JPH02142494A - 抗ウロキナーゼモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、いわゆるＧＦＤ領域（増殖因子ドメイン様ア
ミノ酸配列）、すなわち、表皮増殖因子上に見いだされ
るものに類似するアミノ酸配列、に相当するヒトウロキ
ナーゼ上のエピトープに向けられた、新規なＩｇＧ、モ
ノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗
体の主な特徴は、ウロキナーゼの他のエピトープに結合
しないで、とくに酵素のその基質への結合を妨害しない
で、こうしてウロキナーゼの特異的酵素的活性を妨害し
ないで、前記エピトープに選択的結合するという事実に
ある。

本発明は、また、本発明のモノクローナル抗体を調製す
る方法ならびにそれらを使用する分析アッセイおよび精
製手順を包含する。

ヒトウロキナーゼは、ヒトの治療において、とくに心筋
梗塞、血栓および塞栓の状態の処置において使用される
、既知のプラスノゲンアクチベーター（ＰＡ）である。

それは約５４．０００のセリンプロテアーゼであり、軽
！（Ａ鎖、見掛けの分子量２０．０００）および重鎮（
Ｂ鎖、見掛けの分子量３０．０００）から成り、これは
しばしば頭文字語ＵＫまたはｔｃｕＰＡで識別される。

プロウロキナーゼと命名される、ウロキナーゼの自然前
駆体は、しばしば頭文字ｒｓｃｕＰＡＪにより表される
、−本領タンパク質であるということにおいて、それと
構造的に異なる。プロウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ）はウ
ロキナーゼ（ｔｃｕＰＡ）中にプラスミンにより移され
る。５ｃｕＰＡは、副作用を減少できるので、高い治療
的潜在性を有すると信じられる。

一般に、ウロキナーゼは生物学的源、例えば、ヒト尿か
ら生成されるが、またそれを生成する遺伝子工学の方法
は記載されている（例えば、欧州特許出願第９２１８２
号１） ウロキナーゼのタンパク質加水分解断片の分離および特
徴づけは、ストラベル（Ｓｔｏｐｐｅｌｌ）Ｍ、Ｐ、ら
、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃ
ａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ。

１９８５．８２．４９３９−４９４３に記載されている
。前記断片はＡＴＦ　（アミン末端断片）と呼ばれる。

それはヒトウロキナーゼのアミノ１１からアミノ酸１３
５にまたがり、プラスノゲンアクチベーターに要求され
ず、そして多くの表面の受容体、例えば、内皮のそれら
にに対して高い親和性を有する。

モノクローナル抗体のいくつかのクラスは記載されてき
ている。Ｃ，ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）および
Ｇ、ケーラー（Ｋ５ｈ　Ｉ　ｅ　ｒ）のパイオニア−の
研究は、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５
−４９７　（１９７５）に記載されている。

異なる選択性をもってウロキナーゼ／プロウロキナーゼ
に結合できる、抗ウロキナーゼモノクローナル抗体は、
例えば、次の参考文献に記載されている：ベルギー国特
許第８９６２５３号、バイオサイエンス・リポート（Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐｏｒｔ）３．３７３−３７９
　（１９８３）、Ｔｈｏｒｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、
４９．２４−２７　（１９８３）、欧州特許出願第８４
３４４号、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、１９８４．８１１１０−
１１４および１９８２．７９．３７２０−３７２３、バ
イオケミストリー（Ｂｌｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）
、２１．６４１０−６４１５（１９８２）および欧州特
許出願第１２２９６９号。

しかしながら、上の刊行物のいずれも、表皮増殖因子の
それに類似する配列（ＧＦＤ領域）を有するウロキナー
ゼまたはプロウロキナーゼに選択的結合することができ
るモノクローナル抗体またはこのようなモノクローナル
抗体を調製または分離する方法を記載していない。

本発明のモノクローナル抗体は、Ｇクラスの免疫グロブ
リン、好ましくはＧｌであり、これは表皮増殖因子のそ
れに類似する配列を有し、それに密接するエピトープ、
例えば、「クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）Ｊ　　（参照
、第１図）に結合しないで、そしてウロキナーゼの酵素
的活性またはプロウロキナーゼの酵素的活性化を妨害し
ないで、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼに選択的
に結合することができる。そのうえ、本発明のモノクロ
ーナル抗体は他の尿または血液のエンドペプチダーゼと
交差反応しない。

それらの性質をかんがみて、本発明のモノクローナル抗
体はウロキナーゼ、プロウロキナーゼまたはＧＦＤ領域
を有するそれらの断片または誘導体の精製において使用
することができる。

そのうえ、それらは、変更したＧＦＤ領域を有するウロ
キナーゼまたはプロウロキナーゼ誘導体を検出するアッ
セイ系において使用することができる。なぜなら、前記
誘導体は、本発明のモノクローナル抗体と結合しないか
らである。この場合において、ＧＦＤ以外の部位におけ
る抗原と結合するモノクローナル抗体を使用する平行ア
ッセイを実施することによって、変更したＧＦＤ領域を
有する突然変異を同定することができる。

本発明のモノクローナル抗体の他の可能な使用は、ウロ
キナーゼまたはプロウロキナーゼを使用するフンジャク
チブ（ｃｏｎｊｕｃｔｉｖｅ）治療においてである。事
実、内皮のものを包含する、ウロキナーゼの細胞表面受
容体に対するこれらのモノクローナル抗体の親和性が与
えられると、ウロキナーゼａｄｏ　ｒプロウロキナーゼ
のコンジャクチプ投与は、血液クロス（（ｌｏｔｈ）の
付近以外の部位におけるプラスノゲシのウロキナーゼ仲
介活性化のために副作用を減少させ、ならびに治療効果
に要求されるウロキナーゼおよび／またはプロウロキナ
ーゼの投与量を減少さることができる。

本発明の抗体の他の使用は、この開示およびこの分野に
おける普通の知識に基づいて当業者により容易に見いだ
され、そしてこの説明および特許請求の範囲の範囲によ
り包含されると考えられる。

簡潔のため、本発明のモノクローナル抗体は、また、「
抗ＧＦＤ抗体」とよび、こうしてそれらの最も関連する
特徴、すなわち、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼ
のＧＦＤ領域のエピトープに選択的に結合するＰｒｏを
呼ぶ。

本発明のモノクローナル抗体は、Ｃ，ミルスティン（Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ）およびＧ、ケーラー（Ｋｏｈ　ｌ　ｅ
　ｒ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７５．２
５６．４９５−４９７に記載されている、体細胞のハイ
ブリダイゼーション技術により生成される。

簡単にのべると、抗原で免疫化した動物からの脾細胞を
、一般に融合促進剤の存在下に、安定化した細胞系、例
えば、！１ｉＷＩ細胞系、例えば、骨髄Ｉｌ！＃ｌ胞系
と「融合」させる。使用する動物は、−般に、小さい哺
乳動物、好ましくは薩歯類、とくにマウスまたはラット
である。

本発明の方法において便利に使用することができる、既
知の商業的に入手可能な多数の安定化された細胞系が存
在する。

これらの細胞系のあるものは、また、国際的に認識され
た受託績、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙ
ｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏｔｌｅｃｔｉｏｎ、１
２３０１　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　
　２０８５２）に受託されている。前記受託された培養
物の１例は、「非分泌性」ネズミ骨髄ＷＰＳ／ＮＳ　ｌ
／１−Ａｇ４−１、ＡＴＣＣＮｏ、ＴＩＢ　　１８であ
る。細胞の融合は、一般に、促進剤、例えば、センダイ
（Ｓｅｎｄａｉ）ウィルスまたはポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ１５００または６０００）の存在下に実施す
る。対抗抗原は、一般に、所望の抗体を生成する脾細胞
を得る可能性を最大とするために、高度に精製され、そ
してウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ＡＴＦまたはそ
れらの混合物から選択される。本発明のモノクローナル
抗体を識別するハイブリドーマの選択は、好ましくは、
２段階の手順により実施する。

第１工程において、ウロキナーゼ／プロウロキナーゼま
たはＡＴＦに結合するモノクローナル抗体を、便利には
ＥＬＩＳＡ法により、ウロキナーゼ／プロウロキナーゼ
またはＡＴＦを有する親和性マトリックスを使用するこ
とにより選択する。

次いで、陽性のクローンは、一般に、イムノブロッティ
ングアッセイで、ウロキナーゼのＧＦＤ領域に相当する
（その関連する部分またはそれを含む部分である）ペプ
チド配列の存在下にアッセイする。これらのＰＡＧＥ電
気泳動配列の例は、Ｆ６の命名されるウロキナーゼ断片
により表され、この断片は約６０００の見掛けの分子量
を有し、そしてほぼロイシン４からグルタミン酸４３に
またがり、こうしてＧＦＤ領域を包含するか、あるいは
関連する部分を包含するヒトウロキナーゼ配列に相当す
る。有用に使用されうろこのタイプの他の配列は、この
分野において知られている遺伝子工学により、前述のペ
プチド配列の知識に基づいて得ることができ、そしてそ
れらの突然変異および部分的欠失または挿入生成物を包
含する。すべてのこれらの配列は、また、「ＧＦＤ様配
列」の呼ぶ。これらの配列は、前述のウロキナーゼ配列
の同一の免疫学的性質、すなわち、ウロキナーゼＧＦＤ
領域上のエピトープに向けられた抗体に選択的結合する
能力を示す。

その上澄み液がＧＦＤ様配列（上に定義した）およびウ
ロキナーゼＢよび／またはプロウロキナーゼと反応する
ハイブリドーマを、さらにクロニングし、そして塊状（
ｍａ　ｓ　ｓ）培養して、本発明のモノクローナル抗体
を生成し、次いでこれを純粋な形態で通常のクロマトグ
ラフィー技術により分離する。

ウロキナーゼ／プロウロキナーゼの断片Ｆ６（例えば、
断片Ｂ１１またはＢ１□）は、グルタミン酸残基に隣接
してタンパク質配列を切断できる酵素、例えば、商業的
に入手可能な、グロテアーゼ■８から誘導されたスタフ
ィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）の存在下に、ウロキナーゼ／プ
ロウロキナーゼまたはＡＴＦ　（Ｂ、、またはＦ１２の
場合において）のコントロールした処理により得られる
。適切な反応条件下に、事実、この酵素はアミノ酸配列
のペプチド結合を、グルタミン酸の残基のカルボキシ末
端に隣接して切断する。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１、 本発明の抗ＧＦＤモノクローナル抗体の調製（ＤＣ１、
ＣＤ　　６） ａ）抗ウロキナーゼモノクローナル抗体の生成高度に精
製した５４，０００ダルトンのウロキナーゼ１２０，０
ＯＯＩＵ／ｍｇ　（ＰＥＲ５ＰＬＶＲＬｅｐｅｔｉｔ）
（または本質的に純粋なプロウロキナーゼまたはＡＴＦ
）を使用して、生後７週の雌のＢａ１ｂ／Ｃマウスを免
疫化する。

完全７０インドアジユバント中の１０マイクログラムの
このウロキナーゼを、融合前６０日に動物の腹膜中に注
射する。

他のＩＯマイクログラムのウロキナーゼを、３０日後に
マウスに与える。次いで、融合前の日に、抗ウロキナー
ゼ抗体力価を尾の静脈から取った血液試料中で普通のＥ
ＬＩＳＡ法により測定し、そして融合の５日前に、ｌＯ
マイクログラムのウロキナーゼの最後のブースターを、
１：１０．０００より高い抗体力価を有する動物のみに
皮肉に与える。次いで、肺臓を融合の日に取り出し、そ
して肺細胞（約１ＸＩＯ８）を５０％のＰＥＧ６０００
中で、約５ＸＩＯ’のマウス骨髄腫ＮＳＯ細胞（Ｐ３／
ＮＳＩ／ＩＡｇ　　４．１のサプライン（ｓｕｂｌｉｎ
ｅ）、ＡＴＣＣＮｏ、ＴｌＢ１８）と融合する。

Ｃ，ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）およびＧ、ケー
ラー（Ｋ６ｈ　Ｉ　ｅ　ｒ）の方法に従って実施した融
合後、細胞を１０％の胎児仔つン血清（Ｆｅ２）を補充
したダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨ
ＡＴ培地（０，１ミリモルのハイポキサンチン、０．２
５ミリモルのアミノプテリン、０．０１７ミリモルのチ
ミジン、ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）中に再
懸濁し）そしてえマウスマクロファージを含有する５つ
の異なるコスタ−平板上に配置した（フィーダー層）。

ＨＡＴ培地を３日ごとに交換し、上澄み液の試料を集め
、そして下に報告するアッセイ（参照、点すおよびＣ）
において試験して、それらが結合するウロキナーゼのエ
ピトープを同定する。

本発明の抗体の特徴を有する抗体を生成するハイブリド
ーマ（本質的に：ウロキナーゼ／プロウロキナーゼのＧ
ＦＤ領域に結合する能力）を分離し、制限希釈条件下に
クローニングし、塊状培養し、そしてブリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンチルデカン；Ｏ−５
ｍｆｆ）で前置て処置したＢａ１ｂ／Ｃマウス中に腹腔
内注射した。腹水を処置倹約１５日に集めた。これらの
腹水中のモノクローナル抗体の濃度は一般に５〜２０ｍ
ｇ／ｍ１２である。

ｂ）ＥＬＩＳＡにより抗ウロキナーゼモノクローナル抗
体生成性ハイブリドーマについてのスクリーニング パールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　　８、８７３　　（１９７１））の修
正法に従い、柔軟な９６ウエルのマイクロタイタープレ
ート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、リン酸塩緩衝生理的塩類
溶液ｐＨ７，２（０，５モルのＮａＣＩを含有するリン
酸塩ｐＨ７，２）中の５０μｇ／ウェルの２０μｇ　／
　ｍ　Ｑの溶液で被覆し、そして室温において１時間イ
ンキュベーションした。０．０５％のツイーン２０を含
有するリン酸塩緩衝生理的塩類溶液でよく洗浄した後、
ウェルをリン酸塩緩衝生理的塩類溶液中の３％のウシ血
清アルブミンで、３時間室温において処理して、存在し
うる非特異的部位を飽和する。

注意して洗浄後、５０μＱのハイブリドーマ培養物の上
澄み液（または同体積の腹水）をウェルに添加し、そし
て室温において２時間反応させる。

次いで、プレートを洗浄し、そしてホースラディシュペ
ルオキシダーゼと接合したウサギ抗マウスＩ　ｇ　（Ｐ
　１６１．　ＤＡＫＯ）の１　：　１００００希釈物と
、室温において９０分間インキュベーションする。よく
洗浄した後、プレートを２００μＱ／ウエルの０．１モ
ルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ６中の発色体０−フェニルエ
チレンジアミン（ＳＩＧＭＡ）の１ｍｇ／ｍＱ溶液と１
．７ミリモルのＨ３Ｏ２インキユベーシヨンする。色は
２０分で発生し、そして光学密度を４９２ｎｍにおいて
抗原または抗体を含まないブランクに対して読む。ブラ
ンクより４倍高い色レベルをもつウェルを陽性と考慮す
る。

Ｃ）抗ＧＦＤモノクローナル抗体についてのイムノブロ
ッティングアッセイおよびそれらのエピトープの特徴づ
け 上のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいて陽性のクローン（
参照、実施例１）を、イムノプロッティングアッセイ（
ウェスタン・プロット）により、５ｃｕＰＡ、ｔ　ｃｕ
ＰＡ、ＡＴＦおよびｕＰａ断片Ｆ１２％ＢｌｌおよびＦ
ｉ（これらは下に報告する調製において記載するように
得られる）の存在下にさらに分析する。これらの参照化
合物は平行に５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２０％のアクリルア
ミド；下を参照）中で展開し、次いでニトロセルロース
膜上にブロッティングし、これをＢＳＡ（リン酸塩緩衝
液中の３％）で１時間処理し、そしてモノクローナル抗
体を試料に暴露する（腹水、細胞培養物の上澄み液また
はそれらの部分的に精製した調製物）。

すすいだ後、上の断片に特異的に結合する抗体を、ホー
スラディシュベルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス抗体
により現す。発色体（３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール）を添加し、そして室温において２時間インキュベ
ーションすることによって、発生した色を比色計で測定
する。

この実験において、本発明のモノクローナル抗体はｔｃ
ｕＰＡ、５ｃｕＰＡ％ＡＴＦおよびＦ。

に結合するが、Ｆ１□およびＢｌｌに結合しない。これ
らの特徴をもつ抗体を分泌するハイブリドーマを分離し
、そしてａ）に記載するように再クローニングし、そし
てそれらの上澄み液／腹水を下に記載するように精製す
る。

ｄ）セファローズ−ウロキナーゼの親和クロマトグラフ
ィーによる抗ウロキナーゼモノクローナル抗体の精製 セファローズ−ウロキナーゼ接合体を、ＣＮＢｒ活性化
セファローズ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、好まし
くは高度に精製された形態（１２０゜０００ＩＵ／ｍｇ
）の、高分子量のウロキナーゼと反応させることによっ
て調製する。カップリング効率は、約２０ｍｇのウロキ
ナーゼ７ｍ（ｌの膨潤ゲルである。次いで、上のように
して得られた腹水を、０．１５モルのＮａＣＩを含有す
る０゜０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３中
で予備平衡化した、セファローズ−ウロキナーゼ親和カ
ラム（１−６ｃｍＸ１５ｃｍ）に適用する。

同一緩衝液で洗浄した後、選択的に吸着した抗ウロキナ
ーゼモノクローナル抗体を０．１モルの酢酸ｐＨ３，０
で溶離する。抗体含有分画をプールし、そしてＰＳＤＥ
Ｏ９００５ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜で限外濾
過し、そして使用するまで凍結して貯蔵する。本発明の
特徴をもつモノクローナル抗体の実質的な量を生成する
ことができるクローンを、同定し、そしてＤＣＩおよび
ＣＤ６と命名する。

ｅ）あるいは、本発明のモノクローナル抗体を生成する
ハイブリドーマの塊状培養は、既知の細胞培養系に従う
ことができる。

ｅ、Ｉ）ｐＨ，温度および溶解酸素のコンピューター化
した制御の手段を装備した４Ｑのバイオリアクター（Ｓ
ｅｔｒｉｃ　　Ｇｅｎ１ｅ　　１ｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌ
ｅ）に、１０％の胎児仔ウシ血清を含有する２、５Ｑの
ＤＭＥＭを導入し、そして約１０’細胞／ｍＱの濃度で
産生性ハイブリドーマの培養物とインキュベーションす
る。培養は一般にｌＯ〜１５日間実施する。

５〜６日後、最大細胞濃度は約１０’細胞／ｍＱである
。細胞の増殖が平坦であるとき、抗体の生成（約７０〜
１００μｇ／ｍ（２）は一般に課員紙、そして２００−
４００　ｐ　ｇ／ｍＱまで増加する。細胞濃度が約１０
’細胞／　ｍ　Ｑまで減少するとき、また、抗体の生成
は続く。

ｅ、Ｔ　Ｉ）３００００の繊維のカットオフをもち、そ
してＩ）Ｈ％温度、溶解酸素および培養物の流れのコン
ピューター化された手段を装備した、中空繊維のバイオ
リアクター（Ｖｉｔａｆｉｂｅｒ　　ｐｌｕｓｌｌ、Ａ
ｍ　ｉ　ｃ　ｏ　ｎ）を、本発明のモノクローナル抗体
を生成するハイブリドーマの培養物とともにインキュベ
ーションする。１〜５ＸｌＯ’細胞を、１０％の胎児仔
ウシ血清を含有するＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中の１０００繊
維のバイオリアクター（（ＶＦ　　２Ｐ３０）中でイン
キュベーションする。細胞は繊維の各々のすべてのまわ
りで増殖し、その間培地を繊維内に流す。繊維のカット
オフのため、生成されるモノクローナル抗体は繊維の内
腔中に入らず、こうしてそれは流れる培地により除去さ
れず、繊維の間の空間において濃縮される。結局、抗体
の濃縮は間隔をもって細胞の上澄み液を試料採取するこ
とにより容易に評価され、そのうえそれが最適濃度に到
達したとき、上澄み液の一部を取り出すことにより容易
に制御することができる。このバイオリアクターの方法
は２〜３月働いて４０〜６０μｇ／日の抗体を生成する
ことができる。

実施例２、 ゲル電気泳動によるモノクローナル抗体調製物の純度お
よび均質性の評価 上で得られたモノクローナル抗体をＷ、に、ラエムリ（
Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２
７．６８０　（１９７０）に記載されている方法に従い
、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシルリン酸ナトリウムのア
クリルアミドゲルの電気泳動（下を参照））にかける。

ＩｇＧの軽鎖および重鎮に相当するバンドのみが明らか
であり、上の溶離液が純粋な免疫グロブリンを含有する
ことを示す。

また、ＨＰＬＣ分析は、単一の紫外線ピークの存在を２
８０ｎｍにおいて確証する。

調製 ｕＰＡの断片Ｆ６、ＢｌｌおよびＦｌ、の調製ａ）断片
ＦいＢ、およびＦｌ２の調製。

ｕＰＡアミノ末端断片（ＡＴＦ）（１，１ｍｇ）を、リ
ン酸ナトリウム緩衝液（１，２ｍα　；５０ミリモル、
ｐＨ７，８）中でスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）誘導プ
ロテアーゼｖ８で３７℃において９０分間処理する。こ
れらの条件下に、プロテアーゼｖ８はＡＴＦをグルタミ
ン酸残基のカルボキシル側で切断する。この酵素反応は
、混合物を２分間沸騰させることによって遮断し、そし
てそのようにして得られたタンパク質断片を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　（２０％のアクリルアミド）で分析し、モして
もとのＡＴＦと比較する。ＡＴＦに対応するバンドはも
はや存在せず、３つのバンドが１２０００（Ｆｅｚ）、
ｌ　１０００　（Ｂ、、）および６０００（Ｆａ）の見
掛けの分子量をもって、それぞれ、所定の分子量の標準
との比較により決定される。

ｂ）断片Ｆ１、ＢｌｌおよびＦｌｌの分離上で得られた
混合物を５８４−アガロースマトリックスに適用する（
アガロース変性マトリックス、モノクローナル抗体、５
Ｂ４を有する、これは低分子量の形態に結合しないで、
高分子量のウロキナーゼに結合する、これは次の参考文
献に記載されているようにしてＭＡＢ　　５Ｂ４をセフ
ァローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と結合することによっ
て調製する：欧州特許出願第１９２６７５号およびコロ
ルチ（Ｃｏｒｔｉ）Ａ、、ノリ（Ｎ。

１１ｉ）Ｍ、Ｌ、、ソフイエンチニ（Ｓｏｆｆｉｅｎｔ
ｉｎｉ）Ａ、およびカッサニ（Ｃａｓｓａｎｉ）Ｇ、、
Ｔｈｒｏｍ　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ１９８６．５６．２
１９−２２４゜このカラムは、１％のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）６０００を含有する０、１５モルのＮ
ａＣＩおよび０゜０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ７，４で、前置て平衡化されていた）。

Ｃ）結合しない分画の回収 平衡化緩衝液に相当する溶液をカラムに通過させ、そし
て分画を集め、紫外線で監視しく２８０ｎｍ）そしてそ
れらの含量に依存してプールする。

２つの主要な分画が得られ、その１つは１２．０００の
見掛は分子量を有するｕＰＡ断片を含有しくこれはＦｌ
ｌと命名する）そして他は６０００の見掛は分子量をも
つ（これはＦ、と命名する）。

これらの分画を８）に記載するようにイオン交換クロマ
トグラフィーにより精製し、次いで逆相クロマトグラフ
ィーにより脱塩する。

ｄ）結合した分画の回収 次いで、マトリックスに結合した分画を、１％のＰＥＧ
６０００を含有する１モルの塩化ナトリウムおよび０．
１モルの酢酸で溶離する。分画を集め、紫外線（２８０
ｎｍ）により監視し、そしてそれらの含量に従いプール
する。単一の主要な分画が得られ、これは１１，０００
の見掛は分子量を有するｕＰＡ断片を含有し、これをＢ
ｌｌと命名し、そして下に記載するようにして精製する
。

ｅ）断片Ｂ１１５Ｆ＠およびＦｌ！ノ精製上で得られた
断片Ｂｔ＋ｓＦ＋ｚまたはＦ６を、別々に、含有するプ
ールした分画を、ＦＰＬＣ（急速タンパク質クロマトグ
ラフィー）系（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　　Ｆｉｎｅ　　
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン国）におけるイオン
交換クロマトグラフィーにより、Ｍｏｎｏ　　Ｓ　　Ｈ
Ｒ５１５カラム（狭い分子量分布をもつ親水性樹脂のビ
ーズに基づく強いカチオン交換体；帯電した基は−ＣＨ
。

５０３）（０−０５モルの酢酸ナトリウム、ｐＨ４，８
で予備平衡化されている）により精製および濃縮する）
。

溶離は０〜１モルのの水性塩化ナトリウムの直線の勾配
で６０ｍＱ／時間で４５分で行う。次いで、Ｂ　目、Ｆ
　＠およびＦｌｌを、別々に、含有する分画を脱塩する
；濃縮し、そして、適当ならばＦＰＬＣ（急速タンパク
質液体クロマトグラフィー）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の逆相カラムのク
ロマトグラフィーにより精製し、ｐｒｏ−ＲＰＣＨＲ５
／１０逆相クロマトグラフィーのカラム（巨大多孔質、
微小シリカ、結合したｃ　ｒ／　ｃ　ａ基をもつ）を使
用する、溶離緩衝液：緩衝液Ａ１水中の０．１％のトリ
フルオロ酢酸；および緩衝液Ｂ１アセトニトリル中の０
．１％のトリフルオロ酢酸：溶離のモード＝１００％の
Ａ２０分、Ａ中の０から６０％のへ６５分、１００％の
８２５分；流速０．３ｍＱ１時間。

次いで、Ｆｌ、ＦＩ！またはＢｌｌを別々に含有するプ
ールした分画の溶媒を減圧下に蒸発させ、こうして単一
の生成物を純粋な形態で得る。

ｆ）Ｆｌ、Ｂ１１およびＦｌ２のアミノ酸の配列決定 Ｎ−温度アミノ酸配列の分析を、自動化配列決定装置（
例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　　４
７０Ａ型、気相）で実施した。Ｆｌ２およびＢ、の各々
は少量の汚染物質を含有する主要な断片から構成されて
いたが、断片Ｆ６は単一のペプチドであることが分かっ
た。この分析は、また、断片Ｂ、が「クリングル」　（
これは従来既知のモノクローナル抗体５Ｂ４により境界
されている）硫酸アンモニウム知られているｕＰＡ部分
に相当すること、および断片Ｆ１．（これはＭＡＢ５Ｂ
４により境界されていない）はウロキナーゼの配列のア
ミノ酸５２および５３の間のクリッピング（ｃｌｉｐｐ
ｉｎｇ）のみについてそれと異なるが、多分部分を一緒
に保持するジサルファイド結合の存在のため、分子量は
実質的に変化しないことが示された。

断片Ｆ６は、はぼロインン４からグルタミン酸４３にま
たがるウロキナーゼ配列のそれに実質的に相当する見掛
けの分子量を示し、モしてＧＦＤ領域を包含する（か、
あるいはその中に包含される）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−アクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）をこの分野において知られているようにして実施
する。この方法の最初の記載の１つは、ラエムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）によりなされた（バクテリオファージＴ４
のヘッドのアセンブリーの間の構造タンパク質の開裂、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７０．２２７　：　
６８０−６８５）。

使用したゲル中のアクリルアミドの量は、変化させるこ
とができ、そして一般に示されている（例えば、２０％
のアクリルアミドは最終ゲル中のこの化合物の百分率を
示す）。一般に、既知の分子量をもつ参照物質は試験化
合物と平行に展開する。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、ＧＦＤ領域に相当し、次の特徴： ａ）ＩｇＧクラスである、 ｂ）他のウロキナーゼ免疫原領域に結合しないで、ウロ
キナーゼまにはプロウロキナーゼのＧＦＤ領域に選択的
に結合することができる、を有することを特徴とする、
ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼのエピトープに特
異的に向けられたモノクローナル抗体。

２、ＧＦＤ領域に相当し、次の特徴： ａ）ＩｇＧクラスである、 ｂ）他のウロキナーゼ領域に結合しないで、ウロキナー
ゼまたはプロウロキナーゼのＧＦＤ領域に選択的に結合
することができる、 Ｃ）ウロキナーゼの酵素的活性またはプロウロキナーゼ
の酵素的活性化を妨害しない、を有することを特徴とす
る、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼのエピトープ
に特異的に向けられたモノクローナル抗体。

３、ＩｇＧ１クラスである上記第１または２項記載のモ
ノクローナル抗体。

４、上記第１．２または３項記載の抗ＧＦＤモノクロー
ナル抗体を調製する方法であって、ウロキナーゼ、プロ
ウロキナーゼまたはＡＴＦ、またはそれらの混合物で前
以て免疫化した実験動物からの脾細胞を、骨髄腫細胞系
と、適当な融合促進剤の存在下に融合することによって
、それを産生することができるハイブリドーマを調製し
、次いで増殖因子ドメイン様アミノ酸配列へのその特異
的結合により抗ＧＦＤモノクローナル抗体を同定するア
ッセイにより、所望の産生性ハイブリドーマを分離する
ことを特徴とする方法。

５、脾細胞および骨髄腫細胞はネズミである、上記第４
項記載の方法。

６、融合促進剤はポリエチレングリコールである、上記
第４項記載の方法。

７、増殖因子ドメイン様アミノ酸配列は、ウロキナーゼ
または同一の免疫原性質を維持するその突然変異、欠失
または挿入の誘導体の配列のロイシン４からグルタミン
９４３までにほぼまたがるアミノ酸配列に相当する配列
である、上記第４項記載の方法。

８、上記第４項記載のハイブリドーマを、適当な条件下
に、培養するからなる、上記第１，２または３項記載の
化合物を調製する方法。

９、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼの精製または
決定のための親和性マトリックスの調製における、上記
第１，２または３項記載のモノクローナル抗体の使用。

ｌＯ１試験物質の調製物を、平行または順次に、ａ）Ｇ
ＦＤ領域以外の分子のエピトープに向けられた抗ウロキ
ナーゼ抗体、 ｂ）上記第１，２または３項記載の抗体、と接触させ、
次いでａ）と陽性の反応およびｂ）と陰性の反応を与え
る化合物を検出または分離する、ことを特徴とする、変
更したＧＦＤ領域を有するウロキナーゼまたはプロウロ
キナーゼの誘導体を同定または精製する方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ウロキナーゼのアミノ酸配列の外観を表し、
ここで本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトー
プは目立つようにされている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＧＦＤ領域に相当し、次の特徴： ａ）ＩｇＧクラスである、 ｂ）他のウロキナーゼ免疫原領域に結合しないで、ウロ
   キナーゼまたはプロウロキナーゼのＧＦＤ領域に選択的
   に結合することができる、 を有することを特徴とする、ウロキナーゼまたはプロウ
   ロキナーゼのエピトープに特異的に向けられたモノクロ
   ーナル抗体。 ２、ＧＦＤ領域に相当し、次の特徴： ａ）ＩｇＧクラスである、 ｂ）他のウロキナーゼ領域に結合しないで、ウロキナー
   ゼまたはプロウロキナーゼのＧＦＤ領域に選択的に結合
   することができる、 ｃ）ウロキナーゼの酵素的活性またはプロウロキナーゼ
   の酵素的活性化を妨害しない、 を有することを特徴とする、ウロキナーゼまたはプロウ
   ロキナーゼのエピトープに特異的に向けられたモノクロ
   ーナル抗体。 ３、上記第１または２項記載の抗ＧＦＤモノクローナル
   抗体を調製する方法であって、ウロキナーゼ、プロウロ
   キナーゼまたはＡＴＦ、またはそれらの混合物で前以て
   免疫化した実験動物からの脾細胞を、骨髄腫細胞系と、
   適当な融合促進剤の存在下に融合することによって、そ
   れを産生することができるハイブリドーマを調製し、次
   いで増殖因子ドメイン様アミノ酸配列へのその特異的結
   合により抗ＧＦＤモノクローナル抗体を同定するアッセ
   イにより、所望の産生性ハイブリドーマを分離すること
   を特徴とする方法。 ４、ウロキナーゼまたはプロウロキナーゼの精製または
   決定のための親和性マトリックスの調製における、上記
   第１または２項記載のモノクローナル抗体の使用。 ５、試験物質の調製物を、平行または順次に、ａ）ＧＦ
   Ｄ領域以外の分子のエピトープに向けられた抗ウロキナ
   ーゼ抗体、 ｂ）上記第１または２項記載の抗体、 と接触させ、次いでａ）と陽性の反応およびｂ）と陰性
   の反応を与える化合物を検出または分離する、ことを特
   徴とする、変更したＧＦＤ領域を有するウロキナーゼま
   たはプロウロキナーゼの誘導体を同定または精製する方
   法。