DE60303207T2

DE60303207T2 - Verfahren zur bindung einer verbindung an eine oberfläche

Info

Publication number: DE60303207T2
Application number: DE60303207T
Authority: DE
Inventors: Jan Harm HEKTOR; Rick Rink; Karin Scholtmeijer; Johannes Wemer; Maria Ewa ROGALSKA; Georges Alain WALCARIUS
Original assignee: Applied Nanosystems BV
Current assignee: Applied Nanosystems BV
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: DE60303207D1; ATE315579T1; WO2004000880A1; CN1675238A; EP1527090B1; EP1527090A1; AU2003238721A1; US20050238685A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bindung einer Verbindung an mindestens einen Teil einer Oberfläche eines Objekts, wobei das Verfahren den Schritt des Adsorbierens eines Hydrophobin-ähnlichen Stoffs an die Oberfläche umfasst.
Klassisch sind die Hydrophobine eine Klasse von kleinen ausgeschiedenen Cystein-reichen Proteinen von Pilzen oder Bakterien, welche sich zu amphipathischen Filmen zusammenlagern, wenn sie hydrophilen-hydrophoben Grenzflächen ausgesetzt werden. Einige Hydrophobine bilden instabile, andere extrem stabile amphipathische Filme. Für einige wurde durch Zusammenlagern an einer Wand-Luft-Grenzfläche gezeigt, dass sie eine hydrophobe Oberfläche bereitstellen, die eine Ultrastruktur in Form von Stäbchen besitzt, wie sie auf Lufthyphen und Sporen vorliegt. Für einige Hydrophobine wurde gezeigt, dass sie sich an Grenzflächen zwischen Wasser und Ölen oder hydrophoben Feststoffen zu amphipathischen Filmen zusammenlagern und dass sie an Adhäsions-Phänomenen beteiligt sein können. Es scheint, dass die Hydrophobine zu den am reichlichsten produzierten Proteinen von Pilzen zählen, und möglicherweise enthalten einzelne Arten mehrere Gene, die unterschiedliche Hydrophobine erzeugen, die eventuell für spezifische Zwecke maßgeschneidert sind.
Hydrophobine wurden nun mit verschiedenen Entwicklungsprozessen in Verbindung gebracht, z.B. mit der Bildung von Lufthyphen, Fruchtkörpern und Konidien, und möglicherweise spielen sie eine essentielle Rolle in der Pilz-Ökologie, umfassend Ausbreitung von Sporen, Pathogenese und Symbiose.
Hydrophobine erfüllen beim Wachstum und bei der Entwicklung von Pilzen ein breites Spektrum von Funktionen. Z.B. sind sie an der Bildung von hydrophoben Luftstrukturen (z.B. Lufthyphen und Fruchtkörpern) beteiligt und vermitteln die Anheftung von Hyphen an hydrophobe Oberflächen, wodurch morphogenetische Signale entstehen. Die Mechanismen, die diesen Funktionen zugrunde liegen, basieren auf der Fähigkeit von Hydrophobinen, sich an hydrophilen-hydrophoben Grenzflächen selbst zu amphipathischen Filmen zusammenzulagern.
Hydrophobine, die von unter Wasser vorliegenden Hyphen ausgeschieden werden, diffundieren in der wässrigen Umgebung und können sich an der Grenzfläche zwischen dem Medium und der Luft selbst zusammenlagern.
Dadurch entsteht ein riesiger Tropfen in der Oberflächenspannung des Wassers, wodurch die Hyphen in die Lage versetzt werden, die Grenzfläche zu durchbrechen und aus dem Wasser heraus in die Luft zu wachsen. Andererseits lagern sich Hydrophobine, die von Hyphen ausgeschieden werden, welche Kontakt zu einer hydrophoben Umgebung haben, an der Hyphenoberfläche selbst zusammen. Die hydrophile Seite des amphipathischen Films interagiert mit den hydrophilen Polysacchariden der Zellwand, während die hydrophobe Seite zur hydrophoben Umgebung exponiert wird. Lufthyphen und Sporen werden auf diese weise hydrophob, während Hyphen, die an einem hydrophoben Substrat entlang wachsen, sich fest an dieses anlagern. Hydrophobine sind somit in der Umgebung des Pilzes und an der Hyphenoberfläche aktiv. Darüber hinaus haben sie eine Funktion innerhalb der Matrix der Zellwand, wo sie die Zusammensetzung der Zellwand irgendwie beeinflussen. In diesem Fall scheint das monomere und nicht das selbst zusammengelagerte Hydrophobin beteiligt zu sein.
Das am besten charakterisierte Hydrophobin der Klasse I ist SC3 von Schizophyllum commune, jedoch zeigen bisherige Tests, dass andere Mitglieder dieser Klasse ähnliche Eigenschaften haben. Beim Kontakt mit hydrophilen-hydrophoben Grenzflächen lagern sich SC3-Monomere selbst zu einem 10 nm dicken amphipathischen Film zusammen. Die hydrophile und die hydrophobe Seite der SC3-Membran haben Wasser-Kontaktwinkel von 36° und 110°, so dass diese Seiten mäßig hydrophil (vergleichbar mit einem Kohlenhydrat) bzw. stark hydrophob sind (vergleichbar mit Teflon). Die Selbst-Zusammenlagerung von SC3 an der Grenzfläche umfasst verschiedene Konformationsänderungen. β-Faltblatt-reiche Monomere nehmen anfangs eine Konformation mit zunehmenden α-Helices an (α-Helix-Zustand). An der Wasser-Teflon-Grenzfläche wird SC3 in diesem intermediären Zustand gehalten, dagegen geht das Protein an der Wasser-Luft-Grenzfläche in eine Form mit zunehmenden β-Faltblättern über. Anfangs hat dieser so genannte β-Faltblatt-Zustand keine deutliche Ultrastruktur (β-Faltblatt I-Zustand), jedoch wird nach einigen wenigen Stunden ein Mosaik von Bündeln von 10 nm dicken Stäbchen beobachtet (β-Faltblatt II-Zustand). Diese Änderung in der Ultrastruktur geht mit keiner nachweisbaren Änderung in der Sekundärstruktur einher. Der Übergang vom α-Helix-Zustand zum β-Faltblatt-Zustand kann auch an einer Wasser-Feststoff-Grenzfläche erfolgen, er muss jedoch durch Erhöhen der Temperatur und durch Zufügen von Detergens induziert werden. Bei der Selbst-Zusammenlagerung ändern sich die Eigenschaften der Hydrophobine. Die Hydrophobine im β-Faltblatt-Zustand sind stark oberflächenaktiv, während Monomere keine nachweisbare Oberflächenaktivität besitzen. Außerdem ist die Lectinaktivität erhöht. Ferner scheint die Form des α-Helix-Zustands weniger stabil zu sein als die des β-Faltblatt-Zustands. Obwohl sich beide Formen stark an hydrophobe Oberflächen anheften, kann die α-Helix-Form dissoziiert und zur Bildung von Monomeren umgewandelt werden, indem sie mit kalten verdünnten Detergenzien behandelt wird. Im Gegensatz dazu wird die Konformation der β-Faltblatt-Form und ihre Wechselwirkung mit dem hydrophoben Feststoff durch diese Behandlung nicht beeinflusst. Hydrophobine, die chemisch oder genetisch modifiziert sein können, jedoch nicht sein müssen, können verwendet werden, um die biophysikalischen Eigenschaften einer Oberfläche zu verändern. Auf diese Weise könnte die Bindung von Molekülen oder Zellen an Oberflächen gesteuert werden. Z.B. könnte die Bindung von pathogenen Bakterien an Katheteroberflächen verringert werden, während die Bindung von menschlichen Fibroblasten an Implantatoberflächen gefördert werden könnte. Abgesehen von einer Änderung der biophysikalischen Eigenschaften könnten die Hydrophobine auch eingesetzt werden, um Moleküle an Oberflächen anzuheften, für die sie normalerweise keine hohe Affinität haben. Die Anheftung könnte durch eine chemische Vernetzung erreicht werden, nachdem das Hydrophobin an der Oberfläche zusammengelagert wurde. Z.B. könnten Proteine an die Mannosereste an der hydrophilen Seite von zusammengelagertem SC3 über eine Schiffsche Basen-Reaktion angeheftet werden. Andererseits können im Fall von Proteinen oder Peptiden Fusionsproteine hergestellt und dann an der Oberfläche von Interesse zusammengelagert werden. Der hier verwendete Begriff „Hydrophobin-ähnlicher Stoff" bezieht sich auf ein im Wesentlichen isoliertes oder gereinigtes amphipathisches Protein, das in der Lage ist, eine Oberfläche zu beschichten, wodurch eine hydrophobe Oberfläche im Wesentlichen hydrophil gemacht wird, oder umgekehrt, eine hydrophile Oberfläche im Wesentlichen hydrophob gemacht wird, und umfasst nicht nur Hydrophobine, wie sie aus der Natur isoliert werden können, die im Wesentlichen frei von anderen Pilz-Komponenten sind, z.B. Kohlenhydrat-Polymere wie Schyzophylan, sondern auch Stoffe, die durch chemische Modifikation von klassischerweise bekannten Hydrophobinen oder durch genetische Modifikation von Hydrophobin-Genen erhalten werden können, wodurch genetisch modifizierte Proteine erhalten werden, die zurzeit nicht aus der Natur verfügbar sind, die jedoch noch die gewünschten amphipathischen Eigenschaften besitzen. Klassischerweise bekannte Hydrophobine (vgl. z.B. WO 96/41882, worin auch eine Anleitung zum Herstellen von genetisch modifizierten Hydrophobin-ähnlichen Stoffen bereitgestellt wird) sind meist Proteine mit einer Länge von bis zu 125 Aminosäuren mit einer konservierten Sequenz X_n-C-X_5-9-C-C-X_11-39-C-X_8-23-C-X_5-9-C-C-X_6-18-C-X_m, wobei X natürlich eine beliebige Aminosäure darstellt und n und m natürlich unabhängig eine Zahl bedeuten, wie von Wessels et al. (Ref. 8) beschrieben.
Die meisten klassischen Hydrophobine enthalten die acht konservierten Cysteinreste, welche vier Disulfidbrücken bilden. Wenn jedoch die Disulfidbrücken eines Hydrophobins durch eine chemische Modifikation reduziert sind und die Sulfhydrylgruppen z.B. mit Iodacetamid blockiert sind, lagert sich das Protein in Wasser in Abwesenheit einer hydrophilen-hydrophoben Grenzfläche zusammen. Die Struktur ist nicht von derjenigen eines nativen Hydrophobins zu unterscheiden, das sich an der Wasser-Luft-Grenzfläche zusammengelagert hat.
Offensichtlich bewirken die Disulfidbrücken der Hydrophobine, dass die Monomere in Wasser, z.B. innerhalb der Zellen, in der sie produziert werden, oder in dem Medium löslich sind, wobei sie eine Selbst-Zusammenlagerung an einer hydrophilen-hydrophoben-Grenzfläche erlauben, wobei sie jedoch nicht erforderlich sind, um ihren amphipathischen Charakter per se bereitzustellen.
Bekannt sind Hydrophobine der Klasse I und der Klasse II, die jeweils eine Länge von etwa 100 Aminosäuren haben und charakteristische Hydropathie-Muster aufweisen. Die meisten, jedoch nicht alle, enthalten acht konservierte Cysteinreste, die intramolekulare Disulfidbrücken bilden. Hydrophobine können zwar möglicherweise glycosyliert sein, jedoch kommen die charakteristischen amphipathischen Eigenschaften dieser Proteine einzig und alleine durch ihre Aminosäuresequenzen zustande. Während die Aminosäuresequenzen von Hydrophobinen der Klasse II relativ gut konserviert sind, zeigen die Sequenzen von Hydrophobinen der Klasse I eine geringe Homologie.
Es wäre schwierig, wenn nicht sogar unmöglich, universelle Primer zu entwerfen, um Gene von Hydrophobinen der Klasse I z.B. durch eine Polymerase-Kettenreaktion zu gewinnen.
Tatsächlich lagern sich alle Hydrophobine, die physikalisch isoliert wurden, an hydrophilen-hydrophoben Grenzflächen selbst zu amphipathischen Membranen zusammen. Die eine Seite der Hydrophobin-Membran ist mäßig bis stark hydrophil (Wasser-Kontaktwinkel unter 90°, z.B. im Bereich zwischen 22° und 63°), während die andere Seite eine Oberfläche mit Wasser-Kontaktwinkeln im Wesentlichen über 90° zeigt, z.B. im Bereich zwischen 93° und 140°, die z.B. so hydrophob wie Teflon (Polytetrafluorethylen) oder Paraffin ist (Wasser-Kontaktwinkel bei etwa 110°). Die durch Hydrophobine der Klasse I gebildeten Membranen (z.B. diejenigen von SC3 und SC4 aus S. commune) sind stark unlöslich [wobei sie 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 100°C widerstehen], können jedoch durch Mittel, z.B. Ameisensäure (FA) oder Trifluoressigsäure (TFA), dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu dissoziieren Membranen der Hydrophobine der Klasse II Cerato-Ulmin (CU) von Ophiostoma ulmi und Cryparin (CRP) von Cryphonectria parasitica prompt in 60% Ethanol und in 2% SDS, während auch bekannt ist, dass zusammengelagertes CU dissoziiert, wenn man einen Druck anlegt oder es abkühlt. Die Selbst-Zusammenlagerung von Hydrophobinen geht mit Konformationsänderungen einher. Monomere Hydrophobine der Klasse I und der Klasse II sind reich an der β-Faltblatt-Struktur. An einer Wasser-Luft-Grenzfläche nehmen Hydrophobine der Klasse I mehr β-Faltblatt-Struktur an (der β-Faltblatt-Zustand genannt), während an der Grenzfläche zwischen Wasser und einem hydrophoben Feststoff eine Form mit vermehrter α-Helix festgestellt wird (α-Helix-Zustand). Der α-Helix-Zustand scheint ein Zwischenprodukt der Selbst-Zusammenlagerung zu sein, wohingegen der β-Faltblatt-Zustand wahrscheinlich die stabile Endform darstellt. An der Wasser-Luft-Grenzfläche nehmen Monomere von Hydrophobinen der Klasse I den α-Helix-Zustand innerhalb von Sekunden ein, dagegen erfolgt die Umwandlung in den β-Faltblatt-Zustand viel langsamer und nimmt Minuten bis Stunden in Anspruch. An der Wasser-Feststoff-Grenzfläche nimmt das Protein auch den α-Helix-Zustand prompt ein, man nimmt jedoch an, dass es in diesem Zwischenzustand festgehalten wird. Der β-Faltblatt-Endzustand kann dann erreicht werden, indem eine Kombination aus Hitze und verdünntem Detergens eingesetzt wird. Beide Formen von zusammengelagerten Hydrophobinen haben eine amphipathische Natur und können mit TFA dissoziiert werden, wodurch das Protein aufgefaltet wird.
Nach Entfernen des Lösungsmittels und Lösen in Wasser falten sich Hydrophobine der Klasse I wieder zur gleichen monomeren Struktur, die vor der Reinigung oder TFA-Behandlung festgestellt wurde. Jedoch kann auch bei den Hydrophobinen der Klasse II die Selbst-Zusammenlagerung und Zerlegung wiederholt werden, sogar nach der Dissoziation der Membran durch TFA. Dies zeigt, dass beide Klassen von Hydrophobinen gegenüber dieser Art von Behandlung sehr unverwüstlich sind.
Die Membran aus Hydrophobinen der Klasse I ist durch ein Mosaik von Bündeln aus 5 bis 12 nm breiten parallelen Stäbchen gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu wurden an Oberflächen der zusammengelagerten Hydrophobine der Klasse II CFTH1 von Claviceps fusiformis, CRP von C. parasitica und HFB1 und HFB2 von Trichoderma reesei keine Stäbchen gefunden. Ob das Fehlen von Stäbchen oder die Unterschiede im Stäbchendurchmesser eine funktionelle Signifikanz haben, ist noch nicht bekannt. Die Stäbchen der Hydrophobine der Klasse I, SC3 und SC4 von S. commune, sind den Fibrillen sehr ähnlich, die durch Amyloidproteine gebildet werden. Sie bestehen aus zwei Strängen von zwei bis drei Protofilamenten mit einem Durchmesser von jeweils etwa 2,5 nm, haben eine hohen Anteil an β-Faltblatt-Struktur und interagieren mit den fluoreszierenden Farbstoffen Thioflavin T (ThT) und Kongo-Rot. Diese Farbstoffe können als Sonden eingesetzt werden, um zwischen dem α-Helix-Zustand und dem β-Faltblatt-Zustand zu unterscheiden, wobei beide Farbstoffe stark dazu tendieren, den β-Faltblatt-Zustand anzufärben, nicht jedoch oder nur in geringem Umfang, den α-Helix-Zustand oder einen löslichen Hydrophobin-ähnlichen Stoff. Außerdem lagern sich SC3 und Amyloid-Proteine über Zwischenprodukte und nur oberhalb einer kritischen Konzentration selbst zusammen.
Die Ansicht wurde geäußert, dass die Bildung von Amyloid-Fibrillen bei vielen, wenn nicht bei allen Polypeptidketten vorkommt. Da jedoch die Bildung von Amyloid-Fibrillen mit einem Verlust der Funktion oder sogar mit einer Krankheit (z.B. Alzheimer-Krankheit) einher geht, wäre in der Evolution eine Selektion gegen die Tendenz zur Bildung solcher Fibrillen erfolgt. Jedoch reichen eine oder zwei Mutationen in einem Protein aus, um die Tendenz zur Bildung von Amyloid-Fibrillen deutlich zu steigern. Unseres Wissens sind Hydrophobine das erste Beispiel von funktionellen Amyloiden, die zahlreiche Funktionen in der Entwicklung von Pilzen ausüben. Kürzlich wurde gefunden, dass die vier Disulfidbrücken des Hydrophobins SC3 essentiell sind, um zu verhindern, dass das Protein in Abwesenheit einer hydrophilen-hydrophoben-Grenzfläche die Amyloid-Strukturen bildet. Wenn die Disulfidbrücken reduziert und die Sulfhydrylgruppen mit Iodacetamid blockiert wurden, lagerte sich das Protein spontan in Wasser zusammen. Seine Struktur war dann nicht von derjenigen des nativen SC3 zu unterscheiden, das sich an der Wasser-Luft-Grenzfläche zusammengelagert hatte. Offensichtlich bewirken die Disulfidbrücken der Hydrophobine, dass die Monomere in Wasser löslich sind (z.B. innerhalb der Zelle oder im Medium), und verhindern auf diese Weise eine vorzeitige Selbst-Zusammenlagerung. Dies würde erklären, warum in der Natur die meisten Hydrophobine acht konservierte Cysteinreste besitzen.
Hydrophobine gehören zu den am stärksten grenzflächenaktiven Molekülen. Mit einer maximalen Verminderung der Oberflächenspannung des Wassers von 72 auf 24 mJ m^–2 bei 50 μg ml^–1 ist SC3 das am stärksten grenzflächenaktive Protein, das bekannt ist. Andere Hydrophobine sind auch stark grenzflächenaktiv. Ihre Grenzflächenspannung-herabsetzende Aktivität ist mindestens ähnlich wie diejenige von herkömmlichen biologischen grenzflächenaktiven Mitteln. Im Gegensatz zu diesen grenzflächenaktiven Mitteln ist die Grenzflächenaktivität nicht abhängig von einem Lipid-Konjugat, sondern sie wird einzig und allein durch die Aminosäuresequenz bewirkt.
Während außerdem die maximale Herabsetzung der Grenzflächenspannung durch die traditionellen grenzflächenaktiven Mittel innerhalb von Sekunden erreicht wird, dauert es im Fall von Hydrophobinen der Klasse I Minuten bis Stunden. Dies lässt sich durch die Tatsache erklären, dass Hydrophobine die Oberflächenspannung von Wasser erst nach der Selbst-Zusammenlagerung, die von Konformationsänderungen im Molekül begleitet wird, herabsetzen.
Trotz der Tatsache, dass die Hydrophobine deutlich voneinander divergieren, sind ihre Eigenschaften insgesamt doch ähnlich. Diese Flexibilität wird auch durch die Tatsache erläutert, dass die gentechnische Entfernung von 25 der 31 Aminosäuren, welche vor dem ersten Cysteinrest des Hydrophobins SC3 stehen, wodurch ein verkürztes SC3 erzeugt wird, nur die Benetzbarkeit der hydrophilen Seite des zusammengelagerten Hydrophobins beeinflusste. Ein äußerst interessantes Hydrophobin ist das Trihydrophobin CFTH1 von C. fusiformis. Es enthält drei Klasse-II-Hydrophobin-ähnliche Einheiten, vor denen jeweils eine Gly-Asn-reiche Wiederholungseinheit steht, und verhält sich immer noch wie andere Hydrophobine der Klasse II. Hydrophobine können aufgrund ihrer Selbst-Zusammenlagerung an einer Grenzfläche zu amphipathischen Protein-Filmen die Benetzbarkeit von Oberflächen verändern.
Wie gesagt, besteht ein Verfahren zur Messung der Benetzbarkeit darin, den Kontaktwinkel abzuschätzen oder zu messen, den ein Wassertropfen zu der Oberfläche ausbildet. Ein großer Kontaktwinkel (> 90°) zeigt eine hydrophobe, ein kleiner Kontaktwinkel (< 90°) eine hydrophile Oberfläche an. Weiterhin werden in Gas/Flüssigkeits- oder Flüssigkeits/Flüssigkeits-Systemen, z.B. in kräftig geschütteltem Wasser oder in Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Dispersionen, Luftblasen oder Öltröpfchen in einer Hydrophobin-Lösung mit einem amphipathischen Film beschichtet, der sie stabilisiert. Feststoff/Flüssigkeits-Grenzflächen zeigen die gleiche Stabilisierung. Z.B. wird ein Plättchen eines hydrophoben Kunststoffs, z.B. Teflon (Kontaktwinkel 110°), das in ein Hydrophobin eingetaucht wird, mit einem stark haftenden Protein-Film beschichtet, der die Oberfläche vollständig benetzbar macht (Kontaktwinkel 48°), und zwar sogar noch nach einer SDS-Extraktion (Kontaktwinkel 62°), und die auf einer hydrophilen Oberfläche getrockneten Hydrophobin-Monomere machen die Oberfläche hydrophob.
Die klassischen Hydrophobine werden i) typischerweise aus Pilzen isoliert, z.B. aus Schizophyllum commune (Ref. 8), jedoch können sie jetzt auch rekombinant hergestellt werden; oder ii) umfassen ein Polypeptid, das eine Identität von mindestens 40% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 5% mit mindestens einem Polypeptid aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus i) den Aminosäuren 29 bis 131 der SEQ ID NO: 1 und ii) den Aminosäuren 29 bis 133 der SEQ ID NO: 2. Ein solches Protein kann von einem filamentösen Bakterium stammen, insbesondere einem Bakterium, das in der Lage ist, Lufthyphen zu bilden, z.B. einem Actinomyceten, und insbesondere kann das filamentöse Bakterium eine Streptomyces-Art sein. Eine Streptomyces-Art, aus der das Protein unter Verwendung von Standardverfahren zur Isolierung von Hydrophobinen isoliert werden kann, ist eine Streptomyces-Art, die mit einem Konstrukt transformiert wurde, das aus einem E. coli-Stamm isoliert werden kann, der am 14. März 2000 unter der Hinterlegungsnummer CBS 102638 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures (Oosterstraat 1, P. O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande) hinterlegt wurde. Dies wird in PCT/NL01/00268 offenbart.
Scholtmeijer et al. (Appl. Environm. Microbiol. 68 (3): 1367–1373, 2002) haben Fusionsproteine von Hydrophobinen mit der Zell-bindenden Domäne von Fibronectin (RGD) verwendet, um Hydrophobin-Schichten mit reaktiven Verbindungen zu versehen.
Wenn man keine Fusionsproteine verwendet, würde die einzige Möglichkeit, eine Hydrophobin-Schicht mit reaktiven Verbindungen zu versehen, darin bestehen, eine kovalente Kopplung durchzuführen. Wenn man berücksichtigt, dass Mannosen die einzige Glycosylierung darstellen, die für Hydrophobine bekannt ist, sind diese das Ziel der Wahl, um Verbindungen kovalent an Hydrophobin zu binden. Insbesondere Wessels et al. (Advances in Microbial Physiology 38: 1–45 (1997)) schlagen die Anheftung kleiner Liganden an eine Hydrophobin-Schicht über eine kovalente Bindung oder Kopplung von Aminogruppen an Aldehydgruppen auf Mannoseresten vor (S. 35). Das darin angegebene Beispiel betrifft die Kopplung eines Proteinmoleküls an eine Hydrophobin-Schicht, die auf einer Goldoberfläche vorliegt. Außerdem schlagen Scholtmeijer et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 1–8, 2001) eine chemische Vernetzung des Hydrophobins und der reaktiven Verbindung oder als eine Alternative Fusionsproteine vor. Jedoch ist es bei einigen reaktiven Verbindungen nicht möglich, diese mit Hydrophobinen zu vernetzen oder zu fusionieren, ohne die Funktionalität der reaktiven Verbindung zu schädigen.
Weiterhin wird von Bilewicz et al., in: J. Phys. Chem. B 2001, 105: 9772–9777, vom August 2001, ein Verfahren beschrieben, das die Funktionalisierung von Elektrodenoberflächen mit den kleinen elektroaktiven Verbindungen Q10, Azobenzol oder Q0 möglich macht, dies zeigt, dass das Hydrophobin HYPDPt-1 für elektroaktive Moleküle, abhängig von ihrer Struktur, als ein molekularer Kleber oder als eine Matrix fungieren kann. Jedoch besteht immer noch ein Bedarf für ein Verfahren, mit dem eine Hydrophobin-Schicht mit solchen reaktiven Verbindungen versehen werden kann, die für Änderungen in ihrer Struktur empfindlich sind und bei denen ihre biologische Funktion von dieser Struktur abhängig ist.
Die Erfindung stellt nun ein Verfahren zum Versehen einer Oberfläche eines Objekts mit einer reaktiven Verbindung bereit, die keine kleine elektroaktive Verbindung ist, wobei das Verfahren die Schritte des Beschichtens von mindestens einem Teil der Oberfläche mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff und des Inkontaktbringens der Verbindung mit dem beschichteten Hydrophobin-ähnlichen Stoff zum Bilden einer Beschichtung umfasst, welche die Verbindung in einer nicht-kovalent gebundenen Form oder mindestens nicht-kovalent gebunden an ein Hydrophobin umfasst.
Eine kleine elektroaktive Verbindung ist in der Definition hier eine Verbindung, die Änderungen im Oxidationszustand, d.h. eine Redoxreaktion, durchläuft und die weiterhin ein Molekulargewicht hat, das niedriger ist als das Molekulargewicht von Hydrophobin, insbesondere ein Molekulargewicht von weniger als 2000 Dalton, stärker bevorzugt von weniger als 1000 Dalton. Eine reaktive Verbindung ist hier so definiert, dass sie Proteine (umfassend Peptide und Glycoproteine) und Nucleinsäuren umfasst.
Hier wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, in dem eine erste (nicht-kovalent angeheftete) reaktive Verbindung z.B. einen proteinartigen Stoff, z.B. ein Peptid, jedoch vorteilhafterweise ein Polypeptid mit einem höheren Molekulargewicht als ein klassischerweise bekanntes Hydrophobin (d.h. > 15 kD), umfasst, der/das an diese Beschichtung nicht-kovalent angeheftet wird, ohne im Wesentlichen seine Reaktivität zu verlieren. Erstaunlicherweise kann eine wesentliche nicht-kovalente Anheftung einer solchen Verbindung an eine Oberfläche erreicht werden, wodurch vorzugsweise die Reaktivität der Verbindung, z.B. eine enzymatische Aktivität, oder ihre Tendenz zur Bindung an einen Liganden oder ein Antigen erhalten bleibt indem die Oberfläche in eine Lösung eingetaucht wird, welche die Verbindung umfasst. Während normalerweise angenommen wird, dass eine kovalente Bindung im Wesentlichen mit dem Vorliegen von einem glycosylierten Hydrophobin zusammenhängt, wird nun gezeigt, dass die Oberflächen auch mit größeren Molekülen versehen werden können, wenn die Beschichtung im Wesentlichen frei von Mannoseresten ist, die eine solche kovalente Bindung ermöglichen würden. Dies erleichtert die Verwendung von anderen Hydrophobin-ähnlichen Stoffen für die Beschichtung von Objektoberflächen, an die größere Moleküle angeheftet werden können. Während man in herkömmlichen Verfahren SC3 eingesetzt hat, das in seinen natürlichen Zuständen mit einer N-terminalen Seite, die glycosylierte Reste umfasst, versehen ist, ist es auch möglich, nicht-glycosylierte Substanzen, z.B. trSC3 (verkürztes SC3), bei dem das glycosylierte N- Ende fehlt, jedoch auch andere Hydrophobin-ähnliche Stoffe zu verwenden, die durch einen amphipathischen Protein-Charakter gekennzeichnet sind, z.B. diejenigen, die nicht alle die klassischerweise konservierten Cysteinreste an den richtigen Stellen aufweisen und im Wesentlichen in der Lage sind, eine hydrophobe Oberfläche mit einer hydrophilen Beschichtung zu versehen, und umgekehrt.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Objekt bereit, bei dem mindestens ein Teil seiner Oberfläche mit einer amphipathischen Hydrophobin-ähnlichen Beschichtung (oder Membran) versehen ist, wobei die Beschichtung zusätzlich mit einer reaktiven Verbindung versehen wird, die keine kleine elektroaktive Verbindung ist. Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass die reaktive Verbindung viel größere Molekulargewichte haben kann als z.B. Q10, Azobenzol oder Q0, wobei eine nicht-kovalente Bindung nun für eine reaktive Verbindung bereitgestellt wird, die ein Molekulargewicht (MG) von größer als 1 Kilodalton (kD), vorzugsweise größer als 2 kD, stärker bevorzugt größer als 15 kD, stärker bevorzugt größer als 50 kD, aufweist. Weiterhin wird eine Bindung auch dann bereitgestellt, wenn die Beschichtung im Wesentlichen frei von Mannoseresten ist, wodurch eine Bindung von Peptiden oder Polypeptiden oder anderen proteinartigen Stoffen unabhängig von einer kovalenten Vernetzung an Mannosereste möglich gemacht wird, so dass viel mehr Hydrophobin-ähnliche Stoffe, die mit einer reaktiven Verbindung versehen werden können, verfügbar bleiben als die herkömmlichen bekannten glycosylierten Hydrophobine. Wie gesagt, macht es eine solche Bindung nun möglich, Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Bindungsmoleküle per se und andere aktive Proteine (oder für einen bestimmten Zweck eine Nucleinsäure, die eine Hybridisierung erlaubt) zu binden, die nicht in ihren die (Sekundär- oder Tertiär-) Konformation betreffenden Voraussetzungen behindert sind, wie dies häufig der Fall ist, wenn eine herkömmliche Vernetzung verwendet wird, so dass ihre Reaktivität intakt bleibt. Der Vorteil des Immobilisierens von Proteinen, z.B. Enzymen oder Antikörpern, liegt auch häufig in einer langfristigeren Stabilität, wobei jedoch auch eine erhöhte Stabilität bei höheren Temperaturen oder extremeren pH-Werten festgestellt wird.
Für ein weiteres Beispiel umfasst ein Objekt, in dem die reaktive Verbindung eine Nucleinsäure umfasst, vorzugsweise ein Gen-Chip oder ein DNA- (oder für diesen Zweck RNA- oder PNA-) Array, wodurch es z.B. möglich gemacht wird, die Expression eines Gens zu charakterisieren. Eine Nucleinsäure, die an die Hydrophobin-ähnliche Beschichtung nicht-kovalent gebunden ist, macht verbesserte Hybridisierungsprotokolle möglich.
Im Allgemeinen stellt die Erfindung ein Objekt bereit, das eine Oberfläche aufweist, die eine hydrophobe/hydrophile Grenzfläche umfasst und die eine reaktive Verbindung umfasst, die keine kleine elektroaktive Verbindung ist, dabei kann eine solche Oberfläche eine Flüssig/Flüssig-Grenzfläche, z.B. eine Öl/Wasser-Grenzfläche, umfassen, sie kann eine Fest/Flüssig-Grenzfläche, z.B. eine Feststoff/Wasser-Grenzfläche, oder sogar eine Feststoff/Feststoff-Grenzfläche umfassen, wobei insbesondere ein erster Feststoff eine hydrophobe Oberfläche und ein zweiter Feststoff eine hydrophile Oberfläche umfasst. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem ein Objekt erhalten wird, bei dem mindestens ein Teil seiner Oberfläche an der Grenzfläche mit einer amphipathischen Hydrophobin-ähnlichen Beschichtung versehen ist, wobei die Beschichtung zusätzlich mit einer reaktiven Verbindung versehen wird, wodurch erreicht wird, dass die Verbindung reaktiv, d.h. stabil und aktiv, bleibt, und wodurch sogar eine längere Lagerung in einer im Wesentlichen wasserarmen oder sogar ganz trockenen Form an der beschichteten Oberfläche erreicht wird, wobei das Verfahren ein Inkontaktbringen des Objekts mit einer Lösung einer Hydrophobin-ähnlichen Verbindung zum Erhalten eines beschichteten Objekts und ein Inkontaktbringen des beschichteten Objekts mit einer Lösung, die mindestens eine reaktive Verbindung enthält, unter Bedingungen umfasst, die für die Beschichtung der Oberfläche und für die Anheftung der reaktiven Verbindung an die Beschichtung günstig sind. Ein Vorteil bei der Verwendung von Hydrophobin-ähnlichen Stoffen besteht darin, dass sie in großen Mengen billig produziert werden können. Hydrophobin-ähnliche Stoffe können z.B. aus der Natur isoliert werden, oder sie können aus genetisch modifizierten Organismen erhalten und gereinigt werden, wobei die Verfahren gemäß Wessels und Wösten et al. (Wessels, J. G., 1997, Adv. Microb. Physiol. 38: 1–45; Wösten, H. A. B., et al., 1993, The Plant Cell 5: 1567–1574) und Modifikationen davon eingesetzt werden können. Vor der Verwendung kann der gefriergetrocknete Hydrophobin-ähnliche Stoff mit reiner TFA zerlegt und in einem Strom von Stickstoff oder gefilterter Luft getrocknet werden. Das monomere Protein kann in einer wässrigen Lösung, z.B. 50 mM Phosphatpuffer, oder Wasser gelöst werden.
Wie vorstehend erwähnt, zählen die Hydrophobine zu den am reichlichsten vorhandenen Proteinen, die von Pilzen ausgeschieden werden. Hydrophobine der Klasse I scheinen aufgrund der Stabilität der zusammengelagerten Filme am vielversprechendsten für die Anwendung zu sein. Diese Hydrophobine scheinen besonders im Kulturmedium von Mitgliedern der Basidiomyceten reichlich vorhanden zu sein. Z.B. wurde berechnet, dass in vier Tage alten Kulturen von Schizophyllum commune etwa 15% des in Protein eingebauten ³⁵S in die Synthese des Hydrophobins SC3 geht, wobei bis zu 20 mg SC3 aus 1 Liter Kulturmedium durch ein einfaches Verfahren problemlos gereinigt werden können, das auf den außerordentlichen Eigenschaften des Proteins beruht, nämlich dass ein Eintauchen an hydrophoben/hydrophilen Grenzflächen ausreicht, um den Hydrophobin-ähnlichen Stoff zu akkumulieren. Die Ausbeute kann durch die richtige Auswahl von Stämmen, wobei Stämme ausgewählt werden, die genetisch modifizierte Hydrophobine ergeben, und durch ein Optimieren der Kulturbedingungen noch weiter gesteigert werden, dies ist auch durch molekulargenetische Verfahren möglich, z.B. Erhöhen der Gen-Dosis und heterologe Produktion in Pilzen, die in der Fermentationsindustrie üblicherweise eingesetzt werden. Andererseits sollte man sich deutlich machen, dass die Mengen, die für bestimmte Anwendungen erforderlich sind, häufig klein sind. Dies wird auch dadurch verdeutlicht, dass die Natur ein „teures" Produkt wie ein Protein zum Verändern der Benetzbarkeit von Oberflächen nutzt. Tatsächlich handelt es sich bei dem zusammengelagerten amphipathischen Film um eine Monoschicht. Jedoch muss eine Oberfläche, die mit einer Monoschicht aus Hydrophobin-ähnlichen Stoffen beschichtet wird, nicht mit nur einer einzelnen Monoschicht beschichtet werden, sondern kann auch mit mehreren Monoschichten des Stoffs beschichtet werden. Die Dicke dieser einzelnen Monoschicht beträgt nur etwa 10 nm, und somit ist sehr wenig Hydrophobin erforderlich, um eine drastische Änderung in der Benetzbarkeit zu erreichen. Z.B. kann man aus der Zahl der an Teflon adsorbierten SC3-Moleküle berechnen, dass etwa 1,5 mg SC3-Hydrophobin ausreicht, um 1 m² einer Teflon-Oberfläche zu beschichten, wobei bewirkt wird, dass die Hydrophobie dieser Oberfläche von einem Wasser-Kontaktwinkel von 110° auf 48° abnimmt.
Eine weitere wichtige Lektion aus der Natur besteht darin, dass eine Pilzart verschiedene Hydrophobine für unterschiedliche Zwecke herstellt. Z.B. tritt in S. commune ein SC3-Film auf, um Lufthyphen zu beschichten und diesen Strukturen wasserabweisende Eigenschaften zu verleihen, wohingegen Luftkanäle in Fruchtkörpern mit einer Zusammenlagerung des Hydrophobins SC4 ausgekleidet sind. Man fragt sich, ob mögliche biophysikalische Unterschiede in den Eigenschaften dieser Filme an unterschiedliche Funktionen angepasst sind, insbesondere da Hydrophobine aus ganz verschiedenen Arten näher verwandt sein können als unterschiedliche Hydrophobine innerhalb einer bestimmten Art. Dies ist sicherlich ein Punkt, den man bei biomimetischen Stoffen beachten muss, bevor man die Gentechnik einsetzt, um ein Hydrophobin für einen spezifischen Zweck maßzuschneidern.
In diesem Zusammenhang findet ein Objekt mit einer beschichteten Oberfläche gemäß der Erfindung z.B. in der Gewebetechnik Verwendung, wobei insbesondere hydrophobe Oberflächen beschichtet werden, um ihre Biokompatibilität zu erhöhen. Wie bereits festgestellt, ist die Anheftung des Hydrophobin-Films an hydrophobe Oberflächen sehr fest und die Änderung in der Benetzbarkeit der Oberfläche signifikant. Z.B. findet auch ein Objekt mit einer beschichteten Oberfläche gemäß der Erfindung Verwendung, um die Biokompatibilität von medizinischen Implantaten zu erhöhen, umfassend künstliche Blutgefäße und chirurgische Instrumente. Außerdem können Objekte, z.B. hydrophobe Feststoffe oder Flüssigkeiten (Öle), in Wasser dispergiert werden, indem sie mit einem Hydrophobin beschichtet werden. Ölvesikel, die mit einem Hydrophobin-Film beschichtet sind, können z.B. zum Verabreichen von lipophilen Arzneistoffen eingesetzt werden. Kurz gesagt, ist es die Eigenschaft von Hydrophobinen, eine Oberfläche mit einer sehr dünnen Schicht (etwa 10 nm) zu beschichten und dadurch die Natur dieser Oberfläche dramatisch zu verändern, wodurch es möglich gemacht wird, diese Proteine in der Nanotechnologie einzusetzen. Ursprünglich sind die monomeren Formen am besten wasserlöslich, jedoch lassen sich, im Gegensatz zu den zusammengelagerten Zuständen (α-Helix-Zustand oder β-Faltblatt-Zustand), möglicherweise auch einige Tetramere finden, die in Lösung vorliegen.
Das Zusammenfügen erfolgt bei einem großen Spektrum von Temperaturen, jedoch sollte man beim Einbau von einer reaktiven Verbindung die jeweilige Empfindlichkeit einer solchen Verbindung gegenüber einer Spaltung durch Hitze beachten. Z.B. werden die meisten Enzyme bei höheren Temperaturen als 50°C instabil; jedoch können auch hitzestabile Enzyme eingesetzt werden. Im Allgemeinen verbessert sich die Beschichtung mit der Zeit, weshalb empfohlen wird, im Allgemeinen eine Inkubationszeit von etwa 16 Stunden (d.h. über Nacht) zu verwenden, um eine Oberfläche zu beschichten. Jedoch tritt die Hydrophobin-Beschichtung bereits nach 30 Sekunden auf, abhängig von der in der Lösung vorliegenden Konzentration der Monomere. Eine ausreichende Beschichtung wird erhalten, so lange die Lösung in der Lage ist, die vorstehend beschriebene Monoschicht auf der Oberfläche des Objekts durch Selbst-Zusammenlagerung der Verbindung zu bilden. Eine solche Lösung enthält mindestens 100 ng, besser 1 μg, vorzugsweise 2 μg, stärker bevorzugt 20 bis 100 μg einer Hydrophobin-ähnlichen Verbindung pro ml. Durch eine Überdosierung wird im Allgemeinen die Beschichtung nur beschleunigt, die Beschichtung selbst jedoch nicht verbessert. Ein Verfahren ist bevorzugt, in dem das beschichtete Objekt mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff vorbehandelt wird, bevor das beschichtete Objekt mit der reaktiven Verbindung in Kontakt gebracht wird. Außerdem ist bevorzugt, dass eine Vorbehandlung ausgewählt wird, die ein Inkontaktbringen des beschichteten Objekts mit einer Detergenslösung, z.B. Tween 20 (Polysorbat 20), NP40 (Nonidet P-40) oder SDS-Lösung, umfasst. Nach der Beschichtung mit dem Hydrophobin ist es bevorzugt, das beschichtete Objekt in der Lösung auf 30 bis 80°C zu erhitzen. Alternativ wählt man einen α-Helix-Zustand oder einen β-Faltblatt-Zustand.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, in dem das Objekt nach der Immobilisierung einer reaktiven Verbindung anschließend mit einer amphipathischen Hydrophobin-ähnlichen Verbindung beschichtet wird, die zu mindestens 80%, besser 90 oder vorzugsweise 99% in dem α-Helix-Zustand vorliegt, wodurch ein Blockierungsverfahren für Array-Systeme bereitgestellt wird. Auf diese Weise stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, mit dem ein Objekt hergestellt werden kann, z.B. ein Array-System zum Testen mit Nucleinsäure (die DNA, RNA oder PNA sein kann) oder ein Testsystem für den immunologischen Nachweis (der eine ELISA-Platte oder eine andere Oberfläche sein kann, an der Bindungswechselwirkungen wie zwischen einem Antikörper und einem Antigen stattfinden können), bei dem mindestens ein Teil seiner Oberfläche mit einer reaktiven Verbindung versehen ist, wobei die Oberfläche außerdem mit einer amphipathischen Hydrophobin-ähnlichen Beschichtung versehen wird. Außerdem wird bereitgestellt, dass eine solche Blockierung aus einer Hydrophobin-ähnlichen Beschichtung besteht, die im Wesentlichen im α-Helix-Zustand vorliegt. Weiterhin stellt die Erfindung die Verwendung eines Verfahrens, wie hier beschrieben, zur Beschichtung der Oberfläche eines Objekts bereit. Die Oberfläche kann zwischen einer einfachen geraden oder einer komplizierten gekrümmten Oberfläche variieren, die an der Innenseite oder der Außenseite des Objekts liegt. Z.B. kann auch die Kapillaraktivität von kleinen Röhren oder Mikrokügelchen oder Mikroschwämmen moduliert werden, indem die Kapillaren mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff, der mit einer reaktiven Verbindung versehen ist, gemäß der Erfindung ausgekleidet werden.
Insbesondere wird hier bereitgestellt, Oberflächen von Objekten mit reaktiven Molekülen proteinartiger Natur zu versehen, wobei ein solches Molekül einen herkömmlichen (poly- oder monoclonalen) oder synthetischen Antikörper oder Fragmente davon, z.B. Fab oder einzelkettige Antikörper, oder andere bindende Moleküle (gegebenenfalls zusätzlich mit einem Enzym versehen, z.B. einer Peroxidase, oder mit einer fluoreszierenden Gruppe), ein Enzym, z.B. Glucose-Oxidase oder Cholesterin-Oxidase oder Peroxidase oder Monooxygenase, wie hier in der genauen Beschreibung bereitgestellt, oder alkalische Phosphatase, Luciferase, Esterase, Lipase oder Trypsin oder Kombinationen von Enzymen, einen Rezeptor zum Messen von Lig und Wechselwirkung, einen Licht-Rezeptor oder Lichtsammelkomplex, Kombinationen davon usw. umfassen kann. Insbesondere diejenigen Verbindungen, bei denen eine kovalente Bindung häufig zu einem Verlust an Reaktivität führt, behalten, wenn sie mit einem Verfahren gemäß der Erfindung gebunden werden, im Wesentlichen ihre Reaktivität gegenüber Liganden, Antigenen, Substraten usw. bei, vermutlich genau deshalb, weil die Bindung mit der Beschichtung eine nicht-kovalente Bindung ist. Eine solche Reaktivität kann z.B. durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz, SPR, auch als das BI-ACORE-Sensor-System bekannt) gemessen werden, wodurch ein empfindlicher Nachweis von molekularen Wechselwirkungen in Echtzeit ohne die Verwendung von Markierungen möglich wird. Eine (hydrophobe) Oberfläche eines Goldobjekts wird mit einer Hydrophobin-Lösung beschichtet, indem sie einfach für eine bestimmte Zeit inkubiert wird (wobei im Allgemeinen eine halbe Stunde ausreicht). Danach wird die Oberfläche mit Wasser gewaschen, um jegliches ungebundenes Hydrophobin zu entfernen. Die Oberfläche kann mit einem Detergens behandelt werden, um eine Beschichtung im β-Faltblatt-Zustand zu erhalten. Die Oberfläche kann direkt verwendet werden, um kleine Moleküle (wie Ubichinon), Peptide, Proteinenzyme, Lipide, Nucleinsäuren usw. zu binden. Die Massenzunahme kann nachgewiesen werden und stellt ein Verfahren dar, mit dem die Menge des an einen bestimmten mit Hydrophobinen beschichteten Oberflächenbereich gebundenen Materials quantitativ bestimmt werden kann.
Außerdem stellt die Erfindung ein Objekt bereit, das eine Oberfläche besitzt, die für den Nachweis von spezifischen molekularen Wechselwirkungen eingesetzt werden kann, z.B. für den Nachweis von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen in Display-Technologien oder in einem ELISA-Test oder für den Nachweis von Nucleinsäure-Nucleinsäure-Wechselwirkungen, die DNA, RNA oder PNA sein können. Hydrophobine sind aufgrund ihrer amphipathischen Natur die idealen Blockierungsmittel. Durch Beschichten einer hydrophoben Oberfläche mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff wird die „Klebrigkeit" einer hydrophoben Oberfläche herabgesetzt und deshalb die unspezifische Bindung von hydrophoben Verbindungen an hydrophobe Bereiche vermindert.
Dadurch wird die Leistungsfähigkeit eines solchen Nachweisverfahrens verbessert. Die Erfindung stellt ein Objekt bereit, bei dem mindestens ein Teil der Oberfläche mit einer reaktiven Verbindung versehen ist, wobei die Oberfläche außerdem mit einer Hydrophobin-ähnlichen Verbindung versehen wird, um unerwünschte unspezifische Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu verringern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche eines festen Trägers, z.B. einer ELISA-Platte, mit einem Antikörper beschichtet, und danach wird die Oberfläche weiterhin mit einer Lösung von monomerem Hydrophobin behandelt, wobei die Reaktivität der Verbindung im Wesentlichen unverändert bleibt und die unspezifischen Bindungseigenschaften auf der Oberfläche reduziert werden. Insbesondere ist die Verbindung eine hydrophobe Verbindung oder eine Verbindung, die einen hydrophoben Anker enthält. Solche Verbindungen zählen zu den Verbindungen, die in der Hydrophobin-Beschichtung extrem stabil erhalten bleiben.
Man nimmt an, dass eine ebene hydrophobe Verbindung oder ein Anker von Nutzen sein kann. In der vorliegenden Beschreibung ist der Begriff „Anker" so zu verstehen, dass er einen Teil der Verbindung bedeutet, wobei der Teil eine Seite und/oder Einheit aufweist, welcher hydrophile Gruppen fehlen. Außerdem wird angenommen, dass das Fehlen oder eine reduzierte Zahl von negativen und/oder positiven Ladungen vorteilhaft ist. Wenn eine Ladung vorliegt, stammt sie vorzugsweise von schwach sauren oder basischen Gruppen, die ein Wasserstoffion freisetzen oder aufnehmen können, um die Ladung zu entfernen.
Die Erfindung wird in der hier angegebenen genauen Beschreibung noch weiter beispielhaft dargestellt.
Genaue Beschreibung
1. Immobilisierung von Glucose-Oxidase an eine glasartigen Kohleelektrode
Eine glasartige Kohleelektrode wurde mit Hydrophobin beschichtet, indem die Elektrode in eine Hydrophobin-Lösung (100 μg/ml) gelegt und 15 Minuten inkubiert wurde, danach wurde die Elektrode gründlich mit Wasser gespült. Anschließend wurde die beschichtete Elektrode in eine Glucose-Oxidase-enthaltende Lösung (SIGMA, 210 000 Einheiten/g Feststoff, Endkonzentration 1,8 mg/ml) zwei Stunden eingetaucht und danach mit Wasser gespült.
Die modifizierte und mit dem Enzym funktionalisierte Elektrode wurde in ein Drei-Elektroden-System eingebaut, umfassend eine Ag/AgCl-Referenzelektrode und eine Pt-Gegenelektrode, wobei Phosphatpuffer pH 7 (25 mM) verwendet wurde. Wenn Glucose zugefügt wurde, katalysierte die immobilisierte Glucose-Oxidase die Reaktion, die zur Bildung von Wasserstoffperoxid führte, das als ein kleiner Strom nachgewiesen werden konnte, der zur Glucose-Konzentration proportional war. Die Glucose-Oxidase blieb bei der Immobilisierung an die Hydrophobin-Schicht aktiv.
Die modifizierte Elektrode wurde in einem dicht verschlossenen Behälter, nicht in Flüssigkeit, bei 4°C gelagert und häufig auf Aktivität und Reaktion auf Glucose getestet. Innerhalb des Testzeitraums von 67 Tagen behielt die Elektrode ihre Aktivität bei und wurde durch das häufige Testen nicht beeinflusst.
2. Immobilisierung von Cholesterin-Oxidase an eine glasartige Kohleelektrode
Eine glasartige Kohleelektrode wurde mit Hydrophobin beschichtet, indem die Elektrode in eine Hydrophobin-Lösung (100 μg/ml) gelegt und 15 Minuten inkubiert wurde, danach wurde die Elektrode gründlich mit Wasser gespült. Anschließend wurde die beschichtete Elektrode in eine Cholesterin-Oxidase-enthaltende Lösung (2 mg/ml) zwei Stunden eingetaucht und danach mit Wasser gespült. Die modifizierte und mit dem Enzym (Cholesterin-Oxidase, 0,5 U/ml) funktionalisierte Elektrode wurde in ein Drei-Elektroden-System eingebaut, umfassend eine Ag/AgCl-Referenzelektrode und eine Pt-Gegenelektrode, wobei Phosphatpuffer pH 7 (25 mM) als Elektrolyt verwendet wurde. Um die schlechte Löslichkeit von Cholesterin in Wasser zu umgehen, wurde das Cholesterin in Isopropanol mit Triton in Phosphatpuffer gelöst (Ropers, M.-H., et al., 2001, Phys. Chem. Chem. Phys. 3: 240–245).
Wenn Cholesterin zugefügt wurde, katalysierte die immobilisierte Cholesterin-Oxidase die Reaktion, die zur Bildung von Wasserstoffperoxid führte. Das Peroxid ergab einen kleinen, über die Elektrode nachweisbaren Strom, der auf die zugegebene Cholesterin-Konzentration bezogen wurde. Dieses Beispiel zeigte die Immobilisierung von Cholesterin-Oxidase, die dabei aktiv blieb.
3. Immobilisierung von Glucose-Oxidase und Peroxidase
Zusätzlich zur Immobilisierung an einer Elektrodenoberfläche wurde Glucose-Oxidase auch an beschichteten Plättchen aus Teflon (Polytetrafluorethylen, PTFE) immobilisiert. Die Beschichtung wurde erreicht, indem das Teflon bei 25°C in 2 ml einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung (hier wurden in getrennten Experimenten SC3, trSC3 und SC4 verwendet) in einem 3-ml-Glasgefäß 15 Minuten inkubiert wurde. Die Plättchen wurden aus der Hydrophobin-Lösung entnommen und mit großen Mengen Wasser gewaschen, um jegliches ungebundenes Hydrophobin zu entfernen. Die Glucose-Oxidase wurde immobilisiert, indem die beschichteten Teflon-Plättchen in einer Glucose-Oxidase-enthaltenden Lösung (1 mg/ml) zwei Stunden inkubiert und danach mit Wasser gespült wurden.
Das Vorliegen und die Aktivität der immobilisierten Glucose-Oxidase wurden getestet, indem die behandelten Teflon-Plättchen in einer Lösung mit Peroxidase (1520 U/mg, SIGMA; Konzentration 0,4 mg/ml) und o-Dianisidin (Endkonzentration 68 μg/ml) inkubiert wurden, das, wenn es oxidiert wird, bei 435 nm absorbiert und eine sichtbare Farbe ergibt. Bei Zugabe von Glucose wurde eine Absorption bei 435 nm beobachtet, wodurch die Oxidation von o-Dianisidin durch Peroxidase angezeigt wurde. Die Oxidation von o-Dianisidin stand in einem direkten Zusammenhang mit der durch die Glucose-Oxidase gebildeten Menge an Peroxid und damit mit der Glucose-Konzentration.
Andererseits wurde die Peroxidase an Teflon immobilisiert und Glucose-Oxidase in der Lösung zugegeben. Eine Färbung der Lösung bei Zugabe von Glucose zeigte die Aktivität der immobilisierten Peroxidase an.
Andererseits wurde die Glucose-Oxidase an das eine Teflon-Plättchen immobilisiert, während die Peroxidase an ein anderes Teflon-Plättchen immobilisiert wurde. Beide Plättchen wurden in einen Behälter gegeben, der o-Dianisidin enthielt, und bei Zugabe von Glucose nahm die Lösung eine Farbe an. Dies zeigte die Möglichkeit, mehrere Enzyme zu immobilisieren, die dann eine aus mehreren Schritten bestehende Reaktion katalysieren können.
Die Entfernung des beschichteten und funktionalisierten Teflons reichte aus, um die Reaktion zu stoppen, dies macht deutlich, dass die Enzyme sich nicht von der Oberfläche abgelöst haben. Das funktionalisierte Teflon ist auch nach einer Lagerung von mehreren Wochen bei 4°C noch aktiv.
4. Immobilisierung von verschiedenen Enzymen an eine Teflon-Oberfläche
Oxido-Reduktasen (Glucose-Oxidase, Peroxidase, Laccase), Hydrolasen (Lipase, Esterase) und eine Protease (Trypsin) wurden über das Hydrophobin SC3 an Teflon immobilisiert. Zuerst wurde die Oberfläche mit dem Hydrophobin SC3 beschichtet, indem sie für etwa 30 Minuten in die wässrige Proteinlösung (0,3 mg/ml) eingetaucht wurde. Danach wurde die erhaltene modifizierte Oberfläche für etwa 30 Minuten in eine wässrige Enzymlösung eingetaucht. Nach jedem Schritt wurde die Teflon-Oberfläche mit einer geeigneten Pufferlösung gespült. Die Aktivität der immobilisierten Enzyme wurde durch Spektrophotometrie bei 412 und 435 nm verfolgt, nachdem die funktionalisierte Oberfläche in die entsprechende Substratlösung eingetaucht worden war. Die optische Dichte der Lösung nimmt nach dem Eintauchen der funktionalisierten Oberfläche zu und bleibt nach ihrer Entfernung konstant. Diese Experimente zeigten, dass die immobilisierten Enzyme nicht denaturiert sind und sich nicht von der Oberfläche abgelöst haben. Das funktionalisierte Teflon^® wurde bei 4°C in einem Eppendorf-Röhrchen gelagert, das eine Pufferlösung enthielt. Die verschiedenen Oberflächen sind nach mehreren Wochen noch funktionsfähig.
Verwendete Enzyme: Glucose-Oxidase von Aspergillus niger (SIGMA; 210 U/mg Feststoff, Endkonzentration 1,0 mg/ml), Meerrettich-Peroxidase (SIGMA; 1520 U/mg Feststoff, Endkonzentration 0,14 mg/ml), Laccase von Trametes sp. (Biocatalysts, Wales; Endkonzentration 2,1 mg/ml), Lipase von Candida cylindracea (Biocatalysts, Wales; Endkonzentration 0,25 mg/ml), Schweineleber-Esterase (SIGMA; 41 U/mg Feststoff, Endkonzentration 2,4 mg/ml), Rinderpankreas-Trypsin (SIGMA; 8 750 U/mg Feststoff).
Substrate: Glucose für Glucose-Oxidase bei pH 7; o-Dianisidin für Peroxidase und Laccase in Milli-Q-Wasser, p-Nitrophenylcaprylat für Lipase bei pH 7,7; p-Nitrophenylacetat für Esterase bei pH 7,7 und N-a-Benzoyl-d,l-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid für Trypsin.
5. Immobilisierung eines Antikörpers und eines zweiten Enzyms
Teflon-Plättchen mit einer Hydrophobin-Beschichtung wurden, wie beschrieben, hergestellt. Das Teflon-Plättchen wurde in einer Lösung von 100 μg/ml von äquimolaren Mengen von Glucose-Oxidase-Antikörpern und Peroxidase oder mit Peroxidase alleine zwei Stunden bei 25°C inkubiert.
Das Hydrophobin-beschichtete Teflon-Plättchen mit immobilisierten Antikörpern und/oder Peroxidase wurde gründlich mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Protein zu entfernen.
Die Plättchen wurden eine Stunde in einer Lösung mit verschiedenen (sehr verdünnten) Konzentrationen von Glucose-Oxidase bei 4°C inkubiert. Die Plättchen wurden mit Wasser gewaschen, um das ungebundene Enzym zu entfernen, und danach wurde das Plättchen in eine 1,5-ml-Küvette (parallel zum Lichtstrahl) mit 1 ml Peroxidase-Aktivitäts-Lösung (4-Aminophenazon und Phenol) gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer Glucose-Stammlösung zu der Küvette gestartet und anhand der entstehenden Farbe bei 515 nm verfolgt.
Das Tefon-Plättchen ohne die Glucose-Oxidase-Antikörper zeigte nach einer Inkubation mit den niedrigen Konzentrationen von Glucose-Oxidase kaum eine Umwandlung von Glucose, wohingegen die Teflon-Plättchen mit den immobilisierten Glucose-Oxidase-Antikörpern nach Inkubation mit den gleichen niedrigen Konzentrationen von Glucose-Oxidase hochaktiv waren. Dieses Beispiel macht deutlich, dass immobilisierte Antikörper an einer Hydrophobin-Schicht eingesetzt werden können, um ein Enzym aus einer stark verdünnten Probe auf einer Sensor-Oberfläche anzureichern.
6. Immobilisierung von Antikörpern
Die Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurde mit einer Hydrophobin-enthaltenden Lösung (100 μg/ml) 15 Minuten inkubiert und gründlich mit Wasser gespült. Anschließend wurde eine Lösung, die Oregon Green^® 488-Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (06381, Molecular Probes) (Ab1) enthielt, zu der Vertiefung zugegeben. Nach 15 Minuten Inkubation wurde die Vertiefung dekantiert und gründlich mit Wasser gespült. Die Immobilisierung der Antikörper wurde anhand der Fluoreszenz gemäß dem Protokoll analysiert, das von der Lieferfirma der Oregon Green^®-markierten Antikörper empfohlen wurde, und anschließend wurden diese Werte mit der Fluoreszenz einer unbeschichteten Vertiefung verglichen (Absorptions/Emissions-Maxima bei etwa 496/524 nm).
Die Sättigung der Antikörper Ab1-Immobilisierung wurde durch Titration der Antikörper Ab1-Konzentration und Intensität der Fluoreszenz analysiert.
Die Wirkung der Immobilisierung von Antikörpern bei der Bindung an die beschichtete Oberfläche wurde mit zwei anderen sekundären Antikörpern untersucht, von denen der eine (Ab2a) nicht mit Ab1 interagiert und der andere (Ab2b) damit interagiert. Die Vertiefungen wurden, wie vorstehend beschrieben, behandelt, und die Vertiefungen mit der größten Menge des immobilisierten Antikörpers Ab1 wurden verwendet, um die Immobilisierung von Ab2 an die Hydrophobin-Beschichtung direkt zu verhindern.
Antikörper Ab2a- und Antikörper Ab2b-enthaltende Lösungen wurden in verschiedenen Konzentrationen zugegeben und nach 15 Minuten Inkubation entfernt und die Vertiefungen gespült. Die beiden Antikörper Ab2a und Ab2b haben Absorptions/Emissions-Maxima, die von den Maxima von Ab1 verschieden sind, und können deshalb unabhängig von Ab1 durch Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Andererseits wurde ein Living Colors^TM-Antikörper gegen grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Hydrophobin-beschichteten Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, immobilisiert. GFP wurde zu der Vertiefung zugegeben und 15 Minuten inkubiert. Nach gründlichem Spülen blieb die Vertiefung fluoreszierend, dies zeigt, dass der immobilisierte (nicht-fluoreszierende) Antikörper seine Fähigkeit beibehalten hat, das GFP zu binden. Als negative Kontrolle diente die Hydrophobin-beschichtete Vertiefung, die mit den vorstehend erwähnten Oregon Green 488-Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpern behandelt worden war, die das GFP nicht immobilisierten.
Andererseits wurden anti-Galactosidase-Antikörper an eine Hydrophobin-Beschichtung, wie vorstehend beschrieben, immobilisiert, und anschließend wurde β-Galactosidase zugegeben. Nach gründlichem Spülen wurde die Aktivität des Enzyms durch Zugabe von X-Gal getestet. Als negative Kontrolle diente die Hydrophobin-beschichtete Vertiefung, die mit den vorstehend erwähnten Oregon Green 488-Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörpern behandelt worden war, welche die Galactosidase nicht immobilisierten.
Der Effekt der Bestätigung des Hydrophobins SC3 wurde untersucht, indem die Vertiefungen nach der Inkubation mit dem Hydrophobin SC3 eine Stunde bei 80°C mit SDS behandelt wurden. Die gleichen Experimente wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Außerdem wurde die blockierende Wirkung von Hydrophobinen, die in ihrem monomeren Zustand zugegeben wurden, durch Titration der Menge des Antikörpers Ab1 und des zusätzlichen monomeren Hydrophobins SC3 untersucht.
Die gleichen Experimente wurden durchgeführt, wobei das herkömmliche ELISA-Protokoll eingesetzt wurde, wodurch die verbesserte Empfindlichkeit und einfache Verwendung der nicht-kovalenten Immobilisierung anhand von Hydrophobinen gezeigt wurde. Das herkömmliche ELISA-Protokoll bestand aus der Immobilisierung von 100 μl anti-Galactosidase-Antikörper (10 μg/ml in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2), inkubiert für drei Stunden bei Raumtemperatur. Die Platte wurde ausgeleert und die restliche Flüssigkeit herausgeklopft. Sodann wurde die Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, der 1 M NaCl und 0,02% (Vol./Vol.) Tween- 20 enthielt, gewaschen und dies fünfmal wiederholt. Die Blockierung erfolgte durch Zugabe von 300 μl Blockierungslösung (wobei BSA, Magermilch und Casein getestet wurden) und 15 Minuten Inkubation. Die Vertiefungen wurden ausgeleert, ausgeklopft und dreimal gewaschen. Nach der Blockierung wurde zu den verschiedenen Vertiefungen jeweils ein Gemisch mit unterschiedlichen Konzentrationen von β-Galactosidase zugegeben. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, auf β-Galactosidase-Aktivität getestet. Dieses Verfahren wurde mit der Immobilisierung von anti-Galactosidase-Antikörpern an Hydrophobin-beschichtete Vertiefungen verglichen. Die Empfindlichkeit von niedrigen Konzentrationen von β-Galactosidase wurde mit dem ELISA-Verfahren verglichen.
7. Blockierungswirkung von Hydrophobinen
Die Erfindung stellt außerdem ein Objekt bereit, das eine Oberfläche besitzt, die für den Nachweis von spezifischen molekularen Wechselwirkungen eingesetzt werden kann, z.B. für den Nachweis von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen in Display-Technologien oder in einem ELISA-Test oder für den Nachweis von Nucleinsäure-Nucleinsäure-Wechselwirkungen, die DNA, RNA oder PNA sein können. Hydrophobine sind aufgrund ihrer amphipathischen Natur die idealen Blockierungsmittel. Durch Beschichten einer hydrophoben Oberfläche mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff wird die „Klebrigkeit" einer hydrophoben Oberfläche abgeschwächt und deshalb die unspezifische Bindung von hydrophoben Verbindungen an hydrophobe Bereiche vermindert.
Dadurch wird die Leistungsfähigkeit eines solchen Nachweisverfahrens verbessert. Die Erfindung stellt ein Objekt bereit, bei dem mindestens ein Teil der Oberfläche mit einer reaktiven Verbindung versehen ist, wobei die Oberfläche außerdem mit einer Hydrophobin-ähnlichen Verbindung versehen wird, um unerwünschte unspezifische Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche eines festen Trägers, z.B. einer ELISA-Platte, mit einem Antikörper beschichtet, und danach wird die Oberfläche außerdem mit einer Lösung von monomerem Hydrophobin behandelt, wobei die Reaktivität der Verbindung im Wesentlichen unverändert bleibt und die unspezifischen Bindungseigenschaften der Oberfläche vermindert werden. Wir haben die Blockierungseigenschaften von Hydrophobin mit bekannten Blockierungsreagenzien, z.B. BSA, Magermilch, Casein und Gelatine, in einem herkömmlichen ELISA-Test mit geringfügigen Modifikationen verglichen:
Die Vertiefungen einer ELISA-Platte wurden mit einer Beschichtungslösung, die 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, und 10 μg/ml anti-Galactosidase-Antikörper enthielt, behandelt, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und geleert, indem die Flüssigkeit herausgeklopft wurde. Sodann wurde die Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, der 1 M NaCl enthielt, gewaschen und dies fünfmal wiederholt. Die Blockierung der Platte erfolgte durch Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von BSA, Magermilch, Casein und monomerem Hydrophobin, die Inkubation wurde 15 Minuten durchgeführt und die Platte sodann durch Herausklopfen der Flüssigkeit geleert und dreimal gewaschen. Nach der Blockierung wurde zu den verschiedenen Vertiefungen jeweils ein Gemisch aus unterschiedlichen Konzentrationen und Verhältnissen von β-Galactosidase und GFP zugegeben, die im Bereich von einem 1000-fachen Überschuss von β-Galactosidase gegenüber GFP bis zu einem 1000-fachen Überschuss von GFP gegenüber β-Galactosidase lagen. Sodann wurde die Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer plus 1 M Natriumchlorid + 0,02% (Vol./Vol.) Tween-20 gewaschen und dies fünfmal wiederholt. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen anhand von Fluoreszenz, wie vorstehend beschrieben, auf das Vorliegen von GFP getestet, wodurch die unspezifische Bindung angezeigt wird, und auf die β-Galactosidase-Aktivität, wie vorstehend beschrieben, getestet, um die Bindung des Proteins von Interesse zu bestimmen. Das Vorliegen von GFP und von β-Galactosidase wurde mit der Art der Blockierung verglichen, wodurch eine außerordentlich gute Blockierung von Hydrophobinen gezeigt wird.
8. Zielgerichtetes Hinsteuern anhand von nicht-kovalent gebundenen Liganden
Man nimmt an, dass die Hydrophobine vielseitig sind, da durch gentechnische Verfahren ein Konstrukt hergestellt werden kann, das zu Fusionsproteinen aus einem Hydrophobin und einem Liganden führt. Andererseits kann die Fusion auch nach der Translation durch Vernetzung erfolgen. Dieses Beispiel beschreibt Liganden, die nicht-kovalent an Hydrophobine gebunden sind, wodurch die Vielseitigkeit und die einfache Anwendung von Hydrophobinen noch weiter gesteigert werden.
Das Experiment wurde, wie von Scholtmeijer et al. (Scholtmeijer, K., et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 1367–1373) beschrieben, mit der Modifikation durchgeführt, dass nicht-modifizierte Hydrophobine verwendet wurden, die nach der Zusammenlagerung mit einer RGD-Peptid-enthaltenden Lösung inkubiert wurden. Die Kultivierung und der Aktivitätstest von Fibroblasten und der Rest des Beispiels wurden, wie beschrieben, durchgeführt. Im Wesentlichen wurden Teflon-Plättchen mit Hydrophobinen, wie beschrieben, beschichtet und mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein Polypeptid enthielt, das eine Aminosäuresequenz RGD (RGD-Peptid) umfasste, um das RGD-enthaltende Peptid an der beschichteten Oberfläche zu immobilisieren. Fibroblasten (Zelllinie L292, aus Alveolar-Fettgewebe der Maus) wurden mit 7500 Zellen/cm² in Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät, in die beschichtete oder unbeschichtete Teflon-Plättchen gelegt worden waren und die ein RPMI 1690-Medium enthielten, das mit 10% fetalem Kälberserum, 1 × 10⁴ U/ml Penicillin, 1 × 10⁴ U/ml Streptomycin und Glutaminlösung (1:100; Gibco BRL, USA) angereichert war. Als positive Kontrolle wurden Fibroblasten in Abwesenheit eines Teflon-Plättchens gezüchtet. Die Wachstumsprozesse wurden nach 24, 48, 72 und 96 Stunden ausgewertet. Die biologische Verträglichkeit wurde ermittelt, indem die Konfluenz der Kulturen an den verschiedenen Oberflächen mikroskopisch beurteilt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass eine nicht-kovalente Immobilisierung eines RGD-enthaltenden Peptids eingesetzt werden kann, um eine modifizierte Oberfläche zu erzeugen, und dass diese Modifikation zu einer verbesserten biologischen Verträglichkeit führte. Die Ergebnisse zeigten, dass nicht-kovalente Wechselwirkungen auch eingesetzt werden können, um eine modifizierte Oberfläche herzustellen.
Andererseits wurden Hydrophobin-Vesikel, wie von Wösten et al. (Wösten, H. A. B., et al., 1994, EMBO J. 13: 5848–5854) beschrieben, hergestellt, wobei Dansylmarkiertes trSC3, wie von Wang et al. (Wang, X., et al., 2002, Prot. Science 11: 1172–1181) beschrieben, verwendet wurde, wodurch der Nachweis durch Fluoreszenz möglich wurde. Die Hydrophobin-Vesikel wurden in einer RGD-Peptid-enthaltenden Lösung inkubiert, gewaschen und danach mit Fibroblasten inkubiert.
Nach Abtrennen der Fibroblasten von den ungebundenen Hydrophobin-Vesikeln wurde das Vorliegen der Vesikel in der Zellfraktion durch Fluoreszenz bestimmt und mit der Kontrolle der Hydrophobin-Vesikel ohne die angeheftete RGD-Sequenz verglichen.
9. Esterase-, Lipase- und Trypsin-Immobilisierung
Kolloidales Teflon (ø 150 nm) und Teflon-Plättchen, Polyethylen-Plättchen und Glasplättchen (0,8 × 2,5 cm) wurden bei 25°C in 2 ml einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung (entweder SC3, trSC3 oder SC4) in einem 3-ml-Glasgefäß verschiedene Zeitspannen inkubiert, die im Bereich von 10 Minuten bis 16 Stunden lagen. Die Plättchen wurden aus der Hydrophobin-Lösung entnommen und sofort mit großen Mengen Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen (5 × 50 ml Wasser für fünf Minuten); diese Beschichtungen werden als der α-Helix-Zustand bezeichnet. Ein Teil der Plättchen wurde in einer 2% SDS-Lösung zehn Minuten gekocht und danach gründlich mit Wasser gewaschen; diese Beschichtungen werden als der β-Faltblatt-Zustand bezeichnet. Das kolloidale Teflon wurde durch leichte Zentrifugation (2 Min., 2000 UpM) gewonnen, der Überstand wurde entfernt und das Teflon-Pellet in 2 ml reinem Wasser suspendiert, worauf eine Zentrifugation folgte. Das Teflon-Pellet wurde fünfmal mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen.
Die unbeschichteten und die Hydrophobin-beschichteten Plättchen (α-Helix-Zustand und β-Faltblatt-Zustand) wurden in 2 ml Enzymlösung in 3-ml-Glasgefäßen zwei Stunden bei 25°C inkubiert. Die verwendeten Enzymlösungen waren 100 μg/ml 60-kD-Esterase (Schweineleber), 40-kD-Lipase (Weizenkeim) oder 25-kD-Trypsin (Rinderpankreas). Die Plättchen wurden gründlich mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Enzym zu entfernen.
Die Plättchen mit und ohne immobilisiertem Enzym wurden in einem Chromogen-Test eingesetzt. Eine 1,5-ml-Küvette wurde gefüllt mit 1 ml einer 5 mM 4-Nitrophenylacetatlösung (Esterase-Substrat), 5 mM Natriumbenzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (Trypsin-Substrat) oder 5 mM 1,2-di-O-Decanoyl-rac-glycero-3-glutaminsäure-Resorufin markiert in den geeigneten Puffern. Die Küvette wurde in das Spektrophotometer gestellt und die Reaktion gestartet, indem die Hydrophobin-beschichteten Plättchen mit oder ohne immobilisiertem Enzym in die Küvette parallel zum Lichtstrahl platziert wurden. Die Licht-Absorption bei der geeigneten Wellenlänge wurde über die Zeit verfolgt. Nach einer Stunde Inkubation wurden diese Plättchen aus der Küvette genommen und die Reaktion in der Küvette weitere 24 Stunden verfolgt. Die Plättchen wurden mit Wasser gewaschen und in eine neue Küvette mit frischem Substrat überführt, und wieder wurde die Reaktion verfolgt. Die Plättchen wurden in frischem Substrat dreimal am gleichen Tag, nach einem Tag, nach einer Woche und nach einem Monat inkubiert, um die Stabilität der Beschichtung zu bestimmen, indem die Aktivität auf dem Plättchen und die restliche Aktvität nach der Entfernung des Plättchens aus dem Reaktionsgemisch verfolgt wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass Esterase, Lipase und Trypsin an die unbeschichteten Plättchen und auch an die Hydrophobin-beschichteten Plättchen, sowohl im α-Helix-Zustand als auch im β-Faltblatt-Zustand, angeheftet waren.
Jedoch war das Enzym, das an die unbeschichteten Plättchen angeheftet war, nicht aktiv, wohingegen das Enzym, das an die Hydrophobin-beschichteten Plättchen angeheftet war, bis zu einen Monat in Puffer oder trocken bei 4°C aktiv und stabil war. Die Entfernung des Plättchens aus der Substratlösung führte zu einem absoluten Stopp der Reaktion, dies zeigt, dass die/das immobilisierte Esterase, Lipase oder Trypsin fest an die Plättchen gebunden ist. Das mit Hydrophobin beschichtete kolloidale Teflon wurde für Bindungsexperimente von Glucose-Oxidase, Esterase, Lipase und Trypsin mit Cirkulardichroismus-Spektrometrie eingesetzt. 400 μl einer 100 μg/ml Lösung der erwähnten Enzyme wurden zu einer 1-mm-Küvette zugegeben und ein Circulardichroismus-Spektrum zwischen 190 und 250 nm aufgenommen. Zu dieser Lösung wurden steigende Konzentrationen von reinem kolloidalem Teflon oder von Hydrophobin-beschichtetem Teflon zugegeben und Änderungen durch Aufzeichnen von CD-Spektren verfolgt. Esterase, Lipase, Glucose-Oxidase und Trypsin durchliefen alle bei der Bindung an unbeschichtetes Teflon strukturelle Veränderungen, dies wurde aus Unterschieden in den CD-Spektren des löslichen Enzyms mit und ohne Teflon gefolgert. Wenn das mit Hydrophobin beschichtete Teflon zu den Enzymlösungen zugegeben wird, sind die Änderungen im CD-Signal (nach Korrektur um das Hydrophobin-Signal) weniger stark ausgeprägt. Außerdem kann ein Teil des Enzyms aus der Lösung entnommen werden, indem das kolloidale Teflon abzentrifugiert wird, dies zeigt, dass das Enzym an den Teflon-Kügelchen immobilisiert ist. Weiterhin wurden Öltröpfchen mit Hydrophobin beschichtet. Beschichtung von Öltröpfchen wurde erreicht, indem 100 μl Öl (Mineralöl oder Paraffinöl) in 3 ml Wasser durch Beschallung und Zugabe von 3 ml einer wässrigen Hydrophobin-Lösung (200 μg/ml) emulgiert wurden. Andererseits wurde das Öl direkt in der Hydrophobin-Lösung emulgiert, und 3 ml wurden zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur oder 60°C in Gegenwart von 0,02% NaN₃ wurden die Emulsionen 30 Minuten bei 10 000 × g zentrifugiert und die Öltröpfchen viermal mit Wasser mittels Zentrifugation gewaschen, um das lösliche Hydrophobin zu entfernen.
Anschließend wurden Öltröpfchen mit zusammengelagertem Hydrophobin in einem kleinen Volumen Wasser (Gesamtvolumen 200 μl) resuspendiert. 20 μl der mit Hydrophobin beschichteten Öltröpfchen wurden in 1 ml 100 μg/ml Enzymlösungen von Esterase, Lipase und Trypsin zwei Stunden bei 25°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Öltröpfchen fünfmal mit Wasser mittels Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, gewaschen, um alles ungebundene Enzym zu entfernen. Die gewaschenen SC3-beschichteten Öltröpfchen mit dem daran gebundenen Enzym wurden in 1,5-ml-Küvetten mit 1 ml der geeigneten Substratlösungen überführt, wie vorstehend für Teflon-, Polyethylen- und Glasplättchen beschrieben. Die Reaktion wurde eine Stunde spektrophotometrisch verfolgt und die Öltröpfchen aus der Küvette herauspipettiert, sodann wurde die restliche Lösung noch weitere 24 Stunden verfolgt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Lipase, Esterase und Trypsin an SC3-beschichtete Öltröpfchen immobilisiert werden können und dass das jeweilige Enzym sogar nach Schritten gründlichen Waschens angeheftet bleibt. Das Enzym ist noch katalytisch aktiv, wie aus der Umwandlung von Substrat in der Küvette, sobald die beschichteten Öltröpfchen zugegeben wurden, beurteilt wurde. Durch Entfernung der Öltröpfchen wird die Umwandlung beendet, dies zeigt, dass durch Entfernung der Öltröpfchen alle Enzyme wirksam entfernt werden.
10. Immobilisierung von Leuchtkäfer-Luciferase
150 μl einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung (entweder SC3, trSC3 oder SC4) oder 150 μl Wasser wurden zu Vertiefungen von zwei Mikrotiterplatten zugegeben. Diese wurden bei 25°C unterschiedliche Zeitspannen inkubiert, die im Bereich von 10 Minuten bis 16 Stunden lagen. Die Vertiefungen wurden gründlich mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen; diese Beschichtungen wurden als der α-Helix-Zustand bezeichnet. Eine heiße 2% SDS-Lösung wurde zu den mit Hydrophobin beschichteten und unbeschichteten Vertiefungen der einen Mikrotiterplatte zugegeben, und diese Platte wurde 20 Minuten bei 60°C gehalten. Die SDS-behandelten Vertiefungen wurden gründlich mit Wasser gewaschen. Diese Beschichtungen wurden als der β-Faltblatt-Zustand bezeichnet.
150 μl von Lösungen mit 10 bis 100 μg/ml Leuchtkäfer-Luciferase (Roche, Kat. Nr. 411523) wurden zu den unbeschichteten und Hydrophobin-beschichteten Vertiefungen (α-Helix und β-Faltblatt) zugegeben und 2 bis 16 Stunden bei 0°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden gründlich mit 0,5 M Tris-Acetat-Puffer, pH 7,5, gewaschen, um alles ungebundene Enzym zu entfernen. Um die Aktivität des immobilisierten Enzyms zu testen, wurden 100 μl Luciferase-Reagens in 0,5 M Tris-Acetat-Puffer, pH 7,5, (das Substrat, Roche, ATP Bioluminescence Testkit CLS II, Flasche 1, Kat. Nr. 1699 695) zu den Leuchtkäfer-Luciferase-beschichteten Vertiefungen zugegeben. Die Reaktion wurde gestartet, indem 50 μl einer Verdünnungsreihe (3 × 10^–5 bis 3 × 10^–10 M) einer ATP-Stammlösung (Roche, ATP Bioluminescence Testkit CLS II, Flasche 2, Kat. Nr. 1 699 695) zu den Vertiefungen zugegeben wurden. Die Lumineszenz wurde gemessen und über die Zeit verfolgt, wobei ein MTP-Format-Luminometer gemäß dem Protokoll verwendet wurde.
Nach einer Stunde Inkubation wurde die Substratlösung aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit 0,5 M Tris-Acetat-Puffer, pH 7,5, gewaschen. Frische Substrat- und ATP-Lösungen wurden zu den Vertiefungen zugegeben und die Reaktion wurde erneut verfolgt. Die Vertiefungen wurden in frischem Substrat dreimal am gleichen Tag, nach einem Tag, nach einer Woche und nach einem Monat inkubiert, um die Stabilität der Beschichtung zu bestimmen, indem die Aktivität in den Vertiefungen verfolgt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass Leuchtkäfer-Luciferase an die unbeschichteten und auch an die Hydrophobin-beschichteten Vertiefungen (im α-Helix-Zustand und im β-Faltblatt-Zustand) angeheftet war. Jedoch war das Enzym, das an die unbeschichteten Vertiefungen angeheftet war, nicht aktiv, wohingegen das Enzym, das an die Hydrophobin-beschichteten Plättchen angeheftet war, aktiv und bis zu einen Monat stabil war.
(Anmerkung: die konzentrierte Luciferase-Lösung von 1 mg/ml ist mehrere Monate stabil, wenn sie in 50-μl-Portionen eingefroren wird, verdünnte Lösungen sind instabil und sollten in einem Eisbad gehalten werden! Außerdem ist zu beachten, dass diese Lösung gegenüber Schütteln und einer Lagerung in Kunststoffgefäßen empfindlich ist!)
11. Immobilisierung von alkalischer Phosphatase
150 μl einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung (entweder SC3, trSC3 oder SC4) oder 150 μl Wasser wurden zu Vertiefungen von zwei Mikrotiterplatten zugegeben. Diese wurden bei 25°C unterschiedliche Zeitspannen inkubiert, die im Bereich von 10 Minuten bis 16 Stunden lagen. Die Vertiefungen wurden gründlich mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen; diese Beschichtungen wurden als der α-Helix-Zustand bezeichnet. Eine heiße 2% SDS-Lösung wurde zu den mit Hydrophobin beschichteten und unbeschichteten Vertiefungen der einen Mikrotiterplatte zugegeben, und diese Platte wurde 20 Minuten bei 60°C gehalten. Die SDS-behandelten Vertiefungen wurden gründlich mit Wasser gewaschen. Diese Beschichtungen wurden als der β-Faltblatt-Zustand bezeichnet.
Eine Verdünnungsreihe von 5- bis 100-fach verdünnter alkalischer Phosphatase der menschlichen Plazenta (4 U/ml, Roche, SEAP Chemiluminescent Reporter-Gentest, Kat. Nr. 1 779 842) wurde in dem gelieferten Verdünnungspuffer hergestellt. 150 μg von jeder Verdünnung wurden zu den unbeschichteten und Hydrophobin-beschichteten Vertiefungen (α-Helix- und β-Faltblatt-Zustand) zugegeben und zwei Stunden bei 25°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden gründlich mit Verdünnungspuffer gewaschen, um alles ungebundene Enzym zu entfernen.
Um die Aktivität des immobilisierten Enzyms zu testen, wurden 50 μl Substratreagens und 100 μl Verdünnungspuffer (Roche, SEAP Chemiluminescent Reporter-Gentest, Kat. Nr. 1 779 842) zu den mit alkalischer Phosphatase beschichteten Vertiefungen zugegeben und zehn Minuten bei 25°C inkubiert. Die Lumineszenz wurde gemessen und über die Zeit verfolgt, wobei ein Luminometer im MTP-Format gemäß dem Protokoll verwendet wurde.
Nach zwei Stunden Inkubation wurde die Substratlösung aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen wurden mit Verdünnungspuffer gewaschen. Frisches Substrat und Verdünnungspuffer wurden zu den Vertiefungen zugegeben und die Reaktion wurde erneut verfolgt. Die Vertiefungen wurden in frischem Substrat zweimal am gleichen Tag, nach einem Tag, nach einer Woche und nach einem Monat inkubiert, um die Stabilität der Beschichtung zu bestimmen, indem die Aktivität in den Vertiefungen verfolgt wurde.
Die Ergebnisse zeigen, dass die alkalische Phosphatase sowohl an die unbeschichteten als auch an die Hydrophobin-beschichteten Vertiefungen (im α-Helix-Zustand und im β-Faltblatt-Zustand) angeheftet war. Jedoch war das Enzym, das an die unbeschichteten Vertiefungen angeheftet war, nicht aktiv, wohingegen das Enzym, das an die Hydrophobin-beschichteten Plättchen angeheftet war, bis zu einen Monat aktiv und stabil war.
12. Immobilisierung des Lichtsammelkomplexes (LHC)
Drei verschiedene Elektrodensubstrate (hydrophiles GE und hydrophobes GCE oder TMFE) wurden mit Hydrophobin (entweder SC3, trSC3 oder SC4) in einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung beschichtet, und zwei wurden in Wasser gelegt. Diese wurden bei 25°C unterschiedliche Zeitspannen inkubiert, die im Bereich von 10 Minuten bis 16 Stunden lagen. Die Elektroden wurden mit Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen; diese Beschichtungen wurden als der α-Helix-Zustand bezeichnet. Eine Hydrophobin-beschichtete und eine unbeschichtete Elektrode von jedem Typ wurden zehn Minuten in 2% SDS-Lösung gekocht. Die SDS-behandelten Elektroden wurden gründlich mit Wasser gewaschen. Diese Beschichtungen wurden als der β-Faltblatt-Zustand bezeichnet. Die verschiedenen Typen von beschichteten und unbeschichteten Elektroden wurden mit den elektroaktiven Verbindungen Q10, Azobenzol oder Q0, wie von Bilewicz et al. in: J. Phys. Chem. B 2001, 105: 9772–9777, beschrieben, oder mit einem Vermittler, z.B. Methylenblau, beladen. Die verschiedenen Typen von beschichteten und unbeschichteten Elektroden, die mit den elektroaktiven Verbindungen beladen oder nicht damit beladen waren, wurden in LHC von Cyclotella cryptica, der, wie in Rhiel et al. (Rhiel, E., et al., 1997, Botanica Acta 110: 109–117) angegeben, isoliert worden war, bei verschiedenen Konzentrationen zwei Stunden bei 25°C inkubiert. Die Elektroden wurden mit den geeigneten Puffern gewaschen.
Um die Aktivität des immobilisierten LHC zu testen, wurden die Elektroden (in dem geeigneten Puffer) in Dunkelheit gehalten, anschließend wurden sie dem Tageslicht ausgesetzt und der Strom wurde gemessen. Die Dunkelheit-Licht-Zyklen wurden mehrmals am gleichen Tag, nach einem Tag, nach einer Woche und nach einem Monat wiederholt, um die Stabilität des immobilisierten LHC zu bestimmen.
13. Immobilisierung von DNA
Außer Proteinen können auch noch andere Moleküle immobilisiert werden. Als ein Beispiel wird die Immobilisierung von DNA beschrieben.
Es gibt zwar bekannte Verfahren zur Immobilisierung von DNA, jedoch beruhen die meisten Verfahren zur Immobilisierung von DNA auf einer kovalenten Bindung und benötigen deshalb eine reaktive Gruppe, üblicherweise das 5'-Ende des DNA-Moleküls. Auch die Immobilisierung von DNA an einer Hydrophobin- Beschichtung ist fest, sie erfordert jedoch kein reaktives Ende der DNA und ist deshalb vielseitiger. Gleichzeitig ist die Immobilisierung im Vergleich zu der linearen kovalent-gebundenen DNA weniger empfindlich gegenüber Spaltung. Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung einer DNA und die Zugänglichkeit nach erfolgter Bindung.
PCR-Röhrchen (Polypropylen, Sarstedt) wurden 16 Stunden bei 25°C mit 50 μl einer 100 μg/ml SC3-Hydrophobin-Lösung beschichtet. Die SC3-Hydrophobin-Lösung wurde entfernt, und 100 μl 1% SDS wurden zugegeben und zehn Minuten auf 80°C erhitzt, hierdurch kommt es zur Bildung des β-Faltblatt-Zustands. Andererseits wurden 100 μl Wasser zugegeben und auch zehn Minuten auf 80°C erhitzt (α-Helix-Zustand). Die Röhrchen wurden fünfmal mit 100 μl Wasser gespült, anschließend wurde eine Plasmid-enthaltende Lösung zugegeben und 15 Minuten inkubiert, danach wurde die ungebundene DNA mit zehnmal 200 μl Wasser abgespült. Die Röhrchen mit der immobilisierten DNA wurden als Reaktionsröhrchen in einer PCR-Reaktion mit Primern eingesetzt, die für die immobilisierte DNA spezifisch waren. Eine Standard-PCR wurde in den Röhrchen durchgeführt (50 μl, 1' bei 96°C, 30'' bei 60°C, 4' bei 72°C, 25 Zyklen) und das Produkt sodann auf einem Gel analysiert. Die nicht-beschichteten Röhrchen ergaben kein PCR-Produkt, dies zeigt, dass die DNA abgespült worden war. Die Röhrchen mit der α-helikalen Beschichtung ergaben ein PCR-Produkt, dies zeigt, dass die Immobilisierung der Plasmid-DNA an der Hydrophobin-Beschichtung erfolgt war. An den Röhrchen mit der β-Faltblatt-Beschichtung wurde keine DNA immobilisiert, dies zeigt, dass die verschiedenen Beschichtungen unterschiedliche Spezifitäten aufweisen.
Das resultierende PCR-Produkt zeigt nicht nur die Fähigkeit von Hydrophobin, DNA zu immobilisieren, es zeigt außerdem, dass die immobilisierte DNA noch für Oligonucleotide und Enzyme wie Polymerase zugänglich ist.
14. Immobilisierung von CYP2D6 und CYP2C19 an eine Teflon-Oberfläche
Cytochrom P450 ist eine Superfamilie von Häm-enthaltenden Mono-Oxygenasen. Sie enthalten am aktiven Zentrum ein Eisenatom, das in der oxidierten Form (Fe³⁺) das Substrat binden kann. Die Reduktion findet statt und Fe²⁺ wird erzeugt. Mit molekularem Sauerstoff kann das Fe²⁺ wieder zu Fe³⁺ oxidiert werden, wobei das nun oxidierte Produkt freigesetzt wird. Zwei Beispiele von Cytochrom P450 sind CYP2D6 und CYP2C19, die in der Leber des Menschen vorliegen und an der Metabolisierung von Fremdstoffen wie Arzneistoffen beteiligt sind.
Die Cytochrome CYP2D6 und CYP2C19 wurden an ein Teflon-Plättchen immobilisiert, indem das Teflon in einer Lösung mit Hydrophobin (100 μg/ml), wie vorstehend beschrieben, inkubiert wurde, nach dem Spülen wurde es in einer Lösung mit Cytochromen inkubiert und schließlich erneut gespült. Die Teflon- Plättchen, die mit CYP2D6 und CYP2C19 beschichtet waren, die an das Teflon gebunden waren, wurden in einem Medium inkubiert, das NADPH und die Modellsubstrate Dextromethorphan und Mephenytoin enthielt. Nach der Inkubation für verschiedene Zeitspannen wurden die Substrate Dextromethorphan und Mephenytoin zusammen mit ihren Metaboliten Dextrorphan und 4-Hydroxymephenytoin gemessen. Wie stark der Metabolismus des jeweiligen immobilisierten Cytochroms ausgeprägt war, wurde aus dem Verhältnis von Substrat zu Produkt berechnet.
15. Immobilisierung von CYP2D6 und CYP2C19 an eine Elektrodenoberfläche
Eine glasartige Kohleelektrode wurde mit Hydrophobin beschichtet, indem die Elektrode 15 Minuten in eine Lösung eingetaucht wurde, die Hydrophobin enthielt (100 μg/ml). Danach wurde die Elektrode gründlich gespült. Die Cytochrome CYP2D6 und CYP2C19 wurden getrennt an jeweils eine Hydrophobin-beschichtete Elektrode gebunden, indem diese in einer CYP2D6- oder CYP2C19-enthaltenden Lösung 15 Minuten inkubiert und gründlich gespült wurde. Die modifizierten Elektroden wurden in ein Medium gegeben, das NADPH und die Modellsubstrate Dextromethorphan und Mephenytoin enthielt. Während des Inkubationszeitraums wurde die Spannung gemessen, die durch den Kontakt mit den Substraten Dextromethorphan und Mephenytoin induziert wurde. Der Wert der Spannung gibt den Metabolismus durch die Isoenzyme wieder. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Elektroden entfernt und anschließend die Substrate (Dextromethorphan bzw. Mephenytoin) und die Produkte (Dextrorphan bzw. 4-Hydroxymephenytoin) quantitativ bestimmt. Das Verhältnis dieser beiden zeigte die Aktivität der Cytochrome an und konnte mit der gemessenen Spannung in Beziehung gesetzt werden.
16. Immobilisierung von BSA, Fibronectin oder Proteinen, die in RPMI-Medium vorliegen
BSA (Rinderserumalbumin) und Fibronectin wurden an beschichteten Teflon-Plättchen immobilisiert. Die Beschichtung wurde hergestellt, indem das Teflon bei 25°C in 2 ml einer 100 μg/ml Hydrophobin-Lösung (entweder SC3 oder trSC3) in einem 3-ml-Glasgefäß 15 Minuten inkubiert wurde. Die Plättchen wurden aus der Hydrophobin-Lösung entnommen und sofort mit großen Mengen Wasser gewaschen, um alles ungebundene Hydrophobin zu entfernen. Die beschichteten und die unbeschichteten Teflon-Plättchen wurden entweder in einer BSA- oder in einer Fibronectin-enthaltenden Lösung (50 μg/ml) 14 Stunden inkubiert und danach mit Wasser gespült. Das Vorliegen von BSA oder Fibronectin auf dem unbeschichteten oder dem beschichteten Teflon wurde nachgewiesen, indem alles Protein mit TFA extrahiert wurde, die TFA abgedampft wurde und die Probe sodann auf eine SDS-PAGE aufgetragen und gefärbt wurde, wobei Standardverfahren verwendet wurden.
Dies zeigt, dass BSA und Fibronectin nicht an dem unbeschichteten Teflon immobilisiert wurden, während sie an dem beschichteten Teflon immobilisiert werden können. Weiterhin lagen unterschiedliche Mengen von BSA oder Fibronectin an den SC3-beschichteten und den trSC3-beschichtenen Teflon-Plättchen vor. Außerdem wurde ein ähnliches Experiment, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei angereichertes RPMI-Medium (Sigma, Kat. Nr. R 0883) anstelle von BSA oder Fibronectin verwendet wurde. Auch hier konnte keine Immobilisierung von Proteinen an dem unbeschichteten Teflon festgestellt werden, während Unterschiede in der Menge der Proteine an dem SC3- oder trSC3-beschichteten Teflon nachgewiesen werden konnten.
17. Verwendung in einem Biosensor-System
Eine weitere Verwendung der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung eines Sensortyps, der günstige Eigenschaften besitzt und der als Biosensor verwendet werden kann. In Biosensoren werden biologische Moleküle eingesetzt, um andere biologische Moleküle oder chemische Substanzen nachzuweisen. Z.B. könnte in Biosensoren ein monoclonaler Antikörper eingesetzt werden, um ein Antigen nachzuweisen, oder ein kleines synthetisches DNA-Molekül könnte verwendet werden, um eine DNA nachzuweisen. Ein Biosensor ist eine Vorrichtung, in dem ein biologisches Erkennungs- (Sensor-) Element in naher Nachbarschaft zu dem Signalwandler enthalten ist oder mit ihm zusammen eingebaut ist, wodurch ein Reagens-freies Sensorsystem erhalten wird, das für eine Zielverbindung (Analyt) spezifisch ist. Wandler sind physikalische Komponenten des Sensors, die auf Produkte des Biosensor-Erfassungs-Prozesses ansprechen, wobei dies optisch, elektrochemisch, thermometrisch, piezoelektrisch oder magnetisch erfolgen kann, und sie erzeugen eine Antwort, die verstärkt, gespeichert oder angezeigt werden kann. Das biologische Erkennungselement kann ein biologisches Material oder ein biomimetischer Stoff sein (z.B. Gewebe, Mikroorganismen, Organellen, Zellrezeptoren, Enzyme, Antikörper, Nucleinsäuren usw.). Der Vorteil von Biosensor-Elementen besteht in ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, zwischen dem Analyt von Interesse und ähnlichen Stoffen zu unterscheiden. Das Erfassen mit Biosensoren findet nur dann statt, wenn der Analyt durch das biologische Element spezifisch erkannt wird. Mit Biosensoren ist es möglich, spezifische Analyte mit einer sehr großen Genauigkeit zu messen.
Vorzugsweise werden die biologischen Elemente an die Sensoroberfläche in einer nicht-kovalenten Weise gebunden, wie dies in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist, wodurch die Sekundär- und Tertiärstrukturen solcher biologischen Verbindungen im Wesentlichen intakt bleiben und auf diese Weise eine optimale biologische Erkennung möglich gemacht wird.
Für eine bestimmte Analyt-Erkennungselement-Reaktion können verschiedene Wandlungsschemata eingesetzt werden. Amperometrische Vorrichtungen weisen Änderungen des Stromes bei konstanter Spannung nach. Leitfähigkeitsmessvorrichtungen weisen Änderungen in der Leitfähigkeit zwischen zwei Elektroden nach. Spannungsmessvorrichtungen weisen Änderungen in der Spannung bei konstantem Strom (üblicherweise Null) nach. Optische Wandler können gemäß der optischen Konfiguration in zwei Arten unterteilt werden (die extrinische und die intrinsische Art). Bei der intrinsischen Art wird die einfallende Welle nicht durch den Hauptteil der Probe geleitet, sondern verstärkt sich entlang eines Wellenleiters und interagiert mit der Probe an der Oberfläche innerhalb des Feldes mit herabgesetzter kritischer Frequenz („evanescent field"). Andere Oberflächenverfahren zum optischen Nachweis einer biologischen Erkennung beruhen auf einer Modulation des Feldes, das an der Grenzfläche zwischen verschiedenen Materialien aufgrund des einfallenden Lichts angeregt wird. Z.B. überwacht das BIAcore-System biospezifische Wechselwirkungen mit einem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Detektor. Der Masse-Detektor basiert im Allgemeinen auf einem Quarzkristall, dessen Frequenz durch winzige Änderungen an der Oberfläche, z.B. Antikörperbindung an ein Oberflächen-immobilisiertes Antigen, voraussagbar beeinflusst wird.
Die Realisierung des Biosensor-Konzepts ist in den meisten Fällen von Schlüsseltechnologien abhängig, welche die Fertigung von Komponenten und die Zusammenlagerung zu der „Reagens-freien" Form möglich machen. Die Reagens-freie Form wird in den meisten Fällen erreicht, indem das biologische Erkennungselement an die Sensoroberfläche immobilisiert wird. Es ist vorteilhaft, die Biosensoroberfläche mit einer Verbindung zu beschichten, die eine nicht-kovalente Anheftung eines biologischen Erkennungsmoleküls möglich macht. Z.B. wird eine Gold-Sensoroberfläche (hydrophob) mit einer Hydrophobin-Lösung beschichtet, indem sie einfach eine bestimmte Zeit darin inkubiert wird. Danach wird die Oberfläche mit Wasser gewaschen, um jegliches ungebundenes Hydrophobin zu entfernen. Nach der Behandlung der Oberfläche mit einem Detergens, wodurch eine Beschichtung im β-Faltblatt-Zustand hergestellt wird, wird die beschichtete Oberfläche direkt verwendet, um ein biologisches Erkennungsmolekül, z.B. Antikörper, Enzyme, Peptide, Lipide, Nucleinsäuren oder Kohlenhydrate, zu binden. Im Allgemeinen kann die Immobilisierungsmatrix nur als ein Träger dienen, oder sie kann außerdem auch an einer Vermittlung des Signals beteiligt sein, das mit der Erkennung des Analyten durch das Biosensorelement assoziiert ist.
Vorzugsweise sollte die Immobilisierungsmatrix nicht die Empfindlichkeit des Biosensors stören. Während die bloße Beschichtung einer Sensoroberfläche mit Hydrophobin eine verminderte Signalübertragung zur Folge haben würde, fanden wir, dass es möglich ist, eine Verbindung in die Hydrophobin-Beschichtung einzubauen und dadurch die Leistungsfähigkeit des Sensors zu steigern. Z.B. wird hier eine solche Verbindung bereitgestellt, die eine elektroaktive Verbindung ist, welche in die Hydrophobin-Beschichtung eingebaut wird, um die Empfindlichkeit des Sensors im Vergleich zu einer Hydrophobin-Beschichtung, welche die Verbindung nicht enthält, zu verbessern. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Versehen einer Sensoroberfläche mit einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff bereit, wobei die Beschichtung außerdem sowohl mit einer reaktiven Verbindung, um die Empfindlichkeit des Sensors zu verbessern, auch als Signalwandler bezeichnet, als auch mit einer nicht-kovalent gebundenen biologischen Erkennungsverbindung versehen wird.

Claims

Objekt, dessen Oberfläche mindestens teilweise mit einer Hydrophobin-ähnlichen Beschichtung (oder Membran) versehen wurde, wobei die Beschichtung zusätzlich eine reaktive Verbindung besitzt, die nicht-kovalent an die Beschichtung gebunden ist und wobei die reaktive Verbindung ein Antikörper, ein Enzym, ein Peptid, ein Lipid, eine Nucleinsäure oder ein Kohlenhydrat ist.
Objekt gemäß Anspruch 1, wobei die reaktive Verbindung ein Molekulargewicht (MG) von mehr als 1 Kilodalton (1 kD) hat.
Objekt gemäß einem der Anspruche 1 bis 2, wobei die Beschichtung im Wesentlichen frei von Mannoseresten ist.
Objekt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die reaktive Verbindung ein Enzym umfasst.
Objekt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die reaktive Verbindung einen Antikörper oder ein Fragment davon umfasst.
Objekt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Oberfläche eine flüssig/flüssig-Grenzfläche umfasst.
Objekt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Oberfläche eine festflüssig-Grenzfläche umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche eines Objekts mit einer reaktiven Verbindung, wobei die reaktive Verbindung ein Antikörper, ein Enzym, ein Peptid, ein Lipid, eine Nucleinsäure oder ein Kohlenhydrat ist, umfassend die Schritte des Beschichtens von mindestens einem Teil der Oberfläche des Objekts mit einer Beschichtung aus einem Hydrophobin-ähnlichen Stoff und des Inkontaktbringens der reaktiven Verbindung mit dem beschichteten Hydrophobin-ähnlichen Stoff zum Bilden einer nicht-kovalenten Bindung zwischen dem Hydrophobin-ähnlichen Stoff und der Verbindung.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Stoff in der Lage ist, eine Monoschicht auf der Oberfläche des Objekts durch Selbstzusammensetzung des Stoffes zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das beschichtete Objekt vor dem Inkontaktbringen mit dem beschichteten Objekt mit der reaktiven Verbindung vorbehandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das beschichtete Objekt mit einer Detergenzlösung vorbehandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8 bis 11, umfassend das Erhitzen der Oberfläche des beschichteten Objekts auf eine Temperatur im Bereich zwischen 30 bis 80°C.
Verfahren zum Versehen einer Oberfläche eines Objektes mit einer reaktiven Verbindung, umfassend die Schritte des Beschichtens von mindestens einem Teil der Oberfläche des Objekts mit einer Beschichtung aus einer reaktiven Verbindung und nachfolgend des Inkontaktbringens der Oberfläche mit einer Lösung eines Hydrophobin-ähnlichen Stoffes, wobei die Reaktivität der Verbindung im Wesentlichen unverändert bleibt.