DE3586402T3

DE3586402T3 - Proteinzusammensetzung mit Koagulations-wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE3586402T3
Application number: DE3586402T
Authority: DE
Inventors: George Kuo; Frank R. Masiarz; Martha Truett; Pablo Valenzuela; Mirella Ezban Rasmussen; Jennifer Favaloro
Original assignee: Novo Nordisk AS; Chiron Corp
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1985-01-11
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2005-01-12
Also published as: JPH04218399A; EP0150735B2; DK165506C; EP0466199B1; EP1006182A2; ATE78871T1; DE122004000028I1; DE3588242T2; ATE224445T1; NL300153I1; EP0150735A2; EP1006182A3; DK38892A; JPS60185723A; LU91087I2; NL300119I1; NL300118I2; JP2000023670A; NL300120I1; DK13585A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Proteinzusammensetzung, die einen calciumverbrückten Komplex aus zwei Polypeptidfragmenten enthält, der eine dem Human-Faktor VIIIC ähnliche Koagulationswirkung aufweist, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Faktor VIIIC ist ein Plasmaprotein, das am eigentlichen Stoffwechselweg der Blutgerinnung teilnimmt. Bei Individuen mit vererbter, an das X-Chromosom gebundener rezessiver Bluterkrankheit vom Typ der Hämophilie A fehlt dieses Protein oder weist Defekte auf. Die Isolierung von Faktor VIIIC war mit großen Schwierigkeiten verbunden, da dieses Molekül nur in extrem niedriger Konzentration im Plasma vorliegt, sowie aufgrund des Umstands, daß es ein Zwischenprodukt oder ein Endprodukt des Abbaus eines größeren Protein-Vorläufermoleküls darzustellen scheint. Daher führten Versuche zur Isolierung von Faktor VIIIC zu komplexen Gemischen von signifikanter Heterogenität und mit variierenden Molekülmassen.
Eine der Möglichkeiten, die bei der Herstellung physiologisch wirksamer Proteine breite Anwendung gefunden hat, besteht in der Isolierung des interessierenden Proteins in gereinigter Form. Das interessierende Protein stellt dabei ein wertvolles Hilfsmittel bei der Entwicklung geeigneter Rekombinant-DNA-Systeme zur Herstellung des Proteins dar. Wenn man über das interessierende Protein verfügt, können monoklonale Antikörper hergestellt werden, die für das Protein spezifisch sind und zur Produktion des Proteins in Lysaten verwendet werden können, und zwar durch Expression von mRNA in Oocyten, oder aus einem cDNA-Gen in einzelligen Mikroorganismen. Darüber hinaus können durch Ermittlung der Aminosäuresequenz durch Sequenzierung Sonden hergestellt werden, wobei Codons, welche die betreffende Aminosäuresequenz codieren, zur Hybridisierung mit mRNA, chromosomaler DNA oder cDNA angewandt werden und entsprechend zur Ermittlung, Isolierung und Expression des relevanten Gens oder der betreffenden Information und zur Produktion des angestrebten Produkts in hohen Ausbeuten in einem oder mehreren Wirtsorganismen geeignet sind.
US-A-4 361 509 und die darin genannten Druckschriften beschreiben die Reinigung von Faktor VIIIC (vgl. auch Fulcher und Zimmerman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 1648–1652). Tuddenham et al., J. of Lab. Clinical Medicine (1979) 93, 40–53, beschreiben die Reinigung von Faktor VIIIC unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern. Austen, British J. Hematology (1979) 43, 669–674, beschreibt die Verwendung von Aminohexyl-Sepharose für die Reinigung von Faktor VIIIC. Weinstein et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78, 5137–5141, beschreiben ferner Untersuchungen zur Wirkung von Thrombin auf Faktor VIIIC, vgl. auch Kuo et al., Abstracts for IX International Congress of Thrombosis and Hemostasis, (Copenhagen; July 1983).
Es war ferner von C. A. Fulcher, J. R. Roberts and T. S. Zimmerman, Blood (1983) 61, No. 4, 807–811, bekannt, daß zwei Polypeptidfragmente von 79/80 kd und 92 kd aus den Thrombinabbauprodukten von Human-Faktor VIIIC durch SDS-Gelelektrophorese isoliert werden können.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer Proteinzusammensetzung anzugeben, die eine dem Human-Faktor VIIIC ähnliche Koagulationswirkung aufweist, sow ein Verfahen zu ihrer Herstellung anzugeben.
Diese Aufgabe wird gemäß dem Anspruch gelöst.
Die der Erfindung zugrundeliegende Proteinzusammensetzung ist eine isolierte Proteinzusammensetzung, die einen Komplex aus einem 77/80 kd-Dublett-Polypeptidfragment, das mit einem 92,5 kd-Polypeptidfragment calciumverbrückt ist, und Vorläuferspecies enthält, wobei der Komplex eine dem Human-Faktor VIIIC ähnliche Koagulationswirkung aufweist, der Komplex und die Vorläuferspecies eine Reinheit von mindestens 90%, bezogen auf Gesamtprotein, aufweisen und der Komplex eine Reinheit von mindestens 30%, bezogen auf Gesamtprotein, besitzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieser Proteinzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt folgende Schritte:

(A) Immunsorptionschromatographie von Human-Faktor VIIIC unter Verwendung einer Sepharosesäule mit polyklonalen anti-VIIIR-Antikörpern,
(B) säulenchromatographische Trennung des resultierenden Materials an aminohexylsubstituierter Agarose und
(C) weitere chromatographische Reinigung.

Die Fragmente und Untereinheiten von Human-Faktor VIIIC werden in im wesentlichen reiner Form erhalten.
Die Polypeptidfragmente der oben definierten Proteinzusammensetzung können für zahlreiche Anwendungszwecke herangezogen werden, beispielsweise zur Herstellung von Human-Faktor VIIIC sowie Varläufern und Untereinheiten davon durch Expression in einem Mikroorganismus oder in kultivierten Säugergewebezellen. Im Rahmen der Erfindung wurden gereinigter Faktor VIIIC sowie Untereinheiten und Fragmente davon isoliert und ihre physiologischen Beziehungen zueinander ermittelt, insbesondere unter Anwendung des Thrombinabbaus. Zumindest ein Teil jeder der zugeordneten Reihen von Polypeptiden kann sequenziert werden, und die Seguenzen können zur Entwicklung komplexer Sonden herangezogen werden. Darüber hinaus können genomische DNA-Fragmente auf homologe Sequenzen hin getestet werden, und hybridisierende Fragmente können isoliert und darüber hinaus manipuliert werden, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das eine vollständige Untereinheit oder ein Fragment codiert, und/oder zur Isolierung reifer mRNA Verwendung finden, aus der ds cDNA erhalten werden kann. Die DNA-Seguenz kann dann ferner zur Insertion in einen Expressionsvektor manipuliert werden, worauf der Expressionsvektor zur Einführung in einen verträglichen Wirtsorganismus zur Expression des Polypeptids verwendet werden kann.
Darüber hinaus können die Zusammensetzungen zur Expression von Untereinheiten und Fragmenten von Faktor VIIIC zur Herstellung von Faktor VIIIC als Vorläufermolekül oder in seiner aktiven Form oder zur Erzeugung individueller Untereinheiten zur Verwendung in Kombination mit natürlich erhältlichen Untereinheiten Verwendung finden. Die Untereinheiten und Fragmente weisen eine oder mehrere biologische Eigenschaften auf, die mit Faktor VIIIC in Zusammenhang stehen, beispielsweise Epitopstellen, Koagulations wirkung und Immunogenität, so daß sie zur Herstellung von Antikörpern herangezogen werden können, die ihrerseits als Reagentien verwendbar sind, insbesondere als markierte Reagentien in Immunoassays.
Human-Faktor VIIIC stellt ein komplexes Protein dar, das in im wesentlichen reiner Form isoliert werden kann und eine apparente Molekülmasse von etwa 460 kd aufweist. Nach Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen resultiert eine große Anzahl von Fragmenten mit unterschiedlichen Molekülmassen: 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 und 77 kd, wobei festgestellt wurde, daß die beiden letztgenannten als Dublett wandern. Die Analyse der Fragmente durch chemische Spaltung sowie Spaltung mit Proteasen einschließlich Thrombin, die Verwendung von Antikörpern zur Verfolgung der immunogenen Beziehungen und der Spaltungsmuster zur Verfolgung der strukturellen Beziehungen zeigt, daß das 92,5 kd-Polypeptid mit den Polypeptiden mit 240, 160, 140 und 115 kd in Beziehung steht, während das 77/80 kd-Dublett keine identifizierbaren Eigenschaften aufweist, die es mit den übrigen Peptiden gemeinsam hat, mit Ausnahme des 240 kd-Polypeptids. Es wird ferner festgestellt, daß das 77/80 kd-Dublett durch Thrombin in ein 67/70 kd-Dublett umgewandelt wird, während das 92,5 kd-Polypeptid, das in mit Thrombin behandeltem gereinigtem Faktor VIIIC-Material vorliegt, durch Thrombin, direkt oder indirekt, in zwei Polypeptide von etwa 40 und etwa 52,5 kd aufgespalten wird. Darüber hinaus wird festgestellt, daß die elektrophoretisch isolierten Polypeptide des 77/80 kd-Dubletts blockierte N-Termini aufweisen, während die Polypeptide des 67/70 kd-Dubletts an ihren N-Termini nicht blockiert sind.
Ferner wird festgestellt, daß der Genlocus für Faktor VIIIC Exons mit großen Introns aufweist, wobei die Exons verschiedene Faktor VIIIC zugeordnete Domänen enthalten. So können individuelle Exons isoliert werden, die mit bestimmten Polypeptiden oder Fragmenten davon korreliert sind, die wiederum mit dem Faktor VIIIC-Komplex in Beziehung stehen. Durch Identifizierung der speziellen Aminosäureseguenzen für Untereinheiten und Fragmente von Faktor VIIIC können die Exons aus genomischer DNA selektiv isoliert werden, die dann als solche, in Kombination oder in Verbindung mit synthetischer DNA verwendet werden können, um Sequenzen zu erzeugen, welche Polypeptiduntereinheiten von Faktor VIIIC oder Fragmente davon codieren und die zu deren Herstellung verwendet werden können.
Die genomischen DNA-Seguenzen von Faktor VIIIC, die sowohl Exons als auch Introns enthalten, können günstigerweise in einen Expressionsvektor eingefügt werden, der für die Transkription und Translation in Säugerzellen geeignet ist, um sowohl wesentliche Mengen geeignet aufgespaltener mRNA, die sich sowohl zur cDNA-Klonierung, als auch zur Herstellung von Faktor VIIIC oder dessen Untereinheiten oder Fragmenten eignet. Darüber hinaus können die aus dem Genom isolierten DNA-Sequenzen zur Hybridisierung mit natürlicher mRNA herangezogen werden, die Faktor VIIIC codiert. Die mRNA kann dann zur Herstellung der ds cDNA Verwendung finden, welche die Untereinheiten von Faktor VIIIC codiert. Die DNA-Sequenzen können zur Expression durch Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor mit den erforderlichen Regulationssignalen zur Transkription und Translation verwendet werden. Der Expressionsvektor des Faktor VIIIC-Gens (Expressionsvektor, der ein oder mehrere Gene aufweist, die den gesamten Faktor VIIIC oder einen Teil davon, Vorläufer, Untereinheiten oder Fragmente davon codieren) kann in einen verträglichen Wirtsorganismus eingefügt werden, der dann zur Expression des Faktors VIIIC kultiviert werden kann. Durch geeignete Wahl der Wirtsorganismen kann die DNA für Faktor VIIIC stromab der sekretorischen Leader- und Processing-Signale eingefügt werden, so daß das Produkt vom Wirtsorganismus ausgeschieden und weiterverarbeitet wird, um so das vollständige Polypeptid zu erhalten. Gewünschtenfalls kann das Polypeptid dann zur Einführung von Funktionalitäten oder Substituenten, die beim natürlich vorkommenden Polypeptid vorliegen, weiterverarbeitet werden.
Die Teilanmeldung EP 91113267.8 bezieht sich auf ein Verfahren zur Synthese von Polypeptidfragmenten von Human-Faktor VIIIC, insbesondere eines Fragments mit einer Molekülmasse von 77/80 kd, DNA-Sequenzen, die Teile dieses Polypeptidfragments codieren, extrachromosomale Elemente, welche diese DNA-Fragmente enthalten, eine komplexe Sonde zum Screening von DNA-Sequenzen, entsprechende DNA-Konstrukte sowie monoklonale Antikörper, die mit einem Immunogen erhalten wurden, das die genannten Polypeptidfragmente umfaßt.
In der ersten Stufe des Verfahrens, das bei der vorliegenden Erfindung Anwendung findet, wird hochgereinigter Faktor VIIIC erhalten und charakterisiert. Gereinigter Faktor VIIIC kann aus im Handel erhältlichem menschlichem antihämophilem Faktor (AHF) hergestellt werden, der aus frischem, normalem menschlichem Plasma als Kryopräzipitat hergestellt wird und eine etwa 40-fache Anreicherung aufweist. Der Faktor VIIIC wird dann weiter aufkonzentriert und gereinigt, indem der antihämophile Faktor in einem geeigneten Puffer, z. B. kochsalzhaltigem Imidazol – Lysin-HCl – Puffer mit pH 7,4, gelöst und anschließend an einer Affinitätssäule chroma tographiert wird, die entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen Faktor VIIIC oder den daran gebundenen Faktor VIIIR aufweist. Die Antikörper werden günstigerweise kovalent an einen Sepharoseträger gebunden. Der Faktor VIIIC kann unter Anwendung einer Kombination einer relativ hohen Konzentration an Calciumionen mit Glycerin von der Säule eluiert werden. Die von der Säule erhaltenen Fraktionen können dann mit einem geeigneten Puffer, wie oben erläutert, dialysiert werden, der eine niedere Konzentration an Calciumionen aufweist, und werden dann durch Verwendung einer Aminohexylsapharosesäule unter Elution mit einem Puffer mit hoher Konzentration an Calciumchlorid oder Natriumchlorid weiter gereinigt. Durch zusätzliche chromatographische Schritte läßt sich eine weitere Reinigung erreichen, beispielsweise durch Chromatographie an Sepharosegel, HPLC, Ionenaustauschchromatographie an Dextransulfat oder Mono-Q oder Chromatographie an Affinitätssäulen unter Verwendung von Lektinen oder Antikörpern gegen Faktor VIIIC. Insbesondere durch Verwendung von Dextransulfat lassen sich Spurenverunreinigungen, beispielsweise Fibrinogen, Fibronectin und IgG, aus der Präparation abtrennen, so daß ein Produkt erhalten wird, das im wesentlichen frei von Fremdproteinen ist. Die Aktivität der aus den Säulen erhaltenen Fraktionen kann hinsichtlich der biologischen Wirksamkeit und/oder hinsichtlich der antigenen Wirksamkeit unter Anwendung eines Koagulationstests (im Handel erhältliche Testkits) und Verwendung für Faktor VIIIC spezifischer Antikörper überwacht werden. Bezogen auf die Konzentration von Faktor VIII im Plasma können nach dem oben beschriebenen Verfahren etwa dem Faktor 200.000 entsprechende Reinheitsgrade bzw. Anreicherungsgrade erzielt werden.
Charakterisierung des Faktors VIIIC
Die Gelfiltration zeigt, daß sich Faktor VIIIC als ein Komplex mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 460 kd verhält. Durch Anwendung der SDS-Gelelektrophorese (denaturierende Bedingungen) können sieben individuelle Polypeptide unterschiedlicher Molekülmasse isoliert werden. Diese Fragmente besitzen Molekülmassen von 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 bzw. 77 kd. Diese Fragmente wurden in der nachstehend erläuterten Weise charakterisiert.
Bei der ersten Untersuchung, die angewandt wurde, fanden Inhibitor-Antikörper Verwendung, die von hämophilen Patienten isoliert worden waren; diese Antikörper sind als Z bzw. E bezeichnet. Beide Antikörper reagierten mit dem 77/80 kd-Dublett. Der E-Antikörper reagierte stark mit dem 240 kd-Polypeptid und schwach mit verschiedenen Banden zwischen dem Dublett und dem 240 kd-Polypetid. Der Z-Antikörper reagierte ferner schwach mit dem 240 kd-Polypeptid.
In Immunpräzipitationsversuchen ergab sich, daß der E-Antikörper das 77/30 kd-Dublett sowie die hochmolekularen Species mit 160, 140, 115 und 92,5 kd fällt, wobei das Dublett zu den stärkeren Banden gehört. Die Mitverwendung von EGTA führt zum Verschwinden der Banden außer dem Dublett, woraus hervorgeht, daß die Species mit 92,5 kd mit den Species mit 77 und/oder 80 kd in einem Komplex verbunden ist, der durch eine Ca⁺⁺-Brücke vermittelt wird.
Bei der nächsten Untersuchung worden monoklonale Antikörper hergestellt, die sowohl die durch Faktor VIIIC vermittelte Koagulationsaktivität inhibieren als auch mit Komponenten des Komplexes reagieren: Antikörper der Klasse I, die mit dem 77/80 kd-Dublett und dem 240 kd-Polypeptid reagieren, sowie Antikörper der Klasse II, die mit den Polypeptiden mit 160, 140, 115 und 92,5 kd reagieren. Die Immunpräzipitation von mit Thrombin abgebautem Faktor VIIIC mit Antikörpern der Klasse I zeigt, daß sich das resultierende 70/67 kd-Dublett vom 77/80-kd Dublett ableitet, das im Faktor VIIIC vorliegt. Die Ergebnisse mit den monoklonalen Antikörpern der Klasse II zeigten, daß die Polypeptide mit 160, 140 und 115 kd Vorläufer des 52,5 kd-Polypeptids sind. Ein Peptidspaltungsprodukt des 92,5 kd-Polypeptids mit 40 kd wurde ebenfalls von den Antikörpern der Klasse II gebunden. Durch ELISA-Assay unter Verwendung monoklonaler Antikörper in Gegenwart sowie in Abwesenheit von EGTA wurde die Ca⁺⁺-Brückenassoziation zwischen den Komponenten 92,5 kd und 77 kd und/oder 80 kd des Faktor VIIIC-Kompleses bestätigt.
Sowohl die Human-Inhibitorantikörper als auch die monoklonalen Antikörper können bei den Verfahren zur Gewinnung von Faktor VIIIC durch Immunsorptions-Säulenchromatographie oder unter Verwendung von EGTA herangezogen werden, um die darin enthaltenen Komponenten, nämlich die Species mit 92,5 kd und 77/80 kd, aufzulösen.
Die nächste Untersuchung betraf den Thrombinabbau von gereinigtem Faktor VIIIC-Material bei pH 6,8 oder 7,4. Aliguote Mengen wurden auf ihre Koagulationsaktivität getestet und zur Gelanalyse mit TCA gefällt. Es ergab sich, daß die Koagulationsaktivität in Übereinstimmung mit einem Anstieg und einem Abfall in der Menge der 92,5 kd-Species ansteigt bzw. abfällt. Die Thrombinbehandlung des gereinigten Faktor VIIIC-Materials während kurzer Reaktionszeiten (5–15 min) erhöht die Menge an 92,5 kd-Species, während das 77/80 kd-Dublett teilweise in ein 67/70 kd-Dublett umgewandelt wird. Bei Anwendung langer Throm binabbauzeiten, beispielsweise von 1 h, wird das 92,5 kd-Protein abgebaut, und zwei neue Proteine mit 40 und 52,5 kd erscheinen, wobei das 40 kd-Polypeptid noch die immunogenen Eigenschaften der 92,5 kd-Species aufweist. Das 52,5 kd-Polypeptid erwies sich als Spaltungsprodukt im Schema des chemischen und enzymatischen Abbaus und als Analogon zur 92,5 kd-Species.
In der nächsten Untersuchung wurden individuelle Untereinheiten und Vorläufer von Faktor VIIIC (z. B. die Species mit 240, 17/80 und 92,5 kd) durch präparative SDS-Gelelektrophorese isoliert, worauf ein zeitabhängiger Thrombinabbau der isolierten Polypeptide vorgenommen wurde. Das von einem präparativen Gel isolierte 240 kd-Fragment ergab 160, 140, 115 und 92,5 kd zugeordnete Banden. Die Fragmente mit 80 kd und 77 kd ergaben ein Fragment mit 70 bzw. 67 kd.
Es wird ein Faktor VIIIC-Komplex abgeleitet, der die Species mit 77 und/oder 80 kd und das Polypeptid mit 92,5 kd als calciumverbrückten Komplex in hochgereinigter Form enthält. Die Reinheit des Faktor VIIIC-Materials (Komplex und Vorläuferspecies) ist üblicherweise höher als 80% und in vielen Fällen größer als 90% und kann 98% oder höhere Werte erreichen, jeweils bezogen auf den gesamten Proteingehalt; die Reinheit des Komplexes beträgt mindestens 20% und noch üblicher 30%, jeweils bezogen auf den gesamten Proteingehalt, nach Säulen-Immunsorptionschromatographie mit anti-Faktor-VIIIR-Antikörpern und Säulenchromatographie an Aminohexylsepharose. Die Anwendung zusätzlicher chromatographischer Schritte, z. B. unter Verwendung von Dextransulfat, erhöht das Reinheitsniveau auf mindestens 90% und üblicherweise noch höhere Werte, bezogen auf das Faktor VIIIC-Material (Komplex Vorläufer). Die Reinheit der Faktor VIIIC-Komponenten, d. h. der 92,5 kd-Species und des 77/80 kd-Dubletts, die durch präparative SDS-Gelelektrophorese isoliert wurden, beträgt üblicherweise mindestens 98%. Wie oben angegeben, kann der Komplex unter Verwendung monoklonaler Antikörper erhalten werden, die für eine Komponente des Dubletts oder für das 92,5 kd-Polypeptid spezifisch sind. Der Komplex kann dann unter Verwendung einer denaturierenden oder chaotropen Lösung vom Antikörper abgetrennt werden, beispielsweise unter Verwendung von wäßriger Harnstoff- bzw. Thiocyanatlösung.
Sequenzen dieser Peptide sind im nachstehenden experimentellen Teil im einzelnen beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die gereinigte Zusammensetzung von Untereinheiten/Fragmenten von Faktor VIIIC zur Erhöhung der Blutgerinnungsfähigkeit bei Personen verwendet werden, welche diese speziellen Untereinheiten benötigen. Die Zusammensetzung kann auch in der Therapie verwendet werden. Darüber hinaus kann die gemäß der Erfindung hergestellte Zusammensetzung zur Erzeugung monnklonaler Antikörper gegen Faktor VIIIC sowie seine Untereinheiten und Fragmente herangezogen werden. Die Untereinheiten und Fragmente können ferner auch als Reagentien Verwendung finden, die markiert und, in Kombination mit den Antikörpern, in diagnostischen Tests auf das Vorliegen von einem oder mehreren Untereinheiten oder Abbaufragmenten davon in physiologischen Flüssigkeiten, beispielsweise Blut oder Serum, verwendet werden können.
Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind nicht einschränkend.
Die Abkürzung Ab bedeutet Antikörper, die Abkürzung Ag Antigen.
Experimenteller Teil
I. Reinigung von Faktor VIIIC
Human-Faktor VIIIC wurde aus handelsüblichen Kryopräzipitat-Präparationen isoliert, und zwar durch a) Immunsorptionschromatographie unter Verwendung einer Sepharosesäule mit polyklonalen anti-VIIIR-Antikörpern nach einem Verfahren, das zuerst von Tuddenham et al., loc. cit., beschrieben wurde, sowie b) chromatographische Trennung an aminohexylsubstituierter Agarose, wie ursprünglich von Austen, loc. cit., beschrieben wurde.
Im folgenden sind Details der Verfahren erläutert.
Von der Firma Atlantic Antibody (Katalog Nr. 040-01) bezogenes Ziegenserum mit Antikörpern geben Human-Faktor VIII-Related Antigen (VIII:R) wurde entweder mit einem Standardschnitt mit 0 bis 50% Ammoniumsulfat und anschließende Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose oder einem ähnlichen 0 bis 33%-Schnitt ohne nachgeschaltete Chromatographie behandelt. Diese Materialien wurden dann an CNBr-aktivierte Sepharose CL2B bzw. 4B gebunden (Pharmacia, 17-0140-01 oder 17-0430-01) und zu einer Säule gegossen (anti-VIII:R-Sepharosesäule).
"HEMOFIL", eine stabile, getrocknete Präparation von Antihämophilem Faktor (Faktor VIII, AHF, AHG) in konzentrierter Form, die aus frischem, normalem menschlichem Plasma gewonnen war und bezüglich Faktor VIIIC etwa 40-fach angereichert war, wurde in folgendem Puffer gelöst: 0,02 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, 0,02% NaN₃, pH 7,4.
Nach dem Auflösen wurde das Produkt HEMOFIL auf die oben erläuterte anti-VIIIR-Sepharosesäule aufgegeben. Nichtspezifisch gebundenes Protein wurde mit dem obigen Puffer, der auf 0,5 M NaCl modifiziert war, eluiert. Danach wurde Faktor VIIIC mit dem obigen Puffer eluiert, der 0,35 M CaCl₂ enthielt und mit 10% Glycerin versetzt war, das die Faktor VIIIC-Aktivität stabilisiert. Aktive Fraktionen von der Immunsorptionssäule wurden gepoolt und gegen Puffer dialysiert (0,02 M Imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M Lysin-HCl, 0,025 M CaCl₂, 0,02% NaN₃, 10% Glycerin, pH 7,4). Ein Aliguot der dialysierten Fraktionen, das 1100 Einheiten Faktor VIIIC enthielt, wurde auf eine Aminohexylsepharosesäule auf der Basis von Sepharose 4B (1 × 6 cm) aufgegeben, die mit dem oben beschriebenen Dialysepuffer äquilibriert war. Die Faktor-VIIIC-Aktivität wurde mit dem gleichen Puffer eluiert, der entweder 0,35 M CaCl₂ oder 2 M NaCl enthielt. Es wurde festgestellt, daß sich die Aktivität in einem Volumen von 2 ml befand und 500 Einheiten Faktor VIIIC pro ml betrug. Die anschließenden Versuche, die in gleicher Weise durchgeführt wurden, ergaben eine Rückgewinnungsrate von 25% von der anti-VIII:R-Säule und eine Rückgewinnungsrate von etwa 90% von der Aminohexylsepharosesäule. Alternativ zu der obigen Verfahrensweise wurde gepooltes, dialysiertes Material, das von der Immunsorptionssäule eluiert worden war, zunächst auf eine Säule mit Dextransulfat (Pharmacia) (1,5 ×6 cm) aufgegeben, die mit dem obigen Dialysepuffer äguilibriert worden war, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Einige Verunreinigungen in geringerer Menge, z. B. Fibrinogen, Fibronectin, IgG, werden auf der Säule zurückbehalten, während Faktor VIIIC in das Eluat austritt, das gesammelt und auf die oben angegebene Aminohexylsepharosesäule aufgegeben wird.
Es wurde festgestellt, daß bei dem gereinigten Faktor VIIIC sowohl die biologische Wirksamkeit, d. h. die Gerinnungswirksamkeit, als auch die antigene Wirksamkeit (cAg) vorlagen, wie in anschließenden Tests nachgewiesen wurde, aufgrund deren sich ein Anreicherungsgrad von 5000 gegenüber dem Anreicherungsgrad von 40 beim Ausgangsmaterial HEMOFIL ergab. Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Dreikomponenten-Standardtestkits von General Diagnostics (APTT, Plasma ohne Faktor VIII, Normalcitrat zum Nachweis) wurde ein Koagulationstest durchgeführt, der hohe biologische Faktor-VIIIC-Aktivität ergab.
Die verwendeten Antikörper stammten von Inhibitorpatienten, wobei einer, der einen niederen Titer besaß (LZ), als Beschichtungsantikörper (coating Ab) und einer, der einen hohen Titer besaß (HZ), als markierter Antikörper (labeled Ab) verwendet wurde. Die Antikörper wurden bei zwei unterschiedlichen Tests eingesetzt. In einem RIA-Test wurde der Antikörper HZ Ab mit ¹²⁵I markiert, während er in einem ELISA-Test an Meerrettich-Peroxidase gebunden wurde. Die Markierung des Antikörpers HZ mit ¹²⁵I für den RIA-Test wurde nach Hunter, W. M., in: Radioimmunoassay, Weir, D. M., Hrsg. Handbonk off Experimental Immunology, 3. Auflage, Band 1, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978, durchgeführt. Die HRP-HZ-Konjugation erfolgte gemäß Wilson und Nakane in: Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Knapp et al., Hrsg., Elsevier, North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978, S. 215–224. Die LZ-Antikörper besaßen eine Aktivität von 700 Bethesda-Einheiten/ml, während die HZ-Antikörper eine Aktivität von 1.500 Bethesda-Einheiten/ml aufwiesen. Die Beschichtungs-Antikörper (LZ Ab) wurden in 0,1 M NaHCO₃, pH 9,8, auf 3,5 μg/mt (RIA) oder 0,05 M Imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA (ELISA) verdünnt, oder es wurde für beide Verfahren PBS-CMF-Lösung angewandt (für 1 l: 200 mg KCl, 200 mg KH₂PO₄, 8,0 g NaCl, 1,15 g wasserfreies Na₂HPO₄, pH 7,4); 1 ml wurde zu jedem Röhrchen (Polystyrol) zugegeben, worauf über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Diese Lösung wurde dann durch Absaugen entfernt, worauf die Röhrchen dreimal mit 3 bis 3,5 ml 0,15 M NaCl oder PBS-CMF mit einem Gehalt von 0,05% Tween 20 gewaschen wurden. Die Proben oder Standardproben (General Diagnostics, Normalcitrat zum Test, Verify Normal Citrate, Katalog Nr. 34112) wurden verdünnt und in die Röhrchen gegeben, wobei ein Gesamtvolumen von 0,9 ml pro Röhrchen eingestellt wurde, und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert (die Verdünnungen wurden in 0,02 M Tris, 0,15 M NaCl, 5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01 Thimerosal, pH 6,5, für RIA oder in 0,05 M Imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA für ELISA oder in PBS-CMF für beide Verfahren vorgenommen). Die Lösungen wurden durch Absaugen entfernt, wonach die Röhrchen wie oben angegeben gewaschen wurden. Für den RIA-Test wurde eine 5 × 10⁵ cpm entsprechende Menge des ¹²⁵I markierten Antikörpers gegen Faktor VIIIC (HZ) in 600 μl RIA-Verdünnungspuffer in jedes Röhrchen gegeben, das dann 16 bis 18 h bei 37°C inkubiert wurde; die Lösungen wurden dann entfernt, wonach die Röhrchen wie oben angegeben, gewaschen und dann in einem Gammazähler vermessen wurden. Für den ELISA-Test wurden 0,9 ml mit Peroxidase konjugierter anti-Faktor-VIIIC-Antikörper (HZ) in jedes Röhrchen gegeben, das dann bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert wurde; die Lösungen wurden dann entfernt, wonach die Röhrchen wie oben angegeben gewaschen wurden; danach wurden 0,9 ml OPD-Lösung (auf 100 ml: 0,73 g Citronensäure, 1,19 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,15 g o-Phenylendiamin, pH 5,0, unmittelbar vor Gebrauch mit 250 μl 10% H₂O₂ versetzt) versetzt, wonach 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Zum Abstoppen dieser Reaktion wurde 0,5 ml 6 N HCl (oder 0,9 ml 1 M H₂SO₄) zu jedem Röhrchen gegeben, worauf die optische Dichte OD₄₉₂ gemessen wurde.
II. Struktur des Faktor VIIIC-Komplexes
A. Immunpräzipitationsversuche
Die Gelfiltrationsversuche des gereinigten Faktor VIIIC-Materials wurden mit einer AcA 44-Säule unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 0,1% Insulin (als Trägerprotein zur Stabilisierung), 0,25 M CaCl₂, 0,01% Thiomerosal, 0,05 M Imidazol, pH 7,2. Die Koagulationsaktivität sowie die Antigenwirksamkeit des Faktor VIIIC wurden im Eluat überwacht. Dabei wurden zwei Antigenpeaks festgestellt. Einer davon mit Faktor VIIIC-Koagulationswirksamkeit verhielt sich als Komplex mit einer apparenten Molekülmasse von etwa 460.000 unter diesen Bedingungen (nativ). Der andere Peak (ohne Koagulationsaktivität) wurde bei einer beobachteten Molekülmasse etwas unter 67 kd eluiert.
Bei der Analyse mit der analytischen Standard-SDS-Gelelektrophorese nach Laemmli, (Laemmli, Nature (1970) 227, 680–685) wurden verschiedene Proteinspecies mit 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 und 77 kd erhalten. Die Beziehung dieser Proteine zu Faktor VIIIC wurde nach Standard-Immunpräzipitationsverfahren ermittelt. Beim Immunpräzipitationsverfahren wurden Sepharose CL4B mit S. aureus-Protein A oder Polystyrolkügelchen (Durchmesser 0,32 mm, 1/8 in, Precision Plastic Ball Co.), die mit einem durch Affini tätschromatographie gereinigten zweiten Antikörper (Ziegen-anti-Aaus-IgG oder -anti-Human-IgG) beschichtet waren, zur Trennung der Antigen-Antikörper-Komplexe vom freien, ¹²⁵I-markierten Faktor VIIIC verwendet.
Die von der Affinitätssäule eluierten Proteine wurden jodiert und dann mit für Faktor VIIIC spezifischen Antikörpern umgesetzt. Die Antikörper waren menschliche Inhibitorantikörper, die von hämophilen Patienten isoliert worden waren; sie sind als anti-Faktor VIIIC-Antikörper (Z) und (E) oder Inhibitor-Antikörper (Z) und (E) bezeichnet.
Die Ergebnisse zeigten, daß beide Antikörper mit dem 77/88 kd-Dublett reagierten. Der Antikörper "E" reagierte ferner stark mit der 240 kd-Bande und ergab eine schwache Fällung mit verschiedenen Banden (160, 140, 115, 92,5 kd) zwischen dem Dublett und der Species mit 240 kd. Der Antikörper "Z" ergab ferner Fällung mit den Proteinen mit 92,5 kd und 240 kd. Die starke Reaktion des Antikörpers "E" mit der 240 kd-Species legt nahe, daß diese Species ein Vorläufer des Faktors VIIIC ist.
Die mit der Antikörpersäule gereinigte Faktor VIIIC-Fraktion wurde jodiert und mit Human-Inhibitorantikörper sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von EGTA (Ethylenglycol-bis(β-aminoethyl-ether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure) umgesetzt. Hierdurch ist es möglich, die Rolle zweiwertiger Kationen und insbesondere von Ca⁺⁺ bei der Assoziation der Faktor VIIIC-Polypeptide zu untersuchen. Dabei wurde festgestellt, daß der Inhibitorantikörper (E) sowohl mit dem 77/80 kd-Dublett als auch mit den Species höherer Molekülmasse mit 160, 140, 115 und 92,5 kd Fällung ergibt. Das Dublett befindet sich stets unter den stärkeren Banden. Dieser Immunpräzipitationsversuch wurde mit den Polystyrolkügelchen durchgeführt. Diese Verfahrensweise führt zu einem niedrigeren Untergrund, und das markierte IgG in der Faktor VIIIC-Präparation wird nicht gefällt. Die Mitverwendung von EGTA führt zum Verlust der Banden mit höherer Molekülmasse (92,5–160 kd), hat jedoch keinen Effekt auf die Menge des ausgefällten Dubletts.
Bei einem ähnlichen Versuch, bei dem an Sepharose als Immunsorbens gebundener Antikörper Z verwendet wurde, wurde gereinigter Faktor VIIIC auf die Säule auf gegeben; nach der Bindung über das 77/80 kd-Dublett wurde das 92,5 kd-Polypeptid mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) selektiv eluiert. Das Verfahren wird zur Fraktionierung der 92,5 kd-Species präparativ angewandt. Diese Immunsorbens-Säule oder eine ähnliche Säule wird mit polyklonalen Antikörpern gegen Faktor VIIIC hergestellt. Bei der Elution mit chaotropen oder denatutrierenden Lösungsmitteln, z. B. Thiocyanatlösung bzw. wäßriger Harnstofflösung anstelle von EGTA, wird der Faktor VIIIC weiter gereinigt. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das 92,5 kd-Polypeptid nicht kovalent über eine Ca⁺⁺-Brücke mit dem 77/80 kd-Dublett assoziiert sein kann. Der Inhibitorantikörper scheint lediglich mit dem Dublett direkt wechselzuwirken. Die Banden mit höherer Molekülmasse (115 kd, 140 kd, 160 kd) gehören wahrscheinlich zu Vorläufern des 92,5 kd-Polypeptids, da sich ergab, daß der monoklonale, gegen das 92,5 kd-Polypeptid gerichtete Antikörper zur Kreuzreaktion mit den Polypeptiden mit 115 kd, 140 kd und 160 kd befähigt ist.
Die Beziehung der verschiedenen Proteinspecies von der Affinitätssäule wurde durch Immunpräzipitation von jodiortem, gereinigtem Faktor VIIIC mit monoklonalen Antikörpern nachgewiesen, die nach dem Verfahren von G. Kohler und C. Milstein (Eur. J. of Immunol. 6 (1975) 511) hergestellt worden waren. Balb/c-Mäuse wurden mit in flüssiger Phase immunadsorbiertem Faktor VIIIC immunisiert. Milzzellen (10⁸) wurden mit 10⁷ NSO- oder NSI-Mäusemyelomzellen verschmolzen. Die Fusionsprodukte wurden dann in zwei Mikrotiterplatten mit je 96 Vertiefungen eingebracht. Eine Feeder-Schicht der Milzzellen mit 10⁴-Zellen/Vertiefung wurde verwendet. Vom 5. Tag an waren Kolonien mikroskopisch sichtbar; der Überstand wurde jeweils nach ein paar Tagen durch ELISA-Test untersucht. Folgende Schichten wurden verwendet: 1. Schicht: Von der Aminohexylsepharose-4B-Säule eluierter Faktor VIIIC, wie oben in Abschnitt I beschrieben; 2. Schicht: Hybridomzellen-Überstand, 3. Schicht: Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertes Ziegen-anti-Maus-IgG; 4. Schicht: HRP-Substrat.
Es wurden verschiedene Klassen monoklonaler Antikörper identifiziert, von denen zwei die Koagulationsaktivität von Faktor VIIIC inhibierten: Antikörper der Klasse I reagierten mit dem 80/77 kd-Dublett und dem 240 kd-Polypeptid; die Antikörper der Klasse II reagierten mit den Proteinen mit 240, 160, 140, 115 und 92,5 kd. Die Immunpräzipitation von mit Thrombin abgebautem Faktor VIII mit monoklonalen Antikörpern der Klasse I zeigt, daß sich das entstandene 70/67 kd-Dublett vom 77/80 kd-Dublett ableitet (vgl. unten). Die Immunpräripitation mit monoklonalen Antikörpern der Klasse III zeigt wiederum an, daß die Polypeptide mit 160, 140 und 115 kd Vorläufer des 92,5 kd-Polypeptids sind. Die monoklonalen Antikörper der Klasse III reagierten ferner mit einem 40 kd-Polypeptid, das durch Thrombinabbau des gereinigten Faktor VIIIC-Materials erzeugt wvorden war.
Es wurde ferner ein ähnlicher Versuch wie oben beschrieben unter Verwendung von EGTA durchgeführt, um die Rolle von Ca⁺⁺-Ionen im Faktor VIIIC-Komplex zu untersuchen, wobei ein ELISA-Assay auf der Basis monoklonaler Antikörper mit folgenden Schichten verwendet wurde: 1. Schicht: Monospezifischer anti-Maus-IgG-Antikörper; 2. Schicht: Monoklonale Antikörper der Klasse III (anti-92,5 kd); 3. Schicht: Gereinigtes Faktor VIIIC-Material, 4. Schicht: HRP-Human-Inhibitorantikörper gegen 77/80 kd. Bei Zusatz von EGTA verschwand die im Kontrollversuch ohne Chelatbildner vorliegende gebundene HRP-Aktivität. Der Umstand, daß die monoklonalen Antikörper der Klasse I und III, die gegen die Proteine des 77/80 kd-Dubletts bzw. des 92,5 kd-Fragments berichtet sind, jeweils die Koagulationsaktivität des Faktors VIIIC inhibieren, erweist, daß beide wesentliche Komponenten des Faktor VIIIC-Komplexes sind.
B. Thrombin-Aktivierung von Faktor VIIIC
Aminohexylkonzentrierter, affinitätsgereinigter Faktor VIIIC wurde mit Thrombin aktiviert (Boehringer, Charge Nr. 1072302), wobei zwei unterschiedliche pH-Bedingungen (6,8 und 7,4) angewandt wurden.
Aliquote Mengen wurden auf ihre Koagulationsaktivität getestet; zusätzlich wurden Proben (jeweils etwa 2,5 Einheiten) zur Gelanalyse mit TCA gefällt. Bei den ersten Versuchen betrug die VIIIC-Aktivität anfänglich 46 Einheiten/ml. Das Material wurde auf eine Endkonzentration von 11,5 Einheiten/ml in Faktor VIIIC-Puffer (20 mM Imidazot, pH 6,8, 150 mM NaCl, 100 mM Lysin, 25 mM CaCl₂ und 10 Glycerin) verdünnt. Die Endkonzentration an Thrombin betrug 0,12 Einheiten/ml (etwa 1 Einheit Thrombin pro 100 Koagulationseinheiten VIIIC). Die Ergebnisse zeigten, daß die Koagulationsaktivität auf etwa 180 Einheiten/ml ansteigt und dann auf etwa 40 Einheiten/ml (im wesentlichen der Ausgangswert) abfällt, und zwar übereinstimmend mit einem ähnlichen Anstieg und Abfall der Menge an 92,5 kd-Species. Die 92,5 kd-Species stellt folglich einen Teil des aktiven Faktor VIIIC-Komplexes dar.
Zusätzliche Versuche mit höherkonzentrierten Faktor VIIIC-Präparationen wurden vorgenommen, um die Thrombinaktivierung in einem präparativen Maßstab durchzuführen. Zur Erzeugung des 92,5 kd-Polypeptids wurde Thrombin zu dem gereinigten Faktor VIIIC-Material (pH 7,4) in einem Verhältnis von etwa 1000 bis 2000 Koagulationseinheiten Faktor VIIIC auf eine Einheit Thrombinaktivität zugegeben, worauf lediglich eine kurze Zeit (5–15 min, je nach der Hemofil-Probe) reagierengelassen wurde. Das resultierende Produkt wurde dann auf ein 7,5%iges präparatives Gel aufgebracht, und die Peptide wurden durch Elektrophorese getrennt; die Gelbanden wurden ausgeschnitten und elektroeluiert.
Wenn der Thrombinabbau lediglich während einer kurzen Zeitdauer vorgenommen wird, kann die Menge an 92,5 kd-Species verdoppelt oder verdreifacht werden; zugleich wird das 77/80 kd-Dublett lediglich teilweise in die 67/70 kd-Species umgewandelt. Zur Optimierung der Bedingungen für die Isolierung des 67/70 kd-Dubletts wird der Thrombinabbau während einer längeren Zeitdauer (mehr als 1 h) durchgeführt. In diesem Fall wird die 92,5 kd-Species weiter gespalten, wobei kleinere Fragmente entstehen. Nach der Thrombinbehandlung erscheinen zwei neue Peptide mit 52,5 kd und 40 kd. Das 40 kd-Polypeptid reagiert mit dem gegen die 92,5 kd-Species gerichteten monoklonaten Antikörper und muß folglich ein Spaltungsprodukt davon sein. Das 52,5 kd-Polypeptid leitet sich ebenfalls vom 92,5 kd-Protein ab, wie aus einem Vergleich des chemischen mit dem enzymatischen Spatungsmuster nachzuweisen ist, d. h., sowohl die 92,5 kd-Species als auch die 52,5 kd-Species zeigen bei Spaltung mit CNBr oder mit Endoproteinase LysC eine Anzahl gemeinsamer Fragmente (aufgrund von SDS-PAGE).
Zum Abbau mit Endoproteinase LysC wird ein Massenverhältnis von LysC zu Protein von etwa 1 : 1–100 und üblicherweise 1 : 10 angewandt. Bei dem hier angewandten Abbau wurden 20 pmol (4,8 μg) LysC mit 20 pmol (14 μg) 70 kd-Polypeptid in etwa 100 μl 0,025 M Tris-HCl, pH 7,7, 0,001 M EDTA und 0,08% SDS kombiniert; das Gemisch wurde zum vollständigen Abbau während einer Zeitdauer von 6 h bis über Nacht bei 37°C inkubiert. Native Polyacrylamidgele gemäß Orstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. 121 (1964) 321–349, wurden zur Isolierung der LysC-Abbauprodukte herangezogen.
C. Thrombinabbau von durch Gelelektrophorese isolierten VIII C-korrelierten Proteinen
Zur Bestätigung der Vorläufer-Produkt-Beziehung dieser Polypeptide wurde eine Anzahl der Banden durch präparative SDS-Gelelektrophorese isoliert, elektroeluiert und anschließend dem Thrombinabbau unterzogen. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

1. Das 240 kd-Protein ergab eine Vielzahl von Banden einschließlich 160, 140, 115 und 92,5 kd, wobei jedoch kein Produkt mit einer Molekülmasse unter 92, 5 kd auftrat, d. h., kein 77/80 kd- oder 67/70 kd-Dublett. Ferner wurde die Zeitabhängigkeit des Thrombinabbaus am 240 kd-Fragment untersucht, wobei die Produkte hinsichtlich des Gelelektrophoresemusters, der Koagulationsaktivität und der Faktor VIIIC-Antigenaktivität (cAg-Aktivität) analysiert wurden. Die Ergebnisse der Gelchromatographie waren die gleichen wie oben, und es wurde im wesentlichen kein cAg bzw. keine Koagulationsaktivität erhalten.
2. Die gelisolierten 160 kd- und 92,5 kd-Polypeptide scheinen keine Substrate für Thrombin nach der Isolierung vom Gel zu sein.
3. Thrombin spaltet spezifisch die gelisolierten 77 kd- und 80 kd-Species, wobei neue Polypeptide von 61 kd bzw. 70 kd entstehen. Nach der Thrombinbehandlung fällen monoklonale Antikörper der Klasse I nicht nur das 77/80 kd-Dublett, sondern auch diese 67- und 70 kd-Species.

D. Analyse der Aminosäuresequenz
Eine partielle Aminosäureseguenzinformation wurde nach Standardverfahren für die 67/70 kd-Peptide, die 77/80 kd-Peptide und das 52,5 kd-Peptid erhalten, die durch präparative SDS-Elektrophorese isoliert worden waren. Die elektrophoretische Analyse ergab, zusammen mit den Ergebnissen hinsichtlich der Aminosäureseguenz, daß die gelisolierten Polypeptide mit 77/80 kd, 67/70 kd, 92,5 kd und 52,5 kd in einer Reinheit von > 95% und üblicherweise 98% erhalten wurden. Die gelisolierten Polypeptide wurden auf. einen Gasphasen-Proteinseguenator (Applied Biosystems) aufgegeben. Die PTH-Aminosäuren wurden auf eine HPLC-Säule (IBM Cyano, 25 cm) aufgegeben, und die Aminosäureseguenz wurde aus den resultierenden Chromatogrammen ermittelt.
Die folgende Sequenz wurde für das 67/70 kd-Dublett am aminoterminalen Ende ermittelt:
Für das 52,5 kd-Protein, das sich, wie im folgenden gezeigt wird, vom 92,5 kd-Protein ableitet, wurde folgende N-terminale Aminosäureseguenz ermittelt:
Die Aminosäureseguenzen der beiden durch Abbau des 77/40 kd-Dubletts mit Endoproteinase LysC (Boehringer-Mannheim) erhaltenen zwei. Polypeptide wurden bestimmt. Der Abbau wurde wie folgt durchgeführt. Das 77/80 kd-Dublett wurde elektrophoretisch an einem Acrylamid-Proteingel aufgetrennt, worauf die dem Dublett entsprechenden Banden elektroeluiert wurden. Das aufgetrennte Material wurde gereinigt und mit Endoproteinase LysC abgebaut; die resultierenden Polypeptide wurden durch Reversphasen-HPLC aufgetrennt. Die Peaks mit Absorption bei 280 nm entsprechenden Fraktionen wurden unter Verwendung eines automatischen Sequenators (Applied Biosystems, Foster City, CA, Modell A70A) sequenziert. Die erste Sequenz war wie folgt:
Das zweite Peptid besaß folgende Sequenz:
Das 77/90 kd-Dublett wurde ebenfalls mit Trypsin abgebaut. Das Dublett-Material wurde wie oben für den Abbau mit Endoproteinase LysC beschrieben gereinigt. Die Lysinanteile wurden durch Citraconylierung blockiert, um lediglich einen Abbau bei den Argininresten zu erhalten. Die Citraconylierung wurde durch Suspendieren der Proteine in einem denaturierenden Puffer, Reduktion und Carboxymethylierung der suspendierten Proteine und Behandlung mit Citraconsäureanhydrid durchgeführt, wobei der pH-Wert zwischen 9,5 und 9,0 gehalten wurde. Nach der Citraconylierung wurden die Proteine mit Trypsin abgebaut, und die resultierenden Polypeptide wurden durch Reversphasen HPLC aufgetrennt. Die Peaks mit Absorption bei 290 nm entsprechenden Fraktionen wurden wie oben seguenziert. Die Seguenz war wie folgt:
Bei Untersuchungen zur Bestimmung der N-terminalen Sequenzen der 80 kd- und 77 kd-Species wurde festgestellt, daß ihre aminnterminalen Enden blockiert waren. Die N-terminale Sequenz wurde daher an einem Material bestimmt, das nach einem alternativen Reinigungsverfahren erhalten wor den war, das Immunoaffinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie umfaßte und bei dem keine präparative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese angewandt wurde. Die Reinigung des 80/77 kd-Dubletts umfaßte das Aufgeben des Faktor VIIIC-Konzentrats auf eine Säule mit monoklonalen Antikörpern und anschließende Chromatographie an einem Mono-S-Kationenaustauscher. Dieses Material besaß nichtblockierte N-Termini, woraus ersichtlich ist, daß die bei dem gelgereinigten 80/77 kd-Material festgestellte Blockierung ein Artefakt war, das von der Gelelektrophorese herrührte. Die für die 80 kd-Species sowie die 77 kd-Species bestimmte aminoterminale Sequenz ist folgende:
E. Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung der 77/80 kd-Dublett-Polypeptide wurde nach Standardverfahren ermittelt und ist wie folgt:

Claims

Isolierte Proteinzusammensetzung, die einen Komplex aus einem 77/80 kD-Dublett-Polypeptidfragment, das mit einem 92,5 kD-Polypeptidfragment calciumverbrückt ist, und Vorläuferspecies enthält, wobei der Komplex eine dem Human-Faktor VIIIC ähnliche Koagulationswirkung aufweist, der Komplex und die Vorläuferspecies eine Reinheit von mindestens 90%, bezogen auf Gesamtprotein, aufweisen und der Komplex eine Reinheit von mindestens 30%, bezogen auf Gesamtprotein, besitzt.