DE69331580T2

DE69331580T2 - Nachweis von beweglichen zellen in einer probe

Info

Publication number: DE69331580T2
Application number: DE69331580T
Authority: DE
Inventors: Miles Cahill; Ruth Hardham
Original assignee: Australian National University
Current assignee: Australian National University
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2013-09-23
Also published as: US5817472A; WO1994008042A1; DE69331580D1; EP0663015B1; EP0663015A4; EP0663015A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Detektion beweglicher Zellen in einer Probe und eine Vorrichtung zur Anwendung in diesem Verfahren. Das Verfahren ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, auf die Detektion von Zoosporen des pathogenen Pilzes Phytophthora cinnamomi gerichtet. Allgemeiner erstreckt sich das Verfahren auf die Detektion von anderen Organismen, die bewegliche Zellen produzieren, einschließlich Bakterien, Pilzen, Algen und Protozoen.

Stand der Technik für die Erfindung

Phytophthora cinnamomi Rands ist einer der größten Pflanzenschädlinge, die in der tropischen und der gemäßigten Klimazone vorzufinden sind (34, 36). Er befällt einen zunehmend diversen Umfang von Spezies einer breiten Vielfalt von Pflanzenfamilien (35). Die Wirte umfassen wirtschaftlich bedeutende Obstpflanzen wie Avocado, Ananas und Macadamia, Zierpflanzen und einige wertvolle Holzarten. Die Einflüsse dieses Pilzes auf die endemische Flora von Südostaustralien und des südwestlichen Teils von Westaustralien, wo sich einige Pflanzenarten am Rande des Verschwindens befinden, sind niederschmetternde Beispiele für den Einfluss eines eingeschleppten Schädlings auf eine Flora, die aus vielen dafür empfänglichen Spezies (31, 34, 35) besteht. Die Bekämpfung dieses Schädlings und ein verbessertes Verständnis seiner Biologie muss teilweise auf Informationen über den Ort und die Dichte des Impfgutes im Boden beruhen. Bisher hat dies, abhängig vom angewendeten Verfahren, relativ schwierige und zeitraubende Arbeitsgänge für zunächst das Isolieren und anschließend die Identifikation von P.cinnamomi aus der Erde erfordert. Es ist möglich, P.cinnamomi innerhalb von 2 bis 3 Tagen (13) zu isolieren und zu identifizieren, doch viele Arbeitsvorschriften sehen die Verwendung eines Lockstoffes auf Erdproben, die bis zu 7 bis 10 Tagen lang dauert, mit anschließendem Ausbreiten des infizierten Lockstoffes auf ein oder mehrere selektive Medien vor. Nach einigen Tagen Wachstum auf dem selektiven Medium ist es erforderlich, dass die Identifizierung von jemandem durchgeführt wird, der sich mit der Taxonomie von Phytophthora auskennt (14, 33).
Gegenwärtig sind die vielseitigsten und nützlichsten Diagnoseassays solche, die auf Antikörpern basieren, die spezifisch den Zielorganismus erkennen. Diese Assays sind mit großem Erfolg bei viralen und bakteriellen Pflanzenkrankheiten (16) und auch bei Pflanzenkrankheiten, die von einer Reihe von Pilzen (9) verursacht werden, angewendet worden. Polyklonale Antikörper sind für die Detektion von P.cinnamomi verwendet worden. Es wurden Antikörper erzeugt, welche die Detektion von Chlamydosporen von P.cinnamomi im Boden erlauben, doch hat dieser Assay den Nachteil einer großen Hintergrundbindung der Antikörper an Erdpartikel, und es mangelt ihm an Spezies- Spezifität (24). Ähnliche Verfahren wurden für die Produktion von Antikörpern angewendet, die Phytophthora-Zoosporen-Zysten und Keimschläuche markieren, doch waren auch sie nicht speziesspezifisch (24). Einige Immunoassays wurden für eine Anzahl bedeutender Pflanzenschädlinge, einschließlich Phytophthora (27), entwickelt. So wurden beispielsweise monoklonale Antikörper verwendet, um Zysten von Phytophthora und Pythium zu detektieren, die von Berieselungswasser auf Filterkissen (1) gesammelt worden waren. Diese Assays basieen alle auf der Verwendung eines Pilzmycels oder von Mycelfraktionen als Immunogen, haben jedoch auch einen beträchtlichen Mangel an Spezifität gezeigt. Eine Sammlung monoklonaler Antikörper, die auf Aldehyd-fixierten Zoosporen von P.cinnamomi gezüchtet wurden, die in vorläufigen Studien Gattuncrs-, Spezies- und Isolat-Spezifizität (18) zeigten, haben ein großes Potential für die Entwicklung eines spezies-spezifischen immunodiagnostischen Tests auf P.cinnamoni.
In EP-A-259 116 ist ein Verfahren zur selektiven Kultivierung beweglicher Bakterien beschrieben, das das Einbringen einer bakterienhaltigen Probe in einen Kultivierungsbehälter, der ein flüssiges Nährmedium enthält, um die beweglichen Bakterien wiederzubeleben und sich vermehren zu lassen, und die Bereitstellung eines Trägers, der in das flüssige Nährmedium getaucht wird, umfasst, wobei der Träger ein getragenes Nährmedium für das selektive Wachstum und die Anzeige der beweglichen Bakterien enthält und eine Öffnung zum flüssigen Nährmedium besitzt, um Bakterien zu ermöglichen, in das getragene Medium zu migrieren.
Der Erfindung liegt als eine Aufgabe zugrunde, einen einfachen, schnellen diagnostischen Tauchstäbchen-Immanoassay bereitzustellen, der in einer Ausführungsform die Detektion und Quantifizierung von P.cinnamomi im Boden innerhalb von 1 bis 2 Tagen ermöglicht. Ein diagnostischer Immunoassay dieses Typs basiert auf einem Antigen, das von einem Tauchstäbchen (Dipstick) absorbiert wird, oder einem an diesem adsorbierten festgehaltenen Antikörper. Diese Assays umfassen die Bewegung des Tauchstäbchens von der Testlösung durch Lösungen, die einen markierten Antikörper enthalten, und anschließend in eine letzte Lösung, welche die Sichtbarmachung des gebundenen Antikörpers erlaubt. Diese Form eines Immunoassays ist erfolgreich für die Detektion mehrerer Pflanzenschädlinge (5, 10, 11, 26) angewendet worden und bildet die Basis vieler medizinischer Diagnoseassays (21, 32). Die großen Vorteile von Tauchstäbchen-Assays gegenüber anderen auf Antikörpern basierenden Assays sind, dass sie schnell, billig und ohne spezialisierte Geräte durchgeführt werden können, wobei eine zuverlässige Diagnose von nicht speziell geschultem Personal durchgeführt werden kann.
Viele Organismen sind in der Lage, chemische und elektrische Gradienten zu detektieren und können sich aktiv bis zum Ursprung des Gradienten bewegen, wobei sie schließlich an diesem Ursprung anhaften. Diese Bewegungsformen werden als Chemotaxis bzw. Elektrotaxis bezeichnet, wobei für das erfindungsgemäße Verfahren die chemotaktischen und/oder elektrotaktischen Fähigkeiten von Organismen genutzt werden.
Es ist in der Literatur gut dokumentiert, dass eine Anzahl von Verbindungen für bewegliche Bakterien, Algen, Pilze oder tierische Zellen als chemische Lockstoffe wirken. Von den Erfindern ist dies bestätigt, sind ausgedehnte Studien über die chemische Anziehung von Zoosporen von Phytophthora-Spezies durchgeführt und ist festgestellt worden, dass Aminosäuren, Aspartat, Glutamat und Asparagin sowie eine Vielfalt anderer Verbindungen starke Lockstoffe für diese Zellen sind. Von den Erfindern ist weiterhin festgestellt worden, dass, wenn eine feste Oberfläche wie ein Filter oder eine Membran mit diesen Verbindungen beschichtet wird, oder wenn die Verbindungen von einer permeablen Oberfläche absorbiert werden, die langsame Abgabe der Verbindungen bewirkt, dass die fungalen Zoosporen bis zu der Oberfläche schwimmen und daran anhaften. Materialien, die sich als erfolgreich erwiesen haben, umfassen Nitrocellulose (Bio-Rad Laboratories), Nucleopore Filter (Gelman), Filterpapier (Nr. 1, Whatman International) und Polysorp und Maxisorp Immunosticks (Nung, Dänemark). In einigen Fällen wurde das Material mit dem chemischen Lockstoff allein imprägniert, in anderen Fällen wurde es mit Glucose oder Gelatine vorbehandelt.
Weiterhin ist bekannt, dass Phytophthora-Zoosporen elektrische Gradienten detektieren und Elektrotaxis aufweisen können. Von den Erfindern ist festgestellt worden, dass Zoosporen von P.cinnamomi stark von positiv geladenen Membranen wie Hybond-N+ (Amersham Australia Pty Ltd) und Zeta-Probe Nylon Membrane (Bio Rad Laboratories) angezogen werden. Die Anziehung der Zoosporen an letztere Membranen geschieht auch ohne chemischen Lockstoff.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend einem erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zum Nachweis beweglicher Zellen in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen dieser Probe mit einem festen Träger in einem Medium und unter Bedingungen, unter denen diese Zellen beweglich sind, wobei dieser feste Träger als Lockmittel für diese Zellen wirkt oder mit einem für diese Zellen als Lockmittel wirkenden Mittel behandelt ist, sodass die beweglichen Zellen sich durch das Medium zu dem festen Träger bewegen, und anschließendes Nachweisen der zu dem festen Träger gelockten und daran gebundenen Zellen bereitgestellt.
Vorzugsweise ist der Lockstoff einer, der einen chemischen oder elektrischen bzw. elektrochemischen Gradienten im Medium erzeugt. Vorzugsweise ist auch das Medium ein flüssiges Medium.
Entsprechend einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Kit, der zum Nachweis beweglicher Zellen durch ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignet ist, bereitgestellt, umfassend
(i) einen festen Träger in Form eines Tauchstäbchens (Dipsticks) zur Verwendung für den Nachweis von beweglichen Zellen in einer Probe, wobei dieser feste Träger ein Lockmittel für diese Zellen oder mit einem diese Zellen anlockenden Mittel behandelt ist, und
(ii) Mittel zum Nachweis der angelockten und an den festen Träger gebundenen Zellen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Von zentraler Bedeutung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Verwendung eines festen Trägers wie eines Tauchstäbchens, der die interessierenden Zellen anlockt. Lies wird vorzugsweise auf eine von zwei Weisen erreicht. Das Tauchstäbchen kann mit einer Verbindung beschichtet sein, die als ein chemischer Lockstoff für die Zielzelle bekannt ist. Diese Verbindung diffundiert vom Tauchstäbchen weg und baut einen Gradienten des chemischen Lockstoffs im flüssigen Medium auf. Alternativ oder zusätzlich kann ein Träger wie ein Membranträger, der eine elektrische Ladung besitzt, verwendet werden, um in einem flüssigen Medium einen elektrischen Gradienten aufzubauen.
Für die Detektion der Zielzellen, die vom festen Träger angelockt werden, kann ein beliebiges geeignetes Verfahren angewendet werden. Beispielsweise können die Zellen durch Verwendung monoklonaler Antikörper detektiert werden, die für die Zielzellen spezifisch sind. Im Falle von P.cinnamomi sind spezies-spezifische monoklonale Antikörper bekannt (17, 18) und solche Antikörper können für die Detektion und immunologische Identifizierung dieser fungalen Spezies verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper sind auf spezifische Komponenten der enzystierten Zoospore gerichtet und erkennen vorzugsweise Antigene auf der Zystenoberfläche. Der Assay ist für P.cinnamomi spezifisch und zeigt keine Querreaktivität mit anderen Phytophthora-Spezies, den Gattungen der Oomyceten oder phytopathogenen Pilzen. Die Sensitivität, Spezifizität und Leichtigkeit der Anwendung dieses Assays wird eine breite Anwendung in Wäldern und auf Fulturpflanzen ermöglichen, die von diesem Schädling befallen sind, und bietet beträchtliche Einsparungen sowohl an Arbeitszeit als auch an Arbeitskraft.
Allgemein ausgedrückt beruht das erfindungsgemäße Verfahren auf der Anwendung des Phänomens der Chemotaxis und, durch Auswahl geeigneter Fangmembranen, kann dieses durch Elektrotaxis an eine positive Ladung verstärkt werden. Dass beide dieser Taxen angewendet werden können, hat Auswirkungen auf den Erfolg dieses Assays. Durch die Diffusion eines chemischen Lockstoffes wird ein chemischer Gradient über eine "große Entfernung" (einige Millimeter) und kurzen Zeitraum (Minuten) aufgebaut, während das Vorhandensein einer positiven Ladung in der und um die unmittelbare Nachbarschaft der Membran als ein Lockstoff mit einem "engen Bereich" und längeren Zeitraum (Stunden) dient.
Zoosporen von Pilzen der Oomyceten werden von einer Vielfalt chemischer Verbindungen, einschließlich Aminosäuren, Zucker, Alkoholen, Aldehyden und phenolischer Verbindungen (2, 7, 19, 20, 28), angelockt. Das Anlocken von P.-cinnamomi-Zoosporen durch einige phenolische Säuren und Phytohormone ist bisher noch nicht beschrieben worden. In einem ähnlichen Assay waren andere phenolische Verbindungen, speziell Isoflavone, Diadzein und Genistein, sowohl potente als auch spezifische Lockstoffe für Zoosporen von P. sojae (28). Von den 65 Verbindungen und Gemischen, die in vorliegender Studie getestet wurden, lockten 32 Zoosporen von P.cinnamomi bei einer Konzentration von 24 mM oder darunter bis zu einem gewissen Grade an. Dabei waren die Alkohole, Aminosäuren und Isovaleraldehyd die anziehendsten Substanzen. Von den Erfindern ist auch gezeigt worden, dass Asparaginsäure und Glutaminsäure sowohl eine Anlockung als auch Inzystierung von Zoosporen von P.cinnamomi in einer Weise auslösen können, die ähnlich derjenigen ist, die bei Zoosporen von Py.aphanidermatum (19) gefunden wurde, Asparaginsäure wird als bevorzugter Lockstoff verwendet, da sie ein potenter Lockstoff war und eine Inzystierung auslöste.
Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Tauchstäbchenassays ist mit nicht mehr als 40 Zoosporen m1&supmin;¹ in einem Erlenmeyerkolben ermittelt worden. Dieser Sensitivitätsgrad ist ähnlich demjenigen eines Immunoassays für Zoosporen in Berieselungswasser (1) und der Detektion von Ascosporen von Venturia inequalis (4) und höher als diejenige eines auf Chemilumineszenz beruhenden Assays für Bodenbakterien (30).
An dem von den Erfindern angewendeten Immunoassay war routinemäßig die Silberverstärkung eines mit kolloidalem Gold markierten sekundären Antikörpers beteiligt. Dieses Detektionssystem erzeugt ein starkes Signal mit hohem Kontrast, das leicht durch das Auge, eine Lupe oder ein Präpariermikroskop erkannt werden konnte. Das Zystenhüllmaterial, das sich immunologisch von Material unterscheidet, das bei der Adhäsion von Zysten hilft (15), breitete sich am Umfang der Zyste während den Inkubationsversuchen aus und vergrößerte deshalb die Menge und den Bereich der Markierung und das Signal.
In Vorversuchen (deren Werte nicht mitgeteilt sind), in welchen Erde mit P.cinnamomi infiziert worden war, war es durch die Verstärkungstechnik mit kolloidalem Gold-Silber möglich, Zysten leicht von anhaftender Erde und organischen Teilchen zu unterscheiden. Die Möglichkeit einer Verwechslung mit anderen Teilchen, die an der Tauchstäbchenmembran anhaften, wurde jedoch vollständig durch einen mit alkalischer Phosphatase markierten sekundären Antikörper mit Naphtaolphosphat/Echtrot als Substrat und Indikatorfarbstoff ausgeschlossen. Die rosarot gefärbten Zysten waren leicht von allen anderen anhaftenden Stoffen zu unterscheiden. Echtblau, das ein unlösliches hellblau gefärbtes Produkt ergibt, und Bromchlorindoylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT), das ein unlösliches violettes Reaktionsprodukt ergibt, sind auch verwendet worden, um Zysten von P.cinnamoni auf Tauchstäbchen zu unterscheiden, die für Erdproben verwendet worden waren.
Der Zeitraum, der für den Routineassay benötigt wurde, betrug 3,5 bis 4 h, um die Markierung und Detektion in den Screening- Assays zu maximieren, für die Entwicklung in einem Diagnosekit kann jedoch der Versuchszeitraum beträchtlich verkürzt werden. Insbesondere verkürzt die Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Antikörpers und von Echtfarbstoffen die Signalentwicklungszeit bis auf nur wenige Minuten. Ein Biotin-Streptavidin-basierender Immunoassay hat auch das Potenzial, das Signal zu vergrößern und die Versuchszeit zu verkürzen. Bei dem mit Biotin markierten sekundären Antikörper und mit kolloidalem Gold (15 nm) markierten Streptavidin wurde die Silberverstärkungszeit auf ein Drittel derjenigen verkürzt, die für einen Gold markierten sekundären Antikörper benötigt wurde, obwohl sich das Hintergrundsignal vergrößerte (werte sind nicht mitgeteilt). Die Verfahrenszeit kann auch merklich verkürzt werden, indem der Assay eher direkt als indirekt durch Verwendung von beispielsweise einem mit kolloidalem Gold markierten primären Antikörper durchgeführt wird, der dann verstärkt werden kann. Die Verfahrensdauer wurde ohne Sensitivitätsverlust verkürzt, wenn diese Technik mit einem an 10-nm-Gold konjugierten Cpaprimären Antikörper durchgeführt wurde.
Einige immunologische Assays für die Detektion von Pflanzenschädlingen sind gegenwärtig in Kitform erhältlich, und es sind einige Assays, bei welchen monoklonale Antikörper als Detektionssystem verwendet werden, beschrieben worden (9, 27). Jedoch hat die Querreaktivität die Anwendung vieler dieser Assays, die Immunogene, die auf ganzen Zellen oder Zellwänden beruhen, und lösliche Oberflächenantigene haben, begrenzt. Auf ähnliche Weise ist die Nützlichkeit kommerzieller Diagnosetests für die Detektion von insbesondere Phytopluthora und P.cinnamomi durch die Querreaktivität sowohl innerhalb der Gattung als auch mit anderen eng verwandten Gattungen wie Pythium und Peronospora (1, 3, 23, 29) ernsthaft behindert.
Weitere Eigenschaften des Verfahrens und andere erfindungsgemäße Merkmale werden anhand der ausführlichen Beschreibung der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

Pilzisolate

Das P.-cinnamomi-Isolat (A2-Paarungstyp, 6BR, H1000), das in dieser Arbeit verwendet wurde, war ursprünjdich aus den Brisbane Ranges, Victoria, Australien, isoliert worden. Quellen und Kultivierungsbedingungen für alle anderen Isolate von Phytophthora und Isolate von Pythium und Saprolegnia sind in Einzelheiten beschrieben (13) und Kulturhimterlegungsnummern (Tabelle 1 in (13)) zugeordnet worden.

Zoosporenproduktion

Zoosporen von P.cinnamomi wurden axenikal (6) und Zoosporen aller anderen Pilze wurden mit dem Verfahren von Dolan und Coffey (12) erzeugt. Die Anzahl der Zoosporen in den Suspensionen reichte von
1·10³ bis 5·10&sup5; ml&supmin;¹.

Monoklonale Antikörper

Es wurden monoklonale Antikörper (MAbs) aus einer zuvor beschriebenen Sammlung (17, 18) verwendet, Die MAbs wurden entsprechend Markierungsmustern an Zoosporen und Zysten eingeordnet: Zt bindet an die Oberfläche der vorderen Flimmergeißeln, Zg bindet an einen begrenzten Bereich in der Ventralrinne und an Mastigoneme auf den vorderen Geißeln, Cpa bindet an das Zystenhüllmaterial, Lpv bindet an die Inhalte großer peripherer Vesikeln, Cpw bindet an die Zystenwand, ZCp bindet an die Oberfläche sowohl von Zoospcren als auch Zysten und Vsv und Gvv binden an die Inhalte ventraler Oberflächenvesikel, die sich um den Rinnerbereich befinden.

Chemotaxis-Assay

Es wurde ein großes Spektrum chemischer Verbindungen mit analytischer Reinheit getestet, einschließlich Zucker, Aminosäuren, phenolischer Verbindungen, Alkohole, organischer Säuren und Phytohormonen. Der Assay für die Bestimmung des chemischen Anziehungsvermögens von Verbindungen für Zoosporen von P.cinnamomi wurde aus einem Verfahren mit mit Agar gefüllten Reagenzgläsern modifiziert (20). Eine Chemotaxiskammer wurde gebildet, indem zwei 5-ul- Mikrokapillarröhrchen längs mit einem Abstand von 13 mm in der Mitte eines Objektträgers (25,4 · 72,6 mm) befestigt wurden und anschließend ein Deckglas (22 · 22 mm) auf den Kapillarröhrchen angeordnet wurde, um eine an den Enden offene Kammer mit einem Volumen von 240 ul zu bilden. Mit einer Glaspipette wurde eine Zoosporensuspension sorgfältig in die Kammer gefüllt. Die in destilliertem Wasser gelöste Testsubstanz wurde in ein 5-ul-Kapillarröhrchen gezogen und 7 mm in ein Ende der Kammer eingefüllt. Ein nur destilliertes Wasser enthaltendes Röhrchen wurde in das entgegengesetzte Ende der Kammer gesteckt und diente in jedem Test als Kontrolle. Für jede Testsubstanz wurden vier Objektträger hergestellt. Die Objektträger wurden sofort in eine Feuchtigkeitskammer gebracht, die anschließend im Licht bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) gehalten wurde. Nach 20- minütiger Inkubation wurden die Objektträger aus der Kammer entfernt und 5 Sekunden auf einer Heizplatte erhitzt, um die Zoosporen zu immobilisieren. Die Zoosporen in den Kapillarröhrchen wurden aus Bildern ausgezählt, die von einem Videographikdrucker (Sony (Australien) Pty. Ltd., North Ryde, NSW, 2113), gekoppelt mit einem Bildschirm und einer Videokamera, die auf einem Zeiss Photoscope III Mikroskop befestigt war, erzeugt wurden. Die Zoosporen wurden einzeln von einem elektronischen Koloniezähler (Manostat, New York, NY, USA) ausgezählt. Der Mittelwert der Zoosporen im Test und in den Kontrollkapillarröhrchen wurde berechnet, wobei abhängig vom Verhältnis der Anzahl Zoosporen in dem Kapillarröhrchen, das das Lockmittel enthielt, zu der Anzahl von Zoosporen im Kapillarröhrchen ohne Lockmittel die Testverbindungungen als nicht anziehend (Verhältnis 1. 1), schwach anziehend (1. 1, 1 bis 1,5), mäßig anziehend (1. 1,6 bis 2,5) oder stark anziehend (1: > 2,5) (Tabelle 1) bewertet wurden. Die Tests wurden mindestens zweimal mit jeder Testsubstanz durchgeführt.

Gestaltung des Tauchstäbchens

In Vorversuchen wurde ein Spektrum fester Träger verwendet, auf welchen Zoosporen in der Lage waren, zu enzystieren und anzuhaften. Diese Träger umfassten Kunststoff, Glas, Filterpapier, einen Immunostick (Nung, Dänemark), Nitrocellulosemembranen (reine Nitrocellulose und getragene Nitrocellulose von Bio-Rad, North Ryde, 145 W, 2113 und Hybond-C- und Hybond Super-C von Amersham Australia Pty Ltd., North Ryde, NSW, 2113), Nylonmembranen (Zeta-Probe und Zeta-Probe GT, beide positiv geladen, von Bio-Rad, und Hybond-IF und Hybond-N+, letztere positiv geladen, von Amersham) und eine Polyvinylidendifluorid-(PVDF)-Membran von Bio-Rad. Diese Träger wurden auf verschiedene Weise für die Verwendung in einigen Assay-Typen (Tabelle 2) behandelt. In einigen Assays wurde ein Lockstoff dem Membranquadrat zugesetzt, das in einigen Tests an ein Ende eines Kunststoffträgers durch klaren Nagellack befestigt wurde. In anderen Assays wurde der Lockstoff Filterstreifen zugesetzt oder mit Gelatine, Poly-L-Lysin oder Glucose vermischt und auf den festen Träger aufgebracht. Die Wirksamkeit des Formats des Tauchstäbchens hinsichtlich des Anziehens und Festhaltens der Zoosporen wurde beurteilt, indem die Anzahl der Zysten gezählt wurde, die nach 30-minütiger Inkubation in einer Zoosporensuspension (10&sup4; ml&supmin;¹) an den Tauchstäbchen angehaftet hatten. Tauchstäbchen, die keinen Lockstoff enthielten, dienten als Kontrolle.

Tauchstäbchen-Immunoassay

In Vorversuchen wurden mehrere direkte und indirekte Immunoassays beurteilt. In anfänglichen Versuchen wurde das Vorhandensein von Zysten auf dem Tauchstäbchen mit einer alkalische Phosphatase- oder Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörperenzymreaktion getestet, um eine gefärbte Lösung zu produzieren, wobei jedoch diese Assays nur erfolgreich waren, wenn eine große Anzahl von Zysten (500 bis 1000) an der Membran anhaftete (Werte sind nicht mitgeteilt) Methoden, die auf der Bildung eines unlöslichen, gefärbten Präzipitats auf und um die Zysten beruhten, waren weit überlegen. Ein indirekter Immunoassay mit einem mit kolloidalen Gold (10 nm) markierten sekundären Antikörper (AuroProbeTM BL plus GAM IgG + IgM (H + L), Amersham) und anschließender Silberverstärkung (IntenSETM BL-Silberverstärkungskit, Amersham) wurde routinemäßig in allen folcenden Versuchen angewendet. Bei der Entwicklung dieses Verfahrens wurden Assays in 96-Loch-ELISA-Platten durchgeführt, wobei die gesamte Assayzeit 3,5 bis 4 h betrug. Der Zeitraum für den Assay wurde auf weniger als 45 Minuten ohne Verlust am Sensitivität durch Senkung der Inkubationszeiten und Erhöhung der Konzentration der primären und sekundären Antikörper verkürzt.
Für den Routineassay wurde ein Tauchstäbchen 30 min lang in 200 ul einer Zoosporensuspension getaucht und 15 min lang in 250 ul 5-%ige Magermilch (Carnation, Sydney, NSW, 2000) in Trisgepufferter Kochsalzlösung (TBS) pH 7,4 mit 0,1% Gelatine gebracht. Das Tauchstäbchen wurde zweimal 3 min lang in 250 ul TBS gewaschen, die 0,8% Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., Castle Hill, NSW, 2154) (TBS/BSA) enthielt, und in 200 ul eines gattungs- oder spezies-spezifischen monoklonalen Antikörpers, der auf geeignete Weise in TBS/BSA verdünnt worden war, gebracht. Nach 45-minütiger Inkubation wurde das Tauchstäbchen zweimal 3 min lang in 250 ul TBS/BSA gewaschen und 45 min lang in 200 ul eines mit Gold markierten Ziegen- Antimaus IgG + IgM (H+L) gebracht. Danach wurde das Tauchstäbchen einmal 3 min lang in 250 ul TBS/BSA, einmal 3 min in 250 ul TBS und 1 min lang in 250 ul destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Tauchstäbchen in 250 ul des Silberverstärkungsreagenz gebracht. Innerhalb von 60 bis 70 min bilete sich ein kräftig schwarzes Präzipitat auf und um die Zysten, die den primären Antikörper gebunden hatten. Die Reaktion wurde beendet, indem das Tauchstäbchen 1 bis 2 min lang in destilliertes Wasser eingetaucht wurde. Danach wurde das Tauchstäbchen an der Luft getrocknet, und die Zysten wurden mit bloßem Auge oder mit einer 10-fach vergrößernden Lupe betrachtet. Die Tauchstäbchen wurden kritisch mit einem Stereopräpariermikroskop mit Zoomoptik (maximale Vergrößerung 67,5x) und auffallender Beleuchtung untersucht. Alle Stufen in der Versuchsvorschrift wurden in einem Labor bei Raumtemperatur unter konstanten Beleuchtungsbedingungen durchgeführt. In Assays, bei denen die Zählung der Gesamtzahl der Zysten auf jedem Tauchstäbchen erforderlich war, wurde die angewendete Vorgehensweise für das Zählen der Zysten in den Chemotaxis- Kammern befolgt. Mit Klebeband wurden Tauchstäbchen auf Objektträgern befestigt und von oben mit einer Präpariermikroskoplichtquelle beleuchtet.

Aufbringen des chemischen Lockmittels

Asparaginsäure oder Glutaminsäure wurde in destilliertem Wasser bei 95ºC gelöst. Ein 1-ul-Aliquot einer geeignet verdünnten Lösung der Aminosäure wurde auf die Mitte des Membranquadrats gegeben. Danach wurden die Tauchstäbchen sofort oder nach Lagerung im Trocknen verwendet. Um die Wirksamkeit dieser zwei Verbindungen nach Aufbringen auf die Tauchstäbchenmembran zu testen, wurden die Tauchstäbchen 30 min lang in einer Zoosporensuspension inkubiert und die Zysten wie weiter oben beschrieben gezählt.

Monoklonales Antikörper-Screening

24 MAbs, die aus dem Immunofluoreszenzassay als potenzielles Diagnostikum aus einer originalen Sammlung von 35 MAbs (13) ausgewählt worden waren, wurden auf ihr Vermögen, an Zysten im Tauchstäbchenassay zu binden, untersucht. 35 wurden Affinitätsgereinigte Antikörper (1 oder 10 ug ml&supmin;¹) oder Hybridoma- Überstände (rein oder in 50-%iger Verdünnung in TBS/BSA) im indirekten Immunoassay verwendet, wobei jeder nach Silberverstärkung der sekundären Sonde im Bezug auf eine nichtimmune Maus-IgG(NIM) negative Kontrolle (10 ug ml&supmin;¹) auf ihr Vermögen an Zysten zu binden, die an der Tauchstäbchenmembran anhafteten, und auf Erzeugung eines sichtbaren Präzipitats bewertet wurde. MAbs wurden an zwei Tauchstäbchen mit P.-cinnamomi-(6BR, H100())-Zysten getestet.

Querreaktivität von Phytophthora und verwandten Gattungen

Die Querreaktivität der MAbs mit Zysten von Isolaten von Phytophthora Pythium oder Saprolegnia wurde mit dem Tauchstäbchen-Immunoassay getestet. Die Cpa MAbs (Cpa-2, 1 ug ml&supmin;¹ des gereinigten MAb, Cpa-3, 25-%ige Verdünnung des Hybridoma-Überstands und Cpa-7, 50-%ige Verdünnung des Hybridoma-Überstands) und ZCp-2 (50-%ige Verdünnung des Hybridoma-Überstands) und Cpw-4 (10 ug ml&supmin;¹ des gereinigten MAb) wurden getestet. NIM (10 ug ml&supmin;¹) wurde als negative Kontrolle für das jeweilige Isolat verwendet. Alle MAbs wurden in TBS/BSA verdünnt. MAb Vsv-1, der ein Artigen in den ventralen Oberflächenvesikeln von Zoosporen in der jeweiligen Gattung erkennt, wurde als Prüfung auf das Vorhandensein von Zysten von Pythium und Saprolegnia auf der Tauchstäbchenmembran verwendet, da Zysten dieser Gattung nicht mit den getesteten MAbs markiert waren. Die Tauchstäbchen wurden zu Bündeln aus 12 vereinigt, sodass sie in einem 96-Loch-ELISA-Plattenversuch verwendet werden konnten.

Sensitivität des Tauchstäbchenassays

Drei Vorgehensweisen wurden miteinander verglichen und angewendet, um die Sensitivität des Tauchstäbchenassays zu bestimmen. Für jeden wurde eine Verdünnungsreihe von Zoosporen ab einer Anfangskonzentration von 104 Zoosporen ml&supmin;¹ verwendet. Bei der ersten Vorgehensweise wurde die Zoosporensuspension mit destilliertem Wasser auf einen Konzentrationsbereich in einem Gesamtvolumen von 12 ml verdünnt und in einen 10-ml- Erlenmeyerkolben gefüllt, sodass die Oberfläche der Zoosporensuspension etwa bis zur Hälfte des Halses (12 mm Innendurchmesser) des Kolbens reichte. Bei der zweiten Vorgehensweise wurden 10 ml der Zoosporensuspension in kleine gläserne Petrischalen (40 mm Durchmesser) verteilt. Ein einziges Tauchstäbchen würde mit der Membranseite nach unten auf die Oberfläche der Zoosporensuspension in jedem Kolben oder jeder Petrischale gebracht. In einer dritten Vorgehensweise wurden Tauchstäbchen in einem ELISA-Platten-Assay verwendet, in welchem Zoosporen mit destillierten Wasser verdünnt worden waren, um eine Verdünnungsreihe zu bilden. Tauchstäbchen wurden senkrecht in 200 ul einer Zoosporensuspension im Loch der Platte gebracht. Nach 30-minütiger Inkubation in den Zoospcrensuspensionen wurden die Tauchstäbchen herausgezogen und einem Immunoassay unterworfen. Zysten auf der Tauchstäbchenrrembran wurden wie weiter oben beschrieben ausgezählt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 4 wie folgt aufgeführt:
Tabelle 1: Relative Anziehungskraft von Vsrbindungen für Zoosporen von P.cinnamomi, bestimmt durch einen Assay, in welchem die Zellen im eine Kapillare schwimmen, aus welcher die zu testende Verbindung diffundiert.
Tabelle 2: Wirksamkeit von verschiedenen festen Trägern, Assays, Beschichtungen und chemischen Lockmitteln für das Festhalten und Bewerten von Zoosporen von P.cinnamomi.
Tabelle 3: Vergleich von Aminosäuren (1 mM) im Chemotaxis- Assay auf Anziehungsvermögen für P.-cinnamomi- Zoosporen.
Tabelle 4: Screening-Ergebnisse, die aus dem Tauchstäbchenversuch erhalten wurden, um die Reaktion von 24 monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen Bindungseigenschaften für die Markierung von Zysten von P.cinnamomi zu bestimmen.

Auswahl von (einem) chemischen Lockstoff(en)

Verbindungen, die für Zoosporen von P.cinnamomi chemotaktisch anziehend waren, wurden im 'Einschwimm"-Versuch (Tabelle 1) identifiziert. Viele der getesteten Verbindungen verursachten eine schnelle Ansammlung von Zoosporen in den Kapillarröhrchen. Die Verbindungen umfassten diejenigen, die dafür bekannt sind, in der Rhizosphäre aufzutreten, beispielsweise Wurzelexsudate und Wurzeln vieler Pflanzenspezies (8, 25). Von den getesteten Verbindungen waren einige Aminosäuren, Alkohole, phenolische Verbindungen und Isovaleraldehyd stark anziehend. Dabei waren die Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure besonders anziehend (Tabelle 3). Manche Verbindungen, einschließlich Pektin, Syringasäure, Abscisinsäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure, verursachten auch eine Enzystierung. Zucker waren im Allgemeinen nicht anziehend, außer bei relativ hohen Konzentrationen (> 100 mM, Werte sind nicht mitgeteilt). Vorversuche mit einigen der Verbindungen in Verdünnungsreihen zeigten, dass es eine Konzentration für jede obige Verbindung (üblicherweise > 100 mM), bei welcher Zoosporen abgeschreckt oder schnell enzystiert wurden, und eine Konzentration gab, unterhalb der Zoosporen nicht angezogen wurden. So differierten beispielsweise Konzentrationen von Asparaginsäure und Glutaminsäure, die die größte Ansammlung von Zoosporen in den Kapillarröhrchen verursachten, und betrugen 0,1 mM für Asparaginsäure (L- oder D-Konfiguration) und 1 mM für Glutaminsäure. Auf der Grundlage ihres Anziehungsvermögens und ihrer die Enzystierung auslösenden Eigenschaften wurden Asparaginsäure, Glutaminsäure, Arginin, Pektin und Ethanol für die Entwicklung des Tauchstäbchenversuchs ausgewählt. Gestaltung des Tauchstäbchens
Zoosporen wurden von allen verwendeten festen Trägern angezogen und darauf enzystiert (Tabelle 2). Das Vorhandensein eines Lockmittels, das in einer Membran absorbiert war, vermischt mit der Beschichtungssubstanz oder getrocknet auf der Trägeroberfläche, erhöhte die Zahl von Zysten, die am Träger gebunden wurden, verglichen mit Kontrollen, die keine Lockmittel enthielten. Die Zystenzahlen waren höher auf der Nitrocellulose- und der Nylonmembran, die mit einem Lockstoff behandelt worden waren, als auf anderen Trägertypen und Beschichtungen. Beschichtete Träger wie der Immunostick, gläserne Objektträger und Kunststoff-Tauchstäbchen zogen Zoosporen an, jedoch band das Beschichtungsmaterial üblicherweise nicht gut und ging nach mehreren Waschungen verloren. Dies macht die Beschichtungen ungeeignet für eine Verwendung in einem Immunoassay. Demgegenüber hafteten die Zysten gut auf den Membranoberflächen und wurden nicht durch Waschen entfernt.
Das erfolgreichste und nützlichste Format war das Kunststofftauchstäbchen (5 mm · 20 mm) mit einem Quadrat (5 mm · 5 mm) aus einer Nitrocellulose- oder Nylonmembran, die an ein Ende angeklebt worden war. Es wurde eine Vielfalt von Membrantypen untersucht, wobei jedoch die Nylonmembranen, die hydrophiler als Nitrocellulose sind, eine noch gleichmäßigere Verteilung und schnellere Absorption des Wassertropfens, der den gelösten Lockstoff enthielt, ermöglichten. Die PVDF-Membran, obwohl sie erfolgreich von anderen (9) verwendet worden war, war ungeeignet, da sie vor Verwendung mit Methanol befeuchtet werden musste. Positiv geladene Nylonmembranen zogen Zoosporen mit oder ohne chemisches Lockmittel in größerer Zahl als eine neutrale Membrane an. Die Zeta-Probe-Nylonmembran, die eine hochdichte quartäre Aminladung trägt, war besonders anziehungsfähig.
Diese Kunststofftauchstäbchen mit daran befestigter Membran hatten einige Vorteile gegenüber anderen Trägern und Beschichtungen. Sie konnten senkrecht in oder waagerecht auf einer Zoosporensuspension und in 96-Loch-ELISA-Platten entweder als einzelne Stäbchen oder, wenn sie richtig auf einer Länge eines Klebebandes ausgerichtet waren, in Streifen von bis zu 12 verwendet werden. Die Verwendung mehrfacher Tauchstäbchenstreifen ermöglichte die Verarbeitung vieler Proben gleichzeitig und erleichterte die Logistik des Immunoassays beträchtlich.

Monoklonales Antikörper-Screening

Es fand keine Markierung durch MAbs der Zt-Gruppe von P.- cinnamomi-(6BR, H1000)-Zysten statt, die an der Tauchstäbchenmembran anhafteten (Tabelle 9). Es gab sehr kleine lokalisierte Bereiche der Markierung mit jedem der Zg MAbs (mögliche Markierung der wasserexpulsionvakuole), jedoch konnten diese nur mit einer Hochleistungsvergrößerung (> 100x) gesehen werden. Alle Lpv MAbs lieferten schwache bis sehr schwache diffuse Markierungsmuster. Im Gegensatz dazu reagierten sieben der Cpa MAbs mäßig oder stark mit Material, das die Zystenoberfläche bedeckte. Drei der Cpa MPbs (Cpa-5, Cpa-8 und Cpa-12) zeigten keine oder nur eine schwache Markierung. Die Cpw-4 und ZCp-2 MAbs reagierten mäßig und der Gvv MAb nur schwach in dem Assay.
Basierend auf der Stärke der Markierung von Zysten im Tauchstäbchenassay und auf zusätzlichen Informationen aus Immunofluoreszenz- und ELISA-Untersuchungen (13) wurden fünf MAbs ausgewählt: MAbs Cpa-2, Cpa-3 und Cpa.-7 (putativ speciesspecifisch) und Cpw-4 und ZCp-2 (putativ spezies-spezifisch). Diese MAbs wurden in weiteren Untersuchungen für Tests auf Spezifität im Tauchstäbchenassay verwendet.

Screening von Phytophthora und verwandten Gattungen

Vierundvierzig Isolate von P.cinnamomi, einschließlich 15 A1 Paarungstyp und 29 A2 Paarungstyp, erhalten aus dem gesamten Australien, und einschließlich Isolaten von Papua Neuguinea und Japan, 21 Spezies oder Varietäten von Phytophthora, die 75 Isolate umfassten, 11 Spezies von Pythium, die 13 Isolate umfassten, und drei Spezies von Saprolegnia (jeweils Isolat) wurden gegen die fünf ausgewählten MAbs mit dem Tauchstäbchenassay getestet. Alle drei Cpa MAbs markierten Zysten der P.-cinnamomi-Isolate, markierten aber keine Zysten von Isolaten der anderen Phytophthora-Spezies oder -Varietäten. Demgegenüber markierten MAbs Cpw-4 und ZCr-2 alle Phytophthora- Isolate. Eine geringe Variation trat unter den P.-cinnamomi- Isolaten in der Markierungsintensität der Zysten auf, wobei jedoch kein Unterschied zwischen A1 und A2 Paarungstypen auftrat. Die putativ spezies-spezifischen MAbs markierten Zysten stärker als die putativ gattungsspezifischen MAbs.
MAbs Cpa-3 und Cpa-7 markierten keine Zysten von den getesteten Isolaten von Pythium and Saprolegnia. MAb Cpa-2 hatte jedoch eine schwache Querreaktion mit Pythium aphanidermatum, Py. butleri, Py. debaryanum, Py. irregulare und S. declina. MAb ZCp-2 reagierte schwach mit Py. debaryanum and Py. irregulare. MAb Cpw-4 reagierte schwach mit Py. middletonii.
MAb Vsv-1, der den Inhalt ventraler Oberflächenvesikeln markiert, reagierte mit allen Isolaten VOlL Pythium und Saprolegnia.

Sensitivität des Tauchstäbchenversuchs

Die Form des Behälters, in dem sich die Zoosporenlösung befand, beeinflusste die Anzahl der Zysten, die auf der Tauchstäbchenmembran gefunden wurde. Über den Verdünnungsbereich der Zoosporensuspension wurden mehr Zysten auf Tauchstäbchen gefunden, die in dem Erlenmeyerkolben-Assay verwendet worden waren, als im Petrischalen- oder ELISA-Platten-Assay. Die Sensitivität des Tauchstäbchenassays wurde aus einer Verdünnungsreihe als die höchste Verdünnung der Zoosporen bestimmt, die detektiert werden konnte. Für den Erlenmeyerkolben-Assay waren 40 Zoosporen ml&supmin;¹ die niedrigste Konzentration, bei welcher eine oder mehrere Zysten nach der 30- minütigen Inkubationsdauer auf der Tauchstäbchenmembran gefunden wurden. Untere Nachweisgrenzen waren 156 und 312 Zoosporen ml&supmin;¹ für den Petrischalen- bzw. ELISA-Platten-Assay. Ergebnisse aus dem ELISA-Platten-Assay sind jedoch nicht direkt vergleichbar mit denjenigen der anderen beiden Assays, da die Tauchstäbchen senkrecht in die Zoosporenlösung getaucht wurden. Eine einzige Zyste, die an der Tauchstäbchenmembran anhaftete, war das Minimum, das für eine positive Identifizierung erforderlich ist, obwohl in der Praxis wahrscheinlich nicht weniger als 5 bis 10 Zysten pro Membran das Minimum sein werden, das für die Zuverlässigkeit einer Identifizierung erforderlich ist. Tabelle 1 Relative Anziehungskraft von Verbindungen auf Zoosporen von P.cinnamomi, bestimmt durch einen Chemotaxisassay
RA = relative Anziehungskraft
- , Verbindung wirkte nicht anziehend
+, schwach anziehend
++, mäßig anziehend
+++, stark anziehend
* verursachte eine Enzystierung Tabelle 2 Wirksamkeit verschiedener fester Träger, Assays, Beschichtungen und chemischer Lockmittel auf das Festhalten und den Assay von Zoosporen von P.cinnamomi Tabelle 2 (Fortsetzung)
Das Verhältnis ist die Anzahl Zoosporen auf dem festen Träger, der mit dem Lockmittel behandelt worden war, geteilt durch die Anzahl Zoosporen auf dem festen Träger ohne Lockmittel, wobei + Verhältnis von 1, 1 bis 1,5, ++ = 1,6 bis 2,5 und +++ = > 2,5. keine = unbeschichtet. Tabelle 3: Vergleich von Aminosäuren (1 mM) im Chemotaxisassay für die Anziehungskraft auf P.cinnamomi
Es sind der Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts von vier Wiederholungen in zwei getrennten Versuchen gezeigt. Die Werte sind Zählungen von einem Gesichtsfeld (10-fache Vergrößerung des Objektivs) oder von zwei (#) Gesichtsfeldern. Verhältnis berechnet als Anzahl Zoosporen in den Kapillarröhrchen, die die Aminosäure enthalten, geteilt durch die Anzahl in den Kapillarröhrchen ohne Aminosäure.
*, signifikant verschieden von der Kontrolle, P < 0,1, **, P < 0,05, ***, P < 0,01.

Tabelle 4: Ergebnisse des Screenings vor. 24 MAbs auf Wirksamkeit der Markierung von P.-cinnamomi-Zysten im Tauchstäbchenassay

MAb Reaktion

Zt-1 -
Zt-2 -
Zg-1 -
Zg-2 -
Zg-3 -
Zg-4 -
Cpa-2 ++
Cpa-3 ++··
Cpa-4 ++
Cpa-5 +
Cpa-6 ++
Cpa-7 ++··
Cpa-8 -
Cpa-9 ++
Cpa-10 ++
Cpa-12 +/··
Lpv-1 +
Lpv-2 +/··
Lpv-3 +/··
Lpv-4 +/··
Lpv-5 +/··
Cpw-4 ++
ZCp-2 ++
Gvv +
- , keine Markierung
+/-, Spuren
+, schwach
++, mäßig
+++, stark

Beispiel 2

Materialien und Verfahren

A. Tests im Gewächshaus/Kammern mit konstanter Umgebung

Es wurden Tests in Kammern mit konstanter Umgebung durchgeführt, um festzustellen, ob der Tauchstäbchenversuch im Gewächshaus und unter Feldbedingungen wirksam und für P.cinnamomi in Gegenwart von Sporen anderer Phytophthora und Pythium-Spezies spezifisch ist. Die Tests umfassten das Beimpfen verschiedener Pflanzenarten (Eucalyptus sieben, Pinus radiata, Lycopersicon esculentum und Banksia serrata) mit Isolaten von Phytophthora cinnamomi A1, P.citricola, P.nicotianae var nicotianae, P.cryptogea und zwei Pythium- Spezies, Pythium aphanidermatum und Py.inegulare. Diese Isolate wurden einzeln oder in Kombination mit und ohne Zugabe von P.cinnamomi A2 verwendet.
Für die Rückisolation von P.cinnamomi A2 wurden verschiedene Methoden angewendet. In allen Versuchen wurde ein Lock-Assay (Eucalyptus sieben cotyledons/oder Kiefernnadeln) verwendet, um die Ergebnisse des Tauchstäbchenassays zu überprüfen und zu bestätigen. Die Lockmittel wurden auf ausgewählten Medien ausgebreitet, die Antibiotika enthielten, die das Wachstum von Pilzen (anderen als Phytophthora und Pythium) und Bakterien hemmen, wobei das Impfgut durch herkömmliche taxonomische Mittel bestätigt wurde. Außerdem wurden Tauchstäbchen auf ausgewählten Medien ausgebreitet, um das Vorhandensein sowohl von Sporen von P.cinnamomi als auch der anderen Phytophthora- und Pythium-Spezies in den genommenen Proben nachzuweisen. In einigen Versuchen wurden Aliquote der Aufschlämmung, die aus der genommenen Probe hergestellt worden war, auf ausgewählten Medien ausgebreitet, um erneut das Vorhandensein interessierender Isolate zu bestätigen.
All diese Vorgehensweisen für die RückisoJierung von P.cinnamomi funktionieren, insbesondere der Tauchstäbchen- und der Lock-Assay. Das Ausbreiten von Tauchstäbchen auf ausgewählten Medien hat sich als weniger zuverlässig (wahrscheinlich, da nur ein Tauchstäbchen pro Probe als Probe genommen wurde) für die Rückisolierung vor. P.cinnamomi erwiesen, jedoch als extrem nützlich für den Nachweis erwiesen, dass bewegliche Sporen der anderen Spezies produziert worden sind und an der Membran des Tauchstäbchens anhaften. Die Erdaufschlämmungstechnik, obwohl auch nützlich für die Bestimmung von Mengen fungalen Materials in der Probe, hat den Nachteil einer Kontamination durch Pilze und Bakterien, die nicht durch die ausgewählten Medien inhibiert werden.
Der Tauchstäbchenassay hat sich auch als extrem zuverlässig für die Detektion von P.cinnamomi unter den angewendeten kontrollierten Bedingungen erwiesen. Es gibt nur eine kleine Anzahl von Fällen, wo das Tauchstäbchen bei der Aufnahme von P.cinnamomi versagte, wenn der Lock-Assay positiv war. Dabei ist festzustellen, dass es auch Beispiele für den umgekehrten Vorgang gibt, d. h., das Tauchstäbchen ist positiv und der Lockstoff negativ.

B. Tests mit Erde von einem Feld

Der entscheidende Test für den Tauchstäbchenassay besteht darin, ob er in der Lage ist, P.cinnamomi in der Erde von Feldern zu detektieren. Es stehen jetzt Werte zur Verfügung, die zeigen, dass der Assay in verschiedenen Erdarten von mehreren Orten in Australien funktioniert.
Von den Erfindern wurden Isolations- und Bestätigungsvorgänge angewendet, die ähnlich denjenigen waren, die in den kontrollierten Versuchen angewendet worden waren, d. h. Ausbreiten von Lockstoffen auf ausgewählten Medien, Ausbreiten von Tauchstäbchen auf ausgewählten Medien und Isolation von Erdaufschlämmungen. Außerdem wurden Identifizierungen aus Felderde streng durch Isolieren putativer Phytophthora-Spezies bestätigt, indem diese in eine reine Kultur gebracht wurden, wodurch sie angeregt wurden, Zoosporen zu bilden, und anschließend der Tauchstäbchenversuch mit den reinen Zoosporenkulturen durchgeführt wurde.
Der Tauchstäbchenversuch hat sich als völlig zuverlässig für die Identifizierung von P.cinnamomi in Felderde erwiesen. Bisher gibt es keine Fälle, dass es keine Übereinstimmung zwischen Lock- und herkömmlichen Isolationsverfahren und dem Tauchstäbchenassay gibt.

C. Sensitivität des Tauchstäbchenassays

In den weiter oben beschriebenen Laborversuchen ist festgestellt worden, dass der Tauchstäbchenassay in der Lage ist, mindestens 40 Zoosporen pro Milliliter zu detektieren. In Tests, wobei Pflanzen in Blumentöpfen gezüchtet wurden, die mit einer Verdünnungsreihe von Zoosporen beimpft worden waren (die verwendeten Pflanzen waren Pinus radiata, Lycopersicon esculentum und Banksia serrata) waren der Tauchstäbchenversuch und der Cotyledon-Lock-Assay in der Lage, das Vorhandensein von P.cinnamomi nach Zugabe von 3000 Zoosporen pro Blumentopf zu detektieren. In manchen Fällen war der Tauchstäbchenversuch in der Lage, das Vorhandensein von P.cinnamomi nach Zugabe von nur 300 Zoosporen pro Blumentopf zu detektieren.

Claims

1. Ali-Shtayeh, M.S., MacDonald, J.D. und Kabashima, J., A method for using commercial ELISA tests to detect zoospores of Phythophthora and Pythiun species in irrigation water, Plant Dis., 75: 305-311 (1991)

2. Allen, R.N. und Newhook, F.J., Chem< > taxis of zoospores of Phytophthora cinnamomi to ethanol in capillaries of soil pore dimensions, Trans. Br. mycol. Soc., 61: 287-302 (1973)

3. Benson, D M., Detection of Phythophtlzora cinnamomi in Azalea with commercial serological assay kits, Plant Dis., 75: 478-482 (1991)

4. Berkett, L.P., Gotleib, A.R. und Bergdahl, J.A., Development of an antibody-based diagitostic kit to detect mature Venturia inegualis ascospores, Arch. Microbiol., 55: 66-77 (1992) (Abstract)

5. Bossi, R. und Dewey, F.M., Developmerit of monoclonal antibody-based immunodetection assay tor Botrytis cinerea., Plant Pathol., 41: 472-482 1992)

6. Byrt, P. und Grant, B.R., Some condit.ions governing zoospore production in axenic cultures of Phythophthora cinnamomi Rands, Aust. J. Bot., 27: 1C'3-115 (1979)

7. Cameron, J.N. und Carlile, M.J., Fat.ty acids, aldehyds and alcohols as attractants for zoospo res of Phytophthora palmivora, Nature, 271: 448-449 (1978)

8. Curl, E.A. und Truelove, B., The Rhizosphere, Springer- Verlag, Berlin (1986)

9. Dewey, F.M., Detection of plant-invacung fungi by monoclonal antibodies, 47-62, in: TecJiniques for the Rapid Detection of Plant Pathogens. J.M. Diincan und L. Torrance, Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1992)

10. Dewey, F.M., MacDonald, M.M. und Phzllips, S.I., Development of monoclonal-antibody-ELZSA, DOT-BLOT and - DIP-STICK immunoassays for Humicola langinosa in rice, J. Gen. Microbiol., 135: 361-374 (1989)

11. Dewey, F.M., MacDonald, M.M., PhillLps, S.I. und Priestley, R.A., Development of monoclonal-antibody-ELISA and -DIP-STICK immunoassays for Pencillium islandicum in rice grains, J. Gen. Microbiol., 136: 753-760 (1990)

12. Dolan, T.E. und Coffey, M.D., Laboratory screening techniques for assessing resistance of four avocado rootstocks of Phytophthora cinnamomi, Plant Dis., 70: 115- 118 (1986)

13. Gabor, B.K., O'Gara, E.T. Philip, B A., Horan, D.P. und Hardham, A.R., Specificities of nonoclonal antibodies to Phytophthora cinnamomi in two rapid diagnostic assays, Plant Dis. (im Druck) (1993)

14. Greenhalgh, F.C., Evaluation of techiiiques for quantitative detection of Phytophthora cinnamomi, Soil Biol. Biochem., 10: 257-259 (1978)

15. Gubler, F. und Hardham, A.R., Secretion of adhesive material during encystment of Phytophthora cinnamomi zoospores, characterized by immunogolci labelling with monoclonal antibodies to components of peripheral vesicles, J. Cell Sci., 90 : 225-235 (1988)

16. Hampton, R., Ball, E. und Deßoer, 5., Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens, APS Press, St. Paul, Minnesota (1990)

17. Hardham, A. R., Gubler, F., Duniec, J und Elliott, J., A review of methods for the production and use of monoclonal antibodies to study zoosporic plant pathogens, J. Microsc., 162: 305-318 (1991)

18. Hardham, A.R., Suzaki, E. und Perkin, J.L., Monoclonal antibodies to isolate-, species- and c~enus-specific components on the surface of zoospores and cysts of the fungus Phytophthora cinnamomi, Can. J. Bot., 64: 311-321 (1986)

19. Jones, S.W., Donaldson, S.P. und Deacon, J.W., Behaviour of zoospores and zoospore cysts in relation to root infection by Pythium aphanidermatum, New Phytol., 117: 289-301 (1991)

20. Khew, K.L. und zentmyer, G.A., Chemotactic response of zoospores of five species of Phytophtlzora, Phytopathology, 63: 1511-1517 (1973)

21. Kricka, L.J. und Thorpe, G.H.G., Inimobilized enzymes in analysis, Trends in Biotech., 4: 253-258 (1986)

22. MacDonald, J.D. und Duniway, J.M., itse of fluorescent antibodies to study the survival of Phytophthora megasperma and P.cinnamomi zoospores in soil, Phytopathology, 69: 436-441 (1979)

23. MacDonald, J.D., Stites, J. und Kabashima, J., Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants, Plant Dis., 74: 655-659 (1990)

24. Malajczuk, N., McComb, A.J. und Parker, C.A., An immunofluorescence technique for deteoting Phytophthora cinnamomi Rands, Aust. J. Bot., 23 : 2ß9-309 (1975)

25. Malajczuk, N. und McComb, A.L., Root exudates from Eucalyptus calophylla R. Br. and E.marginata Donn, ex Sm. seedlings and their effect an Phytophthora cinnamomi Rands, Aust. J. Bot., 25: 501-514 (19'7)

26. Miller, S.A., Grothaus, G.D., Peterson, F.P., Rittenburg, J.H., Plumley, K.A. und Lankow, R.K., Detection and monitoring of turfgrass pathogens by immunoassay, Amer. J. Bot., 55: 66-77 (1987)

27. Miller, S.A. und Martin, R.R., Moleeular diagnosis of plant disease, Annu. Rev. Phytopath., 26: 409-432 (1988)

28. Morris, P.F. und Ward, E.W.B., Chenioattraction of zoospores of the soybean pathogen, Phjrtophthora sojae, by isoflavones, Physiol. Mol. Pl. Path., 40: 17-22 (1992)

29. Pscheidt, J.W., Burket, J.Z., Fischer, S.L. und Hamm, P.B., Sensitivity and clinical use of Phytophthoraspecific immunoassay kits, Plant Dis., 76: 928-932 (1992)

30. Schloter, M., Bode, W., Hartmann, A. und Beese, F., Sensitive chemoluminescence-based immiznological quantitation of bacteria in soll extrazcts with monoclonal antibodies, Soi1 Biol. Biochem., 24: 339-403 (1992)

31. Shearer, B.L. und Tippet, J.T., Jarrah Dieback: The Dynamies and Management of Phytophthoa cinnamomi in the Jarrah (Eucalyptus marginata) Forest of South-western Australia. Department of Conservation and Land Management, Como, WA (1989)

32. Snowden, K. und Hommel, M., Antigen detection using dipsticks and colloidal dyes, J. Irnnz; ino. Methods 140: 57- 65 (1991)

33. Tsao, P.H., Factors affecting isolation and quantitation of Phytophthora from soil, 219-236 in Phytophthora. Its Biology, Taxonomy, Ecology, and Patho:.ogy, D.C. Erwin, S. Bartnicki-Garcia und P.H. Tsao, Hrsg, American Phytopathological Society, St. Paul. PIN (1983)

34. Weste, G. und Marks, G.C., The biolocry of Phytophthora clnnamomi in Australasian forests, AI2JIU. Rev. Phytopath., 25 : 207-229 (1987)

35. Wills, R.T., The ecological impact of Phytophthora cinnamomi in the Stirling Range National Park, Western Australia, Aust. J. Ecol., 10: 55-661993)

36. Zentmyer, G.A., Phytophthora clnnamomi and the Diseases it Causes, The American PhytopathoLogical Society, St. Paul, Minnesota (1980)