DE69620539T2

DE69620539T2 - Verfahren zur Reinigung von Thrombomodulin

Info

Publication number: DE69620539T2
Application number: DE69620539T
Authority: DE
Inventors: Aki Asada; Jun-Ichi Kajihara; Kazuo Katoh; Kozue Shibata
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-10-25
Also published as: JP3745805B2; DE69620539D1; TW408129B; EP0770626B1; ATE215968T1; EP0770626A2; EP0770626A3; JPH09110900A; CN1151406A; US5753123A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Thrombomodulin, das in menschlichem Urin enthalten ist, durch Einengen oder Konzentration. Thrombomodulin ist ein gerinnungshemmendes Mittel oder Antikoagulans und es ist davon auszugehen, dass es als prophylaktisches und therapeutisches Mittel gegen Krankheiten Anwendung findet, die mit Anomalitäten in der Fähigkeit zur Blutgerinnung verbunden sind.
Thrombomodulin (im Folgenden kurz als "TM" bezeichnet), das ein Thrombinrezeptor mit hoher Affinität ist., der auf Angioendothelzellen vorhanden ist, wurde von N.L. Esmon et al. (J. Biol. Chem., 257: 859-864, 1982) entdeckt als ein Protein, das die Aktivierung von Protein C fördern kann. TM bindet an Thrombin in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 und aktiviert dadurch Protein C in Gegenwart von Ca²&spplus;, während andererseits TM-gebundenes Thrombin seine eigenen Gerinnungsaktivitäten fast vollständig verliert, z. B. die Fibrinogen agglutinierende Aktivität und die Plättchen aktivierende Aktivität. Es ist auch bekannt, dass TM mit seiner endogenen Heparinaktivität die Thrombinunterdrückung durch Antithrombin III fördert und es wird erwartet, dass es klinische Anwendung als neue Art von Arzneimittel findet.
Menschliches TM wurde anfangs aus menschlicher Plazenta von H.H. Salem et al. (J. Biol. Chem., 259: 12246-12251, 1984) gereinigt, aber die menschliche Plazenta ist nicht als Ausgangsmaterial für eine Herstellung von TM in großem Maßstab geeignet (EMBO J. 6: 1891-1897, 1987). Obwohl die genetische Struktur von menschlichem TM von Suzuki et al. (EMBO J. 6: 1891-1897, 1987) identifiziert wurde, ist es weiterhin schwierig, TM mit den gleichen Zuckerketten, wie den natürlich vorkommenden, zu synthetisieren, da TM viele Zuckerketten enthält.
Anschließend wurde TM aus menschlichem Urin isoliert und gereinigt von Yamamoto et al. (J. Biochem. 113: 433-440, 1993) und D.E. Jackson et al. (Eur. J. Biochem. 221: 1079-1087, 1994), was zeigt, dass menschlicher Urin als Ausgangsmaterial zur Isolierung der natürlich vorkommenden Art von TM dienen kann.
Bezug nehmend auf das Verfahren zur Reinigung von TM aus Urin erzeugten Yamamoto et al. gereinigtes TM durch Verwendung von QAE Sephadex, einer Säule mit monoklonalen Anti-TM-Antikörpern, einer Affinitätssäule, bei der Thrombin als Ligand verwendet wurde und Sephadex G-200, da aber dieses Verfahren die Herstellung von monoklonalem Antikörper erfordert, ist das Verfahren kompliziert und mühsam. D.E. Jackson et al. reinigten TM durch die vereinigte Verwendung von DEAE Sepharose, eine Affinitätssäule, bei der Thrombin als Ligand angewendet wurde, und Reverse-Phase-HPLC, wobei das Verfahren Probleme lieferte, da die Reinigungsausbeute, die mit Reverse Phase HPLC erzielbar ist, sehr schlecht ist und da HPLC für eine Reinigung in großem Maßstab nicht geeignet ist. Weiterhin berichteten Aoki et al. (Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho-63-30423) und Kunihiro et. al. (Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho-63-218399), dass TM aus frischem Urin durch Ionenaustauschchromatographie, eine Affinitätssäule mit gebundenem Thrombin und Gelpermeation gereinigt wurde. Aus den Erfahrungen der Erfinder wurde jedoch abgeleitet, dass der Gehalt an TM in Urin nicht immer konstant ist, wobei gerade im Fall von geringeren TM-Gehalten ein solches Verfahren häufig nicht befriedigend arbeitet. Demzufolge ist die Entwicklung von praktisch anwendbaren und effizienten Reinigungsmitteln, die auch angewendet werden können, wenn der TM-Gehalt im Urin niedrig ist, stark gefragt.
Im Hinblick auf das oben Ausgeführte, untersuchten die Erfinder Reinigungsmittel, mit denen es möglich sein könnte, TM mit einem verbesserten Reinheitsgrad herzustellen, unabhängig von der Größenordnung des TM-Gehaltes im Urin.
Um das oben erwähnte Problem zu lösen, führten die vorliegenden Erfinder wiederholt intensive Untersuchungen durch und fanden als Ergebnis, dass Adsorptionschromatographie mit Hydroxyapatit, das als Adsorbens verwendet wird, äußerst wirksam ist zur Reinigung von Thrombomodulin, was zur vorliegenden Erfindung führte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Thrombomodulin aus menschlichem Urin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verfahren die Reinigung von Thrombomodulin aus menschlichem Urin durch Anwendung von Adsorptionschromatographie mit Hydroxyapatit als Adsorbens umfasst.
Bezug nehmend auf ein Material, das Thrombomodulin aus menschlichem Urin enthält, das das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren ist, kann z. B. roher menschlicher Urin als solcher verwendet werden, oder nachdem er durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat konzentriert wurde, wünschenswerterweise vorher gereinigter menschlicher Urin, der mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie mit gebundenem Thrombin etc. erhalten wurde, falls möglich, obwohl es keine spezifischen Beschränkungen gibt.
Unter spezieller Bezugnahme auf Hydroxyapatit, kann jedes der im Handel erhältlichen Produkte verwendet werden (z. B. solche, die von Seikagaku Kogyo K.K., Japan und Wako Pure Chemicals Co., Japan, hergestellt werden).
In den Fällen, in denen das Ausgangsmaterial in geringen Mengen verfügbar ist, ist es möglich, eine HPhC-Säule zur Fraktionierung oder analytischen Verwendung anzuwenden, z. B. TSK- Gel HA-1000 (hergestellt von Tosoh Inc., Japan) und KBC- Säulen (hergestellt von Kohken Co. Ltd., Japan).
Eine Säule wird mit Hydroxyapatit gepackt und dann mit 1 bis 30 mM, bevorzugt 5 bis 10 mM Phosphatpuffer, der auf pH 5 bis 8, bevorzugt pH 6 bis 7, eingestellt ist, equilibriert, wobei es wirksam ist, Salze, wie Calciumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid der verwendeten Equilibrierungslösung zuzugeben, wobei Calciumchlorid besonders bevorzugt in einer Menge von weniger als 1 mM angewendet wird.
Dann wird ein Ausgangsmaterial auf die so mit Puffer ausgetauschte Säule aufgebracht und anschließend sorgfältig mit dem gleichen Puffer gewaschen. Nachdem das Effluens eine vollständig verringerte Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm zeigt, wird die Elution mit Phosphorsäure mit einem linearen Konzentrationsgradienten durchgeführt, wobei ein Konzentrationsgradient im Bereich von 5 bis 300 mM für die Reinigung von TM geeignet ist. Bei der Elutionsstufe wird TM an erster Stelle eluiert (die Phosphorsäurekonzentration liegt im Bereich von 50 bis 100 mM), wobei Verunreinigungen anschließend eluiert werden. In den Fällen, in denen eine offene Säule verwendet wird, kann eine solche offene Säule wünschenswerterweise in langer und schmaler Form vorliegen, um eine verbesserte Trennung zu erreichen. Wenn Verunreinigungen nach Abschluss dieser Stufe immer noch nachgewiesen werden, kann die letzte und endgültige Reinigung mit Hilfe einer Gelpermeation etc. durchgeführt werden. Das Verfahren der Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Hydroxyapatit gemäß der vorliegenden Erfindung bietet das charakteristische Merkmal, dass sogar dann, wenn ein Ausgangsmaterial mit geringerer spezifischer Aktivität für ein solches chromatographisches Verfahren angewendet wird, das gereinigte Produkt immer mit demselben Reinheitsgrad hergestellt werden kann, wie in dem Fall, in dem eines mit hoher spezifischer Aktivität verwendet wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit anderen chromatographischen Verfahren verwendet werden, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie mit gebundenem Thrombin und Gelfiltrationschromatographie, um Thrombomodulin aus menschlichem Urin zu reinigen.
Bei jeder Reinigungsstufe kann die spezifische Aktivität von TM mit dem folgenden Verfahren untersucht werden: 30 ul Puffer A (20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,1 M Natriumchlorid und 3,5 mM Calciumchlorid enthält), 10 ul Lösung von menschlichem Protein C (eine Lösung, die mit Puffer B (einer Lösung von 0, 1% BSA in Puffer A) auf eine Konzentration von 100 ug/ml hergestellt wird), jeweils 10 ul Probe und Standardprobe werden vermischt und 50 ul einer Humanthrombinlösung (eine Lösung, die mit Puffer B auf eine Konzentration von 4 U/ml hergestellt wird) werden zu der Mischungslösung zugegeben und anschließend für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann werden 150 ul Human-Antithrombin-III-Lösung (eine Lösung, die mit Puffer C (einer Lösung, die mit 50 mM Tris-HCl- Lösung (pH 7,5), die 0,1 M Natiumchlorid und 1 mM Calciumchlorid enthält, hergestellt wird) auf eine Konzentration von 50 ug/ml hergestellt wird) und 50 ul Heparinlösung (eine Lösung, die mit Puffer C auf eine Konzentration von 2 U/ml hergestellt wird) zu der Reaktionslösung zugegeben und anschließend 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 600 ml einer Substratlösung (eine Lösung von 25 mg Test Zyme S-2366 (hergestellt von Daiichi Kagaku Inc., Japan) in 23,19 ml Puffer C) werden zu der Lösung zugegeben und anschließend 20 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und dann wird die Reaktion gestoppt, indem 100 ul einer 50%igen Essigsäurelösung zugegeben werden. Die Absorption der Reaktionslösung bei einer Wellenlänge von 405 nm wird gemessen, um den TM-Gehalt in der Probe zu berechnen auf Basis der Absorptionsmessungen, die mit Standardproben erhalten wurden (Lösungen von TM aus Kaninchenlungen, verdünnt mit Puffer B auf Konzentrationen von 2, 5, 10, 20 bzw. 40 mU/ml werden als Standardproben verwendet).
Wie sich aus dem Obigen ergibt, lässt die vorliegende Erfindung durch Verwendung eines leicht durchzuführenden Verfahrens der Adsorptionschromatographie nicht nur zu, dass Thrombomodulin aus menschlichem Urin mit erhöhter Reinigungsrate konzentriert und gereinigt wird, sondern dass sogar ein Ausgangsmaterial mit geringerer spezifischer Aktivität an Thrombomodulin mit höherer Reinigungsrate gereinigt wird, als solches mit höherer spezifischer Aktivität.
Unten werden Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben, aber die Erfindung soll nicht auf die unten beschriebenen Beispiele beschränkt werden, wobei in den beigefügten Zeichnungen
Fig. 1 ein Elutionsmuster von Thrombomodulin, das in Beispiel 1 erhalten wurde, ist, wenn ein Ausgangsmaterial (Charge Nr. 1), das Thrombomodulin aus menschlichem Urin enthält, adsorbiert an eine Hydroxyapatitsäule, mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Natriumphosphat eluiert wird;
Fig. 2 ein Elutionsmuster von Thrombomodulin, das in Beispiel 2 erhalten wurde, ist, wenn das gleiche Verfahren mit einem Ausgangsmaterial durchgeführt wird (Charge Nr. 2);
Fig. 3 eine Fotografie ist, die die Ergebnisse von SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen mit dem gereinigten Thrombomodulin aus menschlichem Urin zeigt, das in Beispiel 1 erhalten wurde.

Beispiel 1

Unten ausgeführt sind die Reinigungsergebnisse, die mit zwei verschiedenen Chargen von jeweils 2000 l menschlichem Urin erhalten wurden. Bei einem Volumen von 2000 l frischem menschlichem Urin wurde der pH auf 5,5 eingestellt und eine 0,5% Chitosanlösung (G/V), die als Adsorbens diente, zugemischt und anschließend gerührt. Der pH der Lösungsmischung wurde 30 Minuten lang auf 5,5 gehalten, dann wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und in einer 5%igen Ammoniumsulfatlösung (pH 10,5) suspendiert und anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem die Suspension filtriert worden war und anschließend gewaschen worden war, um die adsorbierte Komponente zu eluieren, wurde eine Fraktionierung mit 60% Ammoniumsulfat bewirkt und der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen. Der abgetrennte Niederschlag wurde in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst und die Lösung wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert und anschließend auf eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650M (Harzmenge 1,2 l, gemessen von 115 bis 11 cm) (hergestellt von Tosoh Inc., Japan), die vorher mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Elution wurde mit dem gleichen Puffer, der 0,3 M Natriumchlorid enthielt, durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden zusammengefasst und dreifach mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) verdünnt und die Lösung wurde mit Calciumchlorid auf eine Endkonzentration von 5 mM vermischt. Die Mischung wurde auf eine DIP-Sepharosesäule mit gebundenem Thrombin (Harzmenge 40 ml, gemessen 2,5 bis 8 cm) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,1 M Natriumchlorid und 5 mM Calciumchlorid enthielt, equilibriert worden war und danach wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, die Elution wurde mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 2 M Natriumchlorid und 10 mM EDTA enthielt, durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden gegen 5 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8), der 0,4 mM Calciumchlorid und 0,9% Natriumchlorid enthielt, dialysiert und auf eine Hydroxyapatitsäule aufgetragen (Adsorbensmenge 20 ml; gemessen 1,0 bis 25 cm) (hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K., Japan), die vorher mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Elution wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Natriumphosphat von 5 bis 300 mM durchgeführt, wobei die TM-Aktivität zuerst als scharfer Peak eluierte, wie in Fig. 1 (Charge Nr. 1) und Fig. 2 (Charge Nr. 2) dargestellt, wobei die Verunreinigungen anschließend eluiert wurden. Die aktive Fraktion wurde eingeengt und das Konzentrat wurde auf eine Säule Sephacryl S-300 (Harzmenge 80 ml; gemessen 1,5 cm bis 90 cm) (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) aufgetragen, die vorher mit 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,9% Natriumchlorid enthielt, equilibriert worden war und anschließend wurde mit dem gleichen Puffer eluiert. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse aufgeführt, nachdem die Reinigung zweimal durchgeführt worden war, was zeigt, dass sogar die Reinigung eines Ausgangsmaterials mit geringer spezifischer Aktivität vor der Hydroxyapatitchromatographie ein gereinigtes Produkt mit ausreichend hohem Grad an spezifischer Aktivität liefern. konnte. Fig. 3 erläutert die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des fertig gereinigten Produktes unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen und die Figur zeigt zwei benachbarte Banden (in der Nähe von 70.000 Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen), die für TM charakteristisch sind, die in beiden Chargen des Ausgangsmaterials beobachtet wurden. Tabelle 1

Beispiel 2

Um zu bestätigen, dass die gereinigten Produkte jeweils aus TM bestanden, wurde weiterhin eine Untersuchung durchgeführt, um die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen. Die Aminosäurezusammensetzung wurde analysiert unter Verwendung einer Aminosäureanalysevorrichtung (hergestellt von Beckmann Co., USA) mit einem Hydrolysat mit 6 n Salzsäure, während die N-terminale Aminosäuresequenz mit einem Proteinsequenzautomaten 473A (hergestellt von Applied Bio-System Co., USA) analysiert wurde. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse sind in Tabelle 2 aufgeführt, wobei die identifizierte N-terminale Aminosäuresequenz unten gezeigt ist:

N-terminale Aminosäuresequenz:

Ala-Pro-Ala-Glu-Pro-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Gln- Tabelle 2
Anmerkung: n. b. steht für "nicht bestimmt".
Die Werte unter Ref. bezeichnen solche, die aus der Aminosäuresequenz des Teils von Ala 1 bis Asp 468 von TM berechnet wurden.
Asx bedeutet (Asp + Asn), während Glx (Glu + Gln) bedeutet.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Thrombomodulin aus menschlichem Urin, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren eine Adsorptionschromatographie mit Hydroxyapatit als Adsorbens umfasst.

2. Verfahren zur Reinigung von Thrombomodulin, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst, dass ein Ausgangsmaterial, das Thrombomodulin aus menschlichem Urin enthält, auf eine Säule gegossen wird, die mit Hydroxyapatit gepackt ist, um Thrombomodulin zu adsorbieren und anschließend von dem Hydroxyapatit desorbiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Ausgangsmaterial, das Thrombomodulin enthält, roher menschlicher Urin, das durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat erhaltene Konzentrat oder vorher gereinigtes Material ist, das durch Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie mit gebundenem Thrombin erhalten wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Adsorption bei pH 5 bis 8 durchgeführt wird, während die Desorption mit einem Konzentrationsgradienten von Phosphorsäure durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Reinigung alleine oder in Kombination mit Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie mit gebundenem Thrombin und/oder Gelpermeationschromatographie durchgeführt wird.