JPS6349096A

JPS6349096A - ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体及びその用途

Info

Publication number: JPS6349096A
Application number: JP62201680A
Authority: JP
Inventors: ジョセフ　フィーダー; ニコラオス　コンスタンティノス　ハラカス; ジットカ　ベラ　オランダー; ジョン　ピーター　シャウマン
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-12
Publication date: 1988-03-01
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0753758B2; US4833085A; ZA875974B; AU598572B2; AU7679687A; CA1294901C; EP0257010A2; EP0257010A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は、ヒト結腸線維芽細胞由来の組歎プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ　）に対して特異性’ｋＴｈ
することを％似とする、ハイブリッドセルにより産生さ
れるモノクローナル抗体に関する。

更には本発明は、ｔ−ＰＡの精製法及びｔ　−ＰＡのイ
ムノアッセイ法におけるモノクローナル抗体の用途に関
する。

Ｋ６ｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｊｎによって初めて開発
されたハイブリドーマ技術の出現により、今日では、あ
る結合部位に対して一定の親和性ヲ有し本質的に均質な
組成のモノクローナル抗体を産生ずることが可能である
。これら開発者によるマウスハイブリドーマの産生につ
いては、Ｎａｔｕｒｅ　２５６　＋４９５−４９７　（
１９７５）及びＥｕｒ−Ｊ。

ＩｍｍｕｎｏＬ　６．５１１−５１９　（１９７６）に
記載されている。この方法によれは、組織培養したマウ
スミエローマ細胞を、免疫化マウスの肺臓細胞と融合し
て、大量の単一な抗体分子を産生ずるハイブリッドセル
（ｆ−得ている。細胞融合は一般的にはポリエチレング
リコール（ＰＥ（）　）の存在下に実施され（Ｇａ１ｆ
ｅら、　Ｎａｔｕｒｅ　２６６　＋　５５０−５５２（
１９７７））、次いでＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、ア
ミノプテリン及びチミジン）にニジ融合細胞が選択され
る（　Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ　、　５ｃｉｅｎｃｅ１
４５．７０９−７１０（１９６４））。

いかなる外来抗原を用いた場合でも、大体は免疫化を行
なうことができるが、多くの困難が生じ、場合に応じて
の変更が必要でちる。ある特定のハイブリドーマを調製
する場合、目的とするハイブリドーマが得られるか否か
、得られた場合それが抗体’ｔｋ生するか否か、そして
得られる抗体が目的とする特異性を有するか否かについ
ては何んらの保証もない。

ボウス（Ｂｏｗｅｓ　）メラノーマ培養細胞、ヒト血漿
及びヒト子宮組線由来のｔ−ＰＡに対するモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマの調製に関して多くの
報告がなされている〔例えば、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら
、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　１１　（５ｕｐｐ、　１
　）ｐ、　７５　、　ａｂｓｔｒａｃｔ　１３４　（１
９８２）　；ｐｅ　ｔｔｅｒｓｓｏｎらｒ　Ｐｒｏｇ、
　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　６　＋　１９１−１９４
　（１９８’３　）　；　Ｎ１ｅ１ｓｅｎらｌ　Ｔｈｅ
　ＥＭＢＯＪ、２（１）、１１５−１１９（１９８３）
；Ｍａｔｓｕｏらｅ　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、３６，
５１７−５２６（１９８４）　；　ＭａｃＧｒｅｇｏｒ
ら＋　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓ。

５３　（１）　＝　　４５−５０　（１９８５）　：　
　５ｃｈｌｅｅｆら、　ｒｂｌａ−、５３（１）　、　
１７０−１７５（１９８５）　；　Ａｎｇｌｅｓ−Ｃａ
ｎｏ　、　Ｂｌｏｏｄ　６６　（４）　。

９１３−９２０　（１９８５）　；　Ｈｏｘｖｏｅｔら
。

Ｂｌｏｏｄ　６７　（５）　−１４８２−１４８７（１
９８６）；及び１９８４年１月１１日公開のＵＫ特許出
願Ｃ）Ｂ２，１２２．２１９）。これらのハイブリドー
マ技術用いてモノクローナル抗体を産生じ、このモノク
ローナル抗体がＢｏｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡＣＩｎ　
ｖｊ　ｔｒｏ　Ｍ製に使用されている〔例えば、Ｅｊ　
ｎａｒｓｓｏｎら、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ　８３０　！１−１０　（１９８５）　
；　ＲｅａｇａｎらＪ　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｒｅｓ、４０．１−９（１９８５））。Ｂｏ　Ｗｅ　ｓ
メラノー７に対するこれらモノクローナル抗体ノいくつ
かは、例えば、Ａｍｅｒｊｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃａ社（ＡＤＩ　、　（）ｒｅｅｎｗｉｃｈ　＋　Ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　）がら入手することができる。

最近、本発明者のうちの６名と他の発明者によって、ヒ
ト結腸線維芽細胞由来ｔ−ＰＡｔ−ｉ＋４製する方法が
開発された（特願昭６２−８６７５１号明細書）。これ
らｔ−ＰＡのユニークで異種のグリコジル化パターンに
ついては、本発明者のうちの１名と他の発明者による特
願昭６２−４２４３８号明細書に記載されている。これ
ら明細書の記載は本明細書に引用する。

Ｂｏｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡに対するモノクローナル
抗体が結腸組織のｔ−ＰＡを認撤することが’ｒｉｓｓ
ｏｒｔ及びＢａＣｈｍａｎによって報告されているが（
Ｐｒｏｇ、　Ｆｊｂｒ：１ｎｏｌｙｓｉｓ　６　＋　１
３３−１３５（１９８３））、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−
ＰＡに対するモノクローナル抗体についてはこれまで報
告されていない。

本発明の要旨本発明によれば、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−ＰＡに対して
特異性を有することを特徴とする、ハイブリッドセルラ
インによって産生される新規モノクローナル抗体が提供
される。かかる抗体は、ｔ−ＦＡの精製及びイムノアッ
セイ（′こ有用でちる。

ｔ−ＰＡ’（ｉ−含む生物学的試料からのｔ−ＰＡの精
製は、固相支持体に結合しておジｔ−ＰＡ金選択的に吸
着することのできる本発明の新規モノクローナル抗体を
含む免疫吸着カラムに該試料を通すことからなるイムノ
アフイニテイクロマトグラフイーによって笑施すること
かできる。

ｔ−ＰＡｉ含む生物学的試料中のｔ−ＰＡレベルを測定
するｔ−ＰＡイムノアッセイは、ｔ−ＦＡを含む生物学
的試料全公知の量の本発明の新規モノクローナル抗体と
接触せしめ得られる吸着・されたモノクローナル抗体の
量を測定することによって失施することができる。

これら抗体を産生ずるのに使用される好ましい６つのハ
イブリッドセルラインが得られ、これらはセルラインＦ
Ａ６３−４．ＰＡ５４−２及びｐｐ、７９−７と命名さ
れた。以後本明細書においては、これらセルラインは”
ＰＡ″の接頭語を省略して単に奇骨によジ略称する。こ
れらノ・イブリッドセルラインの単離品は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌ
’ｌｅ　ｅＭａｒｙｌａｎｄ　）に永久保存の形でを託
されており、受託奇骨としてＡＴＣＣＨＢ　９１５５　
、　ＡＴＣＣＨＢ　９１５７及びＡＴＣＣＨＢ　９１５
６がそれぞれ付与されている。

これらセルラインのサンプルは、特許付与日から肢を託
機関への要求に工６じて公衆に付与される。

本発明の抗体はヒト結腸線維芽細胞ｔ−ＦＡに対して特
異性を有し、かかるｔ−ＰＡはヒト正常結腸繊維芽細胞
セルラインＣＣＤ　−１３Ｃｏから単離することができ
る。このセルラインは、アメリカン・タイプ・刀ルチャ
ー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉ工１ｅ　＋　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ　）に永久保存の形で制限なしに寄託され１お
ジ、受肚奇骨ＡＴＣＣＣＲＬ　−１４５９が付与されて
いる。このサンプルは、該寄託機関′＼の袂求に応じて
公衆に付与でれる。

本発明の詳細な説明を形成すると考えられる対象事項を指摘しＤ）Ｊ確に主
張するか、一方矢の如き図面を伴った明細書の記載によ
って本発明がよりよく理解きれるものと信ずる。

第１因は、不発明の一態様である、プロティンＡ−セフ
ァロースアフィニティーカラムによ！７精製し次いでＢ
ｉｏ−Ｃ｝ｅｌ　ＴＳＫ　ＤＥＡＥ−５−ＰＷイオン交
換｝｛ＰＬＯカラムで精製した、ヒト結腸線維芽細胞ｔ
−ＦＡに対するモノクローナル抗体の高速液体クロマト
グラフィー（　ＨＰＬＣ　）のプロファイルを示す図で
ある。

第２図は、ＣＮＢｒによってセファロースに吸着された
、ヒト結腸線維芽細胞ｔ−ＰＡに対する本発明の三つの
態様であるモノクローナル抗体（レーン８，９及び１０
）’に用いたイムノアフイニテイ−クロマトグラフイー
により拍゜製されたヒト結ｙｉｉ５線維芽細胞ｔ−ＰＡ
の、還元型ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
デル電気泳動パターンを示す図である。

第３図は、第２図の３つのモノクローナル抗体の、非還
元型ＳＤＳ−ＰＡ．ＧＥパターンを示す図である。

マウス全免疫するのに用いた最初のｔ−ＰＡ抗原は、最
終精製工程においてＴＳＫ　３　０　０　０　ＳＷサイ
ズ排除ＨＰＬＣ力ラムを用いて２回精製した（カラムに
２回通した）以外は、特願昭６　２　−　８６７５１号
明細書の例２の表ｒに記載されたと同様の材料からなる
バッチから得、同様の精製工程により精製した。これら
の精製工程は次のステップからなる。即ち、ヒト正常結
腸線維芽培養細胞ＣＣＤ−１　８Ｃ。

（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　−　１　４　５　９　）の適正化
（　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地を、亜鉛キレート−
アガロースを用いた第１のアフィニティークロマトグラ
フィーに付し、次いでコンカナバリンＡ−アがロースを
用いた第２のアフィニティークロマトグラフィーに付し
、次いでＴＳＫ　３　０　０　０　ｓ　ｗサイズ排除高
速液体クロマトグラフイーに付す工程からなる。最終的
に得られるｔ−ＰＡサンプルの特性は次の通やであった
。

容量＝　３　”　（　（　Ｈ２Ｏ　＋　０．０　１％Ｔ
ｗｅｅｎ”　８　０　）浴液〕：蛋白質濃度＝　０．３　ｍｉｐ／　ｍｂ　〔Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ　、　Ａｎａｌ。

Ｂｊｏｃｈｅｍ．　７　２　、　２　４　８　−　２　
５　４　（　１　９　７　６　）に記載された方法によ
り測定した。〕：プラスミノーケ゛ン活性化活性−４８
０プラウ（Ｐｌｏｕｇ　）単位／！ｎ１ＣＰＡスポット
アッセイ法（特願昭６２−８６７５１号明細書）によジ
測定した〕：ｔ−ＦＡ抗原”：：　０．１５　＃　／　ｍｂ　（５Ｄ
ｓ−ｐＡｃ＋ｇ法（特願昭６２−８６７５１号明細書）
によシ評価した純度は５０係であった。〕。

マウスの免疫化マウス６匹（雌性ヤングアダルトＢＡＬＢ／Ｃ。

ＢＹＪ　）を、次の如くにして皮下注射して免疫化した
。即ち、完全フロインドアジュバント〔ミコバクテリア
を用いた油中水型エマルジョン（ＤａｖｌＳら、　Ｍｊ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　、　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　
、　Ｈａｒｐｅｒ及びＲｏｗ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　
＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　ＮＹ　＋　１９８０　＋ｐ
ｐ、４３６−４３７））０−１μ中に含有せしめた上記
ｔ−ＰＡ抗原を、それぞれのマウスの背部及び右側の側
ａ部に２回皮下注射して、該ｔ−ＰＡ抗原１５μｇ全そ
れぞれのマウスに投与した。２週曲後に、非完全フロイ
ンドアジュバント（ミコバクテリアを用いない油中水型
エマルジョン）を用いる以外は同様にして、前回と異な
る背部及び左側の側腹部に投与した。更に２週間後、ｔ
−ＰＡ５０μｇを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ
　＝０．０１−０．０２　Ｍリン酸ナトリウム、　０．
１５　ＭＮａＣ６，ｐＨ６−８−７−４）溶液０．’２
！Ｊ−ｅ腹腔内に投与して、それぞれのマウスを最終的
に感作せしめた。６日後、細胞融合に資するため肺臓全
取〕出した。

Ｄａｖｉｅの方法〔ハイブリドーマ：産生試薬の改良＋
　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ］ｅｗｓ　
＊　３７　（１）　＋１１５−１１８（１９８２））に
本質的に従って、免疫屏風細胞を、融合パートナ−であ
るＳｐ２／１０−Ａｇ１４ばエローマと融合せしめた。

Ｓｐ２１０−Ａｇ１４は、Ｓｃｈｔｘｌｍａｎら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２７６　、２６９−２７０（１９７８）に
定義された、ＢＡＬＢ／Ｃ由来のよく知られたセルライ
ンである。Ｉｇ鎖を合成しないこれらの細胞は、Ｂａ５
ｅｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏ−１
０ｇｙから人手することができ、またアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションから受託奇骨ＡＴＣＣＣ
ＲＬ−１５８１として入手することができる。融合の最
良の結果を得るためには、融合パートナ−として、１５
％Ｈｙｃｌｏｎｅ胎児牛血清を含む培地での対数増殖期
にあるｓｐ２を用いることが必要であった。融合前３日
間で毎日、５ｐ２１１ｉｆｌ胞を５Ｘ１０５セル／成に
希釈してＴ−７５フラスコに入れ全ｉｔｌｓｍととした
。細胞融合後、細胞を９６ウ工ルプレート６個に分注せ
しめ、支持細胞としてヒト包皮線維芽細胞を、約６０セ
ル／ウエルの量で加えた。１５％Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＦＢ
Ｓ　（胎児牛血清）を含むＨＡＴ選択培地で、新規ノ・
イブリッドセルの生育が支持きれるウェル全てを注意深
く選んだ。接種した６００ウエルのうち、４００ウエル
（７５％）中に生育したハイブリドーマが含まれており
、このうち１５０ウエルについて、ＥＬＩＳＡ法（酵素
結合免疫吸看測定法）により、ｔ−ＰＡに対するモノク
ローナル抗体産生をスクリーニングし、１５ウエル（１
０％）が陽性を示した。

ＥＬ工ＳＡ　法は、不質的にはｇｎｇｖａｌｌ及びＰｅ
　ｒｌｍａｎｎの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１１０９，
１２９−１３５（１９７２））に従って実施した。選択
したノ・イブリドーマは、Ｂ１５ｈｏｐの方法（Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　、
　　４６　、　４７−５１　　（１９８１）　）及びＤ
ａｖｉＳらの方法（Ｉｂｊｄ、、　５０．１６１−１７
１　（１９８２））に本質的に従ってサブクローン化し
た。

上記の如くシて調製されたｔ−ＰＡ陽性ノ・イブリドー
マのうち５つのハイブリドーマがサブクローン化石れ、
これらは後述する表■に示した即き特徴を示した。全て
のクローンは、適度にモノクローナル抗体を産生した。

即ち、１ｇＧ１アイソタイプのモノクローナル抗体１０
−２０μ夕／廐（適正化培地ｉ　ｍｅ当り１０−２０μ
夕のモノクローナル抗体）全産生した。５つのモノクロ
ーナル抗体全ては、ＢｏＷｅＳメラノーマｔ−ＰＡと交
差反応したがウロキナーゼ（ｕ−ＦＡ）とは反応しなか
った。

モノクローナル抗体のうち６つを選んで、１−ｐＡ精製
及びｔ−ＦＡイムノアッセイの用途について更にテス）
ｋ行なった。それぞれのクローン６３−４．５４−２．
７９−７からの適正化培地５００Ｍｋ用いて、プロティ
ンＡ−セファロ−ｐカラムによりモノクローナル抗体を
単離し、次いでこれら金、シアノデンブロマイド活性化
セファロースに結合せしめて免疫吸着カラムを調製した
。

ＣＣＤ　−１８ＣＯ結腸線維芽細胞の適正化培地から分
離したｔ−ＰＡｉ、亜鉛キレート−セファロース６Ｂ’
を用いた第１のアフィニティークロマトグラフィー次い
でコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂを用いた第２の
クロマトグラフィーによシ精製しく％願昭６２−８６７
５１号明細曹）、得られた部分精製ｔ−ｐＡ５．６３−
４モノクロ一ナル抗体が結合したカラムに通し、ＫＳＣ
Ｎで俗出し、６つの溶出画分全還元型５ＤＳ−ＰＡ（）
Ｅで分析した。

ｉＭ　ＫＳＣＮ画分：　ｔ−ｐ　Ａ＊　Ｏｔ２Ｍ　ＫＳ
ＣＮ画分：１不鎖及び２重鎖ｔ−ｐＡ；４Ｍ　ＫＳＣＮ
画分：１重鎖ｔ−ｐＡ、７５係以上。

ドデシル懺酸ナトリウムポリアクリルアミドｒルを用い
て評価した所、用いた材料は純粋であり、後述スるウェ
スタンプロット法による測定ではウロキナーゼ゛の混入
が検出されなかった。この予備的なテストの結果から、
６３−４モノクロ一ナル抗体に、２本鎖蛋白質よりもい
く分１本鎖蛋白質とよく結合することが判る。更に進ん
で行なうテスト用に十分な量のモノクローナル抗体を得
るために、６つのハイブリドーマ（６３−４，５４−２
及び７９−７）全１０ｔにスケールアップし九本明ａＵ
曹におけるヒト結腸繊維芽細胞ｔ−ＦＡに対するモノク
ローナル抗体を評価するため、商業的に入手し得るＢｏ
ｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡ並びに結腸ｔ−ＦＡの精製に
関して、本発明のモノクローナル抗体とＢｏｗｅｓ　ｔ
　−Ｐ　Ａに対する商業的に入手し得るモノクローナル
抗体調製物（ｐＡｔＡ−１）との間で比較実験を行なっ
た（　ＰＡＭ−１及びＢ□ｗｅｓｔ−ＦＡは、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｄｊａｇｎｏｓｔｉｃａ　ｌ　Ｉｎｃ。

（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ　＋　ＣＴ　（ＡＤＩ　）から購
入しり。例えは、ＡＤＩ　カら入手した、’７”ル１．
７　紅当、ｊ；＋　ＩｇＧ　１０′Ｉｎ９を含むＰＡＭ
　−ｉ−セファロースバイアルを、結腸ｔ−ＰＡの透析
したコンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ　）溶
出画分２５酎と共に室温で４時間ゆっくりと撹拌した。

ＣｏｎＡ　ｔ　−Ｐ　Ａ画分は本質的には特願昭６２−
８６７５１号明細書に記載された方法によシ調製した。

即ち、ヒト正常結腸森維芽培養細胞ＣＣＤ−１３Ｃｏの
適正化培地を亜鉛キレートアガロースを用いた第１のア
フィニティークロマトグラフィーに付し、次いでＣｏｎ
　Ａを用いた第２のアフィニティークロマトグラフィー
に付して調製した。溶液を濾過し、洗浄して小をなカラ
ムに注いだ。ＰＢＳ及び０．２５　Ｍ　ＫＳＣＮで洗浄
後、ｔ−ＰＡを１．６　＞ａ　ＫＳＣＮで溶出せしめた
。本明細曹に記載した方法で単離されたモノクローナル
抗体を用いて、カラム、バッチ吸増法及び溶出試薬を変
えて同様のテストを繰り返した。またセファロースに成
層した抗体の濃度を変えた場合、ｔ−ＰＡのｂ出に用い
るＫＳＣＮの濃度を変えた場合、あるいはｔ−ＦＡとチ
ャージに用いた抗体との比？変えたち６合についてもテ
ストし、またバッチ対カラム法についての、培地中のｔ
−ＰＡｉ結合せしめる効果についてもテストした。

この方法は以下の如く修正はしたが、本質的には、ＲＢ
ｎａｒｔ及び５ａｎｄｏｖａｌ　＋　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏ１１０４（Ｃ）、４５５−４６０（１９８４）
に記載された方法に従って実施した。Ｉ　Ｆ４のｔ−Ｐ
Ａ及びｕ−ＰＡ（見掛は分子量、　Ｍｒ＋　５４．ＯＤ
　Ｏ。

Ｃａｌｂｊｏｃｈｅｍ社＋　Ｌａｊｏｌｌａ　、　Ｃａ
１ｉｆ、　）　’；ｚ　５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。Ａ
ＤＩから入手しだＢｏｗｅｓメラノーマｔ−ＰＡ、及び
本発明のモノクローナル抗体を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより精製したヒト結腸繊維芽細胞ｔ
−ＰＡを用いた。電気泳動後、蛋白質を活性化ペーパー
上に電気的にプロットし、商業的に入手し得る抗ウロキ
ナーゼ抗体（Ｃａｔ、７Ｍ６２００．抗ヒトウロキナー
ゼ抗体。

ラビット血清、ミドリ十字社（日本、大阪）〕の１　：
３０００希釈液と反応せしめた。貼合抗１：１・は、１
２５Ｉ−プロティンＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ
ｕｃｌｅａｒ社。

Ｂｏｓｔｏｎ　、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）で
ラベル化されていた。洗浄後、放射標識化された免疫標
識化ペーパーをＸ線フィルムにさらした。Ｘｉフィルム
上の黒いスポットからウロキナーゼ全検出することがで
きた。

Ｐａｒｍａｃｉａ社から供給を受けた、アガロースビー
ズ上に吸着せしめたプロティンｐ’　ｋ　、免疫グロブ
リンの簡単なワンステップ梢製法用のマ）　ＩＪソック
スして用いた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社（Ｒｉｃｈｍｏｎａ　、　Ｃａ’１ｉｆｏｒｎｉ
ａ　）よジキットの形態で商条的に入手したＡｆｆｉ−
（）ｅｌ［有］プロティンＡ　ＭＡＰＳ緩衝液シ液液ム
？用いてクロマトグラフィーを実施した。即ち、適正化
培地をパインディングバッファーで希釈し、希釈した適
正化培地？プロティンＡ−セファロースのカラムに通し
、過剰の蛋白質を洗い流し、次いで結合免疫グロブリン
ヲ賂出緩衝液を用いて溶出せしめてクロマトグラフィー
を実施した。

結合現象Ｖａｚ　Ｈｅｙｎｊｎｇｅｎら＋　Ｊ　−Ｉ＋ｎｍｕｎ
ｏ１．　Ｍｅｔｒｈ−６２ｐｌ　４７−１５３（１９８
３）に記載された抗体希釈法により、結合親和性全評価
した。即ち、酵素結合免疫吸着測定法〔ＥＬＩＳＡ　、
　Ｅｎｇｖａ’ｌ及びＰｅｒｌｍａｎ　、　Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　１０９　ｅ　１２９−１３５（１９７２
））により、吸着したｔ−ＰＡへの、モノクローナル抗
体の一連の希釈液の結合を測定した。Ｔｒｊｓ　（トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）　０．６０５　
ｇ、塩化ナトリウム４−０５　、！ｉ’及びＨＣｌでｐ
ｌ−１８に調整されたＴｗｅｅｎ　２０　（ポリソルベ
ート２　Ｏｅ　Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ、　ＬＯｕｊＳ＋　
Ｍｉｓｓｏｕｒｊ））１Ｍから構成され５００１１１７
に希釈された洗浄緩衝液中に精製ｔ−ｐＡｋ１６０ｎｇ
含む溶液５０　μｔｔ１９６クエル組懺培妥グレード（
湿潤性）７°ラステイツクプレートの各ウェルに加えた
。プレート全上記し、室温で乾燥保存した。ウェル葡使
用直前に洗浄緩衝液で洗った。洗浄しプレーｔｆ軽く杓
って過剰の緩衝准を除いた後、１０〜／廐生血清アルブ
ミンを含む抗体の上記した緩衝液の一連の２倍希釈液５
０μｔ　ｋ　、一対のウェルに加えた。プレートｔカバ
ーし、６７℃でインキュベートした。２時間後、プレー
ト全上記した洗浄緩衝液で６回洗い、軽く打って過剰の
液を除いた。牛血清アルブミンを含むアルカリホスファ
ターゼ結合ヤヤ抗マウス免疫グロブリン緩衝液の１　：
　２００希釈液５０μｔ２、各ウェルに加え、プレート
を３７’Ｃで２時間再びインキュベートシタ。７’　ｖ
　−トラ、無血清緩衝液で６回洗浄し、次いでジェタノ
ールアミン４８Ｍ及び０．２４　ｍＭ塩化マグネシウム
からなる溶液（ＰＩ−１９，８）全貌イオン水で希釈し
て５　Ｑ　Ｑ　ｍｙ、とした浴液中に１１ｎ９／　ｒｕ
ｅパラニトロフェニルホスフェート全含む溶１１００μ
ｔ２、各ウェルに加えた。室己で６０分間発色せしめて
、直ぐに自動プレートリーダーで４１０　ｎｍで測定す
るか、あるいは後で測定するために２Ｍ水酸化す）　Ｉ
Ｊウム５０μｔを加えて発色全圧めた。得られる相対的
結合性（親和性）パラメーターは、後述する表ｖ１及び
〜口に示した通りである。

上記した事項により、ＥＬＩＳＡ型テストでｔ−ＰＡの
レベルケ測定する免役測定法における本発明のモノクロ
ーナル抗体の用途について既に説明てれている。このテ
ストでは、ｔ−ＰＡがプラスティックプレートなどの固
相担体表面に吸着され、次いでこの吸着ｔ−ｐ　ｐ、と
モノクローナル抗体とを反応せしめる。次いで吸着され
たモノクローナル抗体の量を、酵素標識化第２抗体ケ用
いて分光光度計により測定する。適当な酵素基質を加え
た時、最Ｐ、ｆＧ液の光学濃度は、もとの試料中のｔ−
ＦＡの址に直接比例する。

本発明の免疫測定法の典型的な例では、結腸線維子細胞
ｔ−ＦＡに対するモノクローナル抗体を用いてプラステ
ィックウェル七被覆し、このモノクローナル抗体により
、ウェルに加えられた試料、例えは測定すべき未知濃度
のｔ−ＰＡｉ含む患者の血清試料、既知濃度のｔ−ＰＡ
ｉ含む標準コントロール浴液試料などの試料中のｔ−Ｐ
Ａが捕えられる（結合される）。かくして形成きれたウ
ェル中の反応複合体に、ウェルに適用ちれた酵素標識化
第２モノクローナル抗体と史Ｖこ反応せしめられる。該
複合体に結合した第２抗体の量は、もとの試料のｔ−Ｐ
Ａｉ度に比例する。発色性基質ｔウェルに加えて一定の
特定反応時間後の光学濃度を測定することによシ、酵素
標識化抗体を検出することができる。次いでそれぞれの
アッセイについて作成した標準曲線からｔ−ＦＡ濃濃度
読み取ることができる。

電気泳動ポリアクリルアミドゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ　２２７　、６８０　（１９７０）　）に本
質的に従って実施した。還元型グルは、ドデシル硫酸ナ
トリウム緩衝液中のメルカプトエタノール又はジテオス
レイトールを用いて調製した。

通常のｔ−ＰＡススクリーニング法して、特願昭６２−
８６７５１号明細誉に記載されたＰＡスポット測定法、
あるいはＷａｌｌｅｎら、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｊｏｃｈｅｍ、　１３２　、６８１−６８６　（１９
８３）に記載されたＳ　−２３２２（Ｄ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−バラニトロアニリド）又はＳ　−２４４４
ＣＤ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−バラニトロアニリド）
　（Ｋａｂｊ社の酵累基買）？！−利用したマイクロタ
イタープレートでの直接比色分析測定法を使用した。Ｆ
Ａスポット測定法では、フィブリノ−ｒン、スロンビン
及びプラスミノーゲンを含むペトリ皿中のアガロースグ
ル上に試料５μｔ’ｔ（適用することによって測定した
１成当りのＰｌｏｕｇ単位で、活性が表現される。

曇ったグルが、ｔ−ＰＡ活性に比例した面積で透明にな
る。これら両者の測定法は、ウロキナーゼ又は商業的＋
−ＰＡ溶液あるいはＧａｆｆｎｅｙ及びＣｕｒｔｊｓに
よって定義された如き（Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔ、　５３　、１３４−１４０　（１９８
５）　〕ＷＨＯ標準ｔ−ＦＡに対して規格化されている
。

ｔ−ＰＡ？５含む調製物中のｕ−ＰＡの定量のために、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｊｍ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社（Ｉｎｄｊａｎａｐｏｌｉｓ、　　Ｉ
ｎｄｉａｎａ　（Ｃａｔ、　１６ろ７８−４６１）：］
から商条約に入手し得る基質Ｃｈｒｏｍｏ−ｚｙｍ　　
ＰＬ　（トシルーグリシルーゾロリルーリシン−４−ニ
トラニリドアセテート）金、ＲＩ　Ｊ　ｋ　ｅ　ｎ　＋
１ヒト組域のプラスミノーゲン活性化因子”。

Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、ライデン大学、ネーブル
ランド２ｐ、７０（１９８０）に記載された基質Ｓ　−
２３２２と共に用いた。

Ｍａｎｃ　ｊ　ｎｉらによって開発されたこの測定法［
：　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ−２，２３５−２５４（１９
６５））は、俗解性抗原がその特異的抗体と適当な割合
いで反応する時に目に見える沈降物が形成されるという
原理に基いている。この測定法では、工ｇＧ１免疫グロ
ブリンに対する抗体がアがロースケ゛ル中に混入されて
おυ、測定しようとする免疫グロブリン？、かかるデル
を切って作成したウェル中に置く。免役グロブリン試料
がウェルから外へ向って放射状に拡散し、抗体と反応し
て目に見える沈降物の輪が形成される。試料中の抗原が
全て反応する１で沈降物の輪が続いて形成され、そして
最後に広い輪の状態で再び浴屏する。この時点で、目に
児える輸の面積は、ウェルに導入された免役グロブリン
に直接関連している。輪の面接？、同時に行なったマウ
スＩ　ｇＧ’ｌの標退浴゛散の輪の面積と比較する。実
踪の値は、グラフペーパー上にるるいは数学的に作成し
た標準曲線から決定される。

ＴＡＧＯ社（Ｂｕｒｌｊｎｇａｍｅ　、　Ｃａ１ｉｆｏ
ｒｎｉａ　）から入手し得るプレート及び標準物音用い
た。

Ｐｈａｒｍａｃｊａ社から供給された、セファＯａ（ア
ガロースビーズ）上に成層されたプロティンＡ’（＋−
，モノクローナル抗体の簡単なワンステップ精製用のマ
ｌ−１ｊツクスとして用いた。前記した如く、これらの
モノクローナル抗体は、所望の特性を有するか否かによ
って選択されたハイブリドーマの組織培養によ＃）産生
されたものでちる。Ｂ１０−　Ｒａｄ社より供給を受け
たＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　、ｙ’　ＯティアＡＭＡ　ＰＳ緩
衝液キット（Ｃａｔ、Ａ１５３−６１６０　。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、　Ｃａ１ｉｆ
ｏｒｎｉａ　）　：）　ｋ用いて、クロマトグラフィー
による精製ケ行なった。

ハイブリドーマがモノクローナル抗体全分泌した組織培
養培地を、等量のパインデイングバソファー（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ社うで希釈し、プロティンＡ−セファロースアフ
ィニティーカラムに江いた。対象とするモノクローナル
抗体を含む免役グロブリンがプロティンＡ−セファロー
スに結合された。カラム容権の約１５倍のパインディン
グバッファーを用いて、他の蛋白質及び不要な化学物＊
をカラムに結合した”モノクローナル抗体から洗い流し
、次いで溶出緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で船出した。

各画分のＵＶ吸光度’ｒ　６＋１１定してｆ７製物全追
跡し、クーマン−蛋白％　（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

７２：２４８−２５４（１９７６））分析及びＭａｎｃ
ｊｎｊの方法（ＩｍＩｎｕｎＯＣｋｌｅｍｊＳｔｒｙ＋
　２　：　２３５−２５４（１９６５））による放射免
疫拡散測定法（ＴＡＧＯ社（Ｂｕｒｌｊｎｇａｍｅ　）
　ｌ　ＣＡ　Ｉ　Ｃａｔ、　／ｌ６１３４６）により蛋
白質全定量してマウスＩｇ（）１の量′に測定し、第１
図に示しだ如くアガロースデル電気原動及びＨＰＬＣに
より純度全チェックした。

第１図では、プロティンＡ−セファロースアフイニディ
ー力ラムで精製したモノクローナル抗体（６ろ−４）５
０μｔ（１１９μ９／ｍＬクーマシー蛋白負）紫、　０
．０２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩傭ｎ夜（ｐＨ８，５）
及びＢｊＯ−Ｇｐｌ　ＴＳＫ　ＤｇＡＥ−５−ＰＷ　（
Ｂｊｏ−Ｒａｄ社（Ｒｊｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏ
ｒｎｉａ　）　）イオン父換ＨＰＬＣカラムを用いたク
ロマトグラフィーに何し、０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｚ　（ｐＨ７−０）及び０．３　Ｍ　ＮａＣｔ’ｆ含む
浴液まで上昇する勾配を用いて流速１駐／　ｍｊｎで溶
出せしめた。牛アルブミン、午トランスフェリン及びマ
ウスＩ　ｇＧｌについても同一の条件でクロマトグラフ
ィーを行ない、スタンダードとした〔全てはＳｉｇｍａ
社（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）から商
業的に入手した〕。時間対２８０　ｎｍでの吸光度全プ
フットし、比較のために吸光度スケール全修正した。後
述する表Ｈには、これらの方法ケ用いて得られた相対的
栢裂度が示されている。対象とするそれぞれのモノクロ
ーナル抗体ｋ　ｆＦ４製するために、２０立方センチメ
ートルのプロティンＡ−セファロースを用いた。４°Ｃ
にてクロマトグラフィー全実施した。

以下に示す手法に従って、各モノクローナル抗体のセフ
ァ・−ス■＝トリックスへの吸ｙＭ　ｋ　央ｙ＝した。

１、　　Ｐｈａｒｍａｃｊａ社製の凍結乾燥ＣＮＢｒ活
性化セフ７０−ス４Ｂ約６００Ｉｎ！２ｋ、１ｍＭ　Ｈ
ＣＺ中で少なくとも１５分間没して膨張させた。次いで
焼結ガラスフィルター上で１　ｍＭ　ＨＣｔ１２Ｑｔｎ
ｔ、で洗浄して祭加されていた保存剤及び安定化剤を除
去した。

２、　プロティンＡで精製したモノクローナル抗Ｓ４．
（クローン６３−４．５４−２及び７９−７）２．７　
ｍＩ？のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ　）溶液を、
０．１シ目ＪａＨＣ○３緩衝液（Ｐ）′１８．３）で希
釈して４Ｕとした。

ろ、　ケ゛ルｋ　ＮａＨＣＯ３緩備液約５　ｍｂで洗浄
し、直ぐに希釈モノクローナル抗体と混合し、次いで４
°Ｃの冷室で一晩回転１せながらゆっくりと混合した。

４　ケ９ルを濾過し、１Ｍエタノールアミン（−８）２
０−４０１Ｕに移して２時間室温で放置し、ケ゛ル上の
残った活性部位をブロックした。

ｂ、　　Ｏ−５Ｍ　ＮａＣ２ｋ　冨む０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩２ｊｊＪ液（ｐｌｉ４）でケゞル全洗浄した。

６、　再ひデル全ＮａＨＣＯ３緩伽准で洗浄し、最後に
ＰＢＳで平衡化した。

ス　小さなポリスチレンカラム（８龍、　１．Ｄ、。

Ｐｊｅｒｃｅ　　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　社　製　（Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ、　　　１１１コ、ｎｏ１ｓ＋ＣａＬ腐
２９９２０）腐金９９２０ノクローナルアフィニティー
カラムを保持し、ガラスへのｔ−ＰＡの疎水性結合を阻
止した。

結腸線維芽細胞ｔ−ＰＡ中のウロキナーゼの混入を評価
するため、亜鉛キレートセファロース６Ｂ次いでコンカ
ナバリンＡ−セファロースを用いたアフィニティークロ
マトグラフィーにより％Ｓ　ｉしたｔ−ＰＡ試料を調べ
た。基ＸＳ−２３２２及びＣｈｒｏｍｏｚｙｍ　ＰＬ　
’（用いた直接比色分析測定法により、２つのプラスミ
ノーケ１ン活注化因子の分子濃度ケ調べた。プラスミノ
ーデン活性化因子全濃度の１．７％がウロキナーゼであ
った。セファロースの如き固相支持体マトリックス上に
吸糸された、ヒト結腸め帷子細胞ｔ−ＰＡに対するモノ
クローナル抗体を用いて、（ａ）−ｕ　−ＰＡＤ性全完
全完全去できるか否か、そして（ｂ）結暢線維芽細紀ｔ
−ＰＡあるいは他のｔ−ＰＡ’ｊ均質に精製することが
できるか否かを決定するのが望ましい。従って、シアノ
ケ゛ンブロマイド活性化セファロースに結合した６６−
４モノクロ一ナル抗体から構成されたモノクローナル抗
体カラムを用いて、試料上火に精製した。溶液中にウロ
キナーゼｒ６性が残存しており、これ全カラムに通過さ
せた。２　）ｖｉ及び４ＭＫＳＣＮ　ｉ用いて、カラム
からｔ−ＦＡ活性のいくつかｒ＝出せしめた（後述する
表ｉ）。ウェスタンプロット法により、溶出画分につい
てｕ−ＰＡの存在全テストした所、イロ」んら検出され
なかった。

かくして精製の主たる目的は達成された。この実験では
、機械上の問題があったため、ｔ−ＦＡの回収ｔは低く
かった。わ”じいての実験では、後述する表■の如く、
他の６つの七ツクローナル抗体を用いて、モノクローナ
ル抗体アフィニティーカラムから９０％以上（ＥＬＩＳ
Ａ法の測定による）のｔ−Ｐ　Ａ　７．！を注がし１収
された。かくして第２の主たる目的が達成され、これに
よりｔ−ＰＡｉ均質に精製することかできる。出発拐料
及び精製画分の５ＤＳ−ＰＡ（）Ｅを行なうことにより
、本発明のイムノアフイニテイ−クロマトグラフイーの
精製能力を証明した。第２図及び第６図には、ＫＳＣＮ
の直線勾配を用いてモノクローナル抗体カラムからＵ出
したｔ−ＦＡの電気泳動パターンが示されている。

第２図及び８３図のレーン１−１０は次の通りである。

レーン１　：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製低分子量７１．
　、Ｊ　７ダード：）、１ｒ９４，０００．ホスホリラ
ーゼＢ　、　０．６４μｐ；Ｍｒ６７＋ＯＯＯ，”牛血
清アルブミ７　、１１．８３μ＃　；　Ｍｒ　４３１０
００１オバルブミ”　＋　１−４７　ｉ’ｇ　ｐＭｒ３
０，０００．カルボニックアンヒドラーゼ。

０．８６μ５；Ｍｒ２０，０００．ソイビーントリプシ
ンインヒビター、０．８μ＆　；　Ｍｒ　１４，０００
　、α−ラクトアルブミン、１．２１μｇ０レーア　２：　ＡＤＩ　Ｂｏｗｅｓ　ｔ−ＰＡ　、　３
μｊＪ　。

レーン６：結腸ｔ−ＰＡのＣｏｎ　Ａ画分、０．５μｇ
０レーン４：水に対して透析したレーン乙のＣｏｎＡ画分
、０．５μｙ０レーン５．６及び７：モノクローナル抗体６６−４．５
４−２．７９−７それぞれからの非結合画分、それぞれ
６μｙ０レーン８，９及び１０：４ＭＫＳＣＮを用いた、レーア
５１６１７それぞれのモノクロ−・ナル抗体からの溶出
液、それぞれ２μｙ０Ｉｘｏｒｒｉｓｓｅｙの１法（Ａｎａｌ−Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　１１７　ｔ３０７−３１０（１９８１））によジ
、５ＤＳ−ＰＡＣ）Ｅを銀発色せしめた。

６つの異なるモノクローナル抗体で精製したｔ−ＰＡの
還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥは、１つの相違点全除いては同
じであった。第２図に示した全てのサンプルの共通点は
、レーン８，９．１０において見掛り一分子量（Ｍｒ　
）約３６キロダルトン（Ｋｄ　）及び６９　Ｋｄに対応
する２つの主要バンド（２及びＸ）が存在したことであ
る。低分子量バンド（Ｚ）には、Ｂａｃｈｍａｎｎ及び
Ｋｒｕｉｔｈｏｆ　、　Ｓｅｍ１ｎｅｒｓ　ｉｎＴｈｒ
ｏｍｂａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　１０
　（１）　＋　６−１７（１９８４）に記載された如き
プラスミン開裂ｔ−ＰＡのＡ鎖及びＢ鎖が含１れでいた
。６９　Ｋｄのバンド（Ｘ）は、非開裂単一鎖ｔ−ＰＡ
に対応している。ＰＡ７９−７で精製しｆｃｔ−ＦＡ（
し−ン１’０）では現われなかった４　９　Ｋｄの第３
番目のバンド（Ｙ）は、フリーｔ−ＰＡ断片あるいは免
疫学的に認識される蛋白質と巴われる。

精製ｔ−ＰＡの非還元型５ＤＳ−ＰＡＣ）Ｅは、第６図
の分子ｉｆ（Ｍｒ）約６７，０００のバンド（Ｖ）及び
いくつかの蛋白質混入物とｔ−ＰＡの複合体と思わわる
Ｍｒ約９８，０００の小さなバンド（Ｑ）ε ８謙でいる。。かくして６つのモノク・−す・・抗体マ
トリックス６４−３．５４−２．７９−７（それぞれレ
ーン８，９．１０）で稍製さ１１たｔ−ＰＡ（バンド■
）は、％９昭６２−８６７５１号明細書に記載されたサ
イズ排除ＨＰＬＣにより、丈に均質に精製することがで
きる。７９−フイムノアフイニテイーマトリックスケ書
ひ使用した場賠合にも、両者において同様の精製材率が得られているこ
とケ示す表■の結果から、同様に有効な結果が得られた
ことが証明される。他の原料由来のｔ　−Ｐ　Ａ　？ｌ
ｃ−稍製した場合にも実質的に同様の結果が得られた。

結腸ｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の結合親和性
について前記した方法により評価し、ＡＤＩから入手し
たＢｏｗｅｓメラノーマｔ−ＦＡ対する結合親和性と比
較した。得られる結果は表ｖ１に示した通りである。Ｂ
ｏｗｅｓ　ｔ　−Ｆ　Ａに対するＰＡＭ−６モノクロ一
ナル抗体の結合親和性の評価は、技術パンフレットＡＤ
Ｉ　８４−０８−０８でＡＤＩから公表されている値と
一致した。同様に、表〜ｒに示したように、６つのモノ
クローナル抗体６６−４．５４−２．７９−７の相対的
結合親和性をＰＡＭ　−３モノクロ一ナル抗体と比較し
た。

表１−　Ｖｌｌに示したデータについての簡単な要旨は
次のＡ９である。

表Ｉは、５つのノ・イブリドーマから誘導された抗体の
特性及び特異性を示したものである。

表■に、６つのモノクローナル抗体の精製工程表量は、
モノクローナル抗体ケ用いるイムノアフイニテイ−クロ
マトグラフイーによ５、ｔ−ＰＡとウロキナーぜの完全
な分離が達成されること？示している。ウロキナーゼは
カラムを通過するがｊ、−ＰＡはカラムに保持される。

ｔ−ＦＡは後にカラムから溶出され、ウロキナーゼの混
入は検出されない。

表■は、固相支持体に吸崩された６つのモノクローナル
抗体のカラムによるｔ−ＰＡの精製工程を示したもので
ある。

表■は、表■に記載された同じカラムにより精製したｔ
−ＦＡの第２のバッチを示したものであり、モノクロー
ナル抗体７９−７から得たカラムは再使用することがで
きることを示したものである。

表ｖ１は、結腸ｔ−ＦＡとＢｏｗｅｓ　ｔ　−Ｐ　ＡＹ
こ対すルモノクローナル抗体６６−４の結合親和性ｔＰ
ＡＭ　−３と比較したものである。ＡＤＩより公表され
ているＢｏｗｅｓ　ｔ　−Ｐ　Ａ対ＰＡＭ　−３結合定
数と、本発明で測定した結合″ａ、和性とは一致する。

ａ　Ｖｔ＋は、モノクローナル抗体の結腸ｔ−ＦＡとＢ
ｏｗｅｓ　ｔ　−Ｐ　Ａとに対する相対的結合性全比較
したものであり、この結果から、結合特性の相違により
異なった用途が考えられることが判る。

宍　　ルＵｔ、−ｐｈ　　　　　　１０　　　　　１０　　　　　
１０　　　　　１ｔ−ｐＡ　　　　１００　　　　　１
０　　　　　１０　　　　１００ａ　：　Ｖａｎ　Ｈｅ
ｙｎｉｎｇｅｎらの方法（Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔ
、ｈ、６２．１　４３−１　５３（１９８３））により
測定した。

以上に詳述した本明細吉の記載から、不発明の思想及び
範囲内の他の各種の例は当業者にとって自明の墨であろ
う。これらすべての他の例も本明細曹の特許請求の範囲
内のものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、精製したモノクローナル抗体の高速液体クロ
マトグラフィーのプロファイル？示す。第２図は粒子構造を示す写真であシ、七ツクローナル抗
体を用いたイムノアフイニテイークロマトゲラフイーに
よジ精表されたヒト結腸線維芽細胞ｔ−ｒ’Ａの、還元
型ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドデル電気
泳動パターンを示す。レーン８，９．１０が本発明のモノクローナル抗体を用
いて精製したものである。第６図は粒子構造を示す写真でらυ、非還元型５Ｏ８−
ＰＡＧＥパターンを示す。レーン８．９．１０が本発明
のモノクローナル抗体音用いて稍シしたものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノーゲン活
性化因子に対して特異的なモノクローナル抗体。
（２）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
を産生することができ、且つセルラインＡＴＣＣＨＢ９
１５５、ＡＴＣＣＨＢ９１５７、又はＡＴＣＣＨＢ９１
５６の同定特性を有するハイブリドーマセルライン。
（３）固相支持体に結合しておりｔ−ＰＡを選択的に吸
着することのできる特許請求の範囲第１項記載のモノク
ローナル抗体を含む免疫吸着カラムに、ｔ−ＰＡを含む
生物学的試料を通すことを特徴とする、ｔ−ＰＡを含む
生物学的試料からｔ−ＰＡを精製するイムノアフイニテ
イ−クロマトグラフイー法。
（４）ｔ−ＰＡがヒト結腸線維芽細胞由来のｔ−ＰＡで
ある、特許請求の範囲第３項記載の方法。
（５）吸着したｔ−ＰＡを、ＫＳＣＮを用いて固相支持
体から溶出せしめる、特許請求の範囲第３項記載の方法
。
（６）固相支持体がアガロースである、特許請求の範囲
第６項記載の方法。
（７）ｔ−ＰＡを含む生物学的試料を、公知の量の特許
請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体と接触せし
め、得られる吸着されたモノクローナル抗体の量を測定
することを特徴とする、ｔ−ＰＡを含む生物学的試料中
のｔ−ＰＡレベルを測定するイムノアツセイ法。