DK165506B

DK165506B - Proteinpraeparat med koagulationsaktivitet samt fremgangsmaade til fremstilling deraf

Info

Publication number: DK165506B
Application number: DK013585A
Authority: DK
Inventors: George Kuo; Frank R Masiarz; Martha Truett; Pablo Valenzuela; Mirella Ezban Rasmussen; Jennifer Favaloro
Original assignee: Novo Nordisk As; Chiron Corp
Priority date: 1984-01-12
Filing date: 1985-01-11
Publication date: 1992-12-07
Also published as: EP0150735B2; JP2002186487A; LU91015I2; DK165506C; DE10399011I1; EP0150735A2; DK13585D0; EP0466199A1; LU91087I2; ATE224445T1; DE10399009I1; DK38892D0; NL300153I1; DE10399010I1; EP1006182A3; NL300119I1; DE3588242D1; NL300118I1; EP0150735B1; EP1006182A2

Description

i

DK 165506B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt proteinmateriale, som indeholder et calciumbroforbundet komplex af to polypeptidfragmenter, og som udviser en koagulationsaktivitet som Faktor VIIIC, samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

5 Faktor VIIIC er et plasmaprotein, der deltager i intrinsicdelen ved blodkoagulering. Det findes ikke eller er defektivt i individer med arvet X chromosombundet recessiv blødningsforstyrrelse, hæmofili A. Man har mødt store vanskeligheder ved at isolere faktor VIIIC på grund af dets yderst ringe koncentra-10 tion i plasma og den kendsgerning, at det synes at være et mellemprodukt eller endligt nedbydningsprodukt af et større proteinforstudie. Forsøg på at isolere faktor VIIIC har ført til komplekse blandinger af forskellige polypeptider med betydelig heterogenisitet og varierende molekylvægte.

15 En af de løsninger, der i udstrakt grad er anvendt til fremstilling af fysiologisk aktive proteiner, indebærer isolering af det pågældende protein i oprenset form. Det pågældende protein giver uvurderlig hjælp ved fremstillingen af en rekombinant DNA-evne til fremstilling af proteinet. Når man er 20 i besiddelse af de pågældende protein, kan man fremstille monoklonale antistoffer, der er specifikke for proteinet, og som kan anvendes til at etablere fremstillingen af proteinet i lysater, ekspression fra messenger-RNA i oocyter eller fra cDNA-gen i encellede mikroorganismer. Herudover kan man ved 25 bedømmelse aminosyresekvensen udvikle prober, der anvender codoner til at kode for den pågældende aminosyresekvens, til hybridisering af messenger-RNA, chromosomålt DNA eller cDNA, og som derfor muliggør afsløringen, isoleringen og ekspressionen af det relevante gen eller den relevante information og 30 fremstillingen af det ønskede produkt med højt udbytte i en eller flere værter.

I US patentskrift nr. 4 361 509 og de deri anførte referencer beskrives rensning af fuld længde faktor VIIIC ved en to-trins adsorptions-desorptionsfremgangsmåde, og der er ingen antydning

DK 165506 B

2 af fremstilling eller isolering af et calciumbroforbund komplex af et 92,5 kD polypeptidfragment med et 77/80 kD dublet polypeptidfragment eller at et sådant komplex skulle udvise koagulationsaktivitet. Se også Fulcher og Zimmerman, Proc.

5 Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 1648 - 1652. Tuddenham et al., J. of Lab. Clinical Medicine (1979) 92:40 - 53 beskriver rensning af faktor VIIIC under anvendelse af polyklonale antistoffer. Austen, British J. Haematology (1979) 42:669 -674 beskriver anvendelsen af aminohexyl-sepharose til rensning af 10 faktor VIIIC. Weinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 7ji: 5137 - 5141 beskriver et studie over virkningen af thrombin på faktor VIII. Se også Kuo et al., Abstracts for IX International Congress of Thrombosis and Hemostasis, (København, juli 1983).

15 Det har nu overraskende vist sig, at koagulationsaktivitet kan opnås med et calciumbroforbundet komplex af to polypeptid-fragmenter af det fulde faktor VHIC-molekyle.

Den foreliggende opfindelse angår et oprenset proteinmateriale, hvilket materiale er ejendommeligt ved et komplex af et 77/80 20 dublet polypeptidfragment calciumbroforbundet med et 92,5 kD polypeptidfragment, som udviser en koagulationsevne som faktor VIIIC, og som har en renhed på mindst 90% baseret på komplex plus precursor.

Proteinmaterialet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved, 25 a) at underkaste et i handelen tilgængeligt cryopréci-pitatpræparat indeholdende faktor VIII immunosorbent-chromatografi under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR-sepharosesøjle, b) at separere det resulterende materiale på en aminohexyl- 30 substitueret .agarosesøjle, og c) at rense yderligere ved chiromatografisk behandling.

DK 165506 B

3

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af det her omhandlede proteinmateriale, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) humant Faktor VIII underkastes immunosorbent-chromato- 5 grafi under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR- sepharosesøjle, b) det resulterende materiale separeres på en aminohexyl-substitueret agarosesøjle og c) renses yderligere ved chromatografisk behandling.

10 Ifølge et foretrukket aspekt af opfindelsen anvendes der i trin a) et eller flere af følgende punkter.

1 human anti-hæmofilifaktor (AHF) anvendes som udgangsmateriale, især i form af et cryoprecipitat, 2 Factor VIIIC opløses til immunosorbentchromatografi i 15 saltvand-imidazol-lysin-HCl-puffer ved pH-værdi 7,4, 3 elueringen udføres under anvendelse af forholdsvis store koncentrationer af calciumion sammen med glycerol.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden dialyseres de fraktioner, som fås fra søjlen i trin a), med en puffer 20 indeholdende lave koncentrationer af calciumion, før de underkastes trin b).

Ved en udførelsesform for fremgangsmåden udføres elueringen i trin b) i høj calcium- eller natriumchloridkoncentrations-puffer.

25 Ved en yderligere, foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden anvendes der i trin c) gelatinesepharose-, HPLC-, ionbytning på dextransulfat- eller Mono Q-affinitets-søjler, der anvender lecitiner eller antistoffer over for Faktor VIIIC til yderligere chromatografisk rensning.

30 Opfindelsen tilvejebringer human faktor VHIC-fragmenter og subenheder heraf i det væsentlige i ren form.

DK 165506 B

4

Polypeptidfragmenterne i proteinmaterialet ifølge opfindelsen kan anvendes i forbindelse med fremstilling af human faktor VIIIC, precursorer og subenheder heraf ved ekspression i en mikroorganisme eller i et pattedyrsvævdyrkingsceller. Inden for 5 opfindelsen er foretaget isolering af ren faktor VIIIC, subenheder og fragmenter heraf og bestemmelse af deres fysiologiske forhold, specielt ved at anvende thrombinnedbrydning. Mindst en del af hver af de relaterede rækker af polypeptider sekvensbedømmes, og sekvenserne kan anvendes til at frembringe 10 kompleksprober. Genome DNA-fragmenter kan endvidere undersøges med prober for homologe sekvenser og hybridiseringsfragmenter isoleres og manipuleres yderligere til frembringelse af et DNA-fragment, der koder for en fuldstændig subenhed eller fragment og/eller anvendes til isolering af det fuldstændige mRNA, 15 hvorfra ds cDNA kan opnås. DNA-sekvensen kan herefter yderligere manipuleres til indførsel i en ekspressionsvektor, og ekspressionsvektoren kan anvendes til indførsel i en forenelig værtsorganisme til udtrykkelse af polypeptidet.

Herudover kan præparaterne anvendes til udtrykkelse af faktor 20 VHIC-subenheder og fragmenter til fremstilling af faktor VIIIC som en præcursor eller i dens aktive form eller tilvejebringe enkelte subenheder til anvendelse sammen med naturligt tilgængelige subenheder. Subenhederne og fragmenterne er i besiddelse af en eller flere biologiske egenskaber, der er 25 associeret med faktor VIIIC som f.eks. epitope pladser, koaguleringsevne og immunogenisitet, således at de kan anvendes til fremstilling af antistoffer, der anvendes som reagenser, specielt som mærkede reagenser ved immunoundersøgelsesmetoder.

Human faktor VIIIC er et komplekst protein, som kan isoleres på 30 i alt væsentligt ren form, og som udviser en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460 kD. Efter elektroforese under denatureringsbetingelser opnås en lang række fragmenter med varierende molekylvægt: 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD, hvor de to sidstnævnte findes at vandre som en dublet. Analyse

DK 165506B

5 af fragmenterne ved kemisk spaltning og proteasespaltning omfattende thrombin, under anvendelse af antistoffer for at følge immunogene forhold og spaltningsmønstre for at følge strukturelle forhold, viser, at 92,5 kD-polypeptidet er 5 beslægtet med 240, 160, 140 og 115-polypeptiderne, mens 77/80-dubletten synes at have fælles indentificerbare egenskaber med andre peptider bortset fra 240-kD-polypeptidet. Det findes yderligere, at 77/80 kD-dubletten konverteres af thrombin til en 67/70 kD-dublet, mens 92,5 kD-polypeptidet, der er til stede 10 i det rensede faktor VHIC-materiale, der er behandlet med thrombin, spaltes af thrombin, direkte eller indirekte, i to polypeptider på ca. 40 og 52,5 kD. Det har vist sig, at de elektroforetisk isolerede 77/80 kD-dublet-polypeptider har deres N-endestillinger blokeret, medens 67/70 kD dublet-15 polypeptiderne ikke har deres N-endestillinger blokeret.

Det har yderligere vist sig, at stedet for faktor VIIIC omfatter exoner med store introner, hvor exoner omfatter forskellige områder associeret med faktor VIIIC. Enkelte exoner kan således isoleres, der omfatter specifikke polypeptider 20 eller fragmenter deraf, der står i forbindelse med faktor VHIC-komplekset. Ved at identificere specifikke aminosyrese-kvenser i forbindelse med faktor VlllC-subenheder og fragmenter heraf kan man selektivt isolere exonerne fra genomt DNA og anvende exonerne som sådan, sammen, eller i forbindelse med 25 syntetisk DNA til opnåelse af sekvenser, der koder for og frembringer polypeptidsubenheder af faktor VIIIC eller fragmenter heraf.

Bekvemt kan faktor Vllic-genome DNA-sekvenser indeholdende både exoner og introner indføres i en ekspressionsvektor passende 30 til transcription og translation i pattedyrceller til opnåelse af både væsentlige mængder af korrekt sammenknyttet messenger-RNA, der er i stand til cDNA-kloning og til fremstilling af faktor VIIIC, subenheder eller fragmenter. Herudover kan DNA-sekvenserne isoleret fra genomet anvendes til hybridisering til 35 naturlige messenger-RNA, der koder for VIIIC. Messenger-RNA kan

DK 165506 B

6 herefter anvendes til at fremstille ds cDNA, der koder for subenhederne af faktor VIIIC. DNA-sekvenserne kan anvendes til ekspression ved indførsel af en passende ekspressionsvektor, der er i besiddelse af de nødvendige regulerende signaler for 5 transcription og translation. Faktor VHIC-genekspressions-vektoren (en ekspressionsvektor, der bærer en eller flere gener, der koder for hele eller en del af faktor VIIIC, precursor, subenheder eller fragmenter heraf) kan indføres i en passende værtsorganisme, og værten dyrkes til ekspression af 10 faktor VIIIC. Ved passende udvælgelse af værtsorganismerne kan faktor VIIIC-DNA indføres neden for en secernerende leder og produktionssignaler, således at produktet vil secerneres fra værten og oparbejdes til opnåelse af det komplette polypeptid. Afhængig af hvad der er passende, kan polypeptidet yderligere 15 bearbejdes til indførsel af egenskaber eller substitutenter, der forekommer på det naturligt forekommende polypeptid.

I det første trin i den omhandlede opfindelse fås særdeles ren faktor VIIIC og karakteriseres. Den rene faktor VIIIC kan fås fra kommercielt tilgængelig humant antihæmofilifaktor (AHF), 20 der fremstilles ud fra frisk normal human plasma som et cryoprecipitat og som repræsenterer en ca. 40 gange berigelse. Faktor VIIIC koncentreres yderligere og renses ved opløsning af anti-hæmof il if aktoren i en passende puffer som f.eks. saltvand-imidazol-lysin-HCl, pH 7,4 efterfulgt af chromatografi på en 25 affinitetssøjle, der indeholder enten polyklonale eller monoklonale antistoffer over for faktor VIIIC eller faktor VIIIR. Bekvemt bindes antistofferne covalent til en sepharose-understøttelse. Faktor VIIIC kan elueres fra søjlen under anvendelse af en kombination af forholdsvis store koncentratio-30 ner af calciumion sammen med glycerol. De fraktioner, der fås fra søjlen, kan herefter dialyseres med en passende puffer som beskrevet ovenfor indeholdende lave koncentrationer af calciumion, og der kan herefter yderligere renses under anvendelse af en aminohexyl-sepharosesøjle, der elueres med en høj 35 calcium- eller natriumchloridkoncentrations-puffer. Yderligere chromatografiske behandlinger som f.eks. gelatinesepharose-,

DK 165506B

7 HPLC-, ionbytning på dextransulfat- eller Mono Q-affinitets-søjler, der anvender lectiner eller antistoffer over for faktor VIIIC, giver yderligere rensning. Specielt fjerner anvendelsen af dextransulfat spor af forurening som f.eks. fibrinogen, 5 fibronectin, IgG fra præparatet, således at man opnår et produkt, der i det væsentlige er uden fremmmede proteiner. Aktiviteten af fraktionerne fra søjlerne kan kontrolleres for den ene eller begge biologiske og antigene virkninger under anvendelse af koagulationsmetoder (kommercielt tilgængelige 10 prøvemetoder) og antistoffer specifikke over for faktor VIIIC. Baseret på koncentrationen af faktor VIII i plasma kan opnås renhed på ca. 20000 gange ved ovennævnte metode.

Karakterisering af faktor VIIIC

Gelfiltrering angiver, at faktor VIIIC opfører sig som et 15 kompleks med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460 kD. Under anvendelse SDS-gelelektroforese (under denaturerende betingelser) kan syv enkelte polypeptider isoleres med forskellig molekylvægt. Fragmenterne defineres ved hjælp af deres molekylvægt og er på 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD. Disse 20 fragmenter karakteriseredes på følgende måde.

Den første undersøgelse omfatter anvendelse af inhibitorantistoffer isoleret for hæmofile patienter, idet antistofferne betegnes som Z og E. Begge antistoffer reagerer med 77/80 kD-dubletten. E-antistoffet reagerer kraftigt med 240 kD-polypep-25 tidet og svagt med adskillige bånd mellem dubletten og 240 kD-polypeptidet. Z-antistoffet reagerer også svagt med 240 kD-polypeptidet.

I immunoprecipitationsforsøg udfælder E-antistoffet 77/80 kD-dubletten såvel som højmolekylære arter af 160, 140, 115 og 30 92,5 kD med dubletten blandt de stærkere bånd. Inklusion af EGTA bevirker tabet af båndene bortset fra dubletten, hvilket indicerer, at 92,5 kD-arten er associeret med 77 kD og/eller 80 kD-arter i et kompleks, der er styret med en Ca++-bro.

DK 165506 B

8 I den næste undersøgelse fremstilledes monoklonale antistoffer, der både hæmmer faktor VIIIC, der styrer koaguleringsevnen, og 5 reagerer med komponenterne i komplekset;

Klasse I reagerer med 77/80 kD-dubletten og 240 kD-polypepti-derne? klasse II reagerer med 160, 140, 115 og 92,5 kD-polypep-tiderne. Immunoprecipitation af thrombinnedbrudt faktor VIIIC med klasse I antistoffer angiver, at 70/67 kD-dubletten, der 10 fremkommer, stammer fra 77/80 kD-dubletten, der findes i faktor VIIIC. Klasse II monoklonalerne indicerer, at 160, 140 og 115 kD-peptiderne er precursorer for 92,5 kD-peptidet. Et 40 kD-peptidspaltningsprodukt af 92,5 kD-peptidet blev også bundet med klasse Il-antistofferne. Et ELISA-forsøg under anvendelse 15 af monoklonale antistoffer med og uden -EGTA bekræfter Ca**-broassocieringen mellem 92,5 kD og 77 kD og/eller 80 kD-komponenterne af faktor VHIC-komplekset.

Både humane inhibitor og monoklonale antistoffer kan anvendes ved immunosorbent sø j lebehandlingsmetoder til opnåelse af faktor 20 VIIIC eller anvende EGTA til at opløse dens bestående bestanddele, 92,5 kD og 77/80 kD-arterne.

Den næste undersøgelse omfatter thrombinnedbrydning af renset faktor VHIC-materiale ved pH 6,8 eller 7,4. Prøver undersøgtes for koaguleringsevne og TCA udfældet til gelanalyse. Koagu-25 leringsevne viste sig at stige med tiden og herefter aftage sammenfaldende med en nedgang eller en forøgelse i mængden af 92,5 kD-arter. Thrombinbehandling af renset faktor VIIIC-materiale i kort tid (5-15 minutter) forøger mængden af 92,5 kD-arter, medens 77/80 kD-dubletten delvis omdannes til 67/70 30 kD-dublet. Dersom der anvendes lange thrombinnedbrydningstider, f.eks. l time, nedbrydes 92,5 kD-proteinet, og to nye peptider på 40 og 52,5 kD kommer til syne, idet 40 kD-peptidet bibeholder de immunogene egenskaber fra 92,5 kD-arterne. 52,5 kD-

DK 165506B

9

Peptidet viser sig at være et spaltningsprodukt ved kemiske og enzymatisk nedbrydning, idet mønstre og slutprodukter er analoge med 92,5 kD-arterne.

I den næste undersøgelse isoleredes enkelte faktor VIIIO 5 subenheder og precursorer f.eks. 140, 77/80, 92,5 kD-arterne) ved præparativ SDS-gelelektroforese, og en tidsafhængig thrombinnedbrydning af de isolerede polypeptider blev herefter udført. 240 kD-Fragmentet isoleret fra en prærativ gel frembragte 160, 140, 115 og 92,5 kD-bånd. 80 kD og 77 kD-fragmen-10 terne frembragte henholdsvis et 70 kD og 67 kD-fragment.

Et faktor VUIC-kompleks frembringes indeholdende 77 kD og/eller 80 kD-arterne og 92,5 kD-polypeptid som et calciumforbundet kompleks i stærk oprenset form. Renheden af faktor VHIC-materialet (komplekset og precursorarterne) er sædvanlig-15 vis højere en 80%, ofte højere end 90%, og kan være 98% eller højere baseret på det totale protein, og kompleksets renhed er i det mindste 20%, sædvanligvis 30% baseret på det totale protein, efter anti-faktor VIIIR-immunosorbent og aminohexyl-sepharosesøjlerne. Anvendelsen af yderligere chromatografiske 20 behandlinger som f.eks. dextransulfat forøger renhedsgraden til mindst 90% og sædvanligvis højere for faktor VlllC-materialet (kompleks plus precursor). Renheden af faktor VHIC-komponen-ter, 92,5 kD-arter og 77/80 kD-dubletten isoleret ved præparativ SDS-gelelektroforese er sædvanligvis på mindst 98%. Som 25 angivet ovenfor kan komplekset fås under anvendelse af monoklo-nale antistoffer, der er specifikke for en speciel dublet eller for 92,5 kD-polypeptidet. Komplekset kan herefter skilles fra antistoffer under anvendelse af et denaturerende eller chaio-tropisk opløsningsmiddel som f.eks. henholdsvis vandigt 30 urinstof eller thiocyanat.

Sekvenserne af disse peptider er beskrevet nedenfor detaljeret i den eksperimentelle del.

DK 165506 B

10

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås et renset proteinmateriale omfattende subenheder/fragmenter af faktor VIXIC, der kan anvendes til at forøge koaguleringsevnen for individer, der kræver den pågældende subenhed. Proteinmaterialet kan også 5 anvendes inden for terapien. De omhandlede polypeptider kan anvendes til fremstilling af monoklonale antistoffer over for faktor VIIIC, dens subenheder og fragmenter deraf. Subenhedeme og fragmenterne kan også anvendes som reagenser, der kan mærkes og sammen med antistoffer anvendes til diagnostiske formål til 10 undersøgelse af tilstedeværelsen af en eller flere subenheder eller nedbrydningsproduktet heraf i fysioloigske væsker som blod eller serum.

Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere.

I foreliggende beskrivelse med krav betegner Ab antistof og Ag 15 antigen.

Forsøasprocedure

1. Rensning af faktor VIIIC

Human faktor VIIIC blev isoleret fra i handelen tilgængelige cryoprecipitatpræparater ved a) immunosorbentchromatografi 20 under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR-sepharosesøjle ved en metode, der først er beskrevet af E.G.D. Tuddenham, N.C. Trabold, J.A. Collins og L.W. Hoyer, J. of Lab. Clinical Medicine (1979) £3:40, og b) en chromatografisk separation på aminohexylsubstitueret agarose som oprindeligt beskrevet af 25 D.E.G. Austen, British J. of Hematology (1979) 43:660. Detaljer ved procedurerne er beskrevet i det følgende.

Gedeanti-human faktor VIII relateret antigen (VIIIR) serum opnået fra Atlantic Antibody (katalog nr. 040-01) blev behandlet med enten en standard 0 - 50% ammoniumsulfattraktion

DK 165506B

11 efterfulgt af DEAE-cellulosesøjlechromatografi, eller en lignende 0 - 33% fraktion uden efterfølgende chromatografi. Disse materialer blev derpå konjugeret til CNBr-aktiveret Sepharose CL2B eller 4B (Pharmacia, 17-0140-01 eller 17-0430-5 01) og udhældt som en søjle (anti-VIUR-sepharosesøjle).

"HEMOFIL", et stabilt, tørret præparat af antihæmofil faktor (faktor VIII, AHF, AHG) på koncentreret form fremstillet ud fra frisk, normalt humant plasma, repræsenterende en ca. 40 ganges berigelse for faktor VIIIC, blev opløst i følgende puffer: 0,02 10 M imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M lysin-Hcl, 0,02% NaN3, pH 7,4.

Efter opløsning blev "HEMOFIL" påført den i det foregående beskrevne anti-VIIIR-sepharosesøjle. Ikke-specifikt bundet protein blev elueret med ovennævnte puffer modificeret til 0.5 M NaCl. Dernæst blev faktor VIIIC elueret med ovennævnte 15 puffer, indeholdende 0.35 M CaCl2 med tilsætning af 10% glycerol, som stabiliserer faktor VHIC-aktiviteten. Aktive fraktioner fra immunosorbentsøjlen blev samlet og dialyseret mod puffer (0,02 M imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1 M lysin-HCl, 0,025 M CaCl2, 0,02% NaN3. 10% glycerol, pH 7,4). En aliquot af 20 de dialyserede fraktioner, som indeholdt 1100 enheder faktor VIIIC, blev anbragt på aminohexyl-Sepharose 4B-søjlen (1x6 cm) bragt i ligevægt med dialysepuffer som beskrevet i det foregående. Faktor VHIC-aktivitet blev elueret med samme puffer indeholdende enten 0,35 M CaCl2 eller 2 M NaCl. Aktivite-25 ten fandtes i et volumen på 2 ml med 500 enheder faktor VIIIC pr. ml. Efterfølgende eksperimenter udført på samme måde gav en udvinding på 25% fra anti-VIIIR-søjlen og en udvinding på 90% fra aminohexylsøjlen. Alternativt føres samlet, dialyseret materiale elueret fra immunosorbentsøjlen først til en dex-30 transulfatagarose (Pharmacia) søjle (1,5 x 6 cm) bragt i ligevægt med dialysepufferen som nævnt i det foregående og elueret med samme puffer. Adskillige mindre forureninger, f.eks. fibrinogen, fibronectin, IgG, tilbageholdes på søjlen, mens faktor VIIIC kommer ud i gennemstrømningen, som samles og 35 anbringes på aminohexyl-sepharosesøjlen som før.

DK 165506 B

12 Både biologisk, dvs. størknende, og antigen (CAg) aktivitet blev vist at være til stede i den rensede faktor VIIIC, hvilket blev vist ved de efterfølgende prøver, der indikerede en 5000 ganges rensning i forhold til den 40 ganges koncentration i 5 "Hemofil". Under anvendelse af et i handelen tilgængeligt standardiseret trekomponentudstyr fra General Diagnostics, (APTT, Faktor VIII deficient plasma, Verify Normal Citrate) blev en koaguleringsprøve udført og indikerede høje koncentrationer af faktor VIIIC biologisk aktivitet.

10 De anvendte antistoffer stammede fra inhibitorpatienter, en med en lavtiter (LZ) som dæk-Ab og en med en høj titer (HZ) som det mærkede Ab. Disse antistoffer anvendtes ved to forskellige forsøgstyper. I et RIA-forsøg mærkes HZ-Ab med I125, medens i et ELISA-forsøg, kobles HZ til peberrodsperoxidase. Mærkning med 15 I125 af antistof HZ for RIA-forsøget udførtes som beskrevet af Hunter, W.M., i Radioimmunoassay, Weir, D.M., udg. Handbook of Experimental Immunology, tredie udgave, vol. 1, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978. HPR-HZ-konjugation udførtes som beskrevet af Wilson og Nakane, i Immunofluor-20 escence and Related Staining Techniques, Knapp et al., udgivere Elsevier, North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 1978, p. 215-224. LZ havde en aktivitet på 700 Bethesda-enheder/ml, medens HZ havde en aktivitet på 1500 Bethesda-enheder/ml. Dækantistof (LZ) fortyndedes til 3,5 Mg/ml i 0,1 M NaHC03, pH 25 9,8 (RIA) eller 0,05 M imidazol, 0,1 M NaCl, 0,01% Thimerosal, 0,05% Tween 20, 5% BSA (ELISA) eller til begge forsøg PBS-CMF (til 1 liter: 200 mg KC1, 200 mg KH2P04, 8,0 g NaCl, 1,15 g vandfrit Na2HP04, pH 7,4), og 1 ml sattes til hvert rør (polystyren) og inkuberedes natten over ved stuetemperatur. Denne 30 opløsning fjernedes ved af sugning, og rørene vaskedes tre gange med 3 - 3,5 ml 0,15 M NaCl eller PBS-CMF indeholdende 0,05% Tween 20. Prøver eller standarder (General Diagnostics, Verify Normal Citrate, katalog nr. 34112) fortyndes og sættes til rørerne til et totalt rumfang på 0,9 ml pr. rør og inkuberes 35 natten over ved stuetemperatur (fortyndinger foretoges i 0,02 M Tris, 0,15 M NaCl, 5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,01% Thimerosal,

DK 165506B

13 pH 6,5 for RIA eller 0,05 M imidazol. 0,1 NaCl, 0,01% Thimero-sal, 0,05% Tween 20, 5% BSA for ELISA eller PBS-CMF til begge forsøg. Opløsninger fjernedes ved af sugning, og rørene vaskedes som tidligere beskrevet. Til RIA tilsættes 5 x 105 cpm 125i-5 mærket antistof over for faktor VIIIC (HZ) i 600 juliter RIA-fortyndingspuffer til hvert rør, der herefter inkuberedes ved 37*C i 16 - 18 timer; opløsningerne fjernedes, rørene vaskedes som tidligere beskrevet og blev talt i en c-tæller. Til ELISA-forsøget sattes 0,9 ml peroxidasekonjugeret anti-faktor 10 VIIIC(HZ) til hvert rør, der herefter inkuberedes natten over ved stuetemperatur; opløsningerne fjernedes, og rørene vaskedes som før, hvorefter 0,9 ml OPD-opløsning tilsattes (til 100 ml: 0,73 g citronsyre, 1,19 g dinatrium surt phosphat, 0,15 g o-phenylendiamin, pH 5,0 med 250 juliter 10% H202 tilsat lige inden 15 brugen), og der inkuberedes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. For at afbryde reaktionen tilsattes hvert rør 0,5 ml 6 N HC1 (eller 0,9 ml i M H2S04), og OD492 aflæstes.

II. Qpbvcming af faktor VIITC-komplekset A. Immunoprecipitationsforsøg 20 Gelfiltreringsforsøg udførtes med en AcA 44-søjle på faktor VHIC-renset materiale under følgende betingelser: 0,1% insulin (som bærerprotein for stabilisering), 0,25 M CaCl2, 0,01% Thimerosal, 0,05 M imidazol, pH 7,2. Faktor VHIC-koagulering og antigenvirkning af eluatet kontrolleredes. Der observeredes 25 to antigene toppe. En med Faktor Vllic-koaguleringsevne opførte sig som et kompleks med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 460000 under disse betingelser (oprindelig). Den anden top (uden koaguleringsevne) eluerede ved en observeret molekylvægt lidt under 67000.

30 Dersom der analyseredes ved standardanalytisk Laemmli SDS-gelelektroforese (Laemmli, Nature (1970) 227:680-685) opnåedes

DK 165506B

14 forskellige proteinarter på 240, 160, 140, 115, 92,5, 80 og 77 kD. Forholdet mellem disse proteiner og faktor VIIIC bestemtes ved standardimmunoprecipitationsmetoder. I immunoprecipita-tionsmetoden anvendtes S. aureus protein A-sepharose (CL4B 5 eller polystyrenkugler (1/8 inc, Precision Plastic Ball Co.) beklædt med affinitetsrenset andet antistof (gedeanti-mus IgG eller anti-human IgG) for at adskille antigen-Ab-komplekser fra fri 1251-mærket faktor VIIIC.

Proteinerne, der eluerede fra affinitetssøjlen, blev iodbehand-10 let og herefter omsat med antistoffer specifikke for faktor VIIIC. Antistofferne var humane inhibitorantistoffer isoleret fra hæmofile patienter og betegnet anti-faktor VIIIC (Z) og (E) eller inhibitorantistof (Z) og (E).

Resultaterne viste, at begge antistoffer reagerede med 77/80 15 kD-dubletten. "E"-antistoffet reagerede også stærkt med 240 kD-båndet og gav svag precipitation med adskillige bånd (160, 140, 115, 92,5 kD) mellem dubletten og 240 kD-arten. "Z"-antistoffet precipiterede også 92,5 kD og 240 kD-proteiner. Den stærke reaktion mellem "E"-antistof og 240 kD-arten antyder, at denne 20 art er en precursor for faktor VIIIC.

Antistof-søjlerenset faktor VIIIC-fraktion iodbehandledes og omsattes med humant inhibitorantistof både med og uden EGTA (ethylenglycol-bis(/3-aminoethylether)-Ν,Ν,Ν*,N'-tetraeddike-syre). Dette muliggør en undersøgelse af den rolle som divalen-25 te kationer spiller, specielt Ca** i forbindelse med faktor vmc-polypeptiderne. Man fandt, at inhibitorantistof (E) udfælder 77/80 kD-dubletten, samt de højmolekylære arter af 160, 140, 115 og 92,5 kD. Dubletten er altid blandt de stærkere bånd. (Dette immunoprecipitationsforsøg udførtes med po-30 lystyren. Denne metode bevirker en lavere baggrund, og det mærkede IgG i faktor VHIC-præparatet udfældes ikke). Inklusion af EGTA bevirker tabet af de højmolekylære bånd (92,5 - 160 kD), men havde ingen virkning på mængden af udfældet dublet. Et lignende forsøg anvendte Z-antistof koblet til Sepharose som en

DK 165506B

15 immunosorbent: renset faktor VIIIC påføres søjlen og efter binding via 77/80 kD, elueres 92,5 kD-polypeptidet selektivt med EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). Metoden anvendes præparativt til fraktionering af 92,5 kD-arterne. Denne 5 immunosorbentsøjle eller en lignende en præpareres med polyklo-nale antistoffer over for faktor VIIIC. Når der elueres med chaiotropiske eller denaturerende opløsningsmidler som f.eks. henholdsvis thiocyanatopløsninger eller vandigt urinstof i stedet for EGTA renses faktor VIIIC yderligere. Disse resulta-10 ter tyder på, at 92,5 kD-peptidet kan være associeret ikke-covalent til 77/80 kD-dubletten via en Ca^-bro. Inhibitorantistoffet synes at indvirke direkte kun på dubletten. De højmolekylære bånd (115 kD, 140 kD, 160 kD) er sandsynligvis precursorer for 92,5 kD, hvilket indikeres af det monoklonale 15 antistofs evne rettet mod 92,5 kD-polypeptidet til at kryds-reagere med 115 kD, 140 kD og 160 kD-polypeptiderne.

Forholdet mellem de forskellige proteinarter fra affinitetssøjlen demonstreredes ved immunoprecipitation af iodbehandlet, renset faktor VIIIC med monoklonale antistoffer fremstillet som 20 beskrevet af G. Kohler and C. Milstein (Eur. J. of Immunol. (1975) 6:511). Balb/c-mus immuniseredes med væskefaseimmu- noadsorberet faktor VIIIC. Miltceller (108) kobledes med 107 NSO eller NSI-mus-myelomaceller. Fusionsprodukterne udsåedes i to 96-brøndsmikrotiterplader. Et miltcellefødelag anvendtes med 25 104-celler/brønd. Kolonier var mikroskopisk synlige fra den femte dag, og supernatanterne undersøgtes med få dages mellemrum under anvendelse af et ELISA-forsøg. Følgende lag anvendtes: første, faktor VIIIC elueret fra hexyl-Sepharose 4B-søjle som beskrevet i afsnit I ovenfor; andet, hybridomacelle-30 supernatant; tredje peberrodsperoxidase (HPR) -mærket gedeanti-mus IgG; fjerde HPR-substrat.

Adskillige grupper af monoklonale antistoffer blev identificeret, hvoraf to hæmmede faktor VHIC-koagulationsevne: gruppe I-antistoffer reagerede med 80/77 kD-dubletten og 240 kD-35 polypeptiderne, og gruppe Il-antistoffer reagerede med pro-

DK 165506B

16 teinerne på 240, 160, 140, 115 og 92,5 kD. Immunoprecipitation af thrombin-nedbrudt faktor VIII med gruppe I-monoklonale antistoffer indicerer, at den frembragte 70/67 kD-dublet stammer fra 77/80 kD-dubletten (se nedenfor). Gruppe III-5 monoklonale antistoffer tyder på, at 160, 140, 115 kD-peptider-ne er precursorer for 92,5 kD-peptidet. De monoklonale antistoffer fra gruppe III reagerede yderligere med et 40 kD-peptid frembragt ved thrombinnedbrydning af renset faktor VIIIC-materiale.

10 Et forsøg som det ovenfor beskrevne under anvendelse af EGTA for at undersøge rollen af Ca^-ionen i faktor VHIC-komplekset udførtes også under anvendelse af et nonoklonalt antistof baseret i ELISA-forsøg med følgende lag: første monospecifikt anti-(muse-IgG); andet, gruppe Ill-monoklcnalt antistof (anti-15 92,5 kD); tredje renset faktor VHIC-materiale? fjerde HRP-humant inhibitorantistof over for 77/80 kD. Tilsætning af EGTA fjernede bunden HRP-aktivitet til stede i kontrollen uden chelator. Den kendsgerning, at gruppe I og gruppe III monoklonale antistoffer rettet over for henholdsvis 77/80 kD-dubletten 20 og 92,5 kD-proteinerne hver især er hæmmende over for faktor VHIC-koagulationsevne tyder på, at begge er essentielle komponenter af faktor VHIC-komplekset.

B Thrombinaktiverina af faktor VIIIC

Aminohexyl-koncentreret affinitetsrenset faktor VIIIC er 25 aktiveret ved hjælp af thrombin (Boehringer, fremstillingsnummer 1072302), idet der anvendtes to forskellige sæt pH-betingelser (6,8 og 7,4).

Udtagne prøver blev undersøgt for koagulationsevne og herudover TCA-udfældedes prøver (på ca. 2,5 enheder hver) til gelanalyse.

30 I de første forsøg var VlllC-aktiviteten til at begynde med 46 enheder/ml. Dette fortyndedes til en slutkoncentration på 11,5 enheder/ml i faktor VHIC-puffer (20 mM imidazol, pH 6,8, 150

DK 165506B

17

Mm NaCl, 200 mM lysin, 25 xnM CaCl2 og 10% glycerol) Slutkon-centrationen af thrombin var 0,12 enheder/ml (ca. 1 enhed thrombin pr. 100 koagulationsenheder VIIIC). Resultaterne viste, at koagulationsevnen steg til ca. 180 enheder/ml 5 herefter af tog til ca. 40 enheder/ml (i det væsentlige udgangsværdien) sammenfaldende med en lignende forøgelse og nedgang i mængden af 92,5 kD-arter. Dette peger således på, at 92,5 kD-arterne er en del af det aktive faktor VHIC-kompleks.

Yderligere forsøg med mere koncentreret faktor VUIC-præparater 10 blev udført for at anvende thrombinaktivering på præparativ måde. For at frembringe 92,5 kD-polypeptid sattes thrombin til det rensede faktor VHIC-materiale (pH 7,4) i et forhold på ca. 1000-2000 koagulationsenheder faktor VIIIC til 1 enhed throm-binaktivitet, og man lod reagere i en kort tid (5-15 minut-15 ter, afhængig af hæmofilprøven). Det fremkomne produkt påførtes herefter en 7,5% præparativ gel, og peptiderne fraskiltes ved elektroforese, idet gelbåndene blev udskåret og elektroelueret.

Dersom thrombinnedbrydning udføres i kort tid kan mængden af 92,5 kD-arter fordobles eller tredobles; på samme tid er 77/80 20 kD-dubletten kun delvis omdannet til 67/70 kD-arter. For at optimere betingelser for isolering af 67/70 kD-dubletten udføres en længerevarende (mere end 1 time) thrombinnedbrydning. I dette tilfælde spaltes 92,5 kD-arten yderligere til frembringelse af mindre fragmenter. To nye peptider 52,5 kD og 25 40 kD kommer til syne efter thrombinbehandling. 40 kD-peptidet reagerer med det monoklonale antistof rettet mod 92,5 kD-arter og må derfor være et spaltningsprodukt. 52,5 kD-peptidet stammer også fra 92,5 kD-proteinet hvilket vises ved en sammenligning af kemiske og enzymatiske spaltningsmønstre dvs.

30 både 92,5 kD og 52,5 kD-arterne viser, dersom de underkastes CNBr eller endoproteinase lys C-spaltning, et antal fælles fragmenter (ved hjælp af SDS-PAGE).

Til endoproteinase lys C-nedbrydning anvendes et vægtforhold mellem lys C til protein på ca. 1:1 - 100 sædvanligvis 1:10. I

DK 165506 B

18 den pågældende nedbrydning anvendtes 10 pmol (4,8 /ig) lys C sammen med 200 pmol (14 μ%) 70 kD-polypeptid i ca. 100 /iliter 0. 025.M Tris-HCl, pH 7,7, 0,001 M EDTA, 0,08% SDS, og blandingen inkuberedes ved 37“C i 6 timer indtil natten over for at 5 opnå fuldstændig nedbrydning. Native polyacrylamidgeler som beskrevet af Orstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1964) 121: 321-349 anvendtes til isolering af lys C-nedbrydningsprodukterne.

C Thrombinnedbrydning af gelisoleret VlllC-relaterede proteiner 10 For at bekræfte precursor-produktforholdet af disse peptider isoleredes en række bånd ved præparativ SDS-gelelektroforese, elektroelueredes og underkastedes thrombinnedbrydning. Resultaterne var følgende: 1. 240 kD-proteinet frembragte multiple bånd herunder 160, 15 140, 92,5 kD, men intet mindre end 92,5 kD dvs. ingen 77/80 kD eller 67/70 kD-dublet. Herudover udførtes et tidsforløb for nedbrydning med 240 kD-fragmentet og analyseredes for gelelektroforesemønster, koagulationsevne og faktor VHIC-antigen (CAg) aktivitet. Gelresul-20 taterne var de samme som ovenfor,, og i det væsentlige udvandtes ingen CAg eller koagulationsevne.

2. 160 kD og 92,5 kD-gelisolerede polypeptider viste sig ikke at være substrater for thrombin eller isolering fra gelen.

25 3. Thrombin spalter specifikt gelisoleret 77 kD og 80 kD-arter til frembringelse og henholdsvis nye polypeptider på 67 kD og 70 kD. Efter thrombinbehandling udfælder monoklonale antistoffer af gruppe I ikke alene 77/80 kD-dubletten, men også de nye 67 og 70 kD-arter.

DK 165506B

19 D Aminosvresekvensanalvse

Delvis aminosyresekvensinformation blev opnået ved standardmetoder for 67/80 kD-peptiderne, 77/80 kD-peptiderne og 52,5 kD-peptidet isoleret ved hjælp af præparativt SDS-elektrofore-5 se. Den elektroforetiske analyse indicerer sammen med amino-syresekvensresultaterne, at de gelisolerede 77/80 kD, 67/70 kD, 92.5 kD og 52,5 kD-polypeptiderne blev opnået med >95%, sædvanligvis 98% renhed. De gelisolerede peptider blev påført en gasfaseproteinsekvenser (Applied Biosystems). PTH-amino- 10 syrerne blev påført en HPLC-søjle (IBM cyano, 25 cm), og aminosyresekvensen bestemt ud fra de fremkomne chromatogrammer.

Følgende sekvens blev bestemt for 67/70 kD-dubletten ved dens aminoendestilling 123456789 10 11 15 ? Phe Gin Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met 52.5 kD-proteinet, der er angivet nedenfor, stammer fra 92,5 kD-proteinet, idet følgende aminosyresekvens ved N-endestil- 20 lingen bestemmes: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Trp Asp Tyr Met Gin Ser Asp ? Gly Glu Leu Pro Val 25 Aminosyresekvenserne for to peptider opnået ved nedbrydning af 77/80 kD-dubletten med endoproteinase Lys C (Boehringer-Mannheim) bestemtes. Nedbrydningen blev udført på følgende måde. 77/80 kD-dubletten blev elektroforesebehandlet på en

DK 165506B

20 polyacrylamidproteingel, og båndene svarende til dubletterne blev elektroelueret. Det fraskilte materiale blev renset og nedbrudt med endoproteinase lys C, og de fremkomne peptider blev fraskilt ved omvendt fase HPLC. Fraktionerne, der svarede 5 til toppe for absorbans ved 280 nm, blev sekvensbedømt under anvendelse af en automatiseret sekvenser (Applied Biosystems, Foster City, CA, Model A70A). Den første sekvens var følgende: 12 3 4 5 67 8 9 10 11 12

Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Val Leu Leu Pro ser Lys 10 Det andet peptid havde følgende sekvens: 123456789 10

Val Thr Gly Val Thr Thr Gin Gly Val Lys 77/80 kD-dubletten blev også nedbrudt med trypsin. Dubletmaterialet blev renset som beskrevet for nedbrydning med 15 endoproteinase lys C ovenfor. Lysiner blev blokeret ved citraconylering for at muliggøre nedbrydning kun ved argininer-ne. Citraconylering udførtes ved at opslæmme proteinerne i en denaturerende puffer, reducere og carboxymethylere de op-slæmmede proteiner og behandle med citraconanhydrid, idet man 20 holdt pH mellem 8,5 og 9,0. Efter citraconylering blev proteinerne nedbrudt med trypsin, og de fremkomne peptider fraskilt ved omvendt fase HPLC. De fraktioner, der svarede til absorbanstoppe ved 280 nm, blev sekvensbestemt som ovenfor. Sekvensen var følgende: 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Met Gly Val Leu Gly Cys Glu Ala Gin Asp Leu Tyr

Dersom metoder til bestemmelse af N-endestillingssekvenserne af 80 og 77 kD-arterne udføres, viste det sig, at deres aminoen-destillinger var blokeret. Derfor bestemtes N-endestillings-30 sekvensen ud fra det materiale, der blev opnået ved en alterna-

DK 165506B

21 tiv rensningsmetode, der omfattede immunoaffinitetschromatogra-fi og ionbytterchromatografi, og som udelukkede tilsætning af præparativ SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Rensning af 80/77 kD-dubletten indebærer tilsætning af faktor VIIiC-koncentrat 5 til en monoklonal antistofsøjle efterfulgt af chromatografi på en mono S-kationbytter. Dette materiale havde en ublokeret N-endestilling, hvilket viste, at blokeringen afsløret i gelrenset 80/77 kD var en artefakt, der skyldtes gelelektrofore-sen. Aminoendestillingssekvenserne bestemt for både 80 og 77 10 kD-arterne er følgende: 123456789 10

Glu Ile Thr ? ? ? Leu Gin ? Asp 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Gin Glu Glu Ile Asp Tyr ? Asp Asp Ile 15 E. Aminosvresammensætnina

Aminosyresammensætningerne for 77/80 kD-peptiderne bestemtes ved standardmetoder at være følgende:

Aminosyre 80 kD 77 kD

Asp 58 54 20 Glu 74 76

Cys 12 14

Ser 47 44

Gly 51 46

His 8 12 25 Arg 32 29

Thr 35 29

Ala 35 33

Pro 33 30

Tyr 25 25 30 Val 46 44

Met 17 17

DK 165506 B

22

Ile 33 35

Leu 49 48

Phe 32 31

Lys 47 47 5 Totalt antal aminosyrer 634 608

Beregnet molekylvægt: 82 kD 79 kD

Claims

1. Oprenset proteinmateriale, kendetegnet ved et komplex af et 77/80 dublet polypeptidfragment calciumbroforbun-det med et 92,5 kD polypeptidfragment, som udviser en koagula- 5 tionsevne som faktor VIIIC, og som har en renhed på mindst 90% baseret på komplex plus precursor.

2. Proteinmateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det kan fremstilles ved, a) at underkaste et i handelen tilgængeligt cryopreci- 10 pitatpræparat indeholdende faktor VIII immuno-sorbent- chromatografi under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR-sepharosesøjle, b) at separere det resulterende materiale på en aminohexyl-substitueret agarosesøjle, og 15 c) at rense yderligere ved chromatografisk behandling.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af proteinmaterialet ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at a) humant Faktor VIII underkastes immunosorbent-chromato-grafi under anvendelse af en polyklonal anti-VIIIR- 20 sepharosesøjle, b) det resulterende materiale separeres på en aminohexyl-substitueret agarosesøjle og c) renses yderligere ved chromatografisk behandling

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegenet ved, 25 at der i trin a) anvendes et eller flere af følgende punkter: 1 human anti-hæmofilifaktor (AHF) anvendes som udgangsmateriale, især i form af et cryoprecipitat,

2 Factor VIIIC opløses til immunosorbentchromatografi i saltvand-imidazol-lysin-HCl-puffer ved pH-værdi 7,4, 30. elueringen udføres under anvendelse af forholdsvis store koncentrationer af calciumion sammen med glycerol. DK 165506B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at de fraktioner, som fås fra søjlen i trin a), dialyseres med en puffer indeholdende lave koncentrationer af calciumion, før de underkastes trin b).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at elueringen i trin b) udføres i høj calciumeller natriumchloridkoncentrationspuf f er

7. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 3-5, kendetegnet ved, at der i trin c) anvendes gelatinesepharose-,

10 HPLC-, ionbytning på dextransulfat- eller Mono Q-affinitets-søjler, der anvender lecitiner eller antistoffer over for Faktor VIIIC til yderligere chromatografisk rensning.