JPH06105688A - ファクターｖｉｉｉ ｃをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ファクターＶIII Ｃをコードする遺伝子を提
供する。 【構成】 ファクターＶIII Ｃ又はその前駆体の少なく
とも部分をコードする約２００bp以上のＤＮＡ。 【効果】 遺伝子工学的にファクターＶIII Ｃ又はその
誘導体を製造するための手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ファクターＶIII Ｃは血液凝固の
本質的経路に関与する血漿蛋白質である。遺伝性のＸ染
色体連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個体
においてはこのファクターは存在せず、又は不足してい
る。ファクターＶIII Ｃの血漿中濃度は極めて低く、そ
して一層大形の蛋白質前駆体の中間分解生成物または最
終生成物であると考えられるため、該ファクターの単離
においては大きな困難に遭遇する。従って、ファクター
ＶIII Ｃを単離しようとすれば分子量の異る有意に不均
一な複雑な混合物が得られる。

【０００２】生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用す
ることができる方法の１つに精製された形での目的蛋白
質の単離が含まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造
のための組換ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助
けとなる。目的蛋白質を手にすることによって、該蛋白
質に特異的なモノクローナル抗体を製造することがで
き、この抗体を用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメ
ッセンジャーＲＮＡからの発現、又は単細胞微生物中で
のｃＤＮＡ遺伝子からの発現において、蛋白質の製造を
確立することができる。

【０００３】さらに、アミノ酸配列を決定することによ
り、特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、
メッセンジャーＲＮＡ、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡとハ
イブリダイズするプローブを開発することができ、従っ
て該当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし、そ
して所望の生成物を１種類又は複数種類の宿主において
高収量で製造することができる。

【０００４】

【従来の技術】米国特許第４，３６１，５０９号及びこ
れに引用された文献にはファクターＶIII Ｃの精製が記
載されている。さらに、 Fulcher及びZimmerman,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA（1982）79：1648-1652 を参照のこ
と。 Tuddenham等、J.of Lab.Clinical Medicine（197
9）93：40-53 にはポリクローナル抗体を用いるファク
ターＶIII Ｃの精製について記載されている。Austen,
British J.Hematology(1979)43：669-674 にはファクタ
ーＶIII Ｃの精製のためのアミノヘキシル−セファロー
スの使用について記載されている。 Weinstein等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1981）78：5137-5141 にはファ
クターＶIII Ｃに対するスロンビンの効果が検討されて
いる。さらに、 Kuo等、Abstracts for IX Internation
al Congress of Thrombosis and Hemostasis、（コペン
ハーゲン、１９８３年７月）を参照のこと。

【０００５】

【発明の概要】微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発
現によるヒト−ファクターＶIII Ｃ、その前駆体及びサ
ブユニットの製造方法及び組成物が提供される。この方
法は、純粋なファクターＶIII Ｃ、そのサブユニット及
び断片を単離し、そして特にスロンビン消化を用いてこ
れらの生理的関連性を決定することを含む。関連する一
連のポリペプチドの各々の少なくとも部分を配列決定
し、そしてこの配列を複合プローブの開発に使用する。

【０００６】ゲノムＤＮＡ断片を相同配列について探索
し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして完全なサ
ブユニット又は断片をコードするＤＮＡ断片を得るため
にさらに操作し、そして／又は成熟ｍＲＮＡを単離する
ために使用し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る。次に
ＤＮＡ配列をさらに操作して発現ベクターに挿入し、そ
してこの発現ベクターを適合性の宿主に挿入しポリペプ
チドを発現せしめる。

【０００７】

【特定の態様の記載】ヒト−ファクターＶIII Ｃ断片及
びサブユニットが実質上純粋な形で提供される。さら
に、前駆体としての又は活性形でのファクターＶIII Ｃ
を製造するため、あるいは天然に得られるサブユニット
と組合わせて使用する個々のサブユニットを得るための
ファクターＶIII Ｃサブユニット及び断片を発現するた
めの方法及び構成物が提供される。このサブユニット及
び断片はファクターＶIII Ｃと関連する１又は複数の生
物学的性質、例えばエピトープ部位、凝固活性、及び免
疫原性を有し、抗体を製造するために使用され、この抗
体は試薬として、特にイムノアッセイにおけるラベルさ
れた試薬として使用される。

【０００８】ヒト−ファクターＶIII Ｃは、約４６０kd
の見かけ分子量を示しそして実質上純粋な形で単離され
得る複合蛋白質である。変性条件下での電気泳動に際
し、種々の分子量、すなわち２４０，１６０，１４０，
１１５，９２．５，８０、及び７７kdの多数の断片が生
じ、後２者はダブレットとして移動する。免疫的関係を
調べるために抗体を用いそして構造的関係を調べるため
に切断パターンを用いながら、化学的切断及びスロンビ
ン切断を含むプロテアーゼ切断により断片を分析するこ
とにより、９２．５kdポリペプチドが２４０，１６０，
１４０及び１１５ポリペプチドと関連しており、他方７
７／８０ダブレットは他のペプチドと共通の同定され得
る特性を有さず２４０kdポリペプチドとのみ共通の特性
を有することが示される。

【０００９】さらに、７７／８０kdダブレットはスロン
ビンにより６７／７０kdダブレットに転換され、他方ス
ロンビンで処理された精製ファクターＶIII Ｃ物質中に
存在する９２．５kdポリペプチドはスロンビンにより直
接的又は間接的に約４０及び５２．５kdの２個のポリペ
プチドに切断される。電気泳動的に単離された７７／８
０kdダブレットポリペプチドはそのＮ−端がブロックさ
れており、６７／７０kdダブレットはそのＮ−端がブロ
ックされていないことが見出される。

【００１０】さらに、ファクターＶIII Ｃの座は大きな
イントロンと共にエクソンを含み、エクソンはファクタ
ーＶIII Ｃと関連する種々の領域を含むことが見出され
る。すなわち、ファクターＶIII Ｃ複合体に関する特定
のポリペプチド及びその断片に係る個々のエクソンを単
離することができる。ファクターＶIII Ｃサブユニット
及びその断片に関する特定のアミノ酸配列を同定するこ
とにより、ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離
し、そしてそのエクソンをそれ自体として組合わせて、
又は合成ＤＮＡにより連結して、ファクターＶIII Ｃの
ポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする配
列を得、これらを製造することができる。

【００１１】便利には、エクソン及びイントロンの両者
を含有するファクターＶIII ＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳
動物細胞中での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿
入し、ｃＤＮＡのクローニングに適するように適切にス
プライスされた実質的な量のメッセンジャーＲＮＡを
得、そしてファクターＶIII Ｃ、サブユニット又は断片
を製造する。さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列
を用いてファクターＶIII Ｃをコードする天然メッセン
ジャーＲＮＡとハイブリダイズさせることができる。

【００１２】次に、このメッセンジャーＲＮＡを用いて
ファクターＶIII Ｃのサブユニットをコードするｄｓ
ｃＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡ配列は、これ
を転写及び翻訳のために必要な制御がシグナルを有する
適当な発現ベクターに挿入することによって、発現のた
めに使用することができる。ファクターＶIII Ｃ遺伝子
発現ベクター（ファクターＶIII Ｃ、その前駆体、サブ
ユニット又は断片の全体又は部分をコードする１個又は
複数個の遺伝子を担持する発現ベクター）を適合性の宿
主に導入し、そしてこの宿主をファクターＶIII Ｃの発
現のために増殖せしめることができる。

【００１３】宿主を適切に選択することにより、ファク
ターＶIII ＣのＤＮＡを分泌リーダー及びプロセシング
シグナルの下流に挿入し、生成物が宿主から分泌され、
そしてプロセシングされて完全なポリペプチドとなるよ
うにすることができる。適当であれば、このポリペプチ
ドをさらに処理してこれに天然ポリペプチド上に存在す
る官能基又は置換基を導入することができる。

【００１４】この発明の最初の段階において、高度に精
製したファクターＶIII Ｃを得そして特徴付ける。精製
されたファクターＶIII Ｃは市販のヒト−抗血友病因子
（ＡＨＦ）から得ることができる。この因子は正常なヒ
トの新鮮な血漿から冷却沈澱物として調製されるもので
あり約４０倍に濃縮されている。これを適当な緩衝液、
例えばイミダゾール−リジン−ＨＣｌ塩溶液（pH７．
４）に溶解し、次にファクターＶIII Ｃ又はファクター
ＶIII Ｒに対するポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体を有するアフィニティーカラム上でクロマトグラ
フ処理することによりファクターＶIII Ｃをさらに濃
縮、精製する。便利には、抗体をセファロース支持体に
共有結合せしめる。

【００１５】比較的高濃度のカルシウムイオンとグリセ
リンとの組合せを用いてカラムからファクターＶIII Ｃ
を溶出することができる。次に、カラムから得られた画
分を低いカルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて
透析し、そして次にアミノヘキシル−セファロースカラ
ムを用い高濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを
含む緩衝液で溶出することにより、さらに精製すること
ができる。追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチン
セファロース、ＨＰＬＣ、デキストランサルフェート又
はＭｏｎｏ Ｑ上でのイオン交換、レクチン又はファク
ターＶIII Ｃに対する抗体を用いるアフィニティーカラ
ム等によりさらに精製することができる。

【００１６】特に、デキストランサルフェートを使用す
ることにより微量汚染物、例えばフィブリノーゲン、フ
ィブロレクチン、ＩｇＧが標品から除去され、外来性蛋
白質を実質上含有しない生成物が残る。カラムからの画
分の活性は、凝固アッセイ（市販キット）及びファクタ
ーＶIII Ｃに特異的な抗体を用いて、生物学的活性及び
抗原活性のいずれか又は両方について監視することがで
きる。血漿中のファクターＶIII の濃度に基いて、上記
の方法により約２００，０００倍の精製が達成される。

【００１７】ファクターＶIII Ｃの特徴付け ゲル濾過により、ファクターＶIII Ｃが約４６０kdの見
かけ分子量を有する複合体として挙動することが示され
る。ＳＤＳ−ゲル電気泳動（変性条件）を用いて分子量
を異にする７個の個別のポリペプチドを単離することが
できる。その分子量により定義される断片は２４０，１
６０，１４０，１１５，９２．５，８０及び７７kd断片
である。これらの断片を次の方法により特徴付けた。

【００１８】第１の研究は、血友病患者から単離された
阻害抗体を用いることを含む。これらの抗体をＺ及びＥ
と称する。両抗体は７７／８０kdダブレットと反応し
た。Ｅ抗体は２４０kdポリペプチドと強く反応し、そし
てダブレットと２４０kdポリペプチドとの間の複数のバ
ンドと弱く反応した。Ｚ抗体は２４０kdポリペプチドと
も弱く反応した。

【００１９】免疫沈澱実験において、Ｅ抗体は７７／８
０kdダブレット、並びに１６０，１４０，１１５及び９
２．５kdの高分子量種を沈澱せしめ、ダブレットは一層
強いバンド中にある。ＥＧＴＡを含有せしめることによ
りダブレット以外のバンドが消失し、９２．５kd種がＣ
ａ⁺⁺橋に中介されて複合体中で７７kd及び／又は８０kd
種と会合することが示される。

【００２０】次の研究において、ファクターＶIII Ｃに
介在される凝固活性を阻害しそして複合体の成分と反応
するモノクローナル抗体を調製した。クラスＩは７７／
８０kdダブレット及び２４０kdポリペプチドと反応し、
クラスIIは１６０，１４０，１１５及び９２．５kdポリ
ペプチドと反応する。クラスＩ抗体とスロンビン消化フ
ァクターＶIII Ｃとの免疫沈澱により、生成する７０／
６７kdダブレットはファクターＶIII Ｃ中に存在する７
７／８０kdダブレットに由来することが示される。

【００２１】クラスIIモノクローナル抗体は、１６０，
１４０及び１１５kdペプチドが９２．５kdペプチドの前
駆体であることを示した。９２．５kdペプチドの切断生
成物である４０kdペプチドもクラスII抗体により結合さ
れた。ＥＧＴＡの存在下及び非存在下でモノクローナル
抗体を用いるＥＬＩＳＡ測定によりファクターＶIIIＣ
複合体の９２．５kd成分と７７kd及び／又は８０kd成分
との間のＣａ⁺⁺橋会合が確認された。

【００２２】ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両
者は、イムノソルベントカラム法においてファクターＶ
III Ｃを得るために使用することができ、又はＥＧＴＡ
を用いながら、構成成分である９２．５kd種と７７／８
０kd種を分けるために使用することができる。

【００２３】次の研究では、精製されたファクターＶII
I Ｃ物質のpH６．８又は７．４におけるスロンビン消化
を用いた。アリコートを凝固活性について測定しそして
ゲル分析のためにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は９
２．５kd種の量の増加及び減少に伴って時間と共に増加
しそして減少することが示された。精製されたファクタ
ーＶIII Ｃ物質の短時間（５〜１５分間）のスロンビン
処理により９２．５kd種の量が増加し、７７／８０kdダ
ブレットは部分的に６７／７０kdダブレットに転換され
る。

【００２４】長時間、例えば１時間スロンビン消化する
場合、９２．５kd蛋白質が分解され、そして４０kd及び
５２．５kdの２個の新たなペプチドが生じ、４０kdペプ
チドは９２．５kd種の免疫原性を維持している。５２．
５kdペプチドは、化学的及び酵素的分解パターン及び９
２．５kd種に類似する生成物により、切断生成物である
ことが示される。

【００２５】次の研究において、個々のファクターＶII
I Ｃサブユニット及び前駆体（例えば２４０，７７／８
０，９２．５kd種）を調製用ＳＤＳゲル電気泳動により
単離し、そして次に単離されたポリペプチドの経時的ス
ロンビン消化を行った。調製用ゲルから単離された２４
０kd断片は１６０，１４０，１１５、及び９２．５kdの
バンドを生成した。８０kd及び７７kdの断片はそれぞれ
７０kd及び６７kdの断片を生成した。

【００２６】７７kd及び／又は８０kd種と９２．５kdポ
リペプチドとをカルシウム橋複合体として含有するファ
クターＶIII Ｃ複合体は高度に精製された形で得られ
る。抗−ファクターＶIII Ｒイムノソルベントカラム及
びアミノヘキシルセファロースカラムで処理した後、フ
ァクターＶIII Ｃ物質（複合体及び前駆体種）の純度
は、全蛋白質を基礎にして、通常は８０％より高く、し
ばしば９０％より高く、そして９８％以上でありえ、そ
して複合体の純度は、全蛋白質を基礎にして２０％以上
であり、さらに一般的には３０％以上である。

【００２７】追加のクロマトグラフ段階、例えばデキス
トランサルフェートの使用により、ファクターＶIII Ｃ
物質（複合体＋前駆体）の純度レベルが９０％以上に上
昇する。調製用ＳＤＳゲル電気泳動により単離されたフ
ァクターＶIII Ｃ成分、すなわち９２．５kd種及び７７
／８０kdダブレットの純度は通常９８％以上である。上
記のように、ダブレットの１員又は９２．５kdポリペプ
チドに特異的なモノクローナル抗体を用いて複合体を得
ることができる。次に、変性剤又はチャオトロピック
（chaotropic) 溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソシ
アナートを用いて複合体を抗体から分離することができ
る。

【００２８】プローブの調製 ６７及び７９kdポリペプチドのＮ−端の部分的アミノ酸
配列は次の通りである。

【化２】

【００２９】この配列に基いて、６７／７０kdダブレッ
ト用の（従って、このダブレットが由来する７７／８０
kdダブレット用の）、次の配列を有するプローブを調製
することができる。

【化３】

【００３０】５２．５kd蛋白質のＮ−端アミノ酸配列は
実質上次の通りである。

【化４】

【００３１】このアミノ酸配列に基いて、５２．５kd蛋
白質用の、次のようなコード鎖を基礎にするプローブを
調製することができる。

【化５】

【００３２】７７／８０kd蛋白質の３個の断片のアミノ
酸配列は次の通りである。

【化６】

【００３３】これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎
を置くそれぞれ次のようなプローブを調製することがで
きる。

【化７】

【００３４】これらのペプチドの配列及び対応するプロ
ーブの調製については実験の部において詳細に後記す
る。ＤＮＡの単離 上記のプローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメッセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。ゲノムＤ
ＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの切断及び約１０〜２５kdの断片のサイ
ズ選択を含む。制限消化はクローン化される断片がオー
バーラップするように不完全であるべきである。これら
の断片は適当なベクターにクローン化して微生物、例え
ば細菌、例えばＥ．コリ（E.coli) 中にクローンの「ラ
イブラリー」を調製することができる。

【００３５】プラスミド又はウイルス、例えばｐＢＲ３
２２、ラムダ、シャロン４Ａ、ＥＭＢＬ−４等の種々の
ベクターを使用することができる。酵素的に放射能ラベ
ルした上記のプローブを用いてＤＮＡをスクリーニング
し、そして相同な配列を検出する。１又は複数のプロー
ブとハイブリダイズするこれらの配列を再クローン化
し、そして１回又は複数回再ハイブリダイズすることが
できる。

【００３６】最初に使用したプローブとは異る１種類又
は複数種類の制限酵素を用いて一層小さい断片を得るこ
とができる。これらの小断片は一般には約１〜１０kd、
さらに普通には１〜６kdの範囲の大きさを有する。次
に、これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリー
ニングして陽性の断片を同定することができる。次に、
ＤＮＡ断片の配列決定のためにプライマーとして合成プ
ローブを使用することができる。

【００３７】最も便利に配列決定される断片は、１種類
又は複数種類の上記のプローブと相補的な配列を含有す
る断片であり、ここで相同な配列は５′−端から約５塩
基〜約５００塩基である。注目される他の断片には最初
にクローン化された断片の末端部の断片が含まれる。な
ぜなら、これらはライブラリー中の他のクローンにおい
て示され、そしてそれ故に完全な目的遺伝子を回収する
まで染色体にそって「歩く」ために使用されるからであ
る。

【００３８】ＤＮＡ断片を配列決定した後、決定された
配列に基いてさらに操作する。この配列に基いて、決定
されたアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレー
ムを同定することができる。制限部位を決定することに
より、コード配列を失うことなく断片のサイズをさらに
小さくすることができる。但し、Ｎ−端の短い配列を除
去することは許容される。これは適当なアダプターを用
いて置き換えることができるからである。

【００３９】適当な位置において制限部位を容易に用い
ることができない場合には、ＤＮＡ断片を種々の時間に
わたってＢａｌ３１切断（リセクト）により変形し、生
じた断片をクローン化し、そして種々の技法によりＮ−
端を決定することができる。便利には、リセクトされた
断片が連結される３′−塩基の適切な選択により特定の
制限酵素の認識部位を設けることができる。この方法に
おいて、生ずるクローンをあらかじめ定められた制限部
位についてスクリーニングすることができ、この部位は
所望の部位へのリセクトされた断片の存在を示すであろ
う。

【００４０】好ましくは、エクソン、又は５０bp以上、
さらに一般的には約１００bp以上、さらには約２５０bp
又はこれより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト
細胞、特にファクターＶIII ＣのためのｍＲＮＡを産生
するヒト細胞からｍＲＮＡを得るためのプローブとして
使用することができる。ハイブリダイズするｍＲＮＡを
単離することによって、卵母細胞又は網状赤血球溶解物
中での翻訳、及びファクターＶIII Ｃに対する抗体又は
ファクターＶIII Ｃサブユニットへの結合に基く凝固活
性を用いるファクターＶIII Ｃの産生の検出を行うこと
によりｍＲＮＡをスクリーニングすることができる。次
に、例えばＡＭＶ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを逆転写
することができる。

【００４１】逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（Kl
enow断片) 第２鎖を形成しそして適当であればヌクレア
ーゼ、例えばＳ₁ ヌクレアーゼにより末端ループを除去
することにより、種々の方法を用いてｓｓ ｃＤＮＡを
ｄｓ ｃＤＮＡに転換することができる。不完全なコピ
ーが得られる場合、ｍＲＮＡの５′−コード配列がコピ
ーされるまでメッセンジャーを「歩かせ」、又はｃＤＮ
Ａプライム合成を行い、そしてｍＲＮＡの全コード領域
をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。

【００４２】上記の方法に基いて、ファクターＶIII Ｃ
の前駆体又は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ
配列を用いて発現せしめ、又はファクターＶIII Ｃの特
定のサブユニット、例えば９２．５kd、８０kd又は７７
kdのサブユニットをコードする小断片を用いることがで
きる。

【００４３】前駆体ポリペプチド（プローファクターＶ
III Ｃ）のためには、遺伝子を１端又は両端において平
滑末端化し、そして相補末端を有する発現ベクター中に
挿入することができ、あるいは５′−コード端から下流
で切断し、そしてベクターに挿入するために適当なアダ
プターに連結することができる。そして、適当なＮ−端
を有する断片（７０kd又は８０kdポリペプチドのコード
配列にあってもよく、又は最初の塩基から下流、一般に
約３０塩基以下下流、さらに一般的には約２０塩基以下
下流に５′−端を有してもよい）を、適当であればアダ
プターを用いて、適切なベクターに挿入することができ
る。

【００４４】染色体外要素を得るため、特定の宿主、発
現の態様、構成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌
が好ましいか否か等に依存して種々のベクターを使用す
ることができる。（ここで、ベクターとは無傷の複製系
を意味する。）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細
胞、又は原核性微生物及び真核性微生物、例えばＥ．コ
リ、Ｂ．ズブチリス（B.subtilis) 、Ｂ．サーモフィル
ス（B.thermophilus）、Ｓ．セレビシエー（S.cerevisi
ae）等により認識される転写及び翻訳制御シグナルを有
する種々のベクターを使用することができる。

【００４５】ベクターは宿主により認識される複製系を
有するであろう。但し、ある場合には、宿主ゲノムへの
翻訳及び転写制御シグナル並びに注目のシストロンを有
する構成物の組み込みが望ましいであろう。このような
場合には、構成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の
配列が付加されるであろう。

【００４６】使用される発現ベクターは宿主により認識
される転写及び翻訳シグナルを有するであろう。転写シ
グナルはプロモーター及びターミネーター、並びに１又
は複数個のエンハンサーのごとき補助シグナルを含むで
あろう。さらに、転写の制御は、オペレーター、アクチ
ベーター、抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめること
によって行われるであろう。転写に関する他の配列には
キャップ配列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳
のためには、宿主に依存して、リボゾーム結合部位、開
始コドン、終始コドン等が存在するであろう。

【００４７】便利には、宿主により認識されるシグナル
が適切な関連において存在するように、宿主にとって本
来的である遺伝子由来の非コード５′−及び３′−フラ
ンク領域が用いられるであろう。遺伝子のリーディング
フレームが開始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止
コドンを有し又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に
挿入されるように、上記のフランク領域を遺伝子に連結
することができる。ベクターは、選択を可能にし、そし
て宿主の増殖中に連続的な選択圧をもたらす１個又は複
数個のマーカーを有するであろう。これらのマーカーに
は、栄養要求宿主における原栄養性、抗生物質耐性、毒
性耐性等が含まれるであろう。

【００４８】分泌リーダー及びプロセシングシグナルが
設けられる場合、通常アダプターを使用する必要があろ
う。分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るＤＮＡ配列の末端又はその上流に適当な制限部位を設
けることにより、通常約１０〜５０bpのオリゴヌクレオ
チドアダプターを合成し、これを、分泌リーダー及びプ
ロセシングシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子
（この遺伝子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５′
末端を有する）との間に挿入し、こうすることによって
アダプターが必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして
遺伝子のリーディングフレームとリーダー配列の開始コ
ドンが整合するようにすることができよう。

【００４９】次に、こうして得られた所望の遺伝子を含
有する構成物を、常法、例えばトランスホーメーショ
ン、接合、トランスフェクション等によって、培養にお
いて増殖することができる宿主に導入することができ
る。次に、宿主を適当な栄養培地中で増殖せしめ、そし
て生成物を常法に従って単離することができる。生成物
が細胞内に維持される場合、細胞を集め、そして溶解す
る。分泌される場合には、生成物を培地から単離する。
生成物にクロマトグラフィーにより、例えばアフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等
により精製することができる。

【００５０】哺乳動物細胞での発現のためにはベクター
として哺乳動物ウイルス、例えばＳＶ−４０、乳頭腫ウ
イルス、マロニー（Maloney)ネズミサルコーマウイル
ス、アデノウイルス等を使用することができる。これら
のウイルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターと
して使用するために変性されている。代表的な系におい
ては、組込まれたＳＶ−４０ゲノムを担持しそしてＳＶ
−４０の複製のために必要なラージＴ抗原を産生するＣ
ＯＳ細胞が使用される〔Gluzman,Cell (1981) 23：175
〕。ＳＶ−４０地図上のＨｐａ Ｉ部位からＳＶ−４
０地図上の０．１４部位にわたる断片がベクターとして
使用される。ファクターＶIII Ｃ遺伝子又はその部分と
ＳＶ−４０ベクターとを連結することによって得られる
組換プラスミドはモンキーＣＶ−１細胞のトランスフェ
クトのために使用することができる。

【００５１】この発明に従えば、ファクターＶIII Ｃの
精製されたサブユニット及び断片が得られ、そして特定
のサブユニットを必要とする個体の凝固能力を強化する
ために使用される。ファクターＶIII Ｃはまた医療にお
いて使用される。さらに、この発明によって製造された
ポリペプチドは、ファクターＶIII Ｃ、そのサブユニッ
ト及び断片に対するモノクローナル抗体を製造するため
に使用することができる。

【００５２】さらに、サブユニット及び断片は試薬とし
て使用される。この試薬はラベルされ、そして抗体と組
合わせて生理的液体、例えば血液又は血清中の１又は複
数のサブユニット又はその分解断片の存在に診断的測定
において使用される。次に例によりこの発明をさらに具
体的に説明する。特にことわらない限りＡｂは抗体を意
味し、そしてＡｇは抗原を意味する。

【００５３】実験 Ｉ．ファクターＶIII Ｃの精製 ａ）E.G.D.Tuddenham, N.C.Trabold, J.A.Collins 及び
L.W.Hoyer, J.of Lab.Clinical Medicine (1979)93：40
により最初に記載された方法によるポリクローナル抗体
ＶIII Ｒ−セファロースカラムを用いるイムノソルベン
トクロマトグラフィー；及び ｂ）D.E.G.Austen, Brit
ish J.of Hemotology (1979)43：669 により最初に記載
されたアミノヘキシル置換アガロース上でのクロマトグ
ラフ的分離により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファ
クターＶIII Ｃを単離した。

【００５４】この方法の詳細を次に記載する。アトラン
ティック・アンチボディー（Atlantic Antibody)から得
られたヤギ抗−ヒトファクターＶIII 関連抗原（ＶIII
：Ｒ）血清（カット No.０４０−０１）を、標準０−
５０％硫酸アンモニウムカットで処理し、次にＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィーにかけ、又は同様
の０−３３％カットで処理し、次にクロマトグラフィー
を行わなかった。次にこれらの物質をそれぞれＣＮＢｒ
−活性化セファロースＣＬ２Ｂ又は４Ｂ（ファルマシ
ア、１７−０１４０−０１又は１７−０４３０−０１）
と接合せしめ、そしてカラムに注入した（抗ＶIII ：Ｒ
−セファロースカラム）。

【００５５】“ＨＥＭＯＦＩＬ”、すなわち正常なヒト
の新鮮な血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（フ
ァクターＶIII 、ＡＦＨ、ＡＨＧ）の安定な乾燥標品
（ファクターＶIII Ｃについて約４０倍に濃縮されてい
る）を、０．０２Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１Ｍリジン−ＨＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃ を含
むpH７．４の緩衝液に溶解した。

【００５６】溶解した後、ＨＥＭＯＦＩＬを上記の抗Ｖ
III ：Ｒ−セファロースカラムに適用した。非特異的に
結合した蛋白質を０．５Ｍ ＮａＣｌに変性された上記
の緩衝液によって溶出した。次に、０．３５Ｍ ＣａＣ
ｌ₂ を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターＶII
I Ｃ活性を安定化する１０％グリセリンを添加して、フ
ァクターＶIII Ｃを溶出した。イムノソルベントカラム
からの活性画分をプールし、緩衝液（０．０２Ｍイミダ
ゾール、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍリジン−ＨＣ
ｌ、０．０２５Ｍ ＣａＣｌ₂ 、０．０２％ＮａＮ₃ 、
１０％グリセリン、pH７．４）に対して透析した。

【００５７】１，１００ユニットのファクターＶIII Ｃ
を含有する透析された画分のアリコートを、上記の透析
緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−セファロース４
Ｂカラム（１×６cm）に適用した。ファクターＶIII Ｃ
を０．３５Ｍ ＣａＣｌ₂ 又は２Ｍ ＮａＣｌを含有す
る同じ緩衝液で溶出した。５００ユニット／mlのファク
ターＶIII Ｃを含有する２mlの容積中に活性が存在する
ことが見出された。同様にして行った後続の実験によ
り、抗ＶIII ：Ｒカラムにおける２５％引きの収量及び
アミノヘキシルカラムにおける約９０％引きの収量が得
られた。

【００５８】上記の方法に代えて、イムノソルベントカ
ラムから溶出され、プールされ、透析された物質をま
ず、上記の透析緩衝溶液で平衡化されたデキストランサ
ルフェート（ファルマシア）カラムに適用し、そして同
じ緩衝液により溶出する。若干の微量汚染物、例えばフ
ィブリノーゲン、フィブロネクチン、ＩｇＧはカラム上
に保持され、ファクターＶIII Ｃは流過液中に現われ
る。この液を集め、そして前記のアミノヘキシル−セフ
ァロースカラムに負荷する。

【００５９】後続の測定により、精製されたファクター
ＶIII Ｃ中に両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗
原（ｃＡｇ）活性が存在し、ＨＥＭＯＦＩＬ中の４０倍
濃縮よりさらに５，０００倍濃縮されていることが示さ
れた。ゼネラル・ジアグノスティクス（General Diagno
stics)製の市販の標準的３成分キット〔ＡＰＴＴ、ファ
クターＶIII 欠損血漿、ベリファイ・ノーマル・シトレ
ート（Verify NarmalCitrate)〕を用いて凝固測定を行
った。ファクターＶIII Ｃの高レベルの生物学的活性が
示された。

【００６０】使用する抗体は阻害患者から得た。コート
抗体（ａｂ）としての低力価（ＬＺ）を有するものと、
ラベルされるａｂとしての高力価を有するものである。
２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。ＲＩ
Ａ測定においてはＨＺａｂをＩ¹²⁵ でラベルし、ＥＬＩ
ＳＡ測定においてはＨＺａｂをホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合せしめる。ＲＩＡのた
めの ¹²⁵Ｉによる抗体ＨＺのラベル化はHunter W.M., R
adioimmunoassay, Weir D.M 編、Hand book ofExperime
ntal Immunology、第３版、Vol 1, Blackwell Scientif
ic Publications, オックスフォード、１９７８に従っ
て行った。

【００６１】ＨＲＰ−ＨＺ接合はWilson及びNakane, Im
munofluorescense and Related Staining Techniques,
Knopp 等編、Elsevier, North-Holland Biomedical Pre
ss、アムステルダム、１９７８，２１５−２２４頁に従
って行った。ＬＺは７００Bethesdaユニット／mlの活性
を有し、ＨＺは１，５００Bethesdaユニット／mlの活性
を有していた。コート抗体（ＬＺ）は、０．１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ₃(pH９．８）中（ＲＩＡ）又は０．０５Ｍイミダ
ゾール、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍチメロサー
ル、０．０５％トウィーン２０、５％ＢＳＡ中（ＥＬＩ
ＳＡ）、あるいは両方法のためにＰＢＳ−ＣＭＦ（１ｌ
につき、２００mg ＫＣｌ、２００mg ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、
８．０ｇ ＮａＣｌ、１．１５ｇ無水Ｈａ₂ ＨＰＯ₄ 、
pH７．４）中に３．５μｇ／mlに溶解し、そして１mlを
各チューブ（ポリスチレン）に加え、そして室温にて一
夜インキュベートした。

【００６２】この溶液を吸引除去し、そしてチューブを
０．０５％のトウィーン２０を含有する０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ又はＰＢＳ−ＣＭＦ３〜３．５mlで３回洗浄し
た。サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノスティク
ス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタログ＃３
４１１２）を稀釈し、そして全容量がチューブ当り０．
９mlとなるようにチューブに加え、そして室温にて一夜
インキュベートする〔稀釈は、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５％ＢＳＡ、０．０５％トウィ
ーン２０、０．０１％チメロサール、pH６．５（ＲＩＡ
のため）中に；又は０．０５Ｍイミダゾール、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１％チメロサール、０．０５％トウ
ィーン２０、５％ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡのため）中に；あ
るいはＰＢＳ−ＣＭＦ（両方法のため）中に行った〕。

【００６３】溶液を吸引除去し、そしてチューブを上記
のようにして洗浄した。ＲＩＡについては、６００μｌ
のＲＩＡ稀釈緩衝液中ファクターＶIII Ｃに対する ¹²⁵
Ｉ−ラベル抗体（ＨＺ）５×１０⁵ cpm を各チューブに
加え、このチューブを３７℃にて１６〜１８時間インキ
ュベートし、溶液を除去し、チューブを上記のようにし
て洗浄し、そしてガンマ−カウンターにより計数した。

【００６４】ＥＬＩＳＡについては、抗−ファクターＶ
III Ｃ（ＨＺ）に接合したパーオキシダーゼ０．９mlを
各チューブに加え、次にこれを室温にて一夜インキュベ
ートし、溶液を除去し、そしてチューブを前記のように
して洗浄し、次に０．９mlのＯＰＤ溶液（１００mlにつ
いて、０．３７ｇクエン酸、１．１９ｇ燐酸二ナトリウ
ム、０．１５ｇｏ−フェニレンジアミン、pH５．０、使
用直前に１０％Ｈ₂ Ｏ ₂ を２５０μｌ添加）を加え、そ
して暗中、室温にて３０分間インキュベートした。この
反応を停止するために０．５mlの６Ｎ ＨＣｌ（又は
０．９mlの１ＭＨ₂ ＳＯ₄ ）を各チューブに加え、そし
てＯＤ₄₉₂ を読み取った。

【００６５】II．ファクターＶIII Ｃ複合体の構造 Ａ．免疫沈澱実験 次の条件：０．１％インシュリン（安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として）、０．２５Ｍ ＣａＣｌ₂ 、０．
０１％チオメロサール、０．０５Ｍイミダゾール、pH
７．２のもとで、精製されたファクターＶIII Ｃ物質に
ついてＡｃＡ ４４カラムを用いてゲル濾過実験を行っ
た。溶出液のファクターＶIII Ｃ凝固活性及び抗原活性
を監視した。２つの抗原ピークが観察された。ファクタ
ーＶIII Ｃ凝固活性を有するものはこれらの条件下で約
４６０，０００の見かけ分子量を有する複合体として挙
動した（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪失してい
る）は６７，０００よりわずかに低い観察された分子量
において溶出した。

【００６６】標準的分析用 Laemmli SDS−ゲル電気泳動
〔Lesmmli,Nature（1970）227 ：680-685 〕により分析
した場合、２４０，１６０，１４０，１１５，９２．
５，８０及び７７kdの種々の蛋白質種が得られた。これ
らの蛋白質とファクターＶIIIＣとの関係を標準的免疫
沈澱法により決定した。この免疫沈澱法においては、遊
離の ¹²⁵Ｉ−ラベルファクターＶIII Ｃから抗原−Ａｂ
複合体を分離するために、アフィニティー精製された第
２抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ又は抗−ヒトＩｇＧ）を
コートしたポリスチレンビーズ〔１／８インチ、プレシ
ジョン・プラスチック・ボール社（Precision Plastic
Ball Co.）〕又はＳ．アウレウス（S.aureus) 蛋白質Ａ
−セファロースＣＬ４Ｂを使用した。

【００６７】アフィニティーカラムから溶出した蛋白質
をヨウ素化し、そしてファクターＶIII Ｃに特異的な抗
体と反応せしめた。これらの抗体は血友病患者から単離
されたヒト阻害抗体であり、抗−ファクターＶIII Ｃ
（Ｚ）及び（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称
される。

【００６８】この結果は、両抗体が７７／８０kdダブレ
ットと反応することを示す。“Ｅ”抗体はさらに２４０
kdバンド強く反応し、そしてダブレットと２４０kd種と
の間の複数のバンド（１６０，１４０，１１５，９２．
５kd）の弱い沈澱をもたらす。“Ｚ”抗体はまた９２．
５kd及び２４０kd蛋白質を沈澱せしめる。“Ｅ”抗体と
２４０kd種との強い反応は、この種がファクターＶIII
Ｃの前駆体であることを示唆する。

【００６９】抗体カラムで精製したファクターＶIII Ｃ
画分をヨウ素化し、そしてＥＧＴＡ〔エチレングリコー
ルビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′，−四酢酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体
と反応せしめた。これは、ファクターＶIII Ｃポリペプ
チドの会合における２価陽イオン、特にＣａ⁺⁺の役割の
研究を可能にする。阻害抗体（Ｅ）は７７／８０kdダブ
レット、並びに１６０，１４０，１１５及び９２．５kd
の一層分子量の高い種を沈澱せしめることが観察され
た。

【００７０】ダブレットは常に一層強いバンドの間に存
在する。（この免疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用
いて行った。この方法は低いバックグラウンドをもたら
し、ファクターＶIII Ｃ標品中のラベルされたＩｇＧは
沈澱しない。）ＥＧＴＡを含有させることにより高分子
量のバンド（９２．５〜１６０kd）は消失するが、ダブ
レットの沈澱量は影響を受けない。イムノソルベントと
してセファロースに結合したＺ抗体を使用して同様の実
験を行った。

【００７１】精製したファクターＶIII Ｃをカラムに適
用し、そして７７／８０kdを介して結合した後、ＥＤＴ
Ａ（エチレンジアミン四酢酸）により９２．５kdポリペ
プチドが選択的に溶出する。この方法は９２．５kd種を
分画調製するために使用される。このイムノソルベント
カラム又はこれに類似するものはファクターＶIII Ｃに
対するポリクローナル抗体を用いて調製される。ＥＧＴ
Ａの代りにチャオトロピック溶剤又は変性溶剤、例えば
それぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶
出する場合、ファクターＶIII Ｃはさらに精製される。

【００７２】これらの結果は９２．５kdペプチドがＣａ
⁺⁺橋を介して非共有結合的に７７／８０kdダブレットに
会合していることを示唆する。より分子量の高いバンド
（１１５kd、１４０kd、１６０kd）はおそらく９２．５
kdの前駆体であろう。このことは、９２．５kdポリペプ
チドに対するモノクローナル抗体の１１５kd、１４０kd
及び１６０kdポリペプチドと交差反応する能力により示
される。

【００７３】アフィニティーカラムからの種々の蛋白質
種の関係を、G.Kohler及びC.Milstein〔Eur.J.of Immun
ol. (1975)６：511 〕の方法によって調製したモノクロ
ーナル抗体による、ヨウ素化され、精製されたファクタ
ーＶIII Ｃの免疫沈澱により示した。Balb／c マウスを
液相免疫吸着されたファクターＶIII Ｃにより免疫し
た。脾臓細胞（１０⁸ 個）を１０¹¹個のＮＳＯ又はＮＳ
Ｉマウス骨髄腫細胞と融合させた。

【００７４】融合生成物を２枚の９６ウエルミクロタイ
タートレイにプレートした。脾臓細胞フィーダー層を１
０⁴ 細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から顕
微鏡観察でき、そして上清液は数日毎にＥＬＩＳＡ法に
より測定した。次の層を使用した。第１層：前記Ｉにお
ける、ヘキシル−セファロース４Ｂカラムから溶出した
ファクターＶIII Ｃ；第２層：ハイブリドーマ細胞上清
液；第３層：ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）−ラベルしたヤギ抗−マウスＩｇＧ；第４
層：ＨＲＰ−基質。

【００７５】モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同
定され、その２つはファクターＶIII Ｃ凝固活性を阻害
した。クラスＩ抗体は８０／７７kdダブレット及び２４
０kdポリペプチドと反応し；そしてクラスII抗体は２４
０，１６０，１４０，１１５，９２．５kdの蛋白質と反
応した。スロンビン消化したファクターＶIII とクラス
Ｉモノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した７０／
６７kdダブレットが７７／８０kdダブレットに由来する
ことを示す（下記参照のこと。）クラスIII モノクロー
ナル抗体は、１６０，１４０及び１１５kdペプチドが９
２．５kdペプチドの前駆体であることを示す。クラスII
I のモノクローナル抗体はさらに、精製されたファクタ
ーＶIII Ｃ物質のスロンビン消化により生成した４０kd
ペプチドとも反応する。

【００７６】ファクターＶIII Ｃ複合体中のＣａ⁺⁺イオ
ンの役割を研究するため、ＥＧＴＡを用いて上記と同様
の実験を行った。この実験はモノクローナル抗体を用い
て、次の層によるＥＬＩＳＡ法に基いて行った。第１
層：単一特異性抗（マウスＩｇＧ）；第２層：クラスII
I モノクローナル抗体（抗−９２．５kd）；第３層：精
製ファクターＶIII Ｃ物質；第４層：７７／８０kdに対
するＨＲＰ−ヒト阻害抗体。ＥＧＴＡの添加により、キ
レート剤を用いない対照に存在する結合ＨＲＰ活性が除
去された。

【００７７】それぞれ７７／８０kdダブレット及び９
２．５kd蛋白質に向けられたクラスＩ及びクラスIII の
モノクローナル抗体がそれぞれファクターＶIII Ｃ凝固
活性に対して阻害的である事実は、両者がファクターＶ
III Ｃ複合体の本質的構成成分であることを示唆してい
る。

【００７８】Ｂ．ファクターＶIII Ｃのスロンビンによ
る活性化 アミノヘキシル濃縮し、アフィニティー精製したファク
ターＶIII Ｃを、２種類の異るpH条件（６．８及び７．
４）を用いて、スロンビン〔ベーリンガー（Boehringe
r) 、ロット＃１０７２３０２〕により活性化した。ア
リコートを凝固活性について測定し、そしてさらに、サ
ンプル（それぞれ約２．５ユニット）をゲル分析のため
にＴＣＡ沈澱せしめた。

【００７９】第１の実験において、ＶIII Ｃ活性は最初
４６ユニット／mlであった。これを、ファクターＶIII
Ｃ緩衝液（２０mMイミダゾール、pH６．８、１５０mM
ＮａＣｌ、１００mMリジン、２５mM ＣａＣｌ₂ 及び１
０％グリセリン）中に最終濃度１１．５ユニット／mlに
稀釈した。スロンビンの最終濃度を０．１２ユニット／
ml（ＶIII Ｃの１００凝固ユニット当り約１ユニットの
スロンビン）とした。この結果、凝固活性は約１８０ユ
ニット／mlに上昇しそして約４０ユニット／ml（実質上
出発値）に低下し、これは９２．５kd種の量の同様な増
加及び減少に伴って生じた。従って、９２．５kd種は活
性なファクターＶIII Ｃ複合体の部分であることが示唆
される。

【００８０】製造的方法においてスロンビン活性化を用
いる目的で、一層濃縮されたファクターＶIII Ｃ標品を
用いて追加の実験を行った。９２．５kdポリペプチドを
生成せしめるため、１ユニットのスロンビン活性に対し
て約１０００〜２０００凝固ユニットのファクターＶII
I Ｃの比率で、スロンビンを精製ファクターＶIII Ｃ物
質に加え、そして短時間（ＦＥＭＯＦＩＬサンプルに依
存して５〜１５分間）のみ反応せしめた。次に、得られ
た生成物を７．５％調製用ゲルに適用し、そしてペプチ
ドを電気泳動により分離し、ゲルバンドを切り出し、そ
して電気溶出した。

【００８１】スロンビン消化を短時間行う場合、９２．
５kd種の量は２倍又は３倍になり、同時に、７７／８０
kdダブレットは部分的にのみ６７／７０kd種に転換され
る。６７／７０kdダブレットを単離するための条件を最
適にするためには、より長時間（１時間以上）のスロン
ビン消化を行う。この場合、９２．５kd種は、さらに切
断されてさらに小さい断片が生ずる。スロンビン処理の
後、２種類の新たなペプチドである５２．５kd及び４０
kdペプチドが生ずる。

【００８２】４０kdペプチドは９２．５kd種に対するモ
ノクローナル抗体と反応し、従って切断生成物でなけれ
ばならない。５２．５kdペプチドも９２．５kd蛋白質に
由来し、このことは、化学的及び酵素的切断パターンの
比較により、すなわち９２．５kd種及び５２．５kd種を
ＣＮＢｒ又はエンドプロテイナーゼＬｙｓＣ切断にかけ
た場合に多数の共通の断片が生ずる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による）ことにより証明される。

【００８３】エンドプロテイナーゼｌｙｓＣ消化のた
め、ｌｙｓＣと蛋白質との比率を約１：１〜１００、通
常は１：１０とする。この消化において、２０ｐモル
（４．８μｇ）のｌｙｓＣを、約１００μｌの０．０２
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．７、０．００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、０．０８％ＳＤＳ中で２００ｐモル（１４μ
ｇ）の７０kdポリペプチドと混合し、そして混合物を３
７℃にて６時間〜一夜インキュベートして消化を完結し
た。ｌｙｓＣ消化生成物の単離のために、Orsten, Ann.
N.Y.Acad.Sci. (1964) 121：321-349 のネイティブ・ポ
リアクリルアミドゲルを使用した。

【００８４】Ｃ．ゲル単離したＶIII Ｃ関連蛋白質のス
ロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するた
め、精製用ＳＤＳゲル電気泳動により多数のバンドを分
離し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結
果は次の通りであった。

【００８５】１．２４０kd蛋白質は１６０，１４０，１
１５，９２．５kdを含む多数のバンドを生成するが、一
層小分子量のバンド、すなわち７７／８０kd又は６７／
７０kdダブレットを生成しない。さらに、２４０kd断片
を経時消化し、そしてゲル電気泳動パターン、凝固活
性、及びファクターＶIII Ｃ抗原（Ｃａｇ）活性につい
て分析した。ゲルパターンの結果は上記と同様であり、
そしてＣａｇ活性又は凝固活性は実質上回収されなかっ
た。

【００８６】２．１６０kd及び９２．５kdゲル分離ポリ
ペプチドは、ゲルから分離した後スロンビンの基質では
ないようである。 ３．スロンビンはゲル分離された７７kd及び８０kd種
を、それぞれ６７kd及び７０kdの新たなポリペプチドに
特異的に切断する。スロンビン処理の後、クラスＩのモ
ノクローナル抗体は７７／８０kdダブレットのみならず
新たな６７及び７０kd種も沈澱せしめる。

【００８７】Ｄ．アミノ酸配列分析 調製用ＳＤＳ電気泳動により単離された６７／７０kdペ
プチド、７７／８０kdペプチド、及び５２．５kdペプチ
ドについて、標準的方法により部分的アミノ酸配列情報
を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果と相まっ
て、７７／８０kd、６７／７０kd、９２．５kd及び５
２．５kdポリペプチドが９５％以上、通常は９８％の純
度で得られたことを示した。

【００８８】ゲル単離されたペプチドを気相蛋白質シー
ケンサー〔アプライド・ビオシステムス（Applied Bios
ystems）〕に適用した。ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰＬＣカ
ラム（ＩＢＭシアノ、２５cm）に適用し、そして得られ
たクロマトグラムからアミノ酸配列を決定した。６７／
７０kdダブレットのアミノ端（配列表Ｂ中棒により示
す）について次の配列が決定された。

【００８９】

【化８】

【００９０】６７／７０kd蛋白質のＮ−端領域のアミノ
酸配列により得られた情報を用いて、ヒト−ゲノムライ
ブラリーのスクリーニングに使用するために次のオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成した。 M.S.Urdea等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80：7461-7465 に記載さ
れているホスホラミデート法を使用した。

【化９】

【００９１】次に、各プローブが導びかれたアミノ酸配
列の領域のスキームを示す。

【化１０】

【００９２】後記のように９２．５kd蛋白質に由来する
５２．５kd蛋白質について、Ｎ−端の下記のアミノ酸配
列が決定された。

【化１１】

【００９３】５２．５kdペプチドのアミノ酸配列に基い
て、次のヌクレオチド配列（コード配列）を有する部分
変性プローブを合成した。

【化１２】

【００９４】このプローブは、ゲノムライブラリー及び
ｃＤＮＡライブラリーの両者をスクリーニングするため
に有用である。７７／８０kdダブレットをエンドプロテ
イナーゼＬｙｓＣ（ベーリンガーマンハイム）によって
消化することにより得られた２種類のペプチドのアミノ
酸配列を決定した。

【００９５】次のようにして消化を行った。７７／８０
kdダブレットをアクリルアミド蛋白質ゲル上で電気泳動
し、そしてダブレットに対応するバンドを電気溶出し
た。分離された物質を精製し、エンドプロテイナーゼＬ
ｙｓＣにより消化し、そして生成したペプチドを逆相Ｈ
ＰＬＣにより分離した。２８０nmでの吸光ピークに対応
する画分を、自動シーケンサー（アプライド・ビオシス
テムス，フォスターシティー，カリホルニア，モデルＡ
７０Ａ）を用いて配列決定した。第１配列は次の通りで
あった。

【化１３】

【００９６】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。

【化１４】

【００９７】第２ペプチドは次の配列を有していた。

【化１５】

【００９８】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。

【化１６】

【００９９】さらに、７７／８０kdダブレットをトリプ
シンにより消化した。ダブレット物質を、エンドプロテ
イナーゼＬｙｓＣによる消化について上記したのと同様
にして精製し、リジンをシトラコニル化（citraconylat
ion)によりブロックしてアルギニンにおいてのみ消化さ
れるようにした。

【０１００】シトラコニル化は、蛋白質を変性緩衝液に
懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそしてカルボキシメ
チル化し、そしてpHを８．５〜９．０に保持しながら無
水シトラコン酸で処理した。シトラコニル化した後、蛋
白質をトリプシンで消化し、そして生成したペプチドを
逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０nmにおける吸光ピ
ークに対応する画分を上記のようにして配列決定した。
配列を次に示す。

【化１７】

【０１０１】このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオ
チド配列（非コード配列）を有する部分変性プローブを
合成した。

【化１８】

【０１０２】８０及び７７kd種のＮ−端配列を決定する
ための方法を実施した際、これらのアミノ端がブロック
されていることが見出された。従って、Ｎ−端配列は他
の精製法により得られた物質から決定した。この精製法
はイムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン
交換クロマトグラフィーを含み、そして調製用ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いない。８０／７
７kdダブレットの精製を、ファクターＶIII Ｃ濃縮物を
モノクローナル抗体カラムに適用し、次にmono

【０１０３】Ｓ陽イオン交換体でクロマトグラフ処理す
ることにより行った。この物質はブロックされていない
Ｎ−端を有し、ゲル濾過された８０／７７kd中に検出さ
れるブロックはゲル電気泳動により生ずる人為的なもの
であることが示された。８０及び７７kd種について決定
されたアミノ端配列は次の通りである（配列表Ｂ中棒で
示す）。

【化１９】

【０１０４】Ｅ．アミノ酸組成 ７７／８０kdペプチドのアミノ酸組成を、標準的方法に
より、次のように決定した。

【０１０５】

【表１】

【０１０６】Ｆ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製 ＧＭ１４１６細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト
−リンパ芽球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から
約３mgのＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３Ａにより部分消化し、そして消化されたＤＮＡ（４
００〜５００μｇ）を１０％〜４０％シュークロースグ
ラジエント上で画分した。

【０１０７】１０〜２５kdのサイズの範囲の画分をプー
ルし、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で透析し、そしてSchliech
er及びScheull のElutip-d無菌ジスポーサブルカラムで
精製した。このＤＮＡのアリコートをＥＭＢＬ−４アー
ム（ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化しそしてグラジエン
ト上で単離することにより得られる）に連結し、そして
次に１×１０⁶pfu／μｇのＤＮＡ挿入効率をもってバク
テリオファージλにパッケージした。使用したベクター
ＥＭＢＬ−４はバクテリオファージλの変形物である
〔Karn等、Methods Enzymol.(1983)101 ：3-19を参照の
こと〕。全ライブラリーは５×１０⁶ 個のファージから
成る。

【０１０８】Ｇ．ヒト４Ｘゲノムライブラリーのプレー
ティング及びスクリーニング バクテリオファージをＥ．コリＤＰ５０株に吸着せし
め、そして２０枚のプレートにプレート（大きさ１５０
×１５mm）当り５０，０００pfu としてプレーティング
し、合計１×１０⁶pfuとした。（プレート、上層寒天、
及びプレーティングの詳細な技法は、T.Maniatis, E.F.
Fritsch 及びJ.Sambrook；Cold Spring Harbor Lab, ニ
ューヨーク,1982, Molecular Cloning, A Laboratory M
annual中に記載されている。）

【０１０９】ニトロセルロースフィルターを、ファージ
プラークを有する各プレートの表面に２回適用し（こう
してパッケージされていないＤＮＡの分子をフィルター
に移す）、そして³²Ｐ−ラベルされた２５６倍の４８マ
ープローブＤＮＡ（プローブ＃４）とハイブリダイズせ
しめた。（ニトロセルロース移行法の詳細はManiatis
等、前掲、に記載されている。）前−ハイブリダイゼー
ション及びハイブリダイゼーションは Wallaceミックス
（１ｌ中に３１０mlの蒸留水、２００mlの５０％デキス
トランサルフェート、１８０mlの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、pH８．２、２２５mlの４Ｍ ＮａＣｌ、２０mlの
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、５０mlの１００×Denhart 溶
液、５mlの１００％ＮＰ−４０、及び１０mlの１０％Ｓ
ＤＳを含む）中で行った。

【０１１０】プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを触媒として用いて、γ−ＡＴＰ ³²から各ＤＮＡ分子
の５′ホスフェート端に³²ＰＯ₄ を酵素的に移行せしめ
ることによりラベルした。ハイブリダイゼーションの条
件は次の通りとした。１０mlのハイブリダイゼーション
混合物／フィルター×５０００cpm のラベル化プローブ
＃４（変性）／ml。ハイブリダイゼーションは３７℃に
て一夜行った。フィルターを、６×ＳＳＣ、１mM ＥＤ
ＴＡ中、５０〜５５℃にて洗浄し、空気乾燥し、そして
Ｘ線フィルムに暴露した。

【０１１１】Ｈ．陽性クローンの特徴付け 第１回スクリーニングにおいて陽性であった２３個のプ
ラークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハ
イブリダイズせしめた（第２回）。１１個の陽性プラー
クを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたプローブ＃４とハイブ
リダイズせしめた（第３回）。８個の陽性プラークを分
離し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ１００mlずつ
の液体培養）。

【０１１２】これら８個のクローンのそれぞれに対応す
るＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し（挿入されたヒト−ゲノ
ムＤＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめるた
め）、そして生成した断片を０．８％アガロースゲル上
での電気泳動によりサイズに従って分離し、変性し、そ
してニトロセルロースに移した。これを４通り行い、そ
して各フィルターを³²Ｐ−ラベルプローブ＃１，２，３
又は４とハイブリダイズせしめた。フィルターをＸ線フ
ィルムに暴露し、そして約４．４kdサイズの単一バンド
が４種類のすべてのプローブとハイブリダイズすること
が、２個のクローンについて見出された。

【０１１３】これら２個のクローンは、１方が他方に比
べて大きなＤＮＡ挿入部を有する点を除き同一であった
（１５．２１kdの大挿入部を有するクローンを２３Ｄと
称し、約１３kdの小挿入部を有するクローンを１１と称
する）。４．４kdのゲル単離されたＥｃｏＲＩ断片をベ
クターＭ１３及びｐＵＣ−９（ｐＢＲ３２２の誘導体）
中にサブクローン化した。プライマーとして合成プロー
ブ＃３及びその逆相補体を用いてＭ１３ＤＮＡ上でジデ
オキシ法によりＤＮＡ配列の決定を行った。

【０１１４】４．４kd断片の部分配列を次のように決定
した。この配列は（ ）で示すプローブ＃４の配列、及
び〔 〕で示すはじめに決定された６７／７０kd断片の
部分アミノ酸配列を含む。

【０１１５】

【化２０】

【０１１６】

【化２１】

【０１１７】従って、このクローンは７７／８０kdダブ
レット蛋白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前
記のごとくヒト−ファクターＶIII Ｃ複合体に部分的に
対応する。クローン２３ＤをＥｃｏＲＩ断片としてファ
ージＭ１３中にサブクローン化し、そして挿入されたヒ
トＤＮＡに対応する配列を決定した。

【０１１８】クローン２３Ｄの完全な１５．１２１kb配
列を第１表（配列表Ａ）（配列番号：１）に示す。サブ
クローンの名称が配列の右側の欄外に示されており、
３′−方向に延びるＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩを示してい
る。３．１１０kbのオープンリーディングフレームが７
０−３断片の３′−末端から４．４kb断片の中間にわた
って存在することが見出された。従って、このオープン
リーディングフレームは７７／８０kbダブレット蛋白質
のコード領域の少なくとも部分を含む。

【０１１９】Ｉ．ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの比較 ３個のｃＤＮＡクローンを次のようにして得た。クロク
ーンＣ１は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをクローン
２３Ｄの４．４kb ＥｃｏＲＩ断片から構成したプロー
ブでスクリーニングすることにより得た。クローンＣ２
もまた、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを４．４kbプロ
ーブでスクリーニングすることにより得た。クローン２
−１１は、ヒト腎臓細胞をクローン２３Ｄのオープンリ
ーディングフレームの３′−末端に見出されるＤＮＡ配
列（配列表Ａのヌクレオチド９３９１〜９４３５）に基
く合成４５−マープローブでスクリーニングすることに
よって得た。このプローブは次の非コード鎖の配列から
成る。

【０１２０】

【化２２】

【０１２１】クローンを配列決定し、そしてクローン２
３ＤのゲノムＤＮＡに対するこれらｃＤＮＡクローンの
位置を、配列を比較することによって決定した。３０４
bpの長さを有するクローンＣ１は配列表Ａ中の番号にお
けるヌクレオチド７７７３から８０７７までのオープン
リーディングフレームに重なる。

【０１２２】８７８bpの長さを有するクローンＣ２はオ
ープンリーディングフレームの３′−端と部分的に重
り、ヌクレオチド９５３８から始まりそしてオープンリ
ーディングフレーム３′−端にあるヌクレオチド９４９
７を越えて伸びる。５７２bpの長さを有するクローン２
−１１もオープンリーディングフレーム３′−端と重な
り、ヌクレオチド９１９０から始まりそしてその末端を
越えて伸びる。これらの知見はオープンリーディングフ
レームが転写されることを確認するものである。

【０１２３】４．４kbオープンリーディングフレームか
らのコード情報をクローン２−１１及びＣ２からの追加
のコード情報と組合わせて、配列表Ｂ（配列番号：２）
に示すすべてのコード配列に対応する３．８４１kbの配
列を調製しそして伸ばすことができる。Ｃ１，Ｃ２、及
びＣ２−１１プローブに対応する領域を枠で囲んであ
る。ファクターＶIII Ｃを製造するために、クローン２
３又はクローン１１からのＤＮＡ配列を、Laub等、J.Vi
rology（1983) 48：271 により記載されているようにＳ
Ｖ−４０プロモーターに挿入してＳＶ−４０初期プロモ
ーターの制御のもとにおく。

【０１２４】得られた組換プラスミドをＣＯＳ細胞（Gu
zman、前掲）にトランスフェクトする。この方法に代え
て、コード配列を、Maloney ネズミサルコーマウイルス
の長ターミナルレピートが挿入されているｐＢＲ３２２
のごときプラスミドに挿入し、クローン２３又は１１の
配列をウイルス性制御系の転写制御のもとにおくことが
できる。次に、構成物を３Ｔ３マウス線維芽球に導入し
て効率的に発現せしめることができる(Perkins等、Mole
cular and Collular Biology, 1983年７月、Vol 3, No.
6,1123頁を参照のこと) 。

【０１２５】上記の結果は、ファクターＶIII Ｃ複合体
のサブユニットをコードするゲノムＤＮＡが単離された
ことを示す。このゲノムＤＮＡを使用することにより、
ＤＮＡをさらに操作してファクターＶIII Ｃ複合体サブ
ユニットをコードする配列を得ることができる。

【０１２６】次に、このＤＮＡを発現ベクター中で使用
し、ファクターＶIII Ｃサブユニットを製造することが
でき、これを種々の方法で、例えば診断測定のための試
薬として、療法剤として、モノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体の製造のために使用することでき、これ
らの抗体は次にファクターＶIII Ｃ複合体の製造のた
め、又は他の目的のために使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡ配列はまた、プロ−ファクターＶIII Ｃをコー
ドするｍＲＮＡの単離のために使用して、前駆体蛋白質
を得ることができる。次にこの蛋白質は生体内プロセシ
ングのために用いることができる。

【０１２７】この発明の方法は、６７／７０kdダブレッ
トをコードする配列の５′−端に又はそれに隣接してい
る特異的配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異的
配列はまた、７７／８０kdダブレットのコード配列中
５′−端から約２００〜４００塩基、さらに正確には約
２７５〜３２５塩基下流に存在する。なお、１４．４３
kb ＥｃｏＲＩ断片を含有するバクテリオファージλＦ
ＶIII ２３Ｄは１９８４年１月４日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．
に、 No.４００９４として寄託された。

【０１２８】

【化２３】

【０１２９】

【化２４】

【０１３０】

【化２５】

【０１３１】

【化２６】

【０１３２】

【化２７】

【０１３３】

【化２８】

【０１３４】

【化２９】

【０１３５】

【化３０】

【０１３６】

【化３１】

【０１３７】

【化３２】

【０１３８】

【化３３】

【０１３９】

【化３４】

【０１４０】

【化３５】

【０１４１】

【化３６】

【０１４２】

【化３７】

【０１４３】

【化３８】

【０１４４】

【化３９】

【０１４５】

【化４０】

【０１４６】

【化４１】

【０１４７】

【化４２】

【０１４８】

【化４３】

【０１４９】

【化４４】

【０１５０】

【化４５】

【０１５１】

【化４６】

【０１５２】

【化４７】

【０１５３】

【化４８】

【０１５４】

【化４９】

【０１５５】

【化５０】

【０１５６】

【化５１】

【０１５７】

【化５２】

【０１５８】

【化５３】

【０１５９】

【化５４】

【０１６０】

【化５５】

【０１６１】

【化５６】

【０１６２】

【化５７】

【０１６３】

【化５８】

【０１６４】

【化５９】

【０１６５】

【化６０】

【０１６６】

【化６１】

【０１６７】

【化６２】

【０１６８】

【化６３】

【０１６９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５１５４ 塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 由来： 生物：ヒト 配列

【０１７０】 GAATTCCCCG GATCTCTTAT ATTCCATTGA CTTATTGGTC TATCTTTGTA CCAGTAACAT 60 ACTATCTTAT AGTAAGTTTT AATATTTGTT AGTATAATTC CTCCAACTTT GCTCTCTTTG 120 ATTTTTATAT AAATTTTAGA ATCATCTTGT CAATTTTATC AATAAAAATA TCTTCTGAGG 180 TTTTGATAGG GATTACATTG ATTCTGCAGA TCAATTTGGG GGAGCATACC TCTTGACAAT 240 ATTGAGTATT CCTGTCCATG AGCATGGTTT AGTTATTTAT TTACATCTTT TAAATTTTCT 300 CTTGGCAATG TTTTTGTAAA ATTTTAGTGT ACAGGTCTTG CACATTTTTG TAAAGTGTAT 360 TCTTTGGTAT TTAATGCTAT TATAATATTT TTTATGGTAT CAGTTTTTGT CAATTGTGTT 420 TTTCTAGAAA TATGTCCCTT TCATCTAAGT TGTTTAATTT ACTTGAAGTA AGTTATTTGT 480 AATGTTCTTT TATCATCCTT ATAATGTCTG TACTGATGTC TCCGTTTTCA TACCTGATAT 540 TGTTATTTAT ATTTTATCTA TTTTAAGTTT ATCGCCTGCA CCCACTAACT CGTCATCTAG 600

【０１７１】 CATTAGGTAT ATCTCCCAAT GATATCCCTC GCCCCTCCCC CTAGTGCACA TGTACCCTAA 660 AACTTAAAGT ATAATAAAAA AAAAAAGTTT GTCGCCTTTG TTATAGGTTC ATCAAATTTA 720 CTAATCCTAC CATAGGATCA AATTTTTGCT TTGTTCATCA GGTCATGGAA TTAAAAAAAT 780 TTTTTTGTTT TGTTTATTTT CTATGTTGAA TTTTTATTTT TATTTTGCTT TGCATTTCAT 840 TTATTTCTGG TCTTTTGTTA TTATTCCAAT ACTTTCTCTG GATTCAGTTT TCTTTTTCTT 900 CTTGACTTCT TGAGATTAAA ACTTGGTTCA TTGATTTTCA ACATTTCTTA CTTTTTAAAA 960 GTTCATACAA AGCATAAATT TCCCTTTATA TACTGCTTTA ACCCCATATC ACAAATTTTG 1020 ATGAGTCATA TTTTTATTAT CATTGAGTTT AAAATATTTT ATAAATTTTA CGTTATTTCT 1080 TGTTTTATTC ATAGTTATTT TACAGTGTTT TACTTAATTT CCCAATATAT GGCGATTTTC 1140 TGGCTCTCTC TCTGTTGCTG ATTTATTTGT TTTACTGTGA TCACATAACA TACTCTATAT 1200

【０１７２】 TATTTCAATC ATTTGAAATT TGTTGAGACT TGCTATATGC CCAGTGAATA ATTTAATTTG 1260 ATTAATGGCC CACTGCATTT GAAACAAATA TGTCTTTGCT GTTATTGGGT AGAGTGTCAT 1320 ATATTTGCCT ATTATGTCAA GTTGCTTTAT CATGTTTTTA AAATCCTTAT AAACTTCCTG 1380 ATATTTTATC TGTTTCTTAC AGACATGGAG GAAACTGTGA CATCTCTGTG ATTGTTGAGT 1440 TTGTTATTTT GATTTTTGTA TTTGTTAGTA AGAATGTTTC AAAATAAATG AGGCAATATA 1500 AAATCAGGTG CTTACAACTT TAAGGTTGTA TTCTTATTAA ATCAATTCTT TCATCTTTGT 1560 GAAATGTCCT TTTTGTCTGA AGTAGTACTT GTTGCCTTAA ACGTCTGCAT TGTCTAAAAT 1620 TTATACACCT GCACTATCAT ATTTATTTTG CTTAATGTTT GTGTGGTATA TATTTCCCAT 1680 TCTTTTCTTT TCAACCTATC TCTATCCTTA TATTTACAGT GTGTCTTTTT TAACATTTTC 1740 TGTAGTGCAA GTCTGTTGGT TAATTAATTT TGTCAGTTTT TGCTTCTCTG AAAAGTCTTT 1800

【０１７３】 ATTTCTGTTT TTGAATTATA TCTTCACTGT GTATAGAATT CTGGGTTTGT GGTTGTTGTT 1860 TTTGTTTTAT TACATTTTGT TTTATTGGTT TTTCCCTCAG CACTTTAAAA ATGCCGCTCC 1920 ATTGTTTCTA CTTGCATAGT TTTTCACAAT AAGTTTGTTG TAATTCCCAT TTGCATTCAA 1980 CTGTACATAA TGTATCTTTT TAAAAAAATC TGGATGGCTT CAAGCTCTTT ACTTTGATTT 2040 TTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTTACTTTGG CATTCTCTAG 2100 GCTTATTCAA TCTGTAATTT GGTATCATTA ATTTTGAAAA ATATTTATCA TCTGTGTCTT 2160 CAAATATTGC TTCTAATTCT TTCTCTTCTT CTGGTATTGC ATTTACATAT ATTATACTGT 2220 TCAATTTTGT CACACAGCTC TTGAATATGC TGTTCTAGTT TGTTTTCTAA CTATTTTTCC 2280 TTCTAGTTGT TCAGTTTTGT TGACATTTAT TGACCTATTT TTACTTCAGT AATTGTTTCC 2340 TGGGTTGTTG AGTTAATTGA TGAACTCATA GATGACATAC AATTTATCTT TTTATTCTTG 2400

【０１７４】 TGTCACTTGT GCTTTTGATG TCACATCTAG GAAGGCTTTG TCTAGCCCAA GGCCACATTT 2460 ACTTCCATAT TTTCTTCTAA GAGTTTGATA GTTGTAGCTG TTACATATAT GTCTATGATC 2520 TAGTTTGAAT AAATTTTTGT GTATGGTGTG AAGAAGAGGT CTAACCTCTT TTTTATTTTT 2580 TGCATGTAAA CATCCAGTTG TCCCGGCACC ATTTGTTGAA AATATGATTC TTTTCCCATT 2640 AAGTCATCTT GACACCCTTG TTGAAAATCA ATTGACCATA AATGTGAGAG TTTATTTCTG 2700 AACTCTCCAT TCTGTTCCAT TGACCCATAC GTCTTCTATA AATTCCTTAT AGCTAATTCT 2760 ACATTAGACT TTGGTTTTTC AGATGTGGTC ATCTCATTAG ATTATGGTGA TATGTTTGGT 2820 TACAAGTTTT ATCTTCTCCT TGGCAACATT TTTTTTATTA CTGCTCTTCT TTTATTCGTT 2880 TTTGTTGTTC CTTTCTCTTT TTGTGAGACA GGGTCTCACT CTGTTGCCCA GGGTGGAGTA 2940 AGTGGTGTGA TCATGGCTCA CTGCAGCCTC AACCTCCTGG GCTCAAGCAA TCCTCCCACC 3000

【０１７５】 TCAGCCTCCC AAGTAGTGGG ACTACAGGCA TGCACCATCA TGCCAGGCTA ACTTTTTTAT 3060 TTTTTGTAGA GACAGGGTCT TGCTTTGTTG CCCAGGCTGG TCTTGAACTC CAAGCTCAAG 3120 CAATCCTCCA ACCTCAGCTT CCCAAAGTGC TGGGATTACC AGTATGAGCC ACTGCACCTG 3180 GCCTTGTTGT TCCTTTCTTC CTTTTATCTT GTAGTATCTT GATCCTTTTT GCTTATTATT 3240 TATCATTGAG GTGAGTTTGT TCTAAATAAA CTTTTCGCAG AAAGTTTATG TAGATATATT 3300 AATATCAATG AGGCATTAGG AGTGAGTTTT AGATTAGCAG GAATTCTCTT ATGAAAGGTA 3360 TTGATTGTAT GTGTGAGTTT TCAGCCTTTA CTTCTCTCCA GCCCATCAAG ATCAAAGCTG 3420 CAGAGTTGTT TACATTTCAG AATTTCTTTC CTCCCCTCCC CACCTTGCAA AACAGACTTA 3480 CAGTGCAAAA ATGACTTGTC AATGTGATTC TTTCTTCTGG TCCCATCTTT CCTACCTTTT 3540 GAGACTTGTG TTGAAAGGAG TCCAGTAAAA CCACCGATGC TAGCTTGTAT ACCCTGATCC 3600

【０１７６】 CATTGTTATA ATGAATGACT GACTGTTTTT CATATCAAAG TATAATACTT GCACCTTGAT 3660 AGAAGAAAGA AACAAGGCCA GGCACAGTGG TTCATGCCTG TAATCCCAGC ACTTTGGGAG 3720 GCTGAAGTAG GAGGAATAAT TAGACTTTGA TATTAAAAAT GGGGAAGATA TGGCGGTATA 3780 AGATATGAGG AAGTATGTCT TCTTGGACTT TTCTGAAATC TGCCAGCCAT GAGCATCCAC 3840 TCTTTTTATC TTTTGATACC TGTTTTATAT TAACTATACT TCTATTTTGT GGTTTCATGG 3900 CTTCAGATAT CTTCCAGCTT AATTGTACTC TGTCTTTAAT TATTTGCAGC AATTTCTGAA 3960 AGGAGCAAGA AGAAAGGCCA GCCCTTTCTT CACTACCTTA AAAACTGGTC ATCTTTTGAA 4020 ACCCCATGAA AGGCACAGTG GGTGACCATC TACATCAGGA GTGGGCAAAC TATGGCCCTT 4080 GGGTAGTCTG GTCTCTGTCC GTTTTTGTAA GGTTTTATTG GAACCCATAC ACACACAAAC 4140 TGATCATCTC TTGTTATGTG TTAAGTTTTC TTATAATTAT TCTTTTCTAT TTCATCCAGC 4200

【０１７７】 TGAATTACCA TTTCACCTTG TGTATGCCCT TTCCAGTCTT AAATTATAGA AGCTATGTCT 4260 TTGTGGTTTT AAATTATGGA AGCTGTGCCT TCTTGTGTTT TAGTATGGCA AGATATTTGT 4320 TCTTACTTTT CCTCTAGAAT CTGCAGTGGA TTACTTTCAG AAGTAGGTAT TGCCTCTAAG 4380 TTTCCTGACT TCTGTTTCCT TCTCCCTGTT CTGTAGTATA TTTATAGATT GCATGTTTTC 4440 TCGTCCTTAA ACAAGGTACA AATATGTTCT GATCAAGGTT TGCTAGCCGA GAGGATAAGT 4500 GGCTTGCTCT TAGCCTAACT CTCTGTCTAC TTAATGGATG TCGAATTCCC TTCTCAACTC 4560 AACAGCTAGT AACTAGTTCC AAGATCGGAT AATAGCTTAC AGAATTAATT AGTTCAGTGA 4620 AAGCCCTGGT TTGATCACAG AGGCAGGAGA CTGATCTATA TATTTGTAGT GCTGACTAGA 4680 CCCCAACTTG GCCAGATAGC TTATACCTAT GTCAGAAGTT GGAGGAGGAG ATTGACAGCT 4740 GAGGTGTCTC CAAGGGAATT ACAATTATTT TCATTTTCTT TGTGTCTGTA ATTATGTCTC 4800

【０１７８】 TTTTCTTACT TCAAATTTTG TATATGTGAA ATTTCTTAAT TTTTATTTGG TTATTTATTT 4860 TATTGACTTT TTCATCAAAC AACCAACTCT AAGTTCTTGG ATTGAAATTT ATGAATTAAT 4920 TATAATGTTT TAAATTTACC ATTAGTCACA CATACAATAC AAAAAGATAT TTTCATTACA 4980 AAATTTTAAC CCAAGCCATT AAAACTAAAC TCCAGCTTGG TCACCATTCC TAATACCAGG 5040 CCCCTCTCAG AGGAGGGTAA ATAAAAGTCC ATTTTGGTAA CTAGTTTGAC GAGAATCTCT 5100 AATTGTTTCC CTGTTTTTCT TATAATGTCT GCCTTTGAAT TATCCTCTTT TTTTCAAGAG 5160 TTCCATCATA TAATGTATTC CTTTTTGCTT ACAGATTGAC CTCCTAGAGG CATGCATCCC 5220 CCTGCTCCAG TCTGAGCTGG TTCTCTCTAG GCCTGAGGCT CAGTTATCAA CTTGGGACTT 5280 TTATTTACCC TCCCTCAGGA TAGGTACCTG GTTCTTGGAT ACCAGGTCTT ACTCTTGTTT 5340 GAGATACTCC TTTATTTTGG TGGCAAACAT TCCATAATCA CTTCCTGATA ATGGTGACAT 5400

【０１７９】 TTGAGGTAGA TTTTCTGAGT CTTTATATGT TAGAATATGT TTTTATTCTC CTTTGCCACT 5460 TGATTGATAA TTTGGCTGCA CATAGAATGT AAGCATTCAC AGGGCTTTTG GGAGCAGCTT 5520 CCCTTGAGAA GAAGGTGGAT GCAGTTAAGA TCTTCCCTGA AAAGACTGTG TGAAATGACA 5580 AGGCTATTGA GGTACCCAAC GGGTAGCTTG GTAAAGGTGT ATCTTGTCTC TTATGTTTAT 5640 GCATCTACTT TACCACCATG TAATTAGCCT ATTATAACTT GTTGCATTCC TTCACTCAGC 5700 TAATCTTGTT CATGGTAGAA ATTAATATTG CTAGTACCAT GGTAGAATTT TATATTAGCT 5760 GGATCCTAGA CCTAAATGCT CCTTCCTTGT GCTTACATAT TCTGCAAGTG GGTGACAGTG 5820 GATGCTAGGT ATTGTGTTAT GTGATTTCAA TGTATTATAT GATGGGGTAG ATACTATTAG 5880 CCTCATTTGA AAATTAGAAA CCTATTGTTC AGAAAGTTTA AGTGACTTTC TCAAAGTCAC 5940 ACAGCTGGTA AATGGTAGAA CTGGGATTTG AATCCAGGCA ATCTGATGGA TTTAAGAGGA 6000

【０１８０】 ACCTGTGCCA CTATGTGATA TAGCAATAAC ATCTAGCCAA TATAAATACT TTCCTGAATT 6060 AAATCACTGT CATATTCAGA GAGTTCTGTG TCACTATTAA GACCCTCCAT TATTGTGTAT 6120 ATTAATTACA TTTCCCTATT TTAATCCCAA TATCTATTCA TTTTTATCAC AGTCCTTTCT 6180 TATGGTCACA AACAGGCATA GTACAACAGC AGCAATGCAA AAACCACTTT TATATTACAT 6240 GTTCCAGGGA TTTAACCCAA TGACCTGTGA TATAATGATA CTGACTAGTA TTTTTTCATT 6300 TATCTGGGAA TGGGAGAGAA CCTCTAACAG AACGTTTTAG AATCTGTGTT ATGAGTAACC 6360 AGAGTCTTAG TTCTTCCTCA TCTCCAGGTC TATGGATTCT GGGGTGCCAC AACTCAGACT 6420 TTCGGAACAG AGGCATGACC GCCTTACTGA AGGTTTCTAG TTGTGACAAG AACACTGGTG 6480 ATTATTACGA GGACAGTTAT GAAGATATTT CAGCATACTT GCTGAGTAAA AACAATGCCA 6540 TTGAACCAAG AAGCTTCTCC CAGAATTCAA GACACCCTAG CACTAGGCAA AAGCAATTTA 6600

【０１８１】 ATGCCACCAC AATTCCAGAA AATGACATAG AGAAGACTGA CCCTTGGTTT GCACACAGAA 6660 CACCTATGCC TAAAATACAA AATGTCTCCT CTAGTGATTT GTTGATGCTC TTGCGACAGA 6720 GTCCTACTCC ACATGGGCTA TCCTTATCTG ATCTCCAAGA AGCCAAATAT GAGACTTTTT 6780 CTGATGATCC ATCACCTGGA GCAATAGACA GTAATAACAG CCTGTCTGAA ATGACACACT 6840 TCAGGCCACA GCTCCATCAC AGTGGGGACA TGGTATTTAC CCCTGAGTCA GGCCTCCAAT 6900 TAAGATTAAA TGAGAAACTG GGGACAACTG CAGCAACAGA GTTGAAGAAA CTTGATTTCA 6960 AAGTTTCTAG TACATCAAAT AATCTGATTT CAACAATTCC ATCAGACAAT TTGGCAGCAG 7020 GTACTGATAA TACAAGTTCC TTAGGACCCC CAAGTATGCC AGTTCATTAT GATAGTCAAT 7080 TAGATACCAC TCTATTTGGC AAAAAGTCAT CTCCCCTTAC TGAGTCTGGT GGACCTCTGA 7140 GCTTGAGTGA AGAAAATAAT GATTCAAAGT TGTTAGAATC AGGTTTAATG AATAGCCAAG 7200

【０１８２】 AAAGTTCATG GGGAAAAAAT GTATCGTCAA CAGAGAGTGG TAGGTTATTT AAAGGGAAAA 7260 GAGCTCATGG ACCTGCTTTG TTGACTAAAG ATAATGCCTT ATTCAAAGTT AGCATCTCTT 7320 TGTTAAAGAC AAACAAAACT TCCAATAATT CAGCAACTAA TAGAAAGACT CACATTGATG 7380 GCCCATCATT ATTAATTGAG AATAGTCCAT CAGTCTGGCA AAATATATTA GAAAGTGACA 7440 CTGAGTTTAA AAAAGTGACA CCTTTGATTC ATGACAGAAT GCTTATGGAC AAAAATGCTA 7500 CAGCTTTGAG GCTAAATCAT ATGTCAAATA AAACTACTTC ATCAAAAAAC ATGGAAATGG 7560 TCCAACAGAA AAAAGAGGGC CCCATTCCAC CAGATGCACA AAATCCAGAT ATGTCGTTCT 7620 TTAAGATGCT ATTCTTGCCA GAATCAGCAA GGTGGATACA AAGGACTCAT GGAAAGAACT 7680 CTCTGAACTC TGGGCAAGGC CCCAGTCCAA AGCAATTAGT ATCCTTAGGA CCAGAAAAAT 7740 CTGTGGAAGG TCAGAATTTC TTGTCTGAGA AAAACAAAGT GGTAGTAGGA AAGGGTGAAT 7800

【０１８３】 TTACAAAGGA CGTAGGACTC AAAGAGATGG TTTTTCCAAG CAGCAGAAAC CTATTTCTTA 7860 CTAACTTGGA TAATTTACAT GAAAATAATA CACACAATCA AGAAAAAAAA ATTCAGGAAG 7920 AAATAGAAAA GAAGGAAACA TTAATCCAAG AGAATGTAGT TTTGCCTCAG ATACATACAG 7980 TGACTGGCAC TAAGAATTTC ATGAAGAACC TTTTCTTACT GAGCACTAGG CAAAATGTAG 8040 AAGGTTCATA TGACGGGGCA TATGCTCCAG TACTTCAAGA TTTTAGGTCA TTAAATGATT 8100 CAACAAATAG AACAAAGAAA CACACAGCTC ATTTCTCAAA AAAAGGGGAG GAAGAAAACT 8160 TGGAAGGCTT GGGAAATCAA ACCAAGCAAA TTGTAGAGAA ATATGCATGC ACCACAAGGA 8220 TATCTCCTAA TACAAGCCAG CAGAATTTTG TCACGCAACG TAGTAAGAGA GCTTTGAAAC 8280 AATTCAGACT CCCACTAGAA GAAACAGAAC TTGAAAAAAG GATAATTGTG GATGACACCT 8340 CAACCCAGTG GTCCAAAAAC ATGAAACATT TGACCCCGAG CACCCTCACA CAGATAGACT 8400

【０１８４】 ACAATGAGAA GGAGAAAGGG GCCATTACTC AGTCTCCCTT ATCAGATTGC CTTACGAGGA 8460 GTCATAGCAT CCCTCAAGCA AATAGATCTC CATTACCCAT TGCAAAGGTA TCATCATTTC 8520 CATCTATTAG ACCTATATAT CTGACCAGGG TCCTATTCCA AGACAACTCT TCTCATCTTC 8580 CAGCAGCATC TTATAGAAAG AAAGATTCTG GGGTCCAAGA AAGCAGTCAT TTCTTACAAG 8640 GAGCCAAAAA AAATAACCTT TCTTTAGCCA TTCTAACCTT GGAGATGACT GGTGATCAAA 8700 GAGAGGTTGG CTCCCTGGGG ACAAGTGCCA CAAATTCAGT CACATACAAG AAAGTTGAGA 8760 ACACTGTTCT CCCGAAACCA GACTTGCCCA AAACATCTGG CAAAGTTGAA TTGCTTCCAA 8820 AAGTTCACAT TTATCAGAAG GACCTATTCC CTACGGAAAC TAGCAATGGG TCTCCTGGCC 8880 ATCTGGATCT CGTGGAAGGG AGCCTTCTTC AGGGAACAGA GGGAGCGATT AAGTGGAATG 8940 AAGCAAACAG ACCTGGAAAA GTTCCCTTTC TGAGAGTAGC AACAGAAAGC TCTGCAAAGA 9000

【０１８５】 CTCCCTCCAA GCTATTGGAT CCTCTTGCTT GGGATAACCA CTATGGTACT CAGATACCAA 9060 AAGAAGAGTG GAAATCCCAA GAGAAGTCAC CAGAAAAAAC AGCTTTTAAG AAAAAGGATA 9120 CCATTTTGTC CCTGAACGCT TGTGAAAGCA ATCATGCAAT AGCAGCAATA AATGAGGGAC 9180 AAAATAAGCC CGAAATAGAA GTCACCTGGG CAAAGCAAGG TAGGACTGAA AGGCTGTGCT 9240 CTCAAAACCC ACCAGTCTTG AAACGCCATC AACGGGAAAT AACTCGTACT ACTCTTCAGT 9300 CAGATCAAGA GGAAATTGAC TATGATGATA CCATATCAGT TGAAATGAAG AAGGAAGATT 9360 TTGACATTTA TGATGAGGAT GAAAATCAGA GCCCCCGCAG CTTTCAAAAG AAAACACGAC 9420 ACTATTTTAT TGCTGCAGTG GAGAGGCTCT GGGATTATGG GATGAGTAGC TCCCCACATG 9480 TTCTAAGAAA CAGGTATGAA TGCATTGGTT ATTCCTTTGC TCTGCTCTTG TGACATTTGA 9540 CTTTACCAGA TGATGACACC AACAATGAGA GTTAGAGGAT GAAAAATCAA GGTGTCTTGA 9600

【０１８６】 AACTCTTACT CTGGTGAGAT AGAGAGAAGA GAGGTTTACA AGAGGGTAGA GGAATCAGGG 9660 ACAAGAAGGA GCAATGGGGA GCAGGAAGAA AGTCAACCTC ACCTATCAAC CTTATGAGCT 9720 GCAGGGGAAA TCTTAGTCTC ATCAGAGAAC TTTAAGCAAG GCAGAAGGAA GAAGCAAGTT 9780 CGTGTTAAAG AGGTTAAGGA CTTGGGGAGG ATTGGTTTTC ATGATACTGG GGATCCAGAG 9840 GGCAAAGTAG GATGATTTTA TTTTTAGGTG AGTAGAGGGA GGTTGAGCAG TCAAGTAGTA 9900 CAGAGAAATG TGGAATATAA ACATAAGGAG AGTCAGTCAG TCACAAATAT TTATGGAACA 9960 CCTACTACAT GCCAGACACT TTTGTACACA TTGGAGTGCA GCACAGCAGG AGCTTATATT 10020 CTATTGGAAA GAGCAAGAGA CAAGTTAGTA CAAAACTAAA TAAGGCAATC TCAATTGTGT 10080 TGTTCAGAAG ATAGAATAGA ATAATATGGT AGAGAGAATA ATATGATAGA GTAATACGTA 10140 GAGTGTTACA TTAGCTGTGG TGGTCATAGA AATCATCTTT GAGGAGTTGA GACCTAAATG 10200

【０１８７】 ATGATAACAG GCCAGCTGAT GGAGCTCTGA GAGAAGATGT TTCCAGACAG AGGGAAGAGA 10260 AAATGCAAAG GCCCTGAGAA TGGAAAAAGT TTACCATGTT TGAGGAACAA GAAGGGACAA 10320 GCATGACTTG TCACTTTCCC ACCTTGCTTT CTAGCTCAAG TAAGCCCTTA TTGCTGCATT 10380 GCAACCATAG ACTATTTCCC TAGTCCACTG ACTTTCTCAT TCTCCTGGAC CTCTATCTTA 10440 GATTTTCTGT GTTTTCCTTA AATCTCGAGC ACCTTTTTTC CATTCTCCAA TGCCCATTTT 10500 CACTCTTAGC TGATGCTGTG CAATGAACCT CCACAGACTC CCAACATCAC ATTTACTGGC 10560 ATTTGTACCC ATATACTCTG CCTGCACACT TATTACAATA AATAGAGTGT CTGTGCTCCT 10620 AAGGCCAACC TCTCCAGTTT TGTACTTGAT TCCCATCTCT TCTCCCTTCA TAAAAAATGT 10680 TGCTCCAGCA ATTTCTCCTT TCTCCCTTAC ATCATCAATT TATCTCTCCA CTAGATTAAT 10740 CTCATCAACA TCAATCATGC TATTATTTCC TCCCCTATCT TTACAGAAAC CGTCTTAAAA 10800

【０１８８】 TAATTGTCCC TGCTTGCAGC CTTTGCATCT TTTCCTGCCA TTCTCTCCTC TTTAACCCAC 10860 TCCAAAGAAG CTTTTATCTC TATTATTTCA TAAGAACTAC ATTTTCAAGG TCATTATTGA 10920 TCTTTACATT ACTGATTACT AGCCCTCATC TTATTTGAAT TCTCAGTAGT ATTTGAGAGG 10980 TGATTACTCC ATCGTTGATA CAGGTTCTCA CTTGGTTTCT CTAACACCAC TTTTCTTCAC 11040 TTTTCTACTA AACTTACTGC CAATCTTTGT CAACTTTGCG AGTCCTTCTT CATCCCCCTA 11100 ATCTTTAAAG GTTAGAGTGC TCCAGGGATT AGTTCTCCAA CTTCTTCTTT ATTCTATTTA 11160 TACTCACTCT GTGACGACAT TGTTTAGCCT CATGATTTTA AGTACTATCT ATCTGCAGAT 11220 AATTCCAGTT GAATATCTGG AGATATTCTC AGATCTCTCT CCTGAAGTCA AAATTTACAT 11280 ATCAACTCCC TACCTTAACA TGCACACAAT TAGACTCTTA ATTCCTGCCC CTTCCCAAAA 11340 CCTGCTGATT GCTCAGCCTT CTCCATGGCA ATCAAAAACC ATTCCTGGCC GGGCATGGTG 11400

【０１８９】 GCTCACTCCT GTAACCCCAG CACTTGGGGA AGCTGAGGCA GGTGGATTGG TTGAGCCCCA 11460 GAGTTCAAGA TCAGCCTGGG CAACATGGCA AAACCTCATC TCTATTAAAA ATACAAAAAT 11520 TAGCCAGGCG TGGTGGTGCA CACCTGCAGT CCCAGCTACT CAGGAGGCTG AGGCACGAGA 11580 ATCGCTTGAA CTGGGGAGAC GGAGGTTGCA GTGAGCTGAG ATGGCCTCAC TGCACTCCAG 11640 CCTGGGCAAC AGAGTCAGAC TTGATCTCAA AAAAATAAAT AAGTAAAACC ATTCCCTATT 11700 TCAGTTATTC AGTCACAGAT CTTGAAGTTT TCCAACTCTT TTTTTCTTAC ATTAACATCT 11760 AATCTGTAAA GGATCCTGTA TTAGTCCATT TTCACACTGC TAATAAAGAC ATACCTGAGA 11820 CTGGGCAATT TACAAAAGAA AGAAGTTTAA TGGACTCACA GTTCCACATG GCTGGGGAGG 11880 CCTCACAATC ATGGCAGAAG GCAGGGAGGA GCAAGTTATA TCTCACATGA TGGCACAGGC 11940 AAAGAGAGAG AGCTTGTGCA GGGAAACTCC TCTTTTTAAA ACCATCAGAT CTTGTGAGAC 12000

【０１９０】 TTATTCACTA TCATGAGAAC AGCAAGGGAA GGACCTACTG CCATGATTCA GTTACCTCCT 12060 ATCAGGTCCC TCCCACAGAA CATGGGAATT CAAGATGAGA TTTGGGTAGG GACACAGCCA 12120 AACCATATCA TTCCACCCCA TCCCCTCCCA AATCTCGTGT CCTCACATTT CAAAACCAAT 12180 CATGCCTTCC CAACAGTCCC CCAAAGTCAT AACACATTTC AGCATTAACT CAAAAGTCCA 12240 CAGTCCAATG TCTCATCTAA GACAAGGCAA GTCCCTTCCA CCTATGAGCA TGTAAAGTCA 12300 AAAGCAAGTT AGTTACTTCC TAGATACAAT GGGGTATAGG CATTGGGTAA ATACAGCCAT 12360 TCCAAATGGG AGAAATTGGC CAAAACAAAG GGCCTACAGG CCCCATGCAA GTCTGAAATT 12420 CTACGGGGCA GTCAAATCTT AAATCTCTAA AGTGATCTCC TTTGACTCCA TGTCTTGCAT 12480 CTGAGTCATG CTGATGCAAG AGGTGGGTGC CCATGGTCTT GGGCAGCTCC ACCCCTGTGG 12540 CTTTGCAGGG TACAGCCTCC CTTGTGTCTG CCTTCATGGG CTGGCATTTT CTGTAGCTTT 12600

【０１９１】 TCCAGATGCT GGTGCAAGTT TCTGATGGAT CTACCATTCC GGGGTCTGGA GGACGGTGGC 12660 CCTCTTCTCA CAGCTCCACT AGGTGGTACC CCAGTAGGGA CTCTGTGTGG GTGCCCTGAG 12720 CCCACATTTC CCTTCTGCAC TGCCCTAGCA GAGTTTCTAC ATGAAGGCCC ACCCCCGCAG 12780 CAAACTTCTG CCTGGGCATC CAGGCACTTC CATTAATTTC TAAACAACAA AGCATTCAAG 12840 AGGCGACTTG GGTGCTATTA AGGGCATTCA GTTTCATAAG GGAAGCAGAG CATAAAAGTT 12900 TGGAAAATTT GCAGCCTGAT AATGTTAGAG AAAAGCAAAT CCCATTTTCT GAGGAGAAAT 12960 TCAAGCAGGC TGCAGAAATT TGCATAAGTA ATGAGGAGCC GAATGTTAAT CCCAAGACAA 13020 TGGGGAAAAT GTCTCCAGGG CATGTCAGAG GTCTTCACAC CAGCCCCTCC CATCACCGGC 13080 CCAGAGGCCT AAGAGGAAAA AGTTGTTTCA TGGGCTGGGC CCAGGATCCC CATGCTGTGT 13140 GCAGCCTAGG GAGTCGGTGC CTTGTGTCCC AGCCGCTACA GCCATGGCTG AAAGGGGTCA 13200

【０１９２】 ATGTAGAGCT CAGGCTGTGG CTTCATAGGG TACAAGTCCC AAGCCTTGGC AGCTTCCACA 13260 TGATGTTGAG CCTGCGAGTG CACAGAAGTC AAGAACTGGG GTTTGGGAAC TTCCGCCTAG 13320 ATTTCAGAAG ATGTATGAAA ACACCTGGAT GCCTAGGCAG AAGTTTGCTG CGGGGGTGGG 13380 CCCTCATGGA GAACCTCTGC TAGGGCAGTG CAGAAGGGAA ATGTGGGCTC AGAGCACACA 13440 CACAGAGTCC CTGCTGGGGT ACCACCTAGT GGAGCTGTGA GAAGAGGACC ACCGTCCTCC 13500 AGGCCCCAGA ATGGTAGATA CCCTAAATCA TCTCTTTCAA ATTCGAAGTT CCACAAATCT 13560 CTAGGACAGG AGCAAAATGC CACCAGTATC TTTGCTAAAA CATAACAAGA GTTACCTTTG 13620 CTCCAGTTCC CAACAAGTTC CTCATCTCTA TCTGAGACCA CCTCAGCCTG GATTTCATTG 13680 TCCATATCAT TATCAGCCTT TTGGTCAAAG CCATTCAACA AGTCTCTAGA GAGTTCCAAA 13740 CTTTCCACAT TTTCCTGTCG TCTTCTGAGC CCTCCAAACT GTTCCAACCT CTGCCTGTTA 13800

【０１９３】 CCCAGTTCCA AAGTCGCTTC CACATTTTTG GGTATCTTTT CAGCAGCACC CCACTCTACT 13860 GGTACCAACT TACTGTATTA GTCTGTTCTC ACACTGCTGA TAAAGATATA CCTGAGACTG 13920 GGAAATTTAC AAAGGAAAGA GGTTTTATGG ACTTACTGTT CCACATGGCT GGGGAGGCCT 13980 CAAAATCATG GCAGAAGGCA AGGAGGAGCA AGTCTTGTCT TACATGGATG GCAGCAGGCA 14040 AAGAAAGAAA GCTTGTGCAG GAAAACTCTT TTTTTTCTTT TCTTCTTTTT AGACAGAGAT 14100 CTTGCTCTGT CACGCAGGCT GGAGTCAGTG GCGTGAGTCT TGGCTCACTG CAACCTCCAC 14160 CTCCCGGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTTCCAAG TAGCTGGTAC TACAGGCATG 14220 TGCCACCACA TGAGATGAGA TTTTGGTAGG GACACAGCCA AACCATATCA TTCCCCCTGT 14280 CCCCTCCCAA ATCTCATGTC CTCACATTTC AAAACCAATC ATGCCTTCCC AACAGTCCCC 14340 CAAAGTCATA ACTCATTTCA GCATTAACTC AAAAGTCCAC AGTATTTTTA GTAGAGATGG 14400

【０１９４】 GGTTTCACCA TATTGGCCAG ACTGGTCTCT AACTCCTGAC CTTATGATCC GCCCGCCTTG 14460 GCCTCCCAAA GCACTGGGAT TACAGGTGTG AGCCACCATG CCCAGCCAAA AACTCTTCTT 14520 TTTAAAACCA TCAGTTCTCG ATGAGACTTA TTCACTATCA CAAGAACAGC ATAGGAAAGA 14580 TCTGCCCCCA TGATTCAATT ACCTCCCACC AGGTCCCTCC CACAACACAT GGGAATTCAC 14640 GATGAGATTT GGGTGGGGAT CCTCTTGGCT ATCATTTCAA AAAATAGTCA GGGTTGATTA 14700 TGGACTTAGT ATTGAATAAG ATGAAAATGT ACTGAAATGG AACGATGAAG ATAATTGACC 14760 AGGGAAAGCA GGTTACAAGC CAAGAGAGGA TACAGTGTCA CTTCAGATGC TATAAAAGTG 14820 ATGTTTTTAT TTTTTGAATG TTATTTGGCT ATATTTTCAA ATTATCTGCA CTGCATATGC 14880 ACTGCTTCTG TAATAATAAA AGGGTATTAA AATAATAAAA TCAAGTCTAT AAATCACACA 14940 CACACACCCC AGCCTCTTCT CTACACCTCA GTGACTACCA ACCACATCTA AATTATCATC 15000 ATTTCTCATC TGAATTATTG CAAGAAGCCA TTGCAATAAT TCAGATGAGA GTTGATACAA 15060 AGCCTTCCTG TTTCCAACCT TACCCTCATA TAGTCTTTTC CCAACATTGC ATCTAAAGTA 15120 ATTTTTCAAA TTGCAATTCT GATCCGGGGA ATTC 15154

【０１９５】配列番号：２ 配列の長さ：３８５１ 塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 由来： 生物：ヒト 配列

【０１９６】 GTCTATGGAT TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC 60 TGAAGGTTTC TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA 120 TTTCAGCATA CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT 180 CAAGACACCC TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA 240 TAGAGAAGAC TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT 300 CCTCTAGTGA TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT 360 CTGATCTCCA AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG 420 ACAGTAATAA CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG 480 ACATGGTATT TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA 540 CTGCAGCAAC AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA 600

【０１９７】 TTTCAACAAT TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC 660 CCCCAAGTAT GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT 720 CATCTCCCCT TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA 780 AGTTGTTAGA ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT 840 CAACAGAGAG TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA 900 AAGATAATGC CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA 960 ATTCAGCAAC TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC 1020 CATCAGTCTG GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA 1080 TTCATGACAG AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA 1140 ATAAAACTAC TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC 1200

【０１９８】 CACCAGATGC ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG 1260 CAAGGTGGAT ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC 1320 CAAAGCAATT AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG 1380 AGAAAAACAA AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA 1440 TGGTTTTTCC AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA 1500 ATACACACAA TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC 1560 AAGAGAATGT AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA 1620 ACCTTTTCTT ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC 1680 CAGTACTTCA AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG 1740 CTCATTTCTC AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC 1800

【０１９９】 AAATTGTAGA GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT 1860 TTGTCACGCA ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG 1920 AACTTGAAAA AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC 1980 ATTTGACCCC GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA 2040 CTCAGTCTCC CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT 2100 CTCCATTACC CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA 2160 GGGTCCTATT CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT 2220 CTGGGGTCCA AGAAAGCAGT CATTTCTTAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG 2280 CCATTCTAAC CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG 2340 CCACAAATTC AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC 2400

【０２００】 CCAAAACATC TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT 2460 TCCCTACGGA AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC 2520 TTCAGGGAAC AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT 2580 TTCTGAGAGT AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG 2640 CTTGGGATAA CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT 2700 CACCAGAAAA AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA 2760 GCAATCATGC AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT 2820 GGGCAAAGCA AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC 2880 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG 2940 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC 3000

【０２０１】 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC 3060 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA 3120 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC 3180 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG 3240 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT 3300 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT 3360 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA 3420 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG 3480 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG 3540 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA 3600

【０２０２】 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC 3660 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA 3720 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA 3780 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC 3840 GAAAAAAAGA G 3851

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョージ クオ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122, サン フランシスコ，シックスス アベニ ュ 1370 (72)発明者 フランク アール．マシャーズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サン フランシスコ，マービュー ウェイ 148 (72)発明者 マーサ トゥルート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，ブロードウェイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サン フランシスコ，アッパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国，2100 コペンハーゲン，ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジェニファー ファバロロ オーストラリア国，ビクトリア，カールト ン 3035，ファラデイ ストリート 108

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全体にわたってオープンリーディングフ
   レームを有し、そしてヒト−ファクターＶIII Ｃ又はそ
   の前駆体の少なくとも部分をコードする約２００bp以上
   のＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 実験例に記載したＤＮＡ配列を含有する
   特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 ヒト−ファクターＶIII Ｃのサブユニッ
   トをコードするＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 ファクターＶIII Ｃの８０kdペプチドを
   コードする特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 ファクターＶIII Ｃの７７kdペプチドを
   コードする特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 培養において増殖することができる宿主
   細胞と適合性の複製系、及びヒト−ファクターＶIII Ｃ
   又はその前駆体の少なくとも部分をコードする約２００
   bp以上のＤＮＡ配列を含有する染色体外要素。
7. 【請求項７】 前記ＤＮＡ配列がファクターＶIII Ｃの
   ８０kdペプチドをコードする特許請求の範囲第６項記載
   の染色体外要素。
8. 【請求項８】 前記ＤＮＡ配列がファクターＶIII Ｃの
   ７７kdペプチドをコードする特許請求の範囲第６項記載
   の染色体外要素。
9. 【請求項９】 前記ＤＮＡ配列の発現のために該ＤＮＡ
   配列に並置された、前記宿主と適合性の転写及び翻訳制
   御シグナルを含有する特許請求の範囲第６項記載の染色
   体外要素。
10. 【請求項１０】 前記宿主が単細胞微生物である特許請
    求の範囲第６項記載の染色体外要素。
11. 【請求項１１】 前記宿主が哺乳動物細胞である特許請
    求の範囲第６項記載の染色体外要素。
12. 【請求項１２】 ファクターＶIII Ｃの少なくとも部分
    をコードし、そして次の配列： 【化１】 で表わされる複合プローブとハイブリダイズする、哺乳
    動物ゲノム由来の約１０〜２５kbp のＤＮＡ配列。
13. 【請求項１３】 単細胞微生物クローニングベクターと
    連結された特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡ配列を
    含んで成るＤＮＡ構成物。