DE3642050C2 - - Google Patents

Description

Vorliegende Erfindung betrifft ein Killertoxin, gemäß voranstehendem Patentanspruch. Es wird durch Hefestämme, die zum Genus Hansenula gehören, produziert.

Makover und Bevan fanden, daß es unter den Hefen bestimmte Stämme gibt, die stammesfremde Hefen zum Absterben bringen (Proc. Int. Congr. Genet., XI, 1, Seite 202, 1963). Durch diese Hefen erzeugte Toxine werden Killertoxine genannt, die von Young et al. in annähernd zehn Typen klassifiziert werden je nach ihrem Abtötungsmethodenmodellen (Antonie van Leeuwenhoek, Vol 44, Seiten 59-77, 1978).

Ein von Hansenula mrakii abstammendes Killertoxin wird von Young et al. dem Typ 9 zugeordnet (K₉-Killertoxin).

Hara et al. haben zwei Arten von Killertoxinen mit einem Molekulargewicht von 30 000 oder mehr und einem Molekulargewicht von etwa 8900 aus einer Kulturlösung von Hansenula mrakii (im folgenden der Einfachheit halber als H. mrakii bezeichnet) durch Gelfiltration, Molekularsieb-Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie isoliert (vgl. Agric. Biol. Chem., Vol 47, Seiten 2953-2955, 1983 und JP-OS 130 599/85).

Es wird angenommen, daß die letztgenannte Substanz auf die Zellmembran einwirkt unter Ausübung einer abtötenden Wirkung auf Hefe (Agric. Biol. Chem., Vol. 47, Seiten 2953-2955, 1983).

Aufgabe vorliegender Erfindung ist es, ein neues Killertoxin zu schaffen, das gegen Hitze und pH-Änderungen stabil und als ein fungistatisches Mittel brauchbar ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß Hefestämme, die zum Genus Hansenula gehören, ein neues Killertoxin des K₉-Typs produzieren und diese Substanz als ein antimykotisches Mittel brauchbar ist.

Als ein Beispiel von Stämmen, die das erfindungsgemäße Killertoxin erzeugen, ist beispielsweise H. mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197) zu nennen.

Der genannte Stamm wird in einem Medium kultiviert, das Nährstoffe enthält, die üblicherweise von Hefestämmen verwertet werden können. Als Quellen für die Nährstoffe können bekannte Nährmedien verwendet werden, wie sie gewöhnlich zur Kultivierung von zum Genus Hansenula gehörenden Hefestämmen eingesetzt werden, vorzugsweise minimales Medium, das mit Aminosäuren und Basen ergänzt ist (0,67% Difco® Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 400 mg Adeninsulfat, 24 mg Uracil, 24 mg Tryptophan, 24 mg Histidin, 24 mg Arginin, 24 mg Methionin, 36 mg Tyrosin, 36 mg Leucin, 36 mg Isoleucin, 36 mg Lysin, 100 mg Asparaginsäure, 150 mg Valin, 200 mg Threonin und 60 mg Phenylalanin pro l Liter; pH 5,5). Wenn dieser Stamm unter Schütteln bei 30°C einen Tag lang kultiviert wird, wird das erfindungsgemäße Killertoxin extrazellulär in das Kulturmedium ausgeschieden.

Das erfindungsgemäße Killertoxin kann aus der Kulturlösung nach bekannten Methoden zur Reinigung von fungistatischen Proteinen gereinigt werden unter Verwendung des Stammes Saccharomyces cerevisiae 5059 als Hefestamm, der gegenüber K₉-Killertoxin empfindlich ist; vorzugsweise wird ein monoklonaler Antikörper gegen das neue Killertoxin eingesetzt, der nach der Methode von Köhler und Milstein gewonnen ist (Köhler and Milstein, Nature, Vol. 256, Seite 476 (1975)). Im folgenden wird das Reinigungsverfahren detailliert beschrieben.

Nach der Kultivierung von H. mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197) wurden Zellen entnommen und anschließend 400fach mit Amicon YM-5 konzentriert.

Das Konzentrat (4 ml) wurde auf eine Sephadex® G 50-Säule (2,6 × 100 cm) aufgebracht und mit destilliertem Wasser (10 ml/h) eluiert, wobei A₂₈₀ (Adsorption bei 280 mm) und Killeraktivität jeder Fraktion überwacht wurden. Die Killeraktivität wurde bestimmt durch Aufbringen einer 10⁶ Zellen/Platte des 5059-Stammes auf eine YPAD-Platte (2% Glucose, 2% Polypepton, 1% Hefeextrakt, 0,04% Adeninsulfat und 2% Agar), die 0,003% Methylenblau enthielt, anschließendes Einsetzen einer Schale mit 8 mm Durchmesser, Einbringung von 100 µl der durch Fraktionierung mit Sephadex® G-50 erhaltenen Flüssigkeit, Inkubation bei 30°C während 2 Tagen und anschließende Messung eines Durchmessers eines Inhibitionsumfanges nach einer Modifikation der Methode von Bevan et al. (J. Gen. Microbiol., Vol. 51, Seite 115 (1968)).

Herstellung von monoklonalen Antikörpern.

Eine Maus (BALB/c) erhielt intracutan 125 µg einer Fraktion, welche die Killeraktivität aufwies und durch Fraktionierung mit Sephadex® G-50 erhalten worden war. Nach 1 Monat wurden der Maus 50 µg Toxin intravenös injiziert. Hybridisierung wurde bewirkt nach der Methode von Oi et al. (Immunoglobulin- procuding hybrid cell lines. In selected methods in cellular immunology, Herausgeber Mishell, B. und Shiigi, S.M., Freeman and Co., Seiten 351-572 (1980)). Monoklonale Antikörper, die durch die Hybridisierung erhalten worden waren, wurden primär klassiert nach der Festphasenmethode. Gemäß der Festphasenmethode wurden 50 µl (10 µg/ml physiologische Kochsalzlösung) der Killeraktivität-Fraktion, die mit Sephadex® G-50 fraktioniert worden war, an eine Festphase einer Polyvinyl-Mikrotiter-Platte fixiert und bei 4°C über Nacht stehengelassen. Nach 3maligem Waschen der Platte mit physiologischer Kochsalzlösung wurde mit 100 µl 25%igem Rinder-Fötalserum mit einem Gehalt an 0,1% NaN₃ versetzt und das System wurde bei Raumtemperatur 1 h lang stehengelassen. Danach wurden nach 3maligem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung 50 µl monoklonale Antikörper, die durch die Zellfusion erhalten worden waren, zugesetzt und das System wurde bei 37°C 3 h lang gehalten. Nach dem Waschen der Platte wurden 50 µl Anti-Maus IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, zugegeben, worauf bei 37°C 3 h lang reagieren gelassen wurde. Nach 4maligem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung wurde eine Farbentwicklung mit o-Phenylendiamin bewirkt. Eine zweite Klassierungsauslese wurde im Hinblick auf die nach der Primärklassierung erhaltenen Antikörper wie folgt durchgeführt unter Verwendung der neutralisierenden Aktivität der K₉-Killeraktivität als ein Index.

Nach Verdünnen von Killertoxin und monoklonalen Antikörpern, die nach der Primär-Klassierungsauslese erhalten worden waren, mit YPAD-Flüssigmedium wurden jeweils 25 µl der beiden Substanzen genommen und in einer 96 Bohrungs-Mikroplatte vermischt und bei 37°C 1 h lang inkubiert. Ferner wurden 50 µl Stationär-Phasenzellen des Saccaromyces cerevisiae 5059-Stammes mit YPAD- Flüssigmedium in den Bohrungen verdünnt und bei 30°C über Nacht inkubiert, um das Wachstum des Saccharomyces cerevisiae 5059-Stammes zu prüfen. Als Kontrollversuch wurden monoklonale Antikörper (Anti-HBs), die gegenüber K₉-Killertoxin irrelevant sind, verwendet. Wenn 250 µg/ml Antikörper (Anti-HBs) mit K₉-Killertoxin umgesetzt wurden, wurde die Killeraktivität bis zu 0,5 µg/ml beobachtet. Demgegenüber wurde bei Einsatz von Antikörpern von 250 µg/ml, 25 µg/ml und 2,5 µg/ml festgestellt, daß sie die Neutralisierungsaktivität gegenüber Killertoxin von 10 µg/ml oder mehr, 2,5 µg/ml und 0,5 µg/ml zeigten.

Aus Vorstehendem ergibt sich, daß es sich bei den durch die Primär-Klassierungsauslese erhaltenen Antikörpern um Anti- K₉-Killertoxin-Monoklonal-Antikörper, welche die neutralisierende Aktivität gegenüber der K₉-Killeraktivität aufweisen, handelt.

Reinigung des K₉-Killertoxins durch Affinitäts-Säulenchromatographie.

Anti-K₉-Killertoxin-Monoklonal-Antikörper wurden an aktivierte Sepharose 4B gekuppelt und an einer Säule (0,9 × 15 cm, 3 ml Bettvolumen) in einer Konzentration von 10 mg/ml immobilisiert und 3 ml einer Kulturlösung von H. mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197), die auf das 200fache konzentriert worden war, wurde auf die Säule aufgebracht und anschließend erfolgte die Elution mit 27 ml/h. Nachdem die eluierten Fraktionen mit NaOH neutralisiert worden waren, wurden aktive Fraktionen gesammelt und in destilliertem Wasser dialysiert, wobei das erfindungsgemäße Killertoxin erhalten wurde.

Physikochemische Eigenschaften des erfindungsgemäßen Killertoxins. (1) Aminosäurezusammensetzung und Aminosäuresequenz.

Eine Aminosäurezusammensetzung ist in Tabelle I aufgeführt. Die Aminosäurezusammensetzung wurde dadurch bestimmt, daß eine Probe der reduktiven Pyridyläthylierung (RPE) unterworfen, bei 110°C 24 h lang in einem zugeschmolzenen Rohr in Gegenwart von 6N HCl und 1% Thioglycolsäure hydrolisiert und in einen Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysator eingebracht wurde.

Die reduktive Pyridyläthylierung wurde wie im folgenden angegeben durchgeführt.

Tabelle I

(2) Aminosäuresequenz.

Die Aminosäuresequenz wurde wie folgt bestimmt. Killertoxin (500 µg) wurde bei 37°C über Nacht in Gegenwart von 0,13 M Tris-HCl-Puffer (Ph 7,6), 6M Guanidin-hydrochlorid und 10 mM Dithiothreit (Reaktionsvolumen von 500 µl) reduziert. Danach wurde 4-Vinylpyridin bis zu einer Endkonzentration von 30 mM zugegeben und bei 37°C wurde 90 min lang inkubiert. Schließlich wurden Proteine mit Hilfe von Reversphasen-HPLC von C₁₈ (5 µm) Ø 6,0 × 150 mm mit einem Gradienten von 0 bis 50% Acetonitril in Gegenwart von 0,1% Trifluoroessigsäure (TFA) abgetrennt.

Der Abbau mit verschiedenen Enzymen wurde wie folgt durchgeführt.

Tosylaminophenyläthyl-chloromethylketon (TPCK)-Trypsin.

RPE-Proteine wurden in 200 µl 1%igem NH₄HCO₃ (pH 8) (mäßig löslich) gelöst und 5 µg TPCK-Trypsin wurden zu der Lösung zugegeben (E/S = 1/100) und daran schloß sich eine Aufschlußbehandlung bei 37°C während etwa 24 h an. Nach dem Aufschluß wurden Niederschläge abzentrifugiert und die Auftrennung wurde durch HPLC unter Verwendung des Überstandes, so wie er angefallen war, und nachdem die Niederschläge in 0,1% TFA/H₂O gelöst worden waren, durchgeführt.

Lysil-endopeptidase.

Zu 100 µl intaktem Protein wurden 100 µl 0,2 M 2-Amino-2- methyl-1,3-propandiol (pH 9,5) zugegeben. Enzym, 0,05 AE, wurde zu dem Gemisch zugesetzt und daran schloß sich eine Aufschlußbehandlung bei 37°C während 24 h an. Nach dem Aufschluß wurden 5 µl 1 M-DTT dem System zugesetzt und bei 90°C 5 min lang reduziert. Danach erfolgte die Auftrennung durch HPLC.

Staphylococcus aureus V8-Protease.

RPE-Protein wurde in 200 µl 0,05 M-Ammoniumacetat-Puffer (pH 4,0) gelöst und 5 µg Enzym wurden zu der Lösung zugesetzt, gefolgt von einer Aufschlußbehandlung bei 37°C während 24 h. Nach dem Aufschluß wurde das Gemisch, so wie es war, durch HPLC getrennt.

α-Chymotrypsin.

RPE-Protein wurde in einer geringen Menge 0,1%iger TFA gelöst (vollständig löslich). Danach wurden 200 µl 1%iges NH₄HCO₃ (pH 8) zu der Lösung zugegeben (wobei sich aufgrund von dessen Unlöslichkeit eine Suspension bildete). Zu der Suspension wurden 5 µg α-Chymotrypsin zugesetzt und danach erfolgte eine Aufschlußbehandlung bei 37°C während 6 h. Nach dem Aufschluß wurden Niederschläge vollständig gelöst und die Lösung wurde, so wie sie war, durch HPLC aufgetrennt.

Die Aminosäuresequenz der durch HPLC getrennten Fragmente wurde mit Hilfe eines 470A-Proteinsequenz-Analysators bestimmt.

Die Formel (I) zeigt die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Killertoxins, bestimmt nach der oben beschriebenen Methode.

2) Molekulargewicht 10 700
3) Temperaturstabilität: Nach Behandlung bei 120°C während 10 min betrug die verbleibende Aktivität etwa 75%.
4) pH-Stabilität: Stabil bei Raumtemperatur bei pH 4 bis 11.

Das erfindungsgemäße Killertoxin zeigt hervorragende Hitzebeständigkeit, pH-Stabilität fungistatische Aktivität gegen Mycomyceten. Das fungistatische Spektrum ist in der folgenden Tabelle II aufgeführt.
   Stämme (TIMM)MIC (µ/ml) Hansenula anomala (0705)   0.4 Hansenula petersonii (0710)   0.4 Pichia membranaefaciens (1485)   0.1 Saccharomyces cerevisiae (0934)   0.4 Torulopspora delbrueckii (1492)   0.8 Candida glabrata (1062)   0.4 Candida krusei (0270)   0.4 Geotrichum candidum (1699)   0.2 Candida albicans (0144)≦λτ100 Cryptococcus neoformans (0354)≦λτ100 Rhodotorula glutinus (1487)≦λτ100

*YEPD-Flüssigmedium (2% Glukose, 2% Polypepton und 1% Hefeextrakt, pH 6,3) wurde verwendet.

Wie oben beschrieben, zeigt das erfindungsgemäße Killertoxin eine fungistatische Aktivität gegen pathogene Fungi und es ist daher als ein fungistatisches Mittel anwendbar.

Das erfindungsgemäße Killertoxin übt die fungistatische Aktivität durch Hemmung der Biosynthese von β-1,3-Glucan, bei dem es sich um eine Zellwandkomponente der genannten Fungi handelt, aus.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1) Kultivierung

H. mrakii IFO 0895 (FERM BP-1197) wurde in einem 3 l-Kolben kultiviert, der mit 1 l Minimalmedium, das mit Aminosäuren und Basen (0,67% Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 400 mg Adeninsulfat, 24 mg Uracil, 24 mg Tryptophan, 24 mg Histidin, 24 mg Arginin, 24 mg Methionin, 36 mg Tyrosin, 36 mg Leucin, 36 mg Isoleucin, 36 mg Lysin, 100 mg Asparaginsäure, 150 mg Valin, 200 mg Threonin und 60 mg Phenylalanin pro l; pH 5,5) ergänzt war, beschickt worden war, durch Schütteln bei 30°C während 1 d. Nach dem Zentrifugieren wurde die Kultur auf das 200fache mit Amicon YM-5 konzentriert unter Erzielung von 5 ml Kulturlösung.

2) Reinigung

Das 200fach-Konzentrat aus der Kultivierung des gemäß 1) erhaltenen IFO 0895-Stammes wurde durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der unten erläuterten monoklonalen Antikörper gereinigt.

Immunität

Das gemäß 1) erhaltene Konzentrat wurde auf eine Sephadex® G-50-Säule (2,6 × 100 cm) aufgebracht und mit destilliertem Wasser in einer Rate von 10 ml/h eluiert, wobei der A₂₈₀- Wert und die Killeraktivität jeder Fraktion (5 ml) festgestellt wurde. Die Killeraktivität wurde bestimmt durch Aufbringen einer 10⁶ Zellen/Platte des S. cerevisiae 5059-Stammes (diploid, empfindlich gegen "Miller") auf eine 0,003% Methylenblau enthaltende YPAD-Platte (2% Glucose, 2% Polypeton, 1% Hefeextrakt, 0,04% Adeninsulfat und 2% Agar), Einsetzen einer Schale mit einem Durchmesser von 8 mm, Zugabe von 100 µl einer Sephadex® G-50-Fraktion, Inkubation bei 30°C während 2 d und Messen des Durchmessers eines Inhibitionskreises. Einer Maus (BALB/c) wurden intracutan 125 µg aktive, mit Sephadex G-50 fraktionierte Killerfraktion verabreicht. Nach 1 Monat wurden der Maus 50 µg Toxin intravenös injiziert.

Hybridisierung

Drei d nach der Endimmunität wurde die Milz der Maus entnommen und eine Suspension von Einzelzellen hergestellt. Die Milzzellen (1 × 10⁸) und 1 × 10⁷ Mäuse-Myelomzellen wurden hybridisiert mit 50% Polyethylenglycol (Molekulargewicht 1500). Die Zellen wurden auf 4 Mikroplatten mit 96 Bohrungen verteilt. Nach 24 h wurde die Hälfte des Überstandes durch HAT-Medium (Hypoxanthimin/Aminopterin/Thymidin) ersetzt. Das Wachstum der HAT-resistenten Zellen wurde 2 Wochen später festgestellt.

Selektion von Anti-Killertoxin-monoklonal-Antikörpern

Die durch die Zellfusion erhaltenen monoklonalen Antikörper wurden einer Primärklassierungsauswahl nach der Festphasenmethode unterworfen. Die Festphasenmethode wurde wie folgt durchgeführt. 50 µl (10 µg/ml) aktive Killerfraktion wurden an einer Polyvinyl-Mikrotiterplatte immobilisiert und danach wurde bei 4°C über Nacht absitzen gelassen. Nach 3maligem Spülen der Platte mit physiologischer Kochsalzlösung wurde mit 100 µl 25%igem Rinder-Fötalserum, das 0,1% Natriumazid enthielt, versetzt und es wurde bei Raumtemperatur 1 h lang stehengelassen. Nach 3maligem Spülen mit physiologischer Kochsalzlösung wurden 50 µl der durch die Zellfusion erhaltenen monoklonalen Antikörper zugegeben und das System wurde bei 37°C 3 h lang gehalten. Nach Spülen der Platte wurde mit 50 µl Anti-Maus IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, versetzt. Nach Inkubation bei 37°C während 3 h wurde eine Färbung mit o-Phenylendiamin hervorgerufen. Bezüglich der durch die Primär-Klassifizierungsauslese erhaltenen Antikörper wurde eine zweite Klassierungsauslese wie folgt durchgeführt unter Anwendung der Neutralisierungsaktivität der Killeraktivität als ein Index.

Nachdem das Killertoxin und die durch die primäre Klassierungsauslese erhaltenen monoklonalen Antikörper mit YPAD-Flüssigmedium verdünnt worden waren, wurden jeweils 25 µl jeder Substanz in einer 96 Bohrungs-Mikroplatte vermischt mit anschließender Inkubation bei 37°C während 1 h. Ferner wurde der mit YPAD-Flüssigmedium verdünnte S. cerevisiae 5059-Stamm in die Zellen in einer Konzentration von 4 × 10⁴ Zellen/ml (letztlich 2000 Zellen/Bohrung) eingebracht, gefolgt von einer Inkubation bei 30°C über Nacht. Danach wurde das Wachstum des 5059-Stammes untersucht. Als Kontrollbestimmung wurden monoklonale Antikörper (anti-HBs), die gegenüber Killertoxin irrelevant waren, verwendet.

Reinigung des Killertoxins durch Affinitäts-Chromatographie

Auf eine Säule (0,9 × 15 cm, 3 ml Bettvolumen), die immobilisierte Anti-Killertoxin-Monoklonal-Antikörper an aktivierter Sepharose 4B in einer Konzentration von 10 mg/ml enthielt, wurden 1,5 ml (mit einem Gehalt an 210 µg Killertoxin) eines 200fachen Konzentrats des IFO 0895-Stammes aufgebracht. Die Elution wurde mit 2,7 ml/h durchgeführt. Das Spülen und die Elution wurden mit 0,15 M NaCl bzw. 0,2 M Glycin-HCl (pH 2,2) vorgenommen. Die gespülte Fraktion wurde so, wie sie war, verwendet und die eluierte Fraktion wurde mit einer Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Die Menge (µg/ml) an Killertoxin wurde bestimmt basierend auf einer zuvor erstellten Kalibrierungskurve. Ferner wurde der Proteingehalt nach der Methode von Lowry et al. gemessen. Als Ergebnis war festzustellen, daß 157 µg K₉-Killertoxin erhalten worden waren.

Claims (1)

1. Killertoxin der folgenden Strukturformel (I):