JPH03187396A - 抗体，抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はテイッシュプラスミノーゲンアクチベータ（以
下、ＴＰＡと略記することがある）に対するモノクロー
ナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略記することがある）に関
する。

本発明はまた、上記の抗体にＴＰＡを免疫結合させてな
る血栓溶解剤に関する。さらに、上記の抗体を用いてＴ
ＰＡを高感度かつ特異的に測定する免疫化学的測定法に
関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）血栓
溶解療法は古くから心筋梗塞、動脈塞栓症。

脳梗塞などの血栓性疾患の治療法として用いられ、当初
はストレプトキナーゼやウロキナーゼ（以下、ＵＫと略
記することがある）などが有用な血栓溶解剤として臨床
応用された。特にＵＫはフィブリン溶解能が高いことか
ら比較的繁用されてきたが、フィブリンに対する選択性
が低く、フィブリノーゲンに対しても作用し、投与患者
に出血傾向を生ぜしめる欠点を有している。かかる欠点
を踏まえて、次に第２世代の血栓溶解剤としてＴＰＡや
グロウロキナーゼが登場した。これらはＵＫに比べてフ
ィブリン選択性が高いため、ＵＫでみられた出血傾向の
副作用を軽減すると予測され、数多くの研究がなされた
。特に最近では遺伝子組み換え技術を利用することによ
って大量生産の途が開かれたことから、臨床への応用も
盛んである（　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏｏｐｅｒａｔ
ｉｖｅ　　５ｔｕｄｙ　　Ｇｒｏｕｐ　　ｆｏｒＲｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ　　　Ｔｉ５ｓｕｅ−Ｔｙｐｅ　　　
ＰＩａｓａ＋ｉｎｏｇｅｎＡｃＬｉｖａｔｏｒ　：ラン
セット（Ｔｈｅ　　Ｌａｎｃｅｔ　）、８４２（１９８
５））。

しかしこれらの臨床応用の結果、ＴＰＡなどにも幾つか
の問題があることが分かってきた。すなわち、［１］Ｔ
ＰＡの半減期は非常に短かく（２〜３分）、血栓溶解に
は多量のしかも長時間の投与が必要なこと、■かかる大
量療法では必ずしも出血傾向の低減を期待できないこと
などである。

この原因の１つとして、血中にはいくつかのプラスミノ
ーゲンアクチベータインヒビター（以下、ＦＡＩと略記
することがある）が存在しくり、Ｃｏ１１ｅｎニスロン
ポーシス・ヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、５６．４１５（１９８７）
］、特にＦＡＩ−１はＴＰＡやＵＫの投与後、速やかに
これと結合し不活化させることが知られている。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記に示したＦＡ　Ｉ　−１によるＴＰ
Ａの不活化を防ぎ、ＴＰＡの血中動態を改善し、投与量
の軽減を図り、副作用のない血栓溶解剤を開発すること
を目的とした。まずＦＡ　Ｉ　−１によるＴＰＡの不活
化作用について鋭意検討し、ＦＡＩ−１がＴＰＡの活性
部位以外に第２の部位と相互作用する可能性［Ｊ、　Ｃ
ｈｍｉｅｌｅｗｓｋａら、バイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｊ、　）、　２５±。

３２７（１９８８）］を追求した結果、ＴＰＡの線溶活
性には影響を与えずに、ＦＡ　Ｉ　−１とＴＰＡとの結
合を阻害する形でＴＰＡに結合できるＭｏＡｂを作製す
ることに成功した。次にＴＰＡをかかる抗ＴＰＡモノク
ローナル抗体に免疫結合させ、ＰＡｒ−１によるＴＰＡ
の不活化を伴わない、あるいは減少させうる抗ＴＰＡモ
ノクローナル抗体とＴＰＡとの１＝１免疫免疫体を血栓
溶解剤として開発し、さらに研究を進め本発明を完成し
た。

すなわち本発明は、ＴＰＡに対してＦＡ　Ｉ　−１と競
争的に結合し、かつＴＰＡの酵素活性を中和しない抗Ｔ
ＰＡモノクローナル抗体およびこれを産生ずるハイブリ
ドーマを提供するものである。

また本発明は、上記抗ＴＰＡモノクローナル抗体にＴＰ
Ａを免疫結合させてなる血栓溶解剤を提供するものであ
る。

さらに本発明は、該抗ＴＰＡモノクローナル抗体が遊離
のＴＰＡとは結合するが、ＴＰＡ−ＦＡＩ−１複合体と
は結合しない性質を利用して、遊離のＴＰＡのみを高感
度で特異的に検出しうる免疫測定法に関するものである
。

本発明で用いられる抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリドーマの
作製にあたっては、該ハイブリドーマがＴＰＡに特異的
で、実質的にＴＰＡ−ＦＡＩ−１複合体と結合しない、
いいかえればＴＰＡに対してＰＡｒ−１と競争的に結合
するＭｏＡｂであって、なおかつＴＰＡの酵素活性を中
和しないＭｏＡｂを産生ずるものであればいずれのもの
でもよい。このようなハイブリドーマの作製については
、常法に従って作製することができる。すなわち、ＴＰ
Ａを動物（例、ウサギ、ラット、マウス、モルモットな
ど）に免疫し抗体産生細胞を得る。次いで免疫動物より
採取したこれらの抗体産生細胞、例えば脾臓細胞やリン
パ節細胞などを骨髄腫細胞（例、ＭＳ−１，Ｐ３Ｕ１．
５Ｐ２１０など）と融合し、得られるハイブリドーマの
中から実質的にＴＰＡ−ＦＡＴ−１複合体に反応せず、
遊離のＴＰＡに特異的に結合する抗体産生細胞をスクリ
ニングすることによって作製できる。

免疫動物としては、例えばウサギ、ラット、マウス、モ
ルモットなどが用いられるが、ＭｏＡｂ製造の場合には
マウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては、
通常実施される方法に従えばよく、例えばマウスに１回
１−１００μｇ、好ましくは１０〜２５１ｇのＴＰＡを
等容量（０、１ｍ）の生理食塩水およびフロイントの完
全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮下あるいは
腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法がとられる
。

これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓およびあるいはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施で
き、融合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下
、ＰＥＧと略記することがある）やセンダイウィルスな
どが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨
髄腫細胞としてはＭＳ−１，Ｐ３Ｕｌ、５Ｐ２１０など
、特にＰ３Ｕｌが好ましく用いられる。例えば脾臓細胞
と骨髄腫細胞との好ましい比率はｌ：１−１０：１で、
これに分子量１．０００〜ａ、ｏｏｏのＰＥＧが１０〜
８０％の濃度で添加され、２０〜３７℃、好ましくは３
０〜３７℃で３〜ｌＯ分インキュベートするのが良い。

抗ＴＰＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングには種々の方法が使用できる。

例えば、マイクロプレートにＴＰＡあるいはＴＰＡ−Ｆ
ＡＩ−１複合体を吸着させ抗原感作プレートを作製する
。次いでハイブリドーマ培養上清を抗原感作マイクロプ
レートに添加し、プレートに結合した抗ＴＰＡ抗体を検
出する酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略記することが
ある）により培養上清中の抗体価を測定する。ＨＡＴ（
ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）添加培地
で選別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直
ちにクローニングに供されるが、通常これは限界希釈法
などで容易に実施される。クローン化されたハイブリド
ーマ培養上清の抗体価を上記の方法で測定し、ＴＰＡ感
作プレートで陽性、ＴＰＡ−ＦＡＩ−１複合体感作プレ
ートで陰性となる抗体産生ハイブリドーマを選別し、目
的とするモノクローナルな抗ＴＰＡ抗体産生ハイブリド
ーマを取得することができる。

以上のような製造法に従って作製した抗ＴＰＡ抗体産生
ハイブリドーマの例として、後述の実施例１に示したマ
ウスハイブリドーマＴＰＡ　　２１４が挙げられる。

上記した本発明のハイブリドーマの培養は通常、液体培
地中、または動物の腹腔内（例えば、マウス等哺乳動物
の腹腔内）で公知の方法により実施できる。培養液およ
び腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を
組み合わせて用いることによりできる。例えば、細胞培
養液もしくは腹水を遠心分離し、上溝を取り出し、塩析
（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用
いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶
液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィー（イオン
交換カラム、ゲルろ過カラム、プロティンＡカラム、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的とする抗体
を分離精製することができる。以上のような分離精製操
作により、例えばｌＱ培養上清からタンパク重量比で９
０％以上の純度のＭｏＡｂを約５−２０ｍｇ得ることが
できる。

また、２０−の腹水液からは同様の抗体が２０−１００
ｍｇ得られる。

以上のようにして得られる本発明の抗ＴＰＡモノクロー
ナル抗体は、下記の性質を有する。

［１］ＴＰＡに対して、プラスミノーゲンアクチベータ
・インヒビターと競争的に結合する。

［２］ＴＰＡの酵素活性を中和しない。

本発明の抗ＴＰＡモノクローナル抗体としては、例えば
上記の性質を有し、さらにその認識エピトープがＴＰＡ
の第２クリングル（Ｋ２）領域である抗ＴＰＡモノクロ
ーナル抗体などが挙げられ、より具体的には後述の実施
例１に示した抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＴＰＡ２−１
４などが挙げられる。

以上のようにして得られたＭｏＡｂはタンパク質として
均一であり、蛋白分解酵素（ペプシン、パパインなど）
処理などにより、ＴＰＡに対する結合能を保持したまま
、Ｆ（ａｂ’）、やＦａｂ断片などを得ることができ、
これらは本発明のＭｏＡｂと同様の目的で用いることが
できる。

またこれらのハイブリドーマがマウスＩｇＧＭｏＡｂを
産生する場合には、該抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂの抗原認識
部位を含む可変領域あるいは超可変領域をコードするＤ
ＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術［Ｚ、　５ｔｅｐ
ｌｅｖｓｋｉら：プロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）
。

８５．４８５２（１９８８）；Ｌ、　Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら：ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３２．３２３（
１９８８）］を用いてヒト１ｇＧの定常領域あるいは／
および可変領域７レームワークをコードする遺伝子を結
合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製することもでき
る。かかるキメラ抗体はヒトへの投与に際し、抗原性が
小さいか、もしくは無いため有利に用いられる。

本発明のＭｏＡｂを用いる血栓溶解療法においては、い
くつかの方法が用いられる。たとえば、■本発明のＭｏ
Ａｂを予め血栓性疾患患者に投与したのち、ＴＰＡを投
与する。■該ＭｏＡｂとＴＰＡとを同時に血栓性疾患患
者に投与する。あるいは■予め該ＭｏＡｂとＴＰＡとを
反応させ、未反応のＴＰＡを分離後、得られたＭｏＡｂ
−ＴＰＡ免疫複合体を血栓性疾患患者に投与する、など
の方法が挙げられる。ＭｏＡｂあるいはＭｏＡｂ−ＴＰ
Ａ免疫複合体は必要により、例えばメンブレンフィルタ
ーなどによるろ過除菌操作ののちに、それ自体あるいは
適宜の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤な
どと混合し、注射剤などとして製剤化して、哺乳動物（
マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サル、ヒト
など）に投与し、例えば心筋梗塞、末梢動・静脈閉塞症
、網膜動・静脈閉塞症、脳梗塞、肺塞栓症などの血栓・
閉塞性疾患の治療に用いることが可能である。

本発明の血栓溶解剤の投与量は、対象となる疾患、症状
あるいは投与ルートなどによって異なるが、例えば心筋
梗塞の成人患者に静脈内投与する場合、ＭｏＡｂとして
１日当り約０．１−１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．
５−５ｍｇ／ｋｇ、ＴＰＡとして１日当り約０．０２−
１．０＋ｏｇ／ｋｇ、好ましくは約０．Ｏ４−０−４ｍ
ｇ／ｋｇである。

以上のような方法で、生物学的半減期の短いＴＰＡを、
ＰＡＩ−１による不活化から保護し、効率良く血栓部位
に作用させることが可能である。

また該抗ＴＰＡ抗体を産生ずるハイプリドーマを抗フィ
ブリン特異抗体産生ハイブリドーマと融合し、一方の手
でフィブリンに、他方の手でＴＰＡに結合できる二重特
異性抗体を産生するポリドーマを作製することもできる
（特願Ｆ＠６３−２４３５４４号、特願昭６３−３０１
９２５号および特願平１−６２９４０号明細書参照）。

かかるポリドーマにより産生される二重特異性抗体は、
ＴＰＡをＰＡ　ｒ　−１による不活化から保護しつつ、
★）つＭ的フｌプ■ン面鰺採行りご鯨里的ｌごＴＰＡを
運搬し、作用させることが可能である。

本発明の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂはさらに、ＴＰＡ−ＦＡ
　Ｉ　−重複合体と反応することなく、遊離のＴＰＡと
のみ反応することから、ＴＰＡの特異免疫測定法を提供
する。従来は、血中の遊離のＴＰＡを正確に測定する方
法はなく、ＴＰＡやＴＰＡ−ＰＡＩ−重複合体などをす
べて含むトータルのＴＰＡ濃度を測定していた。しかし
ながらＴＰＡ−ＦＡＩ−重複合体は酵素活性を有さす、
またＦＡＩ−１の生理学的意義が明らかになるにつれ、
病態との関連、投与ＴＰＡの血中動態の解析などにおい
て、その分離定量が必要となっているが、正確な定量法
がないのが現状である。本発明のＴＰＡの免疫学的測定
法においては、互いに抗原決定部位を重複しない２種の
抗体を用いる、いわゆるサンドインチ（ＳＷ）法が用い
られる。その測定原理を説明すると下記の如くである。

サンドイッチ法：未知量の抗原を含む被検液に担体上に
保持された過剰量の抗体を加えて反応さ体の一定量を加
えて反応させる（第２反応）。

担体上に保持された標識剤もしくは担体上に保持されな
かった標識剤の活性を測定する。第１反応、第２反応は
同時に行なってもよいし、時間をずらして行なってもよ
い。

このＳＷ法は一般に競合法に比べて、被検液中のＴＰＡ
以外の非特異成分の影響を受けにくく、短時間での測定
が可能である。

本発明では、第１反応で用いる固相抗体と、第２反応で
用いる標識抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２
種の抗ＴＰＡ抗体である。この時、固相抗体もしくは標
識抗体として、本発明のＴＰＡ−ＦＡＩ　−重複合体と
反応しない抗ＴＰＡＭｏＡｂを用いるのが本発明の特徴
である。好ましくは固相抗体として該抗ＴＰＡ　　Ｍｏ
Ａｂが用いられる。

固相抗体の調製には、公知の常套手段を応用し得るが、
タトエば“代ｔＭ”　、８．６９６（１９７１）に記載
されているブロムシアン法、グルタルアルデヒド法など
が挙げられる。また、より簡便でかつ好ましい方法とし
て抗体をマイクロプレートやポリスチレン粒子上に物理
的に吸着させる方法などがある。

第２反応で用いる標識抗体における標識剤としては、放
射性同位元素（以下、Ｒ１と略す）、酵素、酵素基質、
蛍光物質、発光物質、ビオチンなどが挙げられる。これ
ら抗体と標識剤との結合には、公知の常套手段であるク
ロラミンＴ法〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　１９４
．４９５（１９６２））、過ヨウ素酸法〔ジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリ
ー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ２）、２２　、　ｌ　Ｏ８４（１９７
４））、マレイミド法〔ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ２）、７９．２３３（
１９７６））、活性化ビオチン法〔ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（Ｊ、　Ａｍ、　
Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　）。

１００．３５８５（１９７８））などが用いられる。

ＴＰＡのＳＷ法による特異的免疫化学的測定方法を実施
するには、（１）未知量のＴＰＡを含有する被検試料に
、公知の常套手段で物理的もしくは化学的に抗体を結合
させた固相を加えて反応させる（第１反応）。固相を洗
浄したのち、標識剤で標識した抗体の一定量を加えて反
応させる（第２反応）。次に通常、固相をよく洗浄し、
固相上に結合している標識剤の活性を測定する。標識剤
がＲＴである場合、ウェルカウンターもしくは液体シン
チレーションカウンターで測定する。標識剤が酵素であ
る場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で
酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であ
っても、それぞれ公知の方法に従って測定する。上述の
アッセイ方法において、第１反応と第２反応との間にお
ける洗浄を省略してもよいし、さらに簡略化するために
被検法、抗体結合固相および標識剤で標識した抗体を同
時に加えて反応させてもよい。

本発明で用いられた抗体は互いに抗原決定部位が異なっ
ており、しかも一方の抗体はＴＰＡ−ＦＡＩ−重複合体
と反応しないため、被検液中の遊離のＴＰＡのみを特異
的に定量できる。ＴＰＡ−ＦＡ　Ｉ　−重複合体の定量
は、ＴＰＡ−ＦＡＩ−重複合体と反応する抗ＴＰＡ抗体
と、抗ＰＡｌｌ抗体との２種の抗体を用いる、通常のＳ
Ｗ法で、公知技術に従って実施できるので［高田由美子
ら：血液と脈管、第１９巻、４５６頁（１９８８）］、
本発明の遊離ＴＰＡ特異免疫測定法と組合せ用いること
により、遊離ＴＰＡとＴＰＡ−ＰＡＩ−重複合体との分
離定量が迅速かつ正確にできる。

〔実施例〕

以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明する
が、これらが本発明の範囲を制限するものでないことは
言うまでもない。

なお、実施例で用いられている動物細胞は、以下の表に
示すように寄託が行なわれている。

（ｒＦｏ）　　　（ＦＲＩ） マウスハイブリドーマ　　　５０１７８　　　ＢＰ−２
０８５７ＰＡ　１−４１ マウスハイブリドーマ　　　５０１７９　　８Ｐ−２０
８６ＴＰＡＩ−７０ マウスハイブリドーマ ０１９４ ＢＰ−２５１９ ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＦＲＩ：通商産業省微生物工業技術研究所参考例１　抗
ＴＰＡ抗体測定用ＥＩＡ ＴＰＡ　　５℃ｇ／−溶液を９６穴マイクロプレートに
１００μαずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン
、Ｏ，Ｏ１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μＱを添加
して感作プレートを作製した。

上記の液を除去し０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有リン
酸食塩緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｖ）で洗浄後、被検ハイブリ
ドーマ培養上清１００μＱを添加し室温で２時間反応さ
せた。再びＰ　Ｂ　Ｓ　−ＴＶでプレートを十分に洗浄
後、ホースラデイツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、さらに室温で２
時間反応させた。

洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミンおよ
びＨ，Ｏ，を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液を各ウェ
ルに加え、室温で酵素反応を実施した。ＩＮ硫酸で反応
停止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長４
９２ｎｍで発色色素量を測定した。

参考例２　抗ＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体抗体測定用ＥＩ
Ａ ＴＰＡ−ＦＡＩ　−１複合体ｌＯμｇ／−溶液を用いて
、参考例１と同様の方法でＴＰＡ−ＰＡｌ−１複合体感
作グレートを作製した。次いでこの感作プレートを用い
て、参考例１と同じＥＩＡ操作法で抗ＴＰＡ−ＦＡＩ−
１抗体価を測定した。

参考例３　フィブリン溶解反応中和試験ＴＰＡ溶液（最
終濃度２０μｓ／１ｌ１２）に被検ＭｏＡｂ溶液を添加
し、３７℃で１時間反応後、反応混液をフィブリンアガ
ロースプレートのｌウェル当り５μＱ注入した。３７℃
で２−６時間後にフィブリンの溶液環（直径）を測定し
、ＴＰＡの酵素活性に対するＭｏＡｂの中和能を測定し
た。

参考例４　　ＴＰＡ測定用ＥＩＡ 抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＴＰＡ−７０１０℃ｇ／−
溶液を用いて参考例１と同様の方法で抗ＴＰＡ抗体感作
プレートを作製した。次いでこのプレートにＴＰＡ含有
検液１００μＱを添加し、室温で２時間反応させた。Ｐ
ＢＳ−Ｔｗでプレートを十分に洗浄後、ＨＲＰ標識した
ウサギ抗ＴＰＡポリクローナル抗体Ｆａｂ’　フラグメ
ントを添加し、さらに室温で２時間反応させた。以下参
考例ＩＪこ記載の反応でプレートに結合したＨＲＰ酵素
活性を測定し、検液中のＴＰＡを定量した。

参考例５　　ＴＰＡ−抗ＴＰＡ抗体免疫複合測定用ＩＡ 市販のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１　ｇＧ７ラクシヨンｌ
Ｏμｇ／−溶液を参考例１と同様の方法でマイクロプレ
ートに感作した。次いでこのプレートにＴＰＡ−抗ＴＰ
Ａ抗体免疫複合体含有検液１００μａを添加し、室温で
２時間反応させた。以下、参考例４と同様にＨＲＰＩＩ
ｉ識ウサギ抗ＴつＡポリクローナル抗体Ｆａｂ’　フラ
グメントを用いる方法で検液中のＴＰＡ−抗ＴＰＡ抗体
免疫複合体を定量した。

参考例６　マウスＩｇＧ測定用ＥＩＡ 参考例５に記載の抗マウスＩｇＧ抗体感作プレートにマ
ウス抗ＴＰＡモノクローナル抗体含有検液１００μＱを
添加し、室温で２時間反応させた。

ＰＢＳ−Ｔｗでプレートを十分に洗浄後、市販のＨＲＰ
標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、以下参考例４と同様
の方法でプレートに結合したＨＲＰ酵素活性を測定し、
検液中のマウス抗ＴＰＡモノクローナル抗体を定量した
。

参考例７　総ＴＰＡ測定用ＥＩＡ ヤギ抗ＴＰＡポリクローナル抗体５μｇ／ｄｉ溶液を用
いて参考例１と同様の方法で抗ＴＰＡ抗体感作プレート
を作製した。次いでこのプレートにＴＰＡ産生細胞培養
上清を添加し室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗで
プレートを洗浄後、ＨＲＰ標識したウサギ抗ＴＰＡポリ
クローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントを添加し、さらに
室温で２時間反応させた。以下、参考例１に記載の反応
でプレートに結合したＨＲＰ酵素活性を測定し、培養上
溝中の総ＴＰＡを定量した。

参考例８　　ＰＡＩ−１測定用ＥＩＡ 固相抗体としてマウス抗ＦＡＩ−１モノクローナル抗体
を、二次抗体として異なった抗原特異性ヲモつＨＲＰ標
識マウス抗ＦＡ　Ｉ　−１モノクロ一ナル抗体を用いる
サンドイッチ−ＥＩＡ（バイオプール社の市販ＥＩＡキ
ット）により検液中のＰＡｌ−１を定量した。

参考例９　　ＴＰＡ−Ｂ鎖の作製 公知の方法［１、Ｄｏｄｄらニスロンポーシス・アンド
・ヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｈａｅ＋ｍｏｓｔａ
ｓｉｓ　）。

５５．９４　（１９８６）］に従い、二本鎖ＴＰＡを１
０−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下、４℃で２
時間還元した。次いで３ｍＭＤＴＴ含有０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したりジン−セファロー
スカラムに供した。

リジン結合能を有するＴＰＡ−Ａ鎖および未反応二本＠
ＴＰＡはカラムに吸着・結合したが、リジン結合能のな
いＴＰＡ−Ｂ鎖は素通り画分として得られた。

参考例１０　　Ｎ末端欠損ＴＰＡの作製常法の遺伝子組
換え実験により［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：モレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｅＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）参照］、ＴＰＡのＮ末端領
域（フィンガ一部位、上皮細胞成長因子部位および第１
クリングル部位）を欠失し、酵素活性部位を有するＢ鎖
および第２クリングル部位（Ｋ２）のみを有するＴＰＡ
ムティン（Ｋ！　　Ｂ）を作製した［　Ｋ、Ｗｉｋｓｔ
ｒａｍらニスロンボーシス・アンド・ヘモスターシス（
Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、　６２．
　１２２　（１９８９）および６２．３３８　（１９８
９）参照］。

■亀−量 市販の１木調ＴＰＡ（中央科学工業に、に、販売）２０
０μｇ／−生理食塩水溶液に等量の７０インド完全アジ
ユバントを添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ　／　ｃマウス
（早、２０ｐｇ１０．２ｄ／マウス）！：＝腹腔および
背部皮下投与し、２〜３週間隔で追加免疫を実施した。

３回の追加免疫後、１０日で最大の血清抗体価を示した
個体について、ＴＰＡ抗原液（５０μｇ１０．ｌ−生理
食塩水／マウス）を静脈内注射した。

■細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０’個）。次いでマウス骨髄ｍｍ
胞（Ｐ３Ｕ１）２Ｘ１０’個を添加し、ＰＥＧ　　６０
００を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５６　、４９５（１９７５）
）に準じて細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒボキサンチン・アミノプテリ
ンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁
し、ｌＯ日間培養した。以後は、親細胞の選択が終了次
第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に
代え培養を続けた。

■ハイブリドーマの選択およびクローニング融合１０−
２０日後にハイブリドーマの出現を認めたので、ＴＰＡ
結合マイクロプレートを用いる参考例１記載のＥＩＡで
ハイプリドーマ培養上清の抗体価を測定した。特に強い
抗体活性を示したハイブリドーマについては、限界希釈
法によるクローニングに供した。

クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様に参考
例１のＥＩＡのスクリーニングに供し、ＴＰＡ結合能の
強い３種の抗ＴＰＡ抗体産生マウスハイブリドーマＴＰ
Ａ　　１−４１．１−７０および２−１４が得られた。

これらの免疫グロブリンクラス、サブクラスはオフタロ
ニー法による測定で、それぞれＩｇＧ＊ｂ、ＩｇＧ＋お
よびＩｇＧ、であった。

■モノクローナル抗体の作製 予め０．５ｍ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
に５ＸｌＯ’個の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ産生ハイブリド
ーマを腹腔内接種した。約１０−１５日後に腹水の貯溜
が見られた。

抗体の精製は常法により、４５−５０％飽和硫酸アンモ
ニウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースおよびプロティ
ンＡカラムクロマトグラフィーに供し実施し、マウスハ
イプリドーマＴＰＡ、１−４１．７ＰＡ　　ｌ−７０８
よびＴＰＡ　　２−１４からそれぞれ抗ＴＰＡモノクロ
ーナル抗体ＴＰＡ１−４１．ＴＰＡ　　１−７０および
ＴＰＡ　　２１４を得た。

実施例２　抗ＴＰＡモノクローナル抗体のＴＰＡ実施例
１−■で作製した抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂを、参考例３に
記載のフィブリンアガロースプレートを用いるフィブリ
ン溶解反応中和試験に供し、ＴＰＡに対する中和活性を
測定した。結果−は第１表に示した通りであった。

抗体ＴＰＡ　　１−１４は弱い中和活性を、抗体ＴＰＡ
　　１−７０は強い中和活性を示したが、抗体ＴＰＡ　
　２−１４は全く中和活性を示さなかった。

第１表 抗体濃度　　　　　％フィブリン溶解活性（ｎｇ／ｄ）
　　　　抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＴＰＡ　　１−４
１　　　ＴＰＡ　１−７０　　　ＴＰＡ　２−１４０．
０１２　　　　　　８６　　　　　　８６　　　　　　
１０００．１２　　　　　　　６３　　　　　　３０　
　　　　　８６１．２　　　　　　　４７　　　　　　
８　　　　　１００１２　　　　　　　　　４７　　　
　　　０　　　　　　１１６実施例３　抗ＴＰＡモノク
ローナル抗体のＴＰＡ抗ＰＡ　Ｉ　−Ｉ　　ＭｏＡｂ溶
液（５μｇ／−）を用いて、参考例１と同様の方法で抗
ＰＡＩ−ＩＭｏＡｂ感作プレートを作製した。

一方、８Ｍグアニジン−塩酸溶液で３７℃。

３０分間処理して活性化したＦＡＩ−１（アメリカン・
ダイアグノステイクス販売）にＴＰＡを添加しく重量比
ｌ：２）、３７℃、３０分間インキュベートして複合体
を調製した。この複合体液を上記の抗ＰＡＩ　　Ｉ　　
ＭｏＡｂ惑作プレートに添加し室温で３時間反応後、Ｐ
ＢＳ−Ｔｗで洗浄した。

次に実施例１−■で得た抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂを常法に
従い、Ｎ−ヒドロキシスクシミドビオチン（フナコシ薬
品に、に、販売）を用いてビオチニル化し、上記のＴＰ
Ａ−ＦＡＩ−１複合体結合固相グレートに添加した。室
温で２時間反応後、ＰＢＳＴｗで洗浄、ざらにＨＲｐＨ
ｌ［識したアビジンＤを添加して室温で１時間反応させ
た。ＰＢＳ−Ｔｖで十分に洗浄後、参考例１に記載の方
法で固相プレートに結合したＨＲＰ活性を測定した。結
果は第１図に示した通りであった。

ＴＰＡ　　２−１４抗体はＴＰＡ　　１−４１および１
−７０抗体と異なり、ＦＡＩ−１と複合体を形成したＴ
ＰＡには反応しなかった。

実施例１−■で得た抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ溶液（５μｇ
／ｄ）を用いて、参考例１と同様の方法で抗ＴＰＡ　　
ＭｏＡｂ感作プレートを作製した。

ついで０．２５℃ｇ／−のＴＰＡに異なる量のＦＡＩ−
１を加え室温で２０分間反応させたのち、上記の抗ＴＰ
Ａ　　ＭｏＡｂ感作プレートに添加した。

室温で３時間反応後プレートを洗浄し、さらにＨＲＰ標
識したウサギ抗ＴＰＡポリクローナル抗体を添加した。

室温で２時間反応後ＰＢＳ−Ｔｗでプレートを十分に洗
浄し、参考例１に記載の方法でプレートに結合したＨＲ
Ｐ活性を測定した。

結果は第２表に示した通りであった。

ＴＰＡ　　１−４１．１−７０あるいは２−１４抗体の
中、ＴＰＡ みがＴＰＡ−ＰＡ 固定しなかった。

第２表 ＦＡ　Ｉ　−１ 濃度 （μｇ／−） ０．３ ＴＰＡ　１−４１　　　ＴＰＡ　１−７０　　　ＴＰＡ
　２−１４１４抗体感作プレートの ■ ｌを複合体固相プレートに ％固相結合ＴＰＡ 抗ＴＰΔモノクローナル抗体 響 ＴＰＡを予め抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂと３７℃、１時間反
応後、ＴＰＡの２倍量のＦＡＩ−１を加えて、さらに室
温で２０分間反応させた。この混合液を、参考例３に記
載のフィブリンアガロースプレートを用いるフィブリン
溶解能試験に供し、残存するＴＰＡのフィブリン溶解能
を測定した。結果は第３表に示した通りであった。

ＴＰＡ　　ｌ−４１８よび１−７０抗体はそれ自体ＴＰ
Ａの中和活性を有しており、抗体非添加時（コントロー
ル、ＦＡＩ−１による不活化のみ）よりもさらにＴＰＡ
活性を減少させたが、ＴＰＡ２−１４抗体は明らかにＦ
ＡＩ−１による不活化をブロックし、コントロールの２
倍以上のフィブリン溶解能を示した。

第３表 抗ＴＰＡモノクローナル　　　　％フィブリン溶解能　
　　ｌ−４１ ＴＰＡ　　　１−７０ ＴＰＡ　　　２−１４ ００ ６ １ ４４ ■ 実施例４で作製した抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ　　ＴＰＡ２
−１４感作プレートに遊離のＴＰＡあるいは実施例３で
作製したＴＰＡ−ＦＡＩ−１複合体を添加し室温で３時
間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗで洗浄後、Ｎ−ヒドロキシ
スクシミドビオチンで標識化した抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ
　　ＴＰＡ　　１−７０を加えて室温で２時間反応、さ
らにＰＢＳ−Ｔｗで洗浄し、ＨＲＰ標識アビジンＤを添
加した。室温で１時間反応後ＰＢＳ−Ｔｗで十分にプレ
ートを洗浄し、ついで参考例１に記載の方法でプレート
に結合したＨＲＰ活性を測定した。結果は第２図に示し
た通りであった。

遊離のＴＰＡ（−〇−）のみが測定可能で、最小検出感
度は０．５部ｇ／ｍｇ以下であった。なおＴＰＡ−ＦＡ
Ｉ−１複合体（−・−）の交差反応性は約６％以下であ
った。

５０ｎｇ／−のＴＰＡに００−６０ｎ／−の異なった量
のＦＡ　Ｉ　−１を添加し室温で２０分間反応させたの
ち、これらの混液を実施例６記載のＥＩＡおよび参考例
３記載のフィブリン溶解能試験に供し、両法で得られた
ＴＰＡ量を比較した。

得られ た結果は第３図に示した通りであった。

両法で得られたＴＰＡ濃度は良好な相関を示し、本発明
のＥＩＡがフィブリン溶解能活性を反映していることが
明らかとなった。

聾 ＴＰＡ（ローロ：　０．１５ｍｇ／ｋｇ、　　ｎ　−３
）およびＴＰＡ−抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＴＰＡ２
１４免疫複合体（−一■：　ＴＰＡＯ，１５ｍｇ／ｋｇ
。

抗体０．６９ａ＋ｇ／ｋｇ、　ｎ　−４）をウサギに静
脈投与し、経時的に採血した。次いでウサギの血漿中の
ＴＰＡ、ＴＰＡ−抗体免疫複合体および抗体濃度をそれ
ぞれ参考例４．５および６に記載のＥＩＡで測定した。

結果は第４．５および６図に示した通りであった。

ＴＰＡは単独で投与するより、ＴＰＡ２−１４抗体と同
時投与することにより２〜４倍の高い血漿中濃度を保持
した（第４図参照）。また血漿中でＴＰＡは、はぼ全量
がＴＰＡ２−１４抗体との免疫複合体として存在した（
第４図および第５図参照）。ざらにＴＰＡ２−１４抗体
は血漿中で高い持続性を有していた（第６図参照）。

実施例Ｑ　　ＴＰＡ産生細胞培養上清中のＴＰＡ量ヒト
さい帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ，ヒト繊維芽細胞Ｗｌ−
３８およびＩＭＲ−９０，ヒトメラノーマ細胞Ｇ−３６
１をウシ胎児血清含有培地で培養し、その上清を実施例
６記載の遊離ＴＰＡ−ＥＩＡ、参考例７記載の総ＴＰＡ
−Ｅ　ＩＡおよび参考例８記載のＦＡＩ−１−ＥＩＡに
供した。結果は第４表に示した通りであった。

第４表の結果から、各種ヒトＴＰＡ産生細胞は同時にＦ
ＡＩ−１をも産生し、ＴＰＡ抗原のほとんど、あるいは
その１部がＴＰＡ−ＦＡＩ−１複合体として存在するこ
とが明らかである。

第４表 ＨＵＶＥＣ１，２４２，９６７４４ Ｗｌ−３８１１，０３３，７６８１ １ＭＲ−９００，５１６，４１２４６ ｃｍ３６１　　７．９　　　　　８８．３　　　　　　
０．５実施例４で作製した抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂ感作プ
レートに、参考例９および１０でそれぞれ取得しｆ：、
　Ｔ　Ｐ　Ａ　−Ｂ鎖およびＮ末端欠損ＴＰＡムティン
（Ｋ！−Ｂ）を添加し、室温で２時間反応させた。

洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ・ポリクローナル抗ＴＰＡ抗
体Ｆａｂ’フラグメントを添加してさらに室温で２時間
反応させた。参考例１記載の方法に従い、プレートに結
合した酵素活性を定量し、抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂの抗原
特異性を測定した。

結果は第５表に示した誦りであった。いずれの抗体もＮ
末端欠損ＴＰＡムティン（Ｋｔ−Ｂ）と反応するが、Ｔ
ＰＡ−Ｂ鎖と反応するのはＴＰＡｌ−７０ＭｏＡｂのみ
であった。以上の事から、ＴＰＡ　　１−４１　　Ｍｏ
ＡｂおよびＴＰＡ　２−１４ＭｏＡｂは共にその認識エ
ピトープが第２クリングル（Ｋ２）領域にあり、ＴＰＡ
　　ｌ−７０Ｍ　ｏ　Ａ　ｂは酵素活性を担うＴＰＡ−
Ｂ鎖にあることが判明した。

第５表 ＴＰＡ　　ｌ　　４１　　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　Ｋ！ＴＰＡＩ−７０＋　　　　　　　　　十　
　　　　Ｂ鎖（発明の効果） 本発明の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂはＴＰＡのフィブリン溶
解能を損なうことなくＴＰＡと結合し、しかもＦＡ　Ｉ
　−１によるＴＰＡの活性の阻害作用をブロックする効
果を有するので、ＴＰＡと併用することにより効率的で
かつ副作用の少ない血栓の溶解・除去が可能である。

また本発明の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂはＴＰＡ−ＰＡＩ−
１複合体と結合しないことから、体液中の遊離のＴＰＡ
のみを特異的に検出する免疫測定法に応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１記載の抗Ｔ　Ｐ　Ａ　　ＭｏＡｂＴＰ
Ａ　　１−４１．１−７０および２−１４のＴＰＡ−Ｐ
Ａｆ−１複合体に対する結合曲線を表わす（実施例３参
照）。 第２図は実施例１記載の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂＴＰＡ　
　２−１４を同相抗体として用いるＥＩＡで作製した遊
離ＴＰＡおよびＴＰＡ−ＰＡＩ−１複合体の検量線を表
わす（実施例６参照）。 第３図は実施例１記載の抗ＴＰＡ　　ＭｏＡｂＴＰＡ　
　２−１４を固相抗体として用いるＥＩＡを参考例３記
載のフィブリン溶解能試験と比較したもので、両法で得
られた活性ＴＰＡ量が良く相関していることを表わす（
！ｌ！施例７参照）。 第４図はウサギにおける静注試験においてＴＰＡ単剤と
ＴＰＡ−抗ＴＰＡ抗体免疫複合体とを比較したもので、
免疫複合体を投与した場合、より高い血漿中ＴＰＡ濃度
が保たれることを表す（実施例８参照）。 第５図はＴＰＡ−抗ＴＰＡ抗体免疫複合体をウサギに静
注した時の複合体の血漿中濃度を表す（実施例８参照）
。 第６図はＴＰＡ−抗ＴＰＡ抗体免疫複合体をウサギに静
注した時の抗体の血漿中濃度を表す（実施例８参照）。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の性質を有する抗ＴＰＡ（テイッシュプラス
   ミノーゲンアクチベータ）モノクローナル抗体。 ［１］ＴＰＡに対して、プラスミノーゲンアクチベータ
   インヒビターと競争的に結合する。 ［２］ＴＰＡの酵素活性を中和しない。
2. （２）認識エピトープがＴＰＡの第２クリングル（Ｋ＿
   ２）領域である請求項１記載の抗体。
3. （３）抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＴＰＡ２−１４。
4. （４）ＴＰＡで免疫した動物の脾臓細胞もしくはリンパ
   節細胞と骨髄腫細胞とを融合することによって得られ、
   かつ請求項１記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
5. （５）マウスハイブリドーマＴＰＡ２−１４。
6. （６）請求項１記載の抗体に、ＴＰＡを免疫結合させて
   なる血栓溶解剤。
7. （７）被検液と担体上に保持された抗ＴＰＡ抗体とを反
   応させ、さらに標識剤で標識された抗ＴＰＡ抗体とを反
   応させたのち、担体上に保持された標識剤または担体上
   に保持されなかった標識剤の活性を測定する、被検液中
   のＴＰＡの免疫化学的測定法であって、担体上に保持さ
   れる抗体と標識剤で標識される抗体とが互いに抗原決定
   部位を重複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方
   が請求項１記載の抗体であることを特徴とする、ＴＰＡ
   の免疫化学的測定法。