JPH0753758B2 - ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体及びその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ヒト結腸線維芽細胞由来の組織プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−PA）に対して特異性を有すること
を特徴とする、ハイブリッドセルにより産生されるモノ
クローナル抗体に関する。更には本発明は、ｔ−PAの精
製法及びｔ−PAのイムノアツセイ法におけるモノクロー
ナル抗体の用途に関する。

Ｋhler及びMilsteinによつて初めて開発されたハイブ
リドーマ技術の出現により、今日では、ある結合部位に
対して一定の親和性を有し本質的に均質な組成のモノク
ローナル抗体を産生することが可能である。これら開発
者によるマウスハイブリドーマの産生については、Natu
re256,495-497（1975）及びEur.J.Immunol.6,511-519
（1976）に記載されている。この方法によれば、組織培
養したマウスミエローマ細胞を、免疫化マウスの脾臓細
胞と融合して、大量の単一な抗体分子を産生するハイブ
リツドセルを得ている。細胞融合は一般的にはポリエチ
レングリコール（PEG）の存在下に実施され〔Galfeら,N
ature266,550-552（1977）〕、次いでHAT培地（ヒポキ
サンチン，アミノプテリン及びチミジン）により融合細
胞が選択される〔Littlefield,Science145,709-710（19
64）〕。

いかなる外来抗原を用いた場合でも、大体は免疫化を行
なうことができるが、多くの困難が生じ、場合に応じて
の変更が必要である。ある特定のハイブリドーマを調製
する場合、目的とするハイブリドーマが得られるか否
か、得られた場合それが抗体を産生するか否か、そして
得られる抗体が目的とする特異性を有するか否かについ
ては何んらの保証もない。

ボウス（Bowes）メラノーマ培養細胞，ヒト血漿及びヒ
ト子宮組織由来のｔ−PAに対するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマの調製に関して多くの報告がな
されている〔例えば、Petterssonら,Haemostasis 11（S
upp.1）p.75,abstract 134（1982）;Petterssonら,Pro
g.Fibrinolysis 6,191-194（1983）;Nielsenら,The EMB
O J.2（１）,115-119（1983）;Matsuoら,Thromb.Res.3
6,517-526（1984）;MacGregorら,Thromb.Haemos.53
（１）,45−50（1985）;Schleefら,Ibid.,53（１）,170
−175（1985）;Angles−Cano,Blood 66（４）,913−920
（1985）;Holvoetら,Blood 67（５）,1482-1487（198
6）；及び1984年１月11日公開のUK特許出願GB2,122,21
9〕。これらのハイブリドーマを用いてモノクローナル
抗体を産生し、このモノクローナル抗体がBowesメラノ
ーマｔ−PAのin vitro精製に使用されている〔例えば、
Einarssonら,Biochem.Biophys.Acta 830,1-10（1985）;
Reaganら,Thromb.Res.40,1−９（1985）〕。Bowesメラ
ノーマに対するこれらモノクローナル抗体のいくつか
は、例えば、American Diagnostica社（ADI,Greenwich,
Connecticut）から入手することができる。

最近、本発明者のうちの３名と他の発明者によつて、ヒ
ト結腸線維芽細胞由来ｔ−PAを調製する方法が開発され
た（特願昭62-86751号明細書）。これらｔ−PAのユニー
クで異種のグリコシル化パターンについては、本発明者
のうちの１名と他の発明者による特願昭62-42438号明細
書に記載されている。これら明細書の記載は本明細書に
引用する。

Bowesメラノーマｔ−PAに対するモノクローナル抗体が
結腸組織のｔ−PAを認識することがTissort及びBachman
によつて報告されているが〔Prog.Fibrinolysis 6,133-
135（1983）〕、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対するモ
ノクローナル抗体についてはこれまで報告されていな
い。

本発明の要旨 本発明によれば、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対して特
異性を有することを特徴とする、ハイブリツドセルライ
ンによつて産生される新規モノクローナル抗体が提供さ
れる。かかる抗体は、ｔ−PAの精製及びイムノアツセイ
に有用である。

ｔ−PAを含む生物学的試料からのｔ−PAの精製は、固相
支持体に結合しておりｔ−PAを選択的に吸着することの
できる本発明の新規モノクローナル抗体を含む免疫吸着
カラムに該試料を通すことからなるイムノアフイニテイ
クロマトグラフイーによつて実施することができる。

ｔ−PAを含む生物学的試料中のｔ−PAレベルを測定する
ｔ−PAイムノアツセイは、ｔ−PAを含む生物学的試料を
公知の量の本発明の新規モノクローナル抗体と接触せし
め得られる吸着されたモノクローナル抗体の量を測定す
ることによつて実施することができる。

これら抗体を産生するのに使用される好ましい３つのハ
イブリツドセルラインが得られ、これらはセルラインPA
63-4，PA54-2及びPA79-7と命名された。以後本発明書に
おいては、これらセルラインは“PA"の接頭語を省略し
て単に番号により略称する。これらハイブリツドセルラ
インの単離品は、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨン（Rockville,Maryland）に永久保存の形で寄
託されており、受託番号としてATCC HB9155,ATCC HB 91
57及びATCC HB 9156がそれぞれ付与されている。これら
セルラインのサンプルは、特許付与日から該寄託機関へ
の要求に応じて公衆に付与される。

本発明の抗体はヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対して特異
性を有し、かかるｔ−PAはヒト正常結腸線維芽細胞セル
ラインCCD-18Coから単離することができる。このセルラ
インは、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨ
ン（Rockville,Maryland）に永久保存の形で制限なしに
寄託されており、受託番号ATCC CRL-1459が付与されて
いる。このサンプルは、該寄託機関への要求に応じて公
衆に付与される。

本発明の詳細な記述 本明細書では、特許請求の範囲において本発明を形成す
ると考えられる対象事項を指摘し明確に主張するが、一
方次の如き図面を伴つた明細書の記載によつて本発明が
よりよく理解されるものと信ずる。

第１図は、本発明の一態様である、プロテインＡ−セフ
アロースアフイニテイーカラムにより精製し次いでBio
−Gel TSK DEAE−５−PWイオン交換HPLCカラムで精製し
た、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対するモノクローナル
抗体の高速液体クロマトグラフイー（HPLC）のプロフア
イルを示す図である。

第２図は、CNBrによつてセフアロースに吸着された、ヒ
ト結腸線維芽細胞Ｔ−PAに対する本発明の三つの態様で
あるモノクローナル抗体（レーン8,9及び10）を用いた
イムノアフイニテイークロマトグラフイーにより精製さ
れたヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAの、還元型ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを
示す図である。

第３図は、第２図の３つのモノクローナル抗体の、非還
元型SDS−PAGEパターンを示す図である。

ハイブリドーマの調製及びヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに
対するモノクローナル抗体の最初の特徴付け マウスを免疫するのに用いた最初のｔ−PA抗原は、最終
精製工程においてTSK 3000 SWサイズ排除HPLCカラムを
用いて２回精製した（カラムに２回通した）以外は、特
願昭62-86751号明細書の例２の表Ｉに記載されたと同様
の材料からなるバツチから得、同様の精製工程により精
製した。これらの精製工程は次のステツプからなる。即
ち、ヒト正常結腸線維芽培養細胞CCD-18Co（ATCC CRL-1
459）の適正化（conditioned）培地を、亜鉛キレート−
アガロースを用いた第１のアフイニテイークロマトグラ
フイーに付し、次いでコンカナバリンＡ−アガロースを
用いた第２のアフイニテイークロマトグラフイーに付
し、次いでTSK 3000 SWサイズ排除高速液体クロマトグ
ラフイーに付す工程からなる。最終的に得られるｔ−PA
サンプルの特性は次の通りであつた。

容量＝3ml〔（H₂O＋0.01％ Tween 80）溶液〕； 蛋白質濃度＝0.3mg/ml〔Bradford,Anal.Biochem.72,248
-254（1976）に記載された方法により測定した。〕； プラスミノーゲン活性化活性＝480プラウ（Ploug）単位
/ml〔PAスポツトアツセイ法（特願昭62-86751号明細
書）により測定した〕； ｔ−PA抗原0.15mg/ml〔SDS−PAGE法（特願昭62-86751
号明細書）により評価した純度は50％であつた。〕。

マウスの免疫化 マウス３匹（雌性ヤングアダルトBALB/C,ByJ）を、次の
如くにして皮下注射して免疫化した。即ち、完全フロイ
ントアジユバント（ミコバクテリアを用いた油中水型エ
マルジョン（Davisら,Microbiology,3rd Edition,Harpe
r及びRow Publishers,New York,NY,1980,pp.436-43
7）〕0.1ml中に含有せしめた上記ｔ−PA抗原を、それぞ
れのマウスの背部及び右側の側腹部に２回皮下注射し
て、該ｔ−PA抗原15μｇをそれぞれのマウスに投与し
た。２週間後に、非完全フロイントアジユバント（ミコ
バクテリアを用いない油中水型エマルジヨン）を用いる
以外は同様にして、前回と異なる背部及び左側の側腹部
に投与した。更に２週間後、ｔ−PA50μｇを含むリン酸
緩衝化生理食塩水（PBS＝0.01-0.02Mリン酸ナトリウム,
0.15M NaCl,pH6.8-7.4）溶液0.2mlを腹腔内に投与し
て、それぞれのマウスを最終的に感作せしめた。３日
後、細胞融合に資するため脾臓を取り出した。

ハイブリドーマの調製 Davieの方法〔ハイブリドーマ：産生試薬の改良,Pharma
cological Rebiews,37（１）,115-118（1982）〕に本質
的に従つて、免疫脾臓細胞を、融合パートナーであるSp
2/0−Ag14ミエローマと融合せしめた。Sp2/0−Ag14は、
Schulmanら,Nature276,269-270（1978）に定義された、
BALB/C由来のよく知られたセルラインである。Ig鎖を合
成しないこれらの細胞は、Basel Institute for Immuno
logyから入手することができ、またアメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨンから受託番号ATCC CRL−15
81として入手することができる。融合の最良の結果を得
るためには、融合パートナーとして、15％Hyclone胎児
牛血清を含む培地での対数増殖期にあるSp2を用いるこ
とが必要であつた。融合前３日間で毎日、Sp2細胞を５
×10⁵セル/mlに希釈してＴ−75フラスコに入れ全量15ml
とした。細胞融合後、細胞を96ウエルプレート６個に分
注せしめ、支持細胞としてヒト包皮線維芽細胞を、約60
セル／ウエルの量で加えた。15％Hyclone FBS（胎児牛
血清）を含むHAT選択培地で、新規バイブリツドセルの
生育が支持されるウエル全てを注意深く選んだ。接種し
た600ウエルのうち、400ウエル（75％）中に生育したハ
イブリドーマが含まれており、このうち150ウエルにつ
いて、ELISA法（酵素結合免疫吸着測定法）により、ｔ
−PAに対するモノクローナル抗体産生をスクリーニング
し、15ウエル（10％）が陽性を示した。ELISA法は、本
質的にはEngvall及びPerlmannの方法〔J.Immunol.109,1
29-135（1972）〕に従つて実施した。選択したハイブリ
ドーマは、Bishopの方法〔J.Immunological Methods,4
6,47-51（1981）〕及びDavisらの方法〔Ibid.,50,161-1
71（1982）〕に本質的に従つてサブクローン化した。

結腸ｔ−PAに対するモノクローナル抗体：最初の特徴付
け 上記の如くして調製されたｔ−PA陽性ハイブリドーマの
うち５つのハイブリドーマがサブクローン化され、これ
らは後述する表Ｉに示した如き特徴を示した。全てのク
ローンは、適度にモノクローナル抗体を産生した。即
ち、IgG₁アイソタイプのモノクローナル抗体10-20μg/m
l（適正化倍地1ml当り10-20μｇのモノクローナル抗
体）を産生した。５つのモノクローナル抗体全ては、Bo
wesメラノーマｔ−PAと交差反応したがウロキナーゼ
（ｕ−PA）とは反応しなかつた。

モノクローナル抗体のうち３つを選んで、ｔ−PA精製及
びｔ−PAイムノアツセイの用途について更にテストを行
なつた。それぞれのクローン63-4,54-2,79-7からの適正
化培地500mlを用いて、プロテインＡ−セフアローズ
カラムによりモノクローナル抗体を単離し、次いでこれ
らを、シアノゲンブロマイド活性化セフアロースに結合
せしめて免疫吸着カラムを調製した。CCD-18Co結腸線維
芽細胞の適正化培地から分離したｔ−PAを、亜鉛キレー
ト−セフアロース6Bを用いた第１のアフイニテイークロ
マトグラフイー次いでコンカナバリンＡ−セフアロース
4Bを用いた第２のクロマトグラフイーにより精製し（特
願62-86751号明細書）、得られた部分精製ｔ−PAを、63
-4モノクローナル抗体が結合したカラムに通し、KSCNで
溶出し、３つの溶出画分を還元型SDS−PAGEで分析し
た。

1M KSCN画分:t−PA,0; 2M KSCN画分:1本鎖及び２本鎖ｔ−PA; 4M KSCN画分:1本鎖ｔ−PA,75％以上． ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを用い
て評価した所、用いた材料は純粋であり、後述するウエ
スタンブロツト法による測定ではウロキナーゼの混入が
検出されなかつた。この予備的なテストの結果から、63
-4モノクローナル抗体は、２本鎖蛋白質よりもいく分１
本鎖蛋白質とよく結合することが判る。更に進んで行な
うテスト用に十分な量のモノクローナル抗体を得るため
に、３つのハイブリドーマ（63-4,54-2及び79-7）を10l
にスケールアツプした。

モノクローナル抗体評価法 ｔ−PA精製法 本明細書におけるヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対するモ
ノクローナル抗体を評価するため、商業的に入手し得る
Bowesメラノーマｔ−PA並びに結腸ｔ−PAの精製に関し
て、本発明のモノクローナル抗体とBowes t−PAに対す
る商業的に入手し得るモノクローナル抗体調製物（PAM
−１）との間で比較実験を行なつた〔PAM−１及びBowes
t−PAは、American Diagnostica,Inc.（Greenwich,CT
（ADI）から購入した〕。例えば、SDIから入手した、ゲ
ル1.7ml当リIgG10mgを含むPAM−１−セフアロースバイ
アルを、結腸ｔ−PAの透析したコンカナバリンＡ−セフ
アロース（ConA）溶出画分25mlと共に室温で４時間ゆつ
くりと攪拌した。ConA t−PA画分は本質的には特願昭62
-86751号明細書に記載された方法により調製した。即
ち、ヒト正常結腸線維芽培養細胞CCD-18Coの適正化培地
を亜鉛キレートアガロースを用いた第１のアフイニテイ
ークロマトグラフイーに付し、次いでConAを用いた第２
のアフイニテイークロマトグラフイーに付して調製し
た。溶液を濾過し、洗浄して小さなカラムに注いだ。PB
S及び0.25M KSCNで洗浄後、ｔ−PAを1.6M KSCNで溶出せ
しめた。本明細書に記載した方法で単離されたモノクロ
ーナル抗体を用いて、カラム，バツチ吸着法及び溶出試
薬を変えて同様のテストを繰り返した。またセフアロー
スに吸着した抗体の濃度を変えた場合、ｔ−PAの溶出に
用いるKSCNの濃度を変えた場合、あるいはｔ−PAとチヤ
ージに用いた抗体との比を変えた場合についてもテスト
し、またバツチ対カラム法についての、培地中のｔ−PA
を結合せしめる効果についてもテストした。

ウエスタンブロツト法 この方法は以下の如く修正はしたが、本質的には、Rena
rt及びSandoval,Meth.Enzymol.104（Ｃ）,455-460（198
4）に記載された方法に従つて実施した。1mgのｔ−PA及
びｕ−PA（見掛け分子量,Mr,54,000,Calbiochem社,Lajo
lla,Calif.）をSDS−PAGEに付した。ADIから入手したBo
wesメラノーマｔ−PA,及び本発明のモノクローナル抗体
を用いたアフイニテイークロマトグラフイーにより精製
したヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAを用いた。電気泳動後、
蛋白質を活性化ペーパー上に電気的にブロツトし、商業
的に入手し得る抗ウロキナーゼ抗体〔Cat.No.6200,抗ヒ
トウロキナーゼ抗体，ラビツト血清，ミドリ十字社（日
本，大阪）〕の1:3000希釈液と反応せしめた。結合抗体
は、¹²⁵I−プロテインＡ（New England Nuclear社,Bost
on,Massachusetts）でラベル化されていた。洗浄後、放
射標識化された免疫標識化ペーパーをＸ線フイルムにさ
らした。Ｘ線フイルム上の黒いスポツトからウロキナー
ゼを検出することができた。

プロテインＡ Parmacia社から供給を受けた、アガロースビーズ上に吸
着せしめたプロテインＡを、免疫グロブリンの簡単なワ
ンステツプ精製法用のマトリツクスとして用いた。Bio
−Rad Laboratories社（Richomond,California）よりキ
ツトの形態で商業的に入手したAffi−Gel プロテインA
MAPS緩衝液システムを用いてクロマトグラフイーを実
施した。即ち、適正化培地をバインデイングバツフアー
で希釈し、希釈した適正化培地をプロテインＡ−セフア
ロースのカラムに通し、過剰の蛋白質を洗い流し、次い
で結合免疫グロブリンを溶出緩衝液を用いて溶出せしめ
てクロマトグラフイーを実施した。

結合現象 Van Heyningenら,J.Immunol.Meth.62,147-153（1983）
に記載された抗体希釈法により、結合親和性を評価し
た。即ち、酵素結合免疫吸着測定法〔ELISA,Engval及び
Perlman,J.Immunol.109,129-135（1972）〕により，吸
着したｔ−PAへの、モノクローナル抗体の一連の希釈液
の結合を測定した。Tris〔トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン〕0.605g,塩化ナトリウム4.05g及びHClでp
H8に調整されたTween20（ポリソルベート20、Sigma社
（St.Louis,Missouri）〕1mlから構成され500mlに希釈
された洗浄緩衝液中に精製ｔ−PAを160ng含む溶液50μ
ｌを、96ウエル組織培養グレード（湿潤性）プラステイ
ツクプレートの各ウエルに加えた。プレートを乾燥し、
室温で乾燥保存した。ウエルを使用直前に洗浄緩衝液で
洗つた。洗浄しプレートを軽く打つて過剰の緩衝液を除
いた後、10mg/ml牛血清アルブミンを含む抗体の上記し
た緩衝液の一連の２倍希釈液50μｌを、一対のウエルに
加えた。プレートをカバーし、37℃でインキユベートし
た。２時間後、プレートを上記した洗浄緩衝液で３回洗
い、軽く打つて過剰の液を除いた。牛血清アルビミンを
含むアルカリホスフアターゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロ
ブリン緩衝液の1:200希釈液50μｌを、各ウエルに加
え、プレートを37℃で２時間再びインキユベートした。
プレートを、無血清緩衝液で３回洗浄し、次いでジエタ
ノールアミン48ml及び0.24mM塩化マグネシウムからなる
溶液（pH9.8）を脱イオン水で希釈して500mlとした溶液
中に1mg/mlパラニトロフエニルホスフエートを含む溶液
100μｌを、各ウエルに加えた。室温で30分間発色せし
めて、直ぐに自動プレートリーダーで410nmで測定する
か、あるいは後で測定するために2M水酸化ナトリウム50
μｌを加えて発色を止めた。得られる相対的結合性（親
和性）パラメーターは、後述する表VI及びVIIに示した
通りである。

上記した事項により、ELISA型テストでｔ−PAのレベル
を測定する免疫測定法における本発明のモノクローナル
抗体の用途については既に説明されている。このテスト
では、ｔ−PAがプラステイツクプレートなどの固相担体
表面に吸着され、次いでこの吸着ｔ−PAとモノクローナ
ル抗体とを反応せしめる。次いで吸着されたモノクロー
ナル抗体の量を、酵素標識化第２抗体を用いて分光光度
計により測定する。適当な酵素基質を加えた時、最終溶
液の光学濃度は、もとの試料中のｔ−PAの量に直接比例
する。

本発明の免疫測定法の典型的な例では、結腸線維芽細胞
ｔ−PAに対するモノクローナル抗体を用いてプラステイ
ツクウエルを被覆し、このモノクローナル抗体により、
ウエルに加えられた試料、例えば測定すべき未知濃度の
ｔ−PAを含む患者の血清試料、既知濃度のｔ−PAを含む
標準コントロール溶液試料などの試料中のｔ−PAが捕え
られる（結合される）。かくして形成されたウエル中の
反応複合体は、ウエルに適用された酵素標識化第２モノ
クローナル抗体と更に反応せしめられる。該複合体に結
合した第２抗体の量は、もとの試料のｔ−PA濃度に比例
する。発色性基質をウエルに加えて一定の特定反応時間
後の光学濃度を測定することにより、酵素標識化抗体を
検出することができる。次いでそれぞれのアツセイにつ
いて作成した標準曲線からｔ−PA濃度を読み取ることが
できる。

電気泳動 ポリアクリルアミドゲルは、Laemmliの方法〔Nature22
7,680（1970）〕に本質的に従つて実施した。還元型ゲ
ルは、ドデシル硫酸ナトリウム緩衝液中のメルカプトエ
タノール又はジチオスレイトールを用いて調製した。

ｔ−PAの定量 通常のｔ−PAスクリーニング法として、特願昭62-86751
号明細書に記載されたPAスポツト測定法、あるいはWall
enら、Eur.J.Biochem.132,681-686（1983）に記載され
たS-2322（Ｄ−Val−Gly−Arg−パラニトロアニリド）
又はS-2444（Ｄ−Glu−Gly−Arg−パラニトロアニリ
ド）（Kabi社の酵素基質）を利用したマイクロタイター
プレートでの直接比色分析測定法を使用した。PAスポツ
ト測定法では、フイブリノーゲン，スロンビン及びプラ
スミノーゲンを含むペトリ皿中のアガロースゲル上に試
料５μｌを適用することによつて測定した1ml当りのPlo
ug単位で、活性が表現される。曇つたゲルが、ｔ−PA活
性に比例した面積で透明になる。これら両者の測定法
は、ウロキナーゼ又は商業的ｔ−PA溶液あるいはGaffne
y及びCurtisによつて定義された如き〔Thromb.Haemost.
53,134-140（1985）〕WHO標準ｔ−PAに対して規格化さ
れている。

ｔ−PAを含む調製物中のｕ−PAの定量のために、Boehri
nger Mannheim Biochemicals社〔Indianapolis,Indiana
（Cat.No.378-461）〕から商業的に入手し得る基質Chro
mozym PL（トシル−グリシル−プロリル−リシン−４
−ニトラニリドアセテート）を、Rijken,“ヒト組織の
プラスミノーゲン活性化因子",Ph.D.Thesis,ライデン大
学，ネーデルランド,p.70（1980）に記載された基質S-2
322と共に用いた。

放射免疫拡散測定法 Manciniらによつて開発されたこの測定法〔Immunochem.
2,235-254（1965）〕は、溶解性抗原がその特異的抗体
と適当な割合いで反応する時に目に見える沈降物が形成
されるという原理に基いている。この測定法では、IgGl
免疫グロブリンに対する抗体がアガロースゲル中に混入
されており、測定しようとする免疫グロブリンを、かか
るゲルを切つて作成したウエル中に置く。免疫グロブリ
ン試料がウエルから外へ向かつて放射状に拡散し、抗体
と反応して目に見える沈降物の輪が形成される。試料中
の抗原が全て反応するまで沈降物の輪が続いて形成さ
れ、そして最後に広い輪の状態で再び溶解する。この時
点で、目に見える輪の面積は、ウエルに導入された免疫
グロブリンに直接関連している。輪の面積を、同時に行
なつたマウスIgGlの標準溶液の輪の面積と比較する。実
際の値は、グラフペーパー上にあるいは数学的に作成し
た標準曲線から決定される。TAGO社（Burlingame,Calif
ornia）から入手し得るプレート及び標準物を用いた。

ヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAに対するモノクローナル抗体
の更に詳細な特徴付け Pharmacia社から供給された、セフアロース （アガロ
ースビーズ）上に吸着されたプロテインＡを、モノクロ
ーナル抗体の簡単なワンステツプ精製用のマトリツクス
として用いた。前記した如く、これらのモノクローナル
抗体は、所望の特性を有するか否かによつて選択された
ハイブリドーマの組織培養により産生されたものであ
る。Bio−Rad社より供給を受けたAffi−GelプロテインA
MAPS緩衝液キツト〔Cat.No.153-6160,Bio−Rad社（Ric
hmond,California）〕を用いて、クロマトグラフイーに
よる精製を行なつた。ハイブリドーマがモノクロナール
抗体を分泌した組織培養培地を、等量のバインデイング
バツフアー（Bio−Rad社）で希釈し、プロテインＡ−ス
アフイニテイ−カラムに注いだ。対象とするモノクロー
ナル抗体を含む免疫グロブリンがプロテインＡ−セフア
ロースに結合された。カラム容積の約15倍のバインデイ
ングバツフアーを用いて、他の蛋白質及び不要な化学物
質をカラムに結合したモノクローナル抗体から洗い流
し、次いで溶出緩衝液（Bio−Rad社）で溶出した。各画
分のUV吸光度を測定して精製物を追跡し、クマシー蛋白
質〔Bradford,Anal.Biochemistry,72:248-254（197
6）〕分析及びManciniの方法〔Immunochemistry,2:235-
254（1965）〕による放射免疫拡散測定法〔TAGO社（Bur
lingame）,CA,Cat.No.1346〕により蛋白質を定量してマ
ウスIgGlの量を測定し、第１図に示した如くアガロース
ゲル電気泳動及びHPLCにより純度をチエツクした。

第１図では、プロテインＡ−セフアロースアフイニテイ
ーカラムで精製したモノクローナル抗体（63-4）50μｌ
（119μg/mlクーマシー蛋白質）を、0.02M Tris−HCl緩
衝液（pH8.5）及びBio−Gel TSK DEAE−５−PW〔Bio−R
ad社（Richmond,California）〕イオン交換HPLCカラム
を用いたクロマトグラフイーに付し、0.02M Tris−HCl
（pH7.0）及び0.3M NaClを含む溶液まで上昇する勾配を
用いて流速1ml/minで溶出せしめた。牛アルブミン，牛
トランスフエリン及びマウスIgGlについても同一の条件
でクロマトグラフイーを行ない、スタンダードとした
〔全てはSigma社（St.Louis,Missouri）から商業的に入
手した〕。時間対280nmでの吸光度をプロツトし、比較
のために吸光度スケールを修正した。後述する表IIに
は、これらの方法を用いて得られた相対的精製度が示さ
れている。対象とするそれぞれのモノクローナル抗体を
精製するために、20立方センチメートルのプロテインＡ
−セフアロースを用いた。４℃にてクロマトグラフイー
を実施した。

モノクローナル抗体の吸着化 以下に示す手法に従つて、各モノクローナル抗体のセフ
アロース マトリツクスへの吸着を実施した。

1.Pharmacia社製の凍結乾燥CNBr活性化セフアロース4B
約600mgを、1mM HCl中で少なくとも15分間浸して膨張さ
せた。次いで焼結ガラスフイルター上で1mM HCl120mlで
洗浄して添加されていた保存剤及び安定化剤を除去し
た。

2.プロテインＡで精製したモノクローナル抗体（クロー
ン63-4,54-2及び79-7）2.7mgのリン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）溶液を、0.1M NaHCO₃緩衝液（pH8.3）で希釈し
て4mlとした。

3.ゲルをNaHCO₃緩衝液約5mlで洗浄し、直ぐに希釈モノ
クローナル抗体と混合し、次いで４℃の冷室で一晩回転
させながらゆつくりと混合した。

4.ゲルを濾過し、1Mエタノールアミン（pH8）20-40mlに
移して２時間室温で放置し、ゲル上の残つた活性部位を
ブロツクした。

5.0.5M NaClを含む0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4）
でゲルを洗浄した。

6.再びゲルをNaHCO₃緩衝液で洗浄し、最後にPBSで平衡
化した。

7.小さなポリスチレンカラム〔8mm.I.D.,Pierce Chemic
al社製（Rockford、Illinois,Cat.No.29920）〕を用い
てモノクローナルアフイニテイーカラムを保持し、ガラ
スへのｔ−PAの疎水性結合を阻止した。

ｔ−PAの詳細な精製法 結腸線維芽細胞ｔ−PA中のウロキナーゼの混入を評価す
るため、亜鉛キレートセフアロース6B次いでコンカナバ
リンＡ−セフアロースを用いたアフイニテイークロマト
グラフイーにより精製したｔ−PA試料を調べた。基質S-
2322及びChromozym PLを用いた直接比色分析測定法によ
り、２つのプラスミノーゲン活性化因子の分子濃度を調
べた。プラスミノーゲン活性化因子全濃度の1.7％がウ
ロキナーゼであつた。セフアロースの如き固相支持体マ
トリツクス上に吸着された、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−PA
に対するモノクローナル抗体を用いて、（ａ）.u−PA活
性を完全に除去できるか否か、そして（ｂ）結腸線維芽
細胞ｔ−PAあるいは他のｔ−PAを均質に精製することが
できるか否かを決定するのが望ましい。従つて、シアノ
ゲンブロマイド活性化セフアロースに結合した63-4モノ
クローナル抗体から構成されたモノクローナル抗体カラ
ムを用いて、試料を更に精製した。溶液中にウロキナー
ゼ活性が残存しており、これをカラムに通過させた。2M
及び4M KSCNを用いて、カラムからｔ−PA活性のいくつ
かを溶出せしめた（後述する表III）。ウエスタンブロ
ツト法により、溶出画分についてｕ−PAの存在をテスト
した所、何んら検出されなかつた。かくして精製の主た
る目的は達成された。この実験では、機械上の問題があ
つたため、ｔ−PAの回収量は低くかつた。続いての実験
では、後述する表IVの如く、他の３つのモノクローナル
抗体を用いて、モノクローナル抗体アフイニテイーカラ
ムから90％以上（ELISA法の測定による）のｔ−PA活性
が回収された。かくして第２の主たる目的が達成され、
これによりｔ−PAを均質に精製することができる。出発
材料及び精製画分のSDS−PAGEを行なうことにより、本
発明のイムノアフイニテイークロマトグラフイーの精製
能力を証明した。第２図及び第３図には、KSCNの直線勾
配を用いてモノクローナル抗体カラムから溶出したｔ−
PAの電気泳動パターンが示されている。

第２図及び第３図のレーン1-10は次の通りである。

レーン1:Pharmacia社製低分子量スタンダード:Mr94,00
0,ホスホリラーゼB,0.64μg:Mr67,000,牛血清アルブミ
ン,0.83μg;Mr43,000,オバルブミン,1.47μg;Mr30,000,
カルボニツクアンヒドラーゼ,0.83μg;Mr20,000,ソイビ
ーントリプシンインヒビター0.8μg:Mr14,000,α−ラク
トアルブミン,1.21μｇ。

レーン2:ADI Bowes t−PA,3μｇ。

レーン3:結腸ｔ−PAのCon A画分,0.5μｇ。

レーン4:水に対して透析したレーン３のCon A画分,0.5
μｇ。

レーン5,6及び7:モノクローナル抗体63-4,54-2,79-7そ
れぞれからの非結合画分，それぞれ３μｇ。

レーン8,9及び10:4M KSCNを用いた、レーン5,6,7それぞ
れのモノクローナル抗体からの溶出液、それぞれ２μ
ｇ。

Morrisseyの方法〔Anal.Biochem.117,307-310（198
1）〕により、SDS−PAGEを銀発色せしめた。

３つの異なるモノクローナル抗体で精製したｔ−PAの還
元型SDS−PAGEは、１つの相違点を除いては同じであつ
た。第２図に示した全てのサンプルの共通点は、レーン
8,9,10において見掛け分子量（Mr）約36キロダルトン
（Kd）及び69Kdに対応する２つの主要バンド（Ｚ及び
Ｘ）が存在したことである。低分子量バンド（Ｚ）に
は、Bachmann及びKruithof,Seminers in Thrombasis an
d Hemostasis 10（１），6-17（1984）に記載された如
きプラスミン開裂ｔ−PAのＡ鎖及びＢ鎖が含まれてい
た。69Kdのバンド（Ｘ）は、非開裂単一鎖ｔ−PAに対応
している。PA79-7で精製したｔ−PA（レーン10）では現
われなかつた49Kdの第３番目のバンド（Ｙ）は、フリー
ｔ−PA断片あるいは免疫学的に認識される蛋白質と思わ
れる。

精製ｔ−PAの非還元型SDS−PAGEは、第３図の分子量（M
r）約67,000のバンド（Ｖ）及びいくつかの蛋白質混入
物とｔ−PAの複合体と思われるMr約98,000の小さなバン
ド（Ｑ）を示している。かくして３つのモノクローナル
抗体マトリツクス64-3,54-2,79-7（それぞれレーン8,9,
10）で精製されたｔ−PA（バンドＶ）は、特願昭62-867
51号明細書に記載されたサイズ排除HPLCにより、更に均
質に精製することができる。79-7イムノアフイニテイー
マトリツクスを再び使用した場合にも、両者において同
様の精製倍率が得られていることを示す表Ｖの結果か
ら、同様に有効な結果が得られたことが証明される。他
の原料由来のｔ−PAを精製した場合にも実質的に同様の
結果が得られた。

結腸ｔ−PAに対するモノクローナル抗体の結合親和性に
ついて前記した方法により評価し、ADIから入手したBow
esメラノーマｔ−PA対する結合親和性と比較した。得ら
れる結果は表VIに示した通りである。Bowes t−PAに対
するPAM−３モノクローナル抗体の結合親和性の評価
は、技術パンフレツトADI 84-08-08でADIから公表され
ている値と一致した。同様に、表VIIに示したように、
３つのモノクローナル抗体63-4,54-2,79-7の相対的結合
親和性をPAM−３モノクローナル抗体と比較した。

表I-VIIに示したデータについての簡単な要旨は次の通
りである。

表Ｉは、５つのハイブリドーマから誘導された抗体の特
性及び特異性を示したものである。

表IIは、３つのモノクローナル抗体の精製工程を示した
ものであり、精製工程でのモノクローナル抗体及び他の
蛋白質の経緯が示されている。

表IIIは、モノクローナル抗体を用いるイムノアフイニ
テイークロマトグラフイーにより、ｔ−PAとウロキナー
ゼの完全な分離が達成されることを示している。ウロキ
ナーゼはカラムを通過するがｔ−PAはカラムに保持され
る。ｔ−PAは後にカラムから溶出され、ウロキナーゼの
混入は検出されない。

表IVは、固相支持体に吸着された３つのモノクローナル
抗体のカラムによるｔ−PAの精製工程を示したものであ
る。

表Ｖは、表IVに記載された同じカラムにより精製したｔ
−PAの第２のバツチを示したものであり、モノクローナ
ル抗体79-7から得たカラムは再使用することができるこ
とを示したものである。

表VIは、結腸ｔ−PAとBowes t−PAに対するモノクロー
ナル抗体63-4の結合親和性をPAM−３と比較したもので
ある。ADIより公表されているBowes t−PA対PAM−３結
合定数と、本発明で測定した結合親和性とは一致する。

表VIIは、モノクローナル抗体の結腸ｔ−PAとBowes t−
PAとに対する相対的結合性を比較したものであり、この
結果から、結合特性の相違により異なつた用途が考えら
れることが判る。

以上に詳述した本明細書の記載から、本発明の思想及び
範囲内の他の各種の例は当業者にとつて自明の事であろ
う。これらすべての他の例も本明細書の特許請求の範囲
内のものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製したモノクローナル抗体の高速液体クロ
マトグラフイーのプロフアイルを示す。 第２図は粒子構造を示す写真であり、モノクローナル抗
体を用いたイムノアフイニテイークロマトグラフイーに
より精製されたヒト結腸線維芽細胞ｔ−PAの、還元型ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
パターンを示す。レーン8,9,10が本発明のモノクローナ
ル抗体を用いて精製したものである。 第３図は粒子構造を示す写真であり、非還元型SDS−PAG
Eパターンを示す。レーン8,9,10が本発明のモノクロー
ナル抗体を用いて精製したものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジットカ ベラ オランダー アメリカ合衆国ミズーリー州，セントルイ ス，キングスベリィ 7114 (72)発明者 ジョン ピーター シャウマン アメリカ合衆国ミズーリー州，カークウッ ド，ラーク アベニュー 1317 (56)参考文献 特開 昭59−5121（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開196226（ＥＰ，Ａ) 欧州特許公開190711（ＥＰ，Ａ) Ｐｒｏｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ, ６（1983）Ｐ．191−194

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セルラインATCC HB 9155,ATCC HB 9156,及
   びATCC HB 9157からなる群より選ばれるハイブリドーマ
   セルラインによって産生されるモノクローナル抗体であ
   ってヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノーゲン活性
   化因子に対して特異的なモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】セルラインATCC HB 9155,ATCC HB 9156,及
   びATCC HB 9157 からなる群より選ばれるハイブリドー
   マセルラインによって産生されるモノクローナル抗体で
   あってヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノーゲン活
   性化因子に対して特異的なモノクローナル抗体の公知の
   量を、ｔ−PAを含む生物学的試料と接触せしめ、得られ
   る吸着されたモノクローナル抗体の量を測定することを
   特徴とする、ｔ−PAを含む生物学的試料中のｔ−PAレベ
   ルを測定するイムノアッセイ法。