FI101476B - Menetelmä kalsiumista riippuvan proteiini C:n vastaisen monoklonaalise n vasta-aineen valmistamiseksi - Google Patents

Description

101476

Menetelmä kalsiumista riippuvan proteiini C:n vastaisen mo-noklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee yleensä plasmaproteiinien, erityisesti proteiinin C, vasta-aineita ja menetelmiä niiden valmistamiseksi .

Proteiini C on vitamiinista K riippuva plasman seriinipro-10 teaasin esiasteproteiini. Aktivoituessaan siitä tulee voimakas veren hyytymistä estävä aine. Aktivoitu proteiini C toimii prokoagulantin kofaktoreiden, faktorin Villa ja faktorin Va spesifisen proteolyysin kautta. Tämä aktiivisuus vaatii toisen vitamiinista K riippuvan proteiinin, proteii-15 nin S, kalsiumin ja fosfolipidi(todennäköisesti solu-)pin-nan läsnäoloa. Viitaten kuvaan 1 teoksesta Hemostasis and Thrombosis :_Basio Principles and Clinical_Practice, 2. pai nos, Colman, R.W. at ai., s. 263 (J.B. Lippincott, Philadelphia, PA 1987), proteiini C kulkee verenkierrossa 2-ket-20 juisessa muodossa, suuremman, raskaan ketjun ollessa sitoutuneena pienempään, kevyempään ketjuun yhdellä ainoalla di- : sulfidisidoksella. Pieni osa proteiinista esiintyy veren

kierrossa myös 1-ketjuisessa muodossa, jossa molekyylin lys-arg-dipeptidi yhdistää keveän ketjun suoraan raskaaseen ’· 25 ketjuun. Proteiini C aktivoituu aktivoiduksi proteiiniksi C

···· (APC) . Trombiini voi aktivoida proteiinin C lohkaisemalla • * * · 12 13 *...* raskaan ketjun Arg -Leu -sidoksen spesifisesti. Tämän ak- ·' tivaation nopeus kasvaa dramaattisesti in vivo kalsiumin fysiologisten konsentraatioiden läsnäollessa, kun trombiini 30 on sitoutunut endoteelin solukofaktoriin, trombomodulii- niin. Edelleen Matschiner at ai., Current Advances in Vita-min K Research, s. 135-140, John W. Suttie, toim. (Elsevier • · · .·:* Science Publishing Co., Inc. 1988) on toimittanut katsauk- ’· · sen vitamiinista K riippuvien proteiinien merkityksestä ve- ·. ·. 35 ren hyytymisessä.

Proteiinilla C on ilmennyt olevan mitä suurin merkitys ±n .··. vivo. Potilailla, joilta puuttuu proteiini C tai sen kofak- tori, proteiini S, on havaittu selviä taipumuksia veritulp-40 paan. Vauvoilla, jotka syntyvät täysin ilman proteiinia C, 2 101476 ilmenee laajalle levinnyttä verisuontensisäistä verenhyytymistä (DIC) ja kuolio-oireyhtymää, joka hoitamattomana johtaa kuolemaan ensimmäisten muutaman elinviikon aikana. Aktivoitu proteiini C on myös osoittautunut suojaavan eläimiä 5 endotoksiinishokin verenhyytymishäiriö- ja kuolettavia vaikutuksia vastaan, kuten Taylor et. ai. on kuvannut julkaisussa J. Clin. Invest 13 (1987) 918-925.

Kuten Kisiel ensin esitti julkaisussa J. Clin. Invest £A 10 (1979) 761-769, proteiini C eristettiin alunperin plasmasta puolipuhtaassa muodossa käyttämällä klassisia proteiinin-puhdistustekniikkoja, joihin liittyi bariumsitraattiadsorp-tio ja -eluointi, ammoniumsulfaattifraktionointi, DEAE-Sephadex-kromatografia, dekstraanisulfaatti/agaroosi-kro-15 matografia ja preparatiivinen polyakryyliamidigeelielektro-foreesi. Tämä menetelmä parani ja helpottui suuresti, kun proteiini C:lle keksittiin ainutlaatuinen vasta-aine, jota merkitään HPC-4, ja jonka on kuvannut: Stearns et ai.; J. Biol. Chem. 263(2) (1988) 826-832. Kuten Esmon et ai. on 20 esittänyt yksityiskohtaisesti symposiumissa the Joint IABS/CSL Symposium on Standardization in Blood Fractionati-on including Coagulation Factors, Melbourne, Australia 1986 (raportoitu julkaisussa Develop, biol. Standard. £3, s. 51-57 (S. Karger, Basel, 1987), proteiini C voidaan eristää ' ' 25 ihmisen plasmasta laimennetun hepariinisoidun plasman jak- ···.' soittaisella absorptiolla QAE Sephadexiin, pesemällä pusku- ·...’ roidulla 0,15 M NaCl:llä ja eluoimalla 0,5 M NaCl:lla, kal- '·/· · siumpitoisuuden säädöllä ja jaksoittaisella adsorboinnilla 2+ i HPC-4:11a, pesemällä sitten Ca :ta sisältävällä puskurilla 30 ja eluoimalla proteiini C EDTA:ta sisältävällä puskurilla.

:\ HPC-4 on kalsiumista riippuva ihmisen proteiinin C monoklo- • · » .·;· naalinen vasta-aine. Vasta-aineen tunnistama epitooppi on • « \ . tunnistettu, ja se vastaa proteiinin C entsyymiesiasteen ·.’· 35 aminohappoaluetta, joka ulottuu trombiinin katkaisukohdan '·'*· yli. HPC-4 ei tunnista aktivoitua proteiini C:tä. 1

Useita ihmisen proteiini C-vasta-aineita on esitetty, esimerkiksi: Laurell at ai., FEBS Letts. 1£L1(1) (1985) 75-81; 40 Wakabayashi et. ai., J. Biol. Chem. 261 (1986) 11097-11105; 3 101476

Sugo at al. , Thromb. Hemost. Abstrs., Brysseli, 229 (1987); ja Ohlin at al., J. Biol. Chem. 2£2 (1988) 13798-13804. Jotkin näistä ovat kalsiumista riippuvia, esimerkiksi yksi vasta-aineista, jotka on esittänyt Laurell, et ai. Kuiten-5 kin, sikäli kuin julkaistuissa raporteissa voidaan määrittää, tämä riippuvuus johtuu siitä, että kalsiumia tarvitaan sitoutumaan proteiinin C keveään ketjuun, ja vasta-aineet tunnistavat epitoopit keveässä ketjussa. Muut vasta-aineet tunnistavat raskaan ketjun trombiinikatkaisukohdan ympäril-10 lä olevan alueen, mutta nämä eivät ole kalsiumista riippuvia, mukaan lukien HPC-4:n, jonka on kuvannut Ohlin et aJL. HPC-4-vasta-aine, jonka on kuvannut Ohlin eii ai., ei ole sekä Ca :sta riippuva että aktivointialuetta kohtaan suunnattu, ja sen vuoksi se on erilainen, kuin tämän keksinnön 15 mukainen vasta-aine.

Mikään muista vasta-aineista, joka sitoutuu proteiini C:n Ca -sitoutumisalueeseen, ei ole sellainen, että se tunnistaa ainoastaan proteiini C:n eikä aktivoitua muotoa. Voi 20 esiintyä tilanteita, että toivotaan proteiinia, joka ei ole kontaminoitunut aktiivisella muodollaan. Näin on erityisesti vasta-aineiden terapeuttisten käyttöjen tapauksissa inhiboitaessa proteiinin C aktivoitumista.

25 Epäonneksi, vaikka tämän keksinnön mukaisen vasta-aineen ·;;; käyttö, ja läheisemmässä menneisyydessä, ominaisuudet, on *··· esitetty kirjallisuudessa, ei se ole ollut yleisesti saata- V 1 villa eristys-, diagnostisissa tai terapeuttisissa menetel missä käytettäväksi.

30 2 +

Sen vuoksi tämä keksintö koskee Ca :sta riippuvaa vasta- •\ ainetta, joka sitoutuu proteiinin C aktivointialueelle.

• · · « · • t • · Edelleen tämä keksintö koskee menetelmää ja välineitä tämän • · 2+ . .

'· 35 Ca :sta riippuvan vasta-aineen alueen käyttämiseksi muiden, ·** metalliin sitoutumattomien peptidien tai proteiinien eris- .*; tykseen metallista riippuvalla af f initeettikromatograf iällä.

4 101476

Edelleen tämä keksintö koskee menetelmää ja välineitä tämän 2+ , , , . , ,

Ca :sta riippuvan vasta-aineen käyttämiseksi terapeuttisiin tarkoituksiin.

5 Edelleen tämä keksintö koskee tämän Ca2+:sta riippuvan vasta-aineen, vasta-aineiden ja niiden johdannaisten ja konju-gaattien käyttöä diagnostisiin tarkoituksiin.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-10 tenttivaatimuksissa.

2 +

Ca :sta riippuva monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti spesifiseen 12-peptidisekvenssiin (E D Q V D P R L I D G K) proteiini C:n aktivointialueella, joka prote-15 iini C on ei-nauta-alkuperää, mukaan lukien ihmisen, sian, paviaanin ja koiran proteiini C:n. Vasta-aine ei sitoudu aktivoituun proteiini C:hen, ja sitä voidaan käyttää estämään proteiini C:n aktivoituminen trombiini-trombomodulii-nilla. Vasta-ainetta voidaan eristää soluviljelmästä tai 20 vatsaontelonesteestä suurissa määrissä affiniteettikromato-grafiällä käyttämällä edellä kuvattua peptidisekvenssiä, .·. joka on kiinnitetty immobilisoituun kantajaan.

Vasta-aineella on joukko erityisiä käyttöjä proteiini C:n ' [ 25 eristyksessä ja karakterisoinnissa, diagnostisena aineena, ·;·' ja terapeuttisena aineena proteiini C:n aktivoitumisen estä- miseen. Proteiini C voi olla luonnollisesti muodostunutta tai yhdistelmä-DNA-geeniekspressiolla tuotettua. Vasta-aineen etuja proteiini C:n puhdistuksessa ovat mm. spesifi-30 syys proteiini C:lle, ja spesifisyyden puuttuminen aktivoidulle proteiini C:lle, ja kyky suojata vasta-aineen antigee-ninsitomiskohta määritellyllä epitooppipeptidillä ja kai-.·;· siumilla vasta-aineen kromatografiselle kantajalle immobi- • · lisoinnin aikana. Vasta-aineen on osoitettu inhiboivan syö- ' 35 vän kasvua in vivo. Edelleen vasta-aine, proteiini S-vasta- ·" aineet, C4B:ään sitoutuva proteiini, yksinään tai yhdisti· telmänä voi olla tehokas edistämään verenhyytymistä poti- » ♦ .··· lailla, joilla on korkeat faktori VIII-inhibiittorien tasot, 5 101476 hemofiliaa, verihiutaleiden puutetta (trombosytopeniaa) ja muita verenhyytymishäiriöitä, joissa halutaan lisätä veren hyytymistä. Lisäksi määritellyn epitoopin käyttöä vasta-aineen puhdistukseen suuressa mittakaavassa ja vasta-aineen 5 stabiilisuutta viraalisia inaktivoitumistapahtumia vastaan ei ole esitetty tekniikan tasolla.

Kuva 1 on proteiini C:n kaaviokuva, jossa esitetään yhden ainoan sisulfidisidoksen yhdistämät keveä ja raskas ketju, 10 jossa kuvassa on merkitty Gla-alue, kasvutekijämäinen alue, seriiniproteaasialue, ja aktivointipeptidialue.

Kuva 2 on kaaviokuva HPC-4:n luontaisen fluoresenssin metalli-ionista riippuvista muutoksista peptidin P(6-17) läsnäol-15 lessa ja puuttuessa, F/Fo funktiona metalli-ionikonsentraa-tiosta [mM]. 1 μΜ HPC-4 titrattiin metalli-ioneilla 2 μΜ P(6-17) läsnäollessa tai puuttuessa. Seurattiin tryptofäänin emission muutoksia. Fo edustaa HPC-4:n emission huipun pinta-alaa (± peptidi) lisätyn metallin puuttuessa. # ja 20 O, HPC-4:n tai HPC-4:n + peptidin Ca^+-tiitteriä vastaavasti, β ja □, HPC-4:n tai HPC-4:n + peptidin Mg2+-tiitteriä, ·.’·· vastaavasti.

Monoklonaalisen vasta-aineen, HPC-4:n ominaisuudet, jotka 25 tekevät sen ainutlaatuisen käyttökelpoiseksi, ovat seuraa-vat: • · * · ♦

Vasta-aine sitoutuu proteiini C:hen, ei aktivoituun proteii- ♦ · « ni C:hen (APC), ja vain kalsiumin läsnäollessa. Siten, kun vasta-aine on immobilisoitu affiniteettikantajalle, proteii-30 ni C voidaan eristää joko plasmasta peräisin olevista lähteistä tai kudosviljelyekspressiojärjestelmistä äärimmäisen miedoissa olosuhteissa. Tämä on tärkeää tuotteen biologisen • · : aktiivisuuden ja kiinteän kantajahartsin stabiilisuuden säi-

• I

lyttämisessä. Koska aktivoitu proteiini C ei sitoudu mis-35 sään olosuhteissa, tulokseksi saatava tuote on täysin puhdas APC:stä.

6 101476

Vasta-aine sitoutuu proteiinin C aktivointikohtaan, ja sitä voidaan sen vuoksi käyttää hyytymistä estävän proteiini APC:n muodostumisen salpaamiseen in vivo. Koska se ei sitoudu APC:hen tai inhiboi APC:tä, voidaan in vivo inhibitiovai-5 kutuksiin vaikuttaa vastakkaisesti APC:tä antamalla.

Vasta-aine sitoutuu proteiini C-molekyylin määritellylle alueelle, joka sisältyy raskaan ketjun tähteiden 6 ja 17 välille, spesifisesti EDQVDPRL I DGK. Tämä peptidi 10 voidaan immobilisoida suoraan kiinteälle kantajahartsille ja käyttää vasta-aineen suurten konsentraatioiden eristämiseen hiiren vatsaontelonesteestä tai kudosviljelysupernatan-teista. Tämä menettely mahdollistaa vasta-aineen eristyksen äärimmäisen puhtaassa muodossa suurella saannolla, jopa 15 hyvin laimeista liuoksista.

Vasta-aine voidaan poistaa kiinteältä kantajapeptidiltä joko poistamalla kalsiumionit, tai haluttaessa, 1,5 M guanidii-nilla, joka ei vaikuta puhdistetun monoklonaalisen vasta-20 aineen toimintaan. Tämä voi olla merkittävää, koska lainsäädännölliset elimet tunnustavat guanidiinin lailliseksi vi-raaliseksi deaktivointiaineeksi. Eluoinnin tai tällä aineella käsittelyn jälkeen vasta-aine eri sisällä lainkaan elävää virusta, jota voi olla läsnä monoklonaalisen vasta-aineen 25 valmistukseen käytetyssä, joko hiirestä peräisin olevassa .“'t vatsaontelonesteessä tai viljelysupernatanteissa, jos käy- « · « tetään hybridooman kudosviljelyä. Niinpä proteiini C-tuot- • « « teeseen ei tule lisää virusta sen valmistamiseen käytetystä vasta-aineesta.

30

Vasta-aine tunnistaa ihmisestä, siasta ja koirasta peräisin olevan proteiini C:n, muttei naudasta peräisin olevaa pro-·.· ’ teiini C:tä. Siten proteiini C, jota voi olla läsnä vasikan- sikiöseerumissa, jota käytetään kasvattamaan soluja, jotka .···. 35 tuottavat proteiinia C yhdistelmä-DNA-tekniikalla, ei kon- taminoi ihmisen proteiini C-tuotetta.

7 101476

Keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta erittää hybridooma HPC-4, joka tuotettiin seuraavalla tavalla:

Monoklonaalisen vasta-aineen tuottaminen.

5 BALB/c-hiiriä injisoitiin vatsaontelonsisäisesti 50 - 100 ygtlla. puhdistettua ihmisen proteiini Citä (HuPC) täydellisessä Freundin adjuvantissa. Hiiret immunisoitiin jälleen 3 viikon kuluttua HuPC:llä emulgoituna epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin, ja 6 viikon kuluttua HuPCillä TBS:ssä 10 (0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5). 4 päivää myöhemmin pernasolut sulatettiin yhteen hiiren myeloomasolulinjan P3X63AG8-653 kanssa käyttäen 35-% polyetyleeniglykolia 1450, käyttämällä vakiotekniikkoja, jotka ovat kuvanneet Laurell, M., K. Ikeda, S. Lindgren, J. Stenflo, FEBS Letters 191 15 (1985) 75-81; Wakabayashi, K., Y. Sakata, N. Aoki, J. Biol.

Chem. 261 (1986) 11097-11105; Borrebaeck, C.A.K., M.E. Etzler, J. Biol. Chem. 256 (1981) 4723-4725; Kohler, G., C. Milstein, Nature 256 (1975) 495-497.

20 Soluja kasvatettiin hybridoomien valitsemiseksi HAT-väliai-neessa. 4 viikon kuluttua yhteensulatetuista soluistasaadut supernatantit seulottiin vasta-aineentuoton suhteen kiinto-faasientsyymisidotulla immunoadsorbenttimäärityksellä 5 mM Ca3+:n läsnäollessa tai ilman.

25

Kasvatussupernatantit laimennettiin määäritystä varten 1:4 • · IVl' puskuriin, joka sisälsi joko 5 mM CaCl2 tai 5 mM EDTA. Kaik- • · · ki reagenssit (vasta-aine, pesupuskurit, detektiovasta-ai-neet) sisälsivät sopivat kalsium- tai EDTA-konsentraatiot.

30

Positiiviset kiinnostava kloonit, määritettynä proteiini • · · *...· C:n kanssa reaktiivisuuden perusteella, kloonattiin uudel- • ·- · · : leen ainakin kahdesti rajoittavalla laimennoksella hiiren .·.’·[ vatsaontelonhuuhtelusyöttösoluilla.

λ! 35 BALB/c-hiiri alustetaan aluksi pristaanilla vatsaontelones-teentuotannon indusoimiseksi, ja 14 päivää myöhemmin se in-:/.· jisoitiin vatsaontelonsisäisesti 0,1 ml:11a 10 mg/ml syklo- 8 101476 fosfamidia eläimen immunokompromisoimiseksi. 74 tuntia myöhemmin injisoitiin 3 - 6 x 10® solua vatsaontelonsisäisesti.

7- 10 päivän kuluttua vatsaonteloneste kerättiin, ja vatsa-ontelonesteestä puhdistettiin HPC-4 monoklonaalisen vasta- 5 aineet. Vatsaontelonesteessä on vasta-ainetta normaalisti 8- 15 mg/ml. Vasta-aineen puihdistamiseen voidaan käyttää 3 erilaista menetelmää: (1) NH4S04~fraktiointi, jota seuraa QAE-Sephadex-kromatografia; (2) affiniteettikromatografia käyttämällä ihmisen proteiini C Affi-Gel 15:ta; tai (3) 10 affiniteettikromatografia HPC-4:n tunnistavalla peptidillä, EDQVDPRLIDGK (Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Ile-Asp-Gly-Lys).

Vaihtoehtoisesti valitut hybridoomat voidaan propagoida in 15 vitro laboratoriokasvatusastioissa, joista valitun antigeenin vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet voidaan kerätä ja puhdistaa tavalla, joka on kuvattu vatsaontelonesteelle. HPC-4:n eristämiseen hybridoomakudosviljelysupernatanteista voidaan käyttää myös epitooppiaffiniteettihartsia. Materiaa-20 li lisätään suoraan kolonniin. Vasta-aineen konsentraatio eksponentiaalisesti kasvavassa viljelmässä on suunnilleen 25 jjg/ml.

Monoklonaalinen vasta-aine HPC-4 puhdistetaan vatsaontelo-25 nesteestä NH4S04-fraktioinnilla (vatsaonteloneste laimennetaan vedellä 1:1, saostetaan sitten lisäämällä yhtäsuuria • · tilavuuksia kylläistä NH4S04:ää), ja kromatografoimalla • 4 · ’ sitten QAE-Sephadex Q-50:llä (ammoniumsulfaattisaostuma kerätään sentrifugoimalla, poistetaan suola 0,027 N Tris 30 P04:ään, pH 6,3, kromatografoidaan kolonnilla suhteella 1 ml hartsia/ml vatsaontelonestettä, tasapainotetaan 0,027 M Tris PC>4:ään, pH 6,3, kehitetään 5 pylvästilavuudella lineaarista gradienttia 0 - 0,4 M NaCl suunnilleen 8 tunnin aikana), jota seuraa vasta-aineen saostus 50-% NH4S04:llä 35 ja Sephadex G200-kolonnikromatografia 0,1 M NaCl, 1 mM M0PS:llä, pH 7,5.

9 101476

Vasta-aine voidaan eristää myös HuPC-Affi-Gel- tai peptidi-Affi-Gel-affiniteettikromatografiällä. HPC-4:n tunnistama epitooppi on 12-peptidisekvenssi proteiinin C raskaan ketjun aktivointialueella, EDQVDPRLIDGK, tai immunolo-5 gisesti samanlainen sekvenssi. Peptidiä yhdistetään Affi-Gel 15:ta lopulliseen konsentraatioon noin 1,0 mg/ml. Epi-tooppipeptidin yhdistäminen suoritetaan 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS, pH 7,5:ssä, 4 °C:ssa valmistajan kuvaamalla tavalla (Bio-Rad, Richmond, CA). Affi-Gel pestään jääkylmällä vedel-10 lä välittömästi ennen käyttöä orgaanisen liuottimen poistamiseksi. Epitooppipeptidi valmistetaan konsentraatioon 1 -2 mg/ml 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS:iin, pH 7,5, ja sekoitetaan riittävän määrän kanssa Affi-Gel 15:ta lopulliseen peptidi/-geeli-suhteeseen 1 mg/ml. Peptidiä ja geeliä sekoitetaan 15 varovasti sekoittimella yön yli (12 - 18 tuntia) peptidin yhdistämiseksi geeliin.

Kun yhdistämisreaktio on suoritettu loppuun, hartsi kaadetaan lasikolonniin ja pestään 0,1 M NaCl, 0,01 M MOPS, pH 20 7,5:llä. 100 ml:11a hartsia on kapasiteetti ainakin 1,5 g HPC-4:ää.

Ihmisen proteiini C voidaan yhdistää Affi-geeliin samalla menetelmällä. 3 - 5 mg proteiini C/ml edellä kuvattua pus- 25 kuria sekoitetaan riittävän määrän kanssa Affi-Gel 15:ta . . lopulliseen ihmisen proteiini C/geeli-suhteeseen 3 - 5 mg ««« proteiinia/ml geeliä.

Vatsaontelonesteen suolasta vapautettua ammoniumsulfaatti-30 jaetta lisätään epitooppiaffiniteettikolonniin, ja kolonni pestään ainakin 4 kolonnintilavuudella 0,4 M NaCl, 0,02 M *···* Tris HC1, 1 mM CaCl2:ta, pH 7,5. Sitten HPC-4 eluoidaan ko- *.* : lonnista yhdellä seuraavista tavoista: (1) 2 M NaCl, 0,02 M Tris HC1, 2 mM EDTA; (2) 2 M NaCl, 1,5 M guanidiini-HCl, 35 0,02 M Tris HC1, 2 mM EDTA. Viimeksimainitun etu on, että proteiini eluoituu paljon terävämpänä huippuna, konsentraa-'·* * tioilla yli 25 mg/ml, kun 100 ml:n hartsikolonniin lisätään 200 ml vatsaontelonestettä. Vasta-aine pysyttää yli 95 % ka- 10 101476 pasiteetistaan sitoutua epitooppiin näissä olosuhteissa eluoinnin jälkeen. Sitten HPC-4 joko dialysoidaan tai siitä poistetaan suola sopivaan puskuriin edelleen käyttöä varten. HPC-4:ssä ei havaita kontaminaatiota SDS-geelielektroforee-5 silla. Lisää HPC-4:ää voidaan saada lisäämällä läpi tuleva materiaali takaisin kolonniin, jos kolonnia kuormitetaan yli sen kapasiteetin.

HPC-4-vasta-aine on 22 °C:ssa stabiili ainakin 2 tuntia 10 guanidiinikonsentraatioissa ainakin 2,6 M tai 2 M kalium- tiosyanaattia, ja pysyttää yli 95 % kapasiteetistaan sitoutua epitooppiin näissä olosuhteissa käsittelyn jälkeen. Käsittely kummalla hyvänsä näistä reagensseista peptidiaf-finiteettikolonnista eluoinnin jälkeen takaa, että kaikki 15 viraaliset aineet, joita voi olla läsnä vasta-ainetta sisältävissä alkuliuoksissa, inaktivoituvat, ja että lopullinen proteiini C-tuote ei ole kontaminoitunut viruksella, joka on peräisin sen valmistamiseen käytetystä vasta-aineesta.

20 Keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta erittävää hybridoomasolulinjaa merkitään HPC-4, ja se talletettiin laitokseen American Type Culture Collection, Rockville, MD, 2. marraskuuta 1988, ja on saanut ATCC-numeron HB 9892.

Tämä talletus on yleisesti saatavissa patentin myöntämisen 25 myötä. Olisi kuitenkin ymmärrettävä, ettei talletuksen saa- , t tavuus muodosta lupaa keksinnön käyttämiseen lainsäädäntö- • · · elinten myöntämien patenttioikeuksien kumoamisen myötä.

Proteiini C-monoklonaalisen vasta-aineen yhdistäminen hart-30 siin.

Vasta-aineen yhdistäminen suoritetaan 0,1 M NaCl, 0,1 M

’···* MOPS, pH 7,5:ssä, 4 °C:ssa valmistajan (Bio-Rad, Richmond, • · ·.· ’ CA) kuvaelmalla tavalla. Affi-Gel pestään jääkylmällä vedellä « « välittömästi ennen käyttöä orgaanisen liuottimen poistami-35 seksi. HPC-4 valmistetaan konsentraatioon 3-5 mg/ml 0,1 ·’· M NaCl, 0,1 M MOPS, pH 7,5:een, ja sekoitetaan riittävän ’ määrän kanssa Affi-Gel 10:tä lopulliseen HPC-4/geeli-suhtee- seen 5 mg/ml.

11 101476

Vasta-ainetta ja geeliä sekoitetaan varovasti sekoittimella yön yli (12 - 18 tuntia) yhdistymisreaktion mahdollistamiseksi. Tavallisesti yli 90 % vasta-aineesta sitoutuu. Kun yhdistämisreaktio on edennyt loppuun, hartsi kaadetaan lasi-5 kolonniin ja pestään 0,1 M NaCl, 0,01 M MOPS, pH 7,5:llä.

Hartsi on näissä oloissa 4 °C:ssa stabiili ainakin 1 vuoden.

Monoklonaalisen vasta-aineen karakterisointi Yksityiskohtainen analyysi HPC-4-monoklonaalisen vasta-ai-10 neen ominaisuuksista on esitetty julkaisussa Stearns et ai., "The Interaction of a Ca2+-Dependent Monoclonal Antibody with the Protein C Activation Peptide Region," J. Biol.

Chem. 263 (1988) 826-832. Edellä kuvatulla tavalla tuotetut HPC-4-monoklonaaliset vasta-aineet ovat suuntautuneet pro-15 teiini C:n raskaassa ketjussa olevaa aktivointialuetta ja

Ca3+:ta vastaan. Vasta-aineella ilmenee peptidinsitoumiskoh-dan lisäksi ainakin yksi metalli-ioninsitoutumiskohta. Peptidin sitoutumisaktiivisuus vastaa, tai on "riippuvaista", sitoutumisesta metalli-ioninsitoutumiskohtaan. Metalli-ionin 20 sitoutumiskohta voi sitoa kahdenarvoisen metallikationin, kuten kalsium, tai metallin, jolla on samanlainen ionisäde :. ja koordinaatio-ominaisuudet, kuten Tb3+:n.

Kun kalsium sitoutuu metalli-ioninsitoutumiskohtaan, mono-25 klonaalinen vasta-aine tulee merkittävästi vastaanottavai-semmaksi peptidiin sitoutumiselle. Kun monoklonaalisen vas- • · · .V. ta-aineen metalli-ioninsitoutumiskohtaan ei ole sitoutunut • · metalli-ionia, antigeeninsitoutumiskohta on suhteellisen vastahakoinen antigeenin sitomiseen. Niinpä vasta-aine/anti-30 geeni-sitoutumista voidaan kontrolloida vaihtelemalla vasta-ainetta ympäröivän väliaineen metalli-ionikonsentraatiota.

• · *···’ Tällä monoklonaalisen vasta-aineen ominaispiirteellä on • · V joukko etuja, jotka kuvataan alla.

« t • · • · 35 HPC-4:n sitoutumista proteiini C:hen kontrolloi kalsiumio- [;]· nien läsnäolo kalsiumionien sitoutumiskohdissa sekä HPC- 4:ssä että proteiini C:ssä. Jotta määritettäisiin, mikä ·*.'·; ihmisen proteiini C:n (HuPC) osa sisälsi HPC-4-sitoutumis- 12 101476 kohdan, HuPC pelkistettiin ja karboksimetyloitiin (RCM) tuottamaan RCM-raskas - ja RCM-keveän ketjun, käyttämällä menetelmää, jonka on kuvannut: Esmon et ai.; J. Biol. Chem. 258 (1983) 554-556. Ketjuja dialysoitiin 0,1 M NaCl, 0,02 5 M Tris HC1, 2 mM CaCl2, pH 7,5:tä vastaan, ja lisättiin HPC-4-Affi-Gel 10-kolonniin (1,5 x 18 cm, 0,2 ml/min, 2-ml fraktioita), joka oli tasapainotettu samassa puskurissa. Sitoutunut proteiini eluoitiin Selmalla puskurilla paitsi, että 2 mM CaCl2:n tilalla käytettiin 2 mM EDTA:ta. Proteii-10 nia sisältävät fraktiot analysoitiin 10-% natriumdodekyyli-sulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla.

Tulokset osoittivat, että proteiinin C kevyt ketju, joka on proteiinin C kalsiumiin sitoutuva ketju, ei pysynyt ko-15 lonnissa, ja raskas ketju, joka itsessään ei voi sitoa kalsiumia, pysyi ja eluoitui EDTA:ta sisältävällä puskurilla.

Aktivointipeptidialueen merkitys tutkittiin affiniteetti-kromatografiällä HPC-4 Affi-Gel 10-kolonnilla. HuPC ja RCM 20 raskas ketju, jotka olivat liuoksessa, jossa oli 0,1 M NaCl 2 mM CaCl2, 0,1 M MOPS, pH 7,5, laimennettiin 0,2 absorbans-siyksikköön/ml, ja lisättiin 1-ml näytteet HPC-4-Affi-Gel 10-kolonniin (0,5 cm x 6 cm), joka oli tasapainotettu Sennassa puskurissa. Sitoutunut proteiini eluoitiin 0,1 M NaCl, 25 2 mM EDTA 0,1 M MOPS, pH 7,5:llä 0,7-ml fraktioissa. HuPC:n fraktiot 23 - 25 eli eluoitunut RCM raskas ketju yhdistet- • · · .*.*. tiin, ja aktivointipeptidi vapautettiin trombiiniproteolyy- sillä (10 %, paino/paino, 4 h, 37 °C). Reaktion pysäyttämiseksi lisättiin antitrombiini III-ylimäärä; liuoksen kal-30 siumpitoisuus säädettiin uudelleen arvoon 5 mM CaCl2, ja lisättiin samaan kolonniin. Proteiinien talteensaanti kustakin • · · ’···’ kromatogrammista oli yli 98 % A280”absork°^-van materiaalin ·.* talteensaannin perusteella.

t « 35 Nämä tulokset osoittivat, että HPC-4-sitoutumiskohta proteiini C:ssä oli aktivointikohdassa tai lähellä sitä, että HuPC sitoutui vasta-ainekolonniin Ca^+:sta riippuvasta, ja ·.*·. että APC:ksi aktivoinnin jälkeen HuPC ei enää sitoutunut 13 101476 HPC-4:ään. Myös RCM-raskas ketju sitoutui HPC-4-kolonniin Ca2+:n läsnäollessa, ja voitiin eluoida EDTA:lla. Kun elu-aatti käsiteltiin aktivointipeptidin vapauttamiseksi trom-biinilla ja lisättiin takaisin HPC-4-kolonniin, ei RCM-ras-5 kas ketju enää sitoutunut HPC-4:ään.

HPC-4-antigeenin sitoutumisen Ca2+:sta riippuvuus tutkittiin inkuboimalla ^25I-leimattuja antigeenejä: RCM raskas ketju, HuPC ja HuPC ilman gammakarboksiglutamiinihappoaluetta 10 (HuGDPC) immunohelmiin (Bio-rad) immobilisoidun HPC-4:n kanssa. Immunohelmiin liitettyä HPC-4:ää inkuboitiin yön yli 4 eC:ssa TBS 0,1 % gelatiini, 1 mM EDTA, pH 7,5:ssä, ja pestiin sitten hyvin TBS 0,1 % gelatiini, pH 7,5:llä (Chelex-käsitelty). Radioleimatut proteiinit lisättiin 100 15 pl:aan HPC-4-liitettyjä helmiä, joissa oli kasvavia Ca2+- konsentraatioita TBS 0,1 % gelatiini, pH 7,5:ssä. Kokonaistilavuus oli 200 μΐ. Liuoksia inkuboitiin sekoittaen 2 tuntia 25 °C:ssa, ja pestiin gelatiinipuskurilla, joka sisälsi sopivan määrän Ca2+:aa, ja helmet laskettiin NE 1600-gamma-20 laskurilla (Nuclear Enterprises, Ltd.). Kontrollinäytteet sisälsivät liuoksia, joihin ei lisätty Ca2+:ta tai 1 mM EDTA:ta, vastaavasti. Lopulliset antigeenikonsentraatiot olivat alueella 0,04 - 0,1 μΜ, ja ne olivat riittävän alhaisia varmistamaan vasta-aineensitoutumiskohtien ylimäärän. 25 Perustasotuikkeet/min, jotka määritettiin 1 mM EDTA:n läsnä- ; ; ollessa (lisäsi 5 - 15 % kokonaistuiketta), vähennettiin si- • · · toutuneista kokonaistuikkeista/min.

• · * l^I-leimatun RCM-raskaan ketjun maksimaalinen sitoutuminen 30 oli 80 - 90 % lisätystä kokonaismäärästä, ja 60 - 70 % lisä- ... tystä ^-2^I-leimatusta HuPCrstä tai HUGDPC:stä. Ca2+-konsent- *··· raatio, joka sai aikaan HPC-4:ään sitoutumisen maksimista * · *.* puolet, oli suunnilleen 36 (± 5) μΜ RCM raskaalle ketjulle, * · ;y 110 (± 29) μΜ HuGDPC:lle ja 205 (± 23) μΜ HuPC:lle.

35 • • · Kummassakaan proteiinissa ei havaittu suuriaffiniteetti- *·* Ca2+-sitoutumista, kun 45Ca2+:lla suoritettiin tasapainodia- ··’*. lyysikokeita HPC-4:n (50 μΜ) tai RCM-raskaan ketjun (35 14 101476 μΜ) kanssa. Kun dialysoitiin yhdessä (30 μΜ RCM raskas ketju, 15 μΜ HPC-4), tulokset osoittivat kuitenkin välillä 2 ja 3 mol sitoutunutta Ca^+jta/mol kompleksia tasolla 2 mM Ca2+, mistä voidaan olettaa, että ketjussa on 2:l-stoi-5 kiometria RCM raskaan ketjun ja HPC-4:n välillä.

Koska aktivointipeptidialuetta tarvittiin vasta-aineen sitoutumiseen, tämän alueen peittämisekis valmistettiin 3 limittäistä synteettistä peptidiä: 10 1 5 10 15 20 25

DTEDQEDQVDPRLIDGKMTRRGDSPWQV

<-----P (1-12 )-----> <-----P ( 6-17 ) -------> 15 <---- P( 15-27) --------> jossa D on asparagiinihappo, T on treoniini, E on glutamii-nihappo, Q on glutamiini, V on väliini, P on proliini, R on arginiini, L on leusiini, I on isoleusiini, G on glysii-ni, K on lysiini, M on metioniini, S on seriini ja W on 20 tryptofaani. Nuoli osoittaa trombiinikatkaisukohdan.

Synteettiset peptidit valmistettiin kiintofaasisynteesillä

Applied Biosystems 430A-peptidisyntetisaattorilla käyttäen t-butoksikarbonyylikemiaa, jonka on kehittänyt tri Kenneth 25 Jackson, St. Francis Hospital, Tulsa Medical Research Ins- ' titute, the University of Oklahoma Health Science Center, »··

Oklahoma City. Peptidit lohkaistiin käsittelemällä vedettömällä vetyfluoridilla. Peptidien puhtaus määritettynä käänteisfaasi-HPLC:llä (reverse-phase high pressure liquid 30 chromatography) oli > 90 %. Peptidien molekyylipaino arvioitiin yhdistämällä yksittäisten vedettömien aminohappojen *·»· molekyylipainot korjaamaan peptidisidoksen muodostus. Pepti- • · V dikonsentraatiot arvioitiin vertaamalla puhtaaseen veteen # · .V tehtyjen 1 mM peptidiliuosten absorbanssiin aallonpituudella .-·· 35 220 nm.

* > » • « Näillä 3 peptidillä määritettiin niiden vaikutus ^25j_^e£_ matun HPC-4:n sitoutumiseen kiintofaasi-HuPC:hen, jolloin 15 101476

HuPC oli päällystetty mikrotiitterilevyn kaivoille. P(l- 12) ei inhiboinut HPC-4:n sitoutumista HuPC:hen; P(15-27) inhiboi HPC-4:n sitoutumisen vain noin 30-%:sti; mutta P(6- 17) inhiboi HPC-4:n sitoutumisen HuPC:hen siten, että maksi-5 maalisen inhibition puoliarvo oli tasolla noin 0,5 μΜ peptidiä.

HPC-4:n vuorovaikutusta 3 synteettisen peptidin kanssa tutkittiin myös seuraamalla proteiinin myötäsyntyistä fluo-10 resenssia Ca^+:n läsnäollessa ja puuttuessa, menetelmien mukaisesti, jotka on kuvannut: Velick et ai., Proc. Nat.

Acad. Sei. USA £6 (1960) 1470-1482; ja Steward et ai.. teoksessa Antibody Affinity: Thermodynamic Aspects and Biological Significance. 76-77 (1983).

15

Myötäsyntyisen fluoresenssin tutkimiseksi 1 μΜ HPC-4 vasta-ainetta TB:issä, pH 7,5 (Chelex-käsitelty), 2 μΜ P(6-17):n läsnäollessa tai puuttuessa, titrattiin CaCl2:lla tai MgCl2:lla, joka oli laimennettu samaan puskuriin. HPC-4, 20 joka titrattiin synteettisellä peptidillä P(l-12), P(6-17) tai P(15-27), oli lopullisessa konsentraatiossa 5 μΜ liuoksessa, joka sisälsi joko 1 mM EDTA:ta tai 1 mM CaC^Jta ennen peptidien lisäystä. Emission intensiteetti (305 - 400 nm) rekisteröitiin 5 min kunkin titrausstandardin lisäyksen 25 jälkeen. Titrausstandardin lisäyksestä johtuva näytteen laimeneminen vaikutti kaikissa koeolosuhteissa < 4 % sig- • · · : naalissa haivaittuun muutokseen.

Koska sitoutuva peptidi ei sisällä aromaattisia aminohappo-30 ja, kaikki myötäsyntyisessä fluoresenssissa havaitut muutok-.*··. set johtuvat suoraan peptidiin sitoutumisesta johtuvista ,·#·φ vasta-aineen määrän muutoksista. HPC-4:n myötäsyntyinen . fluoresenssi kasvoi, kun titrattiin P(6-17):ta 1 mM Ca2+:n

läsnäollessa, saavuttaen maksimiarvon odotetulla peptidi/-35 vasta-aine-suhteella 2:1. Fluoresenssi kasvoi myös 1 mM

EDTA:ssa, mutta tämä vaati suurempia peptidikonsentraatioi-ta. Synteettiset peptidit P(l-12) ja P(15-27) eivät muut- 16 101476 taneet HPC-4-fluoresenssia merkittävästi Ca2+:n läsnäollessa.

HPC-4-P(6-17)-sitoutumisen Ca2+-riippuvuutta tutkittiin myös 5 fluoresenssimenetelmillä. HPC-4:n myötäsyntyinen fluoresenssi kasvoi P(6-17):n läsnäollessa Ca2+:lla titrattaessa, maksimaalisen arvon puoliarvon ollessa tasolla 6,5 i 1,2 μΜ Ca2+. 1 μΜ HPC-4 titrattiin metalli-ioneilla 2 μΜ P(6-17):n läsnäollessa tai ilman. Tryptofaaniemission muutoksia seulo rattiin edellä kuvatulla tavalla. Mg2+:lla ei ollut vaikutusta HPC-4:n myötäsyntyiseen fluoresenssiin peptidin läsnäollessa tai puuttuessa. Vasta-aineen Ca2+-tiitterissä peptidin puuttuessa havaittiin myötäsyntyisessä fluoresenssissa vain vain 5-% väheneminen, osoittaen, mahdollisen 15 alhaisen affiniteetti-Ca2+-vuorovaikutuksaen vasta-aineen kanssa.

Tb3+ :aa käytettiin Ca2+-sitoutumiskohdan tutkimiseen, koska Tb3+ :n fluoresenssiemissio kasvaa huomattavasti, kun se si-20 toutuu proteiinissa kohtaan, joka on riittävän lähellä tryp-tofaani- tai tyrosiinitähdettä tehokkaan singletti-singlet-ti-siirron sallimiseksi. P(6-17) ei sisällä aromaattisia luovuttaja-aminohappoja fluoresenssin kasvattamiseen, kun HPC-4 puolestaan sisältää. 1 μΜ HPC-4 0,1 M MES, 0,1 % gela-25 tiini, 0,02 % NaN3, pH 6,0:ssa titrattiin Tb3+:lla 4 μΜ P(6-17):n läsnäollessa tai puuttuessa. HPC-4-tryptofaania jännitettiin aallonpituudella 285 nm käyttämällä jännitys-reitillä SB 300 UV-kaistanpäästösuodatinta (Oriel). Tb3+-ioniemission intensiteetti rekisteröitiin 2-nm välein, ja 30 integroitiin alueella 538 - 552 nm. Valonsironnan myötävai-.···. kutus mitattiin jännitysaallonpituuden ylivärähtelynä aal- lonpituusalueella 570 - 580 nm. Kullakin Tb3+-konsentraa-tiolla näytteen kanssa rinnan titratun liuotin-0-kokeen emission intensiteetti vähennettiin proteiiniliuoksella saa-35 dusta intensiteetistä, jolloin saatiin ainoastaan proteiinista riippuva Tb3+-fluoresenssi.

17 101476 HPC-4:n titraus Tb3+:lla tuotti Tb3+-fluoresenssin, jonka maksimaalinen puoliarvo oli vapaalla Tb3+-konsentraatiolla 34 ± 11 μΜ. HPC-4:n Tb3+-titraus P(6-17):n läsnäollessa tuotti myös kasvaneen Tb3+-fluoresenssin, mutta maksimaali-5 nen puoliarvo vapaan Tb3+:n konsentraatiossa laski 2 ± 0,9 μΜ:ϋη. Kontrollikokeissa, joissa peptidi titrattiin Sennoissa olosuhteissa, ei havaittu Tb3+-fluoresenssin lisääntymistä, mikä osoitti, ettei peptidi yksinään ollut vastuussa fluoresenssin muutoksista. 17-kertainen kasvu affiniteetissa 10 Tb3+:lle peptidi/HPC-4-kompleksilla osoitti HPC-4:ssä olevan alhaisen affiniteetin omaavan metalli-ioninstoutumiskohdan muutoksen suuriaffiniteettikohdaksi. Nämä tulokset vahvistettiin Ca3+-sitoutumisella vasta-aine/peptidi-kompleksiin käyttämällä Hummel-Dreyer-geelisuodatustekniikkaa, Biochem. 15 Biophys. Act 63 (1962) 530-532. P(6-17):ta, HPC-4sää ja näiden seoksia lisättiin kolonniin, ja määritettiin niiden kyky sitoa Ca^+saa. P(6-17) ei sitonut Ca^+jaa. HPC-4;llä ja P(6-17):ta 3,5-kertaisella moolisella ylimäärällä nähtiin Ca3+-sitoutumisen kasvu tasoon 1,76 mol Ca^+/mol HPC-4:ää.

20 Mg3+;lla ei ollut vaikutusta Ca3+-sitoutumiseen HPC-4/P(6-17)-kompleksilla (1,41 ja 1,52 mol Ca^+/mol HPC-4:ää 0,01 mM Ca3+:ssa tai 0,02 mM Ca3+:ssa, vastaavasti).

Tähän keksintöön kuuluu proteiinin C immunologisesti ak-25 tiivinen fragmentti (epitooppi), joka sitoo vasta-ainetta HPC-4, ja joka fragmetti sisältää ainakin osan aminohappo-:*·*: sekvenssistä glutamiinihappo-asparagiinihappo-glutamiini- valiini-asparagiinihappo-proliini-arginiini-leusiini-isoleu-siini-asparagiinihappo-glysiini-lysiini, joka aminohapposek-30 venssi näkyy kuvassa 1 raskaan ketjun tähteinä 6-17.

• · · • « I*' Kuten edellä kuvattiin, voidaan peptidiä käyttää HPC-4 :n • · · *\ ' eristämiseen ja puhdistamiseen affiniteettikromatografialla.

Samalla tavalla peptidiä voidaan käyttää "suojaamaan" sitou-35 tumiskohtaa tilapäisesti prosessin aikana, jossa vasta-aine sidotaan kromatografiakantajaan, varmistamaan, että maksimi-. määrä sitoutunutta vasta-ainetta on saatavilla eristettävään "· · proteiiniin sitoutumista varten. Peptidin reaktiiviset ryh- 18 101476 mät, jotka voivat reagoida kromatografiakantajän kanssa (aminoterminaalinen, lysiinisivuketju), ja joita ei tarvita HPC-4:n tunnistukseen, salvataan ensin peptidin reaktiolla etikkahappoanhydridin kanssa ammattimiesten tuntemia vakio-5 menetelmiä käyttäen. Kun HPC-4 on yhdistetty hartsiin, vasta-aineen antigeeninsitomiskohtaan kiinnittynyt peptidi poistetaan pesemällä hartsi 1,5 M guanidiini'HCl, 2 mM EDTA, 0,02 M Tris HC1, pH 7,5:llä.

10 Vasta-aine ja peptidi voidaan kiinnittää erilaisille kantajille käytettäväksi proteiinin C ja vasta-aineen puhdistukseen ja eristykseen, vastaavasti, agaroosin, akryyliami-din ja muut tavanomaiset kromatografiahartsit, suodattimet ja vastaavat mukaan lukien. Nämä materiaalit ovat ammatti-15 miesten tuntemia, samoin kuin menetelmät proteiinin kiinnittämiseksi niihin. Materiaalin valinta riippuu suureksi osaksi puhdistuksen tai analysoitavan näytteen mittakaavasta, samoin kuin bioyhteensopivuudesta ja viranomaisten hyväksynnästä silloin, kun lopputuote obn tarkoitettu farmaseutti-20 seen käyttöön. Samoin menetelmät ja välineet vasta-aineen leimaamiseksi diagnostiseen käyttöön ovat ammattimiesten tuntemia, mukaan lukien leimaamisen radioaktiivisella, fluoresoivalla, luminoivalla tai entsymaattisella molekyylillä.

25 Antigeenin talteenotto käyttämällä immobilisoituia vasta-aineita, joissa on metallista riippuvia antioeeninsitomis- » · · :. ·" : kohtia

Keksinnön mukaisella monoklonaalisella vasta-aineella on osoitettu olevan antigeeninsitomiskohta ja ainakin 1 metal-30 li-ioninsitomiskohta. Ioninsitomiskohdan miehitystä tarvi- taan antigeenin sitomiseen suurella affiniteetilla. Metalli-

Ml .·.·. ioninsitomisalueen aminohapposekvenssi vasta-aineessa voi- « · · . daan määrittää, tai vaihtelevan alueen geeni voidaan määrit- tää kloonauksesta ja cDNA-sekvuensöinnistä. Tämä cDNA:n 35 segmentti voidaan sitten insertoida muita proteiineja, erityisesti vasta-aineita koodittaviin geeneihin antamaan tu-! loksena saatavalle proteiinille metallinsitomiskapasitee- tin. Sitten näitä kimeerisiä vasta-aineita voidaan käyttää 19 101476 eristämään muita molekyylejä, joissa ei itsessään tapahdu metallista riippuvia muutoksia muodossa. Tämä on suuri etu proteiininpuhdistuksessa, koska usein on äärimmäisen vaikeaa löytää monoklonaalinen vasta-aine, jolla on miedot eluointi-5 olosuhteet, mistä johtuen kiinnostuksen kohteena olevia proteiineja ei voida eluoida toiminnallisessa muodossa. Tästä johtuen ei monoklonaalisten vasta-aineiden mahdollisuuksia proteiininpuhdistuksessa ole ymmärretty täysin. Vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeeniin metallista riippuvasta joh-10 tuen vasta-aineen kyvystä sitoa metallia, paremminkin kuin vaatimuksesta, että antigeenissä itsessään tapahtuu metallista riippuvia muodon muutoksia, voidaan käyttää affini-teettikromatografiässä hyvin miedoissa olosuhteissa, antigeenin eluoituessa kelatoivalla - tai metallia sisältävällä 15 liuoksella.

HPC-4in metallinsitomisalue voidaan paikallistaa käyttämällä rajoitettuja proteolyysitekniikkoja vasta-aineen pienten fragmenttien tuottamisekis. Metalli-ionien sitomiseen pys-20 tyvä fragmentti voidaan tunnistaa sen kyvyllä lisätä Tb^+-fluoresenssia, koska tällä ionilla on antigeenin puuttuessa vasta-aineeseen riittävä affiniteetti sen sitoutumisen havaitsemiseksi. Ammattimiehet voivat tehdä vakiotekniikoil-la pepsiini- ja papaiinisulatusta käyttämällä vasta-aineen 25 Fab-, Fab'- ja Fc-fragmentteja. Pienempiä fragmentteja voi-^ daan tuottaa vasta-aineen sopiovasta osasta CNBr-katkaisul- :*·*: la* samoin kuin sulatuksella muilla proteolyyttisillä ent syymeillä tavoilla, jotka ovat kuvanneet: Kurosawa, S. et ai., J. Biol. Chem. 263 (1988) 5993-5996; Ohlin, A-K ja 30 J. Stenflo, J. Biol. Chem., 263 (1988) 7411-4717; Stearns, ... D.J. et ai., J. Biol. Chem., "Micro-thrombomodulin; Residues • * ~ • « ;** 310-486 from the epidermal growth factor precursor-homology • · domain of thrombomodulin will accelerate protein C activation" (painossa 1989); kunnes saadaan pienin fragmentti, 35 jolla ioninsitomistoiminta on säilynyt. HPC-4-cDNA voidaan kloonata ja sekvenssöidä ammattimiesten tuntemilla menetelmillä. cDNA voidaan valmistaa hybridoomasolulinjasta HPC-4 (ATCC-numero 9892), ja muodostaa lamda-gtll-ekspressiokir- 20 101476 jasto (T.V. Huynh et ai teoksessa DNA cloning: a practical approach, voi. 1, (D.M. Glover, ed.), IRL Press, Oxford, 1985, s* 49-78.) Kirjasto voidaan seuloa affiniteettipuhdis-tettua vuohen anti-HPC-4-vasta-ainetta käyttämällä. Sitten 5 sopivat kloonit laajennetaan, cDNA poistetaan ja insertoi-daan Ml3:ta vakio-DNA-sekvensöintiä varten (M13 cloning and sequencing handbook, Amersham; Messing, J., "New M13 vectors for cloning", Methods in Enzymology-Recombinant DNA technigues 101. osa C (1983) 20-78).

10

Lisäksi kloonien ekspressöimät fragmentit, jotka reagoivat anti-HPC-4:n kanssa positiivisesti, voidaan myös puhdistaa ja testata Tb^+:nsitomiskyvyn suhteen, mikä mahdollistaa lisämenetelmän HPC-4-molekyylissä olevan kiinnostavan alueen 15 löytämiseksi. Kun HPC-4-vasta-ainegeenin sopivaa ioninsito-misfragmenttia vastaava DNA-fragmentti on löydetty, käytetään tämän fragmentin poistamiseen sopivaa restriktioentsyy-miä, kuten EcpRlstä. Menetelmiä kimeeristen geenien muodostamiseksi ovat esittäneet esimerkiksi: Kobilka, B.K. et 20 ai., "Chimeric «2“f02“Adrenergic Receptors: Delineation of Domains Involved in Effector Coupling ja Ligand Binding Specificity" Science 240 (1988) 1310-1316; Verhoeyen, M., C. Milstein ja G. Winter, "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity," Science 239 (1988) 25 1534-1536; Riechmann, L., M. Clark, H Waldmann ja G. Win ter, "Reshaping human antibodies for therapy," Nature 332 • · · : (1988) 323-327. Kohteena oleva DNA, joka sisältää kiinnos tuksen kohteena olevan monoklonaalisen vasta-aineen geenin, käsitellään lähde-DNA:n tavoin restriktioentsyymillä niin, 30 että on käytettävissä tila cDNA-fragmentin insertiota var-.··*. ten. Sitten insertioon liitetään linkkerit, joissa on yh- teensopivat päät (esimerkiksi Sali), ja suoritetaan liit- • · · täminen. Sitten kimeerinen cDNA voidaan kloonata sopivaan ekspressiovektoriin, kuten Baculovirukseen menetelmillä, 35 jotka on kuvattu käsikirjassa: Summers, M.D. ja G.E. Smith; "A manual of methods for Baculovirus vectors and insect ; cell culture procedures", Texas Agricultural Experimental I < ·

Station (1987). Yhdistelmä-DNA-geenin ekspressio voidaan „ 101476 21 saavuttaa siellä kuvatuilla menetelmillä. Seulominen halutun tuotteen suhteen voidaan saavuttaa ELISA-määrityksellä, jossa testataan vapautuneen proteiinin kyky tunnistaa antigeeni, jolle immunoglobuliini oli spesifinen metallista riippu-5 vasti. Se, tarvitaanko antigeenin tunnistamiseen metalli-ionin läsnäoloa tai puuttumista, riippuu luultavimmin erityisestä vasta-aine/antigeeni-parista.

Siinä tapauksessa, että HPC-4:n metallinsitomisalue ei si-10 jaitse aminohappojen yhdessä ainoassa jaksossa, esimerkiksi jos tähän kohtaan myötävaikuttavat immunogobuliinin sekä raskaan että keveän ketjun sekvenssit, on välttämätöntä toistaa menetelmä kullekin sellaiselle segmentille tavalla, jonka ovat kuvanneet: Verhoeyen, M. et ai, Science, 1988; 15 Riechmann, L. et ai, Nature, 1988). Ammattimiehet havaitsevat, että tämä keksintö ei missään edellä esitetyssä menetelmässä rajoitu erityisiin nukleaaseihin, vektoreihin tai ekspressiojärjestelmiin, ja siihen kuuluvat kaikki yhdistelmät, jotka viimekädessä johtavat toiminnallisen vasta-20 aineen muodostumiseen, joka voi sitoa kiinnostuksen kohteena olevaa antigeeniä metallista riippuvasti, HPC-4:n sopivan peptidisekvenssi tai -sekvenssien insertiosta johtuen.

HPC-4:n terapeuttiset käytöt 25 Nisäkkäiden verenhyydytys- ja hyytymisen vastaiset järjestelmät toimivat herkkänä tarkistus- ja tasapainojärjestel- • · · ·.· ** mänä, joka ylläpitää verta kunnollisessa nestetilassaan.

Tämän järjestelmän minkä hyvänsä yhden ainoan elementin muutoksilla voi olla suunnaton vaikutus nisäkkään kykyyn 30 ylläpitää verenvuodon lakkaamista.

··« • · • · • · ·

Proteiini C-järjestelmä on veren hyytymistä vastustava, • · säätelevä järjestelmä, joka inhiboi veren hyytymistä ja stimuloi fibrinolyysiä. Tämä järjestelmä aktivoituu trom- 35 biinilla, entsyymillä, joka konvertoi verenhyytymisproses- sissa fibrinogeeniä fibriiniksi. Vapaa tai ylimääräinen ,·, ; trombiini sitoutuu trombomoduliinin, endoteelisolujen pin- • · · nalla olevan proteiinin kanssa. Trombiini/trombomoduliini- 22 101476 kompleksi alentaa trombiinin kykyä katalysoida verihyytymän muodostusta, ja konvertoi trombiinin voimakkaaksi proteiini C-aktivaattoriksi. Aktivoitu proteiini C puolestaan toimii yhdistelmänä proteiini S:n ja membraanipinnan kanssa inak-5 tivoiden faktoria Va ja faktoria Villa rajoittuneella pro-teolyysillä. Inaktivoitu faktori Va menettää kykynsä olla tehokkaassa vuorovaikutuksessa entsyymifaktorin Xa tai substraattiprotrombiinin kanssa.

10 Yksilöille, joilla halutaan lisätä veren hyytymistä, voidaan antaa sopivassa muodossa proteiini C:n vasta-ainetta, trom-bomoduliinin vasta-ainetta, proteiini S:n vasta-ainetta tai C4b:tä sitovaa proteiinia, joka sitoo proteiini S:ää, inak-tivoiden sen tällöin kofaktorina. Potilaat, joilla on FVIII-15 inhibiittoreita, ovat edustavia tämän ryhmän potilaita. Estämällä faktoria Va olemasta inaktivoituna veren hyytyminen etenee jopa faktorin VIII suhteellisen pienillä määrillä.

Näiden proteiini C-verenhyytymisen vastustusjärjestelmän 20 inhibiittoreiden vaikutus voidaan kumota antamalla ylimääriä aktivoitua proteiini C:tä tai proteiini S:ää, reitin salpaa-miseen käytetystä aineesta riippuen. Sopiva määrä perustuu laskelmiin veressä läsnäolevien proteiinien suhteellisista moolimääristä.

25 Tämän menetelmän sovellettavuus hyperkoagulointitilan tuot- • · · ; tamiseen on osoitettu antamalla HPC-4:ää paviaaneille (Tay lor et ai., J. Clin. Invest. 79 (1987) 918-925. Kun HPC-4:ää oli läsnä, eläimille kehittyi massiivinen verenhyyty-30 misvaste, jolle oli luonteenomaista täydellinen fibrinogee- .***. nin kulutus, bakteerien alhaisten tasojen infuusioon. Ne • · · .·.· eivät kehittäneet tätä vastetta vasta-aineen puuttuessa.

• · ·

Olennaisesti identtiset tulokset saadaan, kun C4bBP-tasoja kohotetaan tasolle suunnilleen 1 mg/ml plasmaa. Vaikka nämä 35 vasteet ovat eläimille turmiollisia, ne kuvaavat, että kumpikin menetelmä lisää verenhyytymisjärjestelmää. Tämä on edullista tilanteissa, joissa normaali verenvuodon lakkaaminen on heikentynyt.

23 101476 Tätä menetelmä voidaan käyttää myös muiden hyytymistekijä-puutetilojen hoidossa, mukaan lukien veren verihiutaleiden niukkuuden, jonka on aiheuttanut esimerkiksi hepariini tai säteilytyshoito, maksasairaus ja verenvuotoshokki, sekä 5 akuutisti että minimoimaan uutta verenvuotoa akuuttitapauk-sen jälkeen.

HPC-4:tä voidaan käyttää myös indusoimaan hiussuonten veren-hyytymiä kiinteässä kasvainverkostossa. Koiran kiinteässä 10 kasvainmallissa tämän on keksitty estävän kasvaimen kasvua suuresti. Tämän vasta-aineen ja/tai muiden edellä mainittujen, proteiini C-verenhyytymänvastaisen reitin salpaamaan pystyvien aineiden yhdistelmä muiden nykyisin käytettävien hoitomuotojen, kuten kasvainkuoliotekijän tai säteilytyksen 15 kanssa, voi johtaa tehokkaampaan kiinteiden kasvainten hoitoon.

Farmaseuttisesti hyväksyttäviä väliaineita näiden aineiden antamiseen ovat mm. steriili normaalinen suolaliuos, joka 20 on fysiologisessa pH-arvossa. Edullinen menetelmä aineen antoon on injektio kohteeseen, edullisimmin laskimnonsisäi-sesti. Edullisia ovat annokset välillä noin 5 ja noin 20 pg HPC-4/ml plasmaa, joka on riittävä salpaamaan yli 90 % endogeenisestä proteiini C:stä.

25

Esimerkki 1: V : Proteiini C:n suurimittakaavainen. nopea eristys plasmasta.

Proteiini C:n nopea eristys voidaan toteuttaa seuraamalla alla kuvattua menetelmäkaaviota. Lyhyesti, proteiini C ja 30 muut vitamiini K:sta riippuvia proteiineja adsorboidaan .··♦. jaksottain QAE Sephadex Q50:een (30 g turvotettu 0,1 M NaCl, .♦,· 0,02 Tris'HCl, pH 7,5:ssä) 30 l:sta ihmisen plasmaa laimen- • · nettuna 1:1 0,02 M Tris’HCl, pH 7,5, hepariinilla (1 U/ml • < V. lopullista tilavuutta) ja bentsamidiini*HCl:ää (10 mM lopul- I < f 35 linen tilavuus) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, annetaan • · .*;· asettua 30 - 60 min, ja supernatantti poistetaan lapolla.

.·. Sephadex pakataan 10 x 60 cm-kolonniin, pestään 1 1:11a

0,15 M NaCl, 0,02 M Tris*HCl, 10 mM bentsamidiini’HCl, pH

24 101476 7,5:tä ennen proteiini C:n eluointia 0,5 M NaClsllä Sennassa puskurissa. Yhdistettyjen fraktioiden tilavuus alennetaan noin 600 ml:aan. Tähän tilavuuteen lisätään hepariinia tasoon 10 U/ml, Ca^+:aa tasoon 10 mM, DFPttä tasoon 1 mM, 5 ja noin 100 ml HPC-4 Affi-Gel 10:tä. Tätä seosta sekoitetaan 1 tunti, annetaan asettua, pakataan 2,5 x 20 cm-kolonniin, pestään 1 1:11a 0,5 M NaCl, 0,02 M Tris*HCl, 5 mM bentsami-diini’HCl, 2 mM CaCl2r pH 7,5:tä, sitten 100 ml:11a 0,1 M NaCl, 0,02 Tris HC1, 2 mM CaCl2, PH 7,5, ennen proteiini 10 C:n eluointia samalla puskurilla, joka sisältää Ca^+:n sijasta 2 mM EDTA:ta.

Seerumin amyloidi P:n kontaminaatio, joka proteiini sitoutuu Sephadexiin Ca^+:n läsnäollessa, poistetaan ioninvaihtokro-15 matografiällä on QAE Sephadex Q50:llä. Kolonni (0,9 x 30 cm) ajetaan lineaarisella gradientilla 0,1 - 0,6 M NaCl 0,02 M Tris HCl, pH 7,5:ssä. Proteiini C eluoituu kolonnista viimeisenä huippuna. Tämä voidaan vahvistaa SDS-geelielekt-roforeesilla, proteiini C-antigeenin määrityksellä ja pro-20 teiini C:n toiminnallisella määrityksellä. Tämä valmistus tuottaa yksiketjuista - ja kaksiketjuista proteiini C:tä suunnilleen samoissa suhteissa kuin esiintyy ihmisen plasmassa.

25 PROTEIINI C:N PUHDISTUS

• · ' 1 ‘ laimennetun heparinisoidun plasman jaksottainen adsorptio QAE Sephadexilla 30 Pesu puskuroidulla 0,15 M NaCl:llä ;***; Eluointi puskuroidulla 0,5 M NaClsllä • · · • · • · • * »

Kalkkikonsentraation säätö ja jaksottainen adsorptio HPC-4:llä 35

Pesu Ca^+:aa sisältävällä puskuri

Eluointi EDTA:ta sisältävällä puskurilla 25 101476

Kun plasman sijasta käytetään kaupallisesti valmistettuja vitamiini K:sta riippuvien plasmaproteiinien konsentraatte-ja, kuten Konyne (Cutter Labs), Proplex (Hyland) tai FEIBA (IMMUNO, Itävalta), konsentraatit muodostetaan uudelleen 5 puskuriin, joka on yhteensopiva proteiini C:n HPC-4-sitomisen kanssa (ts., on puskuroitu välille pH 6 ja pH 7,5, sisältää 2 mM CaC^Jta, hyytymisenestoaineita, kuten hepa-riinia tasolla 5-10 U/ml ja antitrombiini III:a (10 - 100 (pg/ml) ja proteaasi-inhibiittoreita, kuten bentsamidiinia 10 ja DFP:tä 1 mM kumpaakin), ja lisätään suoraan HPC-4-Affi-Gel 10-hartsiin joko erään tai kolonniin. Käytetyt pesuja eluointiolosuhteet ovat samat, edellä yksityiskohtaisesti kuvatut. QAE-kromatografiaa tarvitaan proteiini C:n HPC-4-hartsista eluoinnin jälkeen vain, jos affiniteettihartsissa 15 lisätyssä materiaalissa esiintyy seerumiamyloidi P:tä.

Kun plasman tai konsentraatin sijasta käytetään supernatant-tia ihmisen proteiini C:n tuottamiseen geenimanipuloiduista kudosviljelmäsoluista, se voidaan joko sekoittaa suoraan 20 HPC-4-affiniteettihartsin kanssa 2 mM CaCl2:n ja proteaasi- inhibiittoreiden lisäyksen jälkeen, konsentroinnin ja uudel-leensuspensoimisen jälkeen edellä yksityiskohtaisesti kuvattuun puskuriin, joka on yhteensopiva proteiini C:n sitomiseksi HPC-4:ään. Supernatantti voidaan konsentroida 50-% 25 N^SOjj-saostuksella tai ioninvaihdolla, joka kuvattiin edellä plasmaan viitaten. Tavallinen proteiini C-saanto on 0,04 mg proteiini C:tä/mg vasta-ainetta.

Esimerkki 2: 30 HPC-4;n käyttö diagnostisena aineena proteiini C:lle.

HPC-4:ää voidaan käyttää analysoimaan proteiini Citä ihmisen plasmassa. Proteiini C voidaan adsorboida kvantitatiivisesti • · « ja eluoida toistettavasta immobilisoidusta HPC-4:stä. Tulokseksi saatavasta proteiini C:stä voidaan analysoida toimin-35 nallisia ominaisuuksia. Tämä on käyttökelpoista proteiini ;*·.) C-puutteen yksiselitteiseen havainnollistamiseen valituilla potilailla, joilla on palaava veritulppaa ja epänormaaleja proteiini C-molekyylejä. Esimerkkejä proteiini C-vasta-ai- 26 101476 neiden käytöstä diagnostisiin tarkoituksiin on kuvattu julkaisuissa: D'Angelo, S.V. et ai, J. Clin. Invest., 77. (1986) 416-425; ja Faioni, E. et ai, Blood. 71 (1988) 940-946.

5

Lisäksi vasta-aine voidaan leimata radioaktiivisella aineella, kuten hiilillä käyttämällä entsymohelmiä (Bio-Rad) , bio-tiinia (Shattil, S et ai,, Blood. XQ. (1987) 307-315), muulla sopivalla ja ammattimiesten tuntemalla rutiininomaisten im-10 munologisten määritysten kehittämiseksi kliinisissä laboratorioissa käytetäväksi, kuten entsyymisidonnaisen immuno-määrityksen (ELISA) tai radioimmunomäärityksen (RIA) proteiini C:n antigeenisen tason määrittämiseksi kliinisissä plasmanäytteissä.

15

Olisi kuitenkin huomattava, että vaikka vasta-aineita käyttävien menetelmien kuvaus on esitetty aikaisemmin, ei tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine ole ollut yleisesti saatavissa.

20

Claims (7)

101476

1. Menetelmä kalsiumista riippuvan proteiini C:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään sopivissa olosuhteissa hybridoomasolu- 5 linjaa HPC-4, jolla on ATCC-talletusnumero HB 9892.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine edelleen sisältää leiman, joka on radioaktiivinen molekyyli, kemiluminoiva molekyyli, fluore- 10 soiva molekyyli, luminoiva molekyyli tai entsyymi.

3. Hybridomcellinje HPC-4, kännetecknad av att den är de- • · ponerad hos American Type Culture Collection med depone-ringsnumret HB 9892.

3. Hybridoomasolulinja HPC-4, tunnettu siitä, että se on talletettu laitokseen American Type Culture talletusnume-rolla HB 9892. 15

4. Forfarande för isolering av en kalciumberoende monoklo- < · nai antikropp specifik för en epitop av aktiveringspeptid-regionen av proteins C tunga kedja, kännetecknat av att nämnda antikropp har en variabel region av monoklonal an- 101476 tikropp HPC-4 deponerad hos American Type Culture Collection med deponeringsnumret HB 9892, varvid förfarandet inne-fattar foljande steg: 1. man astadkommer en immobiliserad polypeptid, som ej bin-5 der kalcium, och innehaller aminosyrasekvensen: glutaminsy- ra-asparaginsyra-glutamin-valin-asparaginsyra-prolin-argi-nin-leucin-isoleucin-asparaginsyra-glycin-lysin, eller en immunologiskt ekvivalent sekvens som binder HPC-4; 2. man astadkommer en lösning innehällande den för separa-10 tion avsedda antikroppen och kalcium, varvid antikroppen binder peptiden i kombination med kalcium; 3. man inkuberar under villkor, som tilläter antikroppen att bindas till peptiden; och 4. man eluerar antikroppen frän den immobiliserade peptiden 15 genom att avlägsna kalciumet.

4. Menetelmä kalsiumista riippuvan, proteiinin C raskaan ketjun aktivointipeptidialueen epitoopille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen eristämiseksi, tunnettu siitä, että mainitun vasta-aineen vaihteleva alue käsittää monoklo- 20 naalisen vasta-aineen HPC-4, joka on talletettu laitokseen .·. : American Type Culture talletusnumerolla HB 9892, menetelmän käsittäessä seuraavat vaiheet: • · · • · · I". 1) valmistetaan immobilisoitu polypeptidi, joka ei sido ' '' kalsiumia ja joka käsittää seuraavan aminohapposekvenssin: • 2 5 glut ami inihappo - asparagi inihappo - glu tami ini - vai i ini - aspara - • · giinihappo-proliini-arginiini-leusiini-isoleusiini-aspara- *·« ·,· · giinihappo-glysiini-lysiini tai immunologisesti samanarvoi nen sekvenssi, joka sitoo HPC-4:n; :Y; 2) valmistetaan erotettavan vasta-aineen ja kalsiumin si- i « ;·*: 3 0 sältämä liuos, jolloin vasta-aine sitoo peptidin yhdessä * . kalsiumin kanssa; • · · · · 3. inkuboidaan sellaisten olosuhteiden vallitessa, jotka sallivat vasta-aineen sitoutumisen peptidiin; ja ·;··; 4) eluoidaan vasta-aine immobilisoidusta peptidistä pois- ·’· : 35 tamalla kalsium. • « · • ·

5. Förfarande enligt patentkrav 4, kannetecknat av att antikroppen är HPC-4 producerad av hybridoman HB 9892. 20 6. Förfarande för isolering av en zymogen av protein C el ler dess tunga kedja, kännetecknat av att * 1) man astadkommer en immobiliserad kalciumberoende mono-klonal antikropp specifik för en epitop av aktiveringspep- ’· ' tidregionen av proteins C tunga kedja och för kalcium, vil- 25 ken monoklonal antikropp produceras av en hybridomcellinje • I I i#>t HPC-4 deponerad hos American Type Culture Collection med :Y deponeringsnumret HB 9892; 2. man astadkommer en lösning innehällande kalcium och den för separation avsedda zymogen av protein C eller dess tun- 30 ga kedja under villkor, som tilläter antikroppen att bindas :·. till aktiveringspeptidregionen och bindning av kalciumet; • · *... och • · • · , 3) man eluerar zymogen av protein C eller dess tunga kedja frän antikroppen genom att avlägsna kalciumet. ·;· 35

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on hybridooman HB 9892 tuottama HPC-4. 101476

6. Menetelmä proteiini C:n tsymogeenin tai sen raskaan ketjun eristämiseksi, tunnettu siitä, että 1. valmistetaan immobilisoitu kalsiumista riippuva mono-klonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen proteiini C:n 5 raskaan ketjun aktivointipeptidialueen epitoopille ja kalsiumille, jota vasta-ainetta tuottaa hybridoomasolulinja HPC-4, joka on talletettu laitokseen American Type Culture Collection talletusnumerolla HB 9892; 2. valmistetaan liuos, joka sisältää kalsiumin ja eristet-10 tävän proteiini C:n tsymogeenin tai sen raskaan ketjun, olosuhteissa, jotka sallivat vasta-aineen sitoutumisen ak-tivointipeptidialueeseen sekä kalsiumin sitomisen; ja 3. eluoidaan proteiini C:n tsymogeeni tai sen raskas ketju vasta-aineesta poistamalla kalsium. 15

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine immobilisoidaan kiinteään substraattiin, joka on kromatografinen hartsi tai suodatin.

20 Patentkrav : 1. Forfarande för framställning av en kalciumberoende mo- noklonal antikropp mot protein C, kännetecknat av att man • < · odlar under lämpliga förhällanden en hybridomcellinje HPC-4 med ATCC-deponeringsnumret HB 9892. 25 • · · • · *···* 2. Forfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att an- • · · *.· * tikroppen vidare innehäller ett märke som är en radioaktiv molekyl, kemiluminescerande molekyl, fluorescerande mole-kyl, luminescerande molekyl eller enzym. 30

7. Förfarande enligt patentkrav 6, kanne tecknat av att an- t · tikroppen immobiliseras i ett fast substrat, som är ett t *·· kromatografiskt harts eller ett filter.