JPH0634760B2 - ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブ - Google Patents
ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブInfo
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- JPH0634760B2 JPH0634760B2 JP3082573A JP8257391A JPH0634760B2 JP H0634760 B2 JPH0634760 B2 JP H0634760B2 JP 3082573 A JP3082573 A JP 3082573A JP 8257391 A JP8257391 A JP 8257391A JP H0634760 B2 JPH0634760 B2 JP H0634760B2
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- factor viiic
- factor
- protein
- viiic
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ファクターVIIIＣは血液凝固の本
質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のＸ染色
体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個体に
おいてはこのファクターは存在せず、又は不足してい
る。ファクターVIIIＣの血漿中濃度は極めて低く、そし
て一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物または最終
生成物であると考えられるため、該ファクターの単離に
おいては大きな困難に遭遇する。従って、ファクターVI
IIＣを単離しようとすれば分子量の異る有意に不均一な
複雑な混合物が得られる。
質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のＸ染色
体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個体に
おいてはこのファクターは存在せず、又は不足してい
る。ファクターVIIIＣの血漿中濃度は極めて低く、そし
て一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物または最終
生成物であると考えられるため、該ファクターの単離に
おいては大きな困難に遭遇する。従って、ファクターVI
IIＣを単離しようとすれば分子量の異る有意に不均一な
複雑な混合物が得られる。
【０００２】生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用す
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中で
のcDNA遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を確立
することができる。
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中で
のcDNA遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を確立
することができる。
【０００３】さらに、アミノ酸配列を決定することによ
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はcDNAとハイブ
リダイズするプローブを開発することができ、従って該
当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そして
所望の生成物を１種類又は複数種類の宿主において高収
量で製造することができる。
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はcDNAとハイブ
リダイズするプローブを開発することができ、従って該
当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そして
所望の生成物を１種類又は複数種類の宿主において高収
量で製造することができる。
【０００４】
【従来の技術】米国特許第 4,361,509号及びこれに引用
された文献にはファクターVIIIＣの精製が記載されてい
る。さらに、 Fulcher及び Zimmerman, Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA (1982) 79：1648−1652を参照のこと。 Tudd
enham等、J. of Lab.Clinical Medicine (1979) 93：4
0−53にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIII
Ｃの精製について記載されている。
された文献にはファクターVIIIＣの精製が記載されてい
る。さらに、 Fulcher及び Zimmerman, Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA (1982) 79：1648−1652を参照のこと。 Tudd
enham等、J. of Lab.Clinical Medicine (1979) 93：4
0−53にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIII
Ｃの精製について記載されている。
【０００５】Austen, British J.Hematology (1979) 4
3： 669−674 にはファクターVIIIＣの精製のためのア
ミノヘキシル−セファロースの使用について記載されて
いる。Weinstein等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1981) 7
8：5137−5141にはファクターVIIIＣに対するスロンビ
ンの効果が検討されている。さらに、 Kuo等、Abstract
s for IX International Congress of Thrombosis and
Hemostasis, （コペンハーゲン、1983年７月）を参照の
こと。
3： 669−674 にはファクターVIIIＣの精製のためのア
ミノヘキシル−セファロースの使用について記載されて
いる。Weinstein等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1981) 7
8：5137−5141にはファクターVIIIＣに対するスロンビ
ンの効果が検討されている。さらに、 Kuo等、Abstract
s for IX International Congress of Thrombosis and
Hemostasis, （コペンハーゲン、1983年７月）を参照の
こと。
【０００６】
【発明の概要】本発明は、以下に記載する方法において
用いられる、ファクターVIIIＣ遺伝子に対するプローブ
を提供する。微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発現
によるヒト−ファクターVIIIＣ、その前駆体及びサブユ
ニットの製造方法及び組成物が提供される。この方法
は、純粋なファクターVIIIＣ、そのサブユニット及び断
片を単離し、そして特にスロンビン消化を用いてこれら
の生理的関連性を決定することを含む。関連する一連の
ポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列決定し、そ
してこの配列を複合プローブの開発に使用する。
用いられる、ファクターVIIIＣ遺伝子に対するプローブ
を提供する。微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発現
によるヒト−ファクターVIIIＣ、その前駆体及びサブユ
ニットの製造方法及び組成物が提供される。この方法
は、純粋なファクターVIIIＣ、そのサブユニット及び断
片を単離し、そして特にスロンビン消化を用いてこれら
の生理的関連性を決定することを含む。関連する一連の
ポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列決定し、そ
してこの配列を複合プローブの開発に使用する。
【０００７】ゲノムＤＮＡ断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟mRNAを単離するため
に使用し、このmRNAからcDNAを得る。次にＤＮＡ配列を
さらに操作して発現ベクターに挿入し、そしてこの発現
ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプチドを発現せ
しめる。
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟mRNAを単離するため
に使用し、このmRNAからcDNAを得る。次にＤＮＡ配列を
さらに操作して発現ベクターに挿入し、そしてこの発現
ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプチドを発現せ
しめる。
【０００８】
【具体的な記載】ヒト−ファクターVIIIＣ断片及びサブ
ユニットが実質上純粋な形で提供される。さらに、前駆
体としての又は活性形でのファクターVIIIＣを製造する
ため、あるいは天然に得られるサブユニットと組合わせ
て使用する個々のサブユニットを得るためのファクター
VIIIＣサブユニット及び断片を発現するための方法及び
構成物が提供される。このサブユニット及び断片はファ
クターVIIIＣと関連する１又は複数の生物学的性質、例
えばエピトープ部位、凝固活性、及び免疫原性を有し、
抗体を製造するために使用され、この抗体は試薬とし
て、特にイムノアッセイにおけるラベルされた試薬とし
て使用される。
ユニットが実質上純粋な形で提供される。さらに、前駆
体としての又は活性形でのファクターVIIIＣを製造する
ため、あるいは天然に得られるサブユニットと組合わせ
て使用する個々のサブユニットを得るためのファクター
VIIIＣサブユニット及び断片を発現するための方法及び
構成物が提供される。このサブユニット及び断片はファ
クターVIIIＣと関連する１又は複数の生物学的性質、例
えばエピトープ部位、凝固活性、及び免疫原性を有し、
抗体を製造するために使用され、この抗体は試薬とし
て、特にイムノアッセイにおけるラベルされた試薬とし
て使用される。
【０００９】ヒト−ファクターVIIIＣは、約 460kdの見
かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され得る
複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際し、種
々の分子量、すなわち240, 160, 140, 115, 92.5, 80、
及び77kdの多数の断片が生じ、後２者はダブレットとし
て移動する。免疫的関係を調べるために抗体を用いそし
て構造的関係を調べるために切断パターンを用いなが
ら、化学的切断及びスロンビン切断を含むプロテアーゼ
切断により断片を分析することにより、92.5kdポリペプ
チドが 240, 160, 140及び 115ポリペプチドと関連して
おり、他方77／80ダブレットは他のペプチドと共通の同
定され得る特性を有さず 240kdポリペプチドとのみ共通
の特性を有することが示される。
かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され得る
複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際し、種
々の分子量、すなわち240, 160, 140, 115, 92.5, 80、
及び77kdの多数の断片が生じ、後２者はダブレットとし
て移動する。免疫的関係を調べるために抗体を用いそし
て構造的関係を調べるために切断パターンを用いなが
ら、化学的切断及びスロンビン切断を含むプロテアーゼ
切断により断片を分析することにより、92.5kdポリペプ
チドが 240, 160, 140及び 115ポリペプチドと関連して
おり、他方77／80ダブレットは他のペプチドと共通の同
定され得る特性を有さず 240kdポリペプチドとのみ共通
の特性を有することが示される。
【００１０】さらに、77／80kdダブレットはスロンビン
により67／70kdダブレットに転換され、他方スロンビン
で処理された精製ファクターVIIIＣ物質中に存在する9
2.5kdポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接
的に約40及び52.5kdの２個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された77／80kdダブレットポリペ
プチドはそのＮ−端がブロックされており、67／70kdダ
ブレットはそのＮ−端がブロックされていないことが見
出される。
により67／70kdダブレットに転換され、他方スロンビン
で処理された精製ファクターVIIIＣ物質中に存在する9
2.5kdポリペプチドはスロンビンにより直接的又は間接
的に約40及び52.5kdの２個のポリペプチドに切断され
る。電気泳動的に単離された77／80kdダブレットポリペ
プチドはそのＮ−端がブロックされており、67／70kdダ
ブレットはそのＮ−端がブロックされていないことが見
出される。
【００１１】さらに、ファクターVIIIＣの座は大きなイ
ントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクター
VIIIＣと関連する種々の領域を含むことが見出される。
すなわち、ファクターVIIIＣ複合体に関する特定のポリ
ペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単離する
ことができる。ファクターVIIIＣサブユニット及びその
断片に関する特定のアミノ酸配列を同定することによ
り、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離し、そし
てそのエクソンをそれ自体として組合わせて、又は合成
ＤＮＡにより連結して、ファクターVIIIＣのポリペプチ
ドサブユニット又はその断片をコードする配列を得、こ
れらを製造することができる。
ントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクター
VIIIＣと関連する種々の領域を含むことが見出される。
すなわち、ファクターVIIIＣ複合体に関する特定のポリ
ペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単離する
ことができる。ファクターVIIIＣサブユニット及びその
断片に関する特定のアミノ酸配列を同定することによ
り、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離し、そし
てそのエクソンをそれ自体として組合わせて、又は合成
ＤＮＡにより連結して、ファクターVIIIＣのポリペプチ
ドサブユニット又はその断片をコードする配列を得、こ
れらを製造することができる。
【００１２】便利には、エクソン及びイントロンの両者
を含有するファクターVIIIＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳動
物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿入
し、cDNAのクローニングに適するように適切にスプライ
スされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを得、そし
てファクターVIIIＣ、サブユニット又は断片を製造す
る。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を用いて
ファクターVIIIＣをコードする天然メッセンジャーＲＮ
Ａとハイブリダイズさせることができる。
を含有するファクターVIIIＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳動
物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿入
し、cDNAのクローニングに適するように適切にスプライ
スされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを得、そし
てファクターVIIIＣ、サブユニット又は断片を製造す
る。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を用いて
ファクターVIIIＣをコードする天然メッセンジャーＲＮ
Ａとハイブリダイズさせることができる。
【００１３】次に、このメッセンジャーＲＮＡを用いて
ファクターVIIIＣのサブユニットをコードする ds cDNA
を調製することができる。ＤＮＡ配列は、これを転写及
び翻訳のために必要な制御がシグナルを有する適当な発
現ベクターに挿入することによって、発現のために使用
することができる。ファクターVIIIＣ遺伝子発現ベクタ
ー（ファクターVIIIＣ、その前駆体、サブユニット又は
断片の全体又は部分をコードする１個又は複数個の遺伝
子を担持する発現ベクター）を適合性の宿主に導入し、
そしてこの宿主をファクターVIIIＣの発現のために増殖
せしめることができる。
ファクターVIIIＣのサブユニットをコードする ds cDNA
を調製することができる。ＤＮＡ配列は、これを転写及
び翻訳のために必要な制御がシグナルを有する適当な発
現ベクターに挿入することによって、発現のために使用
することができる。ファクターVIIIＣ遺伝子発現ベクタ
ー（ファクターVIIIＣ、その前駆体、サブユニット又は
断片の全体又は部分をコードする１個又は複数個の遺伝
子を担持する発現ベクター）を適合性の宿主に導入し、
そしてこの宿主をファクターVIIIＣの発現のために増殖
せしめることができる。
【００１４】宿主を適切に選択することにより、ファク
ターVIIIＣのＤＮＡを分泌リーダー及びプロセシングシ
グナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され、そ
してプロセシングされて完全なポリペプチドとなるよう
にすることができる。適当であれば、このポリペプチド
をさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在する
官能基又は置換基を導入することができる。
ターVIIIＣのＤＮＡを分泌リーダー及びプロセシングシ
グナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され、そ
してプロセシングされて完全なポリペプチドとなるよう
にすることができる。適当であれば、このポリペプチド
をさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在する
官能基又は置換基を導入することができる。
【００１５】この発明の最初の段階において、高度に精
製したファクターVIIIＣを得そして特徴付ける。精製さ
れたファクターVIIIＣは市販のヒト−抗血友病因子(AH
F) から得ることができる。この因子は正常なヒトの新
鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるものであり約
40倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、例えばイ
ミダゾール−リジン− HCl塩溶液（pH7.４）に溶解し、
次にファクターVIIIＣ又はファクターVIIIＲに対するポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体を有するアフ
ィニティーカラム上でクロマトグラフ処理することによ
りファクターVIIIＣをさらに濃縮、精製する。便利に
は、抗体をセファロース支持体に共有結合せしめる。
製したファクターVIIIＣを得そして特徴付ける。精製さ
れたファクターVIIIＣは市販のヒト−抗血友病因子(AH
F) から得ることができる。この因子は正常なヒトの新
鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるものであり約
40倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、例えばイ
ミダゾール−リジン− HCl塩溶液（pH7.４）に溶解し、
次にファクターVIIIＣ又はファクターVIIIＲに対するポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体を有するアフ
ィニティーカラム上でクロマトグラフ処理することによ
りファクターVIIIＣをさらに濃縮、精製する。便利に
は、抗体をセファロース支持体に共有結合せしめる。
【００１６】比較的高濃度のカルシウムイオンとグリセ
リンとの組合せを用いてカラムからファクターVIIIＣを
溶出することができる。次に、カラムから得られた画分
を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて透
析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカラム
を用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを含
む緩衝液で溶出することにより、さらに精製することが
できる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチンセ
ファロース、HPLC、デキストランサルフェート又はMono
Q上でのイオン交換、レクチン又はファクターVIIIＣに
対する抗体を用いるアフィニティーカラム等によりさら
に精製することができる。
リンとの組合せを用いてカラムからファクターVIIIＣを
溶出することができる。次に、カラムから得られた画分
を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて透
析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカラム
を用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを含
む緩衝液で溶出することにより、さらに精製することが
できる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチンセ
ファロース、HPLC、デキストランサルフェート又はMono
Q上でのイオン交換、レクチン又はファクターVIIIＣに
対する抗体を用いるアフィニティーカラム等によりさら
に精製することができる。
【００１７】特に、デキストランサルフェートを使用す
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、 IgGが標品から除去され、外来性蛋白
質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの画分
の活性は、凝固アッセイ（市販キット）及びファクター
VIIIＣに特異的な抗体を用いて、生物学的活性及び抗原
活性のいずれか又は両方について監視することができ
る。血漿中のファクターVIIIＣの濃度に基いて、上記の
方法により約 200,000倍の精製が達成される。
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、 IgGが標品から除去され、外来性蛋白
質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの画分
の活性は、凝固アッセイ（市販キット）及びファクター
VIIIＣに特異的な抗体を用いて、生物学的活性及び抗原
活性のいずれか又は両方について監視することができ
る。血漿中のファクターVIIIＣの濃度に基いて、上記の
方法により約 200,000倍の精製が達成される。
【００１８】ファクターVIIIＣの特徴付け ゲル濾過により、ファクターVIIIＣが約 460kdの見かけ
分子量を有する複合体として挙動することが示される。
ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子量を異
にする７個の個別のポリペプチドを単離することができ
る。その分子量により定義される断片は240, 160, 140,
115, 92.5, 80及び77kd断片である。これらの断片を次
の方法により特徴付けた。
分子量を有する複合体として挙動することが示される。
ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子量を異
にする７個の個別のポリペプチドを単離することができ
る。その分子量により定義される断片は240, 160, 140,
115, 92.5, 80及び77kd断片である。これらの断片を次
の方法により特徴付けた。
【００１９】第１の研究は、血友病患者から単離された
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は77／80kdダブレットと反応した。Ｅ
抗体は 240kdポリペプチドと強く反応し、そしてダブレ
ットと 240kdポリペプチドとの間の複数のバンドと弱く
反応した。Ｚ抗体は 240kdポリペプチドとも弱く反応し
た。免疫沈澱実験において、Ｅ抗体は77／80kdダブレッ
ト、並びに 160, 140, 115及び92.5kdの高分子量種を沈
澱せしめ、ダブレットは一層強いバンド中にある。EGTA
を含有せしめることによりダブレット以外のバンドが消
失し、92.5kd種がCa ++橋に仲介されて複合体中で77kd及
び／又は80kd種と会合することが示される。
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は77／80kdダブレットと反応した。Ｅ
抗体は 240kdポリペプチドと強く反応し、そしてダブレ
ットと 240kdポリペプチドとの間の複数のバンドと弱く
反応した。Ｚ抗体は 240kdポリペプチドとも弱く反応し
た。免疫沈澱実験において、Ｅ抗体は77／80kdダブレッ
ト、並びに 160, 140, 115及び92.5kdの高分子量種を沈
澱せしめ、ダブレットは一層強いバンド中にある。EGTA
を含有せしめることによりダブレット以外のバンドが消
失し、92.5kd種がCa ++橋に仲介されて複合体中で77kd及
び／又は80kd種と会合することが示される。
【００２０】次の研究において、ファクターVIIIＣに介
在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応す
るモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは77／80kd
ダブレット及び 240kdポリペプチドと反応し、クラスII
は 160, 140, 115及び92.5kdポリペプチドと反応する。
クラスＩ抗体とスロンビン消化ファクターVIIIＣとの免
疫沈澱により、生成する70／67kdダブレットはファクタ
ーVIIIＣ中に存在する77／80kdダブレットに由来するこ
とが示される。
在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応す
るモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは77／80kd
ダブレット及び 240kdポリペプチドと反応し、クラスII
は 160, 140, 115及び92.5kdポリペプチドと反応する。
クラスＩ抗体とスロンビン消化ファクターVIIIＣとの免
疫沈澱により、生成する70／67kdダブレットはファクタ
ーVIIIＣ中に存在する77／80kdダブレットに由来するこ
とが示される。
【００２１】クラスIIモノクローナル抗体は、160, 140
及び 115kdペプチドが92.5kdペプチドの前駆体であるこ
とを示した。92.5kdペプチドの切断生成物である40kdペ
プチドもクラスII抗体により結合された。EGTAの存在下
及び非存在下でモノクローナル抗体を用いる ELISA測定
によりファクターVIIIＣ複合体の92.5kd成分と77kd及び
／又は80kd成分との間のCa++橋会合が確認された。
及び 115kdペプチドが92.5kdペプチドの前駆体であるこ
とを示した。92.5kdペプチドの切断生成物である40kdペ
プチドもクラスII抗体により結合された。EGTAの存在下
及び非存在下でモノクローナル抗体を用いる ELISA測定
によりファクターVIIIＣ複合体の92.5kd成分と77kd及び
／又は80kd成分との間のCa++橋会合が確認された。
【００２２】ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターVI
IIＣを得るために使用することができ、又はEGTAを用い
ながら、構成成分である92.5kd種と77／80kd種を分ける
ために使用することができる。
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターVI
IIＣを得るために使用することができ、又はEGTAを用い
ながら、構成成分である92.5kd種と77／80kd種を分ける
ために使用することができる。
【００２３】次の研究では、精製されたファクターVIII
Ｃ物質のpH6.８又は7.４におけるスロンビン消化を用い
た。アリコートを凝固活性について測定しそしてゲル分
析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は92.5kd種の
量の増加及び減少に伴って時間と共に増加しそして減少
することが示された。精製されたファクターVIIIＣ物質
の短時間（５〜15分間）のスロンビン処理により92.5kd
種の量が増加し、77／80kdダブレットは部分的に67／70
kdダブレットに転換される。
Ｃ物質のpH6.８又は7.４におけるスロンビン消化を用い
た。アリコートを凝固活性について測定しそしてゲル分
析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は92.5kd種の
量の増加及び減少に伴って時間と共に増加しそして減少
することが示された。精製されたファクターVIIIＣ物質
の短時間（５〜15分間）のスロンビン処理により92.5kd
種の量が増加し、77／80kdダブレットは部分的に67／70
kdダブレットに転換される。
【００２４】長時間、例えば１時間スロンビン消化する
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び52.5kd
の２個の新たなペプチドが生じ、40kdペプチドは92.5kd
種の免疫原性を維持している。52.5kdペプチドは、化学
的及び酵素的分解パターン及び92.5kd種に類似する生成
物により、切断生成物であることが示される。
場合、92.5kd蛋白質が分解され、そして40kd及び52.5kd
の２個の新たなペプチドが生じ、40kdペプチドは92.5kd
種の免疫原性を維持している。52.5kdペプチドは、化学
的及び酵素的分解パターン及び92.5kd種に類似する生成
物により、切断生成物であることが示される。
【００２５】次の研究において、個々のファクターVIII
Ｃサブユニット及び前駆体（例えば240, 77／80, 92.5k
d種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離し、そし
て次に単離されたポリペプチドの経時的スロンビン消化
を行った。調製用ゲルから単離された 240kd断片は 16
0, 140, 115、及び92.5kdのバンドを生成した。80kd及
び77kdの断片はそれぞれ70kd及び67kdの断片を生成し
た。
Ｃサブユニット及び前駆体（例えば240, 77／80, 92.5k
d種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離し、そし
て次に単離されたポリペプチドの経時的スロンビン消化
を行った。調製用ゲルから単離された 240kd断片は 16
0, 140, 115、及び92.5kdのバンドを生成した。80kd及
び77kdの断片はそれぞれ70kd及び67kdの断片を生成し
た。
【００２６】77kd及び／又は80kd種と92.5kdポリペプチ
ドとをカルシウム橋複合体として含有するファクターVI
IIＣ複合体は高度に精製された形で得られる。抗−ファ
クターVIIIＲイムノソルベントカラム及びアミノヘキシ
ルセファロースカラムで処理した後、ファクターVIIIＣ
物質（複合体及び前駆体種）の純度は、全蛋白質を基礎
にして、通常は80％より高く、しばしば90％より高く、
そして98％以上でありえ、そして複合体の純度は、全蛋
白質を基礎にして20％以上であり、さらに一般的には30
％以上である。
ドとをカルシウム橋複合体として含有するファクターVI
IIＣ複合体は高度に精製された形で得られる。抗−ファ
クターVIIIＲイムノソルベントカラム及びアミノヘキシ
ルセファロースカラムで処理した後、ファクターVIIIＣ
物質（複合体及び前駆体種）の純度は、全蛋白質を基礎
にして、通常は80％より高く、しばしば90％より高く、
そして98％以上でありえ、そして複合体の純度は、全蛋
白質を基礎にして20％以上であり、さらに一般的には30
％以上である。
【００２７】追加のクロマトグラフ段階、例えばデキス
トランサルフェートの使用により、ファクターVIIIＣ物
質（複合体＋前駆体）の純度レベルが90％以上に上昇す
る。調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離されたファク
ターVIIIＣ成分、すなわち92.5kd種及び77／80kdダブレ
ットの純度は通常98％以上である。上記のように、ダブ
レットの１員又は92.5kdポリペプチドに特異的なモノク
ローナル抗体を用いて複合体を得ることができる。次
に、変性剤又はチャオトロピック(chaotropic)溶剤、例
えば尿素水溶液又はチオイソシアナートを用いて複合体
を抗体から分離することができる。
トランサルフェートの使用により、ファクターVIIIＣ物
質（複合体＋前駆体）の純度レベルが90％以上に上昇す
る。調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離されたファク
ターVIIIＣ成分、すなわち92.5kd種及び77／80kdダブレ
ットの純度は通常98％以上である。上記のように、ダブ
レットの１員又は92.5kdポリペプチドに特異的なモノク
ローナル抗体を用いて複合体を得ることができる。次
に、変性剤又はチャオトロピック(chaotropic)溶剤、例
えば尿素水溶液又はチオイソシアナートを用いて複合体
を抗体から分離することができる。
【００２８】プローブの調製 67及び70kdポリペプチドのＮ−端の部分的アミノ酸配列
は次の通りである。
は次の通りである。
【００２９】
【表２】
【００３０】この配列に基いて、67／70kdダブレット用
の（従って、このダブレットが由来する77／80kdダブレ
ット用の）、次の配列を有するプローブを調製すること
ができる。
の（従って、このダブレットが由来する77／80kdダブレ
ット用の）、次の配列を有するプローブを調製すること
ができる。
【表３】
【００３１】52.5kd蛋白質のＮ−端アミノ酸配列は実質
上次の通りである。
上次の通りである。
【表４】
【００３２】このアミノ酸配列に基いて、５２．５ｋｄ
蛋白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブ
を調製することができる。
蛋白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブ
を調製することができる。
【表５】
【００３３】77／80kd蛋白質の３個の断片のアミノ酸配
列は次の通りである。
列は次の通りである。
【表６】
【００３４】これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。
【表７】 これらのペプチドの配列及び対応するプローブの調製に
ついては実験の部において詳細に後記する。
ついては実験の部において詳細に後記する。
【００３５】ＤＮＡの単離 上記のプローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約10〜25kbの断片のサイズ選
択を含む。制限消化は、クローン化される断片がオーバ
ーラップするように不完全であるべきである。これらの
断片は適当なベクターにクローン化して微生物、例えば
細菌、例えばＥ．コリ（E. coli ）中にクローンの「ラ
イブラリー」を調製することができる。プラスミド又は
ウイルス、例えばpBR322、ラムダ、シャロン４Ａ、EMBL
−４等の種々のベクターを使用することができる。
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約10〜25kbの断片のサイズ選
択を含む。制限消化は、クローン化される断片がオーバ
ーラップするように不完全であるべきである。これらの
断片は適当なベクターにクローン化して微生物、例えば
細菌、例えばＥ．コリ（E. coli ）中にクローンの「ラ
イブラリー」を調製することができる。プラスミド又は
ウイルス、例えばpBR322、ラムダ、シャロン４Ａ、EMBL
−４等の種々のベクターを使用することができる。
【００３６】酵素的に放射能ラベルした上記のプローブ
を用いてＤＮＡをスクリーニングし、そして相同な配列
を検出する。１又は複数のプローブとハイブリダイズす
るこれらの配列を再クローン化し、そして１回又は複数
回再ハイブリダイズすることができる。
を用いてＤＮＡをスクリーニングし、そして相同な配列
を検出する。１又は複数のプローブとハイブリダイズす
るこれらの配列を再クローン化し、そして１回又は複数
回再ハイブリダイズすることができる。
【００３７】最初に使用したプローブとは異る１種類又
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜10kb、さ
らに普通には１〜６kbの範囲の大きさを有する。次に、
これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリーニン
グして陽性の断片を同定することができる。次に、ＤＮ
Ａ断片の配列決定のためにプライマーとして合成プロー
ブを使用することができる。
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜10kb、さ
らに普通には１〜６kbの範囲の大きさを有する。次に、
これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリーニン
グして陽性の断片を同定することができる。次に、ＤＮ
Ａ断片の配列決定のためにプライマーとして合成プロー
ブを使用することができる。
【００３８】最も便利には配列決定される断片は、１種
類又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有
する断片であり、ここで相同な配列は５′−端から約５
塩基〜約 500塩基である。注目される他の断片には最初
にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。な
ぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにおい
て示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収する
まで染色体にそって「歩く」ために使用されるからであ
る。
類又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有
する断片であり、ここで相同な配列は５′−端から約５
塩基〜約 500塩基である。注目される他の断片には最初
にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。な
ぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにおい
て示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収する
まで染色体にそって「歩く」ために使用されるからであ
る。
【００３９】ＤＮＡ断片を配列決定した後、決定された
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。適当な位置に
おいて制限部位を容易に用いることができない場合に
は、ＤＮＡ断片を種々の時間にわたってBal 31切断（リ
セクト）により変形し、生じた断片をクローン化し、そ
して種々の技法によりＮ−端を決定することができる。
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。適当な位置に
おいて制限部位を容易に用いることができない場合に
は、ＤＮＡ断片を種々の時間にわたってBal 31切断（リ
セクト）により変形し、生じた断片をクローン化し、そ
して種々の技法によりＮ−端を決定することができる。
【００４０】便利には、リセクトされた断片が連結され
る３′−塩基の適切な選択により特定の制限酵素の認識
部位を設けることができる。この方法において、生ずる
クローンをあらかじめ定められた制限部位についてスク
リーニングすることができ、この部位は所望の部位への
リセクトされた断片の存在を示すであろう。
る３′−塩基の適切な選択により特定の制限酵素の認識
部位を設けることができる。この方法において、生ずる
クローンをあらかじめ定められた制限部位についてスク
リーニングすることができ、この部位は所望の部位への
リセクトされた断片の存在を示すであろう。
【００４１】好ましくは、エクソン、又は50bp以上、さ
らに一般的には約 100bp以上、さらには約 250bp又はこ
れより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト細胞、
特にファクターVIIIＣのためのmRNAを産生するヒト細胞
からmRNAを得るためのプローブとして使用することがで
きる。ハイブリダイズするmRNAを単離することによっ
て、卵母細胞又は網状赤血球溶解物中での翻訳、及びフ
ァクターVIIIＣに対する抗体又はファクターVIIIＣサブ
ユニットへの結合に基く凝固活性を用いるファクターVI
IIＣの産生の検出を行うことによりmRNAをスクリーニン
グすることができる。次に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を
用いてmRNAを逆転写することができる。
らに一般的には約 100bp以上、さらには約 250bp又はこ
れより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト細胞、
特にファクターVIIIＣのためのmRNAを産生するヒト細胞
からmRNAを得るためのプローブとして使用することがで
きる。ハイブリダイズするmRNAを単離することによっ
て、卵母細胞又は網状赤血球溶解物中での翻訳、及びフ
ァクターVIIIＣに対する抗体又はファクターVIIIＣサブ
ユニットへの結合に基く凝固活性を用いるファクターVI
IIＣの産生の検出を行うことによりmRNAをスクリーニン
グすることができる。次に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を
用いてmRNAを逆転写することができる。
【００４２】逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（Kl
enow断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌクレア
ーゼ、例えばＳ1 ヌクレアーゼにより末端ループを除去
することにより、種々の方法を用いて ss cDNAを ds cD
NAに転換することができる。不完全なコピーが得られる
場合、mRNAの５′−コード配列がコピーされるまでメッ
センジャーを「歩かせ」、又はcDNAプライム合成を行
い、そしてmRNAの全コード領域をコードするＤＮＡ配列
を得ることができる。
enow断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌクレア
ーゼ、例えばＳ1 ヌクレアーゼにより末端ループを除去
することにより、種々の方法を用いて ss cDNAを ds cD
NAに転換することができる。不完全なコピーが得られる
場合、mRNAの５′−コード配列がコピーされるまでメッ
センジャーを「歩かせ」、又はcDNAプライム合成を行
い、そしてmRNAの全コード領域をコードするＤＮＡ配列
を得ることができる。
【００４３】上記の方法に基いて、ファクターVIIIＣの
前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ配
列を用いて発現せしめ、又はファクターVIIIＣの特定の
サブユニット、例えば92.5kd、80kd又は77kdのサブユニ
ットをコードする小断片を用いることができる。
前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ配
列を用いて発現せしめ、又はファクターVIIIＣの特定の
サブユニット、例えば92.5kd、80kd又は77kdのサブユニ
ットをコードする小断片を用いることができる。
【００４４】前駆体ポリペプチド（プロ−ファクターVI
IIＣ）のためには、遺伝子を１端又は両端において平滑
末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に挿
入することができ、あるいは５′−コード端から下流で
切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダプ
ターに連結することができる。
IIＣ）のためには、遺伝子を１端又は両端において平滑
末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に挿
入することができ、あるいは５′−コード端から下流で
切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダプ
ターに連結することができる。
【００４５】そして、適当なＮ−端を有する断片（70kd
又は80kdポリペプチドのコード配列にあってもよく、又
は最初の塩基から下流、一般に約30塩基以下下流、さら
に一般的には約20塩基以下下流に５′−端を有してもよ
い）を、適当であればアダプターを用いて、適切なベク
ターに挿入することができる。
又は80kdポリペプチドのコード配列にあってもよく、又
は最初の塩基から下流、一般に約30塩基以下下流、さら
に一般的には約20塩基以下下流に５′−端を有してもよ
い）を、適当であればアダプターを用いて、適切なベク
ターに挿入することができる。
【００４６】染色体外要素を得るため、特定の宿主、発
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis ）、Ｂ．サーモフィ
ルス（B. thermophilus ）、Ｓ．セレビシエー（S. cer
evisiae ）等により認識される転写及び翻訳制御シグナ
ルを有する種々のベクターを使用することができる。
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis ）、Ｂ．サーモフィ
ルス（B. thermophilus ）、Ｓ．セレビシエー（S. cer
evisiae ）等により認識される転写及び翻訳制御シグナ
ルを有する種々のベクターを使用することができる。
【００４７】ベクターは宿主により認識される複製系を
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。使用される発現ベクターは
宿主により認識される転写及び翻訳シグナルを有するで
あろう。転写シグナルはプロモーター及びターミネータ
ー、並びに１又は複数個のエンハンサーのごとき補助シ
グナルを含むであろう。さらに、転写の制御は、オペレ
ーター、アクチベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含
有せしめることによって行われるであろう。転写に関す
る他の配列にはキャップ配列、ポリアデニル化配列等が
含まれる。翻訳のためには、宿主に依存して、リボゾー
ム結合部位、開始コドン、終止コドン等が存在するであ
ろう。
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。使用される発現ベクターは
宿主により認識される転写及び翻訳シグナルを有するで
あろう。転写シグナルはプロモーター及びターミネータ
ー、並びに１又は複数個のエンハンサーのごとき補助シ
グナルを含むであろう。さらに、転写の制御は、オペレ
ーター、アクチベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含
有せしめることによって行われるであろう。転写に関す
る他の配列にはキャップ配列、ポリアデニル化配列等が
含まれる。翻訳のためには、宿主に依存して、リボゾー
ム結合部位、開始コドン、終止コドン等が存在するであ
ろう。
【００４８】便利には、宿主により認識されるシグナル
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５′−及び３′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５′−及び３′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。
【００４９】分泌リーダー及びプロセシングシグナルが
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオチド
アダプターを合成し、これを、分泌リーダー及びプロセ
シングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子（この
遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５′−末端
を有する）との間に挿入し、こうすることによってアダ
プターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして遺伝
子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コドン
が整合するようにすることができよう。
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約10〜50bpのオリゴヌクレオチド
アダプターを合成し、これを、分泌リーダー及びプロセ
シングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子（この
遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５′−末端
を有する）との間に挿入し、こうすることによってアダ
プターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして遺伝
子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コドン
が整合するようにすることができよう。
【００５０】次に、こうして得られた所望の遺伝子を含
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等によ
り精製することができる。
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、HPLC等によ
り精製することができる。
【００５１】哺乳動物細胞での発現のためにはベクター
として哺乳動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウイル
ス、マロニー(Maloney)ネズミサルコーマウイルス、ア
デノウイルス等を使用することができる。これらのウイ
ルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターとして使
用するために変性されている。代表的な系においては、
組込まれたSV−40ゲノムを担持しそしてSV−40の複製の
ために必要なラージＴ抗原を産生するＣＯＳ細胞が使用
される〔Gluzman, Cell(1981) 23：175 〕。SV−40地図
上のHpa Ｉ部位からSV−40地図上の0.14部位にわたる断
片がベクターとして使用される。ファクターVIIIＣ遺伝
子又はその部分とSV−40ベクターとを連結することによ
って得られる組換プラスミドはモンキーCV−１細胞のト
ランスフェクトのために使用することができる。
として哺乳動物ウイルス、例えばSV−40、乳頭腫ウイル
ス、マロニー(Maloney)ネズミサルコーマウイルス、ア
デノウイルス等を使用することができる。これらのウイ
ルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターとして使
用するために変性されている。代表的な系においては、
組込まれたSV−40ゲノムを担持しそしてSV−40の複製の
ために必要なラージＴ抗原を産生するＣＯＳ細胞が使用
される〔Gluzman, Cell(1981) 23：175 〕。SV−40地図
上のHpa Ｉ部位からSV−40地図上の0.14部位にわたる断
片がベクターとして使用される。ファクターVIIIＣ遺伝
子又はその部分とSV−40ベクターとを連結することによ
って得られる組換プラスミドはモンキーCV−１細胞のト
ランスフェクトのために使用することができる。
【００５２】この発明に従えば、ファクターVIIIＣの精
製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定の
サブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化するた
めに使用される。ファクターVIIIＣはまた医療において
使用される。さらに、この発明によって製造されたポリ
ペプチドは、ファクターVIIIＣ、そのサブユニット及び
断片に対するモノクローナル抗体を製造するために使用
することができる。さらに、サブユニット及び断片は試
薬として使用される。この試薬はラベルされ、そして抗
体と組合わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の１
又は複数のサブユニット又はその分解断片の存在の診断
的測定において使用される。
製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定の
サブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化するた
めに使用される。ファクターVIIIＣはまた医療において
使用される。さらに、この発明によって製造されたポリ
ペプチドは、ファクターVIIIＣ、そのサブユニット及び
断片に対するモノクローナル抗体を製造するために使用
することができる。さらに、サブユニット及び断片は試
薬として使用される。この試薬はラベルされ、そして抗
体と組合わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の１
又は複数のサブユニット又はその分解断片の存在の診断
的測定において使用される。
【００５３】次に例によりこの発明をさらに具体的に説
明する。特にことわらない限りＡb は抗体を意味し、そ
してＡg は抗原を意味する。
明する。特にことわらない限りＡb は抗体を意味し、そ
してＡg は抗原を意味する。
【００５４】実験 Ｉ．ファクターVIIIＣの精製 ａ）E.G.D.Tuddenham, N.C.Trabold, J.A.Collins 及び
L.W.Hoyer, J. of Lab.Clinical Medicine (1979)93：
40により最初に記載された方法によるポリクローナル抗
VIIIＲ−セファロースカラムを用いるイムノソルベント
クロマトグラフィー；及びｂ）D.E.G.Austen, British
J. of Hemotology (1979) 43：669 により最初に記載さ
れたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグラ
フ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファク
ターVIIIＣを単離した。
L.W.Hoyer, J. of Lab.Clinical Medicine (1979)93：
40により最初に記載された方法によるポリクローナル抗
VIIIＲ−セファロースカラムを用いるイムノソルベント
クロマトグラフィー；及びｂ）D.E.G.Austen, British
J. of Hemotology (1979) 43：669 により最初に記載さ
れたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグラ
フ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファク
ターVIIIＣを単離した。
【００５５】この方法の詳細を次に記載する。アトラン
ティック・アンチボディー(Atlantic Antibody) から得
られたヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗原（VIII：
Ｒ）血清（カットNo.040−01）を、標準０−50％硫酸ア
ンモニウムカットで処理し、次にDEAEセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、又は同様の０−33％カット
で処理し、次にクロマトグラフィーを行わなかった。次
にこれらの物質をそれぞれCNBr−活性化セファロースCL
2B又は４Ｂ（ファルマシア、17−0140−01又は17−0430
−01）と接合せしめ、そしてカラムに注入した（抗VII
I：Ｒ−セファロースカラム）。
ティック・アンチボディー(Atlantic Antibody) から得
られたヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗原（VIII：
Ｒ）血清（カットNo.040−01）を、標準０−50％硫酸ア
ンモニウムカットで処理し、次にDEAEセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、又は同様の０−33％カット
で処理し、次にクロマトグラフィーを行わなかった。次
にこれらの物質をそれぞれCNBr−活性化セファロースCL
2B又は４Ｂ（ファルマシア、17−0140−01又は17−0430
−01）と接合せしめ、そしてカラムに注入した（抗VII
I：Ｒ−セファロースカラム）。
【００５６】"HEMOFIL" 、すなわち正常なヒトの新鮮な
血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（ファクター
VIIIＣ、AFH, AHG）の安定な乾燥標品（ファクターVIII
Ｃについて約40倍に濃縮されている）を、0.02Ｍイミダ
ゾール、0.15Ｍ NaCl 、0.１Ｍリジン−HCl 、0.02％ N
aN3 を含むpH7.４の緩衝液に溶解した。溶解した後、 H
EMOFILを上記の抗VIII：Ｒ−セファロースカラムに適用
した。非特異的に結合した蛋白質を0.５Ｍ NaCl に変性
された上記の緩衝液によって溶出した。
血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（ファクター
VIIIＣ、AFH, AHG）の安定な乾燥標品（ファクターVIII
Ｃについて約40倍に濃縮されている）を、0.02Ｍイミダ
ゾール、0.15Ｍ NaCl 、0.１Ｍリジン−HCl 、0.02％ N
aN3 を含むpH7.４の緩衝液に溶解した。溶解した後、 H
EMOFILを上記の抗VIII：Ｒ−セファロースカラムに適用
した。非特異的に結合した蛋白質を0.５Ｍ NaCl に変性
された上記の緩衝液によって溶出した。
【００５７】次に、0.35Ｍ CaCl2を含有する上記の緩衝
液を用いて、ファクターVIIIＣ活性を安定化する10％グ
リセリンを添加して、ファクターVIIIＣを溶出した。イ
ムノソルベントカラムからの活性画分をプールし、緩衝
液（0.02Ｍイミダゾール、0.15Ｍ NaCl 、0.１Ｍリジン
−HCl 、 0.025Ｍ CaCl2、0.02％ NaN3 、10％グリセリ
ン、pH7.４）に対して透析した。 1,100ユニットのファ
クターVIIIＣを含有する透析された画分のアリコート
を、上記の透析緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−
セファロース４Ｂカラム（１×６cm）に適用した。ファ
クターVIIIＣを0.35Ｍ CaCl2又は２Ｍ NaCl を含有する
同じ緩衝液で溶出した。500ユニット／mlのファクターV
IIIＣを含有する２mlの容積中に活性が存在することが
見出された。
液を用いて、ファクターVIIIＣ活性を安定化する10％グ
リセリンを添加して、ファクターVIIIＣを溶出した。イ
ムノソルベントカラムからの活性画分をプールし、緩衝
液（0.02Ｍイミダゾール、0.15Ｍ NaCl 、0.１Ｍリジン
−HCl 、 0.025Ｍ CaCl2、0.02％ NaN3 、10％グリセリ
ン、pH7.４）に対して透析した。 1,100ユニットのファ
クターVIIIＣを含有する透析された画分のアリコート
を、上記の透析緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−
セファロース４Ｂカラム（１×６cm）に適用した。ファ
クターVIIIＣを0.35Ｍ CaCl2又は２Ｍ NaCl を含有する
同じ緩衝液で溶出した。500ユニット／mlのファクターV
IIIＣを含有する２mlの容積中に活性が存在することが
見出された。
【００５８】同様にして行った後続の実験により、抗VI
II：Ｒカラムにおける25％引きの収量及びアミノヘキシ
ルカラムにおける約90％引きの収量が得られた。上記の
方法に代えて、イムノソルベントカラムから溶出され、
プールされ、透析された物質をまず、上記の透析緩衝液
で平衡化されたデキストランサルフェート（ファルマシ
ア）カラムに適用し、そして同じ緩衝液により溶出す
る。若干の微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フィ
ブロネクチン、 IgGはカラム上に保持され、ファクター
VIIIＣは流過液中に現われる。この液を集め、そして前
記のアミノヘキシル−セファロースカラムに負荷する。
II：Ｒカラムにおける25％引きの収量及びアミノヘキシ
ルカラムにおける約90％引きの収量が得られた。上記の
方法に代えて、イムノソルベントカラムから溶出され、
プールされ、透析された物質をまず、上記の透析緩衝液
で平衡化されたデキストランサルフェート（ファルマシ
ア）カラムに適用し、そして同じ緩衝液により溶出す
る。若干の微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フィ
ブロネクチン、 IgGはカラム上に保持され、ファクター
VIIIＣは流過液中に現われる。この液を集め、そして前
記のアミノヘキシル−セファロースカラムに負荷する。
【００５９】後続の測定により、精製されたファクター
VIIIＣ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原
(cAg) 活性が存在し、 HEMOFIL中の40倍濃縮よりさらに
5,000倍濃縮されていることが示された。ゼネラル・ジ
アグノスティクス(General Diagnostics) 製の市販の標
準的３成分キット〔APTT、ファクターVIII欠損血漿、ベ
リファイ・ノーマル・シトレート(Verify Narmal Citra
te) 〕を用いて凝固測定を行った。ファクターVIIIＣの
高レベルの生物学的活性が示された。
VIIIＣ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原
(cAg) 活性が存在し、 HEMOFIL中の40倍濃縮よりさらに
5,000倍濃縮されていることが示された。ゼネラル・ジ
アグノスティクス(General Diagnostics) 製の市販の標
準的３成分キット〔APTT、ファクターVIII欠損血漿、ベ
リファイ・ノーマル・シトレート(Verify Narmal Citra
te) 〕を用いて凝固測定を行った。ファクターVIIIＣの
高レベルの生物学的活性が示された。
【００６０】使用する抗体は阻害患者から得た。コート
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。
２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはHZabをＩ12 5 でラベルし、 ELISA測定
においてはHZabをホースラディッシュ・パーオキシダー
ゼ(HRP) と接合せしめる。ＲＩＡのための 125Ｉによる
抗体ＨＺのラベル化はHunter W.M., Radioimmunoassay,
Weir D.M編、Hand book of Experimental Immunolog
y、第３版、Vol 1, Blackwell Scientific Publication
s、オックスフォード、1978に従って行った。
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。
２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはHZabをＩ12 5 でラベルし、 ELISA測定
においてはHZabをホースラディッシュ・パーオキシダー
ゼ(HRP) と接合せしめる。ＲＩＡのための 125Ｉによる
抗体ＨＺのラベル化はHunter W.M., Radioimmunoassay,
Weir D.M編、Hand book of Experimental Immunolog
y、第３版、Vol 1, Blackwell Scientific Publication
s、オックスフォード、1978に従って行った。
【００６１】HRP-HZ接合はWilson及び Nakane, Immunof
luorescense and Related StainingTechniques, Knopp
等編、Elsevier, North-Holland Biomedical Press、ア
ムステルダム、1978、 215−224 頁に従って行った。Ｌ
Ｚは700 Bethesdaユニット／mlの活性を有し、ＨＺは1,
500 Bethesdaユニット／mlの活性を有していた。
luorescense and Related StainingTechniques, Knopp
等編、Elsevier, North-Holland Biomedical Press、ア
ムステルダム、1978、 215−224 頁に従って行った。Ｌ
Ｚは700 Bethesdaユニット／mlの活性を有し、ＨＺは1,
500 Bethesdaユニット／mlの活性を有していた。
【００６２】コート抗体（ＬＺ）は、0.１Ｍ NaHCO3(pH
9.８) 中(RIA) 又は0.05Ｍイミダゾール、0.１Ｍ NaCl
、0.01Ｍチメロサール、0.05％トウィーン20、５％ BA
S中(ELISA) 、あるいは両方法のためにPBS-CMF(１ｌに
つき、200mg KCl 、200mg KH2PO4、8.０ｇ NaCl 、1.15
ｇ無水Na2HPO4 、pH7.４) 中に3.５μｇ／mlに溶解し、
そして１mlを各チューブ（ポリスチレン）に加え、そし
て室温にて一夜インキュベートした。この溶液を吸引除
去し、そしてチューブを0.05％のトウィーン20を含有す
る0.15Ｍ NaCl 又はPBS-CMF ３〜3.５mlで３回洗浄し
た。
9.８) 中(RIA) 又は0.05Ｍイミダゾール、0.１Ｍ NaCl
、0.01Ｍチメロサール、0.05％トウィーン20、５％ BA
S中(ELISA) 、あるいは両方法のためにPBS-CMF(１ｌに
つき、200mg KCl 、200mg KH2PO4、8.０ｇ NaCl 、1.15
ｇ無水Na2HPO4 、pH7.４) 中に3.５μｇ／mlに溶解し、
そして１mlを各チューブ（ポリスチレン）に加え、そし
て室温にて一夜インキュベートした。この溶液を吸引除
去し、そしてチューブを0.05％のトウィーン20を含有す
る0.15Ｍ NaCl 又はPBS-CMF ３〜3.５mlで３回洗浄し
た。
【００６３】サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノ
スティクス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタ
ログ＃34112)を稀釈し、そして全容量がチューブ当り0.
９mlとなるようにチューブに加え、そして室温にて一夜
インキュベートする〔稀釈は、0.02Ｍ Tris 、0.15Ｍ N
aCl 、５％ BSA、0.05％トウィーン20、0.01％チメロサ
ール、pH6.５（ＲＩＡのため）中に；又は0.05Ｍイミダ
ゾール、0.１Ｍ NaCl 、0.01％チメロサール、0.05％ト
ウィーン20、５％ BSA(ELISAのため) 中に；あるいはPB
S-CMF(両方法のため) 中に行った〕。
スティクス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタ
ログ＃34112)を稀釈し、そして全容量がチューブ当り0.
９mlとなるようにチューブに加え、そして室温にて一夜
インキュベートする〔稀釈は、0.02Ｍ Tris 、0.15Ｍ N
aCl 、５％ BSA、0.05％トウィーン20、0.01％チメロサ
ール、pH6.５（ＲＩＡのため）中に；又は0.05Ｍイミダ
ゾール、0.１Ｍ NaCl 、0.01％チメロサール、0.05％ト
ウィーン20、５％ BSA(ELISAのため) 中に；あるいはPB
S-CMF(両方法のため) 中に行った〕。
【００６４】溶液を吸引除去し、そしてチューブを上記
のようにして洗浄した。ＲＩＡについては、 600μｌの
ＲＩＡ稀釈緩衝液中ファクターVIIIＣに対する 125Ｉ−
ラベル抗体（ＨＺ）５×105cpmを各チューブに加え、こ
のチューブを37℃にて16〜18時間インキュベートし、溶
液を除去し、チューブを上記のようにして洗浄し、そし
てガンマーカウンターにより計数した。
のようにして洗浄した。ＲＩＡについては、 600μｌの
ＲＩＡ稀釈緩衝液中ファクターVIIIＣに対する 125Ｉ−
ラベル抗体（ＨＺ）５×105cpmを各チューブに加え、こ
のチューブを37℃にて16〜18時間インキュベートし、溶
液を除去し、チューブを上記のようにして洗浄し、そし
てガンマーカウンターにより計数した。
【００６５】ELISAについては、抗−ファクターVIIIＣ
（ＨＺ）に接合したパーオキシダーゼ0.９mlを各チュー
ブに加え、次にこれを室温にて一夜インキュベートし、
溶液を除去し、そしてチューブを前記のようにして洗浄
し、次に0.９mlのＯＰＤ溶液(100mlについて、0.37ｇク
エン酸、1.19ｇ燐酸二ナトリウム、0.15ｇ ｏ−フェニ
レンジアミン、pH5.０、使用直前に10％ H2O2 を 250μ
ｌ添加) を加え、そして暗中、室温にて30分間インキュ
ベートした。この反応を停止するために0.５mlの６Ｎ H
Cl (又は0.９mlの１Ｍ H2SO4) を各チューブに加え、そ
してOD492 を読み取った。
（ＨＺ）に接合したパーオキシダーゼ0.９mlを各チュー
ブに加え、次にこれを室温にて一夜インキュベートし、
溶液を除去し、そしてチューブを前記のようにして洗浄
し、次に0.９mlのＯＰＤ溶液(100mlについて、0.37ｇク
エン酸、1.19ｇ燐酸二ナトリウム、0.15ｇ ｏ−フェニ
レンジアミン、pH5.０、使用直前に10％ H2O2 を 250μ
ｌ添加) を加え、そして暗中、室温にて30分間インキュ
ベートした。この反応を停止するために0.５mlの６Ｎ H
Cl (又は0.９mlの１Ｍ H2SO4) を各チューブに加え、そ
してOD492 を読み取った。
【００６６】II．ファクターVIIIＣ複合体の構造 Ａ．免疫沈澱実験 次の条件：0.１％インシュリン（安定化のためのキャリ
ヤー蛋白質として）、0.25Ｍ CaCl2、0.01％チオメロサ
ール、0.05Ｍイミダゾール、pH7.２のもとで、精製され
たファクターVIIIＣ物質についてAcA 44カラムを用いて
ゲル濾過実験を行った。溶出液のファクターVIIIＣ凝固
活性及び抗原活性を監視した。２つの抗原ピークが観察
された。ファクターVIIIＣ凝固活性を有するものはこれ
らの条件下で約 460,000の見かけ分子量を有する複合体
として挙動した（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪
失している）は67,000よりわずかに低い観察された分子
量において溶出した。
ヤー蛋白質として）、0.25Ｍ CaCl2、0.01％チオメロサ
ール、0.05Ｍイミダゾール、pH7.２のもとで、精製され
たファクターVIIIＣ物質についてAcA 44カラムを用いて
ゲル濾過実験を行った。溶出液のファクターVIIIＣ凝固
活性及び抗原活性を監視した。２つの抗原ピークが観察
された。ファクターVIIIＣ凝固活性を有するものはこれ
らの条件下で約 460,000の見かけ分子量を有する複合体
として挙動した（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪
失している）は67,000よりわずかに低い観察された分子
量において溶出した。
【００６７】標準的分析用 Laemmli SDS−ゲル電気泳動
〔Leammli, Nature (1970) 227 ：680−685 〕により
分析した場合、240, 160, 140, 115, 92.5, 80及び77kd
の種々の蛋白質種が得られた。これらの蛋白質とファク
ターVIIIＣとの関係を標準的免疫沈澱法により決定し
た。この免疫沈澱法においては、遊離の 125Ｉ−ラベル
ファクターVIIIＣから抗原−Ａb 複合体を分離するため
に、アフィニティー精製された第２抗体（ヤギ抗−マウ
スIgG 又は抗−ヒトIgG)をコートしたポリスチレンビー
ズ〔１／８インチ、プレシジョン・プラスチック・ボー
ル社(Precision Plastic Ball Co.)〕又はＳ．アウレウ
ス（S. aureus ）蛋白質Ａ−セファロースCL4Bを使用し
た。
〔Leammli, Nature (1970) 227 ：680−685 〕により
分析した場合、240, 160, 140, 115, 92.5, 80及び77kd
の種々の蛋白質種が得られた。これらの蛋白質とファク
ターVIIIＣとの関係を標準的免疫沈澱法により決定し
た。この免疫沈澱法においては、遊離の 125Ｉ−ラベル
ファクターVIIIＣから抗原−Ａb 複合体を分離するため
に、アフィニティー精製された第２抗体（ヤギ抗−マウ
スIgG 又は抗−ヒトIgG)をコートしたポリスチレンビー
ズ〔１／８インチ、プレシジョン・プラスチック・ボー
ル社(Precision Plastic Ball Co.)〕又はＳ．アウレウ
ス（S. aureus ）蛋白質Ａ−セファロースCL4Bを使用し
た。
【００６８】アフィニティーカラムから溶出した蛋白質
をヨウ素化し、そしてファクターVIIIＣに特異的な抗体
と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離さ
れたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターVIIIＣ（Ｚ）
及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称され
る。
をヨウ素化し、そしてファクターVIIIＣに特異的な抗体
と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離さ
れたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターVIIIＣ（Ｚ）
及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称され
る。
【００６９】この結果は、両抗体が77／80kdダブレット
と反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに 240kdバン
ド強く反応し、そしてダブレットと 240kd種との間の複
数のバンド(160, 140, 115, 92.5kd) の弱い沈澱をもた
らす。“Ｚ”抗体はまた92.5kd及び 240kd蛋白質を沈澱
せしめる。“Ｅ”抗体と240kd種との強い反応は、この
種がファクターVIIIＣの前駆体であることを示唆する。
と反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに 240kdバン
ド強く反応し、そしてダブレットと 240kd種との間の複
数のバンド(160, 140, 115, 92.5kd) の弱い沈澱をもた
らす。“Ｚ”抗体はまた92.5kd及び 240kd蛋白質を沈澱
せしめる。“Ｅ”抗体と240kd種との強い反応は、この
種がファクターVIIIＣの前駆体であることを示唆する。
【００７０】抗体カラムで精製したファクターVIIIＣ画
分をヨウ素化し、そしてEGTA〔エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，−
四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体と反応せ
しめた。これは、ファクターVIIIＣポリペプチドの会合
における２価陽イオン、特にCa++の役割の研究を可能に
する。阻害抗体（Ｅ）は77／80kdダブレット、並びに 1
60, 140, 115及び92.5kdの一層分子量の高い種を沈澱せ
しめることが観察された。ダブレットは常に一層強いバ
ンドの間に存在する。（この免疫沈澱実験はポリスチレ
ンビーズを用いて行った。この方法は低いバックグラウ
ンドをもたらし、ファクターVIIIＣ標品中のラベルされ
た IgGは沈澱しない。）
分をヨウ素化し、そしてEGTA〔エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′，−
四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体と反応せ
しめた。これは、ファクターVIIIＣポリペプチドの会合
における２価陽イオン、特にCa++の役割の研究を可能に
する。阻害抗体（Ｅ）は77／80kdダブレット、並びに 1
60, 140, 115及び92.5kdの一層分子量の高い種を沈澱せ
しめることが観察された。ダブレットは常に一層強いバ
ンドの間に存在する。（この免疫沈澱実験はポリスチレ
ンビーズを用いて行った。この方法は低いバックグラウ
ンドをもたらし、ファクターVIIIＣ標品中のラベルされ
た IgGは沈澱しない。）
【００７１】EGTAを含有させることにより高分子量バン
ド (92.5〜160kd)は消失するが、ダブレットの沈澱量は
影響を受けない。イムノソルベントとしてセファロース
に結合したＺ抗体を使用して同様の実験を行った。精製
したファクターVIIIＣをカラムに適用し、そして77／80
kdを介して結合した後、EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）により92.5kdポリペプチドが選択的に溶出する。こ
の方法は92.5kd種を分画調製するために使用される。こ
のイムノソルベントカラム又はこれに類似するものはフ
ァクターVIIIＣに対するポリクローナル抗体を用いて調
製される。
ド (92.5〜160kd)は消失するが、ダブレットの沈澱量は
影響を受けない。イムノソルベントとしてセファロース
に結合したＺ抗体を使用して同様の実験を行った。精製
したファクターVIIIＣをカラムに適用し、そして77／80
kdを介して結合した後、EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）により92.5kdポリペプチドが選択的に溶出する。こ
の方法は92.5kd種を分画調製するために使用される。こ
のイムノソルベントカラム又はこれに類似するものはフ
ァクターVIIIＣに対するポリクローナル抗体を用いて調
製される。
【００７２】EGTAの代りにチャオトロピック溶剤又は変
性溶剤、例えばそれぞれチオシアナート溶液又は尿素水
溶液を用いて溶出する場合、ファクターVIIIＣはさらに
精製される。これらの結果は92.5kdペプチドがCa++橋を
介して非共有結合的に77／80kdダブレットに会合してい
ることを示唆する。より分子量の高いバンド(115kd、14
0kd、160kd)はおそらく92.5kdの前駆体であろう。この
ことは、92.5kdポリペプチドに対するモノクローナル抗
体の 115kd、 140kd及び 160kdポリペプチドと交差反応
する能力により示される。
性溶剤、例えばそれぞれチオシアナート溶液又は尿素水
溶液を用いて溶出する場合、ファクターVIIIＣはさらに
精製される。これらの結果は92.5kdペプチドがCa++橋を
介して非共有結合的に77／80kdダブレットに会合してい
ることを示唆する。より分子量の高いバンド(115kd、14
0kd、160kd)はおそらく92.5kdの前駆体であろう。この
ことは、92.5kdポリペプチドに対するモノクローナル抗
体の 115kd、 140kd及び 160kdポリペプチドと交差反応
する能力により示される。
【００７３】アフィニティーカラムからの種々の蛋白質
種の関係を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J. of Immu
nol. (1975) ６：511 〕の方法によって調製したモノク
ローナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファク
ターVIIIＣの免疫沈澱により示した。Balb／c マウスを
液相免疫吸着されたファクターVIIIＣにより免疫した。
脾臓細胞(108個) を1011個のＮＳＯ又はＮＳＩマウス骨
髄腫細胞と融合させた。
種の関係を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J. of Immu
nol. (1975) ６：511 〕の方法によって調製したモノク
ローナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファク
ターVIIIＣの免疫沈澱により示した。Balb／c マウスを
液相免疫吸着されたファクターVIIIＣにより免疫した。
脾臓細胞(108個) を1011個のＮＳＯ又はＮＳＩマウス骨
髄腫細胞と融合させた。
【００７４】融合生成物を２枚の96ウエルミクロタイタ
ートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を 104
細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から顕微鏡
観察でき、そして上清液は数日毎に ELISA法により測定
した。次の層を使用した。第１層：前記Ｉにおける、ヘ
キシル−セファロース４Ｂカラムから溶出したファクタ
ーVIIIＣ；第２層：ハイブリドーマ細胞上清液；第３
層：ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP) −ラ
ベルしたヤギ抗−マウス IgG；第４層：ＨＲＰ−基質。
ートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を 104
細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から顕微鏡
観察でき、そして上清液は数日毎に ELISA法により測定
した。次の層を使用した。第１層：前記Ｉにおける、ヘ
キシル−セファロース４Ｂカラムから溶出したファクタ
ーVIIIＣ；第２層：ハイブリドーマ細胞上清液；第３
層：ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ(HRP) −ラ
ベルしたヤギ抗−マウス IgG；第４層：ＨＲＰ−基質。
【００７５】モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同
定され、その２つはファクターVIIIＣ凝固活性を阻害し
た。クラスＩ抗体は80／77kdダブレット及び 240kdポリ
ペプチドと反応し；そしてクラスII抗体は240, 160, 14
0, 115, 92.5kdの蛋白質と反応した。スロンビン消化し
たファクターVIIIとクラスＩモノクローナル抗体との免
疫沈澱は、生成した70／67kdダブレットが77／80kdダブ
レットに由来することを示す（下記参照のこと）。クラ
スIII モノクローナル抗体は、160, 140及び 115kdペプ
チドが92.5kdペプチドの前駆体であることを示す。クラ
スIII のモノクローナル抗体はさらに、精製されたファ
クターVIIIＣ物質のスロンビン消化により生成した40kd
ペプチドとも反応する。
定され、その２つはファクターVIIIＣ凝固活性を阻害し
た。クラスＩ抗体は80／77kdダブレット及び 240kdポリ
ペプチドと反応し；そしてクラスII抗体は240, 160, 14
0, 115, 92.5kdの蛋白質と反応した。スロンビン消化し
たファクターVIIIとクラスＩモノクローナル抗体との免
疫沈澱は、生成した70／67kdダブレットが77／80kdダブ
レットに由来することを示す（下記参照のこと）。クラ
スIII モノクローナル抗体は、160, 140及び 115kdペプ
チドが92.5kdペプチドの前駆体であることを示す。クラ
スIII のモノクローナル抗体はさらに、精製されたファ
クターVIIIＣ物質のスロンビン消化により生成した40kd
ペプチドとも反応する。
【００７６】ファクターVIIIＣ複合体中のCa++イオンの
役割を研究するため、EGTAを用いて上記と同様の実験を
行った。この実験はモノクローナル抗体を用いて、次の
層による ELISA法に基いて行った。第１層：単一特異性
抗（マウスIgG)；第２層：クラスIII モノクローナル抗
体（抗−92.5kd）；第３層：精製ファクターVIIIＣ物
質；第４層：77／80kdに対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。
EGTAの添加により、キレート剤を用いない対照に存在す
る結合ＨＲＰ活性が除去された。それぞれ77／80kdダブ
レット及び92.5kd蛋白質に向けられたクラスＩ及びクラ
スIII のモノクローナル抗体がそれぞれファクターVIII
Ｃ凝固活性に対して阻害的である事実は、両者がファク
ターVIIIＣ複合体の本質的構成成分であることを示唆し
ている。
役割を研究するため、EGTAを用いて上記と同様の実験を
行った。この実験はモノクローナル抗体を用いて、次の
層による ELISA法に基いて行った。第１層：単一特異性
抗（マウスIgG)；第２層：クラスIII モノクローナル抗
体（抗−92.5kd）；第３層：精製ファクターVIIIＣ物
質；第４層：77／80kdに対するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。
EGTAの添加により、キレート剤を用いない対照に存在す
る結合ＨＲＰ活性が除去された。それぞれ77／80kdダブ
レット及び92.5kd蛋白質に向けられたクラスＩ及びクラ
スIII のモノクローナル抗体がそれぞれファクターVIII
Ｃ凝固活性に対して阻害的である事実は、両者がファク
ターVIIIＣ複合体の本質的構成成分であることを示唆し
ている。
【００７７】Ｂ．ファクターVIIIＣのスロンビンによる
活性化 アミノヘキシル濃縮、アフィニティー精製したファクタ
ーVIIIＣを、２種類の異るpH条件（6.８及び7.４）を用
いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringer)、ロット
＃1072302 〕により活性化した。
活性化 アミノヘキシル濃縮、アフィニティー精製したファクタ
ーVIIIＣを、２種類の異るpH条件（6.８及び7.４）を用
いて、スロンビン〔ベーリンガー(Boehringer)、ロット
＃1072302 〕により活性化した。
【００７８】アリコートを凝固活性について測定し、そ
してさらに、サンプル（それぞれ約2.５ユニット）をゲ
ル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験におい
て、VIIIＣ活性は最初46ユニット／mlであった。これ
を、ファクターVIIIＣ緩衝液（20mMイミダゾール、pH6.
８、150mM NaCl、 100mMリジン、25mM CaCl2及び10％グ
リセリン）中に最終濃度11.5ユニット／mlに稀釈した。
してさらに、サンプル（それぞれ約2.５ユニット）をゲ
ル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験におい
て、VIIIＣ活性は最初46ユニット／mlであった。これ
を、ファクターVIIIＣ緩衝液（20mMイミダゾール、pH6.
８、150mM NaCl、 100mMリジン、25mM CaCl2及び10％グ
リセリン）中に最終濃度11.5ユニット／mlに稀釈した。
【００７９】スロンビンの最終濃度を0.12ユニット／ml
（VIIIＣの 100凝固ユニット当り約１ユニットのスロン
ビン）とした。この結果、凝固活性は約 180ユニット／
mlに上昇しそして約40ユニット／ml（実質上出発値）に
低下し、これは92.5kd種の量の同様な増加及び減少に伴
って生じた。従って、92.5kd種は活性なファクターVIII
Ｃ複合体の部分であることが示唆される。
（VIIIＣの 100凝固ユニット当り約１ユニットのスロン
ビン）とした。この結果、凝固活性は約 180ユニット／
mlに上昇しそして約40ユニット／ml（実質上出発値）に
低下し、これは92.5kd種の量の同様な増加及び減少に伴
って生じた。従って、92.5kd種は活性なファクターVIII
Ｃ複合体の部分であることが示唆される。
【００８０】製造的方法においてスロンビン活性化を用
いる目的で、一層濃縮されたファクターVIIIＣ標品を用
いて追加の実験を行った。92.5kdポリペプチドを生成せ
しめるため、１ユニットのスロンビン活性に対して約10
00〜2000凝固ユニットのファクターVIIIＣの比率で、ス
ロンビンを精製ファクターVIIIＣ物質に加え、そして短
時間(FEMOFILサンプルに依存して５〜15分間) のみ反応
せしめた。次に、得られた生成物を7.５％調製用ゲルに
適用し、そしてペプチドを電気泳動により分離し、ゲル
バンドを切り出し、そして電気溶出した。
いる目的で、一層濃縮されたファクターVIIIＣ標品を用
いて追加の実験を行った。92.5kdポリペプチドを生成せ
しめるため、１ユニットのスロンビン活性に対して約10
00〜2000凝固ユニットのファクターVIIIＣの比率で、ス
ロンビンを精製ファクターVIIIＣ物質に加え、そして短
時間(FEMOFILサンプルに依存して５〜15分間) のみ反応
せしめた。次に、得られた生成物を7.５％調製用ゲルに
適用し、そしてペプチドを電気泳動により分離し、ゲル
バンドを切り出し、そして電気溶出した。
【００８１】スロンビン消化を短時間行う場合、92.5kd
種の量は２倍又は３倍になり、同時に、77／80kdダブレ
ットは部分的にのみ67／70kd種に転換される。67／70kd
ダブレットを単離するための条件を最適にするために
は、より長時間（１時間以上）のスロンビン消化を行
う。この場合、92.5kd種は、さらに切断されてさらに小
さい断片が生ずる。スロンビン処理の後、２種類の新た
なペプチドである52.5kd及び40kdペプチドが生ずる。40
kdペプチドは92.5kd種に対するモノクローナル抗体と反
応し、従って切断生成物でなければならない。
種の量は２倍又は３倍になり、同時に、77／80kdダブレ
ットは部分的にのみ67／70kd種に転換される。67／70kd
ダブレットを単離するための条件を最適にするために
は、より長時間（１時間以上）のスロンビン消化を行
う。この場合、92.5kd種は、さらに切断されてさらに小
さい断片が生ずる。スロンビン処理の後、２種類の新た
なペプチドである52.5kd及び40kdペプチドが生ずる。40
kdペプチドは92.5kd種に対するモノクローナル抗体と反
応し、従って切断生成物でなければならない。
【００８２】52.5kbペプチドも92.5kd蛋白質に由来し、
このことは、化学的及び酵素的切断パターンの比較によ
り、すなわち92.5kd種及び52.5kd種をCNBr又はエンドプ
ロテイナーゼLysC切断にかけた場合に多数の共通の断片
が生ずる（SDS-PAGEによる）ことにより証明される。エ
ンドプロテイナーゼlysC消化のため、lysCと蛋白質との
比率を約１：１〜100 、通常は１：10とする。この消化
において、20ｐモル（4.８μｇ）のlysCを、約 100μｌ
の 0.025Ｍ Tris-HCl 、pH7.７、 0.001Ｍ EDTA 、0.08
％ SDS中で 200ｐモル（14μｇ）の70kdポリペプチドと
混合し、そして混合物を37℃にて６時間〜一夜インキュ
ベートして消化を完結した。lysC消化生成物の単離のた
めに、Orsten, Ann.N.Y.Acad.Sci. (1964) 121：321-34
9 のネイティブ・ポリアクリルアミドゲルを使用した。
このことは、化学的及び酵素的切断パターンの比較によ
り、すなわち92.5kd種及び52.5kd種をCNBr又はエンドプ
ロテイナーゼLysC切断にかけた場合に多数の共通の断片
が生ずる（SDS-PAGEによる）ことにより証明される。エ
ンドプロテイナーゼlysC消化のため、lysCと蛋白質との
比率を約１：１〜100 、通常は１：10とする。この消化
において、20ｐモル（4.８μｇ）のlysCを、約 100μｌ
の 0.025Ｍ Tris-HCl 、pH7.７、 0.001Ｍ EDTA 、0.08
％ SDS中で 200ｐモル（14μｇ）の70kdポリペプチドと
混合し、そして混合物を37℃にて６時間〜一夜インキュ
ベートして消化を完結した。lysC消化生成物の単離のた
めに、Orsten, Ann.N.Y.Acad.Sci. (1964) 121：321-34
9 のネイティブ・ポリアクリルアミドゲルを使用した。
【００８３】Ｃ．ゲル単離したVIIIＣ関連蛋白質のスロ
ンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、調製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結
果は次の通りであった。
ンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、調製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結
果は次の通りであった。
【００８４】1. 240kd蛋白質は 160, 140, 115, 92.5
kdを含む多数のバンドを生成するが、一層小分子量のバ
ンド、すなわち77／80kd又は67／70kdダブレットを生成
しない。さらに、 240kd断片を経時消化し、そしてゲル
電気泳動パターン、凝固活性、及びファクターVIIIＣ抗
原(Cag) 活性について分析した。ゲルパターンの結果は
上記と同様であり、そして Cag活性又は凝固活性は実質
上回収されなかった。
kdを含む多数のバンドを生成するが、一層小分子量のバ
ンド、すなわち77／80kd又は67／70kdダブレットを生成
しない。さらに、 240kd断片を経時消化し、そしてゲル
電気泳動パターン、凝固活性、及びファクターVIIIＣ抗
原(Cag) 活性について分析した。ゲルパターンの結果は
上記と同様であり、そして Cag活性又は凝固活性は実質
上回収されなかった。
【００８５】2. 160kd及び92.5kdゲル分離ポリペプチ
ドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質ではないよ
うである。 3. スロンビンはゲル分離された77kd及び80kd種を、そ
れぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに特異的に切
断する。スロンビン処理の後、クラスＩのモノクローナ
ル抗体は77／80kdダブレットのみならず新たな67及び70
kd種も沈澱せしめる。
ドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質ではないよ
うである。 3. スロンビンはゲル分離された77kd及び80kd種を、そ
れぞれ67kd及び70kdの新たなポリペプチドに特異的に切
断する。スロンビン処理の後、クラスＩのモノクローナ
ル抗体は77／80kdダブレットのみならず新たな67及び70
kd種も沈澱せしめる。
【００８６】Ｄ．アミノ酸配列分析 調製用ＳＤＳ電気泳動により単離された67／70kdペプチ
ド、77／80kdペプチド、及び52.5kdペプチドについて、
標準的方法により部分的アミノ酸配列情報を得た。電気
泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まって、77／80k
d、67／70kd、92.5kd及び52.5kdポリペプチドが95％以
上、通常は98％の純度で得られたことを示した。ゲル単
離されたペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライ
ド・ビオシステムス(Applied Biosystems)〕に適用し
た。ＰＴＨ−アミノ酸をHPLCカラム（ＩＢＭシアノ、25
cm）に適用し、そして得られたクロマトグラムからアミ
ノ酸配列を決定した。
ド、77／80kdペプチド、及び52.5kdペプチドについて、
標準的方法により部分的アミノ酸配列情報を得た。電気
泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まって、77／80k
d、67／70kd、92.5kd及び52.5kdポリペプチドが95％以
上、通常は98％の純度で得られたことを示した。ゲル単
離されたペプチドを気相蛋白質シーケンサー〔アプライ
ド・ビオシステムス(Applied Biosystems)〕に適用し
た。ＰＴＨ−アミノ酸をHPLCカラム（ＩＢＭシアノ、25
cm）に適用し、そして得られたクロマトグラムからアミ
ノ酸配列を決定した。
【００８７】67／70kdダブレットのアミノ端（配列表Ｂ
中棒により示す）について次の配列が決定された。
中棒により示す）について次の配列が決定された。
【表８】
【００８８】６７／70kd蛋白質のＮ−端領域のアミノ酸
配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブ
ラリーのスクリーニングに使用するために次のオリゴヌ
クレオチドプローブを合成した。 M.S.Urdea等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA (1983) 80：7461−7465に記載されて
いるホスホラミデート法を使用した。
配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライブ
ラリーのスクリーニングに使用するために次のオリゴヌ
クレオチドプローブを合成した。 M.S.Urdea等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA (1983) 80：7461−7465に記載されて
いるホスホラミデート法を使用した。
【００８９】
【表９】 次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配列の領域のス
キームを示す。
キームを示す。
【００９０】
【表10】
【００９１】後記のように92.5kd蛋白質に由来する52.5
kd蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ酸配列が決定
された。
kd蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ酸配列が決定
された。
【表11】
【００９２】52.5kdペプチドのアミノ酸配列に基いて、
次のヌクレオチド配列（コード配列）を有する部分変性
プローブを合成した。
次のヌクレオチド配列（コード配列）を有する部分変性
プローブを合成した。
【表12】
【００９３】このプローブは、ゲノムライブラリー及び
cDNAライブラリーの両者をスクリーニングするために有
用である。77／80kdダブレットをエンドプロテイナーゼ
LysC（ベーリンガーマンハイム）によって消化すること
により得られた２種類のペプチドのアミノ酸配列を決定
した。次のようにして消化を行った。77／80kdダブレッ
トをアクリルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動し、そして
ダブレットに対応するバンドを電気溶出した。分離され
た物質を精製し、エンドプロテイナーゼLysCにより消化
し、そして生成したペプチドを逆相HPLCにより分離し
た。 280nmでの吸光ピークに対応する画分を、自動シー
ケンサー（アプライド・ビオシステムス，フォスターシ
ティー，カリホルニア，モデルA70A) を用いて配列決定
した。
cDNAライブラリーの両者をスクリーニングするために有
用である。77／80kdダブレットをエンドプロテイナーゼ
LysC（ベーリンガーマンハイム）によって消化すること
により得られた２種類のペプチドのアミノ酸配列を決定
した。次のようにして消化を行った。77／80kdダブレッ
トをアクリルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動し、そして
ダブレットに対応するバンドを電気溶出した。分離され
た物質を精製し、エンドプロテイナーゼLysCにより消化
し、そして生成したペプチドを逆相HPLCにより分離し
た。 280nmでの吸光ピークに対応する画分を、自動シー
ケンサー（アプライド・ビオシステムス，フォスターシ
ティー，カリホルニア，モデルA70A) を用いて配列決定
した。
【００９４】第１配列は次の通りであった。
【表13】 このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
【表14】 第２ペプチドは次の配列を有していた。
【表15】
【００９５】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。
【表16】
【００９６】さらに、77／80kdダブレットをトリプシン
により消化した。ダブレット物質を、エンドプロテイナ
ーゼLysCによる消化について上記したのと同様にして精
製し、リジンをシトラコニル化(citraconylation) によ
りブロックしてアルギニンにおいてのみ消化されるよう
にした。シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に懸濁
し、懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメチル
化し、そしてpHを8.５〜9.０に保持しながら無水シトラ
コン酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋白質をト
リプシンで消化し、そして生成したペプチドを逆相HPLC
により分離した。 280nmにおける吸光ピークに対応する
画分を上記のようにして配列決定した。配列を次に示
す。
により消化した。ダブレット物質を、エンドプロテイナ
ーゼLysCによる消化について上記したのと同様にして精
製し、リジンをシトラコニル化(citraconylation) によ
りブロックしてアルギニンにおいてのみ消化されるよう
にした。シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に懸濁
し、懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメチル
化し、そしてpHを8.５〜9.０に保持しながら無水シトラ
コン酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋白質をト
リプシンで消化し、そして生成したペプチドを逆相HPLC
により分離した。 280nmにおける吸光ピークに対応する
画分を上記のようにして配列決定した。配列を次に示
す。
【００９７】
【表17】 このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
コード配列）を有する部分変性プローブを合成した。
【表18】
【００９８】80及び77kd種のＮ−端配列を決定するため
の方法を実施した際、これらのアミノ端がブロックされ
ていることが見出された。従って、Ｎ−端配列は他の精
製法により得られた物質から決定した。この精製法はイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換
クロマトグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いない。80／77kdダブ
レットの精製を、ファクターVIIIＣ濃縮物をモノクロー
ナル抗体カラムに適用し、次にmono S陽イオン交換体で
クロマトグラフ処理することにより行った。この物質は
ブロックされていないＮ−端を有し、ゲル濾過された80
／77kd中に検出されるブロックはゲル電気泳動により生
ずる人為的なものであることが示された。80及び77kd種
について決定されたアミノ端配列は次の通りである（配
列表Ｂ中棒で示す）。
の方法を実施した際、これらのアミノ端がブロックされ
ていることが見出された。従って、Ｎ−端配列は他の精
製法により得られた物質から決定した。この精製法はイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換
クロマトグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いない。80／77kdダブ
レットの精製を、ファクターVIIIＣ濃縮物をモノクロー
ナル抗体カラムに適用し、次にmono S陽イオン交換体で
クロマトグラフ処理することにより行った。この物質は
ブロックされていないＮ−端を有し、ゲル濾過された80
／77kd中に検出されるブロックはゲル電気泳動により生
ずる人為的なものであることが示された。80及び77kd種
について決定されたアミノ端配列は次の通りである（配
列表Ｂ中棒で示す）。
【００９９】
【表19】 Ｅ．アミノ酸組成 77／80kdペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法によ
り、次のように決定した。
り、次のように決定した。
【０１００】
【表20】
【０１０１】Ｆ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製 GM1416細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト−リン
パ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から約３mg
のＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Sau ３Ａに
より部分消化し、そして消化されたＤＮＡ(400〜500 μ
ｇ）を10％〜40％シュークロースグラジエント上で画分
した。10〜25kbのサイズの範囲の画分をプールし、 Tri
s-EDTA中で透析し、そしてSchliecher及び ScheullのEl
utip-d無菌ジスポーサブルカラムで精製した。
パ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から約３mg
のＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Sau ３Ａに
より部分消化し、そして消化されたＤＮＡ(400〜500 μ
ｇ）を10％〜40％シュークロースグラジエント上で画分
した。10〜25kbのサイズの範囲の画分をプールし、 Tri
s-EDTA中で透析し、そしてSchliecher及び ScheullのEl
utip-d無菌ジスポーサブルカラムで精製した。
【０１０２】このＤＮＡのアリコートをEMBL−４アーム
（Bam H Ｉ及びSal Ｉで消化しそしてグラジエント上で
単離することにより得られる）に連結し、そして次に１
×10 6pfu／μｇのＤＮＡ挿入効率をもってバクテリオフ
ァージλにパッケージした。使用したベクターEMBL−４
はバクテリオファージλの変形物である〔Karn等、Meth
ods Enzymol. (1983) 101 ：３−19を参照のこと〕。全
ライブラリーは５×10 6 個のファージから成る。
（Bam H Ｉ及びSal Ｉで消化しそしてグラジエント上で
単離することにより得られる）に連結し、そして次に１
×10 6pfu／μｇのＤＮＡ挿入効率をもってバクテリオフ
ァージλにパッケージした。使用したベクターEMBL−４
はバクテリオファージλの変形物である〔Karn等、Meth
ods Enzymol. (1983) 101 ：３−19を参照のこと〕。全
ライブラリーは５×10 6 個のファージから成る。
【０１０３】Ｇ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーのプレー
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリDP50株に吸着せしめ、そ
して20枚のプレートにプレート（大きさ 150×15mm）当
り 50,000pfuとしてプレーティングし、合計１×106pfu
とした。（プレート、上層寒天、及びプレーティングの
詳細な技法は、T.Maniatis, E.F.Fritsch及びJ.Sambroo
k；Cold Spring Harbor Lab、ニューヨーク、1982, Mol
ecular Cloning, A LaboratoryManual中に記載されてい
る。）
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリDP50株に吸着せしめ、そ
して20枚のプレートにプレート（大きさ 150×15mm）当
り 50,000pfuとしてプレーティングし、合計１×106pfu
とした。（プレート、上層寒天、及びプレーティングの
詳細な技法は、T.Maniatis, E.F.Fritsch及びJ.Sambroo
k；Cold Spring Harbor Lab、ニューヨーク、1982, Mol
ecular Cloning, A LaboratoryManual中に記載されてい
る。）
【０１０４】ニトロセルロースフィルターを、ファージ
プラークを有する各プレートの表面に２回適用し（こう
してパッケージされていないＤＮＡの分子をフィルター
に移す）、そして32Ｐ−ラベルされた 256倍の48マープ
ローブＤＮＡ（プローブ＃４）とハイブリダイズせしめ
た。（ニトロセルロース移行法の詳細はManiatis等、前
掲、に記載されている。）前−ハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションは Wallaceミックス（１ｌ
中に 310mlの蒸留水、 200mlの50％デキストランサルフ
ェート、 180mlの１Ｍ Tris-HCl 、pH8.２、 225mlの４
Ｍ NaCl 、20mlの0.25Ｍ EDTA 、50mlの 100× Denhart
溶液、５mlの 100％ NP-40、及び10mlの10％ SDSを含
む）中で行った。
プラークを有する各プレートの表面に２回適用し（こう
してパッケージされていないＤＮＡの分子をフィルター
に移す）、そして32Ｐ−ラベルされた 256倍の48マープ
ローブＤＮＡ（プローブ＃４）とハイブリダイズせしめ
た。（ニトロセルロース移行法の詳細はManiatis等、前
掲、に記載されている。）前−ハイブリダイゼーション
及びハイブリダイゼーションは Wallaceミックス（１ｌ
中に 310mlの蒸留水、 200mlの50％デキストランサルフ
ェート、 180mlの１Ｍ Tris-HCl 、pH8.２、 225mlの４
Ｍ NaCl 、20mlの0.25Ｍ EDTA 、50mlの 100× Denhart
溶液、５mlの 100％ NP-40、及び10mlの10％ SDSを含
む）中で行った。
【０１０５】プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを触媒として用いて、γ−ATP32 から各ＤＮＡ分子の
５′ホスフェート端に 32PO4を酵素的に移行せしめるこ
とによりラベルした。ハイブリダイゼーションの条件は
次の通りとした。10mlのハイブリダイゼーション混合物
／フィルター×5000cpm のラベル化プローブ＃４（変
性）／ml。ハイブリダイゼーションは37℃にて一夜行っ
た。フィルターを、６×SSC 、１mM EDTA 中、50〜55℃
にて洗浄し、空気乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴露し
た。
ゼを触媒として用いて、γ−ATP32 から各ＤＮＡ分子の
５′ホスフェート端に 32PO4を酵素的に移行せしめるこ
とによりラベルした。ハイブリダイゼーションの条件は
次の通りとした。10mlのハイブリダイゼーション混合物
／フィルター×5000cpm のラベル化プローブ＃４（変
性）／ml。ハイブリダイゼーションは37℃にて一夜行っ
た。フィルターを、６×SSC 、１mM EDTA 中、50〜55℃
にて洗浄し、空気乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴露し
た。
【０１０６】Ｈ．陽性クローンの特徴付け 第１回スクリーニングにおいて陽性であった23個のプラ
ークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロー
スに移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイ
ブリダイズせしめた（第２回）。11個の陽性プラークを
再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロースに移
し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブリダ
イズせしめた（第３回）。８個の陽性プラークを分離
し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ 100mlずつの液
体培養）。これら８個のクローンのそれぞれに対応する
ＤＮＡをEco R Ｉで消化し（挿入されたヒト−ゲノムＤ
ＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめるため）、
そして生成した断片を0.８％アガロースゲル上での電気
泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そしてニト
ロセルロースに移した。
ークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロー
スに移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイ
ブリダイズせしめた（第２回）。11個の陽性プラークを
再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロースに移
し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブリダ
イズせしめた（第３回）。８個の陽性プラークを分離
し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ 100mlずつの液
体培養）。これら８個のクローンのそれぞれに対応する
ＤＮＡをEco R Ｉで消化し（挿入されたヒト−ゲノムＤ
ＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめるため）、
そして生成した断片を0.８％アガロースゲル上での電気
泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そしてニト
ロセルロースに移した。
【０１０７】これを４通り行い、そして各フィルターを
32Ｐ−ラベルプローブ＃１，２，３又は４とハイブリダ
イズせしめた。フィルターをＸ線フィルムに暴露し、そ
して約4.４kdサイズの単一バンドが４種類のすべてのプ
ローブとハイブリダイズすることが、２個のクローンに
ついて見出された。これら２個のクローンは、１方が他
方に比べて大きなＤＮＡ挿入部を有する点を除き同一で
あった(15.21kbの大挿入部を有するクローンを23Ｄと称
し、約13kbの小挿入部を有するクローンを11と称す
る）。4.４kbのゲル単離されたEco R Ｉ断片をベクター
Ｍ13及び pUC−９（pBR322の誘導体）中にサブクローン
化した。プライマーとして合成プローブ＃３及びその逆
相補体を用いて M13 DNA上でジデオキシ法によりＤＮＡ
配列の決定を行った。
32Ｐ−ラベルプローブ＃１，２，３又は４とハイブリダ
イズせしめた。フィルターをＸ線フィルムに暴露し、そ
して約4.４kdサイズの単一バンドが４種類のすべてのプ
ローブとハイブリダイズすることが、２個のクローンに
ついて見出された。これら２個のクローンは、１方が他
方に比べて大きなＤＮＡ挿入部を有する点を除き同一で
あった(15.21kbの大挿入部を有するクローンを23Ｄと称
し、約13kbの小挿入部を有するクローンを11と称す
る）。4.４kbのゲル単離されたEco R Ｉ断片をベクター
Ｍ13及び pUC−９（pBR322の誘導体）中にサブクローン
化した。プライマーとして合成プローブ＃３及びその逆
相補体を用いて M13 DNA上でジデオキシ法によりＤＮＡ
配列の決定を行った。
【０１０８】4.４kb断片の部分配列を次のように決定し
た。この配列は（ ）で示すプローブ＃４の配列、及び
〔 〕で示すはじめに決定された67／70kd断片の部分ア
ミノ酸配列を含む。
た。この配列は（ ）で示すプローブ＃４の配列、及び
〔 〕で示すはじめに決定された67／70kd断片の部分ア
ミノ酸配列を含む。
【０１０９】
【表21】
【０１１０】従って、このクローンは77／80kdダブレッ
ト蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前記の
ごとくヒト−ファクターVIIIＣ複合体に部分的に対応す
る。
ト蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前記の
ごとくヒト−ファクターVIIIＣ複合体に部分的に対応す
る。
【０１１１】クローン23ＤをEco R Ｉ断片としてファー
ジＭ13中にサブクローン化し、そして挿入されたヒトＤ
ＮＡに対応する配列を決定した。クローン23Ｄの完全な
15.121kb配列を表１（配列表Ａ）に示す。サブクローン
の名称が配列の右側の欄外に示されており、３′−方向
に伸びるEco R Ｉ−Eco R Ｉを示している。 3.110kbの
オープンリーディングフレームが70−３断片の３′−末
端から4.４kb断片の中間にわたって存在することが見出
された。従って、このオープンリーディングフレームは
77／80kdダブレット蛋白質のコード領域の少なくとも部
分を含む。
ジＭ13中にサブクローン化し、そして挿入されたヒトＤ
ＮＡに対応する配列を決定した。クローン23Ｄの完全な
15.121kb配列を表１（配列表Ａ）に示す。サブクローン
の名称が配列の右側の欄外に示されており、３′−方向
に伸びるEco R Ｉ−Eco R Ｉを示している。 3.110kbの
オープンリーディングフレームが70−３断片の３′−末
端から4.４kb断片の中間にわたって存在することが見出
された。従って、このオープンリーディングフレームは
77／80kdダブレット蛋白質のコード領域の少なくとも部
分を含む。
【０１１２】Ｉ．ゲノムＤＮＡとcDNAの比較 ３個のcDNAクローンを次のようにして得た。クローンＣ
１は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン23Ｄの4.４
kb Eco R Ｉ断片から構成したプローブでスクリーニン
グすることにより得た。クローンＣ２もまた、ヒト肝臓
cDNAライブラリーを4.４kbプローブでスクリーニングす
ることにより得た。クローン２−11は、ヒト腎臓細胞を
クローン23Ｄのオープンリーディングフレームの３′−
末端に見出されるＤＮＡ配列（配列表Ａのヌクレオチド
9391〜9435）に基く合成45−マープローブでスクリーニ
ングすることによって得た。このプローブは次の非コー
ド鎖の配列から成る。
１は、ヒト肝臓cDNAライブラリーをクローン23Ｄの4.４
kb Eco R Ｉ断片から構成したプローブでスクリーニン
グすることにより得た。クローンＣ２もまた、ヒト肝臓
cDNAライブラリーを4.４kbプローブでスクリーニングす
ることにより得た。クローン２−11は、ヒト腎臓細胞を
クローン23Ｄのオープンリーディングフレームの３′−
末端に見出されるＤＮＡ配列（配列表Ａのヌクレオチド
9391〜9435）に基く合成45−マープローブでスクリーニ
ングすることによって得た。このプローブは次の非コー
ド鎖の配列から成る。
【０１１３】非コード鎖（プローブ）…
【表22】
【０１１４】クローンを配列決定し、そしてクローン23
ＤのゲノムＤＮＡに対するこれらcDNAクローンの位置
を、配列を比較することによって決定した。 304bpの長
さを有するクローンＣ１は配列表Ａ中の番号におけるヌ
クレオチド7773から8077までのオープンリーディングフ
レームに重なる。 878bpの長さを有するクローンＣ２は
オープンリーディングフレームの３′−端と部分的に重
なり、ヌクレオチド9538から始まりそしてオープンリー
ディングフレーム３′−端にあるヌクレオチド9497を越
えて伸びる。 572bpの長さを有するクローン２−11もオ
ープンリーディングフレームの３′−端と重なり、ヌク
レオチド9190から始まりそしてその末端を越えて伸び
る。これらの知見はオープンリーディングフレームが転
写されることを確認するものである。
ＤのゲノムＤＮＡに対するこれらcDNAクローンの位置
を、配列を比較することによって決定した。 304bpの長
さを有するクローンＣ１は配列表Ａ中の番号におけるヌ
クレオチド7773から8077までのオープンリーディングフ
レームに重なる。 878bpの長さを有するクローンＣ２は
オープンリーディングフレームの３′−端と部分的に重
なり、ヌクレオチド9538から始まりそしてオープンリー
ディングフレーム３′−端にあるヌクレオチド9497を越
えて伸びる。 572bpの長さを有するクローン２−11もオ
ープンリーディングフレームの３′−端と重なり、ヌク
レオチド9190から始まりそしてその末端を越えて伸び
る。これらの知見はオープンリーディングフレームが転
写されることを確認するものである。
【０１１５】4.４kbオープンリーディングフレームから
のコード情報をクローン２−11及びＣ２からの追加のコ
ード情報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべてのコード
配列に対応する 3.841kbの配列を調製しそして伸ばすこ
とができる。Ｃ１，Ｃ２、及びＣ２−11プローブに対応
する領域を枠で囲んである。
のコード情報をクローン２−11及びＣ２からの追加のコ
ード情報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべてのコード
配列に対応する 3.841kbの配列を調製しそして伸ばすこ
とができる。Ｃ１，Ｃ２、及びＣ２−11プローブに対応
する領域を枠で囲んである。
【０１１６】ファクターVIIIＣを製造するために、クロ
ーン23又はクローン11からのＤＮＡ配列を、Laub等、J.
Virology (1983) 48：271 により記載されているように
SV−40プロモーターに挿入してSV−40初期プロモーター
の制御のもとにおく。得られた組換プラスミドをＣＯＳ
細胞（Guzman、前掲）にトランスフェクトする。
ーン23又はクローン11からのＤＮＡ配列を、Laub等、J.
Virology (1983) 48：271 により記載されているように
SV−40プロモーターに挿入してSV−40初期プロモーター
の制御のもとにおく。得られた組換プラスミドをＣＯＳ
細胞（Guzman、前掲）にトランスフェクトする。
【０１１７】この方法に代えて、コード配列を、 Malon
eyネズミサルコーマウイルスの長ターミナルレピートが
挿入されているpBR322のごときプラスミドに挿入し、ク
ローン23又は11の配列をウイルス性制御系の転写制御の
もとにおくことができる。次に、構成物を３Ｔ３マウス
線維芽球に導入して効率的に発現せしめることができる
(Perkins等、Molecular and Collular Biology, 1983年
７月、 Vol 3, No.6, 1123頁を参照のこと）。
eyネズミサルコーマウイルスの長ターミナルレピートが
挿入されているpBR322のごときプラスミドに挿入し、ク
ローン23又は11の配列をウイルス性制御系の転写制御の
もとにおくことができる。次に、構成物を３Ｔ３マウス
線維芽球に導入して効率的に発現せしめることができる
(Perkins等、Molecular and Collular Biology, 1983年
７月、 Vol 3, No.6, 1123頁を参照のこと）。
【０１１８】上記の結果は、ファクターVIIIＣ複合体の
サブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離されたこ
とを示す。このゲノムＤＮＡを使用することにより、Ｄ
ＮＡをさらに操作してファクターVIIIＣ複合体サブユニ
ットをコードする配列を得ることができる。次に、この
ＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクターVIIIＣサ
ブユニットを製造することができ、これを種々の方法
で、例えば診断測定のための試薬として、療法剤とし
て、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造
のために使用することができ、これらの抗体は次にファ
クターVIIIＣ複合体の製造のため、又は他の目的のため
に使用することができる。ゲノムＤＮＡ配列はまた、プ
ロ−ファクターVIIIＣをコードするmRNAの単離のために
使用して、前駆体蛋白質を得ることができる。次にこの
蛋白質は生体内プロセシングのために用いることができ
る。
サブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離されたこ
とを示す。このゲノムＤＮＡを使用することにより、Ｄ
ＮＡをさらに操作してファクターVIIIＣ複合体サブユニ
ットをコードする配列を得ることができる。次に、この
ＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクターVIIIＣサ
ブユニットを製造することができ、これを種々の方法
で、例えば診断測定のための試薬として、療法剤とし
て、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造
のために使用することができ、これらの抗体は次にファ
クターVIIIＣ複合体の製造のため、又は他の目的のため
に使用することができる。ゲノムＤＮＡ配列はまた、プ
ロ−ファクターVIIIＣをコードするmRNAの単離のために
使用して、前駆体蛋白質を得ることができる。次にこの
蛋白質は生体内プロセシングのために用いることができ
る。
【０１１９】この発明の方法は、67／70kdダブレットを
コードする配列の５′−端に又はそれに隣接している特
異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異的配列
はまた、77／80kdダブレットのコード配列中５′−端か
ら約 200〜400 塩基、さらに正確には約 275〜325 塩基
下流に存在する。
コードする配列の５′−端に又はそれに隣接している特
異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異的配列
はまた、77／80kdダブレットのコード配列中５′−端か
ら約 200〜400 塩基、さらに正確には約 275〜325 塩基
下流に存在する。
【０１２０】なお、14.45kb Eco R Ｉ断片を含有するバ
クテリオファージλFVIII 23Ｄは1984年１月４日にA.T.
C.C.に、No.40094として寄託された。
クテリオファージλFVIII 23Ｄは1984年１月４日にA.T.
C.C.に、No.40094として寄託された。
【０１２１】
【表２３】
【０１２２】
【表24】
【０１２３】
【表25】
【０１２４】
【表26】
【０１２５】
【表27】
【０１２６】
【表28】
【０１２７】
【表29】
【０１２８】
【表30】
【０１２９】
【表31】
【０１３０】
【表32】
【０１３１】
【表33】
【０１３２】
【表34】
【０１３３】
【表35】
【０１３４】
【表36】
【０１３５】
【表37】
【０１３６】
【表38】
【０１３７】
【表39】
【０１３８】
【表40】
【０１３９】
【表41】
【０１４０】
【表42】
【０１４１】
【表43】
【０１４２】
【表44】
【０１４３】
【表45】
【０１４４】
【表46】
【０１４５】
【表47】
【０１４６】
【表48】
【０１４７】
【表49】
【０１４８】
【表50】
【０１４９】
【表51】
【０１５０】
【表52】
【０１５１】
【表53】
【０１５２】
【表54】
【０１５３】
【表55】
【０１５４】
【表56】
【０１５５】
【表57】
【０１５６】
【表58】
【０１５７】
【表59】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122, サン フランシスコ，シックスス アベニ ュ 1370 (72)発明者 フランク アール．マシャーズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サン フランシスコ，マービュー ウェイ 148 (72)発明者 マーサ トゥルート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，ブロードウェイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サン フランシスコ，アッパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国，2100 コペンハーゲン ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジェニファー ファバロロ オーストラリア国，ビクトリア，カールト ン 3035，ファラデイ ストリート 108
Claims (1)
- 【請求項１】 次のヌクレオチド配列： 【表１】 （配列中、２個のヌクレオチドが示されている部位には
それらのいずれかのヌクレオチドが存在する）で表わさ
れる個々のオリゴヌクレオチド又はそれらの組合わせを
含んで成る、ファクターVIIIＣ遺伝子に対するプロー
ブ。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/570,062 US5004804A (en) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
| US66491984A | 1984-10-26 | 1984-10-26 | |
| US570062 | 1985-01-07 | ||
| US664919 | 1985-01-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Division JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218399A JPH04218399A (ja) | 1992-08-07 |
| JPH0634760B2 true JPH0634760B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=27075219
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Expired - Lifetime JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
| JP3082573A Expired - Lifetime JPH0634760B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-04-15 | ファクターｖｉｉｉｃ遺伝子に対するプローブ |
| JP5092775A Pending JPH06105688A (ja) | 1984-01-12 | 1993-04-20 | ファクターｖｉｉｉ ｃをコードする遺伝子 |
| JP11160290A Pending JP2000023670A (ja) | 1984-01-12 | 1999-06-07 | ファクタ―ｖｉｉｉｃ組成物 |
| JP2001295193A Pending JP2002186487A (ja) | 1984-01-12 | 2001-09-26 | ファクターｖｉｉｉｃ組成物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002269A Expired - Lifetime JPH0826078B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃ組成物 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5092775A Pending JPH06105688A (ja) | 1984-01-12 | 1993-04-20 | ファクターｖｉｉｉ ｃをコードする遺伝子 |
| JP11160290A Pending JP2000023670A (ja) | 1984-01-12 | 1999-06-07 | ファクタ―ｖｉｉｉｃ組成物 |
| JP2001295193A Pending JP2002186487A (ja) | 1984-01-12 | 2001-09-26 | ファクターｖｉｉｉｃ組成物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0150735B2 (ja) |
| JP (5) | JPH0826078B2 (ja) |
| AT (2) | ATE224445T1 (ja) |
| DE (6) | DE3586402T3 (ja) |
| DK (3) | DK165506C (ja) |
| LU (4) | LU91013I2 (ja) |
| NL (4) | NL300118I2 (ja) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
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| US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| IL74909A (en) * | 1984-04-20 | 1992-01-15 | Genentech Inc | Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein |
| EP0182448A3 (en) * | 1984-08-24 | 1987-10-28 | Genetics Institute, Inc. | Production of factor viii and related products |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
| AU5772886A (en) * | 1985-04-12 | 1986-11-05 | Genetics Institute Inc. | Novel procoagulant proteins |
| KR910006424B1 (ko) * | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| FI98829C (fi) * | 1986-01-27 | 1997-08-25 | Chiron Corp | Menetelmä rekombinoidun proteiinikompleksin valmistamiseksi, jolla on humaanitekijä VIII:C-aktiivisuutta |
| US5595886A (en) * | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| EP0251843A1 (fr) * | 1986-06-06 | 1988-01-07 | Transgene S.A. | Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères |
| EP0272304B1 (en) * | 1986-06-24 | 1994-01-26 | Novo Nordisk A/S | A process for producing a coagulation active complex of factor viii fragments |
| ATE63335T1 (de) | 1986-07-11 | 1991-05-15 | Miles Inc | Herstellung von rekombinantem protein. |
| NO872932L (no) * | 1986-07-18 | 1988-01-19 | Gist Brocades Nv | Fremgangsmaate for fremstilling av proteiner med faktorviiiaktivitet ved hjelp av mikrobielle vertsceller, eksprimeringsvektorer, vertsceller, antibiotika. |
| IL84168A0 (en) * | 1986-10-15 | 1988-03-31 | Rorer Int Overseas | Human factor viii-c analogs,process for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same |
| WO1988005825A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-11 | Biogen N.V. | A method for producing factor viii in high yield |
| CA1339946C (en) * | 1987-03-31 | 1998-07-07 | Michael J. Griffith | Ultrapurification process for polypeptides |
| EP0690126B1 (en) | 1987-06-12 | 2001-11-28 | Baxter Aktiengesellschaft | Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| DE3737239A1 (de) * | 1987-11-03 | 1989-10-12 | Behringwerke Ag | Gentechnische herstellung von anticoagulatorischem protein pp4 |
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| EP0965597A4 (en) * | 1996-12-27 | 2003-01-08 | Mochida Pharm Co Ltd | CELL MEMBRANE EFFECTIVE DRUGS |
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