche andere Verfahren, mit denen sehr feine Unterschiede in den qualitativen, morphologischen, physio­ logischen und biochemischen Merkmalen erkannt werden kön­ nen, zur Verfügung. Hier sind die Elektronenmikroskopie (Bedford, J. M.: Am. J. Anat. 123 [1968], 329; Saacke: J. Amin. Sci. 115 [1964], 143, die enzymologishe Ana­ lyse (Acta Vet. Scand. 17 [1976], 83) und die auf der An­ wendung der Lasertechnik beruhenden Verfahren [Magyar Allatorvosok Lapja 38 [1983], 38; Biophys. J. 31 [1983], 147) zu erwähnen.
Im Sperma liegen die Samenzellen in unterschiedlichen biologischen Zuständen vor, und das Mengenverhältnis die­ ser Unterpopulation zueinander ist für die Befruchtung von entscheidender Bedeutung.
Zur Feststellung der Konzentration lebender Samen­ zellen, ihrer Beweglichkeit und auf dieser Basis zur Schätzung des Anteils an lebenden Samenzellen ist auch heute noch die mikroskopische Untersuchung das am ver­ breitetsten angewandte Routineverfahren: Die bei ent­ sprechender Vergrößerung im Gesichtsfeld erscheinenden Spermien werden beobachtet, und auf Grund ihrer Bewegung wird die biologische Verwendbarkeit des Spermas subjek­ tiv eingeschätzt. Dieses Verfahren ist ungenau, ihr Feh­ ler beträgt etwa 25% (Techn. Conf. Art. Ins. Reprod. Proc. [1973], S. 3).
Die Qualitätsbestimmung kann durch unterschiedliche Anfärbetechniken ergänzt werden, und zwar sind durch eine sogenannte vitale Färbung die lebenden Samenzellen von den leblosen unterscheidbar, da der verwendete Farb­ stoff von den lebenden Zellen nicht aufgenommen wird. Die Ungenauigkeit dieses Verfahrens wird dadurch verur­ sacht, daß die aus vielen Millionen Zellen bestehende Zellenpopulation auf Grund der Untersuchung von einigen hundert Zellen beurteilt wird. Das Verfahren ist zeit­ aufwendig und kann in die Aufarbeitungstechnologie nicht eingegliedert werden.
Bekannt ist auch ein Verfahren, bei dem die Sperma­ probe mit dem monochromatischen Licht eines He-Ne-Lasers durchleuchtet wird. Das von den Kopfenden der Samenzel­ len gestreute Licht enthält eine Komponente, deren Fre­ quenz in Abhängigkeit von der Bewegungsgeschwindigkeit der Spermien moduliert wurde; durch Auswertung des Dopp­ lersignals kann auf die Geschwindigkeitsverteilung der Samenzellen geschlossen werden. Dieses Verfahren ist auch zur Bestimmung der Spermienkonzentration geeignet [eine derartige Vorrichtung (genannt LAZYMOT) zur Untersuchung der Motilität wird zum Beispiel von der BTG Biotechnik GmbH in Mönchengladbach, BRD, hergestellt).
Die bekannten Verfahren sind zum Teil zum Erzielen eines genauen, reproduzierbaren Ergebnisses nicht geeig­ net und zum Teil sind sie derart kompliziert und aufwen­ dig, daß sie in die Betriebstechnologie der Spermaaufar­ beitung keinen Eingang gefunden haben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ver­ fahren und eine Vorrichtung zur schnellen Bestimmung der Spermienanzahl und/oder des Anteiles der lebenden Sper­ mien in Spermaproben, mit welchen die Qualitätsein­ schätzung von Sperma einfach, mit verhältnismäßig gerin­ gem Aufwand und mit einer für die Produktion ausreichen­ den Genauigkeit vorgenommen werden kann, sowie die Ver­ wendung eines Fluoreszenzfarbstoffes zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfin­ dung erreicht.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststel­ lung, daß sich die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstof­ fes Propidiumjodid, zum Beispiel die spektrale Verteilung des ausgesandten Lichtes und der Quantenwirkungsgrad der Fluoreszenz, verändern, wenn der Farbstoff mit Nuclein­ säuren in Wechselwirkung tritt und an diese gebunden wird. Die Bindung der Farbstoffmoleküle an die Nuclein­ säuren äußert sich in einem starken Anstieg der Fluor­ eszenz. Die nicht mehr lebenden Spermien [Samenzellen] haben eine viel durchlässigere (permeablere) Membran als die lebenden Zellen und nehmen deshalb das Propidiumjodid viel schneller auf. Dieses kann nun innerhalb der Zelle von den Nucleinsäuren gebunden werden, wodurch die Inten­ sität der Fluoreszenz - im Vergleich zur Intensität des freien Farbstoffes - ansteigt. Wenn nun dem Ansatz ein Mittel, das auch die Cytoplasmamembran der gesunden Sper­ mien durchlässig macht, das heißt ein permeabilisieren­ des Mittel, zugesetzt wird, dann tritt erneut ein An­ stieg der Intensität ein, und dieser ist der Anzahl sämtlicher Spermien proportional.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur schnellen Bestimmung der Spermienanzahl und/oder des An­ teiles der lebenden Spermien in Spermaproben, welches da­ durch gekennzeichnet ist, daß der Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid in einem Puffer gelöst und die Fluor­ eszenz-Intensität (F 0) gemessen wird, dann die Sperma­ probe zugegeben und die Fluoreszenz-Intensität (F 1) er­ neut gemessen wird, anschließend zur Spermaprobe ein die Cytoplasmamembranen permeabilisierendes Mittel zugegeben und die Fluoreszenz-Intensität (F 2) erneut gemessen wird, dann in einem zweiten Ansatz die Fluoreszenz-Intensität (F 3) des im Puffer gelösten Farbstoffes und des permeabi­ lisierenden Mittels zusammen gemessen und schließlich in einem dritten Ansatz die Fluoreszenz-Intensität des rei­ nen Puffers (F 4) und anschließend die Fluoreszenz-Inten­ sität von Puffer und Sperma zusammen (F 5) gemessen wird und aus den gemessenen Werten die Spermienkonzentration mittels der Gleichung
worin
α ein durch Multiplikation des Steilheits­ tangens der Kalibrationskurve mit dem Grad der Vorverdünnung erhaltener Faktor ist,
und der Anteil der lebenden Spermien mittels der Gleichung
ermittelt wird.
Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren als Propidiumjodidlösung eine solche mit einer Konzentra­ tion von 12,5 bis 25 mg/l verwendet.
Ferner ist es vorteilhaft, als die Cytoplasmamembran permeabilisierendes Mittel Saponin, Digitonin oder Nystatin zu verwenden. Durch diese wird die Membran sämt­ licher Zellen besonders gut durchlässig.
Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Puffer solche mit pH-Werten von 6,7 bis 6,9, wie 6,8, verwendet. Bevorzugte Beispiele für diese sind Phosphatpuffer, wie Na2HPO4/KH2PO4-Puffer, und Puffer auf der Basis des Kaliumsalzes von N-[2-(Hydroxy)- äthyl]-piperazin-N′-[2′-(äthan)-sulfonsäure], wie Hepes- Puffer. Vergleiche beispielsweise N. E. Good und Mit­ arbeiter, Biochemistry 5 [1966], Seiten 467 bis 477.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wel­ che dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Lichtquelle, eine an diese angeschlossene Küvettenhaltereinheit mit einer das Licht der Lichtquelle nach dem Ausfiltern des entsprechenden Spektralbereiches auf die in einem ther­ mostatisierbaren Küvettenhalter befindliche Probe rich­ tende zwei Linsen und ein optisches Filter aufweisen­ den Eingangsoptik und mit einer zwei Linsen und ein op­ tisches Filter aufweisenden Ausgangsoptik, deren opti­ sche Achse senkrecht auf die optische Achse der Eingangs­ optik steht, sowie einen die Emission der im Küvetten­ halter befindlichen Probe nachweisenden Lichtdetektor, auf welchen das Licht der zwei Linsen der Ausgangsoptik der Küvettenhaltereinheit gerichtet ist, eine den Licht­ detektor speisende Hochspannungsspeiseeinheit und eine die Signale des Lichtdetektors verarbeitende Elektro­ nik aufweist.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden beispiel­ haften Darlegungen in Verbindung mit den Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt
Fig. 1 eine Ausführungsform der erfindungsge­ mäßen Vorrichtung in schematischer Dar­ stellung,
Fig. 2 eine Kalibrationskurve für Ebersperma und
Fig. 3 eine Kalibrationskurve für Bullensperma.
In Fig. 1 ist eine Hochspannungsspeiseeinheit 9 in einen Lichtdetektor 8, den sie speist, angeschlossen. Dieser Lichtdetektor 8 ist seinerseits mit einer Elek­ tronik 10, welche die Signale des Lichtdetektors 8 ver­ arbeitet, verbunden. Der Lichtdetektor 8 weist die Emis­ sion einer in einem thermostatisierbaren Küvettenhal­ ter 2 einer Küvettenhaltereinheit 1 befindlichen Pro­ be 11 nach. Zwischen dem Lichtdetektor 8 und dem Kü­ vettenhalter 2 ist in der Küvettenhaltereinheit 1 eine Ausgangsoptik mit Licht auf den Lichtdetektor 8 rich­ tenden zwei Linsen 6 und einem optischen Filter 7 an­ geordnet. Senkrecht auf die optische Achse der Ausgangs­ optik ist ebenfalls in der Küvettenhaltereinheit 1 eine Eingangsoptik mit zwei Linsen 3 und einem optischen Fil­ ter 4 angeordnet. An die Küvettenhaltereinheit 1 ist eine Lichtquelle 5 angeschlossen. Das Licht dieser Licht­ quelle 5 wird von den letztgenannten zwei Linsen 3 nach dem Ausfiltern des entsprechenden Spektralbereiches auf die im Küvettenhalter 2 befindliche Probe 11 gerichtet.
Die Wirkungsweise dieser Vorrichtung ist wie folgt.
Die Vorrichtung wird durch Einschalten des Netz­ schalters unter Strom gesetzt. An der Hochspannungs­ speiseeinheit 9 wird ein Hochspannungswert eingestellt, der gewährleistet, daß die die Signale des Lichtdetektors 8 verarbeitende Elektronik 10 bei dem gewählten Verstär­ kerfeld gut meßbare Emissionsintensitäten anzeigt.
Zur Messung der Emissionsintensitäten der Proben 11 wird die jeweilige Probe 11 in die Küvette eingebracht und die Küvette in den Küvettenhalter 2 eingesetzt; von da an zeigt die Elektronik 10 die Emissionsintensität automatisch an.
Zur Vornahme einer kompletten Meßserie, das heißt zur Bestimmung des Anteiles der lebenden Spermien in einer Spermaprobe, müssen die Emissionsintensitäten von sechs unterschiedlich hergestellten Proben gemessen wer­ den. Die Auswertung erfolgt durch Berechnung des Antei­ les der lebenden Spermien und die Berechnung der absolu­ ten Spermienkonzentration.
Die Verstärkung sowie die zur Verringerung der elek­ tronischen Geräusche dienende Filterung können in mehre­ ren Stufen variiert werden. Der Wert der Hochspannung, die an dem als Lichtdetektor 8 verwendeten Photoelektro­ nenvervielfacher anliegt, wird zweckmäßig am Display an­ gezeigt.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Propidiumjodid bei der schnellen Bestimmung der Spermien­ anzahl und/oder des Anteiles der lebenden Spermien in Spermaproben, als Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere im erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung bringt folgende wichtige Vorteile mit sich:
  • a) Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungs­ gemäße Vorrichtung sind einfacher beziehungsweise mit weniger Aufwand verbunden als die bisher be­ kannten.
  • b) Sie liefern schnell genaue und reproduzierbare Er­ gebnisse und können deshalb in die Verfahrenstech­ nik beziehungsweise Technologie der Spermaaufar­ beitung eingegliedert werden.
  • c) Sie sind zur genauen Bestimmung des Verhältnisses zwischen lebenden und abgestorbenen Spermien ge­ eignet.
  • d) Durch Serienuntersuchung von einer Belastungsprobe unterzogenen Spermaproben ist es möglich, die Re­ sistenz eines Ejakulates objektiv festzustellen und dadurch den biologischen Wert des untersuch­ ten Spermas vorauszusagen.
  • e) Die Bestimmung der absoluten Spermienkonzentra­ tion ist möglich.
  • f) Das erfindungsgemäße Verfahren ist empfindlicher als die bekannten.
  • g) Beim Binden des Farbstoffes Propidiumjodid steigt die Fluoreszenz bedeutend an, wodurch ein größeres Auflösungsvermögen ermöglicht wird.
Sowohl in Fig. 2 als auch in Fig. 3 sind auf der Abs­ zisse die Anzahl der Samenzellen und auf der Ordinate der Wert
angegeben.
Die Erfindung wird an Hand des folgenden Beispieles näher erläutert.
Beispiel
Es wurde der Anteil der lebenden Spermien auf fol­ gende Weise bestimmt.
  • 1. Die Fluoreszenz-Intensität (F 0) von in einem Phosphatpuffer PBS (phosphate buffer saline) ge­ löstem Propidiumjodid (PJ) an 1600 µl Farbstoff­ lösung mit einer Konzentration von 25 mg/l ge­ messen. Dieser Wert diente gleichzeitig als Stan­ dard.
  • Die Zusammensetzung des Phosphatpuffers PBS war wie folgt: 8,8 g NaCl,
    0,2 g KCl,
    1,55 g Na2HPO4 · 2 H2O und
    0,2 g KH2PO4,aufgefüllt mit doppelt destilliertem Wasser auf 1000 ml.
  • 2. Zu dieser Lösung wurde eine mit 40 µl Phosphat­ puffer PBS vorverdünnte Spermaprobe zugegeben und die Fluoreszenz-Intensität (F 1) erneut ge­ messen.
  • 3. Dann wurden der Probe als permeabilisierendes Mittel 40 µl alkoholische Digitoninlösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt und die Fluoreszenz-Intensität (F 2) wurde erneut gemessen.
  • 4. Es wurde ein Parallelansatz ohne Spermaprobe hergestellt: 1600 µl Propidiumjodidlösung, 40 µl Phosphatpuffer PBS und 40 µl alkoholische Digitoninlösung. Die Fluoreszenz-Intensität die­ ser Probe ist F 3.
  • 5. Die Fluoreszenz-Intensität von 1600 µl Phosphat­ pufferlösung PBS wurde gemessen (F 4).
  • 6. Dieser Pufferlösung wurden 40 µl vorverdünntes Sperma zugesetzt, die Fluoreszenz-Intensität (F 5) wurde erneut gemessen.
Aus den gemessenen Fluoreszenz-Intensitäten konnte der Anteil der lebenden Samenzellen wie folgt berechnet werden:
Die Gesamtzahl der Spermien konnte aus denselben Fluoreszenz-Intensitätswerten bestimmt werden, da die Differenz zwischen F 2 und F 3, der Wert (F 2-F 3), von sämtlichen permeabilisierten Zellen stammt. Der Wert (F 2-F 3) zeigt im Bereich von 1 × 105 bis 1,5 × 106 Zellen/cm3 eine lineare Beziehung zur Zellenkonzentra­ tion. In diesem Bereich läßt sich demnach aus dem Wert F 2-F 3 mit Hilfe einer Kalibrationskurve die Anzahl der Zellen in der Probe bestimmen.
Auch in diesem Falle muß mit dem von den Spermien stammenden, nicht-spezifischen Intensitätsanstieg (F 5-F 4) gerechnet werden:
worin
α ein durch Multiplikation des Steilheitstan­ gens der Kalibrationskurve mit dem Grad der Vorverdünnung erhaltener Faktor ist.
Die Kalibrationskurve konnte in einem Strömungs­ cytometer an mit Propidiumjodid markierten Spermaproben wie folgt aufgenommen werden.
Die zu untersuchende Zellensuspension wurde mit Phosphatpuffer PBS auf eine Konzentration von 0,5 bis 2 × 106 Zellen/ml verdünnt. Von dieser Suspension wur­ de 1 ml in Eis gekühlt und mit 1 ml einer 1gew.-%igen NP-40-Lösung (Nonidet P-40-Lösung; Hersteller: SIGMA Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD) versetzt. Durch diese Behandlung wurden alle Zellen abgetötet, ihre Zellmem­ branen wurden für das Propidiumjodid durchlässig.
Dann wurde zur Probe so viel in Phosphatpuffer PBS gelöstes Propidiumjodid zugegeben, daß die Endkonzen­ tration 30 µg/ml betrug.
Die angefärbte Probe wurde in einem Strömungscyto­ meter, zum Beispiel einem Becton-Dickinson-Cytometer Typ FACS III, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1500 Zellen/s analysiert. Die Erregung erfolgte mit einem Argonionenlaser bei der Wellenlänge 488 nm, die Emission wurde in dem Wellenlängenbereich oberhalb 620 nm unter Zwischenschaltung eines nach oben durch­ lässigen Schneidefilters registriert.
Während der Analyse wurden die vorbeiströmenden Zellen von dem Gerät auf Grund der Fluoreszenz-Inten­ sität gezählt, und da die Zellen durch die Behandlung alle durchlässig wurden und alle den Farbstoff aufge­ nommen hatten, entspricht die gezählte Zahl der abso­ luten Anzahl der Zellen. Durch genaue Feststellung der verbrauchten Probemenge unter Berücksichtigung der Ver­ dünnungsfaktoren wird die ursprüngliche Zellenkonzen­ tration der Probe erhalten. Diese Konzentration ist dem am Spektrofluorimeter für die gleiche Probe gemessenen Wert
zuzuordnen. Aus der Probe wurde eine Verdünnungsreihe angefertigt und durch Serien von cytometrischen und spektrofluorimetrischen Messungen in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen die den am Spektrofluorimeter gemessenen Intensitätsquotienten zu­ gehörigen absoluten Zellenanzahlen bestimmt. Die Genau­ igkeit dieser Werte wurde durch mehrfach wiederholte Messungen sichergestellt. Da der Wert des Intensitäts­ quotienten sich linear mit der Zellenkonzentration än­ dert, kann für jede untersuchte Spermaart eine Gerade konstruiert werden, auf Grund derer die den gemessenen Intensitätsquotienten zugehörigen Zellenanzahlen ermit­ telt werden konnten.
Durch Multiplikation des Steilheitstangens (Tangens des Anstiegswinkels) der Kalibrationskurve mit dem Grad der Vorverdünnung der Spermaprobe wird ein Faktor α erhalten. Dieser ergibt mit dem gemessenen Intensitäts­ quotienten multipliziert die ursprüngliche Zellenkon­ zentration der Probe unmittelbar an.
Die Kalibrationskurve konnte auch durch hämocyto­ metrische Messungen aufgenommen werden.
Die Berechnungen wurden vorteilhaft mit einem Com­ puter vorgenommen.
Analog gute Ergebnisse wurden bei Verwendung eines Hepes-Puffers auf der Basis des Kaliumsalzes von N-[2- (Hydroxy)-äthyl]-piperazin-N′-[2′-(äthan)-sulfonsäure der folgenden Zusammensetzung erzielt.
 50 Millimol Kaliumsalz von N-[2-(hydroxy)- äthyl]-piperazin-N′-[2′-(äthan)- sulfonsäure {Hepes} und
150 Millimol NaCl,
aufgefüllt mit doppelt destilliertem Wasser auf 1000 ml.
Endgültiger pH-Wert = 6,8.
Molekulargewicht von N-[2-(Hydroxy)-äthyl]-pipera­ zin-N′-[2′-(äthan)-sulfonsäure] {Hepes} = 238,3.
pH-Wert von N-[2-(Hydroxy)- äthyl]-piperazin-N′-[2′- (äthan)-sulfonsäure {Hepes} = 7,55.

Claims (5)

1. Verfahren zur schnellen Bestimmung der Spermienan­ zahl und/oder des Anteiles der lebenden Spermien in Spermaproben, dadurch gekennzeichnet, daß man den Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid in einem Puffer löst und die Fluoreszenz-Intensität (F 0) mißt, dann die Spermaprobe zugibt und die Fluoreszenz-Intensi­ tät (F 1) erneut mißt, anschließend zur Spermaprobe ein die Cytoplasmamembranen permeabilisierendes Mittel zugibt und die Fluoreszenz-Intensität (F 2) erneut mißt, dann in einem zweiten Ansatz die Fluor­ eszenz-Intensität (F 3) des im Puffer gelösten Farb­ stoffes und des permeabilisierenden Mittels zusam­ men mißt und schließlich in einem dritten Ansatz die Fluoreszenz-Intensität des reinen Puffers (F 4) und anschließend die Fluoreszenz-Intensität von Puf­ fer und Sperma zusammen (F 5) mißt und aus den gemes­ senen Werten die Spermienkonzentration mittels der Gleichung worin
α ein durch Multiplikation des Steilheits­ tangens der Kalibrationskurve mit dem Grad der Vorverdünnung erhaltener Faktor ist,
und den Anteil der lebenden Spermien mittels der Gleichung ermittelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß man als Propidiumjodidlösung eine solche mit einer Konzentration von 12,5 bis 25 mg/l ver­ wendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als die Cytoplasmamembran perme­ abilisierendes Mittel Saponin, Digitonin oder Nystatin verwendet.
4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lichtquelle (5), eine an diese angeschlosse­ ne Küvettenhaltereinheit (1) mit einer das Licht der Lichtquelle (5) nach dem Ausfiltern des ent­ sprechenden Spektralbereiches auf die in einem thermostatisierbaren Küvettenhalter (2) befindli­ che Probe (11) richtende zwei Linsen (3) und ein optisches Filter (4) aufweisenden Eingangsoptik (3, 4) und mit einer zwei Linsen (6) und ein op­ tisches Filter (7) aufweisenden Ausgangsoptik, de­ ren optische Achse senkrecht auf die optische Achse der Eingangsoptik (3, 4) steht, sowie einen die Emis­ sion der im Küvettenhalter (2) befindlichen Probe (11) nachweisenden Lichtdetektor (8), auf welchen das Licht der zwei Linsen (6) der Ausgangsoptik der Küvettenhaltereinheit (1) gerichtet ist, eine den Lichtdetektor (8) speisende Hochspannungsspei­ seeinheit (9) und eine die Signale des Lichtde­ tektors (8) verarbeitende Elektronik (10) aufweist.
5. Verwendung von Propidiumjodid bei der schnellen Bestimmung der Spermienanzahl und/oder des Anteiles der lebenden Spermien in Spermaproben, als Fluor­ eszenzfarbstoff, insbesondere im Verfahren nach An­ spruch 1 bis 3.
DE3806556A 1988-01-28 1988-03-01 Verfahren und vorrichtung zur schnellen bestimmung der spermienanzahl in spermaproben und/oder des anteiles der lebenden spermien sowie verwendung von propidiumjodid Withdrawn DE3806556A1 (de)

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SE (1) SE460121B (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2561170B2 (ja) * 1990-07-13 1996-12-04 剛 野間 リンパ球の抗原特異的インターロイキンー２反応性の測定法
ES2044778B1 (es) * 1992-04-02 1994-09-01 Esteve Carmen Blanco Metodo analitico para la determinacion de la capacidad fecundante de una muestra de semen humano.
US5935800A (en) * 1994-10-31 1999-08-10 Beth Israel Deaconess Medical Center Assays and kits for determining male fertility
RU2130183C1 (ru) * 1997-02-06 1999-05-10 Габбасов Зуфар Ахнафович Измеритель количества сперматозоидов или эритроцитов, движущихся в заданном диапазоне скоростей
PT1054948E (pt) * 1998-02-19 2014-07-08 Medical Electronic Systems Llc Sistema de análise de esperma
EP1161671B1 (de) * 1999-03-05 2016-01-20 Viking Genetics f.m.b.a. Bestimmung der konzentration und der lebensfähigkeit von samenzellen zwecks künstlicher befruchtung
US6359683B1 (en) * 2000-04-27 2002-03-19 Becton, Dickinson And Company Method for determining the volume of particles suspended in liquids
MXPA03010689A (es) * 2001-05-24 2005-03-07 M E S Medical Electronic Syste Analisis de semen.
TW201109654A (en) * 2009-09-14 2011-03-16 Univ Nat Taiwan Biochip system, method for determining sperm quality and method for isolating sperm

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4559309A (en) * 1982-09-01 1985-12-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4146604A (en) * 1973-05-31 1979-03-27 Block Engineering, Inc. Differential counting of leukocytes and other cells
GB2145112B (en) * 1983-04-27 1987-02-18 Milk Marketing Board Sorting living spermatozoa
NZ207393A (en) * 1983-08-05 1987-03-31 Neal Lloyd First Staining dna in living cells
US4693972A (en) * 1984-01-16 1987-09-15 Becton, Dickinson And Company Composition and method for rapid detection of microorganisms in clinical samples
US4683213A (en) * 1985-04-22 1987-07-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for predicting the fertility of male mammals

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4559309A (en) * 1982-09-01 1985-12-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Flow cytometry-fluorescence measurements for characterizing sperm

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CA 106 (106)11: 81157 p *
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