FI89634C - Foerfarande, anordning och kitt foer maetning av vaevnadsplasminogenaktivator-aktivitet - Google Patents

Description

89634

Menetelmä, laite ja kitti kudosplasminogeenin aktivaattorin aktiivisuuden mittaamiseksi - Förfarande, anordning och kitt. för mätning av vävnadspl asminogenaktivator-akti vi tet

Esillä olevan keksinnön kohteena on uusi menetelmä, jolla voidaan mitata kudosplasminogeenin aktivaattorin (jäljempänä käytetään nimitystä t-PA) todellinen aktiivisuus vedessä, ja mittaamiseen käytetty laite ja kitti sekä mittaamiseen käytetty uusi monoklonaalinen vasta-aine. Tarkemmin sanoen esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä, jolla mitataan t-PA:n todellinen aktiivisuus vedessä, jossa menetelmässä käytetään kiinteää faasia, johon on sidottu anti-t-PA-vasta-aine IgG-fragmentti, joka omaa aktiivisuuden johonkin muuhun kohtaan kuin t-PA:n aktiiviseen kohtaan ja joka on spesifinen t-PA:lie lie näytteenä toimivassa kokovedessä tai laimennetussa vedessä, josta plasmaa ei ole erotettu ja jossa menetelmässä mitataan aktivaattorin aktiivisuus kiinteän faasin ja näytteen t-PA:n tuotteessa.

t-PA on eräs seriiniproteaasi, joka ottaa osaa fibrinolyytti-seen mekanismiin. Sen tiedetään vaikuttavan veritulpan muodostumista estävästi liuottamalla ja poistamalla vesisuonessa tai kudoksessa muodostunut fibriini. Kudosplasminogeenin aktivaattoria syntetisoidaan lisää veren endoteelisoluissa ja sitä erittyy ja vapautuu tarpeista riippuen. Se on siten oleellinen faktori veritulpan muodostumisen estämisessä ja veren virtauksen säilyttämisessä. Tästä voidaan helposti olettaa, että korkea t-PA:n aktiivisuus veressä lisäisi taipumusta verenvuotoon ja alhainen arvo lisäisi taipumusta veren hyytymiseen. Toistaiseksi ei ole kuitenkaan kehitetty sopivaa menetelmää johtuen veressä olevista t-PA:n inhibiittoreista (PAI) ja t-PA:n lyhyestä puoliintumisiästä. Näiden seikkojen lisäksi voi t-PA helposti inaktivoitua jäissä jäähdytettäessä inyös verestä erotetussa plasmassa. Tavanomaisissa mittauk- 2 89634 -;issa saatujen tulosten perusteella on kuitenkin raportoitu esimerkkejä kliinisistä testeistä, joissa on korkeat t-PA-pitoisuudet: maksasairaus /J. Clin. Invest., 43, 681 (1964), J. Clin. Pathlo., 37, 772 (1983)/, munuaissyöpä /Eur. J. Cancer Clin. Oncol., _20, 577 (1984) /, aivoverenvuoto /Blood, 6_1, 267 (1983)/; potilailla, joilla on alhaiset t-PA-pitoisuudet, on raportoitu: syvä laskimotrombi /Br. J. Surg., 10_, 369 (1983), British Med. J., 290, 1453 (1985)/, surkastunut rakko /Arch. Pathol. Lab. Med., 110. 517 (1986)/, endometrin pahanlaatuinen kasvain /Cancer, 48, 1484 (1982)/, sydänlihaksen infarkti tai hyperlipidemia /The New England Journal of Medicine, 313, No. 25, 1557 (1985) /, jne. Lisäksi on raportoitu sukulinja, jossa laskimotrombi toistuu johtuen t-PA:n tuoton mekanismin epänormaalisuudesta /Acta. Chim. Scand., 138, 313 (1972), Acata. Med. Scand., 203, 477 (1978)/.

Edellä olevasta on selvää, että myös kliiniseltä kannalta on erittäin tärkeää tietää t-PA-pitoisuudet veressä.

Yleisesti sanoen t-PA-pitoisuus plasmassa on tähän mennessä määritetty sen antigeenimäärän ja sen aktiivisuuden avulla. Antigeenin määrän mittaamiseen käytettyjä menetelmiä ovat olleet RlA (radioimmunoassay), IRMA (immuno radiometric assay), ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), jne., joissa on käytetty anti-t-PA-vasta-ainetta (julkaistut tutkimattomat japanilaiset patenttihakemukset (Laid Open n:o 59-174759 ja 61-148200).

Aktiivisuuden mittaaminen voidaan taas luokitella karkeasti kahteen menetelmään; fibrinolyysimenetelmään ja synteettinen substraatti-menetelmään. Seuraavat julkaisut koskevat fibrinolyysimenetelmää.

Thronfr. Haemostas., jk2 (1), 19 (1984) i 3 89634

Thromb. Haemostas., 4jj. (2), 107 (1981)

Thromb. Diathes. Haemoth., 32, 356 (1974)

Seuraavat julkaisut koskevat synteettinen substraatti-menetelmää.

Thrombosis Res., 4_3, 129 (1986)

Thrombosis Haemostasis, 5_3 (3), 356 (1985)

Thrombosis Res., 46, 213 (1987)

Clinica. Chimica. Acata., 127, 279 (1983)

Materiaaleina, joista veren t-PA-aktiivisuus tutkitaan, käytetään tavallisesti plasmaa ja t-PA:n inhibiittoreiden poistamiseksi käytetään erilaisia käsittelyjä. Esimerkiksi eräässä menetelmässä sentrifugoidaan verta 5 minuuttia, minkä jälkeen plasma erotetaan verestä, pH säädetään välittömästi arvoon 5,9 etikkahapolla euglobuliinijakeen saostamiseksi ja sakka sentrifugoidaan /Thromb. Haemostas., 48 (3), 266 (1982)/, eräässä toisessa menetelmässä säädetään plasman Ph arvoon 3,9 ja plasma pakastetaan välittömästi -70°C:ssa (kuiva jää) (joka käytettäessä liuotetaan kuumentamalla ja pH säädetään uudelleen arvoon noin 7,4). Eräässä meneetelmässä adsorboidaan plasman t-PA lysiini-sefaroosiin ja tästä t-PA-inhibiittori poistetaan pesemällä /Thrombosis Res., 4j>, 413 (1987)/.

Kaikissa menetelmissä, joissa t-PA:n antigeenin pitoisuus määritetään, mitataan kuitenkin myös t-PA:n reaktiotuote sen inhibiittorin kanssa antigeenin määränä, mutta missään menetelmässä ei kyetä mittaamaan todellista t-PA-aktiivi-suutta.

Edellä kuvattuihin tavanoamisiin menetelmiin liittyy : lisäksi muita vakavia ongelmia, so.: 4 89634 1) aika, joka tarvitaan erottamaan plasma verestä sentrifu-goimalla, kestää vähintään 10 minuuttia toimenpiteen aloittamisesta sen loppuun; tänä aikana t-PA-aktiivisuus plasmassa laskee paljon; ' (2) tuloksen arviointiin kuluva aika on pitkä (noin 20 tuntia),. Yksinkertaisuuden puutteen lisäksi ei myöskään kyetä mittaamaan todellista t-PA-aktiivi-suutta, koska t-PA:n inhibiittori vaikuttaa koko ajan reaktioajan aikana tulokseen menetelmästä riippuen jne.

Tavanomaisissa menetelmissä on lisäksi suoritettava useiden kymmenien - useiden tuhansien kertainen laimennus t-PA:n inhibiittorin vaikutusten välttämiseksi. Tällöin ongelmaksi muodostuu se, että edes t-PA-aktiivisuutta ei voida mitata, ellei menetelmien herkkyys ja tarkkuus ole erinomainen.

Mikään menetelmä, jolla voidaan t-PA-aktiivisuus määrittää veressä, ei edellä olevista syistä ole toistaiseksi ollut menestyksellinen.

Todellisen t-PA-aktiivisuuden mittaamismenetelmän kehittämiseksi ovat esillä olevan keksinnön keksijät tutkineet laajasti menetelmiä, joilla voitaisiin mitata t-PA-aktiivisuus kokoveressä tai laimennetussa veressä ilman t-PA-aktiviisuutta inaktivoivaa sentrifugointia. Tutkimusten tuloksena he ovat havainneet, että näytteen todellinen t-PA-aktiivisuus voidaan määrittää erittäin tarkasti ja herkästi erittäin yksinkertaisella, lyhytaikaisella käsittelyllä menetelmien avulla, joissa joko annetaan t-PA-spesifisen kromogeenisen peptidisubstraatin vaikuttaa suoraan reaktiotuotteen kanssa, joka on saatu antamalla anti t-PA-monoklonaalisen vasta-aineen reagoida kiinteän faasin knassa, tai antamalla t-PA-spesifisen substraatin vaikuttaa substraattiin, joka on spesifinen tämän reaktion tuottamalla entsyymille. Keksijät ovat näin päätyneet ( 5 89634 esillä olevaan keksintöön. Esillä olevan keksinnön mukaisella määritysmenetelmälle on tunnusomaista, että kiinteä faasi, johon on sidottu anti-t-PÄ vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa affiniteetin t-PA:n johonkin muuhun kuin aktiiviseen kohtaan, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) molekyy1ipaino: 153.000 ± 10.000 b) IgG-alaiuokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi (L-ketju): Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta saatetaan reagoimaan kokoveren tai laimennetun veren t-PA:n kanssa ja sen jälkeen määritetään reaktiotuotteen entsymaattinen aktiivisuus.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle kitille t-PA-aktiivisuuden mittaamiseksi on edelleen tunnusomaista, että se käsittää vähintään kiinteän faasin, johon on sidottu anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa affiniteetin t-PA:n johonkin muuhun kohtaan kuin aktiiviseen kohtaan, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) molekyy1ipaino: 153.000 ± 10.000 b) IgG-alaiuokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi (L-ketju): Asp-I1e-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta ja reagenssin, jolla mitataan fraktion sitovan kiinteän faasin ja t-PA:n välisen reaktiotuotteen entsymaattinen aktiivisuus kokoveressä tai laimennetussa veressä.

Esillä olevan keksinnön tavoitteena on edelleen tuoda esiin uusi monoklonaalinen vasta-aine, jota myös käytetään edellä kuvatussa mittausmenetelmässä.

Esillä olevalle keksinnölle on myös tunnusomaista, että anti t-PA-vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa affiniteetin t-PA:n johonkin muuhun kohtaan kuin aktiiviseen kohtaan, immobilisoi-daan pääl1ystyskerroksena muovipuikon toiseen kärkeen. Esillä olevan keksinnön tavoitteena on edelleen tuoda esiin tällainen mi t taus laite.

6 89634

Kuvio 1 esittää anti-t-PA monoklonaalisei 1 a vasta-aineella päällystettyä puikkoa perspektiivikuvana; tässä n:o 1 tarkoittaa upotuspuikkoa, n:o 2 tarkoittaa puikkoa, n:o 3 tarkoittaa vasta-aineella päällystettyä aluetta, n:o 4 tarkoittaa kärkeä, n:o 5 tarkoittaa BSA:lla kyllästettyä aluetta ja n:o 6 tarkoittaa katkaisualuetta.

Kuvio 2 on virtauskaavio, jossa on esitetty upotuspuikkoa käyttävä mittausmenetelmä; tässä n:o 7 tarkoittaa vakuumiputkea, n:o 8 kokoverta, n:o 9 mikrotiitteri-levyjä, n:o 10 kaivoa, n:o 11 upotuspuikon palaa, n:o 12 tarkoittaa Tris-HCl-puskuria, n:o 13 tarkoittaa laimennettua verta ja n:o 14 tarkoittaa substraatti-1iuosta.

(a) ---> (b): Upotuspuikko upotetaan välittömästi vakuumiput- keen veren keräämisen jälkeen.

(b) ---> (c): Putken annetaan seistä 10 minuuttia huoneen läm- pöti1assa.

(a’) --> (b'): 0,5 ml kokoverta.

(b1 ) --> (c): Pestään puskurilla I.

(d) > (e): Lisätään substraatti 1iuos.

(e) > (f): Inkuboidaan 4 tuntia tai 17 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen mitataan spektrofotometri11ä aallonpituudella 405 nm.

Kuvio 3 esittää mittausmenetelmän erään esimerkin periaatteen; tässä n:o 21 tarkoittaa kiinteää faasia, n:o 22 tarkoittaa anti t-PA-vasta-aine-IgG-fraktiota, n:o 23 tarkoittaa kudosplasminogeenin aktivaattoria, n:o 24 tarkoittaa plasminogeeniä, n:o 25 tarkoittaa stimu-laattoriä, n:o 26 tarkoittaa plasmiinia ja n:o 27 tarkoittaa kromogeenistdä peptidisubstraattia.

Kuvio 4 esittää periaatteen menetelmälle, jossa mitataan tuotteen t-PA-aktiivisuus suoraan kromogeenisel1 a pepti-disubstraati11 a; tässä n:o 21 tarkoittaa kiinteää faasia, n:o 22 tarkoittaa anti t-PA-vasta-aine IgG-frak-tiota, n:o 23 tarkoittaa kudosplasminogeenin aktivaattoria ja n:o 28 tarkoittaa kromogeenista peptidisubstraattia .

89634 7

Kuviot 5 ja 6 esittävät kalibraatiokäyrät puolilogaritmisella asteikolla, kun standardinäytteinä oli kokoveri ja laimennettu veri ja kun käytettiin puikkoa.

Kuvio 7 esittää kalibraatiokäyrää, joka saatiin korjaamalla kuvioissa 5 ja 6 esitetyt kalibraatiokäyrät lineaariseksi funktioksi.

Kuvio 8 esittää kokoveren mittaustuloksia puikkoa käytettäessä.

Kuvio 9 esittää laimennetun veren mittaustuloksia.

Kuvio 10 esittää leimaamattoman t-PA:n, jolla on eri 125 konsentraatiot, inhibiitiokayna I-t-PA:n immunosaostusreaktiossa erilaisten vasta-aineiden kanssa; tässä -o- on SP-322 ja -·- on ESP-2.

Kuvio 11 esittää tyypiltään yksiketjuisen tai tyypiltään kaksiketjuisen leimaamattoman t-PA:n inhibitiokäy- 125 riä I-t-PA:n immunosaostusreaktiossa monoklonaa-lisen vasta-aineen SP-322 kanssa; tässä -o-tarkoittaa kaksiketjuista ja -·- tarkoittaa *.* yksiketjusita tyyppiä.

\ Kuvio 12 esittää erilaisten vasta-aineiden t-PA-aktiivi- suutta inhiboivaa vaikutusta käytettäessä 125 I-fibriinikalvon lyysaysmenetelmää; tässä --Δ-- on kontrollina_toimiva monoklonaalinen vasta-aine, -o- on Sp-322, —4— on n:o 387 (anti-vuohi polyklonaalinen vasta-aine IgG) ja -e- on ESP-2.

Kuvio 13 esittää fibriiniin sitoutumatonta t-PA-aktiivi-suutta, mikä osoittaa monoklonaalisen vasta-aineen SP-322 vaikutuksen t-PA:n fibriiniaffi-niteettiin; tässä -·- on esikäsitelty SP-322;lla ja -o- on käsittelemätön.

a 89634 o 125

Kuvio 14 esittää uorkmaasin vaikutuskayna I-t-PA:n ja monoklonaalisen vasta-aineen SP-322 tai muiden anti-t-PA-vasta-aineiden väliseen immunosaostus-reaktioon; tässä -o- on SP-322, -o- on ESP-2 ja -Δ- on n:o 387.

Seuraavassa on esillä olevaa keksintöä kuvattu yksityiskohtaisemmin.

(Monoklonaalinen vasta-aine)

Esillä olevan keksinnön mukainen anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine on spesifinen t-PA:lle. Sille on ominaista, että sen molekyylipaino on 153.000 + 10.000, IgG-alaluokka on igG l, sen aminopään spesifisen L-ketjun muuttuvan alueen aminohapposekvenssi on Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser ja antigeenin sitoutumiskohta sijaitsee fibriiniaffiniteettikohdassa tai lähellä sitä. Erityisesti todettakoon, että anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä mainittu aminohapposekvenssi, on tähän mennessä täysin tuntematon, ja että se on uusi monoklonaalinen vasta-aine. Anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine käsittää kaikki edellä kuvatut edellytykset täyttävät vasta-aineet, mutta eräs esimerkki on anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine SP-322, joka on valmistettu immunisoimalla melanoomasoluista saatu t-PA. Monoklonaalista vasta-ainetta SP-322 tuotetaan hiiren hybridoma SP-322-soluilla viljelmässä tai hiiren askites-nesteessä. Hiiren hybridomaklooni SP-322 voidaan saada solufuusioimalla BALB/C-hiiren perna-solut, jotka on immunisoitu ihmisen melanoomasoluista saadulla t-PA:11a, hiiren myeloomasolujen (esimerkiksi P3X63 Ag 8.ui (P3U1)-solujen kanssa tavalliseen tapaan, esimerkiksi Köhler'in ja Milstein'in (vrt. jäljempänä kuvatut esimerkit) kuvaamalla solufuusiomenetelmällä. Alustana, jossa edellä kuvattuja hybridomasoluja viljellään, voidaan käyttää Dalbecco'n modifioitua minimialustaa (jäljempänä käytetään 9 89654 yksinkertaisesti nimitystä DMEM) täydennettynä naudansikiösee-rumilla, L-glutamiinilla, glukoosilla, natriumpyruvaatilla, 2-merkaptoetanolilla ja antibiooteilla (esimerkiksi penisilliini G, streptomysiini, gentamysiini jne.), jne. Hybridomasolujen viljely suoritetaan esillä olevassa keksinnössä yleensä joko 37°C alustassa kaasufaasissa, jossa on 5 % hiilidioksidia ja 95 % ilmaa, 2-4 päivän aikana tai BALB/C-hiiren, joka on esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla (Pristan, tavaramerkki, valmistaja Aldrich Co., Ltd.), vatsaontelossa 10 - 20 päivän aikana, millä voidaan tuottaa vasta-ainetta niin paljon, että se voidaan puhdistaa.

Näin tuotettu monoklonaalinen vasta-aine voidaan eristää ja puhdistaa viljelmän supernatantista tai askitisnesteistä proteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen käytetyillä tavanomaisilla tavoilla. Esimerkkejä tällaisista tavanomaisista tavoista ovat sentrifugointi, dialyysi, ulossuolaus ammoniumsulfaatilla, pylväskromatografia käyttämällä DEAE-selluloosaa, hydroksiapatiittia, proteiini A-agaroosia, Sephadex-hartsia (tavaramerkki, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd.), jne.

(Mittausmenetelmä)

Esillä olevan keksinnön mukaisessa mittausmenetelmässä käytetään kiinteää faasia, johon anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine on sidottu. Menetelmä eroaa kuitenkin täysin tavanomaisesta ELISA-menetelmästä, jossa käytetään mono-klonaalista vasta-ainetta, sillä: (1) entsyymi-vasta-ainetta ei käytetä; ja (2) mitataan t-PA:n aktiivisuus eikä antigeenin määrää.

Tavanomaisessa ELISA-menetelmässä osa näytteen t-PA:sta sitoutuu t-PA:n inhibiittoriin olosuhteissa, joissa 89634 ίο samanaikaisesti on mukana t-PA:n inhibiittoria, jolloin menetetään t-PA-aktiivisuutta; tästä huolimatta mitataan myös t-PA:n ja t-PA:n inhibiittorin liittymätuote t-PA-antigeenin määränä. Esillä olevan keksinnön kohteena on kokoveren tai laimennetun veren mittausmenetelmä, jossa myös on samanaikaisesti mukana inhibiittoria lyhyen aikaa. Tämän mittauksen kohteena ei myöskään ole t-PA:n ja t-PA:n inhibiittorin reaktiotuote, jolloin voidaan spesifisesti määrittää todellinen t-PA-aktiivisuus veressä.

Tässä keksinnössä käytetty anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktio voi olla mikä tahansa anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine niin kauan kuin se ei sitoudu t-PA:n aktiiviseen kohtaan mutta on spesifinen t-PA:lle. Käyttökelpoisia ovat siten kaikki kaupallisesti saatavissa olevat ESP-2 (Bioscott Co.,

Ltd. valmistama t-PA monoklonaalinen vasta-aine) ja anti-t-PA monoklonaaliset vasta-aineet, joita on kuvattu julkaistuissa tutkimattomissa japanilaisissa patenttihakemuksissa (Laid Open) n:o 59-5121, 61-148200 ja 61-181964 (tai 61-183299), niin kauan kuin ne eivät sitoudu t-PA:n aktiiviseen kohtaan. Erityisen hyvänä pidetty on kuitenkin edellä kuvattu anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine SP-322, koska sillä on erityisesti erinomainen affiniteetti t-PA:lle.

Mitä taas tulee sillä olevassa keksinnössä käytettävään kiinteään faasiin, voidaan käyttää mitä tahansa tällaista faasia, joka kykenee sitoutumaan edellä mainittuun t-PA-vasta-aineeseen. Niitä voidaan käyttää esimerkiksi mikrolevyinä, helminä, puikkoina, koeputkina jne., jotka on tehty polymeereistä, kuten polystyreenistä, polykarbonaatista, polypropy-leenistä, polyvinyylistä jne. Näistä on suositeltavaa käyttää anti-t-PA monoklonaalisen vasta-aineen sitovaa puikkoa, jota on erittäin yksinkertaista käyttää ja joka tullaan kuvaamaan jäljempänä.

Esillä olevan keksinnön mukaisen mittausmenetelmän tavoitteena on käsittelyn suorittaminen lyhyen ajan kuluessa. Sen vuoksi on suositeltavaa käyttää testattavana näytteenä kokoverta, 11 89634 jossa on mukana antikoagulanttia, välittömästi veren vapaaehtoisilta ottamisen jälkeen. Mitä taas tulee laimennettuun verinäytteeseen, on suositeltavaa käyttää verta, joka on saatu laimentamalla kokoverta 1aimennusaineel1 a, kuten fysiologisella suolaliuoksella jne. 4-16-kertaisesti. Esillä olevan keksinnön mukaisesa mittausmenetelmässä voidaan t-PA:n inhibiittorin vaikutus minimoida laimentamalla nelinkertaisesti.

Anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktion sitovan kiinteän faasin ja t-PA:n reaktioseoksen aktiivisuus näytteessä määritetään lisäämällä reaktiotuotteeseen välittömästi t-PA:lle spesifistä kromogeenistä peptidisubstraattia ja määrittämällä fotometri-sesti kromogeenisestä peptidisubstraatista vapautuneen kromo-geenisen tai valoa emittoivan aineen määrä. Vaihtoehtoisesti saatetaan t-PA:lle spesifinen entsyymisubstraatti reagoimeen reaktiotuotteen kanssa stimulaattorin läsnäollessa tai ilman sitä, enstyymille spesifinen kromogeeninen peptidisubstraatti saatetaan reagoimaan muodostuneen entsyymin kanssa ja mitataan fotometrisesti kromogeenisestä peptidisubstraatista vapautuneen kromogeenisen tai valoa emittoivan aineen määrä.

t-PA.lle spesifinen koromogeeninen peptidisubstraatti voi tässä yhteydessä olla mikä tahansa substraatti niin kauan kuin se reagoi t-PA:n kanssa ja hajoaa kromogeenistä tai . - valoa emittoivaa ainetta vapauttaen. Tällöin kromogeenisen . tai valoa emittoivan aineen määrä korreloi t-PA-aktiivisuu- den kanssa. Esimerkkejä kaupallisesti saatavista tällaisista .. . kromogeenisistä peptidisubstraateista ovat S- 2 2 88 (H-D-i 1 e-Prc-Arg-NH- -N02.2HCl; valmistaja Kabi Co., Ltd.), S-2 444 (H~L-pGiu_G1y_L_Arg_NH- -N02.2HCl; . . . valmistaja Kabi Co., Ltd.), jne. [vrt. julkaistu tutkimaton ... japanilainen patenttihakemu (Laid Open No.) 52-24581 (jul kaistu tutkittu japanilainen patenttihakemus 56-15238), 89634 julkinen patenttijulkaisu n:o 55-500076, jne./. Kaikki nämä substraatit ovat kromogeenisiä ja vapauttavat p-nitro-aniliinia. p-nitroaniliinilla on näkyvällä keltaisella alueella tunnusomainen absorptioaallonpituus 405 nm. Siinä tapauksessa, että edellä kuvatuissa substraateissa olevat kromogeeniset ryhmät ovat esimerkiksi 4-metoksi-$-naftyyli-amidiryhmä tai 7-amino-4-metyylikumariiniryhmä, ne antavat fluoresoivia substraatteja. Näitä ei kuitenkaan ole kaupallisesti saatavissa. Vapautuneet 4-metoksi-p-naftyyliamiini ja 7-amino-4-metyylikumariini virittyvät valolla, jonka viritysaallonpituus on vastaavasti noin 350 nm ja noin 380 nm. Niiden määrät voidaan määrittää mittaamalla fluoresenssi vastaavasti aallonpituuksilla noin 420 nm ja noin 440 nm.

Tyypillinen t-PA:lle spesifinen entsyymisubstraatti on plasminogeeni. Hyviä esimerkkejä ovat ihmisen lysiiniplas-minogeeni, glutamyyliplasminogeeni jne.

Stimulaattori, jota voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa mittauksessa, voi olla mikä tahansa stimulaattori, mikäli se nostaa t-PA:n entsyymiaktiivisuutta. Sitä lisätään mittausjärjestelmän herkkyyden parantamiseksi, ja sillä on edellä kuvatut ominaisuudet. Yksittäisiä esimerkkejä ovat syanogeenibromidilla käsitelty fibrinogeeni, liukoinen fibrinogeenimonomeeri, polylysiini, fibriini jne.

Entsyymi, jota muodostuu tuotteen reagoidessa t-PA:lle spesifisen substraatin kanssa, on plasmiini, kun entsyymi-substraattina käytetään plasminogeeniä.

Kromogeeninen peptidisubstraatti, joka on spesifinen muodostuneen entsyymin suhteen, voi olla mikä tahansa entsyymi niin kauan, kun se reagoi t-PA:n kanssa ja hajoaa vapauttaen kromogeenistä tai valoa emittoivaa ainetta. Tällöin kromo-geenisen tai valoa emittoivan aineen määrä korreloi muodostuneen entsyymin aktiivisuuden ja siten t-PA-aktiivisuuden 13 89634 kanssa. Siinä tapauksessa, että muodostunut entsyymi on esimerkiksi plasmiini, esimerkkejä voivat olla ne, jotka ovat substraatteja plasmiinille seuraavassa kuvatuissa substraateissa: julkaistu tutkimaton japanilainen patenttihakemus (Laid Open No.) 52-24581 (julkaistu tutkittu japanilainen patenttihakemus n:o 56-15238) ja edellä kuvattu julkainen patenttijulkaisu n:o 55-500076; tai julkaisu tutkimaton japanilainen patenttihakemus (Laid Open No.) 52-3494 (julkaistu tutkittu japanilainen patenttihakemus n:o 56-22519), julkaistu tutkimaton patenttihakemus (Laid Open No.) 57-2253 (julkaistu tutkittu japanilainen patenttihakemus n:o 62-57197), julkaistu tutkimaton japanilainen patenttihakemus (Laid Open No.) 58-63399 (julkaistu tutkittu japanilainen patenttihakemus n:o 61-9840), julkaistut tutkimattomat japanilaiset patenttihakemukset (Laid Open No.) 58-172354, 62-294695 ja 62-294696 jne. Erityisen mielellään käytettyjä ovat kaupallisesti saatavissa olevat S - 2 2 51 (H-D-Val - L-Leu-L-T.y»-NH- -N02.2HC1 ; valmistaja Kabi Co., Ltd.), S-2302 (H-D-Pro-Phe-Arg-NH- -NG2.2HCl; valmistaja Kabi Co., Ltd.)

Nr. 51-32 (H-D-Va1-SHT-Lys-pNa.2AcOH; valmistaja Pentapharm Co., Ltd.). Chromozym PL (TosGly-Pro-Lys-pNa; valmistaja . Boehringer Mannheim AG). Siinä tapauksessa, että kromogeenise- nä peptidisubstraattina käytetty tuote on S-2251 tai S-2302, kromogeenisenä aineena vapautuu p-ni t r oani 1 i li ni a . Sen mittavistapa ja fluoresoiva substraatti ovat samat kuin rnitä edellä on • · : kuvattu.

Konkreettisemmin sanottuna mittaus suoritetaan seuraavasti: (1) anti-1-ΡΛ-vasta - aine-IgG~fraktio päällystetään kiinteä ·.- ‘. faasin pääl 1 e , (2) sitoutumaton anti-t-ΡΆ-vasta-aine-IgG-fraktio poistetaan systeemistä pesemällä, (3) lisätään kckoverir.äytettä tai laimennettua verinäytettä, 1 minkä tarkoituksena on lyhyen ajan kuluessa reagoida näytteen t-PA:n kanssa ja sitoutua siihen, 14 89654 (4) sitoutumattomat komponentit poistetaan systeemistä pesemällä, millä poistetaan myös inhibiittori), (5) lisätään siihen suoraan t-PA:lle spesifistä kromogeenistä peptidisubstraattia, esimerkiksi S-2288-tuotetta ja inkuboidaan; vaihtoehtoisesti lisätään vaiheeseen (4) vielä t-PA:lle spesifistä entsyymisubstraattia, esimerkiksi lysiiniplasminogeeniä, ja jos aktiivisuus on liian alhainen, lisätään tähän vielä stimulaattoria, esimerkiksi syanogeenibromidilla käsiteltyä fibrinogeeniä ja muodostuneelle entsyymille, esimerkiksi plasmiinille spesifistä kromogeenistä peptidisubstraattia, esimerkiksi tuotteita S-2251, Nr. 51-32 tai Chromozym PL ja inkuboidaan, (6) vapautunut aine mitataan ja määritetään kvantitatiivisesti ja (7) tarvittaessa tämä kalibroidaan t-PA-aktiivisuudeksi.

Käsittelyt, kuten pesu, inkubointi jne. suoritetaan käyttämällä puskureita, joilla on määrätty pH-arvo ja ioniväkevyys. Tällaisista puskureista ovat esimerkkejä fosfaatti-, karbonaatti-, boraatti-, sitraatti-, barbituraattipuskurit jne., Tris-HCl-puskuri, aminohappopuskuri jne. Vaikkakin suositeltavuus jonkin verran vaihtelee käsittelystä riippuen, voidaan käyttää tehokkaasti Tris-HCl-puskuria tai Tris-HCl-puskuria, jota on täydennetty natriumkloridilla ja Tween*11a (poly-oksietyleenisorbitaani-rasvahappoesteri). Reaktiolämpötilana riittää reaktiotuotteen muodostamiseen huoneen lämpötila. Mittauksessa ja kvantiatiivisessa määrityksessä suoritettava inkubointi tehdään edullisesti noin 37°C:ssa.

Kvantatiivinen määritys käyttämällä kromogeenistä peptidisubstraattia tehdään mieluummin käyttämällä tavanomaisia laitteita, kuten spektrofotometriä, fluoresenssidetektoria jne., riippuen vapautuneen aineen laadusta t-PA:n tai muodostuneen entsyymin inaktivoinnin jälkeen tai ilman inakti-vointia.

i 15 8 9 6 5 4 (Mittauskitti)

Esillä oleva keksintö käsittää edellä kuvattuun mittaamiseen tehdyn kitin. Käytön yksinkertraisuuden kannalta kitti sisältää mieluummin kaikki seuraavat: edellä kuvatussa määritysmenetelmässä käytetty kiinteä faasi, anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine, t-PA-aktiivisuuden mittausrea-genssi, so. t-PA-spesifinen kromogeeninen peptidisubstraatti tai t-PA-spesifinen entsyymisubstraatti ja tarvittaessa stimulaattori, muodostuneelle entsyymille spesifinen kromogeeninen peptidisubstraatti ja muut standardiliuokset.

Kitti ei kuitenkaan ole rajoitettu järjestelmään, jossa kaikki nämä reagenssit ovat välttämättä mukana. Esillä olevan keksinnön mukaiselle mittauskitille on nimittäin tunnusomaista, että se sisältää vähintään anti-t-PA-mono-klonaalisen vasta-aineen tai kiinteään faasiin sidotun anti-t-PA-monoklonaalisen vasta-aineen ja reaktiotuotteen t-PA-aktiivisuuden mittausreagenssin. Esillä oleva keksintö sisältää kaikki näitä sisältävät kitit, joilla t-PA-aktiivisuus mitataan kokoverestä tai laimennetusta verestä.

···' (Mittauslaite)

Kiinteänä faasina, johon anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine on sidottu, esillä oleva keksintö käsittää anti-t-PA monoklonaalisen vasta-aineen sitovan puikon, jota on erittäin yksinkertaista käyttää ja joka sopii mitä parhaimmin mittaus-käsittelyn suorittamiseen lyhyen ajan kuluessa.

- . Tarkemmin sanoen esillä olevan keksinnön mukainen, t-PA- aktiivisuuden mittaamiseen tarkoitettu upotuspuikko on *·[ tehty muovista. Se käsittää puikon toiseen kärkeen immobi- lisoidun vasta-aineella päällystetyn alueen, jossa on anti-t-PA-vasta-aine IgG-fragmenttia, joka omaa affiniteetin t-PAj_n johonkin muuhun kohtaan kuin aktiiviseen kohtaan. Erityisen hyvänä pidetään katkaisualueella varustettua 16 89 6 34 upotuspuikkoa, joka voidaan helposti katkaista taivuttamalla käyttäen tukena mittaamiseen käytetyn astian seinämää. Esillä olevan keksinnön eräs hyvänä pidetty esimerkki on lisäksi mittauslaite, joka käsittää vakuumiputkessa jo olevan puikon.

Seuraavassa on kuvattu yksityiskohtaisesti esillä olevan keksinnön mukainen mittauslaite viittaamalla esimerkkimäi-siin piirustuksiin.

Kuviossa 1 on esitetty esillä olevan keksinnön mukainen upotuspuikko 1 perspektiivikuvana. Kuvio 2 on virtauskaavio, jossa on esitetty menetelmä, jolla upotuspuikkoa 1 käytetään.

Puikko 2 muodostuu muovimateriaalista, johon anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine voidaan sitoa ja joka on muodoltaan suorakulmainen levy. Muovimateriaalista ovat esimerkkejä materiaalit, jotka on annettu esimerkkinä kiinteän faasin yhteydessä. Erityisen sopivia ovat katkaisualueella varustetut materiaalit, jotka voidaan helposti katkaista taivuttamalla käyttäen tukena mittaamiseen käytetyn astian seinämää.

Puikko voi muodoltaan olla mikä tahansa niin kauan kuin se voidaan koonsa puolesta päällystää ja immobilisoida tietyllä määrällä anti-t-PA-monoklonaalista vasta-ainetta ja sitä voidaan käsitellä sormin sen puolen kärjestä käsin, johon ei mitään anti-t-PA monoklonaalista vasta-ainetta ole päällystetty. Puikon muotoa ei ole rajoietttu piirustuksessa esitettyyn suorakulmaiseen tai levymäiseen muotoon. Piirustuksessa esitetty levymäinen muoto on puikkomuotoa parempi, kun halutaan saada katkaisualue, joka voidaan helposti katkaista taivuttamalla käyttäen tukena mittaamiseen käytetyn astian seinämää.

Anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella päällystetty alue 3 on laitettu puikon 2 toiseen kärkeen, johon anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine päällystetään ja iromobilisoidaan. Päällystäminen ja immobilisointi suoritetaan tavalliseen i 17 8 9 6 34 tapaan. Puikko pestään ja kuivataan. Sen jälkeen kärki upotetaan puskuria sisältävään koeputkeen. Päällystäminen suoritetaan antamalla seistä noin 4 tuntia huoneen lämpötilassa tai antamalla seistä yön yli, kun lämpötila on 4°C. Päällystetty puikko laitetaan seerumialbumiinia jne. sisältävään koeputkeen. Immobilisointi suoritetaan antamalla seistä noin 1 tunti huoneen lämpötilassa tai antamalla seistä yön yli, kun lämpötila on 4°C. Kuviossa tarkoittaa viitenumero 5 aluetta, joka on rajattu seerumialbumiinilla. Alue ulottuu kuviossa puikon kärjestä 4 20 mm, mutta se voi olla mikä tahansa alue, jolla immobilisointi saadaan aikaan ja olla suurempi kuin edellä kuvattu vasta-aineella päällystetty alue.

Suositeltavaa on, että päällystys tehdään niin, että puikon kärki 4 voidaan täysin upottaa astiassa olevan substraatti-liuoksen yläpintaan (kuviossa noin 6 mm päähän kärjestä). Päällystys tehdään yleensä puikon 12 kärjen koko pinnalle ja takapinnalle, mutta se voidaan tehdä myös yhdelle pinnalle.

'···" Puikko 12 on suositeltavaa varustaa etukäteen katkaisualueella.

Kuvion mukaisesti on suositeltavaa tehdä rako päähän, johon anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine on päällystetty ja immobilisoitu, tai puolelle, joka on kohti päällystämätöntä : aluetta ja astian seinämän vieressä (kuviossa noin 10 mm päähän kärjestä).

Katkaisualue ei ole rajoitettu kuviossa esitettyyn rakoon vaan se voi olla tehty reikien tai kolojen avulla jne.

.. niin kauan kuin se voidaan helposti katkaista, erityisesti että se voidaan helposti katkaista taivuttamalla käyttäen tukena astian seinämää.

Seuraavassa on selvitetty kuvioon 2 (1) viitaten mittausmenetelmää, jossa käytetään upotuspuikkoa 1. Kokoverta otetaan vakuumiputkeen 7 /(a), vakuumiputkessa 7 voi olla myös antikoagulanttia, kuten natriumsitraattia tai hepariinia 18 89634 jne./. Upotuspuikko 1 upotetaan putkeen välittömästi veren keräämisen jälkeen. Systeemin annetaan seistä 5 - 120 minuuttia huoneen lämpötilassa, jotta reaktio kokoveren kanssa tapahtuisi /(b)/. Upotuspuikko 1 vedetään pois /(c)/. Upotus-puikko 1 laitetaan astian 9 sisään, johon substraattiliuos tullaan lisäämään, ja katkaistaan taivuttamalla tukien seinämää 10 vasten, jolloin astiaan 9 putoaa vain katkennut kärki 11 anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella päällys-tettyine alueineen 3 /(d)/. Substraattiliuosta lisätään astiaan 9, jossa katkaistu kärki 11 on, minkä jälkeen inkuboi-daan 37°C:ssa noin 30 minuuttia - 20 tuntia /(e)/. Sen jälkeen upotuspuikko poistetaan ja viedään mittauslaitteeseen (ei esitetty), jossa mitataan substraatista vapautuneen kromogeenisen tai valoa emittoivan aineen määrä /(f)/ (reaktio voidaan mitata kolorimetrisesti myös reaktion pysäyttämisen jälkeen).

Kuvioon 2 (2) viitaten on selitetty toinen menetelmä, jossa käytetään laimennettua verinäytettä. Veri otetaan vakuumi-putkeen 7, joka sisältää laimennusaineen 12 ja upotuspuikon 1 ja tarvittaessa antikoagulantin /(a')/. Näyte sekoitetaan välittömästi ja annetaan seistä huoneen lämpötilassa 5 -120 minuuttia, jotta reaktio laimennetun veren kanssa voisi tapahtua /(b1)/· Sen jälkeen systeemi pestään ja käsitellään mittauksen tekemiseksi samalla tavoin kuin edellä on kuvattu kohdissa (c) - (e).

Myös kokoverta käytettäessä voidaan upotuspuikko 1 laittaa jo etukäteen vakuumiputkeen 7, kuten laimennetun veren 13 tapauksessakin. Tämä johtuu nimittäin siitä, että immobi-lisoitu anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine on niin stabiili, että se kestää tällaisen kaupallisen käyttötavan.

Myöskään laimennetun verinäytteen tapauksessa ei ole mahdotonta soveltaa menetelmää, jossa laimennusaine lisätään ja sekoitetaan välittömästi veren keräämisen jälkeen ilman, f is 89634 että iaimennusaine olisi lisätty etukäteen. Kuviossa esitetty menetelmä on kuitenkin suositeltava, koska esillä olevan keksinnön tavoitteena on suorittaa käsittely lyhyen ajan kuluessa.

(Keksinnön vaikutukset)

Esillä olevan keksinnön mukaisella t-PA-aktiivisuuden mittausmenetelmällä on ensimmäisen kerran mahdollista mitata veren todellinen t-PA-aktiivisuus. Menetelmällä on monia eri etuja yksinkertaisuuden, herkkyyden, tarkkuuden jne. kannalta.

(1) Sentrifugointia ei tarvita, joten t-PA:n inhibiittorin vaikutus pienenee ja t-PA:n mahdollinen inaktivoituminen voidaan minimoida.

(2) t-PA-aktiivisuus on mahdollista määrittää 100 - 130 minuutin sisällä veren keräämisestä, mikä on erittäin paljon vähemmän kuin tavanomaisessa menetelmässä (noin 20 tuntia).

. i (3) Plasmassa tai laimennetussa veressä on mahdollista : suorittaa mittaus käyttämällä pienempää laimennuskr- : : : rointa (noin 4-16) kuin tavanomaisessa laimennuksessa /:’· (yleensä laimennetaan 50 - 3200-kertaisesti) , jolloin t-PA:n inaktivoituminen voidaan estää mahdollisimman paljon, jolloin t-PA-aktiivisuus on mahdollista mitata herkemmin.

;; (4) Ei tarvitse säätää happameksi (pH 3,9) tai apakastaa kuivajäällä (-70°C).

(5) Koko toimenpide on erittäin yksinkertainen.

20 89634 (6) Systeemissä, jossa on mukana stimulaattoria, herkkyys on parempi.

Esillä olevan keksinnön mukaista mittausmenetelmää voidaan käyttää t-PA:n, t-PA-johdosten ja muiden fibrinolyyttisten nopeuttimien skriinauksen tai kliinisten vaikutusten vahvistamisen jne. lisäksi myös spesifisten tautien ja dialysoimi-seen, olosuhteiden seuraamiseen ja terapeuttisen lääkkeen seuraamiseen (TDM, Therapeutic Drug Monitoring).

Esillä olevan keksinnön mukainen mittauskitti on lisäksi edullinen siinä suhteessa, että kitti voidaan tehdä yksin-kertaisesn mittaukseen sopivaksi. Tarkemmin sanoen kittiä, joka sisältää anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktion sitovan kiinteä faasin, erityisesti upotuspuikon, joka on päällystetty ja kyllästetty anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktiolla ja kittiä, joka sisältää tällaisen upotuspuikon, on erittäin helppo käyttää käyttämällä vain kokoverta tai laimennettua verta niin, että lisätään tuotteen mittaamiseksi reagenssia, inkuboidaan ja sen jälkeen t.-PA-aktiivisuus mitataan.

Lisäksi upotuspuikko käytettäessä (1) mitään aktiivisuutta ei häviä, koska veren t-PA on adsorboitunut upotuspuikkoon. Tämän jälkeen pestään puskurilla ja upotuspuikkoa voidaan säilyttää viikon ajan (4°C), mikä tekee mittauksen helpoksi; (2) monoklonaalinen vasta-aine on jo immobi1isoitu, joten pesu on yksinkertainen. Pesu voidaan esimerkiksi tehdä suoraan dekantteri1asissa olevalla puskurilla tai vesi-johtovedel1ä; (3) 4°C:ssa puskurissa säilytettynä on päällystetty ja kyllästetty upotuspuikko stabiili yli 3 kuukauden ajan; ja 21 ö*634 (4) upotuspuikko on myös erittäin stabiili kuljetettaessa .

Esillä olevan keksinnön mukaisella, edellä kuvatulla tavalla saadulla anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella SP-322 on suuri affiniteetti t-PA:lle. Se on hyödyllinen t-PA:n ja sen johdosten puhdistuksessa immunoabsorbenttina tai reagenssina, jolla määritetään t-PA:n antigeenin tai aktiivisuuden määrä. Esillä olevan keksinnön mukaisen monoklo-naalisen vasta-aineen uskotaan tunnistavan t-PA-molekyylin kringle 2-alueen.

Jotta esillä olevan keksinnön mukaista monoklonaaista vasta-ainetta voitaisiin käyttää t-PA:n ja sen johdosten puhdistamiseen, saatetaan anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine SP-322 ensin reagoimaan aktivoidun agaroosigeelin kanssa, esimerkiksi syanogeenibromidilla aktivoidun Sepharose 4B (tavaramerkki, valmistaja Pharmacia Eine Chemicals Co., Ltd.) tai Afigel 10 (tavaramerkki, valmistaja Biorad Laboratories Co., Ltd.) geelin kanssa tavalliseen tapaan, ··. jolloin saadaan SP-322:n sitova agaroosi. Tämän jälkeen t-PA puhdistetaan tavalliseen tapaan joko pylväsmenetelmällä tai painosmenetelmällä.

- Anti-t-PA monoklonaalista vasta-ainetta SP-322 voidaan käyttää reagenssina EI A (enzyme immunoassay)-menetelmässä tai Rl A ( radioimmunoassay)-menetelmässä. EIA-menetelmässä päällystetään SP-322 ensin kiinteän faasin, kuten mikro-tiitterilevyn jne. päälle ja blokataan naudanseerumialbu-miinilla jne. Sen jälkeen tähän lisätään määrätty määrä .·.·. näytettä, joka sisältää tunnetun tai tuntemattoman määrän kudosplasminogeenin aktivaattoria, mikä tehokkaasti adsorboi näytteen t-PA:n vasta-aineen kautta. Systeemiin lisätään -...· värin tai valon muodostamiseksi entsyymillä leimattua tai biotiinilla sidottua anti-t-PA-vasta-ainetta käyttämällä entsyymiä varten kromogeenistä tai valoa emittoivaa 22 89634 substraattia tai entsyymillä leimattua avidiinia ja sen substraattia. t-PA-konsentraationäytteessä kalibroidaan standar-dikäytön avulla, joka on aikaisemmin saatu käyttämällä stan-dardi-t-PA:ta, jolloin t-PA voidaan määrittää kvantitatiivisesti.

SP-322 anti-t-PA monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi t-PA absorboituu mikrotiitterilevyyn jne., joka on päällystetty SPA-322 vasta-aineella, ja aktiivisuus mitataan suoralla menetelmällä, so. saattamalla reagoimaan t-PA:lie spesifisen kromogeenisen substraatin kanssa. Aktiivisuus mitataan vaihtoehtoisesti epäsuoralla menetelmällä, so. muuntamalla ensin plasminogeeni plasmiiniksi ja hajottamalla plasmiinille spesifinen kromogeeninen aine muodostuneen plasmidin avulla, jolloin muodostuu väri. Näytteen t-PA-konsentraatio kalibroidaan standardikäyrän avulla, joka on aikaisemmin saatu käyttämällä t-PA-standardia.

(Esimerkit)

Seuraavassa on esillä olevaa keksintöä kuvattu yksityiskohtaisemmin esimerkkien avulla.

(Mittaus 1)

Anti-t-PA monoklonaalisen vasta-aineen SP-322 konsentraatioksi saatiin 1 /ag/ml 50 mM karbonaattipuskurilla (pH 9,6) ja 200 ' (R)

ui:n erät lisättiin erikseen mikrolevylle (Linbro EIA

plate, Flow Laboratories, Inc.). Mikrolevyn annettiin seistä huoneen lämpötilassa 4 tuntia tai 4°C:ssa yön yli.

Kaivojen sisältö poistettiin imun avulla ja kaivoihin lisättiin erikseen kuhunkin 200 μΐ 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), jota oli täydennetty 150 mM natriumkloridilla (Kanto Chemical Co., Ltd.), 1 % naudanseerumialbumiinia (Sigma, A-7030) ja 0,02 % natriumatsidia. Levyn annettiin seistä huoneen lämpötilassa yksi tunti tai 4°C:ssa yön yli.

8 9 6 3 4 23

Kaivojen sisältö poistettiin imun avulla ja kaivot pestiin neljä kertaa 300 ^tilrlla 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), jota oli täydennetty 0,05 %:lla Tween 20 (Nakarai Chemicals Co., Ltd.) (puskuri I).

Välittömästi tämän jälkeen lisättiin erikseen 200 jil kutakin näytettä (kokoveri tai laimennettu veri), joka sisälsi kudos- ^ plasmogeenin aktivaattoria, minkä jälkeen annettiin reagoida 10 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Kaivojen sisältö poistettiin imun avulla ja kaivot pestiin 6 kertaa 300 jul:lla puskuria I.

Sen jälkeen kaivoihin lisättiin substraattipuskurina erikseen 200 μΐ 20 mM Tris-hydrokloridipuskuria (pH 7,4), jossa täydennyksenä oli 0,45 mM S-2251:a (valmistaja Kabi Co.,

Ltd.), 150 mM natriumkloridia, 0j01 % Tween 80-tuotetta (valmistaja Nakarai Chemicals Co., Ltd.), 0,042 uM lysiini-plas-minogeeniä ja 120 pg/ml syanogeenibromidilla käsiteltyä fibri-nogeeniä. Inkuboitiin 90 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen .·*. reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 50-prosenttista etikk- .···. ahapon vesiliuosta ja t-PA-aktiivisuus määritettiin spektro- - fotometrillä (Titertek Multiskan Type 310C) aallonpituu- .! della 405 nm. (Periaatekaavio on esitetty kuviossa 3. Ku- . ; viossa 4 on esitetty toinen periaatekaavio tavasta, jolla t-PA-aktiivisuus määritetään suoraan käyttämällä kromogee-nistä peptidisubstraattia ).

Lysiini-plasminogeeni-, syanogeenibromidilla käsitelty fibri-nogeeni- ja anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine SP-322-:Y; valmisteet ovat seuraavat.

. I.' Lysiini-plasminogeenivalmiste

Lysiini-plasminogeeniä (valmistaja The Green Cross Corporation, Code No. 1089) (2100CU) liuotettiin puhtaaseen 24 89634 veteen. Sen sisältämän plasmiinin inaktivoimiseksi täysin lisättiin 20 ml 20000 ΚΙ/ml aprotiniinia (Sigma Corp.,

No. A-6012) (ylimäärä) ja systeemin annettiin seistä 4°C:ssa yön yli. Biogel P100 geeli (BIO RAD) tasapainoitettiin 20 mM Tris-hydrokloridipuskurilla (pH 7,5), joka oli täydennetty 140 mM natriumkloridilla. Samalla puskurilla eluoinnin jälkeen fraktioitiin lysiini-plamsinogeenihuippu. Tässä ajossa saatu proteiinimäärä oli 100 mg. Näin saatu lysiini-plasminogeeni pidettiin käyttöön asti erillään pakastettuna -20°C:ssa.

Syanogeenibromidilla käsitelty fibrinogeenivalmiste

Valmistaminen suoritettiin C. Zammaron-menetelmällä /J. Biol. Chem., 259, No. 4, 2080-2083 (1984)/.

0. 8 g ihmisen fibrinogeeniä liuotettiin 70 %:iin muurahaishappoa, joka sisälsi 1,3 g syanogeenibromidia. Liuosta inkuboi-tiin huoneen lämpötilassa 17 tuntia typpikaasussa. Sen jälkeen seos dialysoitiin 24 tunnin ajan puhdasta vettä vastaan (30 litraa). Lisättiin vielä 5 litraa puhdasta vettä, minkä jälkeen dialysoitiin. Näin valmistettiin syanogeenibromidilla käsitelty fibrinogeeni.

Tässä ajossa saatu proteiinimäärä oli 700 mg. Saatu syanogeenibromidilla käsitelty fibrinogeeni säilytettiin käyttöön asti erillään pakastettuna -20°C:ssa.

Anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine-valmiste: 1. Hybridoma SP-322-valmiste a) Immunisoitujen pernasolujen valmistaminen

Emulsio, joka oli saatu sekoittamalla puhdistettua ihmisen melamoonasoluista saatua t-PA:ta (valmistaja Bioscott Co.,

Ltd.) saman tilavuuden kanssa Freund'in täydellistä apuainetta, annettiin intraperitoneaalisesti BALB/C-kannan i 25 89634 naarashiirille (ikä 8 viikkoa immunisoinnin alussa) annoksella 30 pg/hiiri tai 7,5 ug/hiiri (ensimmäinen immunisointi). Tämän jälkeen injisoitiin kaksi kertaa 3-4 viikon välein intraperitoneaalisesti emulsio, joka oli saatu sekoittamalla 30 jug/hiiri tai 7,5 jig/hiiri t-PA:ta saman tilavuuden kanssa Freund'in epätäydellistä apuainetta. Kuuden viikon jälkeen kolmannesta immunisoinnista annettiin intraperitoneaalisesti (viimeinen immunisointi) 0,4 ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 30 ^ig/hiiri tai 7,5 jug/hiiri t-PA:ta. Kolmen päivän kuluttua viimeisestä immunisoinnista otettiin pernasoluja 2 hiireltä ja nämä suspendoitiin DMEM-mediumiin. Punaiset verisolut poistettiin käsitelemällä 10 minuutin ajan 0°C:ssa 0,17M ammoniumkloridilla, minkä jälkeen sentri-fugoitiin.

b) Hybridoma SP-322:n valmistaminen

O

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut pernasolut (5 x 10 ) fuusioitiin hiiren myeloomasolujen P3X63 Ag8.Ul (P3U1) g (.1 x 10 ) kanssa Köhler'in ja Milstein'in menetelmällä '···' /Nature, 256, 495 ( 1975)/. Pernasolut ja P3Ul-solut pestiin ' isten useita kertoja DMEM-mediumilla. Sen jälkeen molemmat :.'*i sekoitettiin 50 ml:n muovisessa koeputkessa, joka sisälsi | tuoretta DMEM-liuosta.

:Y: Sen jälkeen poistettiin medium sentrifugoimalla. Samalla sekoittaen lisättiin m inuutin aikana vähitellen 1 ml 37°C DMEM-mediumia, joka sisälsi 50 % (paino/tilavuus) polyety-leeniglykolia (valmistaja Sigma Corporation, keskimääräinen . . molekyylipaino 3640). Tämän jälkeen solujen fuusio saatet tiin loppuun lisäämällä tipottain 10 ml 37°C DMEM-mediumia.

: ’ : Solususpensio sentrifugoitiin. Supernatantin poistamisen ·:* ' jälkeen lisättiin HAT-mediumia /DMEM-medium, joka sisältää ! 10 % vasikansikiöseerumia täydennettynä hypoksantiinilla -4 _7 ' ; (1 x 10 M), aminopteriinillä (4 x 10 M) ja tymidiinillä 26 89634 (1,6 x 10 5 M)/ solupcllettiin niin, että pernasolujen konsentraatioksi saatiin 5 x 10^ solua/ral. 2 ml tätä solusus-pensiota maljättiin 24 kaivon muovilevylle (pernasolut, 1 x 106/kaivo).

Puolet mediumista poistettiin imun avulla, joka 4. - 5. päivä ja täydennettiin edellä mainitulla HAT-mediumilla.

7-10 päivää solujen fuusioinnin jälkeen havaittiin kaikissa kaivoissa hybridomakasvua. Viljelysupernatantin anti-t-PA-aktiivisuus määritettiin immunosaostusmenetelmällä.

c) Anti-t-PA-aktiivisuuden mittaaminen supernatantissa immu-nosaostusmenetelmällä 125

Radioaktiivista jodia ( I)-leimattua (kloramiini T-mene- telmällä) t-PA:ta /100 pl, liuotettu 25 mM Tris-puskuriin, pH 7,4, jossa 0,7 % naudanseerumialbumiinia, 0,3 M natrium- kloridia ja 0,05 % (paino/tilavuus) Tween 80:a; tästä käytetään 125 jäljempänä yksinkertaiesti nimitystä I-t-PA/ sekoitettiin 20 pii:n kanssa hybridoma-viljelmän supernatanttia. Annettiin seistä muovikoeputkessa huoneen lämpötilassa yön yli, minkä jälkeen seokseen lisättiin 1 ui kaniinin anti-hiiri-IgG-anti-seerumia. Sen jälkeen seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa vielä 3 tuntia.

Seokseen lisättiin 10 ui pansorbiinia (tavaramerkki, valmistaja

Calbiochem Co., Ltd.). Kolmenkymmenen minuutin sekoittamisen jälkeen tähän lisättiin 2 ml Tris-puskuria. Seos sentri- fugoitiin välittömästi (3000 kierr./min., 15 minuuttia).

125

Sueprnatantti poistettiin ja I-t-PA:n radioaktiivisuus sakassa laskettiin Autowell Gamma Counter Model ARC 300- laskimella, valmistaja Aloca Co., Ltd. Hybridomaa kasvavissa 12 5 kavioissa, joissa I-t-PA-immuunisaostuminen oli merkittävää, soluja kasvatettiin edelleen DMEM-mediumissa yhden solun kloonaamiseksi. Kloonaus suoritettiin kaksi kertaa rajalai-mennusmenetelmällä käyttämällä 96 kaivon mikrolevyä, jossa syöttösoluina käytettiin BALB/C-hiiren tymosyyttejä 8 9 63 4 27 (10b solua/kaivo). Näin saadulle hybridomakloonille annettiin nimeksi SP-322. Myös hybridoman SP-322 tuottamalle anti-t-PA monoklonaaliselle vasta-aineelle annettiin nimeksi SP-322.

II. Monoklonaalisen vasta-aineen tuottaminen ja puhdistaminen 0,5 ml 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaania (Pristan, valmistaja Aldrich Co., Ltd.) injisoitiin intraperitoneaali-sesti 6-8 viikon vanhoihin BALB/C-kannan uroshiiriin, minkä jälkeen 7-14 päivän kuluttua injisoitiin intraperitoneaa-lisesti suspensioon, jossa oli 10 hybridoma SP-322 solua 0,5 ml:ssa fysiologista suolaliuosta. 10 - 20 päivän kuluttua hiiristä otettiin askitis-nesteet. Jokaisesta eläimestä saatiin 5 - 10 ml askitis-nestettä, joka sisälsi monoklonaalista vasta-ainetta. Askitis-nesteistä poistettiin liukenematon aines sentrifugoimalla. Sen jälkeen supernatanttiin lisättiin yhtä suuri tilavuus ammoniumsulfaatin kyllästettyä liuosta. Seoksen annettiin seistä 4°C:ssa tunnin - yön yli. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin 0,1 m fos-: ' : faattipuskuriin, pH 8, joka sisälsi 0,9 % natriumkloridia.

Sen jälkeen liuos dialysoitiin saman puskurin 100-kertaista tilavuutta vasten (γ-globuliinijae) . IgG puhdistettiin tästä jakeesta käyttämällä puhdistamiseen MAPS-II-kittiä (hiiren - - monoklonaalinen vasta-aine, tavaramerkki, valmistaja Biorad ! Laboratories). Sen jälkeen γ-globuliinijakeeseen lisättiin yhtä suuri tilavuus sidospuskuria. Sekoittamisen jälkeen seos vietiin pylvääseen (geelipeddin tilavuus 5 tai 10 ml), joka oli pakattu Affigel Protein A-geelillä (valmistaja Bio Rad Laboratories) tai proteiini A Sepharose CL4B-geelillä (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). Geelit oli riit-tävästi esitasapainoitettu samalla sidospuskurilla ja sen ·' jälkeeen pesty 10-kertaisella pylvään tilavuudella. IgG eluoi- tiin kitin sisältämän eluointipuskurin noin pylvään 3-kertai-.. sessa tilavuudessa. Eluoitu IgG-jae väkevöitiin ulossuolaamalla ammoniumsulfaatilla. Tiiviste dialysoitiin 0,01 - 0,1 M fosfaattipuskuria vasten, joka sisälsi 0,9 % natriumkloridia.

28 B9634 Tälle annettiin nimeksi SP-322:n IgG-standardi. 1 ml kohti askitis-nestettä saatiin yleensä 11 - 18 mg IgG-proteiinia.

Monoklonaalisen vasta-aineen fysikokemialliset ominaisuudet

Seuraavat fysikokemialliset ominaisuudet määritettiin käyttämällä monoklonaalisen vasta-aineen SP-322 IgG-jaetta, joka oli puhdisetttu kohdan II mukaisesti lukuunottamatta kohtaa b) .

a) Molekyylipaino: 153.0000 (+ 10.000) SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesi suoritettiin 9 %:n tai 12 %:n levygeelillä käyttämällä Laemli'n puskurisystee-miä /Nature, 227, 680 (1970)/, millä voitiin arvioida vasta-aineen molekyylipaino. Molekyylipainon markkerina käytettiin Pharmacia Fine Chemicals-yhtiön valmistamaa elektroforeesiin tarkoitettua molekyylipainon kalibrointikittiä (pienen mole-kyylipainon kitti; fosforylaasi b, 94000; naudanseerumial-bumiini, 67000; ovalbumiini, 43000; hiilihappoanhydraasi, 30000; trypsiini-inhibiittori, 20100; a-laktalbumiini, 14400).

b) IgG-alaluokka: IgG 1

Hybridomaviljelman supernatanttia käyttämällä määritettiin SP-322:n IgG-alaluokka serotech Co., Ltd.-yhtiön valmistamalla kitillä, joka on tarkoitettu hiiren monoklonaalisen vasta-aineen tyypittämiseen. Tämä suoritetaan Ouchterlony'n kaksoisimmunodiffuusio-menetelmällä, jossa 75 /il supernatanttia laitettiin keskellä olevaan kaivoon ja kehällä oleviin kaivoihin lisättiin 10 μΐ eri anti-hiiri-immunoglobuliini-vasta-aineita. Sen jälkeen, kun oli annettu seistä huoneen lämpötilassa 24 tuntia, tarkkailtiin antigeeni-vasta-ainekomplek-sista johtuvien viivamaisten saostumien muodostumista.

29 B 9 6 3 4 c) Aminohapposekvenssi (amino-pää): L-ketju: Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser

IgG:n L-ketjun ja H-ketjun sekvenssianalyysi sen aminopäässä suoritettiin Edman'in hajotusmenetelmällä (Edman et ai.,

European J. Biochem., 1, 80 (1967)/. Vasta-aine IgG-molekyylin L-ketju ja H-ketju erotettiin toisistaan SDS-polyakryyli-amidigeeli-elektroforeesin avulla pelkistävissä olosuhteissa. Kumpikin ketju otettiin geelistä talteen elektroeluoimalla.

Sen jälkeen puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC-menetelmällä ja kumpikin ketju analysoitiin kaasufaasi-sekvenssointilait-teella (malli 470A; valmistaja Applied Biosystems Co., Ltd.), jolla suoritettiin kytkeminen, peptidisidoksen katkaiseminen ja PTH (fenyylihydantoiini)-leimattujen aminohappojen muodostaminen. Saadut PTH-aminohapot erotettiin ja analysoitiin suoraan sekvenssointilaitteeseen yhdistetyn PTH-analysaatto-rin avulla (malli 120 A, valmistaja Applied Biosystems Co.,

Ltd.). Jokainen PTH-aminohappo tunnistettiin vertaamalla retentioaikaa PTH-aminohappo-standardiin.

Tämän tuloksena tunnistettiin L-ketjussa 14 aminohapporyhmää aminopäästä, jolla on edellä kuvattu sekvenssi. Toisaalta H-ketjusta ei voitu määrittää sen sekvenssiä edellä kuvatulla menetelmällä suoraan aminopäästä; H-ketjun osalta tämän uskotaan mahdollisesti johtuvan siitä, että aminopää on salvattu kaikissa muodoissa.

d) Affiniteetti antigeenin suhteen

Affiniteetti antigeenin suhteen määritettiin seuraavasti.

immunosaostusreaktioon, jossa käytettiin edellä mainitun 125 I-leimatun t-PA:n SP-322-vasta-ainetta, lisättiin en konsentraatioita leimaamatonta t-PA:ta kilpailutilanteen aiheuttamiseksi ja näin saatiin inhibitiokäyrä (kuvio 10). Dissosiaatiovakio arvioitiin karkeasti leimaamattoman t-PA:n siitä konsentraatiosta, jossa inhibitio oli 50 %.

30 b 9 6 3 4

Monoklonaalisen vasta-aineen SP-322 dissosiaatiovakion affiniteetin arvioitiin olevan noin 20 - 40 kertaa suurempi kuin Bioscott Co., Ltd.-yhtiön valmistamalla anti-t-PA monoklo-naalisella vasta-aineella ESP-2. Tämä affiniteetti on verrattavissa polyklonaalisen vasta-aineen n:o 387 (valmistaja American Diagnostica Co., Ltd.), jolla on korkein affiniteetti antigeenin suhteen, affiniteettiin.

Lisäksi tutkittiin t-PA-ketjun eroista riippuva, esillä olevan keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen affiniteetti-eroa käyttämällä ihmisen melamoonasoluista saatua, tyypiltään yksiketjuista tai kaksiketjuista t-PA:ta (valmistaja American Diagnostica Co., Ltd.). Ero määritettiin inhibitiokäyristä, jotka saatiin lisäämällä yksiketjuista tai kaksiketjusita t-PA:ta 1 - 100 ng putkea kohti edellä mainittuun 125 I-t-PA:n immunosaostusreaktioon. Kuvion 11 mukaisesti arvioitiin, että SP-322:11a oli lähes yhtä suuri affiniteetti sekä yksiketjuisen että kaksiketjuisen t-PA:n suhteen.

e) Monoklonaalisten vasta-aineen SP-322 vaikutus t-PA:n fibrinolyyttiseen aktiivisuuteen SP-322:n vaikutus t-PA:n fibrinolyyttiseen aktiivisuuteen 125 tutkittiin in vitro I-leimatun flbrnmkalvon lyysaus- 125 menetelmällä. I-leimatun fibriinikalvon lyysaysmenetelmä suoritettiin Hoyraerts'in et ai. kuvaamalla tavalla /J. Biol. Chem., 257, 2912 (1982)/. Menetelmässä sekoitettiin 125 riittävä määrä I-fibrinogeeniä (valistaja Commissariat A L'energie Atomique Co., Ltd.) 1,8 jiM kanssa f ibrinogeeniä.

96 kaivon mikrotiitterilevylle (Limbro) lisättiin 5 ui seosta kaivoa kohti ja kuivattiin yön yli 40°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin kulloinkin 100 ui 1,6 u/ml trombiinia (valmistaja Mochida Parhamaceutical Co., Ltd.). Levyn annettiin seistä 4 tuntia 37°C:ssa fibriinin muodostumisen saattamiseksi loppuun. Sen jälkeen levy pestiin kaksi kertaa 10 mM fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 0,2 % naudanseerumialbumiinia i 31 89654 ja 0,9 % natriumkloridia, ja aktiivisuus määritettiin. Kuhunkin kaivoon lisättiin 50 μΐ 200 nm plasminogeeniä ja lisättiin 50 ui joko t-PA-standardia tai tuntematonta näytettä. Sekoittamisen jälkeen suoritettiin reaktio 2 tunnin aikana 37°C:ssa.

125

Kustakin kaivosta otettiin 50 Pi i* lyysaantunut I-fibriini laskettiin Autowell gamma counter-laskimella (valmistaja Aloca Co., Ltd. t-PA:n fibrinolyyttinen aktiivisuus määritettiin kvantitatiivisesti kalibroimalla standardikäyrästä, joka oli saatu käyttämällä t-PA-standardia. Käytetty t-PA-standardi on ihmisen melanoomasolusta saatu t-PA (Bioscott Co., Ltd.), joka standardisoitiin kansainvälisen t-PA-stan-dardin mukaisesti /Gaffney ja Curtis, Thromb. Haemostas., 53, 134 (1985)/.

t-PA:n (5 μ/ml), jota oli etukäteen inkuboitu 0,8 - 80 ^g/ml SP-322:n kanssa huoneen lämpötilassa yön yli, aktiivisuus mitattiin. Kuten kuviosta 12 käy ilmi, aktiivisuuden havaittiin jonkin verran pienentyneetn (noin 15 %), mutta pieneneminen ei merkitsevästi eronnut kontrollina käytetystä t-PA:an sitoutumattoman monoklonaalisen vasta-aineen vastaavasta arvosta (anti-humaani tuumorinekroosifaktori-vasta-aine).

Sitä vastoin polyklonaalisella anti-t-PA-vasta-aineella (vuohi, valmistaja American Diagnostica Co., Ltd.) tai monoklonaali-sella vasta-aineella ESP-2 (valmistaja Bioscott Co., Ltd.) esiintyi huomattavaa aktiivisuuden inhibitiota jo minimian-: : ; noksella.

f) Antigeenin sitoutumiskohta t-PA:ta ja SP-322:ta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 tuntia painosuhteessa 1:1000, minkä jälkeen t-PA:n affiniteetti fibriinin suhteen tutkittiin Verheijen'in menetel-mällä /EMBO. J., 5, 3525 (1986)/. 1 u trombiinia lisättiin :·: t-PA:n (loppukonsentraatio 2 μς/ml) ja fibrinogeenin (loppu- konsentraatio 1 - 125 ^g/ml) seokseen. Seosta sekoitettiin ja fibriinin annettiin muodostua seisottamalla huoneen lämpötilassa 3 minuuttia. Sen jälkeen koeputkea sentrifugoitiin (1600 kierr./min., 8 minuuttia) ja fibriinin maljausmene- 32 is9 634 telmällä määritettiin supernatantin fibriiniin sitoutumattoman t-PA:n aktiivisuus. Fibriinin maljausmenetelmässä ei SP-322 inhiboi voimakkaasti t-PA-aktiivisuutta. Kuvion 13 mukaisesti sitoutuminen fibriiniin inhiboitu voimakkaasti, kun t-PA esikäsiteltiin SP-322:lla. SP-322:lla oletetaan olevan sito-miskohdan t-PA:n fibriiniaffiniteetti-kohdassa, mutta sen ei oleteta sitoutuvan T-PA:n aktiiviseen kohtaan.

g) Ristikkäisaktiivisuus urokinaasin kanssa SP-322:n ja urokinaasin (valmistaja The Green Cross Corporation) välinen ristikkäisaktiivisuus tutkittiin edellä mainitun 125 immunosaostusreaktion ja I-fibriinikalvon lyysausmene- telmän avulla. Ristikkäisreaktiivisuus määritettiin immuno- saostusreaktiossa ehkäisevällä vaikutuksella, joka urokinaa- 125 .

silla on I-t-PA:n SP-322:11a suoritettua immunosaostusta vastaan. Havaittu inhibitio oli 44 % vain, kun lisättiin 150 ju/putki urokinaasia (kuvio 14). Verrattaessa t-PA:11a saatuihin inhibitiokäyriin (kuvio 10) saatiin urokinaasin 125 ristikkäisreaktiivisuudeksi noin 0,1 % t-PA:sta. I-fib-riinikalvon lyysausmenetelmässä ei SP-322 lainkaan inhiboinut urokinaasiaktiivisuutta (3^/ml) missään konsentraatioissa 80 ug/ml asti.

Standardisointi

Kalibrointikäyrä saatiin käyttämällä 0,02 - 40 ng/ml yksi-ketjuisen t-PA:n standardinäytetitä. Laimennus suoritettiin puskurilla I, jota oli täydennetty 0,25 %:lla naudanseerumi- albumiinia.

Tulokset osoittivat, että kalibrointikäyrää voitiin käyttää välillä 0,03 - 20 ng/ml.

33 89654 t^PA-aktiivisuuden mittaaminen terveiden vapaaehtoisten verinäytteistä

Terveitä vapaaehtoisia henkilöitä pidettiin levossa 10 minuuttia. Käsivarren yläosaa suljettiin tiiviisti 5 minuutin ajan 100 mmHg paineella, minkä jälkeen punkteerattiin ulompi kyynär-laskimo. Verinäytteet otettiin 1/10 tilavuusosaan 3,8-prosent-tista natriumsitraattia (The Green Cross Corporation). Veren keräämisen jälkeen verinäytteet siirrettiin koeputkeen, jota oli pidetty jäissä. Välittömästi tämän jälkeen laitettiin erikseen 200 ui kokoverinäytettä vasta-aineella päällystetylle, etukäteen valmistetulle mikrolevylle ja käsiteltiin määritystä varten edellä kuvatulla tavalla.

Tulokset on annettu taulukossa 1.

Taulukko 1 N:o Ikä t-PA-aktiivisuus N:o Ikä t-PA-aktiivisuus (ng/ml (ng/ml *1 26 0,34 + 0,02 16 25 0,02 2 28 0.30 + 0.01 7 26 0,16 + 0 3 31 0,17 + 0,01 8 34 0,05 + 0 4 34 0,81 + 0,01 9 43 0,08 + 0 5 37 1.22 + 0j 4 4 10 47 0,42 + 0,02 keski- _ 0,57 keski- - 0,15 arvo x arvo x ' * N:ot 1-5; veri otettiin ptiämällä 5 minuuttia 100 mmHg paineessa.

N:ot 6 - 10:veri otettiin normaalisti.

34 89634

Vertailuna todettakoon, että 1 ng/ml t-PA-aktiivisuutta vastaa 0,55 IU/ml aktiivisuutta.

(Mitatus 2)

Upotuspuikon valmistaminen

Polystyreenistä valmistettu muovipuikko (valmistaja Nippon Soda Co., Ltd., pituus 100 mm, leveys 5,5 mm ja paksuus 1 mm) upotettiin yön ajaksi vesihauteeseen, joka sisälsi 60°C, 20-kertaisesti laimennettua Extran Ma 01-tuotetta (tavaramerkki, valmistaja Merck Inc.). Puikkoa pestiin ultraäänellä toimivassa, pesukoneessa 3 tuntia ja vesijohtovedellä 3 tuntia, minkä jälkeen se upotettiin yön ylitse tislattuun veteen. Puikko kuivattiin kuivaajalla 40°C:ssa ja 10 ml:n päähän puikon kärjestä tehtiin kummallekin pinnalle katkaisualueena toimiva rako. Anti-t-PA monoklo-naalisen vasta-aineen SP-322 konsentraatioksi säädettiin 1 jjg/ml 50 mM karbonaattipuskurilla (pH 9,6) ja 200 yul kutakin laitettiin erikseen PPN Tube^-putkeen (tavaramerkki, valmistaja Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).

Sen jälkeen puikko laitettiin putkeen ja vasta-aine päällystettiin puikon päälle seisottamalla putkea huoneen lämpötilassa 4 tuntia tai yön yli 4°C:ssa. Päällystetty puikko laitettiin PPN Tube-putkeen, jossa oli 500 jal 10 mM Tris-hydrokloridipuskuria (pH 7,4), jossa oli 150 mM natriumkloridia, 1 % naudanseerumialbumiinia (valmistaja Sigma) ja 0,02 % natriumatsidia. Sen pinta blokattiin seisottamalla putkea jälleen huoneen lämpötilassa 4 tuntia tai yön yli 4°C:ssa. Puikko pestiin edellä kuvatulla puskurilla I ja säilytettiin puskurissa I 4°C:ssa.

Tämä päällystetty ja blokattu puikko oli stabiili yli 3 kuukautta, kun sitä säilytettiin puskurissa 4°C:ssa.

35 8 9 6 6 4 t-PA-aktiivisuuden mittaaminen terveen koehenkilön verinäytteistä upotuspuikkoa käyttämällä 1) t-PA-aktiivisuuden mittaaminen käyttämällä kokoverinäy- tettä

Verta otettiin vapaaehtoisten koehenkilöiden ulommasta kyynarlaskimosta vakuumiputkeen, joka sisälsi niin paljon 3,13-prosenttista natriumsitraattia, että natriumsitraatin ja verinäytteen suhde oli 1:9. Välittömästi veren ottamisen jälkeen siirrettiin edellä mainittu etukäteen valmistettu puikko, joka oli päällystetty anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella ja blokattu, vakuumiputkeen, jossa sen annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 10 minuuttia.

Puikko poistettiin, pestiin puskurilla I ja vietiin mikrole-vylle. Käyttämällä mikrolevyn kaivoa tukena katkaistiin puikko ja mikrolevyllä pidettiin vain puikon se osa, jossa oli anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella päällystetty alue.

Sen jälkeen lisättiin mikrolevyn kaivoihin substraattipusku- rina erikseen kulloinkin 200 P1 20 mM Tris-hydrokloridipus- kuria (pH 7,4), joka oli täydennetty 0,45 mM S-2251:lla (valmistaja Kabi Co., Ltd.), 150 mM natriumkloridia, 0,01 % Tween 80:a (valmistaja Nakarai Chemicals Co., Ltd.), 0,042 Jim lysiini-plasminogeenia ja 120 ug/ml syanogeeni- bromidilla käsiteltyä fibrinogeenia. Inkuboitiin 17 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen puikko poistettiin ja näytteestä määritettiin t-PA-aktiivisuus Multiskan Type 310C (R) /Titertek /-spektrofotometrillä aallonpituudella 405 nm.

Reaktio voidaan pysäyttää käyttämällä 50 jil 50-prosentt.ista etikkahapon vesiliuosta, mutta tässä nimenomaisessa esimerkissä ei kuitenkaan etikkahapon vesiliuosta käytetty.

2) t-PA-aktiivisuuden mittaaminen käyttämällä laimennettua verinäytettä 36 89634

Veri kerättiin samalla tavoin kuin kohdassa 1), minkä jälkeen 0,5 ml verinäytettä lisättiin välittömästi koeputkeen, joka sisälsi ennalta valmistetun puikon, joka oli päällsytety anti-t-PA monoklonaalisella vasta-aineella ja blokattu, ja 1,5 ml puskuria I. Koeputken annettiin seistä huoneen lämpötilassa 60 minuuttia.

Sen jälkeen määritettiin t-PA-aktiivisuus laimennetussa verinäytteessä samalla tavoin kuin kohdassa 1) paitsi, että reaktio substraattipuskurin kanssa suoritettiin 4 tunnin aikana.

Verinäytteen t-PA-aktiivisuus voitaisiin määrittää myös ottamalla 0,45 ml verta vakuumiputkeen, joka jo sisältää 1,5 ml puskuria I, 0,05 ml antikoagulanttia ja edellä kuvatun puikon. Tämä menetelmä on erityisen hyvä siinä suhteessa, että reaktio voidaan suorittaa välittömästi veren keräämisen jälkeen. Jäljempänä kuvatut arvot saatiin käyttämällä edellä kuvattua vakuumiputkea.

Standardisointi

Standardisointi suoritettiin myös puikkomenetelmissä 1) ja 2) samalla tavoin kuin mittauksessa 1.

Kuvioissa 5, 6 ja 7 on vastaavasti esitetty 1) puolilogarit-misella asteikolla oleva kalibrointikäyrä, joka on saatu käyttämällä puikkoa ja kokoveri-menetelmää, 2) puoliloga-ritmisella asteikolla oleva kalibrointikäyrä, joka on saatu käyttämällä puikkoa ja laimennettu veri-menetelmää, 3) ja lineaarista kalibrointikäyrää, joka on saatu menetelmällä 2) .

Näistä käyristä voidaan havaita, että ilmeisestikin mitä tahansa mittausmenetelmistä 1) ja 2) voitaisiin käyttää hyvin kalibrointikäyrinä välillä 0,008 - 2 IU/ml.

37 9 9 634 t-PA-aktiivisuuden mittaustulokset terveen koehenkilön verinäytteistä

Kuviossa 8 on esitetty tulokset, jotka on saatu käyttämällä edellä kuvattua menetelmää, jossa kyseessä on kokoverinäyte. Kuviossa 9 on esitetty saadut tulokset käytettäessä laimennettua verinäytettä.

Nämä tulokset osoittavat, että verinäytteen todellinen t-PA-aktiviisuus voidaan mitata keräämällä veri tavalliseen tapaan ja että esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä, erityisesti upotuspuikkomenetelmä, on paljon parempi kuin tavanomaiset menetelmät.

Claims (13)

1. Menetelmä t-PA (kudosplasminogeenin aktivaattori)-aktiivi-suuden mittaamiseksi, tunnettu siitä, että kiinteä faasi, johon on sidottu anti-t-PA vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa affiniteetin t-PA:n johonkin muuhun kuin aktiiviseen kohtaan, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) molekyy1ipaino: 153.000 + 10.000 b) IgG-alaiuokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi (L-ketju): Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta saatetaan reagoimaan kokoveren tai laimennetun veren t-PA:n kanssa ja sen jälkeen määritetään reaktiotuotteen entsymaatti-nen aktiivisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotteen aktiivisuus määritetään saattamalla tuote reagoimaan t-PA:lie spesifisen kromogeenisen peptidisubstraa-tin kanssa ja mittaamalla kromogeenisestä peptidisubstraatista vapautuneen aineen määrä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotteen aktiivisuus määritetään saattamalla reaktiotuote reagoimaan t-PA:lie spesifisen entsyymisubstraa-tin kanssa t-PA:n stimulaattorin läsnäollessa tai ilman sitä, antamalla näin muodostuneen entsyymin vaikuttaa entsyymille spesifiseen kromogeeniseen peptidisubstraattiin ja mittaamalla kromogeenisestä peptidisubstraatista vapautuneen aineen määrä.

4. Kitti t-PA-aktiivisuuden mittaamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään kiinteän faasin, johon on sidottu anti-t-PA-vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa affiniteetin t-PA:n johonkin muuhun kohtaan kuin aktiiviseen kohtaan, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) molekyy1ipaino: 153.000 + 10.000 b) IgG-alaluokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi 39 89634 (L-ketju): Asp-11e-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta ja reagenssin, jolla mitataan fraktion sitovan kiinteän faasin ja t-PA:n välisen reaktiotuotteen entsymaattinen aktiivisuus kokoveressä tai laimennetussa veressä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen mittauskitti, tunnet-t u siitä, että reagenssi, jolla reaktiotuotteen aktiivisuus mitataan, on vain t-PA:lle spesifinen kromogeeninen peptidi-substraatti, t-PA:lle spesifinen entsyymisubstraatti, entsyymille ja mahdollisesti t-PA:lle spesifinen kromogeeninen peptidisubstraatti.

6. Upotuspuikko t-PA-aktiivisuuden mittaamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää muovista valmistetun puikon, jonka päälle on immobilisoitu antit-PA-vasta-aine IgG-fraktio, joka omaa aktiivisuuden t-PA:n johonkin muuhun kuin aktiiviseen kohtaan, ja jolla on seuraavat ominaisuudet: a) molekyylipaino: 153.000 ± 10.000 b) IgG-alaiuokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi (L-ketju): Asp-I1e-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen upotuspuikko t-PA-aktiivi-suuden mittaamiseksi, tunnettu siitä, että siinä on katkaisusiue, niin että immobi1isoidul1 a vasta-aineella kyllästetty pää helposti voidaan katkaista.

8. Patenttivaatimuksen 6 yai 7 mukainen upotuspuikko t-PA-aktiivisuuden mittaamiseksi, tunnettu siitä, että puikko on sijoitettu vakuumiputkeen, joka sisältää antikoagu-lanttia ja/tai 1aimennusainetta. 40 H 9 6 ό 4

9. Anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen t-PA:lle, tunnettu siitä, että sille on tunnusomaista seuraavat ominaisuudet: a) molekyylipaino: 153.000 ± 10.000 b) IgG-a1 aiuokka: IgG 1 c) muuttuvan alueen aminohapposekvenssi (L-ketju): Asp-I1e-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser d) t-PA-antigeenin vastainen sitoutumiskohta: fibriinin sitoutumiskohta tai sitä lähellä oleva kohta.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen anti-t-PA-monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on saatu immunisoimalla ihmisen melanoomasolui injasta saadulla t-PA:lla.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen anti-t-PA-monoklo-naalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on saatu hiiren hybridomasolukloonista SP-322.

12. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-t-PA-vasta-aine-IgG-fraktio on patenttivaatimuksen 9 mukainen monoklonaalinen vasta-aine.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 4-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 9 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta käytetään anti-t-PA-vasta-aine-IgG-fragmenttina. Β 9 6 5 4 41