DE19532495A1

DE19532495A1 - Verfahren zum Reinigen von Hirudin

Info

Publication number: DE19532495A1
Application number: DE19532495A
Authority: DE
Inventors: Sang Ki Rhee; Bong Hyun Chung; Eui Sung Choi; Jung Hoon Sohn; Deok Joong Youn; Myung Kuk Kim; Hae Don Lee
Original assignee: Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd; Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Dong Kook Pharmaceutical Co Ltd; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 1994-09-07
Filing date: 1995-09-02
Publication date: 1996-03-14
Also published as: KR0141651B1; FR2724175A1; JPH08176199A; CN1127260A; GB9518225D0; CN1071337C; GB2292942A; KR960010682A; US5698104A; GB2292942B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Hirudin nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Hirudin, das vom Blutegel, Hirudo medicinalis, isoliert wird, ist ein Thrombininhibitor und besteht aus 65 bis 66 Aminosäuren. Etwa 11 Varianten von Hirudin sind bekannt, die in zwei Gruppen in Abhängigkeit von der Folge von N-Terminalaminosäuren klassifiziert werden: HV1, bei dem die N-Terminalaminosäure Val-Val ist (Bagdy et al., Meth. Enzymol. 45, 669 (1976)), und HV2, bei dem die N-Terminalaminosäure Ile-Thr ist (Walsmann und Markwardt, Thromb. Res. 40, 563 (1985)). Sowohl HV1 als auch HV2 sind zur Thrombosebehandlung verwendet worden. Hirudin zeigt eine Thrombininhibitionskonstante (K_i) von 10^-11M bis 10^-14M, was an zeigt, daß Hirudin mit einer sehr geringen Konzentration eine Blutkoagu lation verhindern kann (Mao et al., Anal. Biochem. 161, 514 (1987)). Insbesondere zeigten klinische Tests, daß Hirudin keine nachteiligen Wirkungen wie Allergien, Immunreaktionen oder Kreislauffehlfunktionen zeigt (Markwardt et al., Thromb. Haemostas, 52, 160 (1984)).

Die Hirudinmenge, die von einem Hirudo medicinalis erhalten werden kann, beträgt nur etwa 20 µg (Markwardt, Meth. Enzymol., 19, 924, 1970). Daher wurden viele Versuche unternommen, um eine große Menge Hirudin durch Kultivierung von genetisch manipulierten Mikroorganismen zu erzeugen (siehe beispielsweise Fareed et al., Blood coagulation and Fibrinolysis, 2, 135 (1991)).

Riehl-Bellon et al. verwenden Anionenaustauschchromatographie und Umkehrphasen-HPLC, um Hirudin zu reinigen, das durch Genklonungs techniken erzeugt wird (Riehl-Bellon et al., Biochem., 28, 2941 (1989)). Misawa et al führen Säulenchromatographie auf DEAE-Cellulofin, Butyl-Toyopearl, Sephadex G-25 und Q-Sepharose abwechselnd aus, um HV2 aus einer rekombinanten E. coli-Kultur zu reinigen (Misawa et al., Procee dings of ApBioChEC., Seite 62, (1992)).

Jedoch wurden diese Methoden nur entwickelt, um die Produktion von Hirudin in Gastzellen feststellen, und sie sind nicht geeignet, zur quantitativen Reinigung von Hirudin verwendet zu werden.

Ein rekombinantes Protein für medizinische Zwecke, das in Form von Injektionsformulierungen verwendet wird, sollte hochgradig gereinigt sein, wobei die Reinigung sehr wichtig in bezug auf die Sicherheit der Präparation und in bezug auf ökonomische Aspekte ist.

Zum Zwecke der Reinigung von Proteinen für medizinische Zwecke wurde Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung einer Antigen-Anti körperreaktion eingesetzt. Jedoch besitzt Immunaffinitätschromato graphie verschiedene Nachteile: sie unterliegt Inaktivierung und ist teuer. Daher war ihre Verwendung auf den letzten Schritt des Reinigungs verfahrens beschränkt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Reinigen von Hirudin zu schaffen, das effektiv und billig ist.

Diese Aufgabe wird entsprechend dem kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 gelöst.

Hierbei wird die Hirudin und andere Substanzen enthaltende Lösung einer Metallionenaffinitätschromatographie unterworfen, wobei das Metallion ein Kupferion (Cu⁺⁺) ist und ein Phosphatpuffer als Elutions mittel verwendet wird.

Insbesondere wird hierbei eine Lösung einer Kupferverbindung durch eine Säule geschickt, die mit einem Liganden gepackt ist, um Kupferionen (Cu⁺⁺) an dem Liganden zu adsorbieren, wonach die Hirudin und andere Substanzen enthaltene Lösung auf die Säule gegeben wird, um Hirudin an den Kupferionen zu binden, wonach Hirudin von dem Kupferion abgelöst und von der Säule eluiert wird, indem ein Phosphatpuffer als Elutionsmittel verwendet wird.

Metallionenaffinitätschromatographie, bei der ein Metallion als ein Affinitätsadsorptionsmittel verwendet wird, wurde erstmalig 1975 entwickelt, um Humanserumprotein zu isolieren (Porath et al., Nature, 258, 598 (1975)). Porath et al. lehren, daß bestimmte Aminosäuren, die eine Imidazolstruktur haben, an einem Metallion gebunden werden, das von einem Liganden adsorbiert ist, mit dem eine chromatographische Säule gepackt ist, wobei dies aufgrund von Affinität zwischen der Aminosäure und dem Metallion geschieht, wonach die Aminosäure von dem Metallion durch Verminderung der Affinität zwischen der Aminosäure und dem Metall ion durch Verwendung eines Elutionsmittels abgelöst wird. Als Metall ionen können beispielsweise zweiwertige Metallionen wie Cu⁺⁺, Ni⁺⁺ und Zn⁺⁺ verwendet werden. Die Metallionenchromatographie hat in bezug auf industrielle Aspekte Vorteile, da der Ligand, an dem Metallionen adsor biert werden, leicht hergestellt werden kann und in seiner Stabilität ausgezeichnet ist, wobei die Immobilisierungsmatrix (oder Träger) rezy kliert werden kann.

Der Ligand, der auf einer Immobilisierungsmatrix oder einem Träger zu immobilisieren ist und an dem Kupferionen als ein Affinitäts adsorbens adsorbiert werden, kann irgendeiner sein, der für die Metall ionenaffinitätschromatographie verwendet wird. Beispielsweise kann es sich um Iminodiessigsäure (IDA), Tris(Carboxymethyl)ethylendiamin (TED) oder Nitrilotriessigsäure (NTA) handeln. Iminodiessigsäure wird bevor zugt verwendet.

Als Immobilisierungsmatrix oder Träger kann ein Agarose- oder Dextrosegel wie Sepharose (Pharmacia), Sephadex (Pharmacia), Cellufine (Amicon), Toyopearl (Tosoh) und dergleichen verwendet werden.

Die Immobilisierungsmatrix, an der der Ligand fixiert wird, kann in bekannter Weise hergestellt werden oder ist kommerziell erhält lich.

Das für die vorliegende Erfindung verwendete Ion ist ein zwei wertiges Ion und vorzugsweise ein zweiwertiges Kupferion (Cu⁺⁺). Das Kupferion kann an dem Liganden durch Hindurchleiten einer Lösung einer Kupferverbindung durch die mit dem Liganden gepackte Säule adsorbiert werden. Die Kupferverbindung ist vorzugsweise Kupfersulfat. Irgendein anderes zweiwertiges Metallion wie Zink oder Nickel hat keine Affinität zu Hirudin und kann dementsprechend nicht für die Reinigung von Hirudin verwendet werden.

Hirudin kann von dem Metallion durch Verwendung eines Puffers wie Phosphat, eines Imidazolkonzentrationsgradienten, eines pH-Gradien ten oder eines Chelatbildners wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Ethylenglycoltetraessigsäure getrennt werden. In bezug auf die Ausbeute von Hirudin wird vorzugsweise ein Phosphatpuffer, insbesondere 50 bis 500 mM Phosphat, vorzugsweise bis etwa 100 mM Phosphatpuffer verwendet. Phosphatpuffer kann bis zu 20 mM Imidazol enthalten, da der Zusatz von Imidazol das Abkoppeln von Hirudin vom Kupferion erleichtert, wenn die Kopplung sehr stark ist.

Hirudin, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gereinigt werden kann, kann natürliches Hirudin, isoliert vom Hirudo medicinalis, Hirudin enthaltende Kulturbrühe, die erhalten wird durch Kultivieren von Hefe oder Bakterien, die eine rekombinante DNA-Kodierung für Hirudin besitzen, kommerziell erhältliche, ungereinigte (rohe) Hiru dinbereitungen und dergleichen umfassen. Hirudin, das durch eine rekom binante DNA-Technik erzeugt werden kann, kann HV2-Hirudin, Lys47-HV2, welches ein HV2-Hirudin ist, in dem Aminosäure 47 durch Lys substituiert ist, oder HV1-Hirudin umfassen.

Hefen oder Bakterien, die eine rekombinante DNA-Kodierung für Hirudin enthalten, können durch gewöhnliche Kulturtechnik kultiviert werden, wie sie zur Herstellung von Hirudin bekannt ist. Hirudin kann roh von der Kulturbrühe der Hefen oder Bakterien in bekannter Weise beispielsweise durch Zentrifugieren der Kulturbrühe und anschließendes Unterwerfen des Überstandes einer Ultrazentrifugierung isoliert werden. Alternativ kann die Kulturbrühe einer Ionenchromatographie oder einer Ausfällung unter Verwendung von Ethanol oder Aceton unterworfen werden.

Unter dem Ausdruck "Hirudin enthaltende Rohlösung" wird eine Lösung verstanden, die Hirudin als auch andere Substanzen enthält. Die Hirudin enthaltene Rohlösung kann, wie oben erläutert, die Kulturbrühe oder rohes Hirudin, isoliert von der Kulturbrühe, kommerziell erhältli che ungereinigte Hirudinbereitungen und dergleichen enthalten.

Hirudin wird quantitativ durch die Folin-Methode analysiert und die Reinheit durch die Sohn-Methode bestimmt (Sohn et al., J. Micro biol. Biotechnol., 1, 266 (1991)), bei der eine Hochleistungsflüssig keitschromatographie (HPLC; Bechman, Model System Gold) auf einer C-8-Säule (4,6 mm × 250 mm, Phenomenex) unter Verwendung von 15-30% Ace tonitril-Wasser-Gradienten durchgeführt wird.

Der Antithrombintiter von Hirudin wird ausgedrückt als Anti thrombineinheit (ATU). Die Thrombinaktivität ist standardisiert als NIH-U, und 1 ATU Hirudinaktivität ist definiert als die Menge von Hiru din, die vollständig die 1 NIH-U Thrombinaktivität verhindert.

Der Antithrombintiter von Hirudin kann durch die Methode von Nadine et al. bestimmt werden (Nadine et al., Biochem., 28, 2941 (1989)).

Das bedeutet, daß 50 µl Thrombinreaktionslösung (0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, 0,12 M NaCl, 0,01% Natriumazid, 0,1% Rinderserumalbumin) zu 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025 oder 0,03 ATU authentisches Hirudin (Accurate Chem. & Scientific) oder gereinigtes Hirudin hergestellt gemäß den Beispielen der vorliegenden Erfindung zugesetzt und dann 0,03 NIH-U/50 µl menschliches Thrombin (Sigma) hinzugefügt wird. Dann werden 100 µl von 200 µM Chromozym TH (Boehringer Mannheim), ein synthetisches Substrat für Thrombin, zugesetzt und die resultierende Mischung bei 37°C für 5 min im Brutofen behandelt und die Farbentwicklung von Chromozym TH bei 405 nm durch Verwendung eines Mikroplattenlesers gemessen. Durch Verwendung der Messungen bei 405 nm für authentisches und gereinigtes Hirudin wird der Titer von gereinigtem Hirudin, das gemäß den Beispielen erhalten wird, berechnet.

Beispiel 1

Hefe, Saccharomyces cerevisiae, KCTC 8519P wurde in einem ge mischten Kulturmedium (4% Hefeextrakt, 0,5% Casaminosäure, 1% Bern steinsäure, 0,4% Natriumhydroxid und 4% Galactose als Kohlenstoff quelle) bei 30°C während 52 h kultiviert. Die Kultivierung fand im Zu führchargenkulturverfahren statt, bei dem Galactose intermittierend zugesetzt wurde, um ihre Konzentration auf 2 bis 4% zu halten.

Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentri fugiert, um einen überstand zu liefern, der durch eine YM3-Ultrafilter membran mit einem Molekulargewichtsschnitt von 3000 (Amicon) gefiltert wurde. Das so erhaltene Filtrat wird als Hirudin enthaltende Rohlösung bezeichnet und in dem nachfolgenden Reinigungsverfahren verwendet.

Beispiel 2

IDA-Sepharose 6B Fast Flow, bei dem es sich um ein Sepharose gel handelt, an dem Iminodiessigsäure (IDA) fixiert ist, wurde von Sigma erworben. IDA-Sepharose 6B wurde in eine 1,5 × 30 cm chromatographische Säule gepackt und 20 mM Kupfersulfatlösung durch die Säule geschickt.

Beispiel 3

1 ml Hirudin enthaltende Rohlösung gemäß Beispiel 1 wurde mit einer Durchströmrate von 1 ml/min durch die IDA-Sepharose 6B Fast Flow Säule, hergestellt gemäß Beispiel 2, geschickt, um Hirudin an den Kupferionen zu binden, wonach die Säule mit 1 mM Phosphatpuffer (pH 6,2) gewaschen wurde, um ungebundene Proteine, bei denen es sich nicht um Hirudin handelt, zu entfernen. Dann wurde Hirudin unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,2) eluiert. Fraktionen von Nr. 38 bis 54, die Hirudin enthalten, wurden gesammelt und einer Ultrafiltration durch eine Membran mit einem Molekulargewichtsschnitt von 3000 unterworfen. Die Menge an Gesamtprotein und Hirudinaktivität enthaltend in dem Fil trat war 1,75 mg bzw. 4000 ATU/mg, während sie 120,8 mg bzw. 68,6 ATU/mg für die Hirudin enthaltende Rohlösung waren. Die Ausbeute und Reinheit des Hirudins waren 85,6% bzw. 90% oder mehr.

Vergleichsbeispiele 1 bis 2

Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebene Vorgehensweise wur de ausgeführt, wobei jedoch 20 mM Nickelionenlösung (Vergleichsbeispiel 1) oder Zinkionenlösung (Vergleichsbeispiel 2) anstelle der Kupfersul fatlösung verwendet wurde.

Es gab hierbei keine Änderung der Beträge von Gesamtprotein und Aktivitäten von Hirudin enthalten in der Lösung vor und nach dem Hindurchführen durch die Säule.

Beispiel 4

Ungereinigtes natürliches Hirudin wurde von Sigma unter der Katalognummer H7016 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Bei spiel 3 gereinigt.

Die Menge an Gesamtprotein und Hirudinaktivität vor Hindurch führen durch die Säule betrug 0,08 mg bzw. 1720 ATU/mg, während nach Hindurchführen durch die Säule diese 0,01179 mg bzw. 10 500 ATU/mg betru gen. Die Ausbeute und die Reinheit von Hirudin waren 90% bzw. 97% oder mehr.

Beispiel 5

Ungereinigtes HV1 wurde von CalBioChem unter der Katalognummer 377 855 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Beispiel 3 gerei nigt. Das Ablösen von Hirudin von den Kupferionen wurde unter Verwendung von 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,2) enthaltend 20 mM Imidazol durchge führt.

Die Menge von Gesamtprotein und Hirudinaktivität vor dem Hin durchführen durch die Säule betrug 0,93 mg bzw. 215 ATU/mg, während nach dem Hindurchführen durch die Säule sich 0,215 mg bzw. 890 ATU/mg erga ben. Ausbeute und Reinheit des Hirudins betrugen 96% bzw. 90% oder mehr.

Beispiel 6

Rekombinantes Hirudin, Lys 47-HV2, wurde von Sigma unter der Katalognummer H0393 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Bei spiel 3 gereinigt.

Der Betrag an Gesamtprotein und die Hirudinaktivität vor Hin durchführen durch die Säule betrugen 0,01 mg bzw. 9900 ATU/mg, während sich nach dem Hindurchführen durch die Säule 0,0095 mg bzw. 12 000 ATU/mg ergaben. Die Ausbeute und Reinheit von Hirudin betrugen 90% bzw. 99% oder mehr.

Vergleichsbeispiel 3

Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Vorgehensweisen wurden ausgeführt, außer daß der pH-Gradient von 6 zu 4 durch Verwendung von Natriumacetatpuffer (20 mM) enthaltend 1M NaCl verwendet wurde, um Hirudin von der Säule zu eluieren.

Das Ablösen von Hirudin von den Kupferionen war unvollständig und die Hirudinausbeute war etwa 60%.

Beispiel 7

Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Vorgehensweisen wurden durchgeführt, außer daß Triscarboxymethylethylendiamin anstelle von Iminodiessigsäure als Ligand verwendet wurde. Die Ausbeute und Rein heit von Hirudin betrugen 86,3% bzw. 90% oder mehr.

Claims

1. Verfahren zum Reinigen von Hirudin aus einer Hirudin und andere Substanzen enthaltenden Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung einer Metallionenaffinitätschromatographie unter worfen wird, in der das Metallion ein Kupferion (Cu⁺⁺) ist und ein Phos phatpuffer als Eluiermittel verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung einer Kupferverbindung durch eine Säule geschickt wird, die mit einem Liganden gepackt ist, um Kupferionen (Cu⁺⁺) an dem Liganden zu adsorbieren, eine Lösung enthaltend Hirudin und andere Substanzen auf die Säule gegeben wird, um Hirudin an den Kupferionen zu binden, und Hirudin von den Kupferionen abgelöst und Hirudin aus der Säule durch Verwendung eines Phosphatpuffers als Eluiermittel eluiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Hirudin als natürliches Hirudin, HV1, HV2 oder Lys47-HV2 eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß als Kupferionen enthaltende Lösung eine Kupfersulfatlösung verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß der Phosphatpuffer in einer Konzentration von weniger als 100 mM verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß der Phosphatpuffer mit bis zu 20 mM Imidazol verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß als Ligand Iminodiessigsäure verwendet wird.