JPH0817697B2 - ファクターｖｉｉｉｃに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン - Google Patents
ファクターｖｉｉｉｃに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルラインInfo
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- JPH0817697B2 JPH0817697B2 JP3215060A JP21506091A JPH0817697B2 JP H0817697 B2 JPH0817697 B2 JP H0817697B2 JP 3215060 A JP3215060 A JP 3215060A JP 21506091 A JP21506091 A JP 21506091A JP H0817697 B2 JPH0817697 B2 JP H0817697B2
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- viiic
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
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- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ファクターVIIIＣは、血液凝固の
イントリンシック（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）経路に関与す
る血漿蛋白質である。このファクターは、遺伝的なＸ染
色体−連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個
体において欠損し又は不足している。ファクターVIIIＣ
は血漿中の濃度が非常に低く、そして一層大形の蛋白質
の分解中間体又は最終生成物であると考えられるため、
これを分離する場合非常に大きな困難に遭遇する。ファ
クターVIIIＣを分離しようとする場合、種々の分子量を
有する多様なポリペプチドの有意に不均一な複雑な混合
物が得られる。
イントリンシック（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）経路に関与す
る血漿蛋白質である。このファクターは、遺伝的なＸ染
色体−連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個
体において欠損し又は不足している。ファクターVIIIＣ
は血漿中の濃度が非常に低く、そして一層大形の蛋白質
の分解中間体又は最終生成物であると考えられるため、
これを分離する場合非常に大きな困難に遭遇する。ファ
クターVIIIＣを分離しようとする場合、種々の分子量を
有する多様なポリペプチドの有意に不均一な複雑な混合
物が得られる。
【０００２】従って、ファクターVIIIＣ由来の個々のポ
リペプチド又はポリペプチド群と選択的に反応すること
ができるモノクローナル抗体を製造することに大きな関
心が持たれている。
リペプチド又はポリペプチド群と選択的に反応すること
ができるモノクローナル抗体を製造することに大きな関
心が持たれている。
【０００３】
【従来の技術】米国特許第４，３６１，５０９号及びこ
の特許に引用されている文献にはファクターVIIIＣの精
製について記載されている。さらに、Fulcher 及びZimm
erman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９８２）７９：
１６４８−１６５２を参照のこと。Tuddenham 等、 J. o
f Lab. Clinical Medicine（１９７９）９３：４０−５
３にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIIIＣの
精製について記載されている。Austen. British J. Hem
atology （１９７９）４３：６６９−６７４にはファク
ターVIIIＣの精製のためのアミノヘキシル−セファロー
スの使用について記載されている。Weinstein 等、 Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA（１９８１）７８：５１３７
−５１４１にはファクターVIIIＣに対するスロンビンの
効果が検討されている。さらにKuo 等、Abstracts for
IX International Congress of Thrombosis and Hemost
asis（ストックホルム、１９８３年７月）を参照のこ
と。
の特許に引用されている文献にはファクターVIIIＣの精
製について記載されている。さらに、Fulcher 及びZimm
erman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９８２）７９：
１６４８−１６５２を参照のこと。Tuddenham 等、 J. o
f Lab. Clinical Medicine（１９７９）９３：４０−５
３にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIIIＣの
精製について記載されている。Austen. British J. Hem
atology （１９７９）４３：６６９−６７４にはファク
ターVIIIＣの精製のためのアミノヘキシル−セファロー
スの使用について記載されている。Weinstein 等、 Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA（１９８１）７８：５１３７
−５１４１にはファクターVIIIＣに対するスロンビンの
効果が検討されている。さらにKuo 等、Abstracts for
IX International Congress of Thrombosis and Hemost
asis（ストックホルム、１９８３年７月）を参照のこ
と。
【０００４】ハイブリテックデータシート（ハイブリテ
ック社、１１０８５トレヤナロード、サンジェゴ、カリ
ホルニア９２１２１）にはヒト−ファクターVIIIＣに特
異的なモノクローナル抗体（カタログ♯０４３２）が記
載されている。米国特許出願第４８１，１０３号及び第
５５６，５０８号に対応するデンマーク特許出願第５３
５１９号にはヒト−ファクターVIIIＣ及びそのポリペプ
チド断片に対するモノクローナル抗体の製造について記
載されている。このデンマーク特許出願に記載されてい
るモノクローナル抗体の幾つかはさらにZimmerman 等
（１９８３）Blood ６１：８０７にも記載されている。
Fass等（１９８２）は、ヒト−ファクターVIIIＣをモノ
クローナル抗体からエチレングリコール（５０％）を用
いて溶出することができる旨記載している。
ック社、１１０８５トレヤナロード、サンジェゴ、カリ
ホルニア９２１２１）にはヒト−ファクターVIIIＣに特
異的なモノクローナル抗体（カタログ♯０４３２）が記
載されている。米国特許出願第４８１，１０３号及び第
５５６，５０８号に対応するデンマーク特許出願第５３
５１９号にはヒト−ファクターVIIIＣ及びそのポリペプ
チド断片に対するモノクローナル抗体の製造について記
載されている。このデンマーク特許出願に記載されてい
るモノクローナル抗体の幾つかはさらにZimmerman 等
（１９８３）Blood ６１：８０７にも記載されている。
Fass等（１９８２）は、ヒト−ファクターVIIIＣをモノ
クローナル抗体からエチレングリコール（５０％）を用
いて溶出することができる旨記載している。
【０００５】
【発明の概要】ヒト−ファクターVIIIＣと反応性のモノ
クローナル抗体を産生する特定のハイブリドーマセルラ
インが提供される。セルライン４２，４７及び５６によ
って産生されるモノクローナル抗体は変性条件下でのフ
ァクターVIIIＣ物質の電気泳動により得られる８０／７
７kdダブレットと反応性である。セルライン１Ｂ９，２
Ｂ６及び２Ｆ６により産生されるモノクローナル抗体は
８０／７７kdダブレット及び２４０kd断片と反応する。
セルライン４Ｅ５及び５Ｂ１により産生されるモノクロ
ーナル抗体は２４０kd断片、９２．５kd断片及びその前
駆体、並びにファクターVIIIＣ物質の４０kdスロンビン
消化生成物と反応する。上記の抗体の内セルライン５６
により産生された抗体のみが凝固阻害を示す。
クローナル抗体を産生する特定のハイブリドーマセルラ
インが提供される。セルライン４２，４７及び５６によ
って産生されるモノクローナル抗体は変性条件下でのフ
ァクターVIIIＣ物質の電気泳動により得られる８０／７
７kdダブレットと反応性である。セルライン１Ｂ９，２
Ｂ６及び２Ｆ６により産生されるモノクローナル抗体は
８０／７７kdダブレット及び２４０kd断片と反応する。
セルライン４Ｅ５及び５Ｂ１により産生されるモノクロ
ーナル抗体は２４０kd断片、９２．５kd断片及びその前
駆体、並びにファクターVIIIＣ物質の４０kdスロンビン
消化生成物と反応する。上記の抗体の内セルライン５６
により産生された抗体のみが凝固阻害を示す。
【０００６】
【具体的な説明】ヒト−ファクターVIIIＣの種々のポリ
ペプチド断片と反応性のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが提供される。クラスＩハイブリドーマ
はファクターVIIIＣの８０／７７kdダブレットと反応す
るモノクローナル抗体又は２４０kd断片及び８０／７７
kdダブレットの両者と反応するモノクローナル抗体を産
生する。クラスIII ハイブリドーマは２４０kd断片、並
びに９２．５kd断片及びその前駆体と反応するモノクロ
ーナル抗体を産生する。クラスIII 抗体はファクターVI
IIＣ物質の４０kdスロンビン消化生成物との追加の反応
性を示す。
ペプチド断片と反応性のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが提供される。クラスＩハイブリドーマ
はファクターVIIIＣの８０／７７kdダブレットと反応す
るモノクローナル抗体又は２４０kd断片及び８０／７７
kdダブレットの両者と反応するモノクローナル抗体を産
生する。クラスIII ハイブリドーマは２４０kd断片、並
びに９２．５kd断片及びその前駆体と反応するモノクロ
ーナル抗体を産生する。クラスIII 抗体はファクターVI
IIＣ物質の４０kdスロンビン消化生成物との追加の反応
性を示す。
【０００７】ヒト−ファクターVIIIＣは、約４６０kdの
見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され得
る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際し、
種々の分子量、すなわち２４０，１６０，１４０，１１
５，９２．５，８０及び７７kdの多数の断片が生じ、後
２者はダブレットとして移動する。
見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され得
る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際し、
種々の分子量、すなわち２４０，１６０，１４０，１１
５，９２．５，８０及び７７kdの多数の断片が生じ、後
２者はダブレットとして移動する。
【０００８】免疫的関係を調べるためにこの発明のモノ
クローナル抗体を用いそして構造的関係を調べるために
切断パターンを用いながら、化学的切断及びスロンビン
切断を含むプロテアーゼ切断により断片を分析すること
により、９２．５kdポリペプチドが２４０，１６０，１
４０及び１１５ポリペプチドと関連しており、他方７７
／８０ダブレットは２４０kdポリペプチドとのみ共通の
抗原特性を有するらしいことが示される。さらに、７７
／８０kdダブレットはスロンビンにより６７／７０kdダ
ブレットに転換され、他方スロンビンで処理された精製
ファクターVIIIＣ中に存在する９２．５kdポリペプチド
はスロンビンにより直接的又は間接的に約４０及び５
２．５kdの２個のポリペプチドに切断される。
クローナル抗体を用いそして構造的関係を調べるために
切断パターンを用いながら、化学的切断及びスロンビン
切断を含むプロテアーゼ切断により断片を分析すること
により、９２．５kdポリペプチドが２４０，１６０，１
４０及び１１５ポリペプチドと関連しており、他方７７
／８０ダブレットは２４０kdポリペプチドとのみ共通の
抗原特性を有するらしいことが示される。さらに、７７
／８０kdダブレットはスロンビンにより６７／７０kdダ
ブレットに転換され、他方スロンビンで処理された精製
ファクターVIIIＣ中に存在する９２．５kdポリペプチド
はスロンビンにより直接的又は間接的に約４０及び５
２．５kdの２個のポリペプチドに切断される。
【０００９】この発明のモノクローナル抗体は種々の目
的のために有用である。例えば、これらの抗体は血漿か
ら全ファクターVIIIＣ複合体を単離するため、及び精製
された分離源からファクターVIIIＣの種々のポリペプチ
ド断片を単離するために使用することができる。さら
に、これらの抗体は、種々のイムノアッセイ法により血
漿中のファクターVIIIＣ及び関連ポリペプチドの存在を
検出するために使用することができる。適切なイムノア
ッセイ法はよく知られており、そして科学文献及び特許
文献に詳細に記載されている。
的のために有用である。例えば、これらの抗体は血漿か
ら全ファクターVIIIＣ複合体を単離するため、及び精製
された分離源からファクターVIIIＣの種々のポリペプチ
ド断片を単離するために使用することができる。さら
に、これらの抗体は、種々のイムノアッセイ法により血
漿中のファクターVIIIＣ及び関連ポリペプチドの存在を
検出するために使用することができる。適切なイムノア
ッセイ法はよく知られており、そして科学文献及び特許
文献に詳細に記載されている。
【００１０】この発明のモノクローナル抗体はさらに、
実質上同一の反応性を有するがアイソタイプ、結合親和
性等のごとき他の特性においてしばしば異なるモノクロ
ーナル抗体を産生する追加のハイブリドーマの調製を促
進するためにも使用することができる。このことは、も
とのファクターVIIIＣ中で抗体により認識される決定部
位を担持するこれらのポリペプチドを濃縮するためにモ
ノクローナル抗体を使用することにより達成される。便
利には、所望の抗体を用いてアフィニティーカラムを調
製することができる。
実質上同一の反応性を有するがアイソタイプ、結合親和
性等のごとき他の特性においてしばしば異なるモノクロ
ーナル抗体を産生する追加のハイブリドーマの調製を促
進するためにも使用することができる。このことは、も
とのファクターVIIIＣ中で抗体により認識される決定部
位を担持するこれらのポリペプチドを濃縮するためにモ
ノクローナル抗体を使用することにより達成される。便
利には、所望の抗体を用いてアフィニティーカラムを調
製することができる。
【００１１】次に、ファクターVIIIＣを適当な緩衝液中
でカラムに適用することにより抗体によって認識される
ポリペプチドが結合されよう。カラムを洗浄して非特異
的に結合した蛋白質を確実に除去した後、pHを調整し、
尿素を用い、又は他の穏和な変性条件を用いることによ
りカラムから注目のポリペプチドを放出することができ
る。次に抗体を単離し、そしてこれを用いて適当な宿主
を高度免疫し、そしてKohler及びMilstein（１９７
５）、Nature２５６：４９５、又はこの方法の最近の改
良法によりハイブリドーマを調製することができる。適
当な免疫化方法、不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ）方法、及びスクリーニング方法は後で詳細に記載
する。このような方法により、実質上同一の反応性を有
するがクラス、結合定数、宿主等において異なる種々の
抗体を得ることができる。
でカラムに適用することにより抗体によって認識される
ポリペプチドが結合されよう。カラムを洗浄して非特異
的に結合した蛋白質を確実に除去した後、pHを調整し、
尿素を用い、又は他の穏和な変性条件を用いることによ
りカラムから注目のポリペプチドを放出することができ
る。次に抗体を単離し、そしてこれを用いて適当な宿主
を高度免疫し、そしてKohler及びMilstein（１９７
５）、Nature２５６：４９５、又はこの方法の最近の改
良法によりハイブリドーマを調製することができる。適
当な免疫化方法、不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉ
ｏｎ）方法、及びスクリーニング方法は後で詳細に記載
する。このような方法により、実質上同一の反応性を有
するがクラス、結合定数、宿主等において異なる種々の
抗体を得ることができる。
【００１２】一般に、ハイブリドーマの調製においては
まず注目のファクターVIIIポリペプチドを用いてマウス
又は他の小哺乳動物を高度免疫する。免疫化のための特
定の方法はよく知られており、そして文献に詳細に記載
されている。ファクターVIIIポリペプチドをアジュバン
トと共に又はアジュバントを用いないで哺乳動物に注射
し、次に比較的短期間にわたって２〜６回の追加の（ブ
ースター）注射を続ける。次に、通常は最終注射から数
日後に動物を殺し、脾臓を摘出し、そして脾臓細胞を不
滅化する。
まず注目のファクターVIIIポリペプチドを用いてマウス
又は他の小哺乳動物を高度免疫する。免疫化のための特
定の方法はよく知られており、そして文献に詳細に記載
されている。ファクターVIIIポリペプチドをアジュバン
トと共に又はアジュバントを用いないで哺乳動物に注射
し、次に比較的短期間にわたって２〜６回の追加の（ブ
ースター）注射を続ける。次に、通常は最終注射から数
日後に動物を殺し、脾臓を摘出し、そして脾臓細胞を不
滅化する。
【００１３】不滅化の方法は臨界的ではない。現在最も
一般的な方法は融合のパートナーである骨髄腫細胞との
融合であり、この明細書においてはこの方法を例示す
る。他の方法としては、ＥＢＶ形質転換、裸の（ｂａｒ
ｅ）ＤＮＡ、例えば腫瘍遺伝子、レトロウイルス等によ
る形質転換、又はセルラインの安定な維持とモノクロー
ナル抗体の産生をもたらす他の任意の方法を挙げること
ができる。
一般的な方法は融合のパートナーである骨髄腫細胞との
融合であり、この明細書においてはこの方法を例示す
る。他の方法としては、ＥＢＶ形質転換、裸の（ｂａｒ
ｅ）ＤＮＡ、例えば腫瘍遺伝子、レトロウイルス等によ
る形質転換、又はセルラインの安定な維持とモノクロー
ナル抗体の産生をもたらす他の任意の方法を挙げること
ができる。
【００１４】融合のパートナーとの融合を用いる場合、
融合方法は臨界的ではなく種々の方法を用いることがで
きる。便利には、脾細胞及び骨髄腫細胞をポリエチレン
グリコール、適当な増殖培地及び他の添加物の存在下で
数分間一緒にする。融合の終点において、細胞を洗浄す
ることにより非イオン性洗剤を除去する。
融合方法は臨界的ではなく種々の方法を用いることがで
きる。便利には、脾細胞及び骨髄腫細胞をポリエチレン
グリコール、適当な増殖培地及び他の添加物の存在下で
数分間一緒にする。融合の終点において、細胞を洗浄す
ることにより非イオン性洗剤を除去する。
【００１５】次に、融合処理した細胞を迅速に小培養ウ
エル中に、通常はミクロタイタープレート中に、比較的
低密度で分配してスクリーニングする。培養ウエル中の
増殖培地は、骨髄腫細胞にとっては致死的であるが雑種
細胞の増殖を支持するように選択する。便利には、特定
の薬剤に対して感受性であるように骨髄腫細胞を変異せ
しめておく。典型的にはＨＡＴ感受性にしておく。
エル中に、通常はミクロタイタープレート中に、比較的
低密度で分配してスクリーニングする。培養ウエル中の
増殖培地は、骨髄腫細胞にとっては致死的であるが雑種
細胞の増殖を支持するように選択する。便利には、特定
の薬剤に対して感受性であるように骨髄腫細胞を変異せ
しめておく。典型的にはＨＡＴ感受性にしておく。
【００１６】十分な時間、通常は１〜２週間の後、雑種
のコロニーを観察し、そして陽性ウエルを含むプレート
を同定する。ウエル当り１個のみのコロニーを有するプ
レート及びウエルを選択し、そしてこれらのウエルから
の上清液をファクターVIIIＣの特定のポリペプチド断片
に対する結合活性について試験する。
のコロニーを観察し、そして陽性ウエルを含むプレート
を同定する。ウエル当り１個のみのコロニーを有するプ
レート及びウエルを選択し、そしてこれらのウエルから
の上清液をファクターVIIIＣの特定のポリペプチド断片
に対する結合活性について試験する。
【００１７】次に、ハイブリドーマセルライン及びモノ
クローナル抗体のその他の特徴、例えばハイブリドーマ
の増殖特性、モノクローナル抗体の結合親和性、抗体ク
ラス、抗体の交差反応性等を決定することができる。次
に、所望の特異性及び他の望ましい特性を有する抗体を
産生するこれらのハイブリドーマを生培養物及び／又は
凍結貯蔵物として維持することができる。次に例により
この発明をさらに具体的に説明する。但し、これによっ
てこの発明の範囲を限定するものではない。
クローナル抗体のその他の特徴、例えばハイブリドーマ
の増殖特性、モノクローナル抗体の結合親和性、抗体ク
ラス、抗体の交差反応性等を決定することができる。次
に、所望の特異性及び他の望ましい特性を有する抗体を
産生するこれらのハイブリドーマを生培養物及び／又は
凍結貯蔵物として維持することができる。次に例により
この発明をさらに具体的に説明する。但し、これによっ
てこの発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】実 験 １．ファクターVIIIＣの精製 ａ）E.G.D. Tuddenham. N.C. Trabold. J.A. Collins及
びL.W. Hoyer, J. ofLab. Clinical Medicine（１９７
９）９３：４０により最初に記載された方法によるポリ
クローナル抗VIIIＲ−セファロースカラムを用いるイム
ノソルベントクロマトグラフィー；及びｂ）D.E.G. Aus
ten, British J. of Hematology （１９７９）４３：６
６９により最初に記載されたアミノヘキシル置換アガロ
ース上でのクロマトグラフ的分離法により、市販の冷却
沈殿標品からヒト−ファクターVIIIＣを単離した。この
方法の詳細を次に記載する。
びL.W. Hoyer, J. ofLab. Clinical Medicine（１９７
９）９３：４０により最初に記載された方法によるポリ
クローナル抗VIIIＲ−セファロースカラムを用いるイム
ノソルベントクロマトグラフィー；及びｂ）D.E.G. Aus
ten, British J. of Hematology （１９７９）４３：６
６９により最初に記載されたアミノヘキシル置換アガロ
ース上でのクロマトグラフ的分離法により、市販の冷却
沈殿標品からヒト−ファクターVIIIＣを単離した。この
方法の詳細を次に記載する。
【００１９】アトランティック・アンチボディー（Ａｔ
ｌａｎｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）から得たヤギ抗−ヒ
トファクターVIII関連抗原（VIIIＲ）血清（カットＮｏ
０４０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモニウムカ
ットで処理し、続いてＤＥＡＥセルロースカラムクロマ
トグラフィーにかけ、あるいは同様の０−３３％カット
で処理しこれに続くクロマトグラフィーを行わなかっ
た。次に、これらの材料をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セ
ファロースＣＬ２Ｂ又は４Ｂ（ファルマシア、１７−０
１４０−０１又は１７−０４３０−０１）と接合せし
め、そしてカラムに注入した（抗VIIIＲ−セファロース
カラム）。
ｌａｎｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）から得たヤギ抗−ヒ
トファクターVIII関連抗原（VIIIＲ）血清（カットＮｏ
０４０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモニウムカ
ットで処理し、続いてＤＥＡＥセルロースカラムクロマ
トグラフィーにかけ、あるいは同様の０−３３％カット
で処理しこれに続くクロマトグラフィーを行わなかっ
た。次に、これらの材料をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セ
ファロースＣＬ２Ｂ又は４Ｂ（ファルマシア、１７−０
１４０−０１又は１７−０４３０−０１）と接合せし
め、そしてカラムに注入した（抗VIIIＲ−セファロース
カラム）。
【００２０】“ＨＥＭＯＦＩＬ”、すなわち正常なヒト
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（フ
ァクターVIII，ＡＨＦ，ＡＨＧ）の安定な乾燥標品（フ
ァクターVIIIＣに関し約４０倍に濃縮されている）を、
０．０２Ｍイミダゾール、０．１５ＭＮａＣｌ，０．１
Ｍリジン−ＨＣｌ，０．０２％ＮａＮ3 から成るpH７．
４の緩衝液に溶解した。
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（フ
ァクターVIII，ＡＨＦ，ＡＨＧ）の安定な乾燥標品（フ
ァクターVIIIＣに関し約４０倍に濃縮されている）を、
０．０２Ｍイミダゾール、０．１５ＭＮａＣｌ，０．１
Ｍリジン−ＨＣｌ，０．０２％ＮａＮ3 から成るpH７．
４の緩衝液に溶解した。
【００２１】溶解した後、ＨＥＭＯＦＩＬを前記の抗VI
IIＲ−セファロースカラムに適用した。非特異的結合蛋
白質を、０．５ＭＮａＣｌに変性した上記の緩衝液によ
り溶出した。次に、０．３５ＭＣａＣｌ2 を含有する上
記の緩衝液を用いて、ファクターVIIIＣ活性を安定化す
る１０％グリセロールを添加して、ファクターVIIIＣを
溶出した。イムノソルベントカラムからの活性画分をプ
ールし、そして緩衝液（０．０２Ｍイミダゾール、０．
１５ＭＮａＣｌ，０．１Ｍリジン−ＨＣｌ，０．０２５
ＭＣａＣｌ2 ，０．０２％ＮａＮ3 ，１０％グリセリ
ン、pH７．５）に対して透析した。
IIＲ−セファロースカラムに適用した。非特異的結合蛋
白質を、０．５ＭＮａＣｌに変性した上記の緩衝液によ
り溶出した。次に、０．３５ＭＣａＣｌ2 を含有する上
記の緩衝液を用いて、ファクターVIIIＣ活性を安定化す
る１０％グリセロールを添加して、ファクターVIIIＣを
溶出した。イムノソルベントカラムからの活性画分をプ
ールし、そして緩衝液（０．０２Ｍイミダゾール、０．
１５ＭＮａＣｌ，０．１Ｍリジン−ＨＣｌ，０．０２５
ＭＣａＣｌ2 ，０．０２％ＮａＮ3 ，１０％グリセリ
ン、pH７．５）に対して透析した。
【００２２】１，１００ユニットのファクターVIIIＣを
含有する透析画分のアリコートを、上記の透析緩衝液で
平衡化したアミノヘキシル−セファロース４Ｂカラム
（１×６cm）に適用した。ファクターVIIIＣ活性を、
０．３５ＭＣａＣｌ2 又は２ＭＮａＣｌを含有する同じ
緩衝液により溶出した。５００ユニット／mlのファクタ
ーVIIIＣを含む２mlの容積中に活性が見出された。同じ
方法により実施した後続の実験において、抗VIIIＲカラ
ムにおける２５％減の回収及びアミノヘキシルカラムに
おける約９０％減の回収がもたらされた。
含有する透析画分のアリコートを、上記の透析緩衝液で
平衡化したアミノヘキシル−セファロース４Ｂカラム
（１×６cm）に適用した。ファクターVIIIＣ活性を、
０．３５ＭＣａＣｌ2 又は２ＭＮａＣｌを含有する同じ
緩衝液により溶出した。５００ユニット／mlのファクタ
ーVIIIＣを含む２mlの容積中に活性が見出された。同じ
方法により実施した後続の実験において、抗VIIIＲカラ
ムにおける２５％減の回収及びアミノヘキシルカラムに
おける約９０％減の回収がもたらされた。
【００２３】上記の方法に代えて、イムノソルベントカ
ラムから溶出されたプールされた透析物を、上記の透析
緩衝液で平衡化されたデキストランサルフェートアガロ
ース（ファルマシア）カラムにまず適用する。若干の微
量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチ
ン、ＩｇＧはカラム上に保持され、他方ファクターVIII
Ｃは流過液中に現われる。この流れを集め、そして前記
のアミノヘキシル−セファロースカラムに負荷する。
ラムから溶出されたプールされた透析物を、上記の透析
緩衝液で平衡化されたデキストランサルフェートアガロ
ース（ファルマシア）カラムにまず適用する。若干の微
量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチ
ン、ＩｇＧはカラム上に保持され、他方ファクターVIII
Ｃは流過液中に現われる。この流れを集め、そして前記
のアミノヘキシル−セファロースカラムに負荷する。
【００２４】その後の測定により、精製されたファクタ
ーVIIIＣ中の両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原（ＣＡｇ）活性が存在することが示され、ＨＥＭＯＦ
ＩＬ中の４０倍濃縮に対してさらに５，０００倍濃縮さ
れていることが証明された。ゼネラルディアグノスティ
クス（General Diagnostics)製の標準的市販３成分キッ
ト〔ＡＰＴＴ、ファクターVIII欠損血漿、ベリファイ・
ノーマル・シトレート（Ｖｅｒｉｆｙ Ｎａｒｍａｌ
Ｃｉｔｒａｔｅ）〕を用いて凝固試験を行った。これに
より高レベルのファクターVIIIＣの生物学的活性が示さ
れた。
ーVIIIＣ中の両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原（ＣＡｇ）活性が存在することが示され、ＨＥＭＯＦ
ＩＬ中の４０倍濃縮に対してさらに５，０００倍濃縮さ
れていることが証明された。ゼネラルディアグノスティ
クス（General Diagnostics)製の標準的市販３成分キッ
ト〔ＡＰＴＴ、ファクターVIII欠損血漿、ベリファイ・
ノーマル・シトレート（Ｖｅｒｉｆｙ Ｎａｒｍａｌ
Ｃｉｔｒａｔｅ）〕を用いて凝固試験を行った。これに
より高レベルのファクターVIIIＣの生物学的活性が示さ
れた。
【００２５】２．モノクローナル抗体の調製 Ｂａｌｂ／ｃマウスを上記の精製ヒト−ファクターVIII
Ｃにより免疫した。脾臓細胞（１０8 個）を、１０7 個
のＮＳＯマウス骨髄腫細胞又は１０7 個のＮＳＩマウス
骨髄腫細胞と融合せしめた〔Kohler及びMilstein（１９
７５）Nature２５６：４９５による〕。各融合の生成物
を２枚の９６ウエルミクロタイタープレート上にプレー
トした。脾臓細胞フィーダー層を１０4 細胞／ウエルで
使用した。コロニーは５日目から顕微鏡観察できた。上
清液を数日間隔でファクターVIIIＣに対する抗体の存在
について測定した。イムノアッセイプレート（Ｎｕｎｃ
Ｆ２）中に下記の層を用いて、エンザイム・リンクド・
イムノアドソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行っ
た。
Ｃにより免疫した。脾臓細胞（１０8 個）を、１０7 個
のＮＳＯマウス骨髄腫細胞又は１０7 個のＮＳＩマウス
骨髄腫細胞と融合せしめた〔Kohler及びMilstein（１９
７５）Nature２５６：４９５による〕。各融合の生成物
を２枚の９６ウエルミクロタイタープレート上にプレー
トした。脾臓細胞フィーダー層を１０4 細胞／ウエルで
使用した。コロニーは５日目から顕微鏡観察できた。上
清液を数日間隔でファクターVIIIＣに対する抗体の存在
について測定した。イムノアッセイプレート（Ｎｕｎｃ
Ｆ２）中に下記の層を用いて、エンザイム・リンクド・
イムノアドソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行っ
た。
【００２６】第１層：単一特異性抗−マウスＩｇ 第２層：ハイブリドーマ細胞上清液 第３層：ヒト−ファクターVIIIＣを含有する冷却沈殿物 第４層：血友病阻害患者からのパーオキシダーゼラベル
ＩｇＧ
ＩｇＧ
【００２７】４つの陽性セルラインを同定し、サブクロ
ーニングにより純化し、そして実験室においてリットル
規模の培養において増殖せしめた。陽性セルラインの内
４２，４７及び５６と称する３種類のセルラインはＮＳ
Ｏ骨髄腫セルラインとの融合に由来する。第４の陽性セ
ルラインはＮＳＩ骨髄腫セルラインとの融合に由来し、
そして１−２８と称する。前記以外の融合処理を上記と
同じ方法で行った。但し、融合のパートナーとしてセル
ラインＰ３Ｘ ６３Ａｇ８，６５３〔Kearney 等（１９
７９）J. Immunol. １２３：１５４８−１５５０〕を使
用した。ＥＬＩＳＡスクリーニングは次の層を用いて行
った。
ーニングにより純化し、そして実験室においてリットル
規模の培養において増殖せしめた。陽性セルラインの内
４２，４７及び５６と称する３種類のセルラインはＮＳ
Ｏ骨髄腫セルラインとの融合に由来する。第４の陽性セ
ルラインはＮＳＩ骨髄腫セルラインとの融合に由来し、
そして１−２８と称する。前記以外の融合処理を上記と
同じ方法で行った。但し、融合のパートナーとしてセル
ラインＰ３Ｘ ６３Ａｇ８，６５３〔Kearney 等（１９
７９）J. Immunol. １２３：１５４８−１５５０〕を使
用した。ＥＬＩＳＡスクリーニングは次の層を用いて行
った。
【００２８】第１層：精製ファクターVIIIＣ 第２層：ハイブリドーマ細胞上清液 第３層：ホースラディシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）でラベルされたヤギ抗−マウスＩｇＧ 第４層：ＨＲＰ−基質
Ｐ）でラベルされたヤギ抗−マウスＩｇＧ 第４層：ＨＲＰ−基質
【００２９】５個の陽性セルラインを同定し、サブクロ
ーニングし、リットル規模の培養において増殖せしめ、
そして４項に記載するようにして特徴付けた。これらの
セルラインを１Ｂ９，２Ｂ６，２Ｆ９，４Ｅ５，及び５
Ｂ１と称する。
ーニングし、リットル規模の培養において増殖せしめ、
そして４項に記載するようにして特徴付けた。これらの
セルラインを１Ｂ９，２Ｂ６，２Ｆ９，４Ｅ５，及び５
Ｂ１と称する。
【００３０】３．陽性ハイブリドーマの増幅 抗−ファクターVIII抗体を産生する各ハイブリドーマか
ら他の免疫グロブリンを産生する細胞及び免疫グロブリ
ンを産生しない細胞を確実に除去するために、サブクロ
ーニングによる純化を行った。ハイブリドーマ細胞４
２，４７，５６，及び２８の稀釈物を、各ウエルが理論
上１個の細胞を含有するようにミクロタイターに接種し
た。
ら他の免疫グロブリンを産生する細胞及び免疫グロブリ
ンを産生しない細胞を確実に除去するために、サブクロ
ーニングによる純化を行った。ハイブリドーマ細胞４
２，４７，５６，及び２８の稀釈物を、各ウエルが理論
上１個の細胞を含有するようにミクロタイターに接種し
た。
【００３１】クローニング効率が低いために必要な場合
には、最初の接種はウエル当り２細胞とし、次にウエル
当り１細胞で第２接種を行った。７〜１４日後、各ハイ
ブリドーマセルライン由来の同一と推定される細胞の各
コロニーからの上清液をスクリーニングし、抗−ファク
ターVIII産生コロニーを同定した。次に陽性サブクロー
ンをマクロカルチュアーに拡大した。
には、最初の接種はウエル当り２細胞とし、次にウエル
当り１細胞で第２接種を行った。７〜１４日後、各ハイ
ブリドーマセルライン由来の同一と推定される細胞の各
コロニーからの上清液をスクリーニングし、抗−ファク
ターVIII産生コロニーを同定した。次に陽性サブクロー
ンをマクロカルチュアーに拡大した。
【００３２】各セルラインの多数のアリコートを、純化
が完了した直後に液体窒素中で凍結した。この操作によ
り、もとの１個のミクロウエル（０．２ml中１０2 細
胞）から約１０8 細胞への培養物の増幅が得られた。こ
の細胞数は１００mlの培地に相当する。細胞はこの増殖
段階中非常に感受性であり、不適当な取り扱いをすれば
培養物が死滅した。各セルラインの個々の特徴は４種類
のすべてのセルラインのために同一の方法を用いること
ができないことを意味したが、培養物の生存及び増殖を
維持するために下記の段階を一般的に使用した。
が完了した直後に液体窒素中で凍結した。この操作によ
り、もとの１個のミクロウエル（０．２ml中１０2 細
胞）から約１０8 細胞への培養物の増幅が得られた。こ
の細胞数は１００mlの培地に相当する。細胞はこの増殖
段階中非常に感受性であり、不適当な取り扱いをすれば
培養物が死滅した。各セルラインの個々の特徴は４種類
のすべてのセルラインのために同一の方法を用いること
ができないことを意味したが、培養物の生存及び増殖を
維持するために下記の段階を一般的に使用した。
【００３３】１．マクロカルチュアーに移行する前にミ
クロウエルをおよそ１／４コンフルエントにした。 ２．サブカルチュアーの最初の２週間の間、前条件調節
した培地を使用した。 ３．マクロカルチュアーからフラスコ培養への移行を、
少なくとも４mlのマクロカルチュアーが半コンフルエン
スに増殖するまで遅らせた。 ４．フラスコ培養の稀釈を、最初の数回の継代の間１：
２未満に制限した。
クロウエルをおよそ１／４コンフルエントにした。 ２．サブカルチュアーの最初の２週間の間、前条件調節
した培地を使用した。 ３．マクロカルチュアーからフラスコ培養への移行を、
少なくとも４mlのマクロカルチュアーが半コンフルエン
スに増殖するまで遅らせた。 ４．フラスコ培養の稀釈を、最初の数回の継代の間１：
２未満に制限した。
【００３４】４．モノクローナル抗体の特徴付け モノクローナル抗−ファクターVIIIＣ抗体の免疫グロブ
リンクラスを同定するため、マウスＩｇＧについてイム
ノアッセイを行った。ここでは、コート抗体は免疫グロ
ブリンサブクラスに特異的であった。抗−アイソタイプ
抗体によってプレコートされたミクロプレートをハゲド
ルン・リサーチ・ラブ（Hagedorn Research Lab.) から
得た。ハイブリドーマセルライン４２，４７及び５６に
より産生された抗体はＩｇＧ１であり、セルライン５Ｂ
１により産生された抗体はＩｇＭであった。
リンクラスを同定するため、マウスＩｇＧについてイム
ノアッセイを行った。ここでは、コート抗体は免疫グロ
ブリンサブクラスに特異的であった。抗−アイソタイプ
抗体によってプレコートされたミクロプレートをハゲド
ルン・リサーチ・ラブ（Hagedorn Research Lab.) から
得た。ハイブリドーマセルライン４２，４７及び５６に
より産生された抗体はＩｇＧ１であり、セルライン５Ｂ
１により産生された抗体はＩｇＭであった。
【００３５】モノクローナル抗体の２つのクラスを、下
記の方法により、ファクターVIIIＣポリペプチドとの反
応性に従って同定した。ハイブリドーマ培養上清液を、
アフィニティー精製されたヤギ抗−マウス免疫グロブリ
ン（ＩｇＧ）をコートしたポリスチレンビーズ〔直径１
／８″、プレシション・プラスチック・ボール社（Prec
ision Plastic Ball Co.) 、シカゴ〕と共に室温にて１
２時間インキュベートした。ポリスチレンビーズを燐酸
緩衝化塩溶液で洗浄し、そしてクロラミンＴ法を用い
て、１125 でラベルされた精製ファクターVIIIＣと反応
せしめた。
記の方法により、ファクターVIIIＣポリペプチドとの反
応性に従って同定した。ハイブリドーマ培養上清液を、
アフィニティー精製されたヤギ抗−マウス免疫グロブリ
ン（ＩｇＧ）をコートしたポリスチレンビーズ〔直径１
／８″、プレシション・プラスチック・ボール社（Prec
ision Plastic Ball Co.) 、シカゴ〕と共に室温にて１
２時間インキュベートした。ポリスチレンビーズを燐酸
緩衝化塩溶液で洗浄し、そしてクロラミンＴ法を用い
て、１125 でラベルされた精製ファクターVIIIＣと反応
せしめた。
【００３６】ビーズ上に結合したラベルされた蛋白質を
ゲル電気泳動用ＳＤＳサンプル緩衝液中に可溶化し、そ
して７．５％アクリルアミドゲル上で分離した〔Laemml
i （１９７０）Nature２２７：２８０〕。ゲルを固定
し、乾燥し、そして強化スクリーンを用いてコダックＸ
−Ｏｍａｔフィルムに、２０時間又はそれより長時間−
８０℃において暴露した。この方法により得られた結果
からモノクローナル抗体が次のように分類された。
ゲル電気泳動用ＳＤＳサンプル緩衝液中に可溶化し、そ
して７．５％アクリルアミドゲル上で分離した〔Laemml
i （１９７０）Nature２２７：２８０〕。ゲルを固定
し、乾燥し、そして強化スクリーンを用いてコダックＸ
−Ｏｍａｔフィルムに、２０時間又はそれより長時間−
８０℃において暴露した。この方法により得られた結果
からモノクローナル抗体が次のように分類された。
【００３７】クラスＩ：８０／７７kdダブレット、又は
８０／７７kdダブレット及び２４０kd蛋白質と反応す
る。これらの抗体はまた測定にスロンビン消化ファクタ
ーVIIIを用いる場合７０／６７kdダブレットとも反応
し、このことはスロンビン消化により生成する７０／６
７kdダブレットが８０／７７kdダブレットに由来するこ
とを示している。クラスIII ：２４０，１４０，１１５，９２．５kd蛋白
質、及び精製ファクターVIIIＣ物質のスロンビン消化に
より生成する４０kdペプチドと反応する。
８０／７７kdダブレット及び２４０kd蛋白質と反応す
る。これらの抗体はまた測定にスロンビン消化ファクタ
ーVIIIを用いる場合７０／６７kdダブレットとも反応
し、このことはスロンビン消化により生成する７０／６
７kdダブレットが８０／７７kdダブレットに由来するこ
とを示している。クラスIII ：２４０，１４０，１１５，９２．５kd蛋白
質、及び精製ファクターVIIIＣ物質のスロンビン消化に
より生成する４０kdペプチドと反応する。
【００３８】表１に、種々のハイブリドーマセルライン
により産生されるモノクローナル抗体のそれぞれに対応
するクラスを示す。
により産生されるモノクローナル抗体のそれぞれに対応
するクラスを示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】抗体を、常用のベセスダ（Bethesda）アッ
セイ〔C. Kasper （１９７５）Thrombos. Diathes. Hae
morrh.３４：８６９−７８２〕を用いて、ファクターVI
IIＣ凝固阻害活性についてスクリーニングした。上記の
抗体の内、セルライン５６により産生された抗体のみが
凝固阻害活性を示した。
セイ〔C. Kasper （１９７５）Thrombos. Diathes. Hae
morrh.３４：８６９−７８２〕を用いて、ファクターVI
IIＣ凝固阻害活性についてスクリーニングした。上記の
抗体の内、セルライン５６により産生された抗体のみが
凝固阻害活性を示した。
【００４１】９２．５kd蛋白質と８０／７７kdダブレッ
トとの間の会合を検討するため、及びこの会合における
カルシウムの役割を研究するため次の実験を行った。１
０mMＣａＣｌ2 の存在下、又は同濃度のＣａＣｌ2 、１
０mMＥＧＴＡ及び１０mMＥＤＴＡの存在下で次のＥＬＩ
ＳＡ測定を行った。
トとの間の会合を検討するため、及びこの会合における
カルシウムの役割を研究するため次の実験を行った。１
０mMＣａＣｌ2 の存在下、又は同濃度のＣａＣｌ2 、１
０mMＥＧＴＡ及び１０mMＥＤＴＡの存在下で次のＥＬＩ
ＳＡ測定を行った。
【００４２】第１層：単一特異性抗−マウスＩｇＧ 第２層：クラスIII モノクローナル抗体（抗−９２．５
kd）、又はクラスＩモノクローナル抗体（抗−８０／７
７kd） 第３層：精製ファクターVIIIＣ物質 第４層：７７／８０kdに対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体
kd）、又はクラスＩモノクローナル抗体（抗−８０／７
７kd） 第３層：精製ファクターVIIIＣ物質 第４層：７７／８０kdに対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体
【００４３】結果を表２に示す。表２において示される
ように、測定中にカルシウムが存在する場合にのみ強い
ＨＲＰ反応が得られ、第４層（７７／８０kdに対するＨ
ＲＰ−ヒト阻害抗体）がクラスIII モノクローナル抗体
と会合した複合体と結合することが示される。測定にＥ
ＧＴＡ及びＥＤＴＡを加えた場合、測定中に結合するＨ
ＲＰ活性は非特異的結合にのみ相当する。これらの結果
は、９２．５kd蛋白質がカルシウム橋を介して８０／７
７kdダブレットに結合することを示している。
ように、測定中にカルシウムが存在する場合にのみ強い
ＨＲＰ反応が得られ、第４層（７７／８０kdに対するＨ
ＲＰ−ヒト阻害抗体）がクラスIII モノクローナル抗体
と会合した複合体と結合することが示される。測定にＥ
ＧＴＡ及びＥＤＴＡを加えた場合、測定中に結合するＨ
ＲＰ活性は非特異的結合にのみ相当する。これらの結果
は、９２．５kd蛋白質がカルシウム橋を介して８０／７
７kdダブレットに結合することを示している。
【００４４】
【表２】
【００４５】抗体が認識するエピトープの観点からモノ
クローナル抗体を特徴付けるために追加の測定を行っ
た。ミクロタイターウエルに固定化されたファクターVI
IIＣを種々の濃度の 125Ｉ−４２ＩｇＧ又は 125Ｉ−４
７ＩｇＧ並びにラベルされていない４２，４７，５６及
びＩ−２８と反応せしめることにより競争的測定を行っ
た。結果は、４７及び４２モノクローナル抗体は異なる
エピトープと反応することを示した。この結果はまた、
５６モノクローナル抗体は４２モノクローナル抗体の結
合部位に近いエピトープと反応し、そしてVIIIＣ中の配
置変化を誘発し、このことが４２抗体に対する親和性を
強化するらしいことを示した。
クローナル抗体を特徴付けるために追加の測定を行っ
た。ミクロタイターウエルに固定化されたファクターVI
IIＣを種々の濃度の 125Ｉ−４２ＩｇＧ又は 125Ｉ−４
７ＩｇＧ並びにラベルされていない４２，４７，５６及
びＩ−２８と反応せしめることにより競争的測定を行っ
た。結果は、４７及び４２モノクローナル抗体は異なる
エピトープと反応することを示した。この結果はまた、
５６モノクローナル抗体は４２モノクローナル抗体の結
合部位に近いエピトープと反応し、そしてVIIIＣ中の配
置変化を誘発し、このことが４２抗体に対する親和性を
強化するらしいことを示した。
【００４６】ファクターVIIIＣの種々の構成ポリペプチ
ド間の識別を行うことができるモノクローナル抗体が提
供される。クラスＩ抗体は８０／７７kdダブレット、又
は２４０kd断片及び８０／７７kdダブレットと反応す
る。クラスIII モノクローナル抗体は２４０kdポリペプ
チド、並びに９２．５kdポリペプチド及びその前駆体と
反応する。クラスIII 抗体はファクターVIIIＣ物質のス
ロンビン消化生成物との追加の反応性を示す。
ド間の識別を行うことができるモノクローナル抗体が提
供される。クラスＩ抗体は８０／７７kdダブレット、又
は２４０kd断片及び８０／７７kdダブレットと反応す
る。クラスIII モノクローナル抗体は２４０kdポリペプ
チド、並びに９２．５kdポリペプチド及びその前駆体と
反応する。クラスIII 抗体はファクターVIIIＣ物質のス
ロンビン消化生成物との追加の反応性を示す。
【００４７】なお、下記のセルラインＮＧ−ＮＳＯ−４
２、ＮＧ−ＮＳＯ−４７、ＮＧ−ＮＳＯ−５６およびＮ
Ｇ−ＮＳＩ−２８がナショナル・コレクション・オブ・
アニマル・セル・カルチャーズ（National Collection
of Animal Cell Cultures；NCACC）に寄託されており、
そしてセルラインＦVIIIＣ ４Ｅ５、ＦVIIIＣ ５Ｂ１お
よびＦVIIIＣ ２Ｂ６がアメリカン・タイプカルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection;A
TCC）に寄託されている。セルラインＮＧ−ＮＳＯ−４
２、ＮＧ−ＮＳＯ−４７、ＮＧ−ＮＳＯ−５６およびＮ
Ｇ−ＮＳＩ−２８の寄託はブダペスト条約に基づく国際
寄託である。
２、ＮＧ−ＮＳＯ−４７、ＮＧ−ＮＳＯ−５６およびＮ
Ｇ−ＮＳＩ−２８がナショナル・コレクション・オブ・
アニマル・セル・カルチャーズ（National Collection
of Animal Cell Cultures；NCACC）に寄託されており、
そしてセルラインＦVIIIＣ ４Ｅ５、ＦVIIIＣ ５Ｂ１お
よびＦVIIIＣ ２Ｂ６がアメリカン・タイプカルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection;A
TCC）に寄託されている。セルラインＮＧ−ＮＳＯ−４
２、ＮＧ−ＮＳＯ−４７、ＮＧ−ＮＳＯ−５６およびＮ
Ｇ−ＮＳＩ−２８の寄託はブダペスト条約に基づく国際
寄託である。
【００４８】 ─────────────────────────────────── セルライン 寄託日 寄託番号 ─────────────────────────────────── セルライン４２（ＮＧ−ＮＳＯ−４２） 1984年12月21日 84122103 セルライン４７（ＮＧ−ＮＳＯ−４７） 1984年12月21日 84122102 セルライン５６（ＮＧ−ＮＳＯ−５６） 1984年12月21日 84122104 セルラインＩ−２８（ＮＧ−ＮＳＩ−２８）1984年12月21日 84122101 セルライン４Ｂ５（ＦVIIIＣ ４Ｅ５） 1985年１月７日 ＨＢ8688 セルライン５Ｂ１（ＦVIIIＣ ５Ｂ１） 1985年１月７日 ＨＢ8689 セルライン２Ｂ６（ＦVIIIＣ ２Ｂ６） 1985年１月７日 ＨＢ8690 ───────────────────────────────────
【００４９】以上、この発明の理由のために詳細に説明
したが、種々の変化、変法を実施することができること
は言うまでもない。
したが、種々の変化、変法を実施することができること
は言うまでもない。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｌ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122, サン フランシスコ，シックスス アベニ ュ 1370 (72)発明者 フランク アール． マシャーズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サン フランシスコ，マービュー ウェイ 148 (72)発明者 マーサ トゥルート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，ブロードウェイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サン フランシスコ，アッパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国，2100 コペンハーゲン，ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジェニファー ファバロロ オーストラリア国，ビクトリア，カールト ン 3035，ファラデイ ストリート 108 (56)参考文献 特開 昭59−184130（ＪＰ，Ａ) ＢＬＯＯＤ，61〜４！（1983）Ｐ．807 −811 Ｊ．ＬＡＢ．ＣＬＩＮ．ＭＥＤ．，101 〜５！（1983）Ｐ．736−746
Claims (2)
- 【請求項１】 マウスミエローマ細胞と予めファクター
VIIIＣで免疫化したマウスの脾臓細胞とを融合すること
により調製されたハイブリドーマセルラインであって、
該セルラインは、以下の特性： （１）ファクターVIIIＣと反応し、 （２）凝固阻害活性を有さず、 （３）変性条件下での電気泳動により得られるファクタ
ーVIIIＣの９２．５Ｋｄダブレットと反応し、 （４）ファクターVIIIＣの２４０Ｋｄポリペプチドと反
応し、および、 （５）ファクターVIIIＣのスロンビン消化により生成す
る４０Ｋｄポリペプチドと反応する、 を有する、モノクローナル抗体を生産する、ハイブリド
ーマセルライン。 - 【請求項２】 前記ハイブリドーマセルラインが、セル
ライン４Ｅ５、あるいはセルライン５Ｂ１である、請求
項１に記載のハイブリドーマセルライン。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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