JPH03504332A

JPH03504332A - プロテインｃに対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH03504332A
Application number: JP2502801A
Authority: JP
Inventors: エスモン，チャールズ　ティ．; エスモン，ナオミ　エル
Original assignee: オクラホマメディカルリサーチファウンデーション
Priority date: 1988-12-30
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1991-09-26
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: AU669540B2; DK209090A; CA2006684C; DE68922491D1; DE68922491T2; DK209090D0; JP2559537B2; EP0407544A1; EP0407544B1; KR940002033B1; FI904262A0; KR910700266A; AU4422893A; AU4968390A; DK171826B1; ES2074562T3; FI101476B; CA2006684A1; AU641634B2; FI101476B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プロティンＣに対するモノクローナル抗体（発明の背景）本発明は一般的には血しょうタンパク質に対する抗体に関し、特にプロティンＣとその利用に関するものである。

プロティンＣは、セリンプロテアーゼ前駆体であるビタミンに依存住血しょうタンパク質であり、活性化により効果的な抗凝固剤となる。活性化プロティンＣはプロ凝固補助因子である第■ａ因子および第Ｖａ因子の特異的加水分解によって作用するが、この活性化には別のビタミンに依存性タンパク質であるプロティンＳ１およびカルシウム、リン脂質表面（多分、細胞表面）が必要である。止血と血栓症二基礎原理と臨床応用　ｅ＋ｇｏｓｔａｓｉｓ　　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃ４１ｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、　Ｃｏｌｍａｎ、　Ｒ，！、　　ら、２６３頁、　へ °ンシルへ゛二了州フィラテ゛・ルフィ７　　　Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、　　１９８７年）記載の第１図によると、Ｃタンパ°り質はより小さい軽鎖に１本のジスルフィド結合でつながれたより大きい重鎮の２本鎖の形で循環している。このタンパク質のごく一部は１本鎖の形で循環しているが、この場合は分子内のりジン−アルギニンジペプチドが軽鎖を重鎖に直接つないでいる。プロティンＣは活性化して活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）となる。トロンビンは、重鎖のＡｒｇ”−Ｌｅｕ”結合を特異的に切断しプロティンＣを活性化することができる。インビボでは、生理的濃度のカルシウムの存在下、トロンビンが内皮細胞補助因子であるトロンボモジュリンと結合することによりプロティンＣの活性化速度は劇的に促進される。Ｍａｔｓｃｈｉｎｅｒら（ビタミンに研究の現代の進歩、　ＣｕｒｒｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｔａｗ＋ｉｎｅ　Ｋ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ）、１３５−１４０頁、Ｊｏｈｎ　’１．５ｕｔｔｉｅ　ｔｉＡ集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　　１．９８８年）は凝固におけるビタミンに依存性タンパク質の役割について、さらに記載している。

プロティンＣはインビボにおいてきわめて重要な役割をはたしている。プロティンＣまたはその補助因子であるプロティンＳが欠損している患者は、顕著な血栓症状を示す。プロティンＣが生まれつき全く欠けている乳児は塊状血管内凝固症（ＤＩＣ）　、および壊死症候群を示し、なんらかの治療を施さなければ生後数週間以内に死亡する。活性化プロティンＣはまた、Ｔａｙｌｏｒらが述べているように（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、第７９巻、９１Ｂ−９２５頁、　１９８７年）内毒素ショックによる凝固傷害および致命的作用から動物を保護することが示された。

Ｋ１５ｉｅｌらが最初に報告している様に（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、第６４巻、　　７６１−７６９頁、　１９７９年）、プロティンＣはシック酸バリウム吸着、および溶離、硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−セファデクスクロマトグラフィー、デキストラン・硫酸アガロースクロマトグラフィーおよび調製ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む古典的タンパク質精製法により血しょうから半端製状態で単離された。この精製方法は、５ｔｅａｒｎｓら（ム」ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、第２６３巻第２号、８２６−８３２頁、１９８８年）の記載にあるＲＰＣ−４と名付けられたプロティンＣに対する特異的抗体の発見により大幅に改良され促進された。「凝固因子を含む血液分画の標準化に関するＩＡＢＳ／ＣＳＬ合同シンポジウム（Ｊ。

ｉｎｔ　ＩＡＢＳ／ＣＳＬ　Ｓｙ＋ｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　５ｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｃｏａｇｕａｌｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ、オーストリア国メルボルン市、１９８６年）」においてＥｓ＋ｍｏｎらが詳細に述べている様に（Ｄｅｖｅｌｏｐ、　ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄ、、　６７巻、５１−５７頁、パーセル市　Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ、　　１９８７年、に報文）、希釈したヘパリン住血しようをＱＡＥセファデクスにバッチ的に吸着させ０．１５Ｍ緩衝化ＮａＣ１で洗浄後、０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶離し、再カルシウム化し、そして、　ＨＰＣ− ４にバッチ的に吸着し、次いでＣａ”を含む緩衝液で洗浄後ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶離することにより、ヒト血しょうからプロティンＣが単離される。

ＲＰＣ−４はヒトプロティンＣに対するカルシウム依存性モノクローナル抗体である６抗体によって認識されるエピトープが同定され、それはトロンビン開裂位置にわたるプロティンＣの前駆体のアミノ酸鎖に対応する。活性化プロティンＣはＲＰＣ−４によって認識されない。

ヒトプロティンＣに対するいくつかの抗体が以下の研究者らによって報告されている。

Ｌａｕｒｅｌ　ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、、第１９１巻第１号、７５−８１頁、１９８５年；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｔ、２６１巻、’１１０９７−　　１１１０５頁、１９８６年；Ｓｕｇｏら、リエ四あ−シ１虹土工尤徂」二、１ひ！鈷月ユ、２２９頁、１９８７年；および０ｈｌｉｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、第２６２巻、１３７９ｇ−１３８０４頁、１９８８年。

これらのうちのいくつかは、例えばＬａｕｒｅｌｌらによって報告されている様に、カルシウム依存性である。しかしながら、刊行された報告で見るかぎり、この依存性はプロティンＣの軽鎖のカルシウム結合要求によるものであり、抗体は軽鎖上のエピトープを認識する。他の抗体は重鎮上のトロンビン開裂領域周辺を認識するが、これらは、０ｈｌｉｎらによって記載されているＲＰＣ−４も含め、カルシウム依存性ではない。０ｈｌｉｎらのＲＰＣ−４抗体はＣａ”依存性でないと同時に活性領域を指向してもおらず、従って本発明の抗体とは異なったものである。

プロティンＣのＣａ”結合領域に結合する抗体は、いずれもプロティンＣのみを認識することはなく、そして、活性型は認識しない。活性型で汚染されていないタンパク質が望ましい場合があるが、プロティンＣの活性化を阻害する治療に使用する場合は特にそうである。

残念ながら本発明の抗体の使用、そして、より最近ではその性質が文献に報告されているにもかかわらず、単離、診断または治療の方法については一般に知られていない。

従って、本発明の目的は、プロティンＣの活性領域に結合するＣａ”依存性抗体を提供することである。

本発明のさらなる目的は、このＣａ２°依存性抗体のドメインを、他の金属非結合ペプチドまたはタンパク質を単離するのに使用する方法および手段（金属イオン依存アフィニティークロマトグラフィーに利用する）を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、このＣａ２“依存性を治療目的に使用する方法と手段とを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、この単数または複数のＣａ２＋依存性抗体、それらの誘導体および複合体を診断目的に提供することである。

（発明の要旨）本発明は、ウシ起源でない、ヒト、ブタ、ヒヒ、およびイヌのプロティンＣの活性領域の１２個の特異的ペプチド配列（ＥＤＱＶＤＰＲＬ　Ｉ　ＤＧＫ）に特異的に結合するＣａ２＋依存性モノクロ一ナル抗体に関するものである。本抗体は活性化プロティンＣには結合せず、トロンビン−トロンボモジュリンによるプロティンＣの活性化阻害に使用することができる。

この抗体は、固定化坦体に結合した上記のペプチド配列を利用スるアフィニティークロマトグラフによって、細胞培養物または腹水から大量に単離することができる。

本抗体はプロティンＣの単離および特徴づけに、そして、診断およびプロティンＣの活性化を阻害する治療に、特別な用途がある。プロティンＣは自然につくられるか、または組み替え遺伝子の発現に・よってつくられる。抗体がプロティンＣに特異的で活性プロティンＣに対しては特異的でないこと、および抗体をクロマトグラフィー支持体に固定化するとき、特定ノエピトーブおよびカルシウムによって抗体の抗原結合位置を保護することができるということが、プロティンＣ精製における本抗体の利点に包含される。インビボにおいて、本抗体は腫瘍の成長を阻害することが示された。さらに、高レベルの第■因子阻害物質、血友病、血小板欠損症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｊａ）　、およびその他凝固性を増大することが望ましい凝固不全症において凝固を促進するのに、本抗体、抗プロティンＳ抗体、ＣＢ−４結合タンパク質が、単独または組み合せで有効である。さらに、特定のエピトープを抗体の大量精製に使用すること、および本抗体がウィルス不活性化処理に対し安定であることは、従来、開示されていない。

（図面の簡単な説明）第１図は、１本のジスルフィド結合で結ばれたプロティンＣの重鎮、軽鎖を示す模式図であり、成長因子様領域（Ｇｌａ−領域）、セリンプロテアーゼ領域および活性ペプチド領域が指定されている。

第２図は、ペプチドＰ　（６−１７）が存在する場合、および存在しない場合の金属イオンに依存するＲＰＣ−４の固有蛍光の変化を示し、Ｆ／Ｆｏ対金属イオン濃度（ｄ）のグラフである。１μＭのＲＰＣ−４を、２μＭの１１（６−１７＞が存在する場合、またはしない場合について、トリプトファンの放射光をモニターしながら金属イオンで滴定した。Ｆｏは金属を添加しないときのＦ［ＰＣ− ４放射光ピ一ク面積（±ペプチド）を示す。・およびＱは、Ｊ（ＰＣ−４または１（ＰＣ〜４＋ペプチドのそれぞれのＣａ”滴定値、そして、■および口は、ＲＰＣ−４またはＨＰＣ−４＋ペプチドのそれぞれのＭ　ｇ２（−滴定値を示す。

（発明の詳細な説明）モノクローナル抗体）ＩＰＣ−４を特に有用にする性質は次の通りである。

本抗体はプロティンＣとカルシウム存在下でのみ結合し、活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）とは結合しない。従って本抗体をアフィニティー支持体に固定化すると、血しょう由来の原料または組織培養発現系由来の原料からきわめて穏和な条件でプロティンＣを単離することができる。このことは生産物の生物活性を維持し、固体支持体樹脂を安定に保つ上で重要である。活性化プロティンＣはどの様な条件でも抗体と結合しないため、得られた生産物には全＜　　Ａｒｃが含まれない。

本抗体はプロティンＣの活性部位に結合するので、インビボで抗凝固タンパク質ＡＰＣ生成を阻止するのに使われ得る。

この抗体はＡＰＣに結合せず、またそれを阻害もしないのでインビボにおける阻害効果はＡＰＣ投与によって逆転することもできる。

本抗体はプロティンＣの特定の領域残基６から１７、特にＥＤＱＶＤＰＲＬ　Ｉ　ＤＧＫ内に結合する。このペプチドは固体坦体樹脂に直接固定化され、マウス腹水液または組織培養物上澄から抗体を高濃度で単離するのに使用され得る。この方法によれば、非常に希薄な溶液からでも抗体をきわめて純粋に高収率で単離することができる。

必要であれば、カルシウムイオンを除去するか、または精製されたモノクローナル抗体の機能に影響しない　１．５Ｍグアニジンによって抗体を固定化ペプチドから外すことができる。

グアニジンは規制当局によって認められたウィルス不活性化剤であるので、後者は有意義である。この試薬で溶離または処理した後は、ハイブリドーマの組織培養物が用いられる場合には、得られた抗体中には、モノクローナル抗体を生産するのに用いられたマウス由来の腹水、または培養物上澄に存在し得る生きたウィルスは、全く含まれない。従って、プロティンＣを調製するために用いられた抗体からプロティンＣ生産物にウィルスが持ち込まれることはない。

本抗体はヒト、ブタ、イヌ由来のプロティンＣを認識するが、ウシ由来のものは認識しない。それゆえ、組替え技術によるプロティンＣ生産細胞を培養するのに使われるウシ胎児血清はヒトプロティンＣ生産物を汚染しない。

本発明のモノクローナル抗体は以下のように生産されるノ＼イブリドーマ　ＲＰＣ−４より分泌される。

モノクロ−乞工血生立翌盈完全フロインドアジ二バント中の５ｏ−ｉｏｏμｇの精製ヒトプロティンＣ（ｆ（ＵＰＣ）をＢＡ　ＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射した。マウスは、３週間後に不完全フロインドアジユバントにエマルジョン化したＨｕＰＣで、そして６週間後にＴＢＳ（０，１Ｍ　ＮａＣ１０，０２ＭＴｒｉｓ塩酸、　ｐＨ７，５）中のＨｕＰＣで再免疫化した。４日後、３５％ポリエチレングリコール１４５０を使用する、以下の文献に記載される標準的な方法により肺臓細胞とマウスミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８−６５３とを融合シタ。

Ｌａｕｒｅｌｌ、Ｍ、、　Ｋ、Ｉｋｅｄａ、　Ｓ、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ、　Ｊ、５ｔｅｎｆｌｏ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ■１９１巻、７５−８１頁、１９８５年；ＷａｋａｂａｙａｓｈｉＪ、、　Ｙ、５ａｋａｔａ、　Ｎ、Ａｏｋｉ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６１巻、１１０９７−１１１０５頁、１９８６年；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ，Ａ、１Ｆ、、　Ｍ、Ｅ、Ｅｔｚｅｒ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　　　２５６巻、４７２３−４７２５頁、１９８１年；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、、　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６巻、４９５−４９７頁　１９７５年。

細胞をＨＡＴ培地で培養しハイブリドーマを選別した。４週間後に、ＳｍＭのＣａ”存在下および不存在下で固相酵素結合免疫吸着分析法により融合細胞の抗体生産性を選別した。

分析のため、培養上澄を５ｅＭ　ＣａＣｌ２または５ｔａＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液中に１＝４の比率で希釈した。全ての試薬（抗原、洗浄用緩衝液、検出用抗体）中には適当な濃度のカルシウムまたはＥＤＴＡが含まれる。

プロティンＣとの反応性を基準に決められる、目的とする陽性クローンを、ネズミ腹膜洗浄供給細胞についての限界希釈により少なくとも２回、再クローン化した。

最初に腹水分泌を誘導するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにブリスタンを投与し、１４日後、免疫順応させるためｌ０ｍｇ／ｍｌのシクロホスファミドＯ，１ｍｌを腹腔内注射した。７４時間後に、３−６×１０６個の細胞を腹腔内注射し、７− １０ＦＥ後に、腹水を採取しＲＰＣ−４モノクロ一ナル抗体を腹水から精製した。抗体は通常、腹水１ｍｌ当り８−１５ｍｇ含まれている。抗体は以下の３つの異なった方法で精製された。（１）　（ＮＨａ）２ｓ０４分画を行ない、次いでＱＡＥセファデクスクロマトグラフィーにかける；（２）ヒトプロティンＣＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１５によるアフィニティークロマトグラフィーを行う；または、（３）　ＲＰＣ−４により認識されるペプチドＥ　Ｄ　Ｑ　Ｖ　Ｄ　Ｐ　ＲＬ　Ｉ　Ｇ　Ｋ　（ＧＬＵ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）上でのアフィニティークロマトグラフィーにかける。

あるいは、選別されたハイブリドーマは実験室用培養容器中、インビトロにて増殖され、選ばれた抗原に対するモノクローナル抗体がデカンテーションによって採取され、そして、腹水の場合と同様に精製することができる。ノ＼イブリドーマ組織培養物上澄から）ＩＰｃ−４を単離するために、エピトープアフィニティー樹脂を使用することもできる。原料は直接カラムにかけられる。対数増殖中の培養物中の抗体濃度は２５μｇ／＋１である。

モノクローナル抗体ＨＰＣ−４は腹水から次のようにして精製された。つまり、まず、腹水をＮＨａＳＯａ分画（腹水を水で１＝１に希釈し、同容量の飽和ＮＨ４ＳＯ４を加えて沈澱させる）後、ＱＡＥ−セファデックスＱ−５０によるクロマトグラフィーを行い（硫酸アンモニウムによる沈澱を遠心分離で集め、０．０２７Ｍ　　丁ｒｉｓ燐酸、ｐ）１６．３中に透析脱塩し、その後、腹水１ｍｌ当り樹脂１ｍｌの割合のカラムを０．０２７Ｍ　Ｔｒｉｓ燐酸ｐＨ６，３で平衡化し、０から０．４ＭのＮａＣｌ直線勾配でカラム容積の約５倍量を流し約８時間かけて展開した）。続いて、溶離液に５０％Ｎ）！４ＳＯ４を加えて抗体を沈澱させ、セファデクス０２００カラムクロマトグラフ４−　（０，ＩＭＮａｃｌ、　ＩｍＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，５）を行うことにより、モノクローナル抗体精製ＲＰＣ−４を得た。

本抗体はＨｕＰＣ−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌまたはペプチド−Ａｆｆ　ｉ−ｇｅｌアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。

ＲＰＣ−４によって認識されるエピトープはプロティンＣ重鎖の活性領域にある１２個のペプチド配列ＥＤＱＶＤＰＲＬ　Ｉ　ＤＧＫまたは免疫学的に類似の配列である。　Ａｆｆｆ−Ｇｅｌ　１５に結合したペプチドの最終濃度は約１．０ｍｇ／＋１となる。製造者（Ｂｉｏ−Ｒａ６社、カリフォルニア州すッチモンド市）の記載によれば、エピトープ・ペプチドの結合は０、ＩＭ　ＮａＣ１，Ｏ，ＩＭ　ＭＯＰＳ。

ｐｉ（７，５，４℃で行われる。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌは有機溶剤を除くため使用直前に水冷水で洗浄される。エピトープ・ペプチドは０．ＩＭＮａＣｌ、　０．１Ｍ　＋ｌｌ０ＰＳ、　　ｐＨ７，５で１−２＋ｏｇ／ｍｌの濃度に調製され、必要量の　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｉｓと混合しペプチドとゲルとの最終比率をｌａｇ／ａｌ　とする。ペプチドとゲルを緩やかに終夜振とう混合しく１２−１８時間）、ペプチドをゲルに結合させる。結合反応が完了した後、樹脂をガラスカラムにそそぎ込み０．ＩＭＮａＣＩ、　０．ＯＩＭ　ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，５で洗浄する。１００ｍ１の樹脂は少なくとも１．５８のＲＰＣ−４を結合する能力がある。

ヒトプロティンＣも同様な方法でＡｆｆｉ−Ｇｅｌに結合させることができる。

１ｍｌ当り３−５＋＊ｇのタンパク質を含む上記緩衝液を必要量のＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１５と混合し、ヒトプロティンＣとゲルの最終比率を３−５＋ａｇタンパク質／＋ｅｌゲルとする。

脱塩した腹水由来の硫酸アンモニウム分画をエピトープ・アフィニティーカラムに負荷し、少なくとも４倍量の　０．４Ｍ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７，５でカラムを洗浄した。次にＲＰＣ−４を以下のいずれかの方法でカラムから溶出した：（１）　２Ｍ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸塩、　２ｍＭ　ＥＤＴＡ；（２）　２Ｍ　ＮａＣ１，１，５Ｍグアニジン塩酸塩、　０．０２Ｍ　　Ｔｒｉｓ塩酸。

２■Ｍ　ＥＤＴＡ。

後者の方法の利点は、タンパク質がより鋭いピークとなり、２００ｍ１の腹水を１００＋ｉｌの樹脂カラムにかけた場合、２５＋ｍｇ／ｍｌを越える高濃度で溶出されることである。この様な条件で溶出した後、抗体は９５％を越えるエピトープ結合能力を保持している。

ついで、次の利用のため）ＩＰＣ−４を適当な緩衝液中に透析もしくは脱塩する。ＳＤＳゲル電気泳動の結果、ＲＰＣ−４中には不純物は認められなかった。カラムが過負荷の場合、素通りした原料を再びカラムに戻すことでさらにＮＰＣ− ４を回収することができる。

ＨＰＣ−４抗体は少なくとも２．６Ｍのグアニジンまたは２Ｍチオシアン酸カリウム中、　２２℃で少なくとも２時間は安定であり、この様な条件で処理した後、９５％を越えるエピトープ結合能力を保持している。ペプチド・アフィニティーカラムから溶出後、上記試薬のいづれかで処理することは、出発原料としての抗体を含有する溶液中に存在するウィルスを確実に不活性化し、プロティンＣ最終生産物は１、それを調製するために使用した抗体に由来するウィルスで汚染されない。

本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系はＮＰＣ−４と名付けられ、１９８８年１１月２日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　）に寄託され、受託番号ＡＴＣＣＮｏ、　）ＩＢ　９８９２を得ている。この寄託物は本願が特許となると一般に入手可能となる。しかし、寄託物が入手可能となるということは１、政府により認められている特許権を侵害して、本発明を業として実施することを認可するものではないことを理解しなければならない。

エヱｊユｌ立芳ノクローナゴ一体旦亘血二Ω亘皇抗体の結合は、生産者（カリフォルニア州すッチモンド市Ｂｉｏ−Ｒａ６社）に記載されているように、０．１Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ　ＭＯＰＳ、　ｐ）！　？、５．４℃で行われるｏ　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌは有機、溶剤を除くため、使用直前に水冷水で洗浄される。ＨＰＣ〜４は０．ＩＭ　ＮａＣ１，０、ＩＭＭＯＰＳ中（ｐＨ７，５）、３−５Ｂ／ｍｌの濃度で調製され、必要量のＡｆｆｉ−ＧｅｌＩＯと混合し、ＮＰＣ−４のゲルに対する最終比率を５＋＋＋ｇｌ／ｍｌとする。抗体とゲルとを終夜（１２ −１８時間）穏和に振とう混合し、結合反応を行わせる。通常、９０％を越える割合での抗体が固定化される。結合反応が終了後、樹脂をガラスカラムにそそぎ込みＯｌＩＭ　ＮａＣ１，０，０１Ｍ　ＭＯＰＳ（ｐｌ（７，５）で洗浄する。

この条件下で樹脂は少なくとも１年間は安定である。

１ム久二ニヱ土肱生旦立盟）ＩＰＣ−４抗体の性質に関する詳細な解析はＳ　ｔｅａｒｎｓらによる「Ｃａ ”依存性モノクローナル抗体とプロティンＣ活性ペプチド領域との相互作用（Ｔｈｅ　！ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　　Ｃａ”−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｖｔｔｈ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｐｅｐｔｔｄｅ　Ｒｅｇｉｏｎ：　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｒｓ、、　２６３巻、　８２６−８３２頁、　１９８８年）」　に述べられている。上記の様に調製された）ＩＰＣ−４モノクロ一ナル抗体はプロティンＣ重鎖の活性領域にあるペプチド配列及びＣａ”に特異的である。この抗体はペプチド結合部位に加えて少なくとも一つの金属イオン結合部位を持っているように思われる。ペプチド結合活性は金属イオン結合部位での結合に敏感であり、あるいはそれに依存している。金属イオン結合部位はカルシウムの様な２価金属カチオンか、丁ｂ３＋の様によく似たイオン半径と、配位する性質と、を有する金属と結合することができる。

カルシウムが金属イオン結合部位に結合すると、モノクローナル抗体はペプチドとの結合について、有意により敏感になる。金属イオンがモノクローナル抗体の金属結合部位に結合していないときには、抗原結合部位は相対的に抗原結合に対し鈍感になる。従って、抗原−抗体結合は抗体を取りまく媒体中の金属イオン濃度を調節することにより制御され得る。

この様なモノクローナル抗体の性質は、以下に述べるよういくつかの利点がある。

ＲＰＣ−４のプロティンＣへの結合は、ＲＰＣ−４およびプロティンＣ双方のカルシウムイオン結合部位でのカルシウムイオンの存在により制御される。ヒトＲＰＣ−４（ＨｕＰＣ）　　のどの部分にＲＰＣ−４結合部位があるかを決めるために、Ｅｓｍｏｎらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　２５８巻、　５５４ −５５６頁、　　１９８３年）によりＨｕＰＣを還元し、カルボ手ジメチル化しくＲＯＭ）　ＲＯＭ−重鎖とＲＣＭ−軽鎖を調製した。この両者を０．　ＩＭ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸、　２　＋ａＭ　ＣａＣ１２（ｐＨ７，５）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＲＰＣ−４−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０カラム（１，５Ｘ　１Ｂｃｍ、　０．２ｍｌ／ｗｉｎ、　、　２＋ｎｌずつ分画）にかけた。結合したタンパク質は、２ｍＭ　ＣａＣ１□の代わりに２＋ｍＭ　ＥＤＴＡを使用した以外は同一の緩衝液で溶離した。タンパク質を含む画分を１０％　ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリロニトリルゲル電気泳動で分析した。

その結果、カルシウムを結合してＣ−タンパク鎖であるプロティンＣ軽鎖はカラムに保持されず、それ目体ではカルシウムを結合できない重鎮は保持され、ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶出することが証明された。

活性ペプチド領域の役割をＲＰＣ−４Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　　ｔｏカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで調べた。Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１゜２ｍＭ　ＣａＣｌ２．　Ｏ，ＩＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７，５）溶液中のＨｕＰＣおよびＲＣＭ重鎖を０，２吸光度単位／ｍｌに希釈し、ｌａｌのサンプルを同じ緩衝液で平衡化したＲＰＣ−４−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０カラム（０，５ｃｍ　Ｘ　６ｃｍ　）にかけた。結合したタンパク質はＯ，１，Ｍ　ＮａＣ１，２＋ＩＩＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７，５）で０．７１画分づつ溶出させた。溶出したＨｕＰＣまたはＲＣＭ重鎖の画分２３−２５をプールし、活性ペプチドをトロンビン分解（１０％、　ｗ／ｖ、４時間、３７°Ｃ）で遊離させた。反応を停止するため過剰のアンチトロンビンｍを加え、再度カルシウムを添加し５１＋１Ｍ　ＣａＣｌ２濃度とした後、同じカラムで処理した。各クロマトグラムでのＡ２８８吸光物質の回収率に基づくタンパク質の回収率は９８％を上回った。

これらの結果は、プロティンＣのＲＰＣ−４結合部位は活性部位上またはその近傍にあること、ＨｕＰＣは抗体カラムにＣａ２”に依存して結合すること、およびＡＰＣへ活性化された後、）ｌｕＰｃはもはや）ＩＰｃ−４には結合しないことを示している。ＲＣＭ重鎖もまたＣａ２＋の存在下にＲＰＣ−４カラムに結合し、ＥＤＴＡで溶出される。溶出液をトロンビンで処理し活性ペプチドを遊離させ、ＲＰＣ−４カラムで再処理した場合、ＲＣＭ−重鎖はもはやＲＰＣ−４カラムに結合し２ない。

ＨＰＣ−４抗原結合のＣａ２”依存性を調べるため、ｔ２ＳＩ標識抗体、即ちＲＣＭ　を鎖、ＨｕＰＣおよびガンマカルボキシグルタミン酸ドメインの無いＨｕＰＣ（ＨｕＧＤＰＣ）をイムノビーズ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）に固定化したＲＰＣ−４とインキュベートした。イムノビーズに結合したＲＰＣ−４をＴＢＳ　Ｏ，１％ゼラチン、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）中、４℃で１夜インキユベートし、ＴＢＳｏ、１％ゼラチン　（ｐＨ７，５）で充分に洗浄した（Ｃｈｅｌｅｘ処理）。放射能標識したタンパク質を、１００μ】の）ＩＰＣ−４結合ベッドにＣａ２＋濃度を増加させたＴＢＳｏ、１％ゼラチン（ｐＨ７，５）と共に加えた。全容量を２００μｌとした。溶液を攪はんしながら２５℃で２時間インキュベートシ、適切な量のＣａ”を含むゼラチン緩衝液で洗浄後、ベッドをＮＥ　１６００ガンマ線計数器（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ社製）で計測した。対照試料としてＣａ２”を加えないもの、およびｌ＋ａＩ　ＥＤＴＡを加えないものを用いた。抗原の最終濃度は０．０４から０．１μＭの範囲であり、抗体結合部位が過剰であることを確認するに充分な低濃度である。１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ存在下に測定した１分当りのベースラインカウント数　（加えた総カウント数の５−１５％）を、１分当りの結合した総カウント数から差し引いた。

１２５μ標ｍ　ＲＭＣ重鎖の最大結合量は加えた総量の８０−９０％であり、＋２Ｊ標識ＨｕＰＣまたはＨＵＧＤＰＣの６０−７０％であった。ＲＰＣ−４への最大結合量の１／２１：に相当するＣａ２ゝ濃度はｌ？Ｍｃ重鎖の場合約３６（ ±５）μＭであり、ＨｕＧＤＰＣの場合１１０（±２９）μＭ、　ＨｕＰＣの場合２０５（±　２３）μＭであった。

ＦＩＰＣ−４（５０μＭ＞またはＲＣＭ重鎮（３５ＭＭ）について４５　Ｃａ　２　”との平衡透析実験を行った結果、両者のタンパク質いずれもＣａ２”と高い親和性をもつ結合部位は検知されなかった。しかしながら、両者を一緒に透析した場合（３０ＭＭ　ＲＣＭ重鎖、１５ＭＭ）ＩＰＣ〜４）　、　ＲＣＭ重鎮とＮＰＣ−４が複合体で２：ｌの化学量比をとると仮定すると、２ｍＭ　Ｃａ２” 濃度で複合体１モル当り　２モルと３モルとの間のＣａ２＋が結合することを示す結果が得られた。

抗体結合には活性ペプチド領域が要求されるので、この領域をカバーするため３種類の重なり合う合成ペプチドを調製した。

ここでＤはアスパラギン酸、Ｔはトレオニン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、■はバリン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｌはロイシン、■はイソロイシン、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリン、Ｗはトリプトファンである。矢印はトロンビンによる開裂部位を示す。

合成ペプチドは、アプライド・バイオシステム社製４０３Ａペプチド合成装置を用いた固相合成法により、Ｄｒ、　Ｋｅｎｎｅｔ、ｈ　Ｊａｃｋｓｏｎ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ。

０ｋｌａｈｏ＋ｅａ　ＣｔｔｙにあるＳｔ、Ｆｒａｎｃｉｓ　Ｂｏｓｐｆｔａｌ、　Ｔｕｌｓａ　ＭｅｄｔｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）によるｔ−ブトキシカルボニルの化学を用いて調製された。ペプチドは無水ぷり化水素処理により切断された。逆相高圧液体クロマトグラフィーにより評価されたペプチドの純度は９０％を上回った。ペプチドの分子量は、個々の無水アミノ酸の分子量の総和にペプチド結合生成の補正を行って見積った。ペプチド濃度は、１ｍＭのペプチドの純水溶液の２２０ｎｍ吸光度を基準に見積った。

３種のペプチドについて、マイクロタイター・プレートの小孔内に塗布された固相ＨｕＰＣに対する１２５１標識ＲＰＣ−４結合に対する効果を調べた。Ｐ（１ −１２）はＲＰＣ−４のＨｕＰＣに対する結合を阻害せず、Ｐ（Ｉｓ−２７）はＲＰＣ−４の結合を３０％しか阻害しなかったが、Ｐ（６−１７）はＲＰＣ−４のＨｕＰＣに対する結合を阻害し、最大値の】／２の阻害が約Ｏ１５μＭペプチド濃度で生じた。ＲＰＣ−４と３種の合成ペプチドとの相互作用は、Ｖｅｌ　ｉｃｋら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　４６巻、　　１４７０−１４８２頁、　１９６０年）およびＳｔｅｗａｒｄら（Ａｎｔｉｂｏｄ　　Ａｆｆｉｎｉｔ　：　Ｔｈｅｒｍｏｄ　ｎａｍｉｃ　Ａｓ　ｅａｔｓａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ　ｔｅａｌ　Ｓｉ　ｎ１ｆｉｃａｎｃｅ、　７ロー７７頁、　１９８３年）の方法により、Ｃａ”の存在する場合およびしない場合についてタンパク質の固有蛍光をモニターして調べた。

固有蛍光の測定に際して、２μＭのＰ（６−１７）が存在する場合　。

および存在しない場合について、ＴＢＳ　（ｐＨ７，５）中ｌμＭのＨＰＣ−４（Ｃｈｅｌｅｘ処理を行ったもの）を同じ緩衝液で希釈したＣａＣ１２またはＭｇＣｌ２で滴定した。合成ペプチドＰ（１−１２）、　Ｐ（６−１７）またはＰ（１５−２７）で滴定されたＲＰＣ−４のｉｏ＋Ｍ　ＥＤＴＡまたは１ｍＭＣａＣｌ２を含有する溶液中の最終濃度は、ペプチドを添加する前は５μＭであった。蛍光強度（３０５−４００ｎｍ）は滴定液添加の５分後に測定された。すべての実験条件で、滴定液添加による試料の希釈は、観測される４％未満の信号変化に寄与した。

結合するペプチドは芳香族アミノ酸を含まないため、観測される固有蛍光の変化はペプチドの結合に起因する抗体の変化に直接関連する。ＲＰＣ−４の固有蛍光は１＋ｍＭ　Ｃａ２“の存在下、Ｐ（６−１７）で滴定すると増加し、ペプチドと抗体との比率が予想される　２：１の値に達したとき最大となった。ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中でも蛍光は増加したが、この場合はより高いペプチド濃度を必要とした。合成ペプチド　Ｐ（１−１２）とＰ（１５−１７）の場合はＣａ”の存在下でＲＰＣ−４の蛍光は有意に変化しなかった。

ＲＰＣ−４−Ｐ（６−１７）結合のＣａ２＋依存性についても、蛍光法で検討した。Ｐ（６−１７）の存在下ＲＰＣ−４の固有蛍光はＣａ”滴定で増加し、６．５±１．２μＭ　Ｃａ”濃度で最大値変化の１／２を示した。２μＭ　Ｐ（６− １７）が存在する場合、あるいは、しない場合について、ＩｕＭ　ＲＰＣ−４を金属イオンで滴定した。さきに述べた様に、トリプトファンの発光の変化をモニターした。ｙ　ｇ　２＋はペプチドが存在する場合、あるいは、しない場合の何れの場合もＲＰＣ−４の内因性蛍光になんらの効果らなかった。ペプチドの不在下で抗体をＣａ２＋で滴定した場合、内因性蛍光の消光はわずか５％であり、Ｃａ２４と抗体との親和性の相互作用が低い可能性を示している。

Ｃａ２”結合部位を研究するためＴｂ３＋を使用したが、その理由はタンパク質のトリプトファンまたはチロシン残基に充分近い部位にＴｂ３＋が結合すると、１重項−１重項遷移が有効におこなわれ、Ｔｂ”＋の蛍光発光が非常に増大するためである。Ｐ（６−１７）は蛍光を増強するためのドナーとなる芳香族アミノ酸を含まないのに対し、ＲＰＣ−４には含まれる。０．１Ｍ　ＭＥＳ、　０．１％ゼラチン、　０．０２％ＮａＮ５（ｐＨ６，０）中、ＩｕＭ　ＨＰＣ−４を４ μＭＰ（６−１７）の存在下、および不存在下にＴｂ”で滴定した。ＳＢ　３００ＵＶバンドパスフイルター（Ｏｒｉｅ１社製）を励起光路に使用し、ＲＰＣ− ４）リブトファンを２８５ｎｍで励起した。Ｔｂ３”イオンの発光強度を２ｒｖ＋毎に記録し、５３８から５５２■まで積算した。散乱光からの寄与は、５７０から５８０ｎｍで記録される励起波長の高調波として測定された。Ｔｂ”＋の各濃度毎に、試料測定と並行して滴定した溶媒の発光強度ブランク値を、タンパク質溶液の値から差し引き、タンパク質依存のＴｂ”の蛍光のみを求めた。

ＲＰＣ−４のＴｂ”による滴定の結果、Ｔｂ”の蛍光が増加し、遊離Ｔｂ３＋濃度が３４±１１μＭで最高値の１７２となった。Ｐ（６−１７）の存在下でも、Ｔｂ３”による）ＩＰＣ−４の滴定によりＴｂ３”の蛍光は増加したが、最高値１／２濃度は遊離Ｔｂ”濃度で２±０．９μＭに減少した。ペプチドを同じ条件で滴定した対照実験ではＴｂ３゜の蛍光には何等の増大は認められず、ペプチドのみでは蛍光の変化は生じないことを示している。ペプチド−）ＩＰＣ−４複合体によりＴｂ”の親和性が１７倍増加することは、ＲＰＣ−４の低親和性金属結合部位が高親和性に変化することを示している。

これらの結果はＣａ２＋の抗体−ペプチド複合体に対する結合に関して、Ｈｕ＋ｎｍｅｌ−Ｄｒｅｙｅｒのゲル濾過手法により確認された（虹匹胎にＩ並すｓ、　Ａｃｔ、、　６３巻、　　５３０−５３２頁、　　１９６２年）。　Ｐ（６− １７）、ＮＰＣ−４およびその混合物をカラムにかけ、それらのＣａ２＋に対する結合能を測定した。Ｐ（６−１，７）はＣａ２°と結合しなかったが、ＲＰＣ −４と３．５倍モル過剰のＰ（６−１７）を使用した場合、ＲＰＣ−４１モル当りＣａ２“１．７６モルのＣａ２＋結合量の増加が認められた。Ｍ　ｇ　２＋はＨＰＣ−４／Ｐ　（６−１７）複合体によるＣａ２°結合に対し何等の効果も示さなかった（０．０１ｍＭあるいは０．０２ｍＭ　Ｃａ”でＲＰＣ−４１モル当りＣａ２”がそれぞれ１．４１および１．５２モル）。

本発明には、第１図に示される重鎮の残基６から１７までのアミノ酸配列部分；グルタミン酸−アスパラギン酸−グルタミン−バリン−アスパラギン酸−フロリン−アルギニン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギン酸−クリシン−リジンを少なくとも包含する、抗体ＲＰＣ−４に結合するプロティンＣの活性断片（エピトープ）が含まれる。

上記したように、このペプチドはアフィニティークロマトグラフィーによるＲＰＣ−４の単離と精製に利用され得る。同様に、このペプチドは抗体がクロマトグラフィーの基質に結合する過程で、結合部位を一時的に保護するため、および最大量の結合した抗体が単離すべきタンパク質に結合するために利用可能であることを保証するために使われ得る。ＲＰＣ−４による認識には必要でなく、クロマトグラフィーの基質と反応できるペプチドの反応活性グループ（アミノ末端、リジン側鎖）は、最初に当業者に公知の標準的な方法を用いて無水酢酸とペプチドとの反応でブロックされる。）ＩＰＣ−４が樹脂と結合した後、抗体の抗原結合部位に結合したペプチドは、１．５Ｍグアニジン塩酸塩、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７，５）で洗浄して除かれる。

抗体とペプチドは、プロティンＣおよび抗体の精製・単離に使用する目的で、それぞれアガロース、アクリルアミドおよびその他の一般的なりロマトグラフィー用樹脂、フィルター等を含む様々な基質に結合することができる。この様な材料は、タンパク質を基質に結合する方法と同様、当業者に公知のものである。材料の選択は、多くは精製の規模や分析すべき試料によるが、最終製品が医薬品用途の場合は材料の生物適合性および政府機関の認可にもよる。同様に、診断に使用する場合の抗体を標識する方法と手段も、当業者に公知であり、放射性分子、蛍光分子、燐光分子、あるいは酵素分子等で標識することが包含される。

ム。Ｉを　つ　　　　　を　いる　　の１収本発明のモノクローナル抗体は、抗原結合部位と、少な（とも一つの金属結合部位を持つことが示されている。抗原が高い親和性で結合するためには、イオン結合部位が占有されることが要求される。クローニングとｃＤＮＡ配列から、抗体の金属イオン結合領域のアミノ酸配列、あるいは可変領域の遺伝子が決められる。このｃＤＮＡセグメントは、他のタンパク質、特にいろいろな抗体をコードする遺伝子に挿入され得、それから造られるタンパク質に金属結合能を与える。

これらのキメラ抗体は、それ自体では金属に依存する構造変化を受けない他の分子を単離するのに使用され得る。このことは、穏和な溶離条件を有するモノクローナル抗体を見いだすことはしばしばきわめて難しく、対象とするタンパク質を機能のある形態で溶離することができないので、タンパク質精製に大きな利点をもたらす。その結果、タンパク質精製におけるモノクローナル抗体の潜在能力は充分に実現されていない。抗原そのものが金属に依存する構造変化を受けるという要求よりはむしろ、抗体の金属結合能により、金属に依存して抗原と結合する抗体は、きわめて穏和な条件でのアフィニティークロマトグラフィーに利用され、抗原はキレート剤または金属を含む溶液で溶離される。

ＲＰＣ−４の金属結合領域は、タンパク質限定分解法により抗体の小断片をつ（ることにより決められる。金属イオン結合能のある断片は、Ｔｂ３ゝの蛍光を増大させる能力によって同定することができるが、その理由はこのイオンが、その結合を検出するための抗原が存在しな（ても、抗体との間に充分な親和性を持つからである。抗体の　ＦａｂＳＦａｂ’、Ｐｃ断片は、ペプシンやパパイン消化を用いる標準手法で、当業者によって調製することができる。より小さな断片は、抗体の適当な部分からＣＮＢｒ分解法あるいは以下の文献に記載されているような他のタンパク分解酵素を用いた消化法によって、イオン結合能を有する最小断片まで分解することにより得られる。

すなわち、Ｋｕｒｏｓａｖａ、　Ｓ、、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６３巻、　５９９３−５９９６頁、　　１９８８年；０ｈｌｉｎ、　Ａ−にとＪ、５ｔｅｎｆｌｏ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２６３巻、　７４１１−４７１７頁、　　１９８８年；５ｔｅａｒｎｓ、　Ｄ、　Ｊ、、ら、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｎ、、　　ｒマイクロトロンボモジュリン；トロンボモジニリンの表皮細胞成長因子前駆体相同領域から得られた残基３１０−４８６はプロティンＣ活性化を促進する。　（Ｍｉｃｒｏｔｈｒｏ＋ｏｂｏｍｏｄｕｌｉｎ；　　Ｒｅ５ｉｄｕｅｓ　　３１０−４８６　　ｆｒｏｍ　　ｔｈｅ　　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ　　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ　　ｄｏｍａｉｎ　　ｏｆ　　ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎｔｉｌｌ　　ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ　　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）Ｊ　、出版準備中、１９８９年である。ＲＰＣ−４ｃＤＮＡはクローン化され、当業者に公知の方法で配列決定される。ｃＤＮＡはハイブリドーマ細胞系ＲＰＣ−４（ＡＴＣＣＮｏ、　９８９２）および確立されたラムダｇｔｌ１発現ライブラリー（Ｔ、　Ｖ、　Ｈｕｙｎｈ、　　ら、ｒ　ＤＮＡクローニング：　実際的手法（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｊｎｇ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　）Ｊ　第１巻、Ｄ。

Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒｍ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社、０ｘｆｏｒｄ、　１９８５年、４９−ｙ８ＪＯから調製され得る。ライブラリーはアフィニティー精製されたヤギ抗ＨＰＣ−４抗体を用いてスクリーニングされ得る。ついで適当なりローンを増殖させ、ｅＤＮＡを切断し標準的なりＮＡ配列決定のためＭ１３に挿入する（Ｍ１３クローニングと配列決定ハンドブック（Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｅｉｎｇ　　ｈａｎｄｂｏｏｋ）、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ社：　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、［クローニングのための新しいＭ１３ベクター　（Ｎｅｗ　ＭＩ３　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｅｌｏｎｆｎｇ）、Ｊ　　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ２虹江り匙」固弓ｎａｎｔ　ＤＮＡ　　Ｔｅｅｔ＋ｎｊ　ｕｅｓ、　１０１巻、　ｐａｒｔ　Ｃ＋　２０−７８頁、　　１９８３年）、さらに、抗ＨＰＣ−４と陽性の反応性を示すりロー・ンによって発現した断片も精製され、Ｔｂ”結合能が試験され、それによりＲＰＣ−４分子中の関連のある領域を見つける他の方法を可能にする。ひとたびＨＰＣ−４抗体遺伝子の適切なイオン結合断片に対応するＤＮＡ断片の位置が決められると、ＥｃｏＲｌの様な適当な制限酵素によってこの断片を切り出すことができる。キメラ遺伝子を構築する方法は、例えば以下の文献に開示されている。Ｋｏｂｉｌｋａ、　Ｂ、　Ｋ、ら、「キメラ　α２−９β２−アドレナリンレセプター：エフェクター結合及びリガンド結合特異性に含まれるドメインのデリニエーション（Ｃｈｉｍｅｒｉｃα２−２β２−Ａｄｒｅｎｅｒｇｊｃ　　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：　　Ｄｅｌｉｎｅａｔｆｏｎ　ｏｆ　Ｄｏｍａｉｎｓ　Ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇａｎｄ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｅｔｔｙ）ＪＳｃｉｅｎｃｅ、　２４０巻、　１３１０−１３１６頁、　　１９８８年；　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ、　Ｍ、、Ｃ。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｇ、　１Ｎｎｔｅｒ、　ｒヒト抗体の改造、抗リゾチー・ム活性グラフティング（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ　　ＨｕＩｌａｎ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎ　Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）Ｊ　５ｅｉｅｎｅｅ、　２３９巻、　１５３４−１５３６頁、　１９８８年；　Ｒｉｅｃｈｌｌａｎｎ、　Ｌ、、　Ｍ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｈ，Ｗａｌｄｎ＋ａｎｎ、　　Ｇ。

Ｗｔｎｔｅｒ、　　ｒ治療のためのヒト抗体の改造（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ　ｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｒａｐｙ）Ｊ　　Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、　３２３−３２７頁、１９８８年。対象とするモノクローナル抗体に対する遺伝子を含む標的ＤＮＡは、ｅＤＮＡ断片を挿入するスペースが得られるよう、起源ＤＮＡと同様に制限酵素で処理される。相補的末端を持つリンカ−が挿入部（例えば５ａｉｌ）に連結されて“連結”が行われる。キメラｅＤＮＡは、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、　Ｄ、とＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ、　　「バキｘＣ’ウィルスベクター法マニ６ユアルと昆虫細胞培養法（Ａ　ｍａｎｕａｌｏｆ　　ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　１ｎｓｅｃｔ　ｅｅｌ！ｃｕｌｔｖｒｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ｊ　　（テ碑サス農業実験ステーシコン（ＴｅＸａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　５ｔａｔｉｏｎ）　（１９８７）に記載している手順等により、バキニロウィルス　（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）　等０：）適当な発現ベクターにクローン化される。組み替え遺伝子の発現はこれに記載された方法で行われ得る。目的の生産物のスクリーニングはＥＬＩＳＡ法で行われ、遊離したタンパク質は、標的免疫グロブリンが金属に依存して特異的である抗原を認識する能力によって試験される。抗原の認識に金属イオンの存在が要求されるか否かは、特定の抗原−抗体ベアに依存することが多い。

ＩＴＰｃ−４の金属結合部位がアミノ酸の単一鎖に存在せず、例えば免疫グロブリンの重鎮と軽鎖とがこの部位に寄与している場合、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ、　Ｍ、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８８年；　（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ。

Ｌ９．ら、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８年に述べられている様、上記の手順をそれらの断片に対して繰り返すことが必要になる。本発明は上記に開示された手順において、特定のヌクレアーゼ、ベクターあるいはその発現システムの使用になんら制限されず、ＲＰＣ−４由来の適当なペプチド配列の挿入により、金属に依存して対象とする抗原を結合できる機能性抗体の生産に最終的に至る、上記手法のあらゆる組み合せが包含されることは、当業者に認められるであろう。

酊−４の治　への哺乳類における凝固・抗凝固システムは、血液を好適な流動状態に保つための精巧なチェック・アンド・バランスシステムである。このシステムのどのひとつの要素が変わっても、哺乳類の止血作用を保つ能力に重大な影響を与える。

プロティンＣシステムは、血液凝固を阻害し、血栓溶解を刺激する抗凝固制御システムである。このシステムは、凝固過程でフィブリノーゲンをフィブリンに変換する酵素であるトロンビンによって活性化される。遊離もしくは過剰のトロンビンは、内皮細胞上のタンパク質であるトロンボモジュリンと結合する。トロンビン−トロンボモジュリン複合体はトロンビンの血塊形成を触媒する能力を減少させ、トロンビンを有効なプロティンＣ活性化因子に変える。一方、活性化プロティンＣはプロティンＳおよび細胞膜表面と共同して、限定タンパク質分解により第Ｖａ因子および第■ａ因子を不活性化する。不活性化された第Ｖａ因子は酵素Ｘａ因子または基質であるプロトロンビンと有効に相互作用する能力を失う。

プロティンＣ５トロンボモジュリン、プロティンＳに対する抗体、あるいはプロティンＳに結合してそれを補助因子としては失活させるＣ４ｂ結合タンパク質を、適当な形態で添加することにより、血塊形成を促進することが望ましい個体に対して血塊形成を促進するために使用することができる。Ｆ■阻害因子をもつ患者がこのグループの代表である。第Ｖａ因子の不活性化を阻止することにより、第■因子が相対的に欠損していても凝固は進行する。

これらのプロティンＣ抗凝固システムの阻害剤を投与する効果は、その経路をブロックするために使われた試薬によるが、過剰の活性化プロティンＣまたはプロティンＳを投与することによって逆転し得る。その適量は血液中に存在するタンパク質の相対的なモル童に関する計算に基づく。

過剰凝固性状態をつくりだす、このアプローチの実現性が）ＩＰｃ−４をヒヒに投与することによって実証された（Ｔａｙｌｏｒら。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７９巻、　９１８−９２５頁、　１９１１７年ン。１（ＰＣ−４が存在する場合、動物は低レベルのバクテリア抽出物に対し、全フィブリノーゲンの消費に特徴づけられる塊状凝固応答を示した。抗体が無い場合は、この応答を示さなかった。Ｃ４ｂＢＰのレベルが約工曽ｇ／＋１血しょうまで上昇した場合も、実質的に同じ結果が得られた。これらの応答は動物に有害であるが、いづれの方法も凝固システムを促進することが示される。

これは、正常な止血作用が損なわれた状況下では、有用である。

この方法は例えば、ヘパリンまたは放射線治療で誘起される血小板減少症、緊急事故の後の再出血を極小にする急性の肝臓疾患および出血性打撲などの凝固因子欠損状態の処置に応用することができる。

ＲＰＣ−４はまた、充実性腫瘍床に毛細血管血塊を誘起するのに使用される。イヌの充実性腫瘍モデルで、腫瘍の成長を大きく阻害することが見いだされた。プロティンＣの抗凝固経路をブロックすることのできる、抗体および／あるいは上記試薬と、腫瘍壊死因子または放射線のような現在使用されている処置とを組み合わせることにより、充実性腫瘍のより有効な処置方法が導かれ得る。

これらの試薬の投与に対して、薬学的に受は入れられるキャリアーとしては、生理ｐＨの無菌生理食塩水が挙げられる。

好ましい投与方法では、試薬は患者に注射され、最も好ましくは静脈注射される。好ましい投与量は血しょう１　ｍｌ当りＲＰＣ−４が約５〜約２０μｇであり、これは９０％を上回る内因性プロティンＣをブロックするに充分な量である。

実施例　ｌ：血しょうからプロティンＣの大量迅速単離プロティンＣの迅速単離法を以下に示されるフローダイアグラムに従って実施した。簡単に言えば、プロティンＣおよびその他のビタミンに依存性タンパク質は、０．０２　ＴｒｉＳ塩酸（ｐＨ７，５）、ヘパリン（ＩＵ／ｍｌ最終容量）およびベンズアミジン塩酸（最終容量でＬＯｍＭ）でｌ：１に希釈したヒト血しょう３゜ＬからＱＡＥ　　ｔ７ｙテ”り２　　Ｑ５０　　　（３０ｇ　　を０．１Ｍ　　　ＮａＣ１，０，０２Ｔｒｉｓ　　塩酸、　ｐＨ７，５で膨潤）に室温で１時間、バッチ的に吸着させ、３０〜６０分間静置し、上澄をサイフオン除去した。セファデクスを１０ｘ６０ｃ＋ｍカラムに充填し、ＩＩＬの０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０２ＭＴｒｉｓ塩酸、１０ｄベンズアミジン塩酸塩（ｐＨ７，５）で洗浄後、プロティンＣを０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む同じ緩衝液で溶離した。

集められた溶液の容積は約６００１１１に減少した。この容積にヘハリ７１０Ｕ／ｍｌ、　Ｃａ”　１０＋＊Ｍ、　ＤＦＰ　１＋ａＭおよび約１００ｍ１ノＲＰＣ−４Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０を加えた。この混合液を約１時間攪はん、静置後、２．５ｘ　２０　ｃｔａＯ）カラムニ充填し、１　ｚ（７）０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸、　ＳｓＭのベンズアミジン塩酸塩、　２ｍＭ　　ＣａＣ１２（ｐＨ７，５）で洗浄し、次いで１００　ｍｌの０．１Ｍ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸。

２ｍＭ　ＣａＣ１２（ｐＨ７，５）で洗浄し、Ｃａ２＋の代わりに２ｍＭ　ＥＤＴＡを含む同じ緩衝液で溶離した。

血清アミロイドＰ、すなわち、Ｃａ２ゝの存在でセファデクスに結合するタンパク質による汚染は、ＱＡＥセファデクスＱＳＯイオン交換クロマトグラフィーで除去された。カラム（０，９Ｘ３０　ｃｍ）を０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７，５）中、０．１から０．６Ｍ　ＮａＣ１直線勾配で展開し、プロティンＣをカラムから最後のピークとして溶離した。精製物をＳＤＳゲル電気泳動、プロティンＣ抗体およびプロティンＣ活性分析で確認した。この調製物から、単一鎖および２本鎖プロティンＣが、ヒト血しよう中にある場合とほぼ同じ比率で得られた。

プロティンＣの精製ヘパリン化希釈血しようをＱＡＥセファデクスヘバッチ的に吸着０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液で溶離再カルシウム化およびＩ（ＰＣ−４へツク・ノチ的に吸着Ｃａ２＋を含む緩衝液で洗浄ＥＤＴＡを含む緩衝液で溶離Ｋｏｎｙｎｅ　（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｓ）、　Ｐｒｏｐｌｅｘ　（Ｈｙｌａｎｓ）、　　ＦＥＩＢＡ　（ＩＭＭＵＮＯ，Ａｕ５ｔｒｕａ）等の市販のビタミンに依存住血しようタンパク質濃縮物を血しょうの代わりに使用した場合、濃縮物はプロティンＣのＲＰＣ−４結合に対応できる緩衝液に再構成され（例えば２１Ｍ　ＣａＣｌ２、ヘパリン等の抗凝固剤Ｓ−１００／ｍｌ、アンチトロンビンｍ　（１０−１００μｇ／ｗ＋１）、ペンズアミヂンおよびＤＦＰ等のプロテアーゼ阻害剤各１ｍＭを含むｐＨ６からｐＨ７，５の緩衝液）、バッチまたはカラムでＲＰＣ−４−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０樹脂に直接かけられる。洗浄および溶離条件は、上記と同じである。プロティンＣをＩ（ＰＣ−４樹脂から溶離後、ＱＡＥクロマトグラフィーは、アフィニティー樹脂で処理される原料中に血清アミロイドＰが存在する場合のみ必要である。

遺伝子工学的にヒトプロティンＣを生産する組織培養細胞由来の上澄を血しょうまたはその濃縮物の代わりに使用した場合、試料は２■Ｍ　ＣａＣｌ２およびプロテアーゼ阻害剤を加えるか、濃縮して、先に詳しく述べたプロティンＣのＲＰＣ−４結合に対応できる緩衝液に再分散した後、ＲＰＣ−４アフイニテイー樹脂と直接混合される。上澄液は、先に血しように関して述べた様に、５０％ＮＨ，Ｓ０４沈澱あるいはイオン交換により濃縮され得る。プロティンＣの収率は通常、抗体！＋ｅｇあたりプロティンＣＯ，０４ｖａｇである。

！：　　プロティンＣの臨床分析へのＲＰＣ−４の応用ＨＰＣ−４は、ヒト血しよう中のプロティンＣの分析に使用できる。プロティンＣは固定化ＲＰＣ−４に定量的に吸着され、かつ再現性よく溶出される。得られたプロティンＣはその活性で分析される。このことは、再発性血小板減少症の特定の患者のプロティンＣ欠損および異常プロティンＣ分子を明瞭に示すのに有用である。プロティンＣ抗体を診断の目的に使用した例が以下の文献に記載されている。Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ、　Ｓ、　Ｖ、ら。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１１＠、　４１６−４２５頁、　１９８６年およびＦａｉｎｏｊ。

Ｅ、ら、狸μ世、　７１巻、　９４０−９４６頁、　１９８８年である。

さらに、臨床臼しようサンプル中のプロティンＣに対する抗体のレベルを決めるための酵素結合イムノア・ノセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線イムノアッセイ　（ＲＩＡ）　　等の、臨床検査室での日常の免疫学的分析法を開発する目的で、抗体は工ンザイモビーズ（Ｅｎｚｙ＋＊ｏｂｅａｄｓＳＢｉｏ−Ｒａｄ社）を使用する＋２Ｊ、ビオチン（Ｓｈａｔｔｉｌ、　Ｓ、ら、　Ｂｌｏｏｄ　７０巻、　３０７−３１５頁、　１９８７年）あるいは当業者に公知の適切な標識等のトレーサーで標識される。

しかしながら、抗体を使用する方法に関する記載はすでに公開されているが、本発明のモノクローナル抗体は一般には提供されていないことはｆＪ２ｍされるべきである。

（忙康扶ぐ）／命Ａイ不ンジ良閃吃　　ＴｍＭ）国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体。
２．ヒトプロテインＣの重鎖活性ペプチド領域には結合するが、ウシプロテインＣには結合しない、請求項１に記載の抗体。
３．トロンビン−トロンボモジユリンによるプロテインＣの活性化を阻害する、請求項１に記載の抗体。
４．金属結合部位を含む請求項１に記載の抗体。
５．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９８８年１１月２日付けで寄託され、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９８９２の受託番号を付与された、ハイプリドーマ細胞系ＨＰＣ−４により生産される請求項２に記載の抗体。
６．放射性分子、化学発光分子、蛍光分子、燐光分子および酵素でなる群から選択される標識をさらに含む請求項１に記載の抗体。
７．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９８８年　１１月２日付けで寄託され、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９８９２の受託番号を付与された、ハイプリドーマ細胞系　ＨＰＣ−４。
８．プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の金属結合部位を含むタンパク質。
９．前記金属結合部位が、ＨＰＣ−４の金属結合部位と機能的には同一である、請求項８に記載のタンパク質。
１０．プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の金属結合部位をコードする配列を含む、遺伝子工学によりつくられた核酸配列により発現する請求項９に記載のタンパク質。
１１．グルタミン酸−アスパラギン酸−グルタミン−バリンーアスパラギン酸− プロリン−アルギニン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン− リジンと機能的には同等であるが、同一でないヒトプロテインＣ上のエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の金属結合部位をコードする配列を含む、遺伝子工学によりつくられた核酸配列により発現する請求項１０に記載のタンパク質。
１２．前記抗体がＨＰＣ−４である請求項８に記載のタンパク質。
１３．プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体を提供することを包含するプロテインＣの単離方法。
１４．前記抗体がＨＰＣ−４である請求項１３に記載の方法。
１５．アミノ酸配列：グルタミン酸−アスパラギン酸−グルタミン−バリン−アスパラギン酸−プロリン−アルギニン−ロイシン−イソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−リジン、もしくは免疫学的に同等な配列を含むポリペプチドを提供することを包含する、プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の単離方法。
１６．前記抗体がＨＰＣ−４である請求項１５に記載の方法。
１７．プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の金属結合部位を含心タンパク質を提供することを包含する、タンパク質の単離方法。
１８．前記金属結合部位が、ＨＰＣ−４の金属結合部位と機能的に同一である、請求項１７に記載の方法。
１９．前記タンパク質が、プロテインＣ重鎖の活性ペプチド領域にあるエピトープに対するＣａ２＋依存性モノクローナル抗体の金属結合部位をコードする配列を含む、遺伝子工学により製造された核酸配列により発現する、請求項１７に記載の方法。
２０．前記抗体がＨＰＣ−４である請求項１７に記載の方法。
２１．前記抗体がＨＰＣ−４である請求項１９に記載の方法。
２２．抗体ＨＰＣ−４に結合するプロテインＣの免疫的に活性な断片を含むポリペプチド。
２３．前記免疫的に活性な断片が、グルタミン酸−アスパラギン酸−グルタミン −バリン−アスパラギン酸−プロリン−アルギニン−ロイシン−ソロイシン−アスパラギン酸−グリシン−リジンでなるのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。