JPH04218399A - ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ファクターＶＩＩＩＣは血液凝固
の本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のＸ
染色体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個
体においてはこのファクターは存在せず、又は不足して
いる。ファクターＶＩＩＩＣの血漿中濃度は極めて低く
、そして一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物また
は最終生成物であると考えられるため、該ファクターの
単離においては大きな困難に遭遇する。従って、ファク
ターＶＩＩＩＣを単離しようとすれば分子量の異る有意
に不均一な複雑な混合物が得られる。

【０００２】生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用す
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することができ
、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメッ
センジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中での
ｃＤＮＡ遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を確
立することができる。

【０００３】さらに、アミノ酸配列を決定することによ
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡとハ
イブリダイズするプローブを開発することができ、従っ
て該当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そ
して所望の生成物を１種類又は複数種類の宿主において
高収量で製造することができる。

【０００４】

【従来の技術】米国特許第　４，３６１，５０９号及び
これに引用された文献にはファクターＶＩＩＩＣの精製
が記載されている。さらに、　Ｆｕｌｃｈｅｒ及び　Ｚ
ｉｍｍｅｒｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ　（１９８２）　７９：１６４８−１６
５２を参照のこと。　Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等、Ｊ．　ｏ
ｆ　Ｌａｂ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　　
（１９７９）　９３：４０−５３にはポリクローナル抗
体を用いるファクターＶＩＩＩＣの精製について記載さ
れている。

【０００５】Ａｕｓｔｅｎ，　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌｏｇｙ　（１９７９）　４３：　６６９−
６７４　にはファクターＶＩＩＩＣの精製のためのアミ
ノヘキシル−セファロースの使用について記載されてい
る。Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　（１９８１）　７８：５１３７
−５１４１にはファクターＶＩＩＩＣに対するスロンビ
ンの効果が検討されている。さらに、　Ｋｕｏ等、Ａｂ
ｓｔｒａｃｔｓ　ｆｏｒ　ＩＸ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，　（コペンハーゲ
ン、１９８３年７月）を参照のこと。

【０００６】

【発明の概要】本発明は、以下に記載する方法において
用いられる、ファクターＶＩＩＩＣ遺伝子に対するプロ
ーブを提供する。微生物又は哺乳動物組織培養細胞での
発現によるヒト−ファクターＶＩＩＩＣ、その前駆体及
びサブユニットの製造方法及び組成物が提供される。こ
の方法は、純粋なファクターＶＩＩＩＣ、そのサブユニ
ット及び断片を単離し、そして特にスロンビン消化を用
いてこれらの生理的関連性を決定することを含む。関連
する一連のポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列
決定し、そしてこの配列を複合プローブの開発に使用す
る。

【０００７】ゲノムＤＮＡ断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟ｍＲＮＡを単離する
ために使用し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る。次に
ＤＮＡ配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。

【０００８】

【具体的な記載】ヒト−ファクターＶＩＩＩＣ断片及び
サブユニットが実質上純粋な形で提供される。さらに、
前駆体としての又は活性形でのファクターＶＩＩＩＣを
製造するため、あるいは天然に得られるサブユニットと
組合わせて使用する個々のサブユニットを得るためのフ
ァクターＶＩＩＩＣサブユニット及び断片を発現するた
めの方法及び構成物が提供される。このサブユニット及
び断片はファクターＶＩＩＩＣと関連する１又は複数の
生物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び
免疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この
抗体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベル
された試薬として使用される。

【０００９】ヒト−ファクターＶＩＩＩＣは、約　４６
０ｋｄの見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単
離され得る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動
に際し、種々の分子量、すなわち２４０，　１６０，　
１４０，　１１５，　９２．５，　８０、及び７７ｋｄ
の多数の断片が生じ、後２者はダブレットとして移動す
る。免疫的関係を調べるために抗体を用いそして構造的
関係を調べるために切断パターンを用いながら、化学的
切断及びスロンビン切断を含むプロテアーゼ切断により
断片を分析することにより、９２．５ｋｄポリペプチド
が　２４０，　１６０，　１４０及び　１１５ポリペプ
チドと関連しており、他方７７／８０ダブレットは他の
ペプチドと共通の同定され得る特性を有さず　２４０ｋ
ｄポリペプチドとのみ共通の特性を有することが示され
る。

【００１０】さらに、７７／８０ｋｄダブレットはスロ
ンビンにより６７／７０ｋｄダブレットに転換され、他
方スロンビンで処理された精製ファクターＶＩＩＩＣ物
質中に存在する９２．５ｋｄポリペプチドはスロンビン
により直接的又は間接的に約４０及び５２．５ｋｄの２
個のポリペプチドに切断される。電気泳動的に単離され
た７７／８０ｋｄダブレットポリペプチドはそのＮ−端
がブロックされており、６７／７０ｋｄダブレットはそ
のＮ−端がブロックされていないことが見出される。

【００１１】さらに、ファクターＶＩＩＩＣの座は大き
なイントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファク
ターＶＩＩＩＣと関連する種々の領域を含むことが見出
される。 すなわち、ファクターＶＩＩＩＣ複合体に関する特定の
ポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単離
することができる。ファクターＶＩＩＩＣサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離し
、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、又
は合成ＤＮＡにより連結して、ファクターＶＩＩＩＣの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。

【００１２】便利には、エクソン及びイントロンの両者
を含有するファクターＶＩＩＩＣゲノムＤＮＡ配列を哺
乳動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに
挿入し、ｃＤＮＡのクローニングに適するように適切に
スプライスされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを
得、そしてファクターＶＩＩＩＣ、サブユニット又は断
片を製造する。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配
列を用いてファクターＶＩＩＩＣをコードする天然メッ
センジャーＲＮＡとハイブリダイズさせることができる
。

【００１３】次に、このメッセンジャーＲＮＡを用いて
ファクターＶＩＩＩＣのサブユニットをコードする　ｄ
ｓ　ｃＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡ配列は、
これを転写及び翻訳のために必要な制御がシグナルを有
する適当な発現ベクターに挿入することによって、発現
のために使用することができる。ファクターＶＩＩＩＣ
遺伝子発現ベクター（ファクターＶＩＩＩＣ、その前駆
体、サブユニット又は断片の全体又は部分をコードする
１個又は複数個の遺伝子を担持する発現ベクター）を適
合性の宿主に導入し、そしてこの宿主をファクターＶＩ
ＩＩＣの発現のために増殖せしめることができる。

【００１４】宿主を適切に選択することにより、ファク
ターＶＩＩＩＣのＤＮＡを分泌リーダー及びプロセシン
グシグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され
、そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとなる
ようにすることができる。適当であれば、このポリペプ
チドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在
する官能基又は置換基を導入することができる。

【００１５】この発明の最初の段階において、高度に精
製したファクターＶＩＩＩＣを得そして特徴付ける。精
製されたファクターＶＩＩＩＣは市販のヒト−抗血友病
因子（ＡＨＦ）　から得ることができる。この因子は正
常なヒトの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製される
ものであり約４０倍に濃縮されている。これを適当な緩
衝液、例えばイミダゾール−リジン−　ＨＣｌ塩溶液（
ｐＨ７．４）に溶解し、次にファクターＶＩＩＩＣ又は
ファクターＶＩＩＩＲに対するポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体を有するアフィニティーカラム上で
クロマトグラフ処理することによりファクターＶＩＩＩ
Ｃをさらに濃縮、精製する。便利には、抗体をセファロ
ース支持体に共有結合せしめる。

【００１６】比較的高濃度のカルシウムイオンとグリセ
リンとの組合せを用いてカラムからファクターＶＩＩＩ
Ｃを溶出することができる。次に、カラムから得られた
画分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用い
て透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカ
ラムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウム
を含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製するこ
とができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチ
ンセファロース、ＨＰＬＣ、デキストランサルフェート
又はＭｏｎｏ　Ｑ上でのイオン交換、レクチン又はファ
クターＶＩＩＩＣに対する抗体を用いるアフィニティー
カラム等によりさらに精製することができる。

【００１７】特に、デキストランサルフェートを使用す
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、　ＩｇＧが標品から除去され、外来性
蛋白質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの
画分の活性は、凝固アッセイ（市販キット）及びファク
ターＶＩＩＩＣに特異的な抗体を用いて、生物学的活性
及び抗原活性のいずれか又は両方について監視すること
ができる。血漿中のファクターＶＩＩＩＣの濃度に基い
て、上記の方法により約　２００，０００倍の精製が達
成される。

【００１８】ファクターＶＩＩＩＣの特徴付けゲル濾過
により、ファクターＶＩＩＩＣが約　４６０ｋｄの見か
け分子量を有する複合体として挙動することが示される
。 ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子量を異
にする７個の個別のポリペプチドを単離することができ
る。その分子量により定義される断片は２４０，　１６
０，　１４０，　１１５，　９２．５，　８０及び７７
ｋｄ断片である。これらの断片を次の方法により特徴付
けた。

【００１９】第１の研究は、血友病患者から単離された
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は７７／８０ｋｄダブレットと反応し
た。Ｅ抗体は　２４０ｋｄポリペプチドと強く反応し、
そしてダブレットと　２４０ｋｄポリペプチドとの間の
複数のバンドと弱く反応した。Ｚ抗体は　２４０ｋｄポ
リペプチドとも弱く反応した。免疫沈澱実験において、
Ｅ抗体は７７／８０ｋｄダブレット、並びに　１６０，
　１４０，　１１５及び９２．５ｋｄの高分子量種を沈
澱せしめ、ダブレットは一層強いバンド中にある。ＥＧ
ＴＡを含有せしめることによりダブレット以外のバンド
が消失し、９２．５ｋｄ種がＣａ＋＋橋に仲介されて複
合体中で７７ｋｄ及び／又は８０ｋｄ種と会合すること
が示される。

【００２０】次の研究において、ファクターＶＩＩＩＣ
に介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反
応するモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは７７
／８０ｋｄダブレット及び　２４０ｋｄポリペプチドと
反応し、クラスＩＩは　１６０，　１４０，　１１５及
び９２．５ｋｄポリペプチドと反応する。 クラスＩ抗体とスロンビン消化ファクターＶＩＩＩＣと
の免疫沈澱により、生成する７０／６７ｋｄダブレット
はファクターＶＩＩＩＣ中に存在する７７／８０ｋｄダ
ブレットに由来することが示される。

【００２１】クラスＩＩモノクローナル抗体は、１６０
，　１４０及び　１１５ｋｄペプチドが９２．５ｋｄペ
プチドの前駆体であることを示した。９２．５ｋｄペプ
チドの切断生成物である４０ｋｄペプチドもクラスＩＩ
抗体により結合された。ＥＧＴＡの存在下及び非存在下
でモノクローナル抗体を用いる　ＥＬＩＳＡ測定により
ファクターＶＩＩＩＣ複合体の９２．５ｋｄ成分と７７
ｋｄ及び／又は８０ｋｄ成分との間のＣａ＋＋橋会合が
確認された。

【００２２】ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターＶ
ＩＩＩＣを得るために使用することができ、又はＥＧＴ
Ａを用いながら、構成成分である９２．５ｋｄ種と７７
／８０ｋｄ種を分けるために使用することができる。

【００２３】次の研究では、精製されたファクターＶＩ
ＩＩＣ物質のｐＨ６．８又は７．４におけるスロンビン
消化を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそ
してゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は
９２．５ｋｄ種の量の増加及び減少に伴って時間と共に
増加しそして減少することが示された。精製されたファ
クターＶＩＩＩＣ物質の短時間（５〜１５分間）のスロ
ンビン処理により９２．５ｋｄ種の量が増加し、７７／
８０ｋｄダブレットは部分的に６７／７０ｋｄダブレッ
トに転換される。

【００２４】長時間、例えば１時間スロンビン消化する
場合、９２．５ｋｄ蛋白質が分解され、そして４０ｋｄ
及び５２．５ｋｄの２個の新たなペプチドが生じ、４０
ｋｄペプチドは９２．５ｋｄ種の免疫原性を維持してい
る。５２．５ｋｄペプチドは、化学的及び酵素的分解パ
ターン及び９２．５ｋｄ種に類似する生成物により、切
断生成物であることが示される。

【００２５】次の研究において、個々のファクターＶＩ
ＩＩＣサブユニット及び前駆体（例えば２４０，　７７
／８０，　９２．５ｋｄ種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳
動により単離し、そして次に単離されたポリペプチドの
経時的スロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離さ
れた　２４０ｋｄ断片は　１６０，　１４０，　１１５
、及び９２．５ｋｄのバンドを生成した。８０ｋｄ及び
７７ｋｄの断片はそれぞれ７０ｋｄ及び６７ｋｄの断片
を生成した。

【００２６】７７ｋｄ及び／又は８０ｋｄ種と９２．５
ｋｄポリペプチドとをカルシウム橋複合体として含有す
るファクターＶＩＩＩＣ複合体は高度に精製された形で
得られる。抗−ファクターＶＩＩＩＲイムノソルベント
カラム及びアミノヘキシルセファロースカラムで処理し
た後、ファクターＶＩＩＩＣ物質（複合体及び前駆体種
）の純度は、全蛋白質を基礎にして、通常は８０％より
高く、しばしば９０％より高く、そして９８％以上であ
りえ、そして複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして２
０％以上であり、さらに一般的には３０％以上である。

【００２７】追加のクロマトグラフ段階、例えばデキス
トランサルフェートの使用により、ファクターＶＩＩＩ
Ｃ物質（複合体＋前駆体）の純度レベルが９０％以上に
上昇する。調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離された
ファクターＶＩＩＩＣ成分、すなわち９２．５ｋｄ種及
び７７／８０ｋｄダブレットの純度は通常９８％以上で
ある。上記のように、ダブレットの１員又は９２．５ｋ
ｄポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いて
複合体を得ることができる。次に、変性剤又はチャオト
ロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）溶剤、例えば尿素水
溶液又はチオイソシアナートを用いて複合体を抗体から
分離することができる。

【００２８】プローブの調製 ６７及び７０ｋｄポリペプチドのＮ−端の部分的アミノ
酸配列は次の通りである。

【００２９】

【表２】

【００３０】この配列に基いて、６７／７０ｋｄダブレ
ット用の（従って、このダブレットが由来する７７／８
０ｋｄダブレット用の）、次の配列を有するプローブを
調製することができる。

【表３】

【００３１】５２．５ｋｄ蛋白質のＮ−端アミノ酸配列
は実質上次の通りである。

【表４】

【００３２】このアミノ酸配列に基いて、５２．５ｋｄ
蛋白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブ
を調製することができる。

【表５】

【００３３】７７／８０ｋｄ蛋白質の３個の断片のアミ
ノ酸配列は次の通りである。

【表６】

【００３４】これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。

【表７】 これらのペプチドの配列及び対応するプローブの調製に
ついては実験の部において詳細に後記する。

【００３５】ＤＮＡの単離 上記のプローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約１０〜２５ｋｂの断片のサ
イズ選択を含む。制限消化は、クローン化される断片が
オーバーラップするように不完全であるべきである。こ
れらの断片は適当なベクターにクローン化して微生物、
例えば細菌、例えばＥ．コリ（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）中に
クローンの「ライブラリー」を調製することができる。 プラスミド又はウイルス、例えばｐＢＲ３２２、ラムダ
、シャロン４Ａ、ＥＭＢＬ−４等の種々のベクターを使
用することができる。

【００３６】酵素的に放射能ラベルした上記のプローブ
を用いてＤＮＡをスクリーニングし、そして相同な配列
を検出する。１又は複数のプローブとハイブリダイズす
るこれらの配列を再クローン化し、そして１回又は複数
回再ハイブリダイズすることができる。

【００３７】最初に使用したプローブとは異る１種類又
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜１０ｋｂ
、さらに普通には１〜６ｋｂの範囲の大きさを有する。 次に、これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリ
ーニングして陽性の断片を同定することができる。次に
、ＤＮＡ断片の配列決定のためにプライマーとして合成
プローブを使用することができる。

【００３８】最も便利には配列決定される断片は、１種
類又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有
する断片であり、ここで相同な配列は５′−端から約５
塩基〜約　５００塩基である。注目される他の断片には
最初にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる
。なぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンに
おいて示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収
するまで染色体にそって「歩く」ために使用されるから
である。

【００３９】ＤＮＡ断片を配列決定した後、決定された
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。適当な位置に
おいて制限部位を容易に用いることができない場合には
、ＤＮＡ断片を種々の時間にわたってＢａｌ　３１切断
（リセクト）により変形し、生じた断片をクローン化し
、そして種々の技法によりＮ−端を決定することができ
る。

【００４０】便利には、リセクトされた断片が連結され
る３′−塩基の適切な選択により特定の制限酵素の認識
部位を設けることができる。この方法において、生ずる
クローンをあらかじめ定められた制限部位についてスク
リーニングすることができ、この部位は所望の部位への
リセクトされた断片の存在を示すであろう。

【００４１】好ましくは、エクソン、又は５０ｂｐ以上
、さらに一般的には約　１００ｂｐ以上、さらには約　
２５０ｂｐ又はこれより大きいエクソン断片を変性し、
そしてヒト細胞、特にファクターＶＩＩＩＣのためのｍ
ＲＮＡを産生するヒト細胞からｍＲＮＡを得るためのプ
ローブとして使用することができる。ハイブリダイズす
るｍＲＮＡを単離することによって、卵母細胞又は網状
赤血球溶解物中での翻訳、及びファクターＶＩＩＩＣに
対する抗体又はファクターＶＩＩＩＣサブユニットへの
結合に基く凝固活性を用いるファクターＶＩＩＩＣの産
生の検出を行うことによりｍＲＮＡをスクリーニングす
ることができる。次に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を用い
てｍＲＮＡを逆転写することができる。

【００４２】逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌ
クレアーゼ、例えばＳ１　ヌクレアーゼにより末端ルー
プを除去することにより、種々の方法を用いて　ｓｓ　
ｃＤＮＡを　ｄｓ　ｃＤＮＡに転換することができる。 不完全なコピーが得られる場合、ｍＲＮＡの５′−コー
ド配列がコピーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」
、又はｃＤＮＡプライム合成を行い、そしてｍＲＮＡの
全コード領域をコードするＤＮＡ配列を得ることができ
る。

【００４３】上記の方法に基いて、ファクターＶＩＩＩ
Ｃの前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮ
Ａ配列を用いて発現せしめ、又はファクターＶＩＩＩＣ
の特定のサブユニット、例えば９２．５ｋｄ、８０ｋｄ
又は７７ｋｄのサブユニットをコードする小断片を用い
ることができる。

【００４４】前駆体ポリペプチド（プロ−ファクターＶ
ＩＩＩＣ）のためには、遺伝子を１端又は両端において
平滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中
に挿入することができ、あるいは５′−コード端から下
流で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なア
ダプターに連結することができる。

【００４５】そして、適当なＮ−端を有する断片（７０
ｋｄ又は８０ｋｄポリペプチドのコード配列にあっても
よく、又は最初の塩基から下流、一般に約３０塩基以下
下流、さらに一般的には約２０塩基以下下流に５′−端
を有してもよい）を、適当であればアダプターを用いて
、適切なベクターに挿入することができる。

【００４６】染色体外要素を得るため、特定の宿主、発
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）、Ｂ
．サーモフィルス（Ｂ．　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　
）、Ｓ．セレビシエー（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
）等により認識される転写及び翻訳制御シグナルを有す
る種々のベクターを使用することができる。

【００４７】ベクターは宿主により認識される複製系を
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。使用される発現ベクターは
宿主により認識される転写及び翻訳シグナルを有するで
あろう。転写シグナルはプロモーター及びターミネータ
ー、並びに１又は複数個のエンハンサーのごとき補助シ
グナルを含むであろう。さらに、転写の制御は、オペレ
ーター、アクチベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含
有せしめることによって行われるであろう。転写に関す
る他の配列にはキャップ配列、ポリアデニル化配列等が
含まれる。翻訳のためには、宿主に依存して、リボゾー
ム結合部位、開始コドン、終止コドン等が存在するであ
ろう。

【００４８】便利には、宿主により認識されるシグナル
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５′−及び３′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。

【００４９】分泌リーダー及びプロセシングシグナルが
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレ
オチドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及び
プロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
（この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５′
−末端を有する）との間に挿入し、こうすることによっ
てアダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そし
て遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始
コドンが整合するようにすることができよう。

【００５０】次に、こうして得られた所望の遺伝子を含
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーション
、接合、トランスフェクション等によって、培養におい
て増殖することができる宿主に導入することができる。 次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そして生
成物を常法に従って単離することができる。生成物が細
胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解する。 分泌される場合には、生成物を培地から単離する。 生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等
により精製することができる。

【００５１】哺乳動物細胞での発現のためにはベクター
として哺乳動物ウイルス、例えばＳＶ−４０、乳頭腫ウ
イルス、マロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）ネズミサルコーマ
ウイルス、アデノウイルス等を使用することができる。 これらのウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベク
ターとして使用するために変性されている。代表的な系
においては、組込まれたＳＶ−４０ゲノムを担持しそし
てＳＶ−４０の複製のために必要なラージＴ抗原を産生
するＣＯＳ細胞が使用される〔Ｇｌｕｚｍａｎ，　Ｃｅ
ｌｌ（１９８１）　２３：１７５　〕。ＳＶ−４０地図
上のＨｐａ　Ｉ部位からＳＶ−４０地図上の０．１４部
位にわたる断片がベクターとして使用される。ファクタ
ーＶＩＩＩＣ遺伝子又はその部分とＳＶ−４０ベクター
とを連結することによって得られる組換プラスミドはモ
ンキーＣＶ−１細胞のトランスフェクトのために使用す
ることができる。

【００５２】この発明に従えば、ファクターＶＩＩＩＣ
の精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特
定のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化す
るために使用される。ファクターＶＩＩＩＣはまた医療
において使用される。さらに、この発明によって製造さ
れたポリペプチドは、ファクターＶＩＩＩＣ、そのサブ
ユニット及び断片に対するモノクローナル抗体を製造す
るために使用することができる。さらに、サブユニット
及び断片は試薬として使用される。この試薬はラベルさ
れ、そして抗体と組合わせて生理的液体、例えば血液又
は血清中の１又は複数のサブユニット又はその分解断片
の存在の診断的測定において使用される。

【００５３】次に例によりこの発明をさらに具体的に説
明する。特にことわらない限りＡｂ　は抗体を意味し、
そしてＡｇ　は抗原を意味する。

【００５４】実験 Ｉ．ファクターＶＩＩＩＣの精製 ａ）Ｅ．Ｇ．Ｄ．Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ，　Ｎ．Ｃ．Ｔｒ
ａｂｏｌｄ，　Ｊ．Ａ．Ｃｏｌｌｉｎｓ　及び　Ｌ．Ｗ
．Ｈｏｙｅｒ，　Ｊ．　ｏｆ　Ｌａｂ．Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９７９）９３：４０により
最初に記載された方法によるポリクローナル抗ＶＩＩＩ
Ｒ−セファロースカラムを用いるイムノソルベントクロ
マトグラフィー；及びｂ）Ｄ．Ｅ．Ｇ．Ａｕｓｔｅｎ，
　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．　ｏｆ　Ｈｅｍｏｔｏｌｏｇｙ
　（１９７９）　４３：６６９　により最初に記載され
たアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグラフ
的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファクタ
ーＶＩＩＩＣを単離した。

【００５５】この方法の詳細を次に記載する。アトラン
ティック・アンチボディー（Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ）　から得られたヤギ抗−ヒトファクターＶ
ＩＩＩ関連抗原（ＶＩＩＩ：Ｒ）血清（カットＮｏ．０
４０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモニウムカッ
トで処理し、次にＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグ
ラフィーにかけ、又は同様の０−３３％カットで処理し
、次にクロマトグラフィーを行わなかった。次にこれら
の物質をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セファロースＣＬ２
Ｂ又は４Ｂ（ファルマシア、１７−０１４０−０１又は
１７−０４３０−０１）と接合せしめ、そしてカラムに
注入した（抗ＶＩＩＩ：Ｒ−セファロースカラム）。

【００５６】”ＨＥＭＯＦＩＬ”　、すなわち正常なヒ
トの新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（
ファクターＶＩＩＩＣ、ＡＦＨ，　ＡＨＧ）の安定な乾
燥標品（ファクターＶＩＩＩＣについて約４０倍に濃縮
されている）を、０．０２Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ
　ＮａＣｌ　、０．１Ｍリジン−ＨＣｌ　、０．０２％
　ＮａＮ３　を含むｐＨ７．４の緩衝液に溶解した。溶
解した後、　ＨＥＭＯＦＩＬを上記の抗ＶＩＩＩ：Ｒ−
セファロースカラムに適用した。非特異的に結合した蛋
白質を０．５Ｍ　ＮａＣｌ　に変性された上記の緩衝液
によって溶出した。

【００５７】次に、０．３５Ｍ　ＣａＣｌ２を含有する
上記の緩衝液を用いて、ファクターＶＩＩＩＣ活性を安
定化する１０％グリセリンを添加して、ファクターＶＩ
ＩＩＣを溶出した。イムノソルベントカラムからの活性
画分をプールし、緩衝液（０．０２Ｍイミダゾール、０
．１５Ｍ　ＮａＣｌ　、０．１Ｍリジン−ＨＣｌ　、　
０．０２５Ｍ　ＣａＣｌ２、０．０２％　ＮａＮ３　、
１０％グリセリン、ｐＨ７．４）に対して透析した。　
１，１００ユニットのファクターＶＩＩＩＣを含有する
透析された画分のアリコートを、上記の透析緩衝液で平
衡化されたアミノヘキシル−セファロース４Ｂカラム（
１×６ｃｍ）に適用した。ファクターＶＩＩＩＣを０．
３５Ｍ　ＣａＣｌ２又は２Ｍ　ＮａＣｌ　を含有する同
じ緩衝液で溶出した。５００ユニット／ｍｌのファクタ
ーＶＩＩＩＣを含有する２ｍｌの容積中に活性が存在す
ることが見出された。

【００５８】同様にして行った後続の実験により、抗Ｖ
ＩＩＩ：Ｒカラムにおける２５％引きの収量及びアミノ
ヘキシルカラムにおける約９０％引きの収量が得られた
。上記の方法に代えて、イムノソルベントカラムから溶
出され、プールされ、透析された物質をまず、上記の透
析緩衝液で平衡化されたデキストランサルフェート（フ
ァルマシア）カラムに適用し、そして同じ緩衝液により
溶出する。若干の微量汚染物、例えばフィブリノーゲン
、フィブロネクチン、　ＩｇＧはカラム上に保持され、
ファクターＶＩＩＩＣは流過液中に現われる。この液を
集め、そして前記のアミノヘキシル−セファロースカラ
ムに負荷する。

【００５９】後続の測定により、精製されたファクター
ＶＩＩＩＣ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び
抗原（ｃＡｇ）　活性が存在し、　ＨＥＭＯＦＩＬ中の
４０倍濃縮よりさらに　５，０００倍濃縮されているこ
とが示された。ゼネラル・ジアグノスティクス（Ｇｅｎ
ｅｒａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　製の市販の標準
的３成分キット〔ＡＰＴＴ、ファクターＶＩＩＩ欠損血
漿、ベリファイ・ノーマル・シトレート（Ｖｅｒｉｆｙ
　Ｎａｒｍａｌ　Ｃｉｔｒａｔｅ）　〕を用いて凝固測
定を行った。ファクターＶＩＩＩＣの高レベルの生物学
的活性が示された。

【００６０】使用する抗体は阻害患者から得た。コート
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。 ２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはＨＺａｂをＩ１２５　でラベルし、　
ＥＬＩＳＡ測定においてはＨＺａｂをホースラディッシ
ュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）　と接合せしめる。Ｒ
ＩＡのための　１２５Ｉによる抗体ＨＺのラベル化はＨ
ｕｎｔｅｒ　Ｗ．Ｍ．，　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ，　Ｗｅｉｒ　Ｄ．Ｍ編、Ｈａｎｄ　ｂｏｏｋ　
ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、第３版、Ｖｏｌ　１，　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オック
スフォード、１９７８に従って行った。

【００６１】ＨＲＰ−ＨＺ接合はＷｉｌｓｏｎ及び　Ｎ
ａｋａｎｅ，　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ
　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　ＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，　Ｋｎｏｐｐ等編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，
　Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
　Ｐｒｅｓｓ、アムステルダム、１９７８、　２１５−
２２４　頁に従って行った。ＬＺは７００　Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａユニット／ｍｌの活性を有し、ＨＺは１，５００
　Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの活性を有していた
。

【００６２】コート抗体（ＬＺ）は、０．１Ｍ　ＮａＨ
ＣＯ３（ｐＨ９．８）　中（ＲＩＡ）　又は０．０５Ｍ
イミダゾール、０．１Ｍ　ＮａＣｌ　、０．０１Ｍチメ
ロサール、０．０５％トウィーン２０、５％　ＢＡＳ中
（ＥＬＩＳＡ）　、あるいは両方法のためにＰＢＳ−Ｃ
ＭＦ（１ｌにつき、２００ｍｇ　ＫＣｌ　、２００ｍｇ
　ＫＨ２ＰＯ４、８．０ｇ　ＮａＣｌ　、１．１５ｇ無
水Ｎａ２ＨＰＯ４　、ｐＨ７．４）　中に３．５μｇ／
ｍｌに溶解し、そして１ｍｌを各チューブ（ポリスチレ
ン）に加え、そして室温にて一夜インキュベートした。 この溶液を吸引除去し、そしてチューブを０．０５％の
トウィーン２０を含有する０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　又は
ＰＢＳ−ＣＭＦ　３〜３．５ｍｌで３回洗浄した。

【００６３】サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノ
スティクス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタ
ログ＃３４１１２）を稀釈し、そして全容量がチューブ
当り０．９ｍｌとなるようにチューブに加え、そして室
温にて一夜インキュベートする〔稀釈は、０．０２Ｍ　
Ｔｒｉｓ　、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　、５％　ＢＳＡ、
０．０５％トウィーン２０、０．０１％チメロサール、
ｐＨ６．５（ＲＩＡのため）中に；又は０．０５Ｍイミ
ダゾール、０．１Ｍ　ＮａＣｌ　、０．０１％チメロサ
ール、０．０５％トウィーン２０、５％　ＢＳＡ（ＥＬ
ＩＳＡのため）　中に；あるいはＰＢＳ−ＣＭＦ（両方
法のため）　中に行った〕。

【００６４】溶液を吸引除去し、そしてチューブを上記
のようにして洗浄した。ＲＩＡについては、　６００μ
ｌのＲＩＡ稀釈緩衝液中ファクターＶＩＩＩＣに対する
　１２５Ｉ−ラベル抗体（ＨＺ）５×１０５ｃｐｍを各
チューブに加え、このチューブを３７℃にて１６〜１８
時間インキュベートし、溶液を除去し、チューブを上記
のようにして洗浄し、そしてガンマーカウンターにより
計数した。

【００６５】ＥＬＩＳＡについては、抗−ファクターＶ
ＩＩＩＣ（ＨＺ）に接合したパーオキシダーゼ０．９ｍ
ｌを各チューブに加え、次にこれを室温にて一夜インキ
ュベートし、溶液を除去し、そしてチューブを前記のよ
うにして洗浄し、次に０．９ｍｌのＯＰＤ溶液（１００
ｍｌについて、０．３７ｇクエン酸、１．１９ｇ燐酸二
ナトリウム、０．１５ｇ　　ｏ−フェニレンジアミン、
ｐＨ５．０、使用直前に１０％　Ｈ２Ｏ２　を　２５０
μｌ添加）　を加え、そして暗中、室温にて３０分間イ
ンキュベートした。この反応を停止するために０．５ｍ
ｌの６Ｎ　ＨＣｌ　（又は０．９ｍｌの１Ｍ　Ｈ２ＳＯ
４）　を各チューブに加え、そしてＯＤ４９２　を読み
取った。

【００６６】ＩＩ．ファクターＶＩＩＩＣ複合体の構造
Ａ．免疫沈澱実験 次の条件：０．１％インシュリン（安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として）、０．２５Ｍ　ＣａＣｌ２、０．
０１％チオメロサール、０．０５Ｍイミダゾール、ｐＨ
７．２のもとで、精製されたファクターＶＩＩＩＣ物質
についてＡｃＡ　４４カラムを用いてゲル濾過実験を行
った。溶出液のファクターＶＩＩＩＣ凝固活性及び抗原
活性を監視した。２つの抗原ピークが観察された。ファ
クターＶＩＩＩＣ凝固活性を有するものはこれらの条件
下で約　４６０，０００の見かけ分子量を有する複合体
として挙動した（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪
失している）は６７，０００よりわずかに低い観察され
た分子量において溶出した。

【００６７】標準的分析用　Ｌａｅｍｍｌｉ　ＳＤＳ−
ゲル電気泳動〔Ｌｅａｍｍｌｉ，　　Ｎａｔｕｒｅ　（
１９７０）　２２７　：６８０−６８５　〕により分析
した場合、２４０，　１６０，　１４０，　１１５，　
９２．５，　８０及び７７ｋｄの種々の蛋白質種が得ら
れた。これらの蛋白質とファクターＶＩＩＩＣとの関係
を標準的免疫沈澱法により決定した。この免疫沈澱法に
おいては、遊離の　１２５Ｉ−ラベルファクターＶＩＩ
ＩＣから抗原−Ａｂ　複合体を分離するために、アフィ
ニティー精製された第２抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ　
又は抗−ヒトＩｇＧ）をコートしたポリスチレンビーズ
〔１／８インチ、プレシジョン・プラスチック・ボール
社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａｌｌ　
Ｃｏ．）〕又はＳ．アウレウス（Ｓ．　ａｕｒｅｕｓ　
）蛋白質Ａ−セファロースＣＬ４Ｂを使用した。

【００６８】アフィニティーカラムから溶出した蛋白質
をヨウ素化し、そしてファクターＶＩＩＩＣに特異的な
抗体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単
離されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターＶＩＩＩ
Ｃ（Ｚ）及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と
称される。

【００６９】この結果は、両抗体が７７／８０ｋｄダブ
レットと反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに　２
４０ｋｄバンド強く反応し、そしてダブレットと　２４
０ｋｄ種との間の複数のバンド（１６０，　１４０，　
１１５，　９２．５ｋｄ）　の弱い沈澱をもたらす。“
Ｚ”抗体はまた９２．５ｋｄ及び　２４０ｋｄ蛋白質を
沈澱せしめる。“Ｅ”抗体と２４０ｋｄ種との強い反応
は、この種がファクターＶＩＩＩＣの前駆体であること
を示唆する。

【００７０】抗体カラムで精製したファクターＶＩＩＩ
Ｃ画分をヨウ素化し、そしてＥＧＴＡ〔エチレングリコ
ールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′，−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターＶＩＩＩＣポリペ
プチドの会合における２価陽イオン、特にＣａ＋＋の役
割の研究を可能にする。阻害抗体（Ｅ）は７７／８０ｋ
ｄダブレット、並びに　１６０，　１４０，　１１５及
び９２．５ｋｄの一層分子量の高い種を沈澱せしめるこ
とが観察された。ダブレットは常に一層強いバンドの間
に存在する。（この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズ
を用いて行った。この方法は低いバックグラウンドをも
たらし、ファクターＶＩＩＩＣ標品中のラベルされた　
ＩｇＧは沈澱しない。）

【００７１】ＥＧＴＡを含有させることにより高分子量
バンド　（９２．５〜１６０ｋｄ）は消失するが、ダブ
レットの沈澱量は影響を受けない。イムノソルベントと
してセファロースに結合したＺ抗体を使用して同様の実
験を行った。精製したファクターＶＩＩＩＣをカラムに
適用し、そして７７／８０ｋｄを介して結合した後、Ｅ
ＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）により９２．５ｋｄ
ポリペプチドが選択的に溶出する。この方法は９２．５
ｋｄ種を分画調製するために使用される。このイムノソ
ルベントカラム又はこれに類似するものはファクターＶ
ＩＩＩＣに対するポリクローナル抗体を用いて調製され
る。

【００７２】ＥＧＴＡの代りにチャオトロピック溶剤又
は変性溶剤、例えばそれぞれチオシアナート溶液又は尿
素水溶液を用いて溶出する場合、ファクターＶＩＩＩＣ
はさらに精製される。これらの結果は９２．５ｋｄペプ
チドがＣａ＋＋橋を介して非共有結合的に７７／８０ｋ
ｄダブレットに会合していることを示唆する。より分子
量の高いバンド（１１５ｋｄ、１４０ｋｄ、１６０ｋｄ
）はおそらく９２．５ｋｄの前駆体であろう。このこと
は、９２．５ｋｄポリペプチドに対するモノクローナル
抗体の　１１５ｋｄ、　１４０ｋｄ及び　１６０ｋｄポ
リペプチドと交差反応する能力により示される。

【００７３】アフィニティーカラムからの種々の蛋白質
種の関係を、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ〔Ｅｕｒ．Ｊ．　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９７
５）　６：５１１　〕の方法によって調製したモノクロ
ーナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファクタ
ーＶＩＩＩＣの免疫沈澱により示した。Ｂａｌｂ／ｃ　
マウスを液相免疫吸着されたファクターＶＩＩＩＣによ
り免疫した。 脾臓細胞（１０８個）　を１０１１個のＮＳＯ又はＮＳ
Ｉマウス骨髄腫細胞と融合させた。

【００７４】融合生成物を２枚の９６ウエルミクロタイ
タートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を　
１０４細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から
顕微鏡観察でき、そして上清液は数日毎に　ＥＬＩＳＡ
法により測定した。次の層を使用した。第１層：前記Ｉ
における、ヘキシル−セファロース４Ｂカラムから溶出
したファクターＶＩＩＩＣ；第２層：ハイブリドーマ細
胞上清液；第３層：ホースラディッシュ・パーオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）　−ラベルしたヤギ抗−マウス　ＩｇＧ
；第４層：ＨＲＰ−基質。

【００７５】モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同
定され、その２つはファクターＶＩＩＩＣ凝固活性を阻
害した。クラスＩ抗体は８０／７７ｋｄダブレット及び
　２４０ｋｄポリペプチドと反応し；そしてクラスＩＩ
抗体は２４０，　１６０，　１４０，　１１５，　９２
．５ｋｄの蛋白質と反応した。スロンビン消化したファ
クターＶＩＩＩとクラスＩモノクローナル抗体との免疫
沈澱は、生成した７０／６７ｋｄダブレットが７７／８
０ｋｄダブレットに由来することを示す（下記参照のこ
と）。クラスＩＩＩ　モノクローナル抗体は、１６０，
　１４０及び　１１５ｋｄペプチドが９２．５ｋｄペプ
チドの前駆体であることを示す。クラスＩＩＩ　のモノ
クローナル抗体はさらに、精製されたファクターＶＩＩ
ＩＣ物質のスロンビン消化により生成した４０ｋｄペプ
チドとも反応する。

【００７６】ファクターＶＩＩＩＣ複合体中のＣａ＋＋
イオンの役割を研究するため、ＥＧＴＡを用いて上記と
同様の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を
用いて、次の層による　ＥＬＩＳＡ法に基いて行った。 第１層：単一特異性抗（マウスＩｇＧ）；第２層：クラ
スＩＩＩ　モノクローナル抗体（抗−９２．５ｋｄ）；
第３層：精製ファクターＶＩＩＩＣ物質；第４層：７７
／８０ｋｄに対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。 ＥＧＴＡの添加により、キレート剤を用いない対照に存
在する結合ＨＲＰ活性が除去された。それぞれ７７／８
０ｋｄダブレット及び９２．５ｋｄ蛋白質に向けられた
クラスＩ及びクラスＩＩＩ　のモノクローナル抗体がそ
れぞれファクターＶＩＩＩＣ凝固活性に対して阻害的で
ある事実は、両者がファクターＶＩＩＩＣ複合体の本質
的構成成分であることを示唆している。

【００７７】Ｂ．ファクターＶＩＩＩＣのスロンビンに
よる活性化 アミノヘキシル濃縮、アフィニティー精製したファクタ
ーＶＩＩＩＣを、２種類の異るｐＨ条件（６．８及び７
．４）を用いて、スロンビン〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ）、ロット＃１０７２３０２　〕により活
性化した。

【００７８】アリコートを凝固活性について測定し、そ
してさらに、サンプル（それぞれ約２．５ユニット）を
ゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験にお
いて、ＶＩＩＩＣ活性は最初４６ユニット／ｍｌであっ
た。これを、ファクターＶＩＩＩＣ緩衝液（２０ｍＭイ
ミダゾール、ｐＨ６．８、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１
００ｍＭリジン、２５ｍＭ　ＣａＣｌ２及び１０％グリ
セリン）中に最終濃度１１．５ユニット／ｍｌに稀釈し
た。

【００７９】スロンビンの最終濃度を０．１２ユニット
／ｍｌ（ＶＩＩＩＣの　１００凝固ユニット当り約１ユ
ニットのスロンビン）とした。この結果、凝固活性は約
　１８０ユニット／ｍｌに上昇しそして約４０ユニット
／ｍｌ（実質上出発値）に低下し、これは９２．５ｋｄ
種の量の同様な増加及び減少に伴って生じた。従って、
９２．５ｋｄ種は活性なファクターＶＩＩＩＣ複合体の
部分であることが示唆される。

【００８０】製造的方法においてスロンビン活性化を用
いる目的で、一層濃縮されたファクターＶＩＩＩＣ標品
を用いて追加の実験を行った。９２．５ｋｄポリペプチ
ドを生成せしめるため、１ユニットのスロンビン活性に
対して約１０００〜２０００凝固ユニットのファクター
ＶＩＩＩＣの比率で、スロンビンを精製ファクターＶＩ
ＩＩＣ物質に加え、そして短時間（ＦＥＭＯＦＩＬサン
プルに依存して５〜１５分間）　のみ反応せしめた。次
に、得られた生成物を７．５％調製用ゲルに適用し、そ
してペプチドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切
り出し、そして電気溶出した。

【００８１】スロンビン消化を短時間行う場合、９２．
５ｋｄ種の量は２倍又は３倍になり、同時に、７７／８
０ｋｄダブレットは部分的にのみ６７／７０ｋｄ種に転
換される。６７／７０ｋｄダブレットを単離するための
条件を最適にするためには、より長時間（１時間以上）
のスロンビン消化を行う。この場合、９２．５ｋｄ種は
、さらに切断されてさらに小さい断片が生ずる。スロン
ビン処理の後、２種類の新たなペプチドである５２．５
ｋｄ及び４０ｋｄペプチドが生ずる。４０ｋｄペプチド
は９２．５ｋｄ種に対するモノクローナル抗体と反応し
、従って切断生成物でなければならない。

【００８２】５２．５ｋｂペプチドも９２．５ｋｄ蛋白
質に由来し、このことは、化学的及び酵素的切断パター
ンの比較により、すなわち９２．５ｋｄ種及び５２．５
ｋｄ種をＣＮＢｒ又はエンドプロテイナーゼＬｙｓＣ切
断にかけた場合に多数の共通の断片が生ずる（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる）ことにより証明される。エンドプロテ
イナーゼｌｙｓＣ消化のため、ｌｙｓＣと蛋白質との比
率を約１：１〜１００　、通常は１：１０とする。この
消化において、２０ｐモル（４．８μｇ）のｌｙｓＣを
、約　１００μｌの　０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
　、ｐＨ７．７、　０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ　、０．０
８％　ＳＤＳ中で　２００ｐモル（１４μｇ）の７０ｋ
ｄポリペプチドと混合し、そして混合物を３７℃にて６
時間〜一夜インキュベートして消化を完結した。ｌｙｓ
Ｃ消化生成物の単離のために、Ｏｒｓｔｅｎ，　Ａｎｎ
．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　（１９６４）　１２１
：３２１−３４９　のネイティブ・ポリアクリルアミド
ゲルを使用した。

【００８３】Ｃ．ゲル単離したＶＩＩＩＣ関連蛋白質の
スロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するため
、調製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分離
し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結果
は次の通りであった。

【００８４】１．　　　２４０ｋｄ蛋白質は　１６０，
　１４０，　１１５，　９２．５ｋｄを含む多数のバン
ドを生成するが、一層小分子量のバンド、すなわち７７
／８０ｋｄ又は６７／７０ｋｄダブレットを生成しない
。さらに、　２４０ｋｄ断片を経時消化し、そしてゲル
電気泳動パターン、凝固活性、及びファクターＶＩＩＩ
Ｃ抗原（Ｃａｇ）　活性について分析した。ゲルパター
ンの結果は上記と同様であり、そして　Ｃａｇ活性又は
凝固活性は実質上回収されなかった。

【００８５】２．　　　１６０ｋｄ及び９２．５ｋｄゲ
ル分離ポリペプチドは、ゲルから分離した後スロンビン
の基質ではないようである。 ３．　　スロンビンはゲル分離された７７ｋｄ及び８０
ｋｄ種を、それぞれ６７ｋｄ及び７０ｋｄの新たなポリ
ペプチドに特異的に切断する。スロンビン処理の後、ク
ラスＩのモノクローナル抗体は７７／８０ｋｄダブレッ
トのみならず新たな６７及び７０ｋｄ種も沈澱せしめる
。

【００８６】Ｄ．アミノ酸配列分析 調製用ＳＤＳ電気泳動により単離された６７／７０ｋｄ
ペプチド、７７／８０ｋｄペプチド、及び５２．５ｋｄ
ペプチドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配
列情報を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と
相まって、７７／８０ｋｄ、６７／７０ｋｄ、９２．５
ｋｄ及び５２．５ｋｄポリペプチドが９５％以上、通常
は９８％の純度で得られたことを示した。ゲル単離され
たペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライド・ビ
オシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）〕に適用した。ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰＬＣカラム（
ＩＢＭシアノ、２５ｃｍ）に適用し、そして得られたク
ロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。

【００８７】６７／７０ｋｄダブレットのアミノ端（配
列表Ｂ中棒により示す）について次の配列が決定された
。

【表８】

【００８８】６７／７０ｋｄ蛋白質のＮ−端領域のアミ
ノ酸配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムラ
イブラリーのスクリーニングに使用するために次のオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成した。　Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄ
ｅａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ　（１９８３）　８０：７４６１−７４６５に記載さ
れているホスホラミデート法を使用した。

【００８９】

【表９】 次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配列の領域のス
キームを示す。

【００９０】

【表１０】

【００９１】後記のように９２．５ｋｄ蛋白質に由来す
る５２．５ｋｄ蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ
酸配列が決定された。

【表１１】

【００９２】５２．５ｋｄペプチドのアミノ酸配列に基
いて、次のヌクレオチド配列（コード配列）を有する部
分変性プローブを合成した。

【表１２】

【００９３】このプローブは、ゲノムライブラリー及び
ｃＤＮＡライブラリーの両者をスクリーニングするため
に有用である。７７／８０ｋｄダブレットをエンドプロ
テイナーゼＬｙｓＣ（ベーリンガーマンハイム）によっ
て消化することにより得られた２種類のペプチドのアミ
ノ酸配列を決定した。次のようにして消化を行った。７
７／８０ｋｄダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上
で電気泳動し、そしてダブレットに対応するバンドを電
気溶出した。分離された物質を精製し、エンドプロテイ
ナーゼＬｙｓＣにより消化し、そして生成したペプチド
を逆相ＨＰＬＣにより分離した。　２８０ｎｍでの吸光
ピークに対応する画分を、自動シーケンサー（アプライ
ド・ビオシステムス，フォスターシティー，カリホルニ
ア，モデルＡ７０Ａ）　を用いて配列決定した。

【００９４】第１配列は次の通りであった。

【表１３】 このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。

【表１４】 第２ペプチドは次の配列を有していた。

【表１５】

【００９５】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。

【表１６】

【００９６】さらに、７７／８０ｋｄダブレットをトリ
プシンにより消化した。ダブレット物質を、エンドプロ
テイナーゼＬｙｓＣによる消化について上記したのと同
様にして精製し、リジンをシトラコニル化（ｃｉｔｒａ
ｃｏｎｙｌａｔｉｏｎ）　によりブロックしてアルギニ
ンにおいてのみ消化されるようにした。シトラコニル化
は、蛋白質を変性緩衝液に懸濁し、懸濁された蛋白質を
還元しそしてカルボキシメチル化し、そしてｐＨを８．
５〜９．０に保持しながら無水シトラコン酸で処理した
。シトラコニル化した後、蛋白質をトリプシンで消化し
、そして生成したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離し
た。　２８０ｎｍにおける吸光ピークに対応する画分を
上記のようにして配列決定した。配列を次に示す。

【００９７】

【表１７】 このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。

【表１８】

【００９８】８０及び７７ｋｄ種のＮ−端配列を決定す
るための方法を実施した際、これらのアミノ端がブロッ
クされていることが見出された。従って、Ｎ−端配列は
他の精製法により得られた物質から決定した。この精製
法はイムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオ
ン交換クロマトグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いない。８０／
７７ｋｄダブレットの精製を、ファクターＶＩＩＩＣ濃
縮物をモノクローナル抗体カラムに適用し、次にｍｏｎ
ｏ　Ｓ陽イオン交換体でクロマトグラフ処理することに
より行った。この物質はブロックされていないＮ−端を
有し、ゲル濾過された８０／７７ｋｄ中に検出されるブ
ロックはゲル電気泳動により生ずる人為的なものである
ことが示された。８０及び７７ｋｄ種について決定され
たアミノ端配列は次の通りである（配列表Ｂ中棒で示す
）。

【００９９】

【表１９】 Ｅ．アミノ酸組成 ７７／８０ｋｄペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法
により、次のように決定した。

【０１００】

【表２０】

【０１０１】Ｆ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製Ｇ
Ｍ１４１６細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト−
リンパ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から約
３ｍｇのＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ　３Ａにより部分消化し、そして消化されたＤＮＡ（
４００〜５００　μｇ）を１０％〜４０％シュークロー
スグラジエント上で画分した。１０〜２５ｋｂのサイズ
の範囲の画分をプールし、　Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で透
析し、そしてＳｃｈｌｉｅｃｈｅｒ及び　Ｓｃｈｅｕｌ
ｌのＥｌｕｔｉｐ−ｄ無菌ジスポーサブルカラムで精製
した。

【０１０２】このＤＮＡのアリコートをＥＭＢＬ−４ア
ーム（Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉで消化しそしてグ
ラジエント上で単離することにより得られる）に連結し
、そして次に１×１０６ｐｆｕ／μｇのＤＮＡ挿入効率
をもってバクテリオファージλにパッケージした。使用
したベクターＥＭＢＬ−４はバクテリオファージλの変
形物である〔Ｋａｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．　（１９８３）　１０１　：３−１９を参照のこ
と〕。全ライブラリーは５×１０６　個のファージから
成る。

【０１０３】Ｇ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーのプレー
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリＤＰ５０株に吸着せしめ
、そして２０枚のプレートにプレート（大きさ　１５０
×１５ｍｍ）当り　５０，０００ｐｆｕとしてプレーテ
ィングし、合計１×１０６ｐｆｕとした。（プレート、
上層寒天、及びプレーティングの詳細な技法は、Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，　Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂ、ニューヨーク、１９８２，　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ中に記載されている。）

【０１０４】ニトロセルロースフィルターを、ファージ
プラークを有する各プレートの表面に２回適用し（こう
してパッケージされていないＤＮＡの分子をフィルター
に移す）、そして３２Ｐ−ラベルされた　２５６倍の４
８マープローブＤＮＡ（プローブ＃４）とハイブリダイ
ズせしめた。（ニトロセルロース移行法の詳細はＭａｎ
ｉａｔｉｓ等、前掲、に記載されている。）前−ハイブ
リダイゼーション及びハイブリダイゼーションは　Ｗａ
ｌｌａｃｅミックス（１ｌ中に　３１０ｍｌの蒸留水、
　２００ｍｌの５０％デキストランサルフェート、　１
８０ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　、ｐＨ８．２、　
２２５ｍｌの４Ｍ　ＮａＣｌ　、２０ｍｌの０．２５Ｍ
　ＥＤＴＡ　、５０ｍｌの　１００×　Ｄｅｎｈａｒｔ
溶液、５ｍｌの　１００％　ＮＰ−４０、及び１０ｍｌ
の１０％　ＳＤＳを含む）中で行った。

【０１０５】プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを触媒として用いて、γ−ＡＴＰ３２　から各ＤＮＡ
分子の５′ホスフェート端に　３２ＰＯ４を酵素的に移
行せしめることによりラベルした。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は次の通りとした。１０ｍｌのハイブリダイ
ゼーション混合物／フィルター×５０００ｃｐｍ　のラ
ベル化プローブ＃４（変性）／ｍｌ。ハイブリダイゼー
ションは３７℃にて一夜行った。フィルターを、６×Ｓ
ＳＣ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　中、５０〜５５℃にて洗浄
し、空気乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴露した。

【０１０６】Ｈ．陽性クローンの特徴付け第１回スクリ
ーニングにおいて陽性であった２３個のプラークを再プ
レートし、ファージＤＮＡをニトロセルロースに移し、
そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブリダイズ
せしめた（第２回）。１１個の陽性プラークを再プレー
トし、ファージＤＮＡをニトロセルロースに移し、そし
て新たにラベルしたプローブ＃４とハイブリダイズせし
めた（第３回）。８個の陽性プラークを分離し、そして
ＤＮＡを調製した（それぞれ　１００ｍｌずつの液体培
養）。これら８個のクローンのそれぞれに対応するＤＮ
ＡをＥｃｏ　Ｒ　Ｉで消化し（挿入されたヒト−ゲノム
ＤＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめるため）
、そして生成した断片を０．８％アガロースゲル上での
電気泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そして
ニトロセルロースに移した。

【０１０７】これを４通り行い、そして各フィルターを
３２Ｐ−ラベルプローブ＃１，２，３又は４とハイブリ
ダイズせしめた。フィルターをＸ線フィルムに暴露し、
そして約４．４ｋｄサイズの単一バンドが４種類のすべ
てのプローブとハイブリダイズすることが、２個のクロ
ーンについて見出された。これら２個のクローンは、１
方が他方に比べて大きなＤＮＡ挿入部を有する点を除き
同一であった（１５．２１ｋｂの大挿入部を有するクロ
ーンを２３Ｄと称し、約１３ｋｂの小挿入部を有するク
ローンを１１と称する）。４．４ｋｂのゲル単離された
Ｅｃｏ　Ｒ　Ｉ断片をベクターＭ１３及び　ｐＵＣ−９
（ｐＢＲ３２２の誘導体）中にサブクローン化した。プ
ライマーとして合成プローブ＃３及びその逆相補体を用
いて　Ｍ１３　ＤＮＡ上でジデオキシ法によりＤＮＡ配
列の決定を行った。

【０１０８】４．４ｋｂ断片の部分配列を次のように決
定した。この配列は（　　）で示すプローブ＃４の配列
、及び〔　　〕で示すはじめに決定された６７／７０ｋ
ｄ断片の部分アミノ酸配列を含む。

【０１０９】

【表２１】

【０１１０】従って、このクローンは７７／８０ｋｄダ
ブレット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は
前記のごとくヒト−ファクターＶＩＩＩＣ複合体に部分
的に対応する。

【０１１１】クローン２３ＤをＥｃｏ　Ｒ　Ｉ断片とし
てファージＭ１３中にサブクローン化し、そして挿入さ
れたヒトＤＮＡに対応する配列を決定した。クローン２
３Ｄの完全な１５．１２１ｋｂ配列を表１（配列表Ａ）
に示す。サブクローンの名称が配列の右側の欄外に示さ
れており、３′−方向に伸びるＥｃｏ　Ｒ　Ｉ−Ｅｃｏ
　Ｒ　Ｉを示している。　３．１１０ｋｂのオープンリ
ーディングフレームが７０−３断片の３′−末端から４
．４ｋｂ断片の中間にわたって存在することが見出され
た。従って、このオープンリーディングフレームは７７
／８０ｋｄダブレット蛋白質のコード領域の少なくとも
部分を含む。

【０１１２】Ｉ．ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの比較３個の
ｃＤＮＡクローンを次のようにして得た。クローンＣ１
は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをクローン２３Ｄの
４．４ｋｂ　　Ｅｃｏ　Ｒ　Ｉ断片から構成したプロー
ブでスクリーニングすることにより得た。クローンＣ２
もまた、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを４．４ｋｂプ
ローブでスクリーニングすることにより得た。クローン
２−１１は、ヒト腎臓細胞をクローン２３Ｄのオープン
リーディングフレームの３′−末端に見出されるＤＮＡ
配列（配列表Ａのヌクレオチド９３９１〜９４３５）に
基く合成４５−マープローブでスクリーニングすること
によって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列か
ら成る。

【０１１３】非コード鎖（プローブ）…

【表２２】

【０１１４】クローンを配列決定し、そしてクローン２
３ＤのゲノムＤＮＡに対するこれらｃＤＮＡクローンの
位置を、配列を比較することによって決定した。　３０
４ｂｐの長さを有するクローンＣ１は配列表Ａ中の番号
におけるヌクレオチド７７７３から８０７７までのオー
プンリーディングフレームに重なる。　８７８ｂｐの長
さを有するクローンＣ２はオープンリーディングフレー
ムの３′−端と部分的に重なり、ヌクレオチド９５３８
から始まりそしてオープンリーディングフレーム３′−
端にあるヌクレオチド９４９７を越えて伸びる。　５７
２ｂｐの長さを有するクローン２−１１もオープンリー
ディングフレームの３′−端と重なり、ヌクレオチド９
１９０から始まりそしてその末端を越えて伸びる。これ
らの知見はオープンリーディングフレームが転写される
ことを確認するものである。

【０１１５】４．４ｋｂオープンリーディングフレーム
からのコード情報をクローン２−１１及びＣ２からの追
加のコード情報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべての
コード配列に対応する　３．８４１ｋｂの配列を調製し
そして伸ばすことができる。Ｃ１，Ｃ２、及びＣ２−１
１プローブに対応する領域を枠で囲んである。

【０１１６】ファクターＶＩＩＩＣを製造するために、
クローン２３又はクローン１１からのＤＮＡ配列を、Ｌ
ａｕｂ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９８３）　４８
：２７１　により記載されているようにＳＶ−４０プロ
モーターに挿入してＳＶ−４０初期プロモーターの制御
のもとにおく。得られた組換プラスミドをＣＯＳ細胞（
Ｇｕｚｍａｎ、前掲）にトランスフェクトする。

【０１１７】この方法に代えて、コード配列を、　Ｍａ
ｌｏｎｅｙネズミサルコーマウイルスの長ターミナルレ
ピートが挿入されているｐＢＲ３２２のごときプラスミ
ドに挿入し、クローン２３又は１１の配列をウイルス性
制御系の転写制御のもとにおくことができる。次に、構
成物を３Ｔ３マウス線維芽球に導入して効率的に発現せ
しめることができる（Ｐｅｒｋｉｎｓ等、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，
　１９８３年７月、　Ｖｏｌ　３，　Ｎｏ．６，　１１
２３頁を参照のこと）。

【０１１８】上記の結果は、ファクターＶＩＩＩＣ複合
体のサブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離され
たことを示す。このゲノムＤＮＡを使用することにより
、ＤＮＡをさらに操作してファクターＶＩＩＩＣ複合体
サブユニットをコードする配列を得ることができる。次
に、このＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクター
ＶＩＩＩＣサブユニットを製造することができ、これを
種々の方法で、例えば診断測定のための試薬として、療
法剤として、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体の製造のために使用することができ、これらの抗体は
次にファクターＶＩＩＩＣ複合体の製造のため、又は他
の目的のために使用することができる。ゲノムＤＮＡ配
列はまた、プロ−ファクターＶＩＩＩＣをコードするｍ
ＲＮＡの単離のために使用して、前駆体蛋白質を得るこ
とができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシングのた
めに用いることができる。

【０１１９】この発明の方法は、６７／７０ｋｄダブレ
ットをコードする配列の５′−端に又はそれに隣接して
いる特異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異
的配列はまた、７７／８０ｋｄダブレットのコード配列
中５′−端から約　２００〜４００　塩基、さらに正確
には約　２７５〜３２５　塩基下流に存在する。

【０１２０】なお、１４．４５ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ　Ｉ断
片を含有するバクテリオファージλＦＶＩＩＩ　２３Ｄ
は１９８４年１月４日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に、Ｎｏ．４
００９４として寄託された。

【０１２１】

【表２３】

【０１２２】

【表２４】

【０１２３】

【表２５】

【０１２４】

【表２６】

【０１２５】

【表２７】

【０１２６】

【表２８】

【０１２７】

【表２９】

【０１２８】

【表３０】

【０１２９】

【表３１】

【０１３０】

【表３２】

【０１３１】

【表３３】

【０１３２】

【表３４】

【０１３３】

【表３５】

【０１３４】

【表３６】

【０１３５】

【表３７】

【０１３６】

【表３８】

【０１３７】

【表３９】

【０１３８】

【表４０】

【０１３９】

【表４１】

【０１４０】

【表４２】

【０１４１】

【表４３】

【０１４２】

【表４４】

【０１４３】

【表４５】

【０１４４】

【表４６】

【０１４５】

【表４７】

【０１４６】

【表４８】

【０１４７】

【表４９】

【０１４８】

【表５０】

【０１４９】

【表５１】

【０１５０】

【表５２】

【０１５１】

【表５３】

【０１５２】

【表５４】

【０１５３】

【表５５】

【０１５４】

【表５６】

【０１５５】

【表５７】

【０１５６】

【表５８】

【０１５７】

【表５９】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　次のヌクレオチド配列：【表１】 （配列中、２個のヌクレオチドが示されている部位には
   それらのいずれかのヌクレオチドが存在する）で表わさ
   れる個々のオリゴヌクレオチド又はそれらの組合わせを
   含んで成る、ファクターＶＩＩＩＣ遺伝子に対するプロ
   ーブ。