JPS60185723A - フアクタ−ｖ３ｃ組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） ファクター■Ｃは血液凝固の本質的経路に関与する血漿
蛋白質である。遺伝性のＸ染色体連鎖劣性出血性疾患で
あるＡ型血友病を有する個体にお兄・ではこのファクタ
ーは存在せず、又は不足している。ファクターＶＩＣの
血漿中濃度は極めて低く、そして一層大形の蛋白質前駆
体の中間分解生成物−またｉｉ最終生成物であると考え
られるため、該ファクターの単離においては大きな困難
に遭遇する。

従って、ファクターＶｌ［Ｃを単離しようとすれば分子
量の異る有意に不均一な複雑な混合物が得られる。

生理的に活性な蛋白質の製造に広く適用することができ
る方法の１つに精製された形での目的蛋白質の単離が含
まれる。目的蛋白質は、その蛋白質の製造のための組換
ＤＮＡ技法の開発において非常に大きな助けとなる。目
的蛋白質を手にすることによって、該蛋白質に特異的な
モノクローナル抗体を製造することができ、この抗体を
用いて、細胞溶解物、卵母細胞中でのメツセンジャーＲ
ＮＡからの発現、又は単細胞微生物中でのｃＤＮＡ遺伝
子からの発現において、蛋白質の製造を確立することが
できる。さらに、アミノ酸配列を決定することにより、
特定のアミノ酸配列をコードするコドンを用いて、メツ
センジャーＲＮＡ　、　染色体ＤＮＡ又はｃ　ＤＮＡと
）・イブリダイズするグローブを開発することができ、
従って該当する遺伝子の検出、単離及び発現をもたらし
、そして所望の生成物を１種類又は複数種類の宿主にお
いて高収量で製造することができる。

（従来技術） 米国特許第４，３６１，５０９号及びこれに引用された
文献にはファクターｖｍＣの精製が記載されている・さ
らに、Ｆｕｌｃｈｅｒ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ　。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　
（１９８２）７９：１６４８−１６５２を参照のこと。

Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等。

Ｊ、　ｏｆ　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉａ
ｉｎｅ　（１９７９）９３　：４０−５３にはポリクロ
ーナル抗体を用いるファクターｖｌＩＩＣの精製につい
て記載されている。

Ａｕ５ｔｅｎ、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ、Ｈｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ　（１９７９）４３：　６６９−６７４１１１Ｃ
は７　アクタ−ＶＩＩＩＣＯ精製のためのアミンヘキシ
ル−セファロースの使用について記載されている。Ｗｅ
ｉｎｓｔｅｉｎ等、す１シＮａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｅ
ｔ、ＵＳＡ　（１９８１）　７８：　５１３７−５１４
１にはファクターｖＩＩＩＣに対するスロンビンの効果
が検討されている。さらに、Ｋｕｏ等。

Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｆｏｒ　ＩＸ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｌｓ＋　（コペン″−
ダン、　１９８３年７月）を参照のこと。

（発明の概要） 微生物又は哺乳動物組織培養細胞での発現によるヒト−
ファクターＶＩＩＣ１その前駆体及びサブユニットの製
造方法及び組成物が提供される。この方法は、純粋なフ
ァクター■Ｃ１そのサブユニット及び断片を単離し、そ
して特にスロンビン消化を用いてこれらの生理的関連性
を決定することを含む。関連する一連のポリペプチドの
各々の少なくとも部分を配列決定し、そしてこの配列を
複合プローブの開発に使用する。ゲノムＤＮＡ断片を相
同配列につ〜・て探索し、ハイブリダイズする断片を単
離し、そして完全なサブユニット又は断片をコードする
ＤＮＡ断片を得るためにさらに操作し、そして／又は成
熟ｍＲＮＡを単離するために使用し、このｍＲＮＡから
ｃＤＮＡを得る。次にＤＮＡ配列をさらに操作して発現
ベクターに挿入し、そしてこの発現ベクターを適合性の
宿主に挿入しポＩＪ−２７’チドを発現せしめる。

（特定の態様の記載） ヒトーファクター■■Ｃ断片及びサブユニットが実質上
純粋な形で提供される。さらに、前駆体としての又は活
性形でのファクターｖＩ［ｌＣを製造するため、あるい
は天然に得られるサブユニットと組合わせて使用する個
々のサブユニットを得るためのファクターｖＩｌｌＣサ
ツユニット及び断片を発現するための方法及び構成物が
提供される。このサブユニット及び断片はファクター■
■Ｃと関連する」又は複数の生物学的性質、例えばエピ
トープ部位、凝固活性、及び免疫原性を有し、抗体を製
造するために使用され、この抗体は試薬として、特にイ
ムノアッセイにおけるラベルされた試薬として使用され
る。

ヒト−ファクターｖＩＣは、約４６０ｋｄの見かけ分子
量を示しそして実質上純粋な形で単離され得る複合蛋白
質である。変性条件下での電気泳動に際し、種々の分子
量、すなわち２４０．１６０．１４０．１１５．９２．
５．８０、及び７７　ｋｄの多数の断片が生じ、後２者
はダブレットとして移動する。免疫的関係を調べるため
に抗体を用いそして構造的関係を調べるために切断パタ
ーンを用いながら、化学的切断及びヌロンビン切断を含
むプロテアーゼ切断によシ断片を分析することにょシ、
９２．５　ｋｄポリペゾチドが２４０．１６０．１４０
及び１１５ポリペプチドと関連しており、他方７７／８
０ダブレツトは他のペプチドと共通の同定され得る特性
を有さず２４０　ｋｄポリペプチドとのみ共通の特性を
有することが示される。さらに、７７／８０ｋｄダブレ
ツトはスロンビンによシロ７／７０ｋｄダブレツトに転
換され、他方スロンビンで処理された精製ファクターＶ
ＩＩＩＣ物質中に存在する９２．５ｋｄ、ｊｅリペプチ
ドはスロンビンによシ直接的又は間接的に約４０及び５
２．５ｋｄの２個のポリペプチドに切断される。電気泳
動的に単離された７７／８０ｋｄ〆プレツトポリペプチ
ドはそのＮ一端がブロックされておシ、６７／７０　ｋ
ｄダブレットはそのＮ一端がブロックされていないこと
が見出される。

さらに、ファクターＶ［ｌＣの座は大きなイントロンと
共にエクソンを含み、エクソンはファクター■■Ｃと関
連する種々の領域を含むことが見出される。すなわち、
ファクターＶｌ［ｌＣ複合体に関する特定のポリペプチ
ド及びその断片に係る個々のエクソンを単離することが
できる。ファクターｖｌＩＩＣサシユニット及びその断
片に関する特定のアミノ酸配列を同定することにより、
ゲノムＤＮＡからエクソンを選択的に単離し、そしてそ
のエクソンをそれ自体として組合わせて、又は合成りＮ
Ａにより連結して、ファクターｖＩＣのポリペゾチドサ
ブユニット又はその断片をコードする配列を得、これら
を製造することができる。

便利には、エクソン及びイントロンの両者を含有するフ
ァクターｖＩＩＩＣゲノムＤＮＡ配列を哺乳動物細胞中
での転写及び翻訳に適当な発現ベクターに挿入し、ｃＤ
ＮＡのクローニングに適するように適切にスジライスさ
れた実質的な量のメツセンジャー　ＲＮＡを得、そして
ファクターｖｍｃ、サブユニット又は断片を製造する。

さらに、ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を用いてファ
クターｖｎ］Ｃをコードする天然メツセンジャーＲＮＡ
とノ・イブリダイズさせることができる。次に、このメ
ツセンジャーＲＮＡを用いてファクターＶＩＣのサブユ
ニットをコードするｄａ　ｃＤＮＡ　を調製することが
できる。

ＤＮＡ配列は、これを転写及び翻訳のために必要な制御
がシグナルを有する適当な発現ベクターに挿入すること
によって、発現のために使用することができる。ファク
ターＶＩＣ遺伝子発現ベクター（ファクター■Ｃ１その
前駆体、サブユニット又は断片の全体又は部分をコード
する１個又は複数個の遺伝子を担持する発現ベクター）
を適合性の宿主に導入し、そしてこの宿主をファクター
■Ｃの発現のために増殖せしめることができる。宿主を
適切に選択することによシ、ファクターｖＩＩＩＣのＤ
ＮＡヲ分泌リーダー及びプロセシングシグナルの下流に
挿入し、生成物が宿主から分泌され、そしてプロセシン
グされて完全なポリペプチドとなるようにすることがで
きる。適当であれば、このポリペプチドをさらに処理し
てこれに天然ポリペプチド上に存在する官能基又は置換
基を導入することができる。

この発明の最初の段階において、高度に精製したファク
ターｖｍＣを得そして特徴付ける。精製されたファクタ
ーＶ［ｌＣは市販のヒト−抗血友病因子（ＡＨＦ）から
得ることができる。この因子は玉状なヒトの新鮮な血漿
から冷却沈澱物として調製されるものであり約４０倍に
濃縮されている。これを適当な緩衝液、例えばイミダゾ
ール−リジン−ＨＣ１塩溶液（ｐＨ７，４）に溶解し、
次にファクターｖｌＩＣ又はファクターＶｎｌＲに対す
るポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を有する
アフィニティーカラム上でクロマトグラフ処理すること
によりファクターＶ［ｌＣをさらに濃縮、精製する。便
利には、抗体をセファロース支持体に共有結合せしめる
。

比較的高濃度のカルシウムイオンとグリセリンとの組合
せを用いてカラムからファクターＶｌ［ｌＣを溶出する
ことができる。次に、カラムから得られた両分を低いカ
ルシウム濃度の上記の適当な緩衝液を用いて透析し、そ
して次にアミンヘキシル−セファロースカラムを用い高
濃度の塩化カルシウム又は塩化ナトリウムを含む緩衝液
で溶出することにより、さらに精製することができる。

追加のクロマトグラフ段階、例えばゼラチンセファロー
ス、ＨＰＬＣ、デキストランサルフェート又はＭＯｎｏ
Ｑ上でのイオン交換、レクチン又はファクターｖＩ［ｌ
Ｃに対する抗体を用いるアフィニティーカラム等によシ
さらに精製することができる。特に、デキストランサル
フェートを使用することによシ微量汚染物、例えばフィ
ブリノ−ダン、フィブロレクチン、ＩｇＧが標品から除
去され、外来性蛋白質を実質上含有しな〜・生成物が残
る。カラムからの両分の活性は、凝固アッセイ（市販キ
ット）及びファクターｖｍｃに特異的な抗体を用いて、
生物学的活性及び抗原活性のいずれか又は両方について
監視することができる。血漿中のファクターｖｆｆＩの
濃度に基いて、上記の方法によシ約２００．０００倍の
精製が達成される。

ファクターｖｌＩＩＣの特徴付は グル濾過によシ、ファクターｖｍｃが約４６０ｋｄの見
かけ分子量を有する複合体として挙動することが示され
る。５ＤＳ−ダル電気泳動（変性条件）を用いて分子量
を異にする７個の個別のポリペプチドを単離することが
できる。その分子量によシ定義される断片は２４０．１
６０．１４０．１１５．９２．５．８０及び７７　ｋｄ
　断片である。これらの断片を次の方法により特徴付け
た。

第１の研究は、血友病患者から単離された阻害抗体を用
いることを含む。これらの抗体を２及びＥと称する。両
抗体は７７／８０ｋｄダブレツトと反応した。Ｅ抗体は
２４０ｋｄポリペゾチドと強く反応し、そしてダブレッ
トと２４０　ｋｄポリペプチドとの間の複数のバンドと
弱く反応した。２抗体は２４０ｋｄポＩＪ　Ｏプチドと
も弱く反応した。

免疫沈澱実験において、Ｅ抗体は７７／８０　ｋｄダシ
レット、並びに１６０．１４０，１１５及び９２．５ｋ
ｄの高分子量様を沈澱せしめ、ダブレットは一層強いバ
ンド中にある。ＥＧ　ＴＡを含有せしめることによシダ
ブレット以外のバンドが消失し、９２．５ｋｄ　種がＣ
ａ＋＋橋に中介されて複合体中で７７　ｋｄ及び／又は
８０ｋｄ種と会合することが示される。

次の研究において、ファクター■■Ｃに介在される凝固
活性を阻害しそして複合体の成分と反応するモノクロー
ナル抗体を調製した。クラスＩは７７／８０ｋｄダシレ
ツト及び２４０ｋｄポリペプチドと反応し、クラス■は
１６０．１４０．１１５及び９２．５ｋｄポリペゾチド
と反応する。クラスＩ抗体とスロンビン消化ファクター
■■Ｃとの免疫沈澱によシ、生成する７　０／６７　ｋ
ｄダブレットはファクターｖＩ［ＩＣ中に存在する７７
／８０ｋｄダブレツトに由来することが示される。クラ
ス■モノクローナル抗体は、１６０．１４０及び１１５
ｋｄ　ペゾチドが９２．５ｋｄ　ペゾチドの前駆体であ
ることを示した。９２．５ｋｄペプチドの切断生成物で
ある４０ｋｄペプチドもクラス■抗体によ多結合された
。

ＥＧＴＡの存在下及び非存在下でモノクローナル抗体を
用いるＥＬＩＳＡ測定によシフアクタ−ｖＩｌｌＣ複合
体の９２．５　ｋｄ酸成分７７　ｋｄ及び／又は８０　
ｋｄ酸成分の間のＣａ＋＋橋会合が確認された。

ヒト阻害抗体及びモノクローナル抗体の両者は、イムノ
ソルベントカラム法においてファクターｖｍｃを得るた
めに使用することができ、又はＥＧＴＡを用いながら、
構成成分である９２．５ｋｄ種と７７７８０ｋｄ種を分
けるために使用することができる。

次の研究では、精製されたファクターｖｍｃ物質のＰＨ
５，８又は７．４におけるスロンビン消化を用いた。ア
リコートを凝固活性について測定しそしてグル分析のた
めにＴＣＡ沈澱せしめた。凝固活性は９２．５ｋｄ種の
量の増加及び減少に伴って時間と共に増力口しそして減
少することが示された。精製されたファクターＶ［ｌＣ
物質の短時間（５〜１５分間）のスロンビン処理によｌ
１１２．５ｋｄ種の量が増加し、７７／８０ｋｄダブレ
ツトは部分的に６７／７０ｋａダズレツトに転換される
。長時間、例えば１時間スロンビン消化する場合、９２
．５　ｋｄ蛋白質が分解され、そして４０ｋｄ及び５２
．５ｋｄの２個の新たなペグチドが生じ、４０ｋｄペゾ
チドは９２．５ｋｄ種の免疫原性を維持している。５２
．５　ｋｄペゾチドは、化学的及び酵素的分解パターン
及び９２．５ｋｄ種に類似する生成物によシ、切断生成
物であることが示される。

次の研究において、個々のファクターｖＩＣサブユニッ
ト及び前駆体（例えば２４０．７７／８０．９２．５ｋ
ｄ種）を調製用ＳＤＳグル電気泳動にょシ単離し、そし
て次に単離されたポリペプチドの経時的スロンビン消化
を行った。調製用ダルがら単離された２　４０　ｋｄ断
片は１６０，１４０，１１５、及び９２．５ｋｄのバン
ドを生成した。８０　ｋｄ及び７７ｋｄの断片はそれぞ
れ７０　ｋｄ及び６７ｋｄの断片を生成した。

７７ｋｄ及び／又は８０ｋｄ種と９２．５ｋｄポリペプ
チドとをカルシウム橋複合体として含有するファクター
ＶＩＩＣ複合体は高度に精製された形で得られる。抗−
フアクタ−ＶＩＩＩＲイムノソルベントカラム及びアミ
ノヘキシルセファロースカラムで処理した後、ファクタ
ーＶｌ［Ｃ物質（複合体及び前駆体積）の純度は、全蛋
白質を基礎にして、通常は８゜チより高く、しばしば９
０％より高く、そして９８チ以上であシえ、そして複合
体の純度は、全蛋白質を基礎にして２０％以上であシ、
さらに一般的には３０チ以上である。追加のクロマトグ
ラフ段階、例えばデキストランサルフェートの使用によ
り、ファクターｖｎ＋ｃ物質（複合体上前駆体）の純度
レベルが９０％以上に上昇する。調製用ＳＤＳダル電気
泳動によシ単離されたファクターｖＩＩＩＣ成分、すな
わち９２．５　ｋｄ種及び７７／８（Ｈｃａダブレット
の純度は通常９８チ以上である。上記のように、ダブレ
ットの１員又は９２．５ｋｄポリベグチドに特異的なモ
ノクローナル抗体を用いて複合体を得ることができる。

次に、変性剤又はチャオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐ
ｉｃ　）溶剤、例えば尿素水溶液又はチオイソンアナー
トを用いて複合体を抗体から分離することができる。

プローブの調製 ６７及び７０ｋｄ　ポリペプチドのＮ一端の部分的アミ
ノ酸配列は次の通シである。

１　２　３　４　５　６　７　８　９　１．０　１１？
　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　
Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ｌ１ｅ１２　１３　１４　１
５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２Ａｌａ
　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ｋＩｅｔこの配列に基いて、
６７／７０ｋｄダブレツト用の（従って、このダブレッ
トが由来する７７７８０ｋｄ　ダブレット用の）、次の
配列を有するグローブを調製することができる。

（Ｘ＝Ｇ、Ｃ，Ａ、Ｔ） グローブ２　：’　３’　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＣＴＴ
ＣＴＧＸ　ＴＣＴ　ＧＴ　５’プローブ３： （コード鎖） ５’　ＧＡＡ　ＣＧＸ　ＴＴＡπ；Ｇ　ＧＡＴ　ＴＡＴ
　ＧＧＸ　ＡＴＧ　３’ＧＡＧＡＧＣＣ ＣＴＸ プローブ４： （非コード鎖） ３’ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＣＧＡ
　ＣＧＡ　ＣＡＣＣＧ、ＧＧＧ ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＣＴＡ　ＡＴＧ　ＣＣＧ
　ＴＡＣ５’ＣＣＧ ５２．５ｋｄ蛋白質のＮ一端アミノ酸配列は実質上次の
通シである。

以下余白 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ｖａｌ このアミノ酸配列に基いて、５２．５ｋｄ蛋白質用の、
次のようなコード鎖を基礎にするプローブを調製するこ
とができる。

Ｔ ７７／８０ｋｄ蛋白質の３個の断片のアミノ酸配列は次
の通りである。

これらの配列に基いて、非コード鎖に基礎を置くそれぞ
れ次のようなプローブを調製することができる。

プローブ１ニ プローブ２ニ プローブ３： ３’−ＴＡＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣＣＣＴ　ＡＣＧ　
Ｃ’ＩＴ　ＣＧＴ　ＧＴＴＴ ＣＴＡ　ＡＡＣＡＴＡ−５’ これらの−２ｆチドの配列及び対応するグローブの調製
については実験の部において詳細に後記する。

ＤＮＡの単離 上記のグローブを用いてゲノムＤＮＡ又はメツセンジャ
ーＲＮＡの検出及び単離を行うことができる。

ゲノムＤＮＡのクローニングは、１種又は複数種の制限
酵素によるゲノムＤＮＡの切断及び約１０〜２５ｋｂ　
の断片のサイズ選択を含む。制限消化は、クローン化さ
れる断片がオーパーラ、デするように不完全であるべき
である。これらの断片は適当なベクターにクローン化し
て微生物、例えば細菌、例えばＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌ
Ｆ）中にクローンの「ライブラリー」を調製することが
できる。シラスミド又はウィルス、例えばｐＢＲ３２２
、ラムダ、シャロン４　Ａ　、　ＥＭＢＬ−４等の種々
のベクターを使用することができる。

酵素的に放射能ラベルした上記のプローブを用いてＤＮ
Ａをスクリーニングし、そして相同な配列を検出する。

１又は複数のプローブとノ・イブリダイズするこれらの
配列を再クローン化し、そして１回又は複数回再ノ・イ
ブリダイズすることができる。

最初に使用したプローブとは異る１種類又はす数種類の
制限酵素を用いて一層小さい断片を得ることができる。

これらの小断片は一般には約１〜１０　ｋｂ　、さらに
普通には１〜６　ｋｂの範囲の大きさを有する。次に、
これらの断片をサブクローン化し、そしてスクリーニン
グして陽性の断片を同定することができる。次に、ＤＮ
Ａ断片の配列決定のためにプライマーとして合成プロー
ブを使用することができる。最も便利に配列決定される
断片は、１種類又は複数種類の上記のプローブと相補的
な配列を含有する断片で１１７、ここで相同な配列は５
′一端から約５塩基〜約５００塩基である。

注目される他の断片には最初にクローン化された断片の
末端部の断片が含まれる。なぜなら、これらはライブラ
リー中の他のクローンにおいて示され、そしてそれ故に
完全な目的遺伝子を回収するまで染色体にそって「歩く
」ために使用されるからである。

ＤＮＡ断片を配列決定した後、決定された配列に基いて
さらに操作する。この配列に基いて、決定されたアミノ
酸配列を含むオープンリーディングフレームを同定する
ことができる。制限部位を決定することＫより、コード
配列を失うことなく断片のサイズをさらに小さくするこ
とができる。但し、Ｎ一端の短い配列を除去することは
許容される。これは適当なアダプターを用いて置き換え
ることができるからである。適当な位置において制限部
位を容易に用いることができない場合には、ＤＮＡ断片
を種々の時間にわたって坦３１　切断（リセクト）によ
り変形し、生じた断片をクローン化し、そして種々の技
法によ、９Ｎ一端を決定することができる。便利には、
リセクトされた断片が連結される３′−塩基の適切な選
択によシ特定の制限酵素の認識部位を設けることができ
る。この方法において、生ずるクローンをあらかじめ定
められた制限部位についてヌクリーニングすることがで
き、この部位は所望の部位へのリセクトされた断片の存
在を示すであろう。

好ましくは、エクソン、又は５０ｂｐ以上、さらに一般
的には約１００ｂｐ以上、さらには約２５０ｂｐ又はこ
れより大きいエクソン断片を変性し、そしてヒト細胞、
特にファクターＶｌｌｌ　Ｃのためのｍ１ＩＡを産生ず
るヒト細胞からｍ　ＲＮＡを得るためのプローブとして
使用することができる。・・イブリダイズするｍＲＮＡ
を単離することによって、卵母細胞又は網状赤血球溶解
物中での翻訳、及びファクター■■Ｃに対する抗体又は
ファクターＶＩＩＩＣサブユニットへの結合に基く凝固
活性を用いるファクターＶＩＩＣの産生の検出を行うこ
とによりｍＲＮＡをスクリーニングすることができる。

次に、例えばυ■逆転写酵素を用いてｍＲＮＡを逆転写
することができる。

逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ
断片）第２鎖を形成しそして適当であればヌクレアーゼ
、例えばＳｌヌクレアーゼによシ末銅ルーゾを除去する
ことによシ、種々の方法を用いてａｓ　ｃＤＮＡをｄｓ
　ｃＤＮＡに転換することができる。

不完全なコピーが得られる場合、ｍＲＮＡの５′−コー
ド配列がコピーされるまでメツセンジャーを「歩かせ」
、又はｃＤＮＡプライム合成を行い、そしてｍＲＮＡの
全コード領域をコードするＤＮＡ配列を得ることができ
る。

上記の方法に基いて、ファクターｖＩ［ＩＣの前駆体又
は該ファクターの大断片をコードするＤＮＡ配列を用い
て発現せしめ、又はファクターＶＩＩＣの特定のサブユ
ニット、例えば９２．５　ｋｄ　、　８０　ｋｄ又は７
７ｋｄのサブユニットをコードする小断片を用いること
かできる。

前駆体ポリペプチド（ブローファクターＶｍＣ）のため
には、遺伝子を１端又は両端において平滑末端化し、そ
して相補末端を有する発現ベクター中に挿入することが
でき、あるいは５′−コード端から下流で切断し、そし
てベクターに挿入するために適当なアダプターに連結す
ることができる。

そして、適当なＮ一端を有する断片（７０ｋｄ又は８０
ｋｄポリペプチドのコード配列にあってもよく、又は最
初の塩基から下流、一般に約３０塩基以下下流、さらに
一般的には約２０塩基以下下流に５′一端を有してもよ
い）を、適当であればアダプターを用いて、適切なベク
ターに挿入することができる。

染色体外要素を得るため、特定の宿主、発現の態様、構
成的か誘導的か、好ましいマーカー、分泌が好ましいか
否か等に依存して種々のベクターを使用することができ
る。（ここで、ベクターとは無傷の複製系を意味する。

）現在、哺乳動物宿主、例えば組織培養細胞、又は原核
性微生物及び真核性微生物、例えば１式、Ｂ、ズブチリ
スｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）等により認識される転写及
び翻訳制御シグナルを有する種々のベクターを使用する
ことができる。

ベクターは宿主によシ認識される複製系を有するであろ
う。但し、ある場合には、宿主ゲノムヘの翻訳及び転写
制御シグナル並びに注目のシストロンを有する構成物の
組み込みが望ましいであろう。このような場合には、構
成物の両端に宿主ゲノム中の配列と相同の配列が付加さ
れるであろう。

使用される発現ベクターは宿主により認識される転写及
び翻訳シグナルを有するであろう。転写シグナルはプロ
モーター及びターミネータ−１並びに１又は複数個のエ
ンノ・ンサーのごとき補助シグナルを含むであろう。さ
らに、転写の制御は、オペレーター、アクチペーター、
抑制をもたらす遺伝子等を含有せしめることによって行
われるであろう。転写に関する他の配列にはキャップ自
己列、ポリアデニル化配列等が含まれる。翻訳のために
は、宿主に依存して、す？シーム結合部位、開始コドン
、終止コドン等が存在するであろう。

便利には、宿主によシ認識されるシグナルが適切な関連
において存在するように、宿主にとって本来的である遺
伝子由来の非コード５′−及び３′−フランク領域が用
いられるであろう。遺伝子のリーディングフレームが開
始コドンと整合し、そしてそれ自身の終止コドンを有し
又は１又は複数の終止コドンのすぐ上流に挿入されるよ
うに、上記のフランク領域を遺伝子に連結することがで
きる。

ベクターは１選択を可能にし、そして宿主の増殖中に連
続的な選択圧をもたらす１個又は複数個のマーカーを有
するであろう。これらのマーカーには、栄養要求宿主に
おける原栄養性、抗生物質耐性、毒性耐性等が含まれる
であろう。

分泌リーダー及びプロセシングシグナルが設けられる場
合、通常アダプターを使用する必要がち／）５゜分泌リ
ーダー及びプロセシングシグナルをコードするＤＮＡ配
列の末端又はその上流に適当な制限部位を設けることに
より、通常約１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレオチドアダ
プターを合成し、これを、分泌リーダー及びプロセシン
グシグナル又はその切断部位と注目の遺伝子（この遺伝
子は遺伝子の開始コドン又はその下流に５′末端を有す
る）との間に挿入し、こうすることによってアダプター
が必要な喪失塩基のすべてを修復し、そして遺伝子のリ
ーディングフレームとリーダー配列の開始コドンが整合
するようにすることができよう。

次に、こうして得られた所望の遺伝子を含有する構成物
を、常法、例えばトランスホーメーション、接合、トラ
ンスフェクション等によって、培養において増殖するこ
とができる宿主に導入することができる。次に、宿主を
適当な栄養培地中で増殖せしめ、そして生成物を常法に
従って単離することができる。生成物が細胞内に維持さ
れる場合、細胞を集め、そして溶解する。分泌される場
合には、生成物を培地から単離する。生成物にクロマト
グラフィーにより、例えばアフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動、抽出、ＨＰＬＣ等によシ精製するこ
とができる。

哺乳動物細胞での発現のためにはベクターとして哺乳動
物ウィルス、例えば５Ｖ−４０、乳頭腫ウィルス、マロ
ニー（Ｍａｌｏｎｅｙ　）　ネズミサルコーマウイルス
、アデノウィルス等を使用することができる。これらの
ウィルスは哺乳動物細胞の培養物中で発現ベクターとし
て使用するために変性されている。代表的な系において
は、組込まれた５Ｖ−４０ゲノムを担持しそして５Ｖ−
４０の複製のために必要なラージＴ抗原を産生ずる匹細
胞が使用されるＣ　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ　（１
９８１）２３　：’１７５　）。

５Ｖ−４０地図上のＨｐａ　Ｉ部位から５Ｖ−４０地図
上の０１４部位にわたる断片がベクターとして使用され
る。ファクターｖＢｃ遺伝子又はその部分と５Ｖ−４０
ベクターとを連結することによって得られる組換シラス
ミドはモンキーＣＶ−１細胞のトランスフェクトのため
に使用することができる。

この発明に従えば、ファクターＶｌ［ｌＣの精製された
サブユニット及び断片が得られ、そして特定のサブユニ
ットを必要とする個体の凝固能力を強化するために使用
される。ファクターｖｍＣはまた医療において使用され
る。さらに、この発明によって製造されたポＩＪ　Ｋプ
チドは、ファクターＶ［ｌＣ１そのサブユニット及び断
片に対するモノクローナル抗体を製造するために使用す
ることができる。

さらに、サブユニット及び断片は試薬として使用される
。この試薬はラベルされ、そして抗体と組合わせて生理
的液体、例えば血液又は血清中の１又は複数のサブユニ
ット又はその分解断片の存在の診断的測定において使用
される。

次に例によシこの発明をさらに具体的に説明する。

特にことわらない限ＪＡｂは抗体を意味し、そしてＡｇ
は抗原を意味する。

実験 ■、　ファクターｖＩ［ｌＣの精製 ａ）　Ｅ、Ｇ、Ｄ、　Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ　、　Ｎ、Ｃ
，Ｔｒａｂｏｌｄ。

Ｊ、Ａ、　ＣＣｏ１１ｉｎ及びり、Ｗ、　Ｈｏｙｅｒ　
＋　Ｊ、　ｏｆ　Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９７９）９
３　：４０によシ最初に記載された方法によるポリクロ
ーナル抗ＶｎｌＲ−セファロースカラムを用いるイムノ
ソルベントクロマトグラフィー：及ヒ１））Ｄ、Ｅ、Ｇ
。

Ａｕｇｔｅｎ＋　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ、ｏｆ　Ｈｅｍｏ
ｔｏｌｏｇｙ　（１９７９）±３：６６９によシ最初に
記載されたアミノヘキシル置換アがロース上でのクロマ
トグラフ的分離によシ、市販の冷却沈澱標品からヒト−
ファクターｖｌＮＩＣを単離した。

この方法の詳細を次に記載する。

アトランティック・アンチビデイー（Ａｔｌａｎｔｉｃ
Ａ１ｔｉｂＯｄ７　）から得られたヤギ抗−ヒトファク
ターｖＢ関連抗原（Ｖｌｎ：Ｒ）血清（カットＡ　０４
０−０１）を、標準０−５０％硫酸アンモニウムカット
で処理し、次にＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラ
フィーにかけ、又は同様の０−３３％カットで処理し、
次にクロマトグラフィーな行わなかった。次にこれらの
物質をそれぞれＣＮＢｒ−活性化セファロースＣＬ２Ｂ
又は４Ｂ（ファルマシア、１７−０１４０−０１又は１
７−０４３０−０１）と接合せしめ、そしてカラムに注
入した（抗Ｖｌｌｌ：Ｒ−セファロースカラム）。

’ＨＥＭＯＦ　Ｉ　Ｌ”、すなわち正常なヒトの新鮮な
血漿から調製された濃縮形の抗血友病因子（ファクター
Ｖｌｌ、ＡＦＨ、ＡＨＧ　）の安定な乾燥標品（ファク
ター■Ｃについて約４０倍に濃縮されている）を、０．
０２Ｍイミダゾール、０．１５Ｍ　ＮａＣ６，０，１Ｍ
リジン−ＨＣＬ、０．０２％　ＮａＮ３を含むｐｉ−１
７，４の緩衝液に溶解した。

溶解した後、ＨＥＭＯＦ　Ｉ　Ｌを上記の抗ＶＩＩＩ：
Ｒ−４ファロースカラムに適用した。非特異的に結合し
た蛋白質を０．５　Ｍ　ＮｈＣｔに変性された上記の緩
衝液によりて溶出した。次に、ｏ、　３５　Ｍ　ＣａＣ
ｌ２を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクター■■
Ｃ活性を安定化する１０％グリセリンを添加して、ファ
クターｖＩｌｌＣを溶出した。イムノソルベントカラム
からの活性画分をプールし、緩衝液（０，０２Ｍイミダ
ゾ−ｋ　、　０．１５　Ｍ　ＮａＣＡ　、０．１　Ｍリ
ジン−ＨＣｌ−，０−０２５Ｍ　ＣａＣｌ２，０．０２
　％　ＮａＮｘ　、１０　％グリセリン、ｐＨ７，４）
に対して透析した。１，１００ユニツトのファクターＶ
Ｉ［ｌＣを含有する透析された両分のアリコートを、上
記の透析緩衝液で平衡化されたアミノヘキシル−セファ
ロース４Ｂカラム（ｌＸ６ｔＭ）に適用した。ファクタ
ーｖｍｃを０．３５　Ｍ　ＣａＣｌ２又は２　Ｍ　Ｎａ
Ｃｔを含有する同じ緩衝液で溶出した。５００ユニツト
／ａのファクターＶＩＩＩＣを含有する２ａの容積中に
活性が存在することが見出された。同様にして行った後
続の実験により、抗Ｖｌ［ｌ：Ｒカラムにおける２５％
引きの収量及びアミノへキシルカラムにおける約９０チ
引きの収量が得られた。上記の方法に代えて、イムノン
ルベントカラムから溶出され、プールされ、透析された
物質をまず、上記の透析緩衝溶で平衡化サレタデキスト
ランサルフェート（ファルマシア）カラムに適用し、そ
して同じ緩衝液によシ溶出する。若干の微量汚染物、例
えばフィブリノ−ダン、フィブロネクチン、ＩｇＧはカ
ラム上に保持され、ファクターｖＩ［ｌＣは流過液中に
現われる。との液を集め、そして前記のアミンヘキシル
−セファロースカラムに負荷する。

後続の測定によシ、精製されたファクターＶ［ｌＣ中に
両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原（ｃＡｇ）
活性が存在し、ＨＥＭＯＦＩＬ中の４０倍濃縮よシさら
に５，０００倍濃縮されていることが示された。

ゼネラル・ジアグノスティクス（ＧｅｎｅｒａｌＤｌａ
ｇｒ＋ｏｓｔｉｃｓ　）製の市販の標準的３成分キット
（ＡＰＴＴ、ファクターＶｌｌｌ欠損血漿、ベリファイ
・ノーマル・シトレー）　（Ｖｅｒｉｆｙ　Ｎａｒｍａ
ｌＣｉｔｒａｔｅ　）　、］を用いて凝固測定を行った
。ファクターｖＩＩＩＣの高レベルの生物学的活性が示
された。

使用する抗体は阻害患者から得た。コート抗体（ａｂ）
としての低力価（ＬＺ　）を有するものと、ラベルされ
るａｂとしての高力価を有するもの工ある。

２つの異るタイプの測定において抗体を使用した。

ＲＩＡ測定においてはＨ２ａ　ｂをＩ　でラベルし、Ｅ
ＬＩＳＡ測定においてはＨｚ　ａ　ｂをホースラディッ
シー・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接合せしめる。

ＲＩＡのための１２５Ｉによる抗体Ｈｚのラベル化はＨ
ｕｎｔｅｒ　Ｗ、　ＩｖＬ　Ｉ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ＋　ＷｅｉｒＤ、Ｍ編ｒ　Ｈａｎｄ　ｂｏ
ｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎ　ｏ
　１　ｏｇｙ　、第３版＋　Ｖｏｌ　１＋　Ｂｌａｃｋ
ｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｌｆｆｃ　ＰｕｂｌｌＣａ口ｏｎ
ｓ、オックスフォード、　１９７８に従って行った。Ｈ
ＲＰ−Ｈ２接合はＷｌｌｓｏｎ及びＮａｋａｎｅｐ　Ｉ
ｍｍｕｎＯｆｌｕｏｒ＋４ｃｅｎｓｅａｎｄ　Ｒｅ１ａ
ｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｅｈｎｉｑｕｅｓ＋　
Ｋｎｏｐｐ等編ｒ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ＋　Ｎｏｒｔｈ−
Ｈｏｌｌａｎｄ　ＢｉｏｍｅｄｉＣａｌＰｒｅｓｓ＋ア
ムステルダム、１９７８．２１５−２２４頁に従って行
った。ＬＺけ７００　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ニー”ット／
威の活性を有し、Ｈ２は１，５００　Ｂｅｔｈｅ＋＋ｄ
ａユニット／厩の活性を有していた。コート抗体（ＬＺ
）は、０．１　Ｍ　ＮａＨＣＯ５（ＰＨ９，８）中（Ｒ
ＩＡ）又は０．０５Ｍイミダゾール、　０．１　ＭＮａ
Ｃｔ、　０．０１　Ｍチメロサール、０．０５％トウィ
ーン２０，５％ＢＳＡ中（ＥＬＩＳＡ　）、あるいは両
方法のためにＰＢＳ−ＣＭＦ　（１７につき、２００ｍ
９ＫＣＡ、２００ｍ９ＫＩ（２ＰＯ４，８，０ｇＮａＣ
４，１，１！１１無水Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，４）中
に３．５μ９／ｍｌ　に溶解し、そしてｌｄを各チュー
ブ（ポリスチレン）に加え、そして室温にて一夜インキ
ュベートした。この溶液を吸引除去し、そしてチーープ
を０．０５％のトウィーン２０を含有する０、　１５　
Ｍ　ＮａＣＬ又はＰＢＳ−ＣＭＦ　３〜３．５ｍｌで３
回洗浄した。サンプル又は標準（ゼネラル・ディアグノ
ステイクス、ベリファイ・ノーマル・シトレート、カタ
ログ≠３４１１２）を稀釈し、セして全容量がチューブ
当シ０．９　ｍとなるようにチューブに加え、そして室
温にて一夜インキュベートする〔稀釈は、０．０２Ｍ　
Ｔｒｉｓ、　０．１５　ＭＮａＣｔ、　５　％　ＢＳＡ
、　０．０５　％トウィーン２０，０．０１％チメロザ
ール、ｐ１４６．５（ＲＩＡのため）中に；又は００５
Ｍイミダゾール。

０、１　Ｍ　ＮａＣｔ、　０．０１　％チメロサール、
０．０．５％トウィーン２０，５襲ＢＳＡ　（ＥＬＩＳ
Ａのため）中に；あるいはＰＢＳ　−ＣＭＦ　（両方法
のため）中に行った〕。

溶液を吸引除去し、そしてチューブを上記のようにして
洗浄した。ＲＩＡについては、６００μｌのＲＩＡ稀釈
緩衝液中ファクターｖＩＩＩＣに対する　Ｉ−ラベル抗
体（Ｈ２）　５Ｘ１０　ｃｐｒｎ　を各チーーブに加え
、このチューブを３７℃にて１６〜１８時間インキ−ベ
ートし、溶液を除去し、チーーブを上記のようにして洗
浄し、そしてガンマ−カウンターによシ計数した。ＥＬ
ＩＳＡについては、抗−フアクタ−ＶＩＣ（Ｉ（Ｚ）に
接合したパーオキシダーゼ０．９コを各チーーゾに加え
、次にこれを室温にて−夜インキュベートし、溶液を除
去し、そしてチューブを前記のようにして洗浄し、次に
０．９ｄのＯＰＤ溶液（ｌｏｏｒｎｔ；について、０．
３７ｇクエン酸。

１．１９．ｌｉ’燐酸二ナトリウム、０．１５ｇｏ−フ
ェニレンジアミン、ＰＩ−ｉ５．ｏ、使用直前に１０％
Ｈ２Ｏ２を２５０μ）添加）をカロえ、そして暗中、室
温にて３０分間インキュベートした。この反応を停止す
るために０．５　ｍｌの６　Ｎ　Ｙ、ＣＬ　（又は０．
９−のＩＭ■２Ｓ０４）を各チーーブに加え、そしてＯ
Ｄ４，２を読み取った。

■、　ファクターｖＩＩＩＣ複合体の構造Ａ、免疫沈澱
実験 次の条件：０．１％インシュリン（安定化のためのキャ
リヤー蛋白質として）　、０，２５　Ｍ　ＣＩＬＣｔ２
　。

０．０エチチオメロサール、０．０５Ｍイミダゾール。

ｐＨ７，２のもとで、精製されたファクターＶ［ｌＣ物
質についてＡｃＡ　４４カラムを用いてグル瀝過実験を
行った。溶出液のファクターｖＩｌ］Ｃ凝固活性及び抗
原活性を監視した。２つの抗原ピークが観察された。

ファクター７ｍＣ凝固活性を有するものはこれらの条件
下で約４６０，０００の見かげ分子量を有する複合体と
して挙動した（天然物）。他のピーク（凝固活性を喪失
している）は６７．０００よシわずかに低い観察された
分子量において溶出した。

標準的分析用Ｌａｅｍｍｌｉ　５ＤＳ−グル電気泳動［
Ｌｅａｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）２２７
　：６８０−６８５〕により分析した場合、２４０，１
６０゜１４０．１１５．９２，５．８０及び７７ｋｄの
種々の蛋白質様が得られた。これらの蛋白質とファクタ
ーＶＩｎＣとの関係を標準的免疫沈澱法によシ決定した
。この免疫沈澱法においては、遊離の　Ｉ−ラベルファ
クターＶＩＩＣから抗１ｇ　−Ａｂ複合体を分離するた
めに、アフィニティー精製された第２抗体（ヤギ抗−マ
ウスＩｇＧ又は抗−ヒ）　ＩｇＧ　）をコード口たポリ
スチレンビーズ（１／８インチ、プレシジョン・プラス
チック・ビール社（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａｓｔｉｃ
　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、　）　：）又はＳ、アウレウス（ｓ
、　ａｕｒｅｕ＋＋　）　彊白質Ａ−セファロースＣＬ
４Ｂを使用した。

アフィニティーカラムから溶出した蛋白質をヨウ素化し
、そしてファクター■ｌｌＩＣに特異的な抗体と反応せ
しめた。これらの抗体は血友病患者から単離されたヒト
阻害抗体であシ、抗−フアクタ−ＶｎｌＣ（Ｚ　）及び
（Ｅ）、又は阻害抗体（Ｚ）及び（Ｅ）と称される。

この結果は、両抗体が７７／８０ｋｄダブレツトと反応
することを示す。“Ｅ’抗体はさらに２４０ｋｄバンド
強く反応し、そしてダブレットと２４０ｋｄ　種との間
の複数のバンド（１６０，１４０，１１５，９２，５ｋ
ｄ）の弱い沈澱をもたらす。″ｚｎ抗体はまた９２．５
ｋｄ及び２４０ｋｄ蛋白質を沈澱せしめる。“Ｅ”抗体
と２４０　ｋｄ種との強い反応はこの種がファクターｖ
ＩＩＩＣの前駆体であることを示唆する。

抗体カラムで精製したファクターＶｍＣ画分をヨウ素化
し、セしてＥＧＴＡ　Ｃエチレングリコールビス〔β−
アミノエチルエーテル）　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’、−四酢
酸〕の存在下及び非存在下でヒト阻害抗体と反応せしめ
た。これは、ファクターＶＩＣポリペゾチドの会合にお
ける２価陽イオン、特にＣａ＋＋の役割の研究を可能に
する。阻害抗体（Ｅ）は７７／８０ｋｄ　ダブレット、
並びに１６０．１４０，１１５及び９２．５ｋｄの一層
分子量の高い種を沈澱せしめることが観察された。ダブ
レットは常に一層強いバンドの間に存在する。（この免
疫沈澱実験はポリスチレンビーズを用いて行った。この
方法は低〜１バックグラウンドをもたらし、ファクター
ＶＩＩＩＣ標品中のラベルされたＩｇＧは沈澱しない。

）ＥＧＴＡを含有させることによシ高分子量バンド（９
２，５〜１６０ｋｄ）は消失するが、ダブレットの沈澱
量は影響を受けない。イムノソルベントとしてセファロ
ースに結合した２抗体を使用して同様の実験を行った。

精製したファクターｖＩＩＩＣをカラムに適用し、そし
て７７／８０ｋｄを介して結合した後、ＥＤＴＡ　（エ
チレンジアミン四酢酸）により９２．５ｋｄポリペゾチ
ドが選択的に溶出する。この方法は９２．５ｋｄ種を分
画調製するために使用される。このイムノソルベントカ
ラム又はこれに類似するものはファクターｖｍＣに対す
るポリクローナル抗体を用いて調製される。ＥＧＴＡの
代りにチャオトロビック溶剤又は変性溶剤、例えばそれ
ぞれチオシアナート溶液又は尿素水溶液を用いて溶出す
る場合、ファクターｖＩｌｌＣはさらに精製される。

これらの結果は９２．５ｋｄペプチドがＣａ″橋を介し
て非共有結合的に７７／８０　ｋｄダブレットに会合し
ていることを示唆する。より分子量の高いバンド（１１
５ｋｄ、１４０ｋｄ、１６０ｋｄ　）はおそらく９２、
５　ｋｄの前駆体であろう。このことは、９２５ｋｄ　
ｙｊ？リペグテドに対するモノクローナル抗体の１１５
　ｋｄ、１４０　ｋｄ及び１６０ｋｄポリベゾチドと交
差反応する能力によシ示される。

アフィニティーカラムからの種々の蛋白質様の関係を、
Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｅｕｒ
。

Ｊ、　ｏｆ’　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９７５）６：５
１１）　の方法によって調製したモノクローナル抗体に
よる、ヨウ素化され、精製されたファクターＶ■Ｃの免
疫沈澱によシ示した。Ｂａ１ｂ／ｃマウスを液相免疫吸
着されたファクターｖｍＣにより免疫した。膵臓細胞（
１０８個）を１０１１　個のＮＳＯ又はＮＳＩマウス骨
髄腫細胞と融合させた。融合生成物を２枚の９６ウエル
ミクロタイタートレイにプレートした。膵臓細胞フィー
ダ一層を１０４細胞／ウエルで使用した。

コロニーは５日目から顕微鏡観察でき、セして上清液は
数日毎にＥＬＩＳＡ法により測定した。次の層を使用し
た。第１層：前記工における、ヘキシル−セファロース
４Ｂカラムから溶出したファクタ−７ｍＣ；第２層：ハ
イブリドーマ細胞上清液；第３層：ホースラディツシュ
・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ラベルしたヤギ抗−マ
ウスｒｇＧ　；第４層：　ＨＲＰ−基質。

モノクローナル抗体の幾つかのクラスが同定され、その
２つはファクターｖｍｃ凝固活性を阻害した。クラスＩ
抗体は８０／７７ｋａダブレツト及び２４０ｋｄｙｊ？
す梗グチドと反応し：そしてクラスＨ抗体は２４０．１
６０．１４０．１１５．９２．５ｋｄ　の蛋白質と反応
した。スロンビン消化したファクターＶ［ｌとクラスＩ
モノクローナル抗体との免疫沈澱は、生成した７０／６
７ｋｄダブレツトが７７、’ｓ　Ｏｋｄダブレットに由
来することを示す（下記参照のこと）。クラス用モノク
ローナル抗体は、１６０．１４０及び１１５　ｋｄ　ペ
プチドが９２．５ｋｄ　−ｅｆチドの前駆体であること
を示す。クラス■のモノクローナル抗体はさらに、精製
されたファクター７ｍＣ物質のスロンビン消化によシ生
成した４０ｋｄペゾチドとも反応する。

ファクター■■Ｃ複合体中のＣａ＋＋イオンの役割を研
究するため、ＥＧＴＡを用いて上記と同様の実験を行っ
た。この実験はモノクローナル抗体を用いて、次の層に
よるＥＬＩＳＡ法に基いて行った。第１層：単−特異性
抗（マウスＩｇＧ　）　：第２層二りラス■モノク　ロ
ーナル抗体（抗−９２，５ｋｄ）：第３層：精製ファク
ター■Ｃ物質；第４層ニア７７８０ｋｄ　に対するＨＲ
Ｐ−ヒト阻害抗体。ＥＧＴＡの添加により、キレート剤
を用いない対照に存在する結合ＨＲＰ活性が除去された
。それぞれ７７／８０　ｋｄダブレット及び９２．５　
ｋｄ蛋白質に向けられたクラス■及びクラスｍのモノク
ローナル抗体がそれぞれファクターＶ■Ｃ凝固活性に対
して阻害的である事実は、両者がファクターＶｌ［ｉＣ
複合体の本質的構成成分であることを示唆している。

Ｂ、　ファクターＶ■Ｃのスロンビンによる活性化アミ
ンヘキシル濃縮し、アフィニティーｆｆｆｆしたファク
ターＶ［ｌＣを、２種類の異る一条件（６，８及ヒフ、
４）を用いて、スロンビン〔ベーリン、ｆ　−（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　）　ｒロット≠１０７２３０２１によ
シ活性化した。

アリゴー１１凝固活性について測定し、そしてさらに、
サンプル（それぞれ約２．５ユニツト）をダル分析のた
めにＴＣＡ沈澱せしめた。第１の実験において、Ｖ［ｌ
Ｃ活性は最初４６ユニツト／ＩＬｌであった。これを、
ファクターｖＩＩＩＣ緩衝液（２０ｍＭイミダゾールｏ
ｐ１１６．８　、１５０ｍＭＮａＣＡ　、１００媚リジ
ン、　２５　ｍＭ　ＣａＣｌ２及び１０ＬＩＩグリセリ
ン）中に最終濃度１１．５ユニット／ｍｌに稀釈した。

スロンビンの最終濃度を０．１２ユニット／Ｍ（ｖｌ［
ＩＣの１００凝固ユニット当り約１ユニツトのスロンビ
ン）とした。この結果、凝固活性は約１８０ユニツト／
ｒｎｌに上昇しそして約４０ユニツト／ｄ（実質上出発
値）に低下し、これは９２，５ｋｄ　種の量の同様な増
加及び減少に伴って生じた。

従って、９２．５　ｋｄ種は活性なファクター■■Ｃ複
合体の部分であることが示唆される。

製造的方法においてスロンビン活性化を用いる目的で、
一層濃縮されたファクターｖｍｃ標品を用いて追加の実
験を行った。９２．５ｋｄポリペプチドを生成せしめる
ため、１ユニツトのスロンビン活性に対して約１０００
〜２０００凝固ユニツトのファクターｖｍｃの比率で、
スロンビンを精製ファクターＶ■Ｃ物質に加え、そして
短時間（ＦＥＭＯＦＩＬサンプルに依存して５〜１５分
間）のみ反応せしめた。次に、得られた生成物を７．５
％調製用ダルに適用し、そしてペプチドを電気泳動によ
部分離し、ダルバンドを切）出し、そして電気溶出した
。

スロンビン消化を短時間行う場合、９２．５ｋｄ種の量
は２倍又は３倍になり、同時に、７７／８０ｋｄダブレ
ツトは部分的にのみ６７／７０ｋａ種に転換される。６
７／７（Ｈｃａダブレットを単離するための条件を最適
にするためには、より長時間（１時間以上）のスロンビ
ン消化を行う。この場合、９２．５ｋｄ　種は、さらに
切断されてさらに小さい断片が生ずる。スロンビン処理
の後、２種類の新たなペプチドである５　２．５　ｋｄ
及び４０　ｋｄ−１！ゾチドが生ずる。４０　ｋｄ−１
！ゾチドは９２．５ｋｄ種に対するモノクローナル抗体
と反応し、従って切断生成物でなければならない。５２
．５ｋｄペゾチドも９２．５ｋｄ蛋白質に由来し、この
ことは、化学的及び酵素的切断パターンの比較によフ、
すなわち９２．５ｋｄ種及び５２．５　ｋｄ種をＣＮＢ
ｒ又はエンドプロテイナーゼｒ、ｙｓｃ切断にかけた場
合に多数の共通の断片が生ずる（　５ＤＳ−ＰＡＧＥに
よる）ことによ）証明される。

エンドデロテイナーゼｌｙｇ　Ｃ消化のため、１ｙｓＣ
と蛋白質との比率を約１：１〜１００、通常は１：１０
とする。この消化において、２０ｐモル（４，８μｇ）
のｌｙｓ　Ｃを、約１００μｌの０．０２５ＭＴｒｉ８
−ＨＣｌ−ｐＨ’７．’７　、０．００１　Ｍ　ＥＤＴ
Ａ　、　０．０８％ＳＤＳ中で２００ｐモル（１４μｇ
）の７０ｋｄポリペプチドと混合し、そして混合物を３
７℃にで６時間〜−夜インキユベートして消化を完結し
た。

ｌｙｓ　Ｃ消化生成物の単離のために、０ｒｓｔｓｎ　
＋３２１−３４９のネイティブ・ポリアクリルアミドダ
ルを使用した。

Ｃ，ダル単離した■Ｃ関連蛋白質のスロンビン消化 これらのペプチドの前駆体−生成物関係を確認するため
、調製用ＳＤＳダル電気泳動によシ多数のバンドを分離
し、電気溶出し、そしてスロンビン消化にかけた。結果
は次の通シであうた。

１、　２４０　ｋｄ蛋白質は１６０．１４０．１１５．
９２．５ｋｄ　を含む多数のバンドを生成するが、一層
小分子量のバンド、すなわち７７／８０　ｋｄ又は６７
／７０ｋｄダシレツトを生成しない。さらに、２４０　
ｋｄ断片を経時消化し、そしてダル電気泳動パターン、
凝固活性、及びファクターｖＩＩＩＣ抗原（Ｃａｇ）活
性について分析した。ダルパターンの結果は上記と同様
であシ、そしてＣａｇ活性又は凝固活性は実質上回収さ
れなかった。

２．１６０ｋｄ及び９２．５ｋｄダル分離ポリペゾチド
は、ダルから分離した後スロンビンの基質ではないよう
である。

３、スロンビンはダル分離された７７ｋｄ及び８０ｋｄ
種を、それぞれ６７ｋｄ及び７０　ｋｄの新たなポリペ
プチドに特異的に切断する。スロンビン処理の後、クラ
ス■のモノクローナル抗体は７７７８０　ｋｄダブレッ
トのみならず新たな６７及び７０　ｋｄ種も沈澱せしめ
る。

Ｄ、アミノ酸配列分析 調製用ＳＤＳ電気泳動によ）単離された６　７／７０ｋ
ｄペプチド、７７／８０ｋｄペゾチド、及び５２．５ｋ
ｄベゾチドについて、標準的方法によシ部分的アミノ酸
配列情報を得た。電気泳動分析は、アミノ酸配列の結果
と相まって、７７／８０　ｋｄ　、　６７／ＴＯｋｄ、
９２．５　ｋｄ及び５２．５ｋｄポリベゾチドが９５チ
以上、通常は９８％の純度で得られたことを示した。ダ
ル単離されたペプチドを気相蛋白質シーケンサ−〔アプ
ライド・ビオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　））に適用した。ＰＴＨ−アミノ酸をＨＰ
ＬＣカラム（ＩＢＭシアノ＋　２５　ｃｍ　）Ｋ適用し
、そして得られたクロマトグラムからアミノ酸配列を決
定した。

６７／７０　ｋｄダシレットのアミノ端（配列表Ｂ中棒
によシ示す）について次の配列が決定された。

１２３４５６７８９１０１１ ？　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ
　Ｈｌｓ、Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ｌ１ｅ１２　１３　１４　
１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ
　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ６７／７０　ｋｄ蛋
白質のＮ一端領域のアミノ酸配列によシ得られた情報を
用いて、ヒトーダノムライブラリーのスクリーニングに
使用するために次のオリゴヌクレオチドグローブを合成
した。Ｍ、　Ｓ。

Ｕｒｄｅａ等ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ（，１９８３）旦ニア４６１−７４
６５に記載されているホスホラミデート法を使用した。

グローブ１： （ｘ＝Ｇ、ｃ、Ａ、’ｒ） グローブ２： ＣＸ プローブ３： ＣＴＸ グローブ４： ３’　ＴＣＴ　ＧＴＡ　Ａ’ＩＹＩ；　ＡＡＡ　ＴＡＧ
　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＣＡＣＣＴＴＣＧ　Ｇ　ＧＧ　Ｃ ＴＣＴ　ＧＡＣＡＣＣＣＴＡ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＡＣ
５’ＣＧ 次に、各グローブが導びかれたアミノ酸配列の領域のス
キームを示す。

以下余白 後記のように９２．５　ｋｄ蛋白質に由来する５２．５
ｋｄ　蛋白質について、Ｎ一端の下記のアミノ酸配列が
決定された。

１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１Ａｈ
ａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｒｏ　Ｖａｔ ５２．５ｋｄペプチドのアミノ酸配列に基いて、次のヌ
クレオチド配列（コード配列）を有する部分変性プロー
ブを合成した。

５’　−ＧＣＡ　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＡＴ　Ｔ
ＡＴ　ＴＴＧ　ＧＧＧＡＧＧ　ＡＡ このグローブは、ゲノムライブラリー及びｃ　ＤＮＡラ
イブラリーの両者をスクリーニングするために有用であ
る。

７７／８０ｋｄダブレツトをエンドデロテイナーゼＬｙ
ｓ　Ｃ（ヘ９ンガーマンノ−イム）Ｋ！つテ消化するこ
とによシ得られた２種類のペプチドのアミン酸配列を決
定した。次のようにして消化を行った。

７７／８０ｋｄダブレツトをアクリルアミド蛋白質グル
上で電気泳動し、そしてダブレ、ットに対応するバンド
を電気溶出した。分離された物質を精製し、エンドゾロ
テイナーゼＬ７ｓＣによシ消化し、そして生成したペプ
チドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。２８０　ｎｍでの
吸光ピークに対応する両分を、自動シーケンサ−（アプ
ライド・ビオシステムス。

フォスターシティ−、カリホルニア、モデルＡ７ＯＡ　
）を用〜・て配列決定した。第１配列は次の通シであっ
た。

１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０１１１２Ｔ
ｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｉｎ　Ｖａ
ｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓこのアミ
ノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非コード配
列）を有する部分変性グローブを合成した。

３’−ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＧＡ　ＡＧＴ　ＧＴ
Ｔ　ＣＡＡ　ＡＡＣＡＡＣ銀−５′ＴＡ　ＴＴＴ 第２ペプチドは次の配列を有していた。

１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｖａｌ　Ｌｙｅこのアミノ酸配列に基いて、次のヌ
クレオチド配列（非コード配列）を有する部分変性プロ
ーブを合成した。

３’　−ＣＡＡ　ＴＧＡ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＴＧＡＴＴ
　ＴＴ さらに、７７／８０　ｋｄダブレットをトリプシンによ
シ消化した。ダブレット物質を、エンドプロテイナーゼ
ｒ、ｙｓｃによる消化について上記したのと同様にして
精製し、リジンをシトラコニル化（ｃｌｔｒａｃｏｎｙ
ｌａｔｉｏｎ　）によＱブロックしてアルギニンにおい
てのみ消化されるようにした。シトラコニル化け、蛋白
質を変性緩衝液に懸濁し、懸濁された蛋白質を還元しそ
してカルボキシメチル化し、そして−（を８．５〜９．
０に保持しながら無水シトラコン酸で処理した。シトラ
コニル化しり後、蛋白質をトリプシンで消化し、そして
生成したペプチドを逆相ＨＰＬＣによシ分離した。２８
０　ｎｍにおける吸光ピークに対応する画分を上記のよ
うにして配列決定した。配列を次に示す。

このアミノ酸配列に基いて、次のヌクレオチド配列（非
コード配列）を有する部分変性グローブを合成した。

８０及び７７ｋｄ種のＮ一端配列を決定するための方法
を実施した際、これらのアミン端がブロックされている
ことが見出された。従って、Ｎ一端配列は他の精製法に
よシ得られた物質から決定した。この精製法はイムノア
フィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマ
トグラフィーを含み、そして調製用５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドダル電気泳動を用いない。８０／７７　ｋｄダ
ブレットの精製を、ファクター■Ｃ濃縮物をモノクロー
ナル抗体カラムに適用し、次にｍｏｎｏ　Ｓ陽イオン交
換体でクロマトグラフ処理することによシ行った。

この物質はブロックされていないＮ一端を有し、ｒル炉
遇された８０／７７ｓｃｄ中に検出されるブロックはグ
ル電気泳動によシ生ずる人為的なものであることが示さ
れた。８０及び７７ｋｄ種について決定されたアミノ端
配列は次の通シである（配列表Ｂ中棒で示す）。

Ｅ、アミノ酸組成 ７７／８０ｋｄ’ゾチドのアミノ酸組成を、標準的方法
によシ、次のように決定した。

以下余白 アミノ酸　８０Ｋ　７７Ｋ Ａｓｐ　５８　５４ Ｇｌｕ　７４　７６ Ｃｙｓ　１２　１４ Ｓｅｒ　４７　４４ ｃｘｙ　５１　４６ Ｈ１ｓ　８　１２ Ａｒｇ　３２　２９ Ｔｈｒ　３５　２９ Ａｉｍ　３５　３３ Ｐｒｏ　３３　３０ Ｔｙｒ　２５　２５ Ｖａｌ　４６　４４ Ｍｅｔ　１７　１７ １１ｅ　３３　３５ Ｌｅｕ　４９　４８ Ｐｈｅ　３２　３１ Ｌｙｍ４７　４１ 合計アミノ酸数　６３４　６０８ 計算分子量　８２Ｋ　７９Ｋ Ｆ、　ヒト４Ｘゲノムライブラリーの調製０Ｍ１４１６
細胞（４コピーのＸ染色体を含有するヒト−リン・や芽
球様セルライン）の細胞培養物の溶解物から約３■のＤ
ＮＡを調製した。

このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ　３　Ａによシ部分消化し
、そして消化されたＤＮＡ　（４００〜５００μｇ）を
１０％〜４０チシーークロースグラジエント上で両分し
た。１０〜２５　ｋｂのサイズの範囲の両分をプールし
、Ｔ　ｒ　ｌ　５−ＥＤＴＡ中で透析し、そして５ｃｈ
ｌｉｅｃｈｅｒ及び５ａｈｅｕｌｌのＥｌｕｔｉｐ−ｄ
無菌ジスポーサブルカラムで精製した。このＤＮＡのア
リコートをＥＭＢＬ−４アーム（垣ＨＩ及び且畦工で消
化しそしてグラジェント上で単離することによ）得られ
る）に連結し、そして次にＩ　Ｘ　１０’ｐｆｕ／μＩ
のＤＮＡ挿入効率をもってバクテリオファージλに・母
ッケージした。使用したベクターＥＭＢＬ−４はバクテ
リオファージλの変形物である［　Ｋａｒｎ等、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ−（１９８３）１０１　：
３−１９を参照のこと〕。全ライブラリーは５Ｘ１０’
個のファージから成る。

Ｇ、　ヒト４Ｘダノムライブラリーのプレーティバクテ
リオファージをＥ、コリＩ）Ｐ２Ｏ株に吸着せしめ、そ
して２０枚のプレートにプレート（大きさ１５０Ｘ１５
＋ｍＲ）当Ｄ５０，０００ｐｆｕとしてシレーティング
し、合計Ｉ　Ｘｉ　Ｏ’　ｐｆｕとした。（プレート、
上層寒天、及びブレーティングの詳細な技法は、Ｔ、　
Ｍａｎ１ａｔｉｓ＋　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ
。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂ−ニュニトロセルロースフィル７−を
、ファーシフラークを有する各プレートの表面に２回適
用しくこうして）ＺッケージされていないＤＮＡの分子
をフィルターに移す）、そして３２ｐ−ラベルされた２
５６倍の４８マーグローブＤＮＡ　（ゾロ−ブナ４）と
ハイブリダイズせしめた。にトロセルロース移行法の詳
細はＭａｉｌａｔｌｓ等、前掲、に記載されている。）
前−ハイブリダイゼーション及びノ・イブリダイゼーシ
ョンはｗａ　１１　ｉ　ｃ　ｅ　ミックス（１１中に３
１０ｄの蒸留水、２００−の５０チデキストランサルフ
ェート、１８０ｄのＩ　Ｍ　Ｔｒ　ｌ　！１−ＨＣｔＩ
ＰＨ８，２、２２５Ｍの４ＭＮａＣｔ、　２０ｍ１ｌの
０．２５　ＭＥＤＴＡ　、　５０Ｍの１００　ＸＤｅｎ
ｈａｒｔ溶液、５ｍｌの１００−ＮＰ−４０、及び１０
ｎｊｌの１０チＳＤＳを含む）中で行った。

プローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを触媒とし
て用いて、γ−ＡＴＰ　３２から“各ＤＮＡ分子の５′
ホスフエート端に３２　ｐ０４を酵素的に移行せしめる
ことによシラペルした。ノ１イグリダイゼーションの条
件は次の通シとした。１０ｍ１Ｖのノ・イグリダイゼー
ション混合物／フィルターＸ５０００ｃｐｍのラベル化
プローブ÷４（変性）７ｍ１０ノ・イブリダイゼーショ
ンは３７℃にて一夜行った。フィルターを、６　Ｘ　Ｓ
ＳＣ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中、５０〜５５℃にて洗浄し
、空気乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴露した。

Ｈ０陽性クローンの特徴付は 第１回スクリーニングにおいて陽性であった２３個のゾ
ラークを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロ
ースに移し、そして新たにラベルしたブローシナ４とハ
イブリダイズせしめた（第２回）。１１個の陽性ゾラー
クを再プレートし、ファージＤＮＡをニトロセルロース
に移し、そして新たにラベルしたブロー２÷４とハイブ
リダイズせしめた（第３回）。８個の陽性ゾラークを分
離し、そしてＤＮＡを調製した（それぞれ１００ｄずつ
の液体培養）。これら８個のクローンのそれぞれに対応
するＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化しく挿入されたヒトーゲ
ノムＤＮＡをラムダベクターＤＮＡから遊離せしめるた
め）、そして生成した断片を０．８％アガロースダル上
での電気泳動によシサイズに従って分離し、変性し、そ
してニトロセルロースに移した。これを４通り行い、そ
して各フィルターを５２ｐ−ラベルブローブナ１．２．
３又は４とハイブリダイズせしめた。フィルターをＸ線
フィルムに暴露し、そして約４．４ｋｄ　サイズの単一
バンドが４種類のすべてのグローブとハイブリダイズす
ることが、２個のクローンについて見出された。

これら２個のクローンは、１方が他方に比べて大きなり
ＮＡ挿入部を有する点を除き同一であった（１５．２１
ｋｂの大挿入部を有するクローンを２３Ｄと称し、約１
３ｋｂの小挿入部を有するクローンを１１と称する）。

４．４ｋｂのグル単離されたＥｃｏ　ＲＩ断片をベクタ
ーＭ１３及びｐ　ＵＣ−９（ｐＢＲ３２２の誘導体）中
にサブクローン化した。

プライマーとして合成グローブ＋３及びその逆相補体を
用いてＭ　１　Ｂ　ＤＮＡ上でジデオキシ法によシＤＮ
Ａ配列の決定を行った。

４．４ｋｂ断片の部分配列を次のように決定した。

この配列は（）で示すプローブ≠４の配列、及び〔〕で
示すはじめに決定された６７／７０ｋｄ断片の部分アミ
ノ酸配列を含む。

以下余白 ＥＣ！Ｉ　＋：Ｉ＜　口Ｃ！１１　、ｄｌ−４もト　臣
〇−＜−＜　−■　−Ｑ　・−く　ΦＥ −〇　聞０　聞■　ｄｏ　−〇　−〇 ：Ｉｌ−＋　−Ｅ−１ロト　Φト　。クートΦ９５１ト
　φ＜　−Ｅ−＋　ｂｏ　−〇−’　”：’　”＜　−
＜’　ＱＪＪ　ａｌＱ玉　＝ご　：１　；に　北　】に −＜ｌｌ１−　聞０　１９　１Ｅ−１ｏ、Ｅ−崎臼　ｗ
　＜ＤＩＥ−１ｈ　ＥＳ　ｋ　ｏ　−〇淵Ｃ’　−Ｆ’
　１１１＜　％　＜　ｏ　Ｃり　６４０ｍ＜　−＜　ａ
ｅＱ　４ＪＦ−１■く　φ日！１　＝１　スミ　北　：
謔　薫　〜ご−＜（社）〇　−＜　ａｌＱ、’　ｂＢ５
　ａｌ＜　Ｏ←臣０　−ト　φ（ｊ　ｅ（Ｊ　−Φ　り
く　−ツ０ΦＥ−１”　＜　＞　＜　ｂ　ＩＪ　楯Ｅ　
Φト　−ΦトーＥ−＋　ａｔ　Ｃ！１１　＝　＜Ｏｓ　
ＣＪ　＞　Ｃり　−〇　ヘート０″ｏ　ｌ＋＜　Ｑ′Ｑ
　ｂｌＪ　０ａａ（、−Ｅｓ　０ＯＱへ１１１−　ΦＱ
ｌｊ’）Φト　Φ０　■、○　−−−〇←Ｆ−１トＱｅ
’ｌｐ＋＋ｌ；（田ｊ　、−１１１１Ｑ　＞Ｃｊ　へ−
〇従って、このクローンは７７／８０ｋｄダブレツト蛋
白質の遺伝子に対応し、そしてこの蛋白質は前記のごと
くヒトーファクターＶＩＣ複合体に部分的に対応する。

クローン２３ＤをＥｃｏＲＩ断片としてファージＭ１３
中にサブクローン化し、そして挿入されたヒ）　ＤＮＡ
に対応する配列を決定した。クローン２３Ｄの完全な１
５．１２１ｋｂ配列を第１表（配列表Ａ）に示す。サブ
クローンの名称が配列の右側の欄外に示されており、３
′一方向に伸びるＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩを示してい
るｏ３．１１０ｋｂのオープンリーディングフレームが
７０−３断片の３′−末端から４．４ｋｂ断片の中間に
わたって存在することが見出された。従って、このオー
プンリーディングフレームは７７／８０　ｋｂダブレッ
ト蛋白質のコード領域の少なくとも部分を含む。

■、ゲノムＤＮＡとｃ　ＤＮＡの比較 ３個のｃＤＮＡクローンを次のようにして得た。

クローンＣ１は、ヒト肝臓ｃＤＮＡ　ライブラリーをク
ローン２３Ｄの４．４　ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　断片から
構成したプローブでスクリーニングすることにょシ得た
。クローンＣ２もまた、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー
を４．４ｋｂｆローブでスクリーニングすることによシ
得た。クローン２−１１は、ヒト腎臓Ｈ胞をクローン２
３Ｄのオープンリーディングフレームの３′−末端に見
出されるＤＮＡ配列（配列表Ａのヌクレオチド９３９１
〜９４３５　）に基く合成４５−マープローブでスクリ
ーニングすることによって得た。このプローブは次の非
コード鎖の配り１ｊから成る。

非コード鎖（グローブ）・・・ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ５’−ＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴ　
ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ３’−ＴＣＧ　ＧＧＧ　ＧＣＧ
　ＴＣＧ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴＴｈｒ　Ａ
ｒｇ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　ＡｌａＡＣＡ
　ＣＧＡ　ＣＡＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＧＣＴ−３
’ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＴＡＡ　
ＣＧＡ−５’クローンを配列決定し、そしてクローン２
３ＤＯゲノムＤＮＡに対するこれらｃＤＮＡクローンの
位置を、配列を比較することによって決定した。

３０４　ｂｐの長さを有するクローンＣ１は配列表Ａ中
の番号におけるヌクレオチド７７７３がら８ｏ７７まで
のオープンリーディングフレームに重なる。

ｓ’ｙｓｂｐの長さを有するクローンＣ２はオープンリ
ーディングフレームの３′一端と部分的に重シ、ヌクレ
オチド９５３８から始まりそしてオープンリーディング
フレーム３′一端にあるヌクレオチド９４９７を越えて
伸びる。５７２ｂｐの長さを有するクローン２−１１も
オープンリーディングフレームの３′一端と重なシ、ヌ
クレオチド９１９ｏがら始まりそしてその末端を越えて
伸びる。これらの知見はオープンリーディングフレーム
が転写されることを確認するものである。

４．４ｋｂオープンリーデイングラレームからのコード
情報をクローン２−１１及びＣ２からの追加のコード情
報と組合わせて、配列表Ｂに示すすべてのコード配列に
対応する３、８４１ｋｂの配列を調製しそして伸ばすこ
とができる。Ｃ１，Ｃ２，及びＣ２−１１７’ロープに
対応する領域を枠で囲んである。

ファクター■■Ｃを製造するために、クローン器又はク
ローン１１からのＤＮＡ配列を、Ｌａｕｂ等。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９８３）±８：２７１に
ょシ記載されているように５Ｖ−４０プロモーターに挿
入して５Ｖ−４０初期グロモーターの制御のもとにおく
。

得られた組換シラスミドをＣＯＳ細胞（Ｇｕｚｍａｎ　
＋前掲）にトランスフェクトする。この方法に代えテ、
コード配列を、Ｍａｌｏｎｅｙネズミサルコーマウイル
スの長ターミナルレピートが挿入されているｐＢＲ３２
２のごときプラスミドに挿入し、クローン２３又は１１
の配列をウィルス性制御系の転写制御のもとにおくこと
ができる。次に、構成物を３Ｔ３マウス線維芽球に導入
して効率的に発現せしめることができる（　Ｐｅｒｋｉ
ｎｓ等＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｏ１１ｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　１９８３年７月りＶｏ１３　、
Ａ６．１１２３頁を参照のこと）。

上記の結果は、ファクターＶ［ｌＣ複合体のサブユニッ
トをコードするゲノムＤＮＡが単離されたことを示す。

このゲノムＤＮＡを使用することによ）、ＤＮＡをさら
に操作してファクター■■Ｃ複合体サブユニットをコー
ドする配列を得ることができる。

次に、このＤＮＡを発現ベクター中で使用し、ファクタ
ーＶＩ［ｌＣサブユニットを製造することができ、これ
を種々の方法で、例えば診断測定のための試薬として、
療法剤として、モノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体の製造のために使用することができ、これらの抗体
は次にファクターｖｍｃ複合体の製造のため、又は他の
目的のために使用することができる。ゲノムＤＮＡ配列
はまた、ブローファクターｖｍＣをコードするｍＲＮＡ
の単離のために使用して、前駆体蛋白質を得ることがで
きる。

次にこの蛋白質は生体内グロセシングのために用いるこ
とができる。

この発明の方法は、６７／７０　ｋｄダブレットをコー
ドする配列の５′一端に又はそれに隣接している特異的
配列を含むＤＮＡ配列を提供した。この特異的配列はま
た、７７／８０ｋｄダブレツトのコード配列中５′一端
から約２００〜４００塩基、さらに正確には約２７５〜
３２５塩基下流に存在する。

なお、１４．４３ｋｂμ乏Ｒ工断片を含有するバクテリ
オファージλＦＶＩ［１２３Ｄば１９８４年１月４日に
Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，に、Ａ４００９４として寄託され
た。

以下余白 手続補正書（方式） 昭和６０年２月２３日 特許庁長官芯　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願　第００２２６９号 ２、発明の名称 ファクターＶｌ）Ｏ組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称チロン　コーポレイション　（外１名）４、代理人 ６８　補正の対象 （１〉　願書の「出願人の代表者」の欄（２）委任状 （３）明細書 Ｚ　補正の内容 （１）（２）別紙の通り （３）　明細書の浄書（内容に変更なし）８、添付書類
の目録 （１）訂正願書　１通 （２）委任状及び訳文　各２通 （３）浄書明細書　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　９２．５ｋｄ蛋白質とカルシウム架橋された８　
   ０　ｋｄ及び７７　ｋｄ蛋白質の複合体を含み、ファク
   ター■Ｃの生物学的活性を有し、そして他の蛋白質を実
   質上含有しない蛋白質組成物。 ２、約６７〜８０　ｋｄの１〜２個のポリペプチドを主
   として含んで成シ、該ポリペプチドのＮ一端側の半分に
   次のアミノ酸配列： Ｐｈｅ　−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈ　ｒ−
   Ａｒｇ−Ｈｉ　５−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉ　１　ｅ−Ａｌ
   　ａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒ
   ｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔを含み、そしてフ
   ァクターｖＩ［ＩＣの生物学的活性を有するヒト蛋白質
   組成物。 ３、約９２．５ｋｄのポリペプチドを主として含んで成
   り、該ポリペプチドのＮ一端側の半分に次のアミノ酸配
   列： 以下余白 Ａｌ　ａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ
   −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｔ　ａ−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｕ　−
   Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇ
   ｌｎ−８ｅｒ−Ａｓｐ−？　−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
   −Ｐｒｏ−Ｖａｌ を含有し、そしてファクターＶ［ｌＣの生物学的活性を
   有するヒト蛋白質組成物。 ４、特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質組成物を含ん
   で成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。 ５、特許請求の範囲第２項に記載の蛋白質組成物を含ん
   で成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。 ６、特許請求の範囲第３項に記載の蛋白質組成物を含ん
   で成る免疫原を用いて調製されたモノクローナル抗体。 ７、次の式： ％式％ で表わされる複合プローブ。 ８、　ファクターｖＩｌｌＣの少なくとも部分をコード
   する天然のポリヌクレオチド配列の存在を検出する方法
   であって、 単鎖形の天然ポリヌクレオチドを特許請求の範囲第７項
   に記載のプローブとノ・イブリダイズし；そして 該グローブとデュプレックスを形成したポリヌクレオチ
   ドを単離する； ことを含んで成る方法。 ９　前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである特許請求の範
   囲第８項記載の方法。 １０　前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １１、全体にわたってオープンリーディングフレームを
   有し、そしてヒト−ファクターＶＩＣ又はその前駆体の
   少なくとも部分をコードする約２００））９以上のＤＮ
   Ａ配列。 １２、実験例に記載したＤＮＡ配列を含有する特許請求
   の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列。 １３、ヒト−ファクターｖｍＣのサブユニットをコード
   するＤＮＡ配列。 １４、ファクターｖｍｃの８０　ｋｄベゾチドを特徴と
   する特許請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列。 １５、ファクターＶＩＩＩＣの７７ｋｄ−＜ゾチドを特
   徴とする特許請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列。 １６、培養において増殖することができる宿主細胞と適
   合性の複製系、及びヒト−ファクター■Ｃ又はその前駆
   体の少なくとも部分をコードする約２００　ｂｐ以上の
   ＤＮＡ配列を含有する染色体外要素。 １７、前記ＤＮＡ配列がファクター■Ｃの８０ｋｄペゾ
   チドを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の染色体
   外要素。 １８　前記ＤＮＡ配列が７７クターｖＩＩＩＣノア７ｋ
   ｄヘゾチドを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載の
   染色体外要素。 １９、前記ＤＮＡ配列の発現のために該ＤＮＡ配列に並
   置された、前記宿主と適合性の転写及び翻訳制御シグナ
   ルを含有する特許請求の範囲第１６項記載の染色体外要
   素。 ２０、前記宿主が単細胞微生物である特許請求の範囲第
   １６項記載の染色体外要素。 ２１、前記宿主が補乳動物細胞である特許請求の範囲第
   １６項記載の染色体外要素。 ２２　ファクターｖｍＣの少なくとも部分をコードし、
   そして特許請求の範囲第７項記載のグローブとハイブリ
   ダイズする、咄乳動物ダノム由来の約１０〜２５　ｋｂ
   ｐのＤＮＡ配列。 ２３、単細胞微生物クローニングベクターと連結された
   特許請求の範囲第２２項記載のＤＮＡ配列を含んで成る
   ＤＮＡ構成物。