DE19532495A1 - Verfahren zum Reinigen von Hirudin - Google Patents
Verfahren zum Reinigen von HirudinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Hirudin
nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Hirudin, das vom Blutegel, Hirudo medicinalis, isoliert wird,
ist ein Thrombininhibitor und besteht aus 65 bis 66 Aminosäuren. Etwa 11
Varianten von Hirudin sind bekannt, die in zwei Gruppen in Abhängigkeit
von der Folge von N-Terminalaminosäuren klassifiziert werden: HV1, bei
dem die N-Terminalaminosäure Val-Val ist (Bagdy et al., Meth. Enzymol.
45, 669 (1976)), und HV2, bei dem die N-Terminalaminosäure Ile-Thr ist
(Walsmann und Markwardt, Thromb. Res. 40, 563 (1985)). Sowohl HV1 als
auch HV2 sind zur Thrombosebehandlung verwendet worden. Hirudin zeigt
eine Thrombininhibitionskonstante (Ki) von 10-11M bis 10-14M, was an
zeigt, daß Hirudin mit einer sehr geringen Konzentration eine Blutkoagu
lation verhindern kann (Mao et al., Anal. Biochem. 161, 514 (1987)).
Insbesondere zeigten klinische Tests, daß Hirudin keine nachteiligen
Wirkungen wie Allergien, Immunreaktionen oder Kreislauffehlfunktionen
zeigt (Markwardt et al., Thromb. Haemostas, 52, 160 (1984)).
Die Hirudinmenge, die von einem Hirudo medicinalis erhalten
werden kann, beträgt nur etwa 20 µg (Markwardt, Meth. Enzymol., 19, 924,
1970). Daher wurden viele Versuche unternommen, um eine große Menge
Hirudin durch Kultivierung von genetisch manipulierten Mikroorganismen
zu erzeugen (siehe beispielsweise Fareed et al., Blood coagulation and
Fibrinolysis, 2, 135 (1991)).
Riehl-Bellon et al. verwenden Anionenaustauschchromatographie
und Umkehrphasen-HPLC, um Hirudin zu reinigen, das durch Genklonungs
techniken erzeugt wird (Riehl-Bellon et al., Biochem., 28, 2941 (1989)).
Misawa et al führen Säulenchromatographie auf DEAE-Cellulofin,
Butyl-Toyopearl, Sephadex G-25 und Q-Sepharose abwechselnd aus, um HV2 aus
einer rekombinanten E. coli-Kultur zu reinigen (Misawa et al., Procee
dings of ApBioChEC., Seite 62, (1992)).
Jedoch wurden diese Methoden nur entwickelt, um die Produktion
von Hirudin in Gastzellen feststellen, und sie sind nicht geeignet, zur
quantitativen Reinigung von Hirudin verwendet zu werden.
Ein rekombinantes Protein für medizinische Zwecke, das in Form
von Injektionsformulierungen verwendet wird, sollte hochgradig gereinigt
sein, wobei die Reinigung sehr wichtig in bezug auf die Sicherheit der
Präparation und in bezug auf ökonomische Aspekte ist.
Zum Zwecke der Reinigung von Proteinen für medizinische Zwecke
wurde Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung einer Antigen-Anti
körperreaktion eingesetzt. Jedoch besitzt Immunaffinitätschromato
graphie verschiedene Nachteile: sie unterliegt Inaktivierung und ist
teuer. Daher war ihre Verwendung auf den letzten Schritt des Reinigungs
verfahrens beschränkt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Reinigen
von Hirudin zu schaffen, das effektiv und billig ist.
Diese Aufgabe wird entsprechend dem kennzeichnenden Teil des
Anspruchs 1 gelöst.
Hierbei wird die Hirudin und andere Substanzen enthaltende
Lösung einer Metallionenaffinitätschromatographie unterworfen, wobei das
Metallion ein Kupferion (Cu⁺⁺) ist und ein Phosphatpuffer als Elutions
mittel verwendet wird.
Insbesondere wird hierbei eine Lösung einer Kupferverbindung
durch eine Säule geschickt, die mit einem Liganden gepackt ist, um
Kupferionen (Cu⁺⁺) an dem Liganden zu adsorbieren, wonach die Hirudin
und andere Substanzen enthaltene Lösung auf die Säule gegeben wird, um
Hirudin an den Kupferionen zu binden, wonach Hirudin von dem Kupferion
abgelöst und von der Säule eluiert wird, indem ein Phosphatpuffer als
Elutionsmittel verwendet wird.
Metallionenaffinitätschromatographie, bei der ein Metallion
als ein Affinitätsadsorptionsmittel verwendet wird, wurde erstmalig 1975
entwickelt, um Humanserumprotein zu isolieren (Porath et al., Nature,
258, 598 (1975)). Porath et al. lehren, daß bestimmte Aminosäuren, die
eine Imidazolstruktur haben, an einem Metallion gebunden werden, das von
einem Liganden adsorbiert ist, mit dem eine chromatographische Säule
gepackt ist, wobei dies aufgrund von Affinität zwischen der Aminosäure
und dem Metallion geschieht, wonach die Aminosäure von dem Metallion
durch Verminderung der Affinität zwischen der Aminosäure und dem Metall
ion durch Verwendung eines Elutionsmittels abgelöst wird. Als Metall
ionen können beispielsweise zweiwertige Metallionen wie Cu⁺⁺, Ni⁺⁺ und
Zn⁺⁺ verwendet werden. Die Metallionenchromatographie hat in bezug auf
industrielle Aspekte Vorteile, da der Ligand, an dem Metallionen adsor
biert werden, leicht hergestellt werden kann und in seiner Stabilität
ausgezeichnet ist, wobei die Immobilisierungsmatrix (oder Träger) rezy
kliert werden kann.
Der Ligand, der auf einer Immobilisierungsmatrix oder einem
Träger zu immobilisieren ist und an dem Kupferionen als ein Affinitäts
adsorbens adsorbiert werden, kann irgendeiner sein, der für die Metall
ionenaffinitätschromatographie verwendet wird. Beispielsweise kann es
sich um Iminodiessigsäure (IDA), Tris(Carboxymethyl)ethylendiamin (TED)
oder Nitrilotriessigsäure (NTA) handeln. Iminodiessigsäure wird bevor
zugt verwendet.
Als Immobilisierungsmatrix oder Träger kann ein Agarose- oder
Dextrosegel wie Sepharose (Pharmacia), Sephadex (Pharmacia), Cellufine
(Amicon), Toyopearl (Tosoh) und dergleichen verwendet werden.
Die Immobilisierungsmatrix, an der der Ligand fixiert wird,
kann in bekannter Weise hergestellt werden oder ist kommerziell erhält
lich.
Das für die vorliegende Erfindung verwendete Ion ist ein zwei
wertiges Ion und vorzugsweise ein zweiwertiges Kupferion (Cu⁺⁺). Das
Kupferion kann an dem Liganden durch Hindurchleiten einer Lösung einer
Kupferverbindung durch die mit dem Liganden gepackte Säule adsorbiert
werden. Die Kupferverbindung ist vorzugsweise Kupfersulfat. Irgendein
anderes zweiwertiges Metallion wie Zink oder Nickel hat keine Affinität
zu Hirudin und kann dementsprechend nicht für die Reinigung von Hirudin
verwendet werden.
Hirudin kann von dem Metallion durch Verwendung eines Puffers
wie Phosphat, eines Imidazolkonzentrationsgradienten, eines pH-Gradien
ten oder eines Chelatbildners wie Ethylendiamintetraessigsäure oder
Ethylenglycoltetraessigsäure getrennt werden. In bezug auf die Ausbeute
von Hirudin wird vorzugsweise ein Phosphatpuffer, insbesondere 50 bis
500 mM Phosphat, vorzugsweise bis etwa 100 mM Phosphatpuffer verwendet.
Phosphatpuffer kann bis zu 20 mM Imidazol enthalten, da der Zusatz von
Imidazol das Abkoppeln von Hirudin vom Kupferion erleichtert, wenn die
Kopplung sehr stark ist.
Hirudin, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
gereinigt werden kann, kann natürliches Hirudin, isoliert vom Hirudo
medicinalis, Hirudin enthaltende Kulturbrühe, die erhalten wird durch
Kultivieren von Hefe oder Bakterien, die eine rekombinante DNA-Kodierung
für Hirudin besitzen, kommerziell erhältliche, ungereinigte (rohe) Hiru
dinbereitungen und dergleichen umfassen. Hirudin, das durch eine rekom
binante DNA-Technik erzeugt werden kann, kann HV2-Hirudin, Lys47-HV2,
welches ein HV2-Hirudin ist, in dem Aminosäure 47 durch Lys substituiert
ist, oder HV1-Hirudin umfassen.
Hefen oder Bakterien, die eine rekombinante DNA-Kodierung für
Hirudin enthalten, können durch gewöhnliche Kulturtechnik kultiviert
werden, wie sie zur Herstellung von Hirudin bekannt ist. Hirudin kann
roh von der Kulturbrühe der Hefen oder Bakterien in bekannter Weise
beispielsweise durch Zentrifugieren der Kulturbrühe und anschließendes
Unterwerfen des Überstandes einer Ultrazentrifugierung isoliert werden.
Alternativ kann die Kulturbrühe einer Ionenchromatographie oder einer
Ausfällung unter Verwendung von Ethanol oder Aceton unterworfen werden.
Unter dem Ausdruck "Hirudin enthaltende Rohlösung" wird eine
Lösung verstanden, die Hirudin als auch andere Substanzen enthält. Die
Hirudin enthaltene Rohlösung kann, wie oben erläutert, die Kulturbrühe
oder rohes Hirudin, isoliert von der Kulturbrühe, kommerziell erhältli
che ungereinigte Hirudinbereitungen und dergleichen enthalten.
Hirudin wird quantitativ durch die Folin-Methode analysiert
und die Reinheit durch die Sohn-Methode bestimmt (Sohn et al., J. Micro
biol. Biotechnol., 1, 266 (1991)), bei der eine Hochleistungsflüssig
keitschromatographie (HPLC; Bechman, Model System Gold) auf einer
C-8-Säule (4,6 mm × 250 mm, Phenomenex) unter Verwendung von 15-30% Ace
tonitril-Wasser-Gradienten durchgeführt wird.
Der Antithrombintiter von Hirudin wird ausgedrückt als Anti
thrombineinheit (ATU). Die Thrombinaktivität ist standardisiert als
NIH-U, und 1 ATU Hirudinaktivität ist definiert als die Menge von Hiru
din, die vollständig die 1 NIH-U Thrombinaktivität verhindert.
Der Antithrombintiter von Hirudin kann durch die Methode von
Nadine et al. bestimmt werden (Nadine et al., Biochem., 28, 2941 (1989)).
Das bedeutet, daß 50 µl Thrombinreaktionslösung (0,1 M Tris-Cl,
pH 8,0, 0,12 M NaCl, 0,01% Natriumazid, 0,1% Rinderserumalbumin)
zu 0,005, 0,01, 0,015, 0,02, 0,025 oder 0,03 ATU authentisches Hirudin
(Accurate Chem. & Scientific) oder gereinigtes Hirudin hergestellt gemäß
den Beispielen der vorliegenden Erfindung zugesetzt und dann
0,03 NIH-U/50 µl menschliches Thrombin (Sigma) hinzugefügt wird. Dann werden
100 µl von 200 µM Chromozym TH (Boehringer Mannheim), ein synthetisches
Substrat für Thrombin, zugesetzt und die resultierende Mischung bei 37°C
für 5 min im Brutofen behandelt und die Farbentwicklung von Chromozym TH
bei 405 nm durch Verwendung eines Mikroplattenlesers gemessen. Durch
Verwendung der Messungen bei 405 nm für authentisches und gereinigtes
Hirudin wird der Titer von gereinigtem Hirudin, das gemäß den Beispielen
erhalten wird, berechnet.
Hefe, Saccharomyces cerevisiae, KCTC 8519P wurde in einem ge
mischten Kulturmedium (4% Hefeextrakt, 0,5% Casaminosäure, 1% Bern
steinsäure, 0,4% Natriumhydroxid und 4% Galactose als Kohlenstoff
quelle) bei 30°C während 52 h kultiviert. Die Kultivierung fand im Zu
führchargenkulturverfahren statt, bei dem Galactose intermittierend
zugesetzt wurde, um ihre Konzentration auf 2 bis 4% zu halten.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturbrühe zentri
fugiert, um einen überstand zu liefern, der durch eine YM3-Ultrafilter
membran mit einem Molekulargewichtsschnitt von 3000 (Amicon) gefiltert
wurde. Das so erhaltene Filtrat wird als Hirudin enthaltende Rohlösung
bezeichnet und in dem nachfolgenden Reinigungsverfahren verwendet.
IDA-Sepharose 6B Fast Flow, bei dem es sich um ein Sepharose
gel handelt, an dem Iminodiessigsäure (IDA) fixiert ist, wurde von Sigma
erworben. IDA-Sepharose 6B wurde in eine 1,5 × 30 cm chromatographische
Säule gepackt und 20 mM Kupfersulfatlösung durch die Säule geschickt.
1 ml Hirudin enthaltende Rohlösung gemäß Beispiel 1 wurde mit
einer Durchströmrate von 1 ml/min durch die IDA-Sepharose 6B Fast Flow
Säule, hergestellt gemäß Beispiel 2, geschickt, um Hirudin an den
Kupferionen zu binden, wonach die Säule mit 1 mM Phosphatpuffer (pH 6,2)
gewaschen wurde, um ungebundene Proteine, bei denen es sich nicht um
Hirudin handelt, zu entfernen. Dann wurde Hirudin unter Verwendung von
100 mM Phosphatpuffer (pH 6,2) eluiert. Fraktionen von Nr. 38 bis 54,
die Hirudin enthalten, wurden gesammelt und einer Ultrafiltration durch
eine Membran mit einem Molekulargewichtsschnitt von 3000 unterworfen.
Die Menge an Gesamtprotein und Hirudinaktivität enthaltend in dem Fil
trat war 1,75 mg bzw. 4000 ATU/mg, während sie 120,8 mg bzw. 68,6 ATU/mg
für die Hirudin enthaltende Rohlösung waren. Die Ausbeute und Reinheit
des Hirudins waren 85,6% bzw. 90% oder mehr.
Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebene Vorgehensweise wur
de ausgeführt, wobei jedoch 20 mM Nickelionenlösung (Vergleichsbeispiel
1) oder Zinkionenlösung (Vergleichsbeispiel 2) anstelle der Kupfersul
fatlösung verwendet wurde.
Es gab hierbei keine Änderung der Beträge von Gesamtprotein
und Aktivitäten von Hirudin enthalten in der Lösung vor und nach dem
Hindurchführen durch die Säule.
Ungereinigtes natürliches Hirudin wurde von Sigma unter der
Katalognummer H7016 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Bei
spiel 3 gereinigt.
Die Menge an Gesamtprotein und Hirudinaktivität vor Hindurch
führen durch die Säule betrug 0,08 mg bzw. 1720 ATU/mg, während nach
Hindurchführen durch die Säule diese 0,01179 mg bzw. 10 500 ATU/mg betru
gen. Die Ausbeute und die Reinheit von Hirudin waren 90% bzw. 97% oder
mehr.
Ungereinigtes HV1 wurde von CalBioChem unter der Katalognummer
377 855 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Beispiel 3 gerei
nigt. Das Ablösen von Hirudin von den Kupferionen wurde unter Verwendung
von 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,2) enthaltend 20 mM Imidazol durchge
führt.
Die Menge von Gesamtprotein und Hirudinaktivität vor dem Hin
durchführen durch die Säule betrug 0,93 mg bzw. 215 ATU/mg, während nach
dem Hindurchführen durch die Säule sich 0,215 mg bzw. 890 ATU/mg erga
ben. Ausbeute und Reinheit des Hirudins betrugen 96% bzw. 90% oder
mehr.
Rekombinantes Hirudin, Lys 47-HV2, wurde von Sigma unter der
Katalognummer H0393 bezogen und entsprechend der Vorgehensweise in Bei
spiel 3 gereinigt.
Der Betrag an Gesamtprotein und die Hirudinaktivität vor Hin
durchführen durch die Säule betrugen 0,01 mg bzw. 9900 ATU/mg, während
sich nach dem Hindurchführen durch die Säule 0,0095 mg bzw. 12 000 ATU/mg
ergaben. Die Ausbeute und Reinheit von Hirudin betrugen 90% bzw. 99%
oder mehr.
Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Vorgehensweisen
wurden ausgeführt, außer daß der pH-Gradient von 6 zu 4 durch Verwendung
von Natriumacetatpuffer (20 mM) enthaltend 1M NaCl verwendet wurde, um
Hirudin von der Säule zu eluieren.
Das Ablösen von Hirudin von den Kupferionen war unvollständig
und die Hirudinausbeute war etwa 60%.
Die in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Vorgehensweisen
wurden durchgeführt, außer daß Triscarboxymethylethylendiamin anstelle
von Iminodiessigsäure als Ligand verwendet wurde. Die Ausbeute und Rein
heit von Hirudin betrugen 86,3% bzw. 90% oder mehr.
Claims (7)
1. Verfahren zum Reinigen von Hirudin aus einer Hirudin und
andere Substanzen enthaltenden Lösung, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lösung einer Metallionenaffinitätschromatographie unter
worfen wird, in der das Metallion ein Kupferion (Cu⁺⁺) ist und ein Phos
phatpuffer als Eluiermittel verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Lösung einer Kupferverbindung durch eine Säule geschickt wird, die mit
einem Liganden gepackt ist, um Kupferionen (Cu⁺⁺) an dem Liganden zu
adsorbieren, eine Lösung enthaltend Hirudin und andere Substanzen auf
die Säule gegeben wird, um Hirudin an den Kupferionen zu binden, und
Hirudin von den Kupferionen abgelöst und Hirudin aus der Säule durch
Verwendung eines Phosphatpuffers als Eluiermittel eluiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß Hirudin als natürliches Hirudin, HV1, HV2 oder Lys47-HV2 eingesetzt
wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß als Kupferionen enthaltende Lösung eine Kupfersulfatlösung
verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Phosphatpuffer in einer Konzentration von weniger als
100 mM verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Phosphatpuffer mit bis zu 20 mM Imidazol verwendet
wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß als Ligand Iminodiessigsäure verwendet wird.
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