DE19503434A1 - Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion von Mikroorganismen und der antiadhäsiven Wirkung von Stoffen - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion von Mikroorganismen und der antiadhäsiven Wirkung von Stoffen

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Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Methode zur Quantifizierung der Bakterienadhäsion an Zellen.
Es ist bereits bekannt, die Gegenwart von Mikroorganismen auf Oberflächen durch Abstriche und damit hergestellte Kulturen nachzuweisen. Rückschlüsse auf die Menge der anhaftenden Mikroorganismen sind so aber nicht möglich oder mit sehr großen Fehlern behaftet.
Aufgabe der Erfindung war es, eine einfach, aber genaue Bestimmungsmethode zu entwickeln, mit der die Anzahl von Mikroorganismen auf Zellen bzw. Zelloberflächen, bestimmt werden kann.
Die Aufgabe wird durch das folgende Verfahren gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion von Mikroorganismen an Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen mit einem Farbstoff färbt und mit isolierten, unbehandelten Zellen inkubiert, die Zellen mit sich darauf befindenden Mikroorganismen abtrennt und die Färbung dieser abgetrennten Zellen mit den an den Zelloberflächen adhäsierten Mikroorganismen photometrisch bestimmt.
Unter Färbung wird z. B. Farbintensität oder Fluoreszenz verstanden.
Bevorzugte Zellen sind pflanzliche Zellen, tierische Zellen, insbesondere Human-Zellen, Prokaryonten-Zellen.
Besonders bevorzugte Zellen sind Hautzellen, insbesondere Corneozyten oder Humancorneozyten, insbesondere cornifizierte und/oder lebende Zellen der Haut.
Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien.
Bevorzugte Farbstoffe sind Chromogene, organische Farbstoffe, Fluorochrome und Fluorogene, die für die Messung gegebenenfalls in die fluoreszierenden Formen oder farbigen Formen umgewandelt werden können.
Insbesondere wurde eine Methode zur Quantifizierung der Baktierenadhäsion an Human-Corneozyten entwickelt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die antiadhäsive Wirkung von Stoffen anhand des Adhäsionsgrades von Mikroorganismen, z. B. Bakterien an Corneozyten zu bestimmen. Außerdem kann man mit der Methode die Bindungsspezifität z. B. der Bakterien an die Corneozyten untersuchen, z. B. um spezifisch wirkende Kosmetika zu entwickeln. Die Quantifizierung konnte für zwei unterschiedliche Meßmethoden mit Hilfe des Coulter Epics Profile II und des Cyto Fluor 2300 etabliert werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung der antiadhäsiven Wirkung von Rohstoffen, Teststoffen oder Wirkstoffen. Diese Stoffe können z. B. direkt vor der Inkubation zugesetzt werden. Ihre antiadhäsive Wirkung äußert sich in einer Verringerung der gemessenen Fluoreszenz oder einer Farbminderung.
Es ist aber auch möglich, Zellen und/oder Mikroorganismen vor der gemeinsamen Inkubation einzeln mit potentiell anti-adhäsiven Wirkstoffen zu behandeln und daran anschließend in einer Ko-inkubation von Zellen und Mikroorganismen, z. B. Bakterien, anti-adhäsive Einflüsse dieser Wirkstoffe zu bestimmen.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Bestimmung der antiadhäsiven Wirkung von Wirkstoffen anhand des Adhäsionsgrades von Mikroorganismen an Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen mit einem Farbstoff färbt und mit isolierten, unbehandelten Zellen inkubiert, wobei vor der Inkubation der zu prüfende Wirkstoff angewendet oder zugesetzt wird, dann die Zellen mit sich darauf befindenden Mikroorganismen abtrennt und die Färbung dieser abgetrennten Zellen mit den an den Zelloberflächen adhäsierten Mikroorganismen photometrisch bestimmt.
Für die Entwicklung von Anti-Adhäsiva z. B. in Kosmetikartikeln ist es sinnvoll, die Wirksamkeit von geeignet erscheinenden Rohstoffen in einem Adhäsionsassay zu testen, der die Bakterienadhäsion an Corneozyten quantitativ erfaßt. Mit der entwickelten "in vitro"-Methode können Stoffe ermittelt werden, die zu einer Reduktion der Bakterienadhäsion an die Corneozyten führen. Zusätzlich zu der Prüfung Anti-adhäsiver Wirksamkeit von Stoffen, kann mit Hilfe der Methode die Bindungsspezifität einzelner Bakterienspezies an Corneozyten in Hemmversuchen untersucht werden.
Die Quantifizierung und Validierung des Verfahrens erfolgt in an sich bekannter Weise für solche Messungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:
Gefärbte, vorzugsweise Fluoreszenzgefärbte Mikroorganismen, z. B. Bakterien, werden mit frisch isolierten und unbehandelten Zellen, z. B. Corneozyten, "in vitro" inkubiert. Daraufhin wird die Farbigkeit oder Fluoreszenz der Corneozyten mit adhärierten Bakterien an der Zelloberfläche im Photometer gemessen. Je nachdem wieviel Bakterien an die Corneozyten adhäriert sind, verändert sich die Gesamtfluoreszenz der "Bakterien-Corneozyten-Komplexe". Zu den Bakterien und Corneozyten werden verschiedene Stoffe gegeben, um deren antiadhäsive Wirkung anhand einer Reduktion der relativen Farbe oder Fluoreszenz zu messen. Da die "Komplexe von Zellen mit Mirkoorganismen" abgetrennt werden, stören die farbigen Mikroorganismen bei der Messung nicht.
Erfindungsgemäß können als Mikroorganismen Bakterien, Hefen, Pilze, Dermatophyten, Viren, Viroide und Prionen verwendet werden.
Alle Mengenangaben, Prozentangaben oder Teile beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf das Gewicht, insbesondere auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen oder der jeweiligen Mischung.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu beschreiben, ohne daß beabsichtigt ist, die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.
Beispiel 1 a) Bakteriengewinnung
Die Bakterien wurden entweder in Flüssig-Medium oder auf Vollagar-Platten angezogen. Hierfür wurde jeweils eine Bakterien-Kolonie mit der Impföse auf eine Agarplatte oder in Flüssig-Medium überimpft. Im Flüssig-Medium wurden die Bakterien 4 Stunden bei 37°C im Schüttler bis zur exponentiellen Wachstumsphase inkubiert und anschließend gewaschen. Auf der Agarplatte wurden die übertragenen Bakterien ausgestrichen, über Nacht bei 37°C inkubiert und mit Phosphatpuffer pH 7,5 von dem Agar abgespült.
b) Corneozytengewinnung
Die Corneozyten wurden von der Innenseite des Unterarmes mittels eines mit einem Puffer getränktem Wattestäbchens von der Haut gespült. Die Corneozytenabspülung mit einem Wattestäbchen hat den Vorteil gegenüber anderen Verfahren, daß die Corneozyten in einer Suspension vorliegen und nicht auf einem Trägermaterial immobilisiert sind, an daß die im Adhäsionsversuch eingesetzten Bakterien binden könnten.
c) Färbung und Fluoreszenzfärbung der Bakterien
Die Bakterien wurden mit verschiedenen Fluorochromen oder Farbstoffen gefärbt, um eine möglichst intensive und lang anhaltende Färbung zu erhalten, die nicht durch die obligaten Wasch- und Inkubationsschritte der Bakterien beispielsweise im Adhäsionsversuch wieder ausgewaschen wird. Hierzu wurden die Bakterien beispielsweise mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), Acridinorange, Hoechst Farbstoff H 33342, 2′,7-Bis-(carboxyethyl)-5(6)- carboxyfluoresceinacetoxy-methylester (BCECF) oder Calceinacetoxymethylester (Calcein/AM) gefärbt. Die höchsten Fluoreszenzwerte wurden mit der Galcein/AM-Färbung erreicht. Auch Farbstoffe, z. B. Kristallviolett oder Malachitgrün sind gut geeinet.
d) Trennung der Bakterien von "Corneozyten-Bakterien-Komplexen"
Um die Adhäsion von Bakterien an die Corneozyten quantifizieren zu können, werden die "Bakterien-Corneozyten-Komplexe" von den freien nicht adhärierten Bakterien getrennt. Um eine höhere Zelldichte der "Komplexe" zu erreichen wurden die "Corneozyten-Bakterien-Komplexe" von den freien, nicht adhärierten Bakterien mit einer Dichtegradientenzentrifugation im Percollgradienten getrennt. Für die optimale Trennung der Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation wurde zuerst die Dichte von Corneozyten und S. epidermidis-Bakterien, mit Hilfe von "density marker beads" bestimmt. Aufgrund der unterschiedlichen Dichte konnten Corneozyten und S. epidermidis-Bakterien im Percollgradienten in zwei distinkten Banden konzentriert werden.
e) Quantifizierung
Die Fluoreszenz der Bakterien die an Corneozyten adhäriert waren, wurde im Cyto Fluor 2300 und Coulter Epics Profile II gemessen. Mit demCyto Fluor 2300 und dem Durchflußzytometer (Coulter Epics II) konnten hohe Fluoreszenzwerte für die Calcein/AM gefärbten Bakterien gemessen werden.
Beispiel 2 Validierung der optimierten Methode Material
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Human-Corneozyten des Unterarmes von 10 gesunden Probanden, Mikrotiterplatte mit sechsundneunzig Vertiefungen (Greiner); Brutschrank (Heraeus); IKA-Schüttler MTS4, Eppendorf-Centrifuge 5415C, Lichtmikroskop (Leitz Dialux 20), Neubauerkammer (Brand);Cyto Fluor 2300 (Perkin Elmer), Coulter Epics Profile II (Coulter Electronics GmbH); L5-75B Ultrazentrifuge (Beckmann) Calceinacetoxymethylester (Calcein/AM; Molucular Probes); 1,5 M Phosphatgepufferte-Lösung pH 7,5/300 mOsm (ohne Calcium und Magnesium).
Methode 1. Bakterien a) Bakteriengewinnung
S. epidermidis-Bakterien wurden auf Vollagarplatten ausgestrichen und ÜN bei 37°C im Brutschrank kultiviert. Die Bakterien der ÜN-Kultur wurden mit 2 ml PBS (pH 7,5) von der Agarplatte gespült und die Bakterienkonzentration in der Neubauer-Kammer bestimmt.
Vor der Färbung wurden die Bakterien mit PBS zu einer Konzentration von 5×10⁸ Bakterien pro ml verdünnt.
b) Bakterienfärbung
5×10⁸ Bakterien wurden in 400 ul Calcein/AM-Lösung (50 uM) resuspendiert und für 30 min. bei RT im Dunkeln auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien zweimal mit PBS (ph 7,5) gewaschen und dann entweder in PBS (Kontrolle) oder in PBS + 100 mM Kohlenhydratlösung (Probenansätze) 60 min. vorinkubiert.
2. Corneozyten Corneozytengewinnung
Die abgewaschenen Corneozyten wurden in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt, 8 min. bei 12 000 rqm zentrifugiert und der Überstand wurde abpipettiert.
Anschließend wurden die Corneozyten mit 300 Mikroliter Test/Wirkstofflösung resuspendiert und in Zellen einer Petrischalen-Platte gepoolt.
Die gefärbten Bakterien wurden mit der Corneozyten-Suspension resuspendiert und 2 Stunden 30 min. im Dunkeln bei RT auf dem Schüttler inkubiert,
3. Isolierung der Corneozyten mit adhärierten Bakterien im Percoll-Gradienten
Um die Adhäsion der S. epidermidis-Bakterien an Corneozyten zu quantifizieren, wurden die Corneozyten mit adhärierten Bakterien von den freien, nicht adhärierten Bakterien in einem Percoll-Gradienten getrennt.
Der Percoll-Stufengradient wurde wie folgt angesetzt:
4,5 ml (80%) 14,4 ml Percoll + 1,8 ml PBS + 1,8 ml NaCl (1,5 M)
4,5 ml (20%) 4,0 ml Percoll + 14,0 ml PBS + 2,0 ml NaCl (1,5 M).
In jedes Zentrifugenröhrchen wurden 4,5 ml 80%-iges Percoll pipettiert und mit 4,5 ml 20%-igem Percoll überschichtet.
Die Corneozyten-Bakterien-Suspensionen wurden auf den Percoll-Gradienten gegeben und 20 min. bei 55 000 g zentrifugiert.
Corneozyten und Bakterien wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte im Percoll-Gradienten in zwei distinkten Banden konzentriert. Aus der Bande mit den "Corneozyten-Bakterien-Komplexen" wurden 1,5 ml entnommen.
4. Fluoreszenzmessung im Cyto Fluor 2300 (Exzitation 485 nm, Emission 530 nm) und im Coulter (Epics Profile II).
Für die Fluoreszenzmessung im Cyto Fluor 2300 wurden pro Ansatz in 12 Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils 100 ul Zellsuspension (Corneozyten mit adhärierten Bakterien) pipettiert. Für die Fluoreszenzmessung im Coulter Counter (Epics Profile II) wurden die Zellen im Eppendorfgefäß belassen und mindestens 10³ Corneozyten pro Ansatz mit adhärierten Bakterien gemessen.
Ergebnisse
Zur Validierung der Quantifizierung der Bakterienadhäsion an Corneozyten wurden verschiedene Stoffe unter standardisierten Bedingungen eingesetzt und hinsichtlich ihrer antiadhäsiven Wirksamkeit gegenüber S. epidermidis mit Hilfe desCyto Fluor 2300 und Coulter Epics II evaluiert.
Ein Vergleich der Ergebnisse vomCyto Fluor 2300 zu dem Coulter Epics II zeigte, daß eine Reduktion der Bakterienadhäsion am deutlichsten mit Hilfe der Durchflußzytometrie gemessen werden konnte.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung der Adhäsion von Mikroorganismen an Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen mit einem Farbstoff färbt und mit isolierten, unbehandelten Zellen inkubiert, die Zellen mit sich darauf befindenden Mikroorganismen abtrennt und die Färbung dieser abgetrennten Zellen mit den an den Zelloberflächen adhäsierten Mikroorganismen photometrisch bestimmt.
2. Verfahren zur Bestimmung der antiadhäsiven Wirkung von Wirkstoffen anhand des Adhäsionsgrades von Mikroorganismen an Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen mit einem Farbstoff färbt und mit isolierten, unbehandelten Zellen inkubiert, wobei vor der Inkubation der zu prüfende Wirkstoff angewendet oder zugesetzt wird, dann die Zellen mit sich darauf befindenden Mikroorganismen abtrennt und die Färbung dieser abgetrennten Zellen mit den an den Zelloberflächen adhäsierten Mikroorganismen photometrisch bestimmt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffe Chromogene, organische Farbstoffe, Fluorochrome oder Fluorogene sind.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Hautzellen, Corneozyten oder Humancorneozyten sind.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien verwendet.
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