DE3304795C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mikroskopisches Analysever­ fahren zur Identifikation, Zählung und Untersuchung von Zellspezies in einer supravitalen Donorprobe, wel­ che menschliche Blut-Leukozyten und -Lymphozyten sowie Entwicklungsstadien neutrophiler, granulozytischer Zellen enthält, wobei die Probe mit einem metachroma­ tischen fluorochromen Farbstoff angefärbt wird, einer Bestrahlung mit einer Lichtquelle ausgesetzt wird, welche eine Wellenlänge aufweist, die die angefärbten Zellspezies zur Fluoreszenz anregt und das von den verschiedenen Spezies emittierte unterschiedliche Fluoreszenzlicht nachgewiesen wird.

Die DE-OS 24 51 409 beschreibt ein Verfahren zur Be­ stimmung spezifischer weißer Blutkörperchen, nach dem das Kernmaterial weißer Blutzellen mit der wäßrigen Lösung eines metachromatischen fluorochromen Farbstof­ fes angefärbt wird und die verschiedenen Zellspezies mit Hilfe eines Aufzeichnungsgerätes identifiziert werden. Die verschiedenen Blutspezies zeigen verschie­ dene Fluoreszenzlicht-Emissionen, wenn sie einer Lichtquelle, welche eine Wellenlänge besitzt, die die gefärbten Zellen zur Fluoreszenz anregt, ausgesetzt werden. In dieser Druckschrift werden Blutzellen wie Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Lymphozyten, Mo­ nozyten und Granulozyten in ihren Entwicklungsstadien erwähnt. Der Farbstoff, der als einziger verwendet wird, ist Acridinorange. Dieses weist keine geeignete Metachromasie bei Lichtabsorptionsverfahren auf.

In der DE-OS 31 09 252 sowie der DE-OS 32 08 629 wird eine große Klasse von Farbstoffen beschrieben, die bei der supravitalen Blutanalyse durch Absorption von Licht im sichtbaren Bereich verwendet werden.

Die DE-OS 31 09 252 beschreibt ein verbessertes Ver­ fahren zur optischen Differenzierung von fünf einzel­ nen weißen Blutzellen-Spezies unter Verwendung einer Klasse basischer quaternärer metachromatischer Farb­ stoffe. Bei diesen Farbstoffen zeigte sich, daß sie jede der Spezies in einem Temperaturbereich supravital anfärben.

Die DE-OS 32 08 629 bezieht sich im wesentlichen auf das gleiche Gebiet, beruht jedoch auf der Fest­ stellung, daß bestimmte Farbstoffe, insbesondere Basischorange 21 zur differentiellen Bestimmung der Entwicklungsstufen neutrophiler granulozytischer Zellen und anderer Leukozyten besonders geeignet sind. Es wird dabei sichtbares Licht mit einer Wellenlänge von etwa 400 bis 770 Nanometer verwendet.

Das hier neu beschriebene Verfahren beruht auf einer kombinierten Untersuchung von mit Basischorange 21 an­ gefärbten Zellen durch weißes Licht und Fluoreszenz­ licht. Dabei stellt die Anregung der präparierten mi­ kroskopischen Zellen, die mit Basischorange Nr. 21 an­ gefärbt sind, durch Laserlicht eine vorteilhafte Mög­ lichkeit zur Identifizierung, Differenzierung und Zäh­ lung der Blutzellen dar.

Es ist fast weltweit Praxis, vor dem Anfärben (bei dem ein Gemisch aus einer Vielzahl chemisch unterschiedli­ cher Farbstoffe verwendet wird) ein Fixierverfahren durchzuführen, das eine Behandlung bis zu einer halben Stunde erfordern kann, bevor die biologische Probe dem Farbstoff ausgesetzt wird. Fixiermittel sind im allge­ meinen Konservierungsmittel und Denaturierungsmittel, die die Empfindlichkeit der Farbstoffabsorption häufig beeinträchtigen. Beispielsweise enthalten Fixiermittel Formaldehyd sowohl als Flüssigkeit als auch als Dampf, absolute Alkohole (Methylalkohol, Picroformal usw.). Sehr häufig werden lebende Zellen nicht angefärbt, wenn Vitalfarbstoffe verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung zeichnet sich demgegenüber dadurch aus, daß der metachromatische fluorochrome Farbstoff Basischorange 21 ist, daß die Anfärbung und Untersuchung in einer fixiermittelfreien, wässrigen Umgebung erfolgt, daß die Zellspezies, welche in den normalen oder pathologischen menschlichen Donorproben vorhanden sind und ein gefärbtes Reaktionsprodukt mit Basischorange 21 bilden, voneinander optisch unter­ scheidbar gemacht werden, indem sie getrennt und se­ lektiv, sowohl einer Fluoreszenzlichtanregung ausge­ setzt werden und Fluoreszenzlicht emittieren, als auch einer Bestrahlung weiteren Lichts ausgesetzt werden und weißes Licht absorbieren, und daß die Identifizie­ rung der Spezies bei Beobachtung unter den vorstehen­ den bimodalen Lichteinwirkungen anhand optischer, für diese Spezies charakteristischer Muster, erfolgt sowie durch die unterschiedlichen Emissions- und Ab­ sorptionseigenschaften des Nukleus, des Zytoplasmas und der Körnchen dieser Blutzellen.

Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Un­ teransprüchen.

Die ungewöhnlichen Eigenschaften des Farbstoffs Ba­ sischorange Nr. 21 (CI #48 035) wurden bei Eosinophilen und Basophilen sowie bei Monozyten festgestellt. Es wurde ursprünglich die Beobachtung gemacht, daß die optische Differenzierung zwischen ausgereiften und un­ ausgereiften Neutrophilen dadurch möglich erscheint, daß die ausgereiften Körnchen (oder Granula) sich im Farbton von den unausgereiften Körnchen unterschieden. Da diese Gruppe, die Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten und Bänder einschließt, nicht immer in sämtlichen Blutproben oder in einer merklichen Anzahl vorhanden ist, wie dies häufig bei T-Lymphozyten und B-Lymphozyten der Fall ist, wurden sie zunächst nicht aufgrund einer metachromatischen und differenzierten Anfärbung durch Basischorange Nr. 21 spezifisch identifiziert.

Die weitere Forschung in Bezug auf den Einsatz dieses einzigartigen Farbstoffs bei Untersuchungen von Blut zeigte jedoch, daß es bei Verwendung dieses ausgewähl­ ten basischen kationischen Farbstoffs der Methin-, Po­ lymethin- und Chinolin-Klasse in reproduzierbarer Weise möglich war, durch metachromatische Reaktion be­ stimmte Lymphozyten zu unterscheiden. Es ist somit möglich, wenigstens zehn Granulozyten und Lymphozyten zu identifizieren.

Da diese Differenzierung außerdem sofort möglich ist, braucht keine verwickelte Biochemie oder eine langwie­ rige Vorbehandlung der Blutproben zu erfolgen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der Farbstoff eine mi­ nimale Toxizität aufweist.

Zu den unausgereiften Granulozyten-Zellen, die identi­ fiziert und voneinander unterschieden werden können, gehören Myeloblasten und Zellen der Myeloidreihe, näm­ lich Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten. Es wird allgemein angenommen, daß dieselben die Vorläufer der polymorphkernigen Leukozyten oder neutrophilen Zellen sind, die gleichfalls metachromatisch angefärbt werden, so daß sie bei den supravitalen Blutanalysen schnell und leicht unterschieden, identifiziert und gezählt werden können.

Es ist ferner möglich, gleichzeitig Neutrophile, Eosi­ nophile und Basophile, Lymphozyten und Monozyten von­ einander und von den oben genannten Vorläufern zu un­ terscheiden.

Darüber hinaus wurde festgestellt, daß durch Basisch­ orange 21 optisch unterschiedliche Farbmuster erhalten werden, ferner unterschiedliche Dichten der Farbe je­ der Granula in der Lymphozyten-Gruppe.

Die Differenzierung der Farbe, der Farbanordnung und der Farbdichte treten in einer solchen Größenordnung auf, daß Zählungen aller oben einzeln genannten Zellen manuell durchgeführt werden können, und zwar mit einem Spektrum weißen Lichts und (Adsorption) durch Fluores­ zenz (Emission). Energiequellen für die Fluoreszenz­ emission sind beispielsweise Quecksilber-Dampflampen, Wolfram-Halogen-Quellen, Laser, Deuterium-Quellen, Xe­ non usw.

Ferner läßt sich auf dieser Grundlage eine automati­ sche Differentialzähleinrichtung entwickeln. Die Qua­ lität der Farben bei Einwirkung bimodalen Lichts führt zu einer doppelten Nachprüfung der Beobachtung und zu einer Möglichkeit der Feststellung von Unterschieden der Zellstruktur.

Es ist ferner möglich, B-Lymphozyten von T-Lymphozyten zu unterscheiden.

Basischorange Nr. 21 zeigt somit nicht nur im weißen Lichtspektrum eine Metachromasie, sondern auch unter Fluoreszenzbedingungen. Basischorange Nr. 21 ist bei Einsatz von Fluoreszenz-Lichtquellen verwendbar, wobei im wesentlichen die gleichen Muster der Zellengeome­ trie und -anordnung in den gleichen Zellen beobachtet werden, wie sie in der DE-OS 32 08 629 beschrieben sind. Die Fluoreszenzfarben zeigen jedoch nicht die gleiche Farbreaktion wie mit weißen Lichtquellen, ob­ gleich die geometrischen Muster vollständig korrelie­ ren.

Basischorange Nr. 21 ist der einzige Farbstoff, der gegenwärtig bekannt ist, der eine bimodale Funktion zur Identifikation aller nachstehend genannten biolo­ gischen Blutzellen zeigt. Diese einzigartigen Farb­ stoffunktionen sowohl im weißen Lichtspektrum wie im angeregten Fluoreszenz-Lichtspektrum führen zu einer metachromatisch unterschiedlichen Identifikation der einzelnen Leukozyten, einschließlich der Entwicklungs­ stadien der neutrophilen, granulozytischen Zellen. Durch eine schnelle supravitale Anfärbung mit wäßri­ gen Lösungen von Basischorange Nr. 21 kann eine op­ tische Differenzierung, Identifizierung und Zählung erfolgen. Durch die bimodale Untersuchung werden zwei verschiedene, jedoch charakteristisch unterschiedliche Farbmuster erhalten, um die Identifikation der Neutro­ hilen, Eosinophilen, Basophilen, Monozyten, Lymphozy­ ten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder und B-Zellen sowie T-Zellen durchzuführen.

Dadurch, daß die Anwendung sowohl von weißer Lichtwel­ lenlänge wie von Fluoreszenz-Lichtwellenlänge bei der vergleichenden Betrachtung einer einzigen biologischen Untersuchungsprobe erfolgt, die mit Basischorange an­ gefärbt ist, wird die Beobachtung sowohl von bestehen­ den Ähnlichkeiten wie Unterschieden der Eigenschaften bekannter Komponenten von Zellen möglich.

Die Körnchen der Eosinophilen zeigen spezifisch eine starke Fluoreszenz ausschließlich an der Peripherie der Körnchen in Form eines "Schalen-" oder "Muschel" Musters. Durch dieses Grenz- oder periphere Fluores­ zenz-Muster oder Schalenmuster werden Eosinophile identifiziert.

Die vorliegende Erfindung stellt einen Fortschritt auf zytologischem Gebiet dar, da sie einen einzigen basi­ schen quaternären kationischen organischen Farbstoff angibt, der selektiv metachromatisch durch einen oder mehrere periphere Blutzellen-Leukozyten absorbiert wird, wodurch eine Verbesserung der Identifikation und Differenzierung zwischen unausgereiften und ausgereif­ ten Teilen verschiedener Arten der Myeloidreihen und der ausgereiften weißen Blutzellen erreicht wird.

Es ist nunmehr möglich, differenziert anzufärben und mit einem einzigen reinen Farbstoff durch einen einfa­ chen wäßrigen Kontakt mit einer peripheren venösen Blutprobe oder Fraktion derselben, einschließlich leu­ kozytenreicher Proben, jede der folgenden Arten oder Typen von Zellvorstufen, weißen Blutzellen, Plättchen usw. durch bimodale Untersuchung genau und leicht zu identifizieren. Diese Arten umfassen Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, Eosinophile und Basophile, B-Lymphozyten, T-Lympho­ zyten und Monozyten. Blutplättchen können gleichfalls identifiziert und gezählt werden.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Anfärben so ausreichend schnell, daß bei normaler Bluttemperatur (37°C) der Zytologe nicht zu warten braucht, bevor die Farbentwicklung der Zellen erfolgt.

Das beschriebene Verfahren basiert auf einer supravi­ talen Technik.

Es können folgende Arten fixiermittelfreier Blutproben verwendet werden: 1. Antikoaguliertes (EDTA, Citrat, Heparin) Gesamt­ blut, 2. Suspensionen von Leukozyten, die mittels Dextran und/oder Schwerkraftsedimentierung des antikoagulier­ ten Gesamtblutes erhalten worden sind, 3. Proben des Gesamtblutes, das mit einer hypotoni­ schen Lösung behandelt worden ist, um eine Auflösung der roten Blutzellen zu bewirken, wobei primär weiße Blutzellen und -plättchen zurückbleiben, 4. Proben anderer Körperflüssigkeiten, wie Rückenmark­ flüssigkeit oder Rippenfellflüssigkeit oder Bauchwas­ serflüssigkeit sowie Proben vereinigter Flüssigkeiten, sofern die weißen Blutzellen von Interesse sind.

In diesem Zusammenhang wird auf die Figur Bezug genom­ men: Sämtliche Blutzellen scheinen von undifferenzierten Stammzellen, sogenannten mesenchymalen Zellen herzu­ rühren. Die unmittelbaren Nachkommen der Stammzellen werden Blasten genannt, wobei die spezifischen Myelo­ blasten als Vorstufen der differenzierten Leukozyten anzusehen sind. Die Myeloblasten sind durch die Abwe­ senheit von Körnchen der Lysosomen identifizierbar, die charakteristisch die drei davon abstammenden Zel­ len der Myleoidreihe durch ihre metachromatische Farb­ absorption erkennen lassen. Die drei abstammenden Zellen, nämlich Promyelozyten, Myelozyten und Metamye­ lozyten sind jeweils in der beschriebenen Art und Weise identifizierbar.

Promyelozyten sind im allgemeinen der Größe nach die größten der Myeloidreihe. Der ovale Nucleus N-1 wird durch Basischorange Nr. 21 nicht angefärbt, wobei er einen relativ großen Teil der gesamten Granulozyten­ zelle darstellt. Das Zytoplasma C ist dicht mit einer großen Anzahl relativ kleiner primärer Körnchen mit einer orangeroten Farbe 1 gepackt, wobei wenige ver­ streute violette Körnchen 2 im allgemeinen beobachtet werden können, die in der Masse der orangeroten Körn­ chen verteilt sind. Unter Fluoreszenz-Emissionsbedin­ gungen fluoreszieren die primären Körnchen oder Lyoso­ men 1 hellgelb und das Zytoplasma mattgrün.

Myelozyten weisen gleichfalls einen nicht angefärbten, eiförmigen Nucleus N-2 mit etwas verminderter Fläche (Volumen) auf. Der herausragende Unterschied ist die eindeutige Entwicklung großer sekundärer gelber Körn­ chen (Granula) 4 in einer unreifen Myelozytenzelle mit im allgemeinen zunehmendem Halbmond. Die beiden ima­ ginären Linien a-a¹ grenzen die zunehmende Anzahl größerer sekundärer gelber Körnchen 4 der Myelozyten von der abnehmenden Anzahl kleiner orangeroter oder fuchsinfarbener primärer Körnchen 6 ab. Es ist festzu­ stellen, daß die Myelozyten von den Promyelozyten sich durch die bemerkbar isolierte Komponente der Entwick­ lung sekundärer gelber Körnchen 4 unterscheiden. Diese (weißes Licht) absorbierenden fuchsinfarbenen Körnchen fluoreszieren unter Fluoreszenz-Emissionsbedingungen hellgelb, und die sekundären (größeren) Körnchen fluo­ reszieren blaßgrün.

Metamyelozyten weisen gleichfalls einen ungefärbten Nucleus N-3 auf, der anfängt, eine lobuläre Form zu entwickeln, im Unterschied zu der vorstehend beschrie­ benen Eiform der ersten Zelle in der Myeloidreihe. Die kleiner werdende Masse kleiner, primärer, orangeroter oder fuchsinfarbener Körnchen 6 wird nun zu einer ver­ gleichsweise kleinen Fläche der gesamten Fläche des beobachteten Zytoplasmas C-2 der Zelle. Größere sekun­ däre gelbe Körnchen 8 scheinen einen erheblichen mitt­ leren Bereich des vorherigen eiförmigen nicht ange­ färbten Nucleus N-3 zu ersetzen, was den Wechsel wie­ dergibt, der verbal mit "von der Eiform zu der lobulä­ ren Form" wiedergegeben wird. Die Fluoreszenz-An­ sprechmuster sind ständig ähnlich und erkennbar.

Die Bänder unterscheiden sich von allen anderen Leuko­ zyten durch einen ungefärbten lobulären Nucleus N-5, der zusammen mit der gesamten Bandgröße eine merklich verminderte Fläche (Volumen) aufweist, im Vergleich zu den bisherigen Leukozytenzellen der Myeloidreihen. Darüber hinaus ist die lobuläre Form des unangefärbten Nucleus N-5 durch weiteres Wachstum des Zytoplasmas C­ 6 nach innen stärker gegabelt worden. Die Zunahme der Zahl der sekundären gelben Körnchen 12 in dem Zy­ toplasma hat bis auf ein sehr kleines Band restlicher primärer kleiner orangeroter Körnchen 10 in dem Zyto­ plasma alles ersetzt. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Band der roten Körnchen 10 spezifisch in dem nach innen gerichteten Vorsprung oder der Bewegung des Zy­ toplasmas C-6 angeordnet ist, der bzw. die den Nucleus N-5 zu teilen bestrebt ist. Größere sekundäre gelbe Körnchen 12 beginnen damit, das Zytoplasma C-6 bis auf diese charakteristische kontrastreiche Farbgruppe der Bänder zu übernehmen. Ein wichtiger Punkt der Trennung ist der schmale Verband der roten Körnchen 10 in dem Zytoplasma C-6 bei 10.

Wie bei der Absorption zeigen Bänder bei Fluoreszenz eine kleine Ansammlung von gelben fluoreszierenden Körnchen 10 im Zytoplasma C-6 mit den vorstehenden charakteristischen Zellmustern mit gleichfalls über­ wiegenden blaßgrünen sekundären Körnchen 12.

Neutrophile, eosinophile und basophile Zellen sind aufgrund der fehlenden farbigen Darstellung in der Zeichnung in ihrer physikalischen Form alle relativ ähnlich. Bei der Verwendung von Basischorange Nr. 21 als supravitalen Farbstoff in einer fixiermittelfreien Umgebung werden die neutrophilen Zellen durch sekun­ däre Körnchen 16 in dem Zytoplasma C-8 identifiziert, wobei sie hauptsächlich gelb sind. Der Nucleus N-8 ist nicht angefärbt und im allgemeinen geteilt. Die großen sekundären gelben Körnchen 16 bilden die größte Fläche (Masse) des Zytoplasmas C-8.

Eosinophile Zellen besitzen gleichfalls einen geteil­ ten unangefärbten Nucleus N-10, jedoch unterscheiden sich die großen sekundären Körnchen 18 von den neutro­ philen und basophilen Zellen durch ihre orange Farbe, die das charakteristische und wichtigste Merkmal des Zytoplasmas C-10 ist.

Die Fluoreszenz-Anregung stellt bei eosinophilen Zel­ len eine charakteristische Entwicklung dar. Die allge­ meine Struktur, die der zweigeteilte Nucleus N-10 wie­ dergibt, ist bei der bimodalen Lichtuntersuchung üb­ lich. Die sekundären Körnchen zeigen jedoch eine hell­ gelbe Außenkontur oder "Schalen"-Fluoreszenz an der Peripherie der sekundären Körnchen 18, die bisher nicht festgestellt worden ist.

Basophile Zellen weisen gleichfalls einen geteilten von Basischorange Nr. 21 unangefärbten Nucleus N-12 auf, wobei die sekundären Körnchen 20 sich von den Körnchen der neutrophilen Zellen 16 und den eosinophi­ len Zellen 18 dadurch unterscheiden, daß die basophi­ len Körnchen 20 durch metachromatische Anfärbung eine helle karmesinrote Farbe annehmen, die einen schwach blauen Farbton oder Unterton aufweist.

Die Fluoreszenz-Anregung der Basophilen führt im we­ sentlichen zu einem Muster, das der des absorbierten Lichts strukturell ähnlich ist. Die Fluoreszenz der sekundären Körnchen 20 führt jedoch zu einer ungewöhn­ lich brillanten zitronengelben Fluoreszenz-Lichtemis­ sion derselben.

B-Lymphozyten und T-Lymphozyten haben einen im wesent­ liche ovalen Nucleus N-14 bzw. N-16. Jeder Nucleus N­ 14 und N-16 ist in ähnlicher Weise gelb gefärbt. Das Zytoplasma C-14 und C-16 bleibt in jedem Falle unange­ färbt. Ein charakteristisches Merkmal des Zytoplasmas C-16 der T-Lymphozyten differenziert wiederum klar die T-Lymphozyten von den B-Lymphozyten. Dies ist die Ge­ genwart einer kleinen Ansammlung roter Körnchen 22 in dem Zytoplasma C-16 der T-Lymphozyten.

Es ist festgestellt worden, daß bei T-Zellen kleine Ansammlungen von Körnchen 22 in dem Zytoplasma 16 hellgelb fluoreszieren und der Nucleus N-16 sehr häu­ fig im wesentlichen unangefärbt bleibt, jedoch eine mattgrüne Fluoreszenz bei derselben Untersuchung zeigt. Die Muster bei beiden Beobachtungsmethoden sind sehr gut vergleichbar und dienen der Bestätigung. Bei den B-Zellen weist der Nucleus ständig eine mattgrüne Fluoreszenz auf.

Bei Beobachtungen mit beiden Arten der Energieanregung variieren die B-Zellen durch eine gelbe Farbe des Nucleus bei der Absorption und eine mattgrüne Fluores­ zenz bei Lichtemissionsbedingungen. Bei beiden Arten der bimodalen Lichtenergieuntersuchung wurden keine sekundären Ansammlungen in dem Zytoplasma der B-Zellen beobachtet. Dieses Muster ist entscheidend.

Mit Basischorange Nr. 21 werden die Monozyten, was ih­ ren im allgemeinen eiförmigen Nucleus N-18 betrifft, nicht angefärbt. Jedoch nimmt das Zytoplasma C-18 einen rosa Ton an, in dem eine verstreute, relativ kleine Anzahl von karmesinroten und rosaroten Körnchen 24 erkennbar ist, die sich im Farbton, dem Wert und der Farbe hinreichend von dem "rosa" Ton des Zytoplas­ mas C-18 unterscheiden, um optisch eindeutig von dem Plasma C-18 differenziert zu werden, das im allgemei­ nen eine ähnliche rosa Färbung besitzt.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die metachromatischen Farbstoffe die Zellen schließlich in einem Ausmaß ein­ färben, wo eine Identifizierung nicht mehr möglich ist. Die beschriebenen Farbunterschiede gehen also verloren oder vermindern sich in einem starken Ausmaß, wenn die Analysen nicht unverzüglich durchgeführt werden. Da in der Praxis das Anfärben jedoch sofort erfolgt, ist jedoch bis zur Bildung maximaler Unterschiede keine Wartezeit erforderlich.

Der Farbstoff wird durch Filtrieren einer wäßrigen Lösung von reinem Basischorange Nr. 21 in destillier­ tem Wasser in einer Konzentration von etwa 1% erhal­ ten. Die Farbstoffkonzentration ist nicht besonders kritisch, vielmehr sind Abweichungen möglich. Vorzugs­ weise werden frische wäßrige Lösungen verwendet, die keine toxischen Zusätze enthalten. Eine Beeinflussung der metachromatischen Reaktion zwischen dem Farbstoff und der spezifischen Art oder Klasse von Leukozyten kann jedoch vollständig durch die Anwesenheit eines der bekannten herkömmlichen Fixiermittel verhindert werden.

Die Bezeichnung "supravital" stellt eine wichtige Ein­ schränkung dar. Sie bezieht sich auf die ursprüngliche Blutprobe und wird für lebende Zellen, die frisch aus einem lebenden Organismus entfernt worden sind oder von einem frisch getöteten Organismus oder dergleichen stammen, verwendet. Durch diese Bezeichnung sollen sämtliche "Fixiermittel" ausgeschlossen werden, jedoch nicht die Verwendung eines Antikoagulans (Heparin, EDTA etc.). Die Blutzellen können auch aus dem Kno­ chenmark, Urin oder anderen dieselben enthaltenden biologischen Teile entfernt werden, einschließlich beispielsweise lymphatischem Gewebe und der Milz.

Das Zellanalyse-Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt: Es wird eine 1%-ige Lösung in destilliertem Wasser aus Basischorange Nr. 21 hergestellt.

Die Blutproben können von verschiedenen Quellen erhal­ ten werden und können frische Proben venösen Bluts, von denen die Erythrozyten entfernt worden sind (Zentrifugierung, hypotonische Lysis, Schwerkraftsedi­ mentation, Dichtegradientensedimentation usw.) oder eine Probe eines nach bekannten physiko-chemischen Verfahren mit weißen Blutzellen angereicherten Plasmas sein. Gewebe mit Zellen (wie sie oben beschrieben sind) können ebenfalls angefärbt und zur Untersuchung einer bimodalen Lichtanregung ausgesetzt werden.

Vorzugsweise werden der wäßrige Farbstoff und die Blutprobe, die beide frisch hergestellt worden sind, bei normaler Blut- oder Körpertemperatur (etwa 36 bis 40°C) miteinander vereinigt. Es wird im allgemeinen ein schnelleres und kontrastreicheres Anfärben bei ei­ ner höheren Temperatur erreicht. Basischorange Nr. 21 scheint nicht temperaturempfindlich zu sein.

Die Farbstoff- und Blutlösungen funktionieren ord­ nungsgemäß, wenn sie in einem Volumenverhältnis von 1 : 4 miteinander vereinigt werden. Das Gemisch wird einige Sekunden leicht bewegt und ein Tropfen des Gemisches wird sofort als nasse Auftragung unter Verwendung eines Deckglases mit einem Lichtmikroskop oder falls vorhanden mit einer automatischen Differential-Leukozyten-Zähleinrichtung untersucht. Weitere Möglichkeiten des Kontakts zwischen dem Farbstoff und den Blutzellen umfassen bekannte Medien, beispielsweise Gelatine, Emulsionen usw., die mit dem Farbstoff in einer Konzentration von etwa 1% impräg­ niert sind.

Die Identifizierung, Differenzierung und Aufzählung von Monozyten ist von großer diagnostischer Bedeutung. Eine zunehmende Anzahl von Monozyten im Blut weist auf die Anwesenheit von aktiver Tuberkulose, Septikämie oder Blutvergiftung sowie Lymphomas, wie die Hodgkin- Krankeit bei der Diagnose hin. Eine Zunahme der Anzahl der Monozyten im Blut von Personen, die sich von hy­ poplastischer oder aplastischer Anämie erholen, kann eine günstige Prognose für den Patienten ankündigen. Eine schnelle und genaue mikroskopische Analyse von Monozyten der beiden Lichtarten begünstigt die aus­ gedehnte Anwendung einer wertvollen Technik.

Die Feststellung, Identifizierung und Aufzählung von polymorphkernigen Leukozyten (neutrophilen) stellen einen kritischen Parameter bei allen Blutbestimmungen dar. Sie sind vor allem bei der Diagnose von akuten Infektionen, wie Lungenentzündung oder Bauchfellent­ zündung von entscheidender Bedeutung, bei denen die Zahl der neutrophilen Zellen anwächst. Sie sind bei der Überwachung von Patienten von Bedeutung, die che­ motherapeutisch oder strahlungstherapeutich behandelt werden. Eine abnehmende Anzahl kann bei einer starken Infektion auftreten, wie sie sich bei Arzneimittelver­ giftungen, einer Hyperaktivität der Milz und bei aku­ ter Leukämie zeigt.

Claims (3)

1. Mikroskopisches Analyseverfahren zur Identifikation, Zählung und Untersuchung von Zellspezies in einer supravitalen Donorprobe, welche menschliche Blut-Leukozyten und -Lymphozyten sowie die Entwicklungsstadien neutrophiler, granulozytischer Zellen enthält, wobei die Probe mit einem metachromatischen fluorochromen Farbstoff angefärbt wird, einer Bestrahlung mit einer Lichtquelle ausgesetzt wird, welche eine Wellenlänge aufweist, die die angefärbten Zellspezies zur Fluoreszenz anregt, und das von den verschiedenen Spezies emittierte unterschiedliche Fluoreszenzlicht nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der metachromatische fluorochrome Farbstoff Basischorange 21 ist, daß die Anfärbung und Untersuchung in einer fixiermittelfreien wässrigen Umgebung erfolgt, daß die Zellspezies, welche in der normalen der pathologischen menschlichen Donorprobe vorhanden sind und ein gefärbtes Reaktionsprodukt mit Basischorange 21 bilden, voneinander optisch unterscheidbar gemacht werden, indem sie getrennt und selektiv sowohl einer Fluoreszenzlichtanregung ausgesetzt werden und Fluoreszenzlicht emittieren als auch einer Bestrahlung weißen Lichts ausgesetzt werden und weißes Licht absorbieren, und daß die Identifizierung der Spezies bei Beobachtung unter der vorstehenden bimodalen Lichteinwirkung anhand optischer, für diese Spezies charakteristischer Muster erfolgt, sowie durch die unterschiedlichen Emissions- und Absorptionseigenschaften des Nukleus, des Zytoplasmas und der Körnchen dieser Blutzellen.

2. Mikroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen, welche in der Donorprobe vorhanden und zu bestimmen sind, eine oder mehrere der folgenden Spezies umfassen: Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten, Metamyelozyten, Bänder, neutrophile, eosinophile und/oder basophile Zellen, B- Lymphozyten und T-Lymphozyten.

3. Mikroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß für die Anregung der Fluoreszenszlichts zumindest teilweise das kohärente Licht eines Laserstrahl verwendet wird.