JPH10179159A - モノクローナル抗体、免疫吸着剤としての使用およびヒトプラスミノーゲンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトプラスミノーゲンの免疫吸着体として使
用し得る抗ヒトプラスミノーゲンモノクローナル抗体、
およびそれを用いる、高純度、高回収率でかつ簡便にヒ
トプラスミノーゲンを製造する方法の提供。 【解決手段】ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１＋
Ｋ２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつε−アミノカプロン
酸によって競合阻害を受ける、ヒトプラスミノーゲンに
対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の、
ヒト血漿からのヒトプラスミノーゲンの製造における免
疫吸着剤としての使用、および該モノクローナル抗体と
ヒト血漿とを接触させてヒトプラスミノーゲンを吸着さ
せ、ついで洗浄後、ＥＡＣＥ含有緩衝液で脱着すること
を特徴とするヒトプラスミノーゲンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒトプラスミノーゲ
ンを抗原として作製されたハイブリドーマの産生するモ
ノクローナル抗体、ヒトプラスミノーゲンの製造におけ
る該モノクローナル抗体の使用、およびヒトプラスミノ
ーゲンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プラスミノーゲンは肝臓で生産され、ヒ
ト血漿中には１０〜１７ｍｇ／ｄｌ、すなわち１．２〜
２μＭ含まれ、７９１個のアミノ酸からなる一本鎖糖蛋
白質で糖含量は約２％と報告されている。プラスミノー
ゲンにはＮ−末端にグルタミン酸をもつＧｌｕ−プラス
ミノーゲン（Ｇｌｕ−Ｐｇ）とＮ−末端にリジンをもつ
Ｌｙｓ−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−Ｐｇ）があるが、
前者は天然のプラスミノーゲンで、後者は、活性化の過
程でＮ−末端のペプチドがプラスミンにより切り出され
た中間的産物である。詳細には、Ｇｌｕ−プラスミノー
ゲンのＮ−末端から７６番目のＬｙｓと７７番目のＬｙ
ｓの結合箇所が、プラスミンによって切断される。１〜
７６番目のペプチドが遊離され、７７番目以降のものが
Ｌｙｓ−プラスミノーゲンである。一方、プラスミノー
ゲンは、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−Ｐ
Ａ）あるいはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（ｕ−ＰＡ）などのアクチベータにより、Ｇｌｕ−
プラスミノーゲンのアミノ酸配列番号として５６０番目
のＡｒｇと５６１番目のＶａｌの結合箇所が限定分解を
受け、２本鎖のプラスミンになる。

【０００３】このプラスミンのＮ−末端側をＨ鎖、Ｃ−
末端側をＬ鎖と呼び、Ｈ鎖にそれぞれが３５％近いホモ
ロジーを有し、３個のＳ−Ｓ結合で結ばれた５つの繰り
返し構造（クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）構造、Ｋ１、
Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５）が存在する（Ｗｉｒｎ，Ｅ．
Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
４，５７９〜５８６，１９８０）。このクリングル構造
はプラスミノーゲン（Ｇｌｕ−ＰｇおよびＬｙｓ−Ｐ
ｇ）にも存在する。Ｋ１〜Ｋ４には、リジンセファロー
スなどに強い親和性のあるリジン結合部位（ＬＢＳ）が
あり、フィブリンの特定のリジン残基、プラスミノーゲ
ンの活性化に伴い遊離されるペプチド、あるいはα２−
プラスミンインヒビターなどと結合する（Ｍｏｒｉ，
Ｍ．ａｎｄＡｏｋｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５１，５９５６〜５９６５，１９７６）。

【０００４】プラスミノーゲンはウォーレンとウィーマ
ンの方法（Ｗａｌｌｅｎ ＆ Ｗｉｍａｎ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２５７，１２２−１
３４，１９７２）に従い、リジンーセファロースカラム
クロマトとイオン交換カラムクロマトによりヒト血漿中
から分離精製されている。抗線溶薬のε−アミノカプロ
ン酸（ＥＡＣＡ）はリジンと類似した構造をもち、プラ
スミノーゲンのＬＢＳに結合してその分子構造を変化さ
せ、プラスミノーゲンのフィブリンへの結合およびα２
−プラスミンインヒビターへの結合を阻止する（Ｍａｒ
ｋｕｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５３，７２７〜７３２，１９７８）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ヒト血漿を上
記分離精製法で処理すると、リジンーセファロースとプ
ラスミノーゲンとの特異的結合が充分でなく、高純度の
プラスミノーゲンを取得することは困難であり、加えて
工程が長く回収率も満足のいくものではなかった。そこ
で、高純度のプラスミノーゲンを簡便に高回収率で取得
する特異的製造方法の開発が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かかる課題は、ヒトプラ
スミノーゲンのクリングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメインを
認識し、かつε−アミノカプロン酸によって競合阻害を
受ける、ヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル
抗体、該モノクローナル抗体の、ヒト血漿からのヒトプ
ラスミノーゲンの製造における免疫吸着剤としての使
用、および固相化した該モノクローナル抗体とヒト血漿
とを接触させてヒトプラスミノーゲンを吸着させ、つい
で洗浄後、ＥＡＣＡ含有緩衝液で脱着することを特徴と
するヒトプラスミノーゲンの製造方法によって解決され
た。上記モノクローナル抗体としては、それへのヒトプ
ラスミノーゲンの結合が、５ｍＭのε−アミノカプロン
酸の存在下で、５０％以上阻害されるものが好適に使用
される。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４
９７，１９７５）によって産生することができる。すな
わち、ヒトプラスミノーゲンで免疫した動物の脾細胞と
骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ細胞」という）とを細
胞融合させ、得られたハイブリドーマからヒトプラスミ
ノーゲンに対して特異的な抗ヒトプラスミノーゲンモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選
ばれたハイブリドーマからヒトプラスミノーゲンのクリ
ングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつＥＡＣ
Ａによって競合阻害を受ける抗ヒトプラスミノーゲンモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、
このハイブリドーマを大量培養あるいは動物の腹腔内で
増殖させ、この培養液あるいは腹水から該モノクローナ
ル抗体を分離することにより製造することができる。

【０００８】以下、本発明のモノクローナル抗体を得る
ための方法について詳細に説明する。 （１）抗原と免疫工程 抗原ヒトプラスミノーゲンはウオーレンとウイーマンの
方法（文献名：前出）に従い、リジンセファロースカラ
ムクロマトグラフィーとイオン交換カラムクロマトグラ
フィーにより、ヒト血漿中から分離精製される。ただ
し、抗原は必ずしも精製標品である必要はない。上記の
ようにして得られるヒトプラスミノーゲンは通常ヒトー
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンである。ヒトーＬｙｓ−プラ
スミノーゲンを得るには、ヒトーＧｌｕ−プラスミノー
ゲンをプラスミンと混合すればよい。なお、ヒト−Ｇｌ
ｕ−プラスミノーゲンもヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲ
ンも市販品（例えばアメリカンダイアグノスティカ社
製）があり、抗原として用いることができる。上記から
明らかなように抗原ヒトプラスミノーゲンはヒトーＧｌ
ｕ−プラスミノーゲンであってもヒトーＬｙｓ−プラス
ミノーゲンであってもそれらの任意割合の混合物であつ
ても良い。免疫される哺乳動物は、細胞融合しようとす
るミエローマ細胞株との組み合わせを配慮して、一般に
は、マウス、ラット等が好ましい。

【０００９】抗原は、哺乳動物の皮下、皮内、腹腔ある
いは静脈等に注射等により投与することができる。具体
的には、ヒトプラスミノーゲンをリン酸塩緩衝液や生理
食塩水等で適当な濃度に希釈し、これに通常はアジュバ
ントを混合し、１〜３週間毎に数回投与する。投与量
は、毎回１匹当たり、ヒトプラスミノーゲンとして、１
〜２００μｇ程度とすることが好ましい。また、最終投
与は、融合に使用する３〜５日前に、アジュバントを用
いない静脈注射による投与とすることが好ましい。最終
免疫の数日後に脾臓細胞を取り出す。

【００１０】（２）細胞融合工程 この工程においては、免疫した動物の脾臓から取り出し
た抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、融合細
胞を生じさせる。上記の脾細胞と融合させるミエローマ
細胞としては、公知の細胞株、例えば、マウスでは、
「ＮＳ−１／１−Ａｇ−１」（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ６，５１１〜５１９（１９７６））、「ＳＰ
−２／Ｏ−Ａｇ１４」（Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９
〜２７０（１９７８））、「ＦＯ」（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５，１〜２１（１９８
０））、「Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１」（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１，１〜７（１９７
８））等、ラットでは、「ＹＢ２／０」（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１））等のミ
エローマ細胞を使用できる。細胞混合比は、脾細胞：ミ
エローマ細胞＝３〜２０：１、好ましくは５〜１０：１
で行うのが適している。

【００１１】融合の際には、通常、融合促進剤としてポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等
が使用され、また同じ目的でさらにジメチルスルホキシ
ド等を適宜添加することもできる。このＰＥＧの分子量
は、通常、１０００〜６０００位のものが好ましい。融
合時の培地としては、牛胎児血清（ＦＣＳ）等を含有し
ない、ミエローマ細胞の増殖に使用されるＭＥＭ（Ｅａ
ｇｌｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍ
ｅｄｉｕｍ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌ
ｌ ＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ´
ｓ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０）培地等が用いられる。融
合操作は、上記した混合比による脾細胞とミエローマ細
胞の所定量と、例えば３７℃に温めておいた、３０〜５
０％（ｗ／ｖ）程度のＰＥＧを含有する、血清無添加の
培地とを混合し、数分間攪拌することにより行う。

【００１２】（３）ハイブリドーマの選択 上記操作で得られた細胞を、例えば数枚の９６穴マイク
ロプレートに分注し、ＨＡＴ培地（例えば、ＭＥＭ培地
あるいはＲＰＭＩ−１６４０培地に、ヒポキサンチン１
００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μ
ＭおよびＦＣＳ約１５％（ｖ／ｖ）となるように含有さ
せた培地）で培養することにより融合細胞を選択し、さ
らにそれらの培養上清から、ヒトプラスミノーゲンを固
相化したマイクロプレートによるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａ
ｓｓａｙ）により、ヒトプラスミノーゲンに特異的な抗
体を産生する細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニング
することができる。

【００１３】（４）クローニング 前記ハイブリドーマを限界希釈法または寒天法（例え
ば、９６穴マイクロプレートまたは寒天入りシャーレで
希釈して培養し、陽性のものを選ぶ）等に付して、モノ
クローンのハイブリドーマを取得することができる。こ
こで取得したハイブリドーマの培養上清を用いて、ヒト
プラスミノーゲンをエラスターゼ処理して得られる、ク
リングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、クリングルＫ４お
よびそれ以外のｍｉｎｉ−Ｐｇ（クリングルＫ５ドメイ
ンを含有する）についてもアッセイを行い、培養上清中
の抗体の認識部位を確認することができる。また、これ
らのイムノグロブリンのタイプを、市販のアイソタイピ
ングキットを用いて、決定することができる。

【００１４】（５）モノクローナル抗体の調製 上記のようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを動
物の腹腔内に接種し、約１０〜１５日後に腹水を採取
し、その上清から、あるいはこのハイブリドーマを適当
な培地で培養し、その培養上清から、本発明のモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。この際、必要に応
じて、モノクローナル抗体を塩析、アフィニティカラ
ム、ゲル濾過等により精製してもよい。

【００１５】このようにして得られた、ヒトプラスミノ
ーゲン（ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよびヒトー
Ｌｙｓ−プラスミノーゲン）のクリングルＫ１＋Ｋ２＋
Ｋ３ドメインを認識する、ヒトプラスミノーゲンに対す
るモノクローナル抗体中に、後述の実施例に示すごと
く、これらのヒトプラスミノーゲンへの結合がＥＡＣＡ
によって競合阻害を受けるモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ
５が見出された。上述のごとく、本発明のモノクローナ
ル抗体は、ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１＋Ｋ
２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつε−アミノカプロン酸
によって競合阻害を受けるという性質を必須要件として
有するが、好ましくはさらに該モノクローナル抗体への
ヒトプラスミノーゲンの結合が、５ｍＭのＥＡＣＡの存
在下で、５０％以上阻害されるものであることが好まし
い。

【００１６】本発明のモノクローナル抗体の上記性質を
利用して、これをヒト血漿からのプラスミノーゲンの製
造における免疫吸着剤として使用することができる。す
なわち、本発明のモノクローナル抗体を固相化し、これ
にヒト血漿からのプラスミノーゲンを吸着させ、ついで
洗浄後、ＥＡＣＡにて脱着させることによりヒトプラス
ミノーゲンを製造することができる。

【００１７】本発明のモノクローナル抗体の固相化は、
公知の手法にしたがって、例えばデキストランゲル、ア
ガロースゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に担体結
合法、架橋法、包括法等により固定化することにより行
うことができる。固定化後、通常、非特異的結合を防止
するためブロッキングを行う。具体例を実施例５に示
す。得られる免疫吸着剤としての固相化抗体は通常緩衝
液に懸濁させ、カラムに充填し、緩衝液で平衡化する。
懸濁に使用する緩衝液としてはヒト血漿と同程度のｐＨ
（例えばｐＨ６．０〜８．０）を示す緩衝液であれば良
く、例えばリン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド
緩衝液等が挙げられる。平衡化に使用する緩衝液として
は、懸濁に使用する緩衝液と同様のものを挙げることが
でき、通常懸濁に使用したものと同じものを使用する
が、異なっていても良い。

【００１８】ヒトプラスミノーゲン原料としてのヒト血
漿については特に制限はなく、例えば健常人の血漿を用
いれば良い。ヒト血漿が新鮮血漿であればそのまま、上
記で調製したカラムに充填した固相化抗体に通液して良
いが、通常血漿は凍結して保存するため、融解後、高分
子の不純物が発生する（血漿では、血液凝固因子、例え
はフィブリノーゲンが含まれていて、これが凝集を起こ
す）。したがって、これを取り除くため、通常ヒト血漿
を分子ふるい、例えばセファロース４Ｂ等の分子ふるい
にかける。ついで、通過液を固相化抗体カラムに通液す
る。固相化抗体に対するヒト血漿の使用量は、特に制限
ないが、通常抗体に対するヒトプラスミノーゲン量とし
て過剰に使用し、例えば本発明のモノクローナル抗体１
ｍｇ当り０．５〜５ｍｌが適当である。ついでカラムを
緩衝液で十分洗浄する。この緩衝液としては、前記懸
濁、平衡化に使用する緩衝液と同様のものを挙げること
ができ、通常懸濁、平衡化に使用したものと同じものを
使用するが、異なっていても良い。

【００１９】ついでＥＡＣＡ含有緩衝液でヒトプラスミ
ノーゲンを溶出する。この緩衝液としては、前記懸濁、
平衡化に使用する緩衝液と同様のものを挙げることがで
き、通常懸濁、平衡化に使用したものと同じものを使用
するが、異なっていても良い。この緩衝液中におけるＥ
ＡＣＡ濃度としては０．００３〜０．０５Ｍが適当であ
る。ＥＡＣＡ含有緩衝液の使用量は溶出液中の蛋白量を
チェックすることによって定めることができる。得られ
るヒトプラスミノーゲンはＥＡＣＡと結合している。使
用目的によってはそのまま用いることもできるが、ＥＡ
ＣＡを外す必要がある場合には、溶出液を緩衝液に対し
て透析すれば良い。この緩衝液としては、前記懸濁、平
衡化に使用する緩衝液と同様のものを挙げることができ
る。以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものではない。

【００２０】

【実施例】

実施例１ （モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製） （１）抗原ヒトプラスミノーゲンの取得 抗原ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンはウオーレンとウ
イーマンの方法（文献名：前出）にしたがって分離、精
製した。すなわち、１００ｍｌのヒト血漿（健常人）
を、トリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、ｐＨ７．
４緩衝液（以下、「ＴＢＳ」という）で平衡化したセフ
ァロース４Ｂカラム（５ｍｌベッド容）に通し、通過し
たヒト血漿をリジンーセファロースカラム（３０ｍｌベ
ッド容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．
０２５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒト−Ｇｌｕ−プラス
ミノーゲンを溶出させ、イオン交換クロマト法（ＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラム）で精製して、ヒト−Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲン８ｍｇを得た。

【００２１】（２）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製 上記（１）で得たヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン１０
０μｇとフロイント完全アジュバント等容量との混合物
をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）１匹、１回当たりの投与量と
し、これを２週間毎に計３回背部に皮下注射した。抗体
価の上昇を、抗原ヒトプラスミノーゲンを固相化したプ
レートを用いて、免疫マウス血清のＥＬＩＳＡにより確
認した。皮下免疫終了後、最終免疫として、生理食塩水
に溶解したヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン５０μｇを
尾静脈に投与し、免疫感作脾細胞を作製した。３日後に
脾臓を取り出し、２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭ
ＥＭ培地にほぐして懸濁し、洗浄した。

【００２２】一方、細胞融合に供するミエローマ細胞と
してマウスミエローマ細胞株ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４を
使用し、これを２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭＥ
Ｍ培地中で増殖させた。得られた２種類の細胞を次の要
領で融合した。すなわち、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレ
ングリコール（分子量１５４０）と１２．５％（ｖ／
ｖ）ジメチルスルホキシドとを含有するＤＭＥＭ培地
０．５ｍｌ中で、遠心分離で集めた上記脾細胞２×１０
個と、遠心分離で集めた対数増殖期にある上記ミエロー
マ細胞４×１０ 個とを混合して細胞融合を行った。細胞
融合の温度は３７℃近傍で時間は４分であった。

【００２３】融合された細胞から融合用培地を除去後、
９６穴マイクロプレート４枚に分注して、ハイブリドー
マの選択培養を行った。すなわち、融合細胞を各２％
（ｗ／ｖ）のヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジンを添加した２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭ
ＥＭ培地で培養した。１〜３日間隔で培地交換を行い、
２週間でハイブリドーマのコロニーの形成を認めた。培
養上清を、ヒトプラスミノーゲン５μｇ／ｍｌ濃度で固
相化したプレートにおけるＥＬＩＳＡ（第二抗体として
パーオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社
製）を使用）によって検査し、ヒトプラスミノーゲンに
強い反応性を示すコロニー６個を選択した。こうして得
られたコロニーを拡大培養した後、プレートのウェル１
穴当たり細胞が１個となるようＤＭＥＭ培地で限界希釈
を行った。２週間後、コロニーの形成を確認し、再びＥ
ＬＩＳＡにより、培養上清に産生された抗体のヒトプラ
スミノーゲンに対する反応性を確認した。さらに、ハイ
ブリドーマの限界希釈によるクローニングをもう一度行
うことにより得られるハイブリドーマを単一のハイブリ
ドーマ株であるとみなし、また産生した抗体のアイソタ
イピングを行った。その結果を表１に示す。

【００２４】

【表１】 表１ 産生抗体のアイソタイピング

【００２５】実施例２ （モノクローナル抗体の反応性）実施例１で得られたハ
イブリドーマ株のそれぞれをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の
腹腔内に接種し、１２日後に腹水を採取し、遠心分離
し、上清をアフィニティクロマトグラフィー（Ｍａｂ・
ＴｒａｐＧ、ファルマシア社製）にて精製し、モノクロ
ーナル抗体を得た。得られた各モノクローナル抗体を用
いてＥＬＩＳＡを行った。すなわち、ヒト−Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲンを５μｇ／ｍｌ濃度、５０μｌ／ウェル
で固相化したプレートに、ヒトプラスミノーゲンのリジ
ン結合部位ＬＢＳＩ（Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン：ＳＩ
ＧＭＡ社製）、ＬＢＳＩＩ（Ｋ４ドメイン：ＳＩＧＭＡ
社製）またはｍｉｎｉ−Ｐｇ（Ｋ１〜Ｋ４ドメインを含
まず、Ｋ５ドメインとＬ鎖の一部を含むヒトプラスミノ
ーゲン：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社
製）を５μｇ／ｍｌになるよう、５０ｍＭ ＥＡＣＡを
含むＴＢＳまたはそれを含まないＴＢＳで希釈し、希釈
液をそれぞれ５０μｌ／ウェルで添加した。

【００２６】さらに、０．１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した
精製モノクローナル抗体溶液を５０μｌ／ウェルで添加
し、室温で２時間反応させた。洗浄後、１％牛血清アル
ブミンを含むＴＢＳを用いて２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社製）を
５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。
洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ基質溶液を５
０μｌ／ウェルで添加し、５分経過後、１Ｎ硫酸を５０
μｌ／ウェルで添加し、波長４９０ｎｍにおける吸光度
を測定した。なお、発色される場合は、モノクローナル
抗体が固相ヒトプラスミノーゲンと結合し、ＬＢＳＩ、
ＬＢＳＩＩまたはｍｉｎｉ−Ｐｇとは結合しないことを
意味する。 この結果、ヒトプラスミノーゲンのクリン
グルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつＥＡＣＡ
によって結合が阻害されるモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ
５を得た。その結果を表２に示す。表２中のモノクロー
ナル抗体Ｆ１１Ｐ５が本発明の抗体であり、他は本発明
外の抗体である。モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ５を産生
したハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究
所に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５９５２として寄託さ
れている。

【００２７】

【表２】 表２ モノクローナル抗体のヒトプラスミノーゲンのク
リングルドメインとの反応性

【００２８】実施例３ （ウェスタンブロットした各種抗原に対するモノクロー
ナル抗体Ｆ１１Ｐ５の反応性）ウオーレンとウイーマン
の方法（文献名：前出）に準じて、ヒトプラスミノーゲ
ンから、クリングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ド
メインおよびｍｉｎｉ−Ｐｇを分離精製した。すなわ
ち、ヒト−Ｌｙｓ−プラスミノーゲン １８０μＭをブ
タ膵臓由来のエラスターゼ１５０単位（ＣＡＬＢＩＯＣ
ＨＥＭ社製）で室温で４時間半処理し、フルオロリン酸
ジイソプロピル（和光純薬工業社製）を終濃度１ｍＭに
なるように添加して、反応を停止させた。これを、リジ
ンーセファロースカラムおよびセファクリルＳ−２００
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｋ１＋Ｋ
２＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ドメインおよびｍｉｎｉ−Ｐｇ
に分離精製した。

【００２９】これらの各試料（タンパク質量０．５μ
ｇ）を、非還元処理液［終濃度で、１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ６．８）、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン］または
還元処理液［終濃度で、１％（ｖ／ｖ）２−メルカプト
エタノール、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ６．８）、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン］と
１：１（ｖ／ｖ）で混合し、９５℃で５分間煮沸した。
ついで各反応液を、１２．５％（ｗ／ｖ）ゲル濃度のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で展開し、ついでポ
リフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲ
Ｅ社製）に、電気的に５０Ｖ、１時間で、ブロッティン
グした。このＰＶＤＦ膜を、５％（ｗ／ｖ）カゼインを
含むＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングし、１０
μｇの１次抗体としてのモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ５
を、室温で２時間反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ１００および０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを
含むＴＢＳで３回洗浄し、２次抗体として、０．０５％
（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００および０．５％（ｗ／
ｖ）カゼインを含むＴＢＳで２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社製）を
添加し、室温で１時間反応させ、同様に洗浄した。洗浄
後、ペルオキシダーゼ基質溶液で発色させた。この結
果、モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ５はＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３
ドメインを非還元処理した場合も還元処理した場合も認
識することが判明した。結果を発色バンドの位置として
図１に示す。

【００３０】実施例４ （ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのモノクローナル抗
体への結合に及ぼすＥＡＣＡの影響）ヒト−Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲン２００μｇを、ＩｏｄｏＢｅａｄｓ（Ｐ
ｉｅｒｃｅ社製）を用いて、１２５−Ｉｏｄｉｎｅ（放
射活性単位１７Ｃｉ／ｍｇ）で標識した。得られたＩ−
標識ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（終濃度５ｎＭ）
を、固相化したモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ１、Ｆ１１
Ｐ４、Ｆ１１Ｐ５およびＦ１１Ｐ６に添加し、種々の濃
度のＥＡＣＡの共存下で、４℃で１６時間反応させた。
結合したＩ−標識ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン量
を、ＥＡＣＡ非存在下での結合量に対するパーセントで
表示した。その結果を図２に示す。図２から、Ｆ１１Ｐ
５は、３ｍＭのＥＡＣＡが存在すると、ヒト−Ｇｌｕ−
プラスミノーゲンとの結合が５０％阻害されることが分
る。

【００３１】実施例５ （免疫吸着クロマトグラフィーによるヒトプラスミノー
ゲンの製造）１ｇのブロムシアン活性化セファロース４
Ｂ（ファルマシア社製）を、１ｍＭ塩酸中で１５分間膨
潤させ、グラスフィルター（Ｇ３）上で１ｍＭ塩酸２０
０ｍｌを用いて洗浄し、ついで０．１Ｍ重炭酸ナトリウ
ム−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．９）緩衝液で洗
浄した。他方、モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ５ １０ｍ
ｇに０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ８．９）緩衝液１ｍｌを加えて溶解し、これを
上記洗浄後のブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（以
下、「ゲル」という）に添加し、室温で２時間振とうし
てカップリングを行った。２時間後、ゲルをグラスフィ
ルター（Ｇ３）で脱水し、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−
０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．９）緩衝液および
０．１Ｍ酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ４．０）
緩衝液で交互に３回洗浄し、０．２Ｍグリシン（ｐＨ
８．０）５０ｍｌを加え、室温で２時間振とうしてブロ
ッキングを行った。得られたゲルを０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．９）緩衝液
および０．１Ｍ酢酸−０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ
４．０）緩衝液で交互に３回洗浄し、ＴＢＳで平衡化し
て免疫吸着担体（３ｍｌベッド容）を得た。

【００３２】次に、１０ｍｌのヒト血漿（健常人）を、
ＴＢＳで平衡化したセファロース４Ｂカラム（５ｍｌベ
ッド容）に通し、通過したヒト血漿を上記免疫吸着担体
（３ｍｌベッド容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗
浄後、０．０２５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒトプラス
ミノーゲンを溶出させ、溶出液をＴＢＳに対して透析す
ることによりヒトプラスミノーゲン０．５６ｍｇを得
た。得られたヒトプラスミノーゲンの活性を従来のウォ
ーレンとウィーマンの方法（文献名：前出）で得たヒト
プラスミノーゲンの活性と比較し表３に示した。ヒトプ
ラスミノーゲンの活性は、テストチームＰＬＧ・２キッ
ト（第一化学薬品社製）を用いて測定した。また、実施
例３と同様にして非還元処理を施し、電気泳動を行い、
電気泳動ゲルをクマシーブルー染色液（第一化学薬品社
製）に３０分浸した。得られた電気泳動図を図３に示
す。上記結果から、本製造法によれば、高純度、高回収
率でヒトプラスミノーゲンが得られ、操作も簡便化され
ることが分る。

【００３３】

【表３】

【００３４】

【発明の効果】本発明の、ヒトプラスミノーゲンのクリ
ングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつＥＡＣ
Ａによって競合阻害を受けるヒトプラスミノーゲンに対
するモノクローナル抗体を、ヒトプラスミノーゲンの免
疫吸着体として用いて、ヒト血漿からヒトプラスミノー
ゲンを製造する場合には、従来法に比し、高純度、高回
収率でヒトプラスミノーゲンが得られ、操作も簡便化さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４およびｍｉｎｉ−Ｐｇをそれぞれ
非還元処理または還元処理したものを電気泳動し、ウェ
スタンブロットし、ついでモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ
５と反応させ、発色させた場合のバンドを示す図である
（実施例３）。

【図２】モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ１、Ｆ１１Ｐ４、
Ｆ１１Ｐ５およびＦ１１Ｐ６をそれぞれ固相化し、Ｉ−
標識ヒト−Ｇｌｕ−ヒトプラスミノーゲンを種々の濃度
のＥＡＣＡの共存下で反応させ、その結合率を示した図
である（実施例４）。

【図３】本製造方法と従来法によって得られたヒトプラ
スミノーゲンをそれぞれ非還元処理したものを電気泳動
し、染色した場合のバンドを示す図である（実施例
５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１
   ＋Ｋ２＋Ｋ３ドメインを認識し、かつε−アミノカプロ
   ン酸によって競合阻害を受ける、ヒトプラスミノーゲン
   に対するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 該モノクローナル抗体へのヒトプラスミ
   ノーゲンの結合が、５ｍＭのε−アミノカプロン酸の存
   在下で、５０％以上阻害される請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
3. 【請求項３】 Ｆ１１Ｐ５ハイブリドーマ（工業技術院
   生命工学工業技術研究所の寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
   ９５２）から得られる請求項１または２記載のモノクロ
   ーナル抗体。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかに記載のモ
   ノクローナル抗体の、ヒト血漿からのヒトプラスミノー
   ゲンの製造における免疫吸着剤としての使用。
5. 【請求項５】 固相化した請求項１ないし３のいずれか
   に記載のモノクローナル抗体とヒト血漿とを接触させて
   ヒトプラスミノーゲンを吸着させ、ついで洗浄後、ＥＡ
   ＣＡ含有緩衝液で脱着することを特徴とするヒトプラス
   ミノーゲンの製造方法。