KR930002834B1

KR930002834B1 - 항유로키나제 모노클론 항체 함유 면역흡착제 및 이를 사용하는 유로키나제 정제방법

Info

Publication number: KR930002834B1
Application number: KR1019860700225A
Authority: KR
Inventors: 마리아 루이사 놀리; 안 겔로 코르티; 아돌포 소피엔티니; 기오바니 카싸니; 프란체스코 파렌티
Original assignee: 그루포 레페티트 에스.피.에이; 레나토 스가르비
Priority date: 1984-08-24
Filing date: 1985-08-21
Publication date: 1993-04-10
Also published as: HU203257B; ES552074A0; FI861715A0; ATE56617T1; HUT40574A; DE3579808D1; KR870700022A; DK176986D0; AU4773085A; NO172549C; ES546594A0; EP0192675B1; PT81050B; ES8704351A1; GR852008B; ES8707563A1; NO861554L; FI861715A; PT81050A; IL76187A0

Abstract

내용 없음.

Description

항유로키나제 모노클론 항체 함유 면역흡착제 및 이를 사용하는 유로키나제 정제방법

본 발명은 인체 유로키나제 상에서 에피토프(epitope)로 되는 새로운 IgG₁모노클론 항체군에 관한 것으로서, 이 항체는 저분자량 유로키나제(33,000)에 결합됨이 없이, 고분자량 유로키나제(54,000) 또는 그의 단일사슬 전구체에 선택적으로 결합되고, 면역 흡착에 기한 정제계에 사용하기에 적합한 친화력 상수를 가지며, 유로키나제의 효소 활성을 손상시키지 않는다.

본 발명의 모노클론 항체를 적당한 매트릭스에 커플링시킬 경우, 생물학적 공급원으로부터 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 건구체를 정제시킬 수 있는 면역 흡착제 매트릭스가 얻어진다. 이러한 면역 흡착제는 항원에 대한 항체의 양호한 친화력 때문에 인체 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 전구체를 공업적 규모로 정제시키는 데도 특히 적합하다.

또한, 본 발명의 모노클론 항체는 고분자량의 인체 유로키나아제(HMW유로 키나제) 또는 그의 단일 사슬 전구체를 검출하기 위한 분석학적 방법(예, 면역-형광에 기초를 둔 분석법, 방사성 면역 분석법 및 효소-면역 분석법)의 용도에 적합하다.

인체 유로키나제는 주로 신장 세포에 의해. 생성되는 기지의 플라스미노겐 활성화제(PA)이다. 이것의 주요한 생리학적 역활은 피브린 용해계에서의 활성화제로서의 역활인 것으로 보인다. 그러므로, 유토키나제는 심근 경색, 발작, 폐색전증, 심정맥 혈전증, 말초 동맥 폐쇄, 출혈 및 망막 정맥 폐쇄와 같은 급성 혈관 질병의 치료에 사용된다.

플라스미노겐 활성화제(PA)는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 세틴 프로테아제로서, 혈액 응괴(clot)의 주성분인 피브린에 대해 높은 특이성을 갖는 프로테아제이다. 면역학적으로 구별되는 2종의 PA는 배양된 악성 종양 세포주로부터 단리되는데, 이들은 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA)[리예켄 디.씨.(Rijken D.C), 비옌가르드 지.(Wijngaard G.), 잘-데 종엠.(Zaal-de Jong M), 벨베르겐 제이(Welbergen J.)(1979)년 Biochem. Biophys Acta 제380권, 제140페이지 참조] 및 뇨 활성화제(UPA)(또한, 유로키나제로 명명된)[윌리암스 제이.알.비.(Williams J.R.B)(1951년) Br.J.Exp.Pathol. 제32권, 530페이지 참조]와 관련된다. 원래 뇨로부터의 2개의 사슬 프로테인으로서 정제된 유로키나 제형은 최근에 전효소 형태(전(前) 유로키나제로 칭함)로 하여, 예를들면 인체 유표피암 세포주 HE_p3[원.티.디.(Wun.T.D.), 오소우스키 엘.(Ossowsky L.) 및 라이히 엘.(Reich E.).(1982년) J.Biol.Chem. 제257권, 제7262페이지 참조], 인체 신경 교아종 세포[닐센 엘.에스(Nielsen L.S.)와 그의 공동 연구자의 (1982년) Biochem 제21권, 제6410페이지 참조], 뇨[후사인 에스.시.(Husain S.C)와 그의 공동 연구자의 논문(1983년) Arch. Biochem. Biopyhs 제220권, 제31페이지] 및 인체 신장 영구 세포주 TCL-598[코노 티.(Kohno T.)와 그의 공동 연구자의 논문(1984년) Biotechnol 제 2 권, 628페이지 참조]로부터 단리되었다.

또한 유로키나제에 면역학적으로 관련된 전효소는 최근에 인체 유포피암 세포주 A431의 상징액으로부터 단리되었다. 이 전유로키나제 효소원은 아미노 분해 활성이 낮거나 없고, 높은 피브린 친화력을 갖는 50 내지 54000의 단일 사슬 프로테인이며, 디이소프로필 플루오로 인산염 처리 및 혈장 억제제에 의한 불활성화에 대해 내성을 가지며 [구레비히 에이.(Gurewich A.)와 그의 공동 연구자의 (1984년) J.Clin.Invest, 제73권, 제1731페이지 참조], 플라스민으로 처리함으로써 2-사슬 활성 효소(유로키나제)로 전환시킬 수 있다.

인체 유로키나제 분자는 생물학적으로 활성인 몇가지 형태로 단리시킬 수 있으나, 주로 고분자량 형태(분자량 약 54,000) 및 저분자량 형태(분자량 약 33,000)로 이루어진다. 저분자량 형태(LMW)는 고분자량 형태(HMW)로부터 효소 분해 의해 얻어진다.

HMW형태는 이황산염 결합으로 연결된 30,000중(重) 사슬(B-사슬) 및 20,000경(輕) 사슬(A-사슬)로 구성된다. LMW형은 전부 B-사슬로 되며, 이것은 활성부위 및 이황산염 결합에 의해 연결된 A-사슬에 유도된 작은 단백질 분해 저항 단편(MW=2,427)을 함유한다. 이 A-사슬은 단백질 분해에 의하여 18,000단편과 상기 2,427단편으로 분리된다. LMW유로키나제는 생체 내에서 혈전 용해를 가속화시키는 HMW유로키나제보다 활성이 적은 것으로 보인다[엠.사마마(M.Samama)와 그의 공동 연구자의 논문, Thromb.Haemostas, 제40권, 제578-580페이지(1979년) 및 지.무라노(Murano)와 그의 공동 연구자의 논문, Blood, 제55권, 제430-436페이지(1980년) 참조]. 인체 유로키나제는 현재 통상의 정제방법에 의해, 뇨 배양, 조직 배양, 특히 정상 및 종양의 신장 세포 배양과 같은 생물학적 공급원으로부터 주로 얻는다. 인체 유로키나제 효소원은 일단 유로키나제로 활성화되면 생리학적으로 유사한 역활을 할 수 있다. 최근에는 인체 유로키나제를 DNA기법으로 제조한다는 것이 보고되어 있다[유럽 특허출원 공개 제92182호 참조].

유로키나제에 대한 모노클론 항체에 대해서는 씨.밀스테인(C.Milstein) 및 지.쾰러(G.

)에 의해 Nature 제256권, 제495-497페이지(1975년)에서 설명된 모노클론 항체 생성 잡종 세포에 관한 선구적인 연구 이래로 발표되어 왔다. 예를들면, 벨기에 특허 제896,253호에는 마우스에 저분자량의 유로키나제(33,000)를 접종시켜서 얻은 몇가지 모노클론 항체가 기재되어 있다. 이 모노클론 항체는 저분자량 형태의 유로키나제의 에피토프로 현전히 전환된다. 이 항체중의 한가지인 AAU2로 정의된 항체를 선택해서 유로키나제의 정제에 사용하였다[피.헤리온(P.Herion) 및 에이. 볼렌(A.Bollen), Bioscience Reports 제 3 권 제373-379페이지(1983년)참조]. 물론 얻어진 유로키나제는 저분자량 및 고분자량 형태를 모두 함유한다. 디.베터라인(D.Vetterlein) 및 지.제이.콜톤(G.J.Colton)은 유로키나제 경 사슬에 대하여 고정시킨 모노클론 항체에 의한 유로키나제의 정제를 기재하였다[Thromb.Haemostas(Stuttgard) 제49권, 제24-27페이지(1983년)참조]. 여기에 기재된 정제 인자는 2.4미만이며[60,000-70,000 CTA 유니트/㎎ 내지 142,000-167,000 CTA 유니트/㎎, 제25페이지, 오른편란, 제10 내지 11행 참조], 기재된 실험에서 뇨와 함께 면역흡착제에 결합된 유로키나제(수지 1ml당 300m1/뇨, 제26페이지 제 2 도의 제 2 단락 참조)는 공업적 규모의 정제에는 적당하지 않다. 더우기, 이 저자들은 모노 클론 항체 면역 흡착제를 사용하는 유로키나제의 공업적인 정제의 문제점이 여전히 해결되어야 한다는 것을 지적한 바 있다(그러나, 여전히 대규모로 이 친화력 방법을 사용하고 있다. 제27페이지 왼편란, 제13-14행 참조).

유럽 특허 출원 공개 제84344호에는 광범위한 항유로키나제 모노클론 항체가 일부 기재되어 있다. 여기에서는, 이 항체들이 유로키나제 정제에 유용하고, 진단 및 분석 목적에 유용하다는 것이 기재되어 있다. 그러나, 최종 생성물인 유로키나제는 고분자량 또는 저분자량 형태에 있어서의 그것의 함량이나 생물학적으로 활성 또는 독성 오염물질에 있어서의 그것의 함량을 특징으로 하는 것은 아니다. 지.살레르노(G.Salerno)와 그의 공동 연구자의 논문, Proc.Natl.Acad.Sci. 미합중국, 제81권, 제110-114페이지(1984년)에는 기타의 항유로키나제 모노클론 항체가 기재되어 있다. 후술하는 바와 같이, 이 항체는 고분자량 형태 및 저분자량 형태의 유로키나제에 결합되며 효율적인 친화력 크로마토그라피에 대해 적합하지 않은 친화력 상수를 갖는다. 기타 "항유로키나제"모노클론 항체에 관한 면역흡착제는 엘.에스.닐슨(L.S.Nielsen)과 그의 공동 연구자의 논문, Bochemistry, 제21권, 제6410-6415페이지(1982년) 및 케이. 칼로프트(K.Kaltoft)와 그의 공동 연구자의 논문, Proc.Natl.Acad.Sci 미합중국, 제79권, 제3720-3723페이지(1982년)에 설명되어 있다. 설명된 모노클론 항체는 플라스미노겐 활성화제의 효소 활성을 억제하는데, 이들 항체는 HPA 52로 명명된다. 그러나, 매트릭스의 ml당 매트릭스에 결합된 항체의 양 및 개질된 최종 매트릭스의 용량은 공업적 규모의 용도에 부적합하다. 더우기, 신경 교아종 세포배양 배지로부터 HPA 52를 정제시키는데 2단계의 연속적인 크로마토그라피 단계의 사용이 필요하다(표 I.제6412페이지 참조).

본 발명은 다음의 특성을 갖는 항인체 유로키나제 모노클론 항체를 제공한다.

a) 이 항체는 IgG₁이다.

b) 본질직으로 트사피스(Tsapis)와 그의 공동 연구자의 논문, Eur.J.Biochem. 제64권, 제369페이지(1976년)에 기재된 방법으로 측정할 경우, 이 항체의 고정된 유로키나제에 대한 친화력 상수는 (1.42±1.5)×10⁷lㆍmole^-1이다.

c) 이 항체는 저분자량(33,000) 유로키나제에 결합되는 일이 없이 고분자량(54,000) 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 전구체에 결합된다.

d) 이 항체는 A-사슬의 18,000 단백질 분해 단편에 결합된다.

e) 이 항체는 유로키나제 이외에 혈청 또는 뇨의 효소학적으로 활성인 단백질분해 효소와 교차 반응하지 않는다.

고분자량의 유로키나제와 유로키나제 전구체에 결합되는 본 발명의 모노클론 항체의 특징에 비추어, 본 발명의 모노클론 항체의 특이성 및 결합성을 다룰 때, 이하의 설명 및 특허청구의 범위에서 "유로키나제"란 용어에는 고분자량 형태의 유로키나제 및 유로키나제 전구체가 포함된다. 동일한 문맥에 있어서 "고분자량 형태의 유로키나제"라는 말은 그의 전구체도 역시 포함되는 것으로 이해할 수 있는데, 이들 전구체는 마찬가지로 본 발명의 모노클론 항체에 의하여 특이적으로 결합된다. 본 발명의 명세서 및 특허청구의 범위에 있어서, "유로키나제 전구체"라는 말은 상기 유로키나제 효소원과 같은 유로키나제의 "천연" 단일 사슬 전구체 및 rec-DNA기법으로 얻어진 유로키나제 전구체 또는 관련 물질에 관한 것으로서 이것은 본 발명의 모노클론 항체에 결합되는 공통적인 특징을 갖는다.

본 발명의 항유로키나제 모노클론 항체는 "비분비"형의 마우스 골수종 세포, 즉 면역 글로블린을 분리하지 않는 골수종 세포와 미리 유로키나제로 면역시킨 마우스의 비장세포를 체세포 융합시켜서 얻는다. 간단히 말해서, Balb/c마우스를 고도로 정제시킨 54,000 유로키나제로 면역시키고, 제거시킨 비장 세포를 잡종 세포를 단리시키기에 매우 유용한 특정 배지중에서 생존할 수 없는 어떤 유전적 결함을 가진 비분비형의 골수종 세포와 융합시킨다. 이러한 세포주의 예는 X 63-Ag 8653으로 알려져 있는데, 이들은 케르니(Kearney)와 그의 공동 발명자의 논문, J.Immunol., 제123권, 제1548-1550페이지(1979년)에서 알려져 있어 당업계의 숙련자들에게 공지되고 용이 입수가 가능하다.

이러한 골수종 세포주는 일반적으로 많은 과학 연구소[예, 샐크 연구소, 세포 분배 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center), 미합중국, 캘리포니아 92112, 산디에고, 피.오.박스 1809 및 의학 연구소, NIGMS 세포 저장소(Institute for Medical Research, NIGMS Cell Repository), 미합중국, 뉴저지주 08103, 캠덴, 코페우드 앤드 데이비스 스트리트 소재]를 통해서 용이 입수가 가능하다. 이 세포 융합은 폴리에틸렌 글리콜, 적합하기로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)6000의 존재하에 행한다.

고도로 정제된 54,000 유로키나제(HMW유로키나제)는 다수의 공급원으로부터 통상적으로 입수가 가능하다. 고도로 정제된 적합한 유로키나제 제제물은 국제단위(IU)의 역가가 높고, 피브린 용해/엑스테트분해 활성비가 높으며, 트롬보플라스틴 오염 물질이 매우 소량으로 또는 실제적으로는 존재하지 않는다. 고도로 정제된 바람직한 유로키나제 제제는 PERSOLV

(그루포 레페티트 에스.피.에이.제품)의 상표로 사용되는 제제인데, 이것은 피브린 용해 활성이 100,000IU/㎎ 이상, 피브린 용해/에스테르 분해 활성이 1.4 이상이고 투여량이 20,000IU/㎏ 이상일때 토끼에게서 무발열원이며, 혈장 농도가 200IU/ml로 높을 때의 응집 활성은 0이다.

면역 계획의 바람직한 특징은 유로키나제의 투여량이 낮다는 것이다. 마우스에 있어서의 전형적인 면역계획은 융합 60일 전에 완전 프로인드 보조제 중의 고도로 정제된 분자량 54,000 유로키나제(120,000IU/㎎, 약 ug)의 1차 복강내 투여, 융합 30일 전에 불완전 프로인드 보조제 중의 동량의 2차 복강내 주입 및 융합 5일전에 동량의 부스터의 최종 정맥내 투여로 이루어진다.

융합 10일 전에 항유로키나제 항체 역가가 1 : 10,000 이상인 동물들에만 최종 부스터를 주입하고 더 처리하였다. 비장을 제거하고, 비장 세포를 약 5×10⁷에 대해 약 10⁸의 비율로 골수종 세포와 융합시켰다. 융합후, 이 세포를 약 10% 태내 송아지 혈청을 함유하는 둘베코의 개질된 이이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)와 같은 적당한 배지 중에서 배양시키고, 융합된 세포는 하이포크산틴, 아미노프레틴, 티미딘 배지(HAT)에서 선택한다. 세포 배지의 상액은 항유로키나제 "통상의" 항혈청에 대한 ELISA방법으로 항유로키나제 항체에 대하여 분석하였다. 그리하여, 동일한 항유로키나제 모노클론 항체의 정제를 이온-교환크로마토그라피 또는 유로키나제-아가로오스 컬럼을 사용하는 친화력 컬럼에 의해 행하는 한편, 얻어진 생성물의 균질성을 평가하기 위해서는 겔 전기 영동법이 편리한 방법이다. 이어서, 항유로키나제 모노클론 항체의 제제물에 대해 아가로오스에 고정시킨 항원에 대한 군 특이성 및 친화력 상수를 평가하였다.

군 특이성은 아우트컬로니의 두배의 면역 확산법(Outcherlony's double immunodiffusion technique)[Acta Pathd. Microbiol. Scand, 제26권, 제507페이지(1949년) 참조]에 의하여 평가하고, 친화력 상수는 본질적으로 트사피스(Tsapis) 등의 방법에 따라 평형결합 실험에 의하여 측정하였다.[트사피스 에이.(Tsapis A.), 로가르드.엔.(Rogard N.), 알프센 에이.(Alfsen A.) 및 니해스코 씨.(Nihaesco C.)의 Eur.J.Biochem. 제64권, 제369페이지(1976년)참조]. 이 실험에서 인산염 완충액 염수(pH 7.2)중에 이미 투석시킨 본질적으로 순수한 모노클론 항체의 농도를 증가시켜서 유로키나제에 대한 매트릭스(예, 유로키나제-아가로오스 매트릭스)에 첨가한다. 결합되지 않은 항체의 농도는 분광광도법으로 측정하고, 결합된 항체의 농도는 첨가된 항체의 총량으로부터의 차이에 의하여 계산하며, 결합 데이타는 공지된 통계법[예, 지.스캐취드(G.Scatchard)의 Ann.N.Y.Acad.Sci.제51권, 제660-672페이지(1949년)참조]에 의하여 정리하였다.

본 발명의 모노클론 항체의 친화력 상수는 상기 분석법으로 측정시(1.42±1.5)×10⁷lㆍmole^-1이다.

본 발명의 목적은 공업적 규모로 유로키나제를 정제하기 위하여, 면역 흡착계에 본 발명의 모노클론 항체를 사용하는 것이다.

특정의 항원(본 발명의 경우에는 유로키나제)에 대하여 생긴 일정의 항체 중공업적 규모 공정에 사용하기에 적합한 것이 없다는 사실은 당업계에 숙련된 사람에 의해 이해될 것이다. 실제로, "실험실적"규모와 "공업적"규모 조작사이의 차이점이 있다는 것을 알려져 있다. 크기의 변화는 사실상 해결하여야 할 문제점들을 크게 확대시키며, 많은 경우에 있어서, 실험실적 규모 조작에 만족스러운 해결책이 공업적 규모 조작에는 부적합하다.

본 발명의 경우에 있어서, 적당한 모노클론 항체는, 결합된 항원을 크게 방출시키는 일이 없이 씻어내는 것이 가능하고, 상당히 상이한 조건에서 매트릭스로부터 방출시키는 것이 가능한 조건에서 항원을 효과적으로 결합시키기 위해서, 항원에 대한 최적의 친화력을 가져야 한다.

반면에, 그 방출조건은 항원이나 면역 흡착제에 어떠한 손상도 주지않을 정도로 온화한 것이어야 한다.

항원에 대한 항체의 친화력은 최종 면역 흡착제의 용량을 일정의 정도로 조절하므로, 낮은 친화력의 항체는 일반적으로 너무 낮은 용량의 면역 흡착제에 관련되고, 이에 따라 정제 수율이 낮다(예컨대, 씻는 도중의 활성 손실 때문에), 반면에, 높은 친화력의 항체는 일반적으로 면역 흡착제에 대한 너무 강한 항원의 결합에 관련되고, 이에따라 예컨대 용출의 곤란성 또는 매우 격렬한(그리고 가능하게는 변성) 용출조건 때문에 수율이 저조하다. 그러나, 모노클론 항체의 친화력 상수 및 대응하는 면역 흡착제의 용량이 면역 흡착에 기초를 둔 공업적 규모의 정제방법에 유일한 임계 변수는 아니다. 그 이유는, 모노클론 항체의 선택적 특이성이 이 계획에서 역시 매우 중요한 역활을 하기 때문이다.

실제로, 본 발명의 모노클론 항체는 고분자량 유로키나제에 결합하지만 저분자량 형태 또는 임의의 기타 혈청 또는 뇨의 단백질 분해 효소의 활성 형태에는 결합하지 않는다.

특히, 본 발명의 항체는 공지된 혈청 또는 뇨의 트롬보플라스틴 오염물질과 교차 반응하지 않는다. 그 밖에 또한 본 발명의 모노클론항체는 최종 면역 흡착제의 매트릭스에 결합될 경우에 이 특이성을 유지한다. 특히, 본 발명의 모노클론 항체는 이미 설명한 바와 같이 상기 분석법에 있어서 상기 특이성이 친화력 상수가(1.42±1.5)×10⁷lㆍmole^-1라는 데 특징이 있으며, 적합한 매트릭스에 결합될 경우에 150,000IU/ml 이상의 용량을 갖는 면역 흡착제를 생성한다.

따라서, 본 발명의 모노클론 항체는 고정된 유로키나제를 사용하는 분석법에서의 친화력 상수가 약(1.42±1.5)×10⁷lㆍmole^-1인 IgG₁이며, 저분자량 형태에 결합되거나 또는 유로키나제 이외에 혈청 또는 뇨의 단백질 분해 효소와 교차반응하지 않고 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 전구체의 고분자량 형태에 대해 양호한 특이성을 갖고, 적당한 매트릭스에 일단 결합될 경우, 150,000IU/㎎ 이상의 용량을 갖는 면역 흡착제 매트릭스를 생성하며, pH 4.5 내지 8.0에서, 심지어 최대 0.5M 염화나트륨 수용액 존재하에 항원에 결합할 수 있고, 0.5M 내지 1M 염화나트륨 수용액 존재하의 pH 3.0 내지 4.0에서, 결합된 항원을 방출시킬 수 있다. 본 발명의 모노클론 항체는 5B4로 명명되는데, 다음의 특성을 갖는다.

a) 이 항체는 IgG₁군에 속한다.

b) 이 항체는 본질적으로 트사피스(Tsapis)와 그의 공동 연구자의 논문, Eur.J.Biochem. 제64권, 제369페이지(1976년)에 기재된 방법으로 측정할 경우, 친화력 상수가 1.42×10⁷lㆍmole^-1이다.

c) 이 항체는 유로키나제의 저분자량(33,000)형태 또는 임의의 혈청 또는 뇨의 트롬보플라스틴 오염 물질에 결합되지 않고, 고분자량 형태(54,000)의 유로키나제 또는 그의 전구체에 특이적으로 결합한다.

d) 이 항체는 18,000 단백질 분해 단편 A-사슬에 결합한다.

e) 이 항체는 흡착되지 않은 유로키나제의 효소 활성에 손상을 주지 않는다.

f) 이 항체는 등전점이 약 5.75이다.

본 발명의 모노클론 항체와 커플링시키기에 적합한 매트릭스로서 대표적인 것으로는 가교결합 덱스트란 및 구멍을 조절시킨 가교 결합 덱스트란, 아가로오스, 개질 및 활성화시킨 아가로오스(예, 카르복시 메틸 아가로오스, 가교 결합ㆍ아가로스의 N-히드록시숙신이미드 엑스테르유도체), 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스가 있다. 이 매트릭스는 대다수의 경우에 활성화 또는 비활성화 형태로 상업적으로 입수가 가능하다. 일반적으로, 활성화 매트릭스가 바람직하다. 그 까닭은, 커플링 반응시의 취급상 잇점이 알려져 있기 때문이다.

본 발명의 면역 흡착제의 제조에 바람직한 매트릭스로 적합한 것은 활성화 아가로오스이다. 이 매트릭스에 대한 본 발명의 모노클론 항체의 커플링은 공지의 방법에 의한다. 사용된 매트릭스에 비활성형인 경우에, 커플링 반응에는 공지의 활성화제[예, 브롬화시아노겐, 에피클로리단, 1, 4-비스-[2, 3-디에폭시프로폭시)부탄 및 3-아미노프로필트리에톡시실란]를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 면역 흡착제의 바람직한 용도 중의 하나는 생물학적 공급원으로부터 54,000MW 유로키나제 또는 그 전구체를 정제, 특히 공업적 규모로 정제시키는 것이다. 그 밖에, 이 면역 흡착제는 항원에 대한 친화력 및 결합된 모노클론 항체의 특이성 때문에, 방사능 면역 흡착제는 항원에 대한 친화력 및 결합된 모노클론 항체의 특이성 때문에, 방사능 면역 분석법, 효소 결합 면역 분석법 및 기타 경쟁적 결합 분석법과 같은 분석학적 시험계에서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 하나의 목적은 생물학적 공급원 또는 그의 농축물을 pH 4.5 내지 8.0에서 본 발명의 면역 흡착제와 접촉시켜서 54,000MW 유로키나제를 본 발명의 면역 흡착제에 선택적으로 결합시키고, 이것을 pH 6 내지 8의 완충 용액으로 씻어내고, pH 3.0 내지 4.0에서, 0.5 내지 1M 염화나트륨 수용액을 함유하는 수용액으로 용출시켜서 면역 흡착제로부터 그 결합 항원을 방출시키는 과정을 포함하는, 생물학적 공급원으로부터 54,000MW 유로키나제(HMW유로키나제) 또는 그 전구체를 정제시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

이 방법에 있어서, 0.5 내지 1M 농도의 염화나트륨 수용액에 의하여 항원/면역 흡착제 복합체로부터 항원이 방출될 수 있는 반면에, 최대 0.5M 농도의 염화나트륨 수용액 존재하에서도 항원이 면역 흡착제에 결합될 수 있다.

당업계의 숙련자들에게 알려지게 되는 바와 같이, 염화나트륨 수용액은 정제공정을 방해하지 않는 동일한 농도의 임의의 수용액으로 대체될 수 있다.

본 명세서 및 특허청구의 범위에서 "생물학적 공급원"이란 용어에는 뇨와 혈액과 같은 생체액, 본 발명의 모노클론 항체에 의해 인지된 유로키나제 또는 플라스미노겐 활성화제를 생성할 수 있는 유전 공학적으로 생산된 미생물의 조직 배양액 및 발효액이 포함된다.

이미 설명한 바와 같이, 본 발명의 면역 흡착제는 생물학적 공급원으로부터 직접 고분자량 형태의 유로키나제를 정제할 수 있으며, 예를들어 생물학적 공급원이 인체의 뇨일 경우에, 다음과 같은 특성을 갖는 유로키나제 생성물이 얻어진다.

a) 피브린 용해 역가가 130,000IU/ml 이상이다.

b) 고분자량 유로키나제가 풍부하게 들어 있다.

c) 실제적으로는 저분자량 유로키나제가 전혀 없다.

d) 피브린 용해/에스테르 분해 활성은 2000 이상이다.

e) 실제적으로 트롬보플라스틴 오염 물질이 없다.(약 200IU/ml 농도에서 응집활성 0임).

실질적으로, 상기 특성을 갖는 유로키나제 생성물은 기타 임의의 생물학적 공급원으로부터 얻는다.

어떤 경우에, 공업적 규모의 정제에 있어서는, 면역 흡착제와 접촉시킬 (또는 면역 흡착제를 함유하는 컬럼에 통과시킬) 생체액의 용적을 감소시키기 위하여 본 발명의 면역 흡착제에 의한 정제 공정에 상기 생체액 대신에 생체액의 농축물을 사용하는 것이 편리할 수가 있으며, 그 결과 전체 조작시간 및 비용을 절약할 수 있다.

또한, 이 경우에 있어서, 본 발명의 면역 흡착제는 그것의 효율을 유지하며, 전술한 특성을 갖는 정제품을 제공한다.

본 발명의 목적 중의 하나인 정제 공정에 사용하기에 적합한 모노클론 항체를 선택하는 문제를 보다 명확히 하기 위하여, 본 발명에 적합한 모노클론 항체(이 항체는 5B4로 명명됨)와 살레르노(Salerno)와 그의 공동 발명자의 논문, Proc.Natl.Acad.Sci.미합중국, 제81권, 제110페이지(1984년)에 기재된 모노클론 항체(이 항체는 mAB 105, IF 10로 명명되고, 친화력 상수는 5B4와 유사함)를 비교한 결과를 다음 표에 기재하였다.

[표 Ⅰ]

동일한 군(IgG₁)에 속하는 이 2종의 모노클론 항체는, 동량의 활성 아가로오스(Affi-gel

10)에 동량으로 결합될 경우에 유로키나제 제제의 정제시에 실질적으로 상이한 결과를 나타낸다.

더욱 구체적으로 말하자면, 동일한 순도의 유로키나제 제제(897에스테르 분해 유니트)를 2종의 상이한 면역 흡착제에 통과시킬 경우에, 결합 분률은 105.1F 10의 경우 10% 미만이고, mAB 5B4의 경우 70% 이상(즉, 77.5%)이다.

본 발명의 모노클론 항체는 항원에 대한 친화력 및 특이성 때문에, 분석 또는 검출 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 이들은 형광 염료, 방사성 동위 원소 및 효소와 같은 여러가지 표지(marker)를 붙일 수 있으며, 면역 형광법, 방사능 면역 분석법 또는 효소 면역 분석법에서 사용될 수 있다.

그리하여, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 모노클론 항체를 사용한 인체 유로키나제 또는 그 전구체의 효소 면역 분석법, 방사능 면역 분석법 또는 면역 형광 분석법을 제공하는 것이다. 인체 유로키나제는 일반적으로 피브린 용해 또는 에스테르 분해 방법으로 분석한다. 첫째 방법은 유로키나제에 의해 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시켜서 생성된 응괴를 용해시키는 것에 기초를 두며, 둘째 방법은 유로키나제에 의해 합성 기질 아세틸-리실-메틸-에스테르(ALME)를 직접적으로 가수 분해시키는 것에 기초를 둔다. 그리하여, 이 분석법은 활성형태의 효소 만을 검출할 수 있다. UK의 불활성 전구체, 예를들면 프리프로유로키나제 또는 프로유로키나제 또는 억제제 효소 복합체는 검출되지 않는다. 이와달리, 분자의 항원성에 기초를 두고 그의 활성에는 기초를 두지 않는 면역 분석법은 활성 및 불활성 항원성에 기초를 두고 그의 활성에는 기초를 두지 않는 면역 분석법은 활성 및 불활성 형태의 효소를 검출할 수 있다. 유로키나제 또는 그의 "불활성"전구체(예, 유로키나제 효소원 또는 프로유로키나제)를 검출 또는 분석하는데 유용한 매우 편리한 면역 분석 방법은 a) 항원을 함유하는 시험 용액을 고체상 담체에 고정시킨 1차 항유로키나제 항체와 반응시켜서 항원을 고체상에 결합시키는 공정, b) 측정 가능한 표지가 결합된 2차 항유로키나제 항체를 함유하는 용액을 결합된 항원과 접촉시키는 공정, (상기 1차 및 2차 항체 중의 하나는 본 발명의 모노클론 항체이다)과, c) 측정 가능한 표지가 고체상 담체에 결합되는 정도에 따라 항원을 검출 또는 분석하는 공정으로 이루어진 이중 항체 샌드위치법이다.

상기 "1차" 항체는 항유로키나제 항혈청, 항유로키나제 정제 면역 글로블린 G(IgG₁) 및 모노클론 항체[이 항체는 상기 "2차"항체의 결합 부위와는 다른 항원의 결합되는 것으로 알려져 있으며, "2차"항체의 결합을 방해하지 않는 것이 명백하다]로 부터 선택되는 것이 좋다. "시험용액"은 본 발명의 모노클론 항체에 의해 결합된 항원을 포함하는 임의의 용액일 수 있으나, 생체액, 발효액(예, 유전 공학적으로 생산된 미생물 및 세포 배양 발효액 및 추출액)이 포함된다. "2차" 항체로는 효소, 형광 염료 또는 방사성기와 같은 적당한 측정 가능한 리간드에 결합된 본 발명의 모노클론 항체가 바람직하다. 바람직한 측정 가능표지는 효소이며, 바람직한 "표지"는 고추냉이 퍼옥시다제이다. 본 발명의 모노클론 항체로 바람직한것은 상기한 5B4 모노클론 항체이다. "1차" 및 "2차" 항체 모두가 모노클론일 경우(그 중의 하나는 본 발명의 모노클론 항체인 반면, 다른 하나는 본 발명의 항체와는 다른 항원 부위에 결합하는 다른 항인체 유로키나제 모노클론 항체이며, 이 결합은 본 발명의 모노클론 항체의 결합을 방해하지 않는다.) 일반적으로 이들은 상기 분석방법에서 상호호환성이 있다. 2종의 모노클론 항체중 하나는 "1차" 항체이고, 다른 하나는 "2차" 항체일 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하다. 반면에, "항체" 중의 하나로 통상의 항혈청을 사용하는 분석법의 경우에는, 계의 효율이 역상황에서보다 더 높으므로, 통상의 항혈청이 "1차" 항체로서 거의 독점 사용될 수 있다.

모노클론 항체와 효소 표지와의 커플링은 공지의 방법에 의한다. 커플링제로 바람직한 것을 글루타르알데히드이다. 측정 가능한 표지가 효소일 경우, 발색색원체 효소 기질이 사용되는데, 이는 공지된 표지 붙힘효소 합성 기질이며, 효소와의 배양 후, 유색 유도체를 발생시키게 되는데 유도체의 색상 강도를 측정하여, 시험 화합물의 표준 제제에 의해 발색된 색과 비교하여 평가한다. 이러한 정량적인 면 이외에, 또한 이 방법은 어느 경우에는, 미지 시료 중의 항원의 존재를 간단히 검출하기 위한 정성적인 방법에 사용할 수 있다.

고체 담체로서는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 가교결합 덱스트란, 실리콘 고무, 미세 결정 유리 및 플라스틱 입자가 있으며, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 폴리비닐과 같은 플라스틱으로부터 성형된 튜우브, 디스크 또는 마이크로플래이트와 같은 성형 물질이 바람직하다. 폴리비닐 마이크로플레이트가 고체 담체로 바람직하다. 본 발명의 방법의 바람직한 적용 범위는 15 내지 100㎎/ml의 항원이다. 당업계의 숙련자들에게 자명한 바와같이, 처리될 한계 이외의 범위에 속하는 항원 농도를 갖는 시료 경우에는, 일시적으로 이러한 최적 농도 범위에 포함되게 하기 위해서 미리 희석 또는 (적절하다면) 농축시켜야 한다. 이어서, 이 방법은 분석간 정밀도와 분석내 정밀도 및 분석 회수율의 백분률을 평가하여 유효성을 갖게 된다. 분석내 정밀도(CV)는 일반적으로 4 내지 8%, 분석간 정밀도(CV)는 일반적으로 7 내지 23%인 한편, 분석 회수율은 87 내지 114%이다. 또한, 인체의 유표피암세포[A431 세포; 제조업자, 드 라르코(De Larco), 토다로(Todaro), 1977년 Proc. Nath.Acad.Sci.미합중국, 제74권, 제565페이지]에 의해 생성된 유로키나제와 유사한 플라스미노겐 활성화제 전구체(단일 사슬 전구체)에 대한 본 발명의 모노클론 항체의 특이성을 나타내고, 본 발명의 방법을 사용하여, 제조된 전구체의 분석을 행하였다.

이하, 본 발명은 다음의 실시예로 더욱 구체적으로 설명되지만, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

항유로키나제 모노클론 항체 5B4의 제조

a) 항유로키나제 모노클론 항체의 제조

고도로 정제된 54,000달톤(Dalton) 유로키나제 120,000IU/㎎(PERSOLV

RICHTER)을 사용해서 7주된 암컷 Balb/C종 마우스를 면역시켰다. 융합 60일 전에 완전 프로인드 보조제 중의 이 유로키나제 10μ을 마우스의 복막에 주입시켰다.

다른 유로키나제 10μ을 30일 후 마우스에게 투여시켰다. 융합 10일 전에, 꼬리 정맥으로부터 채취한 혈액 시료 중에서 통상의 ELISA 방법으로 항유로키나제 항체 역가를 측정하고, 융합 5일 전에, 항체 역가가 1 : 10,000 이상인 동물에게만 유로키나제 10μ의 최종 부스터를 정맥 내 주입하였다. 이어서, 융합시킨 날에 비장을 제거해서 비장 세포(약 1×10⁸)를 50% PEG 6000중에서 5×10⁷마우스 골수종 X63-Ag8653에 융합시켰다.

실질적으로 씨.밀스테인(C.Milstein) 및 지.쾰러(G.

)의 방법으로 융합시킨 후, 세포를 10% 태내송아지 혈청 및 HAT 배지 [0.1mM 하이포크산틴, 0.25mM아미노프테린, 0.017mM 티미딘, 플로우(Flow) 실험실]로 보충시킨 둘베코의 개질된 이이글 배지(DMEM)중에 재현탁시키고, 마우스 대식 세포(포식층)를 함유하는 5개의 상이한 코스타 플레이트(Costar plate)에 넣었다.

이 HAT 배지를 3일마다 변화시키고, 융합 10일 후부터 상징액을 항유로키나제 모노클론 항체 존재 하에 2-3일마다 ELISA 면역 분석법으로 시험하였다.

b) ELISA에 의한, 항유로키나제 모노클론 항체를 생성하는 하이브리도마의 차페

펄만(Perlman) 방법[Immunochemistry, 제 8 권, 제873페이지(1971년) 참조]의 변형 방법에 의해, 가요성의 96개 웰 마이크로티터 플레이트(well microtitre plate)(Dynatech)를 인산염 완충 염수(pH 7.2) 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.05M 인산 나트륨(pH 7)중의 유로키나제 용액 20μl/ml을 웰당 50μl을 사용하여 코팅시키고, 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 0.05% 트윈(Tween) 20인산염 완충 염수로 세척시킨후, 이 웰을 3% 소혈청 알부민 인산염 완충 염수로 실온에서 3시간 동안 포화시켜서 비특이적 결합을 제거했다. 조심스럽게 세척한 후, 하이브리도마 세포 상징액 50μl(또는 동일부피의 복수액)를 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 이 플레이트를 세척하고, 고추냉이 퍼옥시다제(PI 61, DAKO)로 접합시킨 토끼-항마우스 Ig의 1 : 1000 희석액으로 실온에서 90분 동안 배양시켰다. 충분히 세척시킨 후, 이 플레이트를 0.1M 시트르산염 완층액(pH 5), 1.7mM H₂O₂중에서 색원체 o-페닐렌디아민(SIGMA) 용액 1㎎/ml을 웰당 200μl을 사용하여 배양시켰다 20분 내에 발색시키고, 항원 또는 항체 어느 것도 없는 맹검시료(블랭크)에 대한 흡광도를 492㎚에서 기록하였다. 맹검시료(블랭크) 보다 4배 이상의 색도를 갖는 웰을 양성으로 하였다.

c) 항유로키나제 생성 하이브리도마의 대량 배양

항유로키나제 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하여, 제한 희석법에 의해 클론시키고, 대량 배양 배지내에서 증식시키고, pristane

[2, 6, 10, 14-테트라메틸펜타데칸, 알드리치(Aldrich)] 0.5ml로 미리 처리시킨 Balb/c종 마우스의 복막에 주입시켰다. 복수액을 15일 후에 수집하였다. 항유로키나제 모노클론 항체의 농도 범위는 10 내지 20㎎/ml이었다. 이것들을 프로테인 -A Sepharose 또는 유로키나제 -Sepharose 친화력 크로마토그라피에 의해 정제하였다.

d) Sepharose

-유로키나제 친화력 크로마토그라피를 사용한 항유로키나제 모노클론 항체의 정제

CNBr-활성화 Sepharose HMW를 고도로 순수한 유로키나제(120,000IU/㎎) 반응시켜서 Sepharose-유로키나제 접합체를 제조하였다. 커플링 효율은 팽윤된 겔 ml당 유로키나제 약 20㎎이었다. 이어서, 앞서의 공정에서 얻은 복수액(생성되는 하이브리도마 당 1ml)을 0.01M 인산염 완충액(pH 8.0)중에서 미리 평형시킨 Sepharose-유로키나제 친화력 컬럼(1.6㎝×15㎝)에 걸었다. 동일한 완충액으로 씻어낸 후, 선택적으로 흡수된 항유로키나제 모노클론 항체를 0.1M 초산(pH 3.0)으로 용출시켰다. 이 항체를 함유하는 분획을 한데 모으고, PSDE 09005 Millipore막을 이용해서 한외 여과시켜서 농축시키고, 사용할 때까지 동결시켜서 저장하였다.

e) 겔-전기 영동에 의한 모노클론 항체 제제의 순도 및 균질도 평가

위에서 얻은 모노클론 항체를 더블유.케이.래뮬리(W.K.Laemmli)의 논문, Nature, 제227권, 제680페이지(1970년)에 기재된 방법에 따라 SDS-PAGE소듐 도데실포스페이트 폴리아크릴 겔 전기 영동)시켰다. IgG의 중사슬 및 경사슬에 대응하는 밴드들만이 명백히 나타났다. 이 밴드들은 상기 용출액이 순수한 면역글로블린을 함유하고 있음을 나타내는 것이다.

친화력 상수의 측정

인산염 완충 염수 pH 7(각 0.5ml)중의 20% Sepharose-유로키나제 현탁액의 분취량을 농도가 증가한 정제된 항유로키나제 모노클론 항체 제제[이 제제는 상기 공정 d)의 방법에 의하여 얻고, 인산염 완충액 pH 7중에서 투석시킨 것임]에 첨가하였다. 이 시료를 실온에서 2시간 동안 반전 회전시켰다. 대조물에는 수지를 수용하지 않았다.

결합되지 않은 항체의 농도를 280㎚에서 분광 광도 측정법으로 측정하는 한편, (

), 결합된 항체의 농도는 첨가된 항체의 총량으로부터의 차이에 의해 계산하였다. 모든 결합 측정치를 스캐챠드(Scatchard)의 방법(Amm, N.Y.Acad.Sci.제51권, 제660-672페이지, 1949년)으로 정리하였다. 5B4로 명명된 모노클론 항체의 친화력 상수는 1.42×10⁷lㆍmole^-1이다.

[실시예 2]

활성화된 아가로오스에 항유로키나제 모노클론 항체 5B4의 고정

활성화된 아가로오스[비전하 원자 10개의 긴 스페이서 암(spacer arm)을 갖는 가교결합 아가 로오스 비이드의 N-히드록시 숙신이미드 활성 에스테르 유도체, AFFI-gel 10

, 바이오-라드 인크(Bio-rda Inc.), 14g, 습윤된 것임]를 이소프로필알코올 3부피 및 냉증류수 3부피로 20분 동안 세척하였다. 이어서, 이 겔을 0.1M 중탄산나트륨 완충액(pH 8)중에 재현탁시켰다(최종 부피 20ml), 0.1M 중탄산나트륨 완충액(pH 8) 9.7ml중의 위에서 얻은 고도의 정제된 모노클론 항체 5B4를 겔 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 4시간 경과 후, pH 8의 1M 에탄올아민 염산염 수용액 1.5ml를 첨가해서 수지 중의 미반응 에스테르기를 차단시켰다. 이 차단 반응은 실온에서 1시간 이내에 완결되었다. 이어서, 이 겔을 컬럼에 채우고, 커플링 완충액(0.1M 중탄산염 수용액 pH 8) 10부피로 세척하고, 이어서 0.1M 초산 수용액으로 세척한 후, 1M 염화나트륨 수용액을 함유하는 0.1M 초산 수용액으로 세척하고, 최종적으로 0.5M 염화나트륨 수용액을 함유하는 0.05M 인산 나트륨 완충액(pH 7)으로 세척하였다. 커플링의 효율은 반응 전 후의 상징액 시료를 280㎚에서 분광 광도 측정법으로 평가하였다. 이 시료를 분석 전에 pH 2로 조절시켜서 판독시 N-히드록시 숙신이미드의 간섭을 배제시켰다.

그리하여, 수지 ml당 모노클론 항체 5B4 2.5 내지 4㎎을 고정시켰다.

[실시예 3]

a) 5B4-아가로오스 면역 흡착제의 용량 평가

5B4-아가로오스의 최대 용량은 순수한 유로키나제 및 유로키나제의 조제제를 사용하여 평가하였다. 5B4 아가로오스의 컬럼(1.6×10㎝)을 0.5M NaCl, 0.05M Na-인산염 완충액(pH 7)으로 평형시키고, 용출액에서 에스테르 분해 활성이 검출될 때까지 "순수한"유로키나제(120,000IU/㎎)로 충전시켰다. 이어서, 이 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 효소를 1M NaCl, 0.1M 초산으로 용출시킴으로써 흡착을 제거시켰다. 결합된 분회중에서 획수된 총활성을 컬럼의 최대 용량으로 택하였다.

유로키나제(120,000IU/㎎)의 경우에 있어서, 5B4 아가로오스의 용량은 216,000IU/ml이었다.

유로키나제의 조제제(700IU/㎎)를 사용하여 동일한 실험을 반복하여 174,000IU/ml의 용량을 얻었다.

b) 5B4 아가로오스 상에서의 HMW, LMW 및 18,000 유로키나제 단백질 분해 단편의 면역 흡착

정제된 HMW 유로키나제 30㎎을 0.2M NaCl을 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 8) 1ml 중에서 8시간 동안 배양시켜, HMW, LMW 및 18,000 단백질 분해 단편을 약 4 : 4 : 2의 비율로 각각 얻었다. 이 생성물을 0.2M NaCl을 함유하는 5mM 인산염 완충액(pH 4)중에서 평형시킨, 구멍을 조절시킨 가교된 결합 폴리덱스트란(Sephadex

G 100, 초미세, 1.5×100㎝)을 사용해서 겔-여과에 의하여 분리 및 단리시키고, 동일한 혼합물을 3ml/시간의 유량으로 용출시켰다. 이어서, 단일 생성물을 함유하는 용출 분획을 한데 모았다. 0.1%(v/v) Tween

20을 함유하는 인산염 완충액 염수(pH 7.5)중에 5B4-아가로오스(상기 방법으로 제조됨)의 실질량을 현탁시킨 현탁액을 동일한 완충액 중에 HMW, LMW 또는 18,000 단백질 분해 단편 유로키나제 용액(각각 250㎍/ml) 0.5ml를 함유하는 시험관에 첨가하고, 최종 부피를 동일한 완충액으로 1.5ml로 만들었다.

모든 시료를 실온에서 1시간 동안 반전 회전시키고, 이어서 2000rpm에서 5분 동안 원심 분리시켰다.

결합되지 않은 물질은 280㎚에서 상징액의 흡광도를 읽어 측정하고, 결합된 물질은 첨가된 총량과의 차이에 의하여 측정하였다.

이 실험에서 HMW 유로키나제 및 18,000 단백질 분해 단편의 90%가 5B4-아가로오스에 면역 흡착되는 한편, LMW 유로키나제는 면역 흡착되지 않았다.

[실시예 4]

5B4-아가로오스 상의 면역 친화력에 의한 유로키나제의 정제

크로마토그라피 컬럼(1.6×9㎝)을 실시예 2의 방법으로 얻은 5B4-아가로오스 면역 흡착제로 충전시키고 0.5M 염화나트륨 수용액 및 0.05M 인산염 완충 수용액(pH 7)으로 평형시켰다. 이어서, 조뇨 농축물을 60ml/h의 유량으로 충전시켰다. 평형 완충액으로 세척시킨 후, 유로키나제를 1M 염화나트륨 수용액 및 0.1M 초산 수용액을 사용하여 용출시켰다. 유로키나제를 1M 염화나트륨 수용액 및 0.1M 초산 수용액을 사용하여 용출시켰다. 유로키나제를 함유하는 분획을 한데 모으고, 중화시킨 후, 동결 건조시켰다.

회수된 유로키나제의 특이 활성은 항상 130,000IU/㎎ 이상 이었다. 정량적인 데이타는 다음의 표에 기재하였다.

[표 Ⅱ]

[표 Ⅲ]

HPLC 분석에 의하여 고분자량(54,000) 유로키나제가 존재하고, 저분자량(33,000)유로키나제는 없는 것으로 나타났다.

또한, 얻어진 유로키나제의 순도는 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴 아미드를 사용해서 겔 전기 영동에 의해 확인하였다. 또한, 이 실험은 실제로 5B4-아가로오스에 정제된 유로키나제 생성물이 본질적으로 분자량 54,000MW 유로키나제인 것으로 확인되었다.

이 실험을 여러 번(50회 이상) 반복했을 때 그 결과에는 큰 변화가 없었다.

일관되게, 컬럼에 충전된 피브린 용해 활성의 70 내지 80%는 결합된 분획에서 검출되었다. 비결합 분획을 컬럼에 재충전시킬 경우에, 유출물에서 검출되는 모든 활성은 유로키나제에 기인하는 것이 아니라, 오히려 유로키나제에 관련되지 않은 피브린 용해 활성을 갖는 비특이적 단백질 분해에 관련되는 것으로 여겨진다.

뇨 농출물 대신에 뇨(4ℓ)를 사용하는 것을 제외하고는 본질적으로 상기 방법으로 행하여 실질적으로 상기 특성을 갖는 유로키나제를 얻었다.

[실시예 5]

A₄₃₁세포 상징액의 제조

A₄₃₁세포를 성장 표면이 150㎠인 플라스틱 배양 플라스크(NUNC) 중에서 10% 태내 송아지 혈정[플로우 실험실(Flow Laboratories)제품]. 100유니트/μl의 페니실린, 100ug/ml의 스트렙토마이신[프로우 실험실 제품] 및 2mM 글루타민[플로우 실험실 제품]을 함유하는 둘베코의 개질된 이이글 배지에 교회점까지 증식시켰다. 이어서, 상징액을 한데 모아서 원심 분리시켜서 파괴물(debris)을 제거하고, 사용할때까지 프로테아제 억제제(아프로티닌, 10ug/ml) 존재하에 -80℃에서 저장하였다.

[실시예 6]

5B4-아가로오스 상에서의 면역 흡착에 의해 A₄₃₁세포로부터 단일 사슬 유로키나제 전구체의 정제

상기 실시예 5 에서 얻은 원심분리된 상징액 1.5ℓ를 0.15M NaCl, 0.05M Na-인산염 완충액(pH 7)로 미리 평형시키고, 본질적으로 실시예 2 의 방법으로 얻은 5B4-아가로오스 면역 흡착 컬럼(10㎜×30㎜)에 40ml/시간의 유량으로 적용시켰다. 이 컬럼을 평형 완충액 50ml로 세척하고, 1M NaCl, 0.1M 초산으로 용출시켰다. 분획을 유로키나제 항원 존재하에 5B4 모노클론 항체를 포함하는 이중 항체 샌드위치 면역분석법(다음 실시예 7 참조)에 의해 시험하였다. 얻어진 생성물[단일사슬 유로키나제 전구체, (SC-UK)을 -80℃, pH 4.8에서 저장하였다.

이 생성물의 피브린 용해 활성을 피브린 플레이트 방법 플로우 제이(Plough J.)와 그의 공동 연구자의 Biochem Biophys Acta 제24권, 제278페이지(1957년) 참조]으로 측정하는 한편, 아세틸-리실-메틸-에스테르(ALME)의 아미드 용해 활성을 쉐리(Sherry)와 그의 공동 연구자의 논문 J. Lab Clin Med 제64권, 제145페이지(1964년)의 변형 방법으로 평가하였다. 0.5M NaCl, 0.05M Na-인산염(pH 6)중에서 최종 용적이 0.4ml로 될때까지 정제된 SC-UK(10㎍)을 플라스민(4㎍)(시그마 제품)과 혼합시켜서 활성화시킨 후, 실온에서 배양시켰다. 시료를 상이한 횟수로 아미드 분해 활성에 대하여 평가하였다. 플라스민 반응을 완충액 10 ㎕중에 아프로티닌[리처(Richter)]100㎍을 첨가하여 정지시켰다.

환원 및 비환원성 조건 하에 SDS-폴리아크릴아미드-겔-전기 영동(SDS-PAGE)을 램리 유. 케이의 논문(Laemmli U.K.), Nature, 제227권, 제680페이지(1970년)의 방법으로 행하였다. 면역 분석 실험은 본질적으로 전술한 바와 같이[살레르노 지.(Salerno G.)등의 논문, Proc Natl Acad Sci 미합중국 제81권, 110페이지 참조], 면역 반응 중에 순수한 MAB 5B4, 항유로키나제 및 항조직 PA 항혈청을 사용해서 행하였다.

MAB 5B4의 면역 분석 방식은 AMW-유로키나제와 HMW-유로키나제의 A-사슬로부터 유도된 단백질 분해 단편(18,000)사이의 상호 작용을 나타내는 것이다. 이것은 에피토프가 A-사슬에 위치한다는 것을 나타내는 것이다. HMW-유로키나제를 β-메르캅토에탄올로 환원시켰을 때 어떤 상호 작용도 관찰되지 않는 것은 환원제에 의하여 유발된 구조 변화 때문에 에피토프가 파되었음을 가르키는 것이다.

이 생성물을 SDS-PAGE로 분석하였을 경우, 52,000의 단일 폴리펩티드 사슬에 대응하는 주요 밴드가 나타났다. 이 값은 SDS-PAGE에 의해 평가된 바와 같이, 인체 유로키나제(54,000)의 나타난 분자량보다 약간 적었다. SC-UK의 항유로키나제모노클론 또는 폴리클론 항체의 면역 분석은 단백질이 유로키나제에 면역학적으로 관련된다는 것을 나타내었다. 항조직 PA와는 반응이 일어나지 않았다.

SC-UK는 피브린 용해 및 아미드 분해 활성의 특징을 더 갖는다. SC-UK의 피브린 용해 활성은 피브린 플레이트 방법에 의해 평가되었는데, 그결과는 18,823 I.U./ml(OD₂₈₀) 즉 순수한 54,000 유로키나제의 특이 활성보다 7배 낮았다. 또한, 합성 기질 ALME에서의 아미드 분해 활성은 유로키나제보다 약 12배 낮게 나타났다. 그러나, 플라스민으로 처리한 후의 아미드 분해 활성은 8배 증가되었다.

이러한 증가는 단일 사슬이 전기 영동에 의하여 인체 유로키나제에 유사한 2-사슬의 프로테인으로의 전환되는 것과 관련이 있으며, SC-UK가 인체 유로키나제의 전구체임을 확인시켜 준다.

이 정제에 관련된 정량적인 몇가지 자료를 다음의 표에 기개하였다.

[표 IV]

[실시예 7]

이중 항체 샌드위치 ELISA

가요성의 96개의 웰 마이크로리터 플레이트(FALCON 3912)를 pH 7.2의 PBS 중에서 1 : 200으로 희석시킨(IgGs 10㎍/ml) 정제된 항 UK IgGs(이 제제 방법은 실시예 3 에 기재되어 있음)를 100μl/웰로 사용하여 코팅시키고, 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. PBS-Tween 0.05%로 세척한 후, 이 웰을 PBS-BSA 3% 250μl/웰과 실온에서 2시간 동안 접촉시켜서 코팅하지 않은 플라스틱 표면을 차단시켰다. 이 용액을 폐기 처분한 후, 10% FCS(태내 송아지 혈청) 또는 A₄₃₁세포 상징액 100μl로 보충시킨 둘베코의 개질된 이이글 배지(DMEM, 플로우 실험실)중의 표준 유로키나제의 적당한 희석액 100μl를 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 철야 반응시켰다.

이어서, 마이크로티터를 PBS-Tween 0.05%로 세척하고, PBS-BSA 0.3%, Tween 0.05% 중에 1 : 100으로 희석시킨 5B4-HRP 접합체(이 접합체의 제조 방법은 실시예 9 에 기재됨) 100μl/웰로 37℃에서 30분 동안 배양시켰다.

세척한 후, 이 마이크로티터를 5mM H₂O₂를 함유하는 0.1M 시트르산 나트륨(pH 5)중의 o-페닐렌디아민 1㎎/ml 용액 200μl/웰로 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. 이 반응을 4.5M H₂SO₄로 정지시키고, 492㎚에서 흡광도를 기록하였다.

맹검 시료(블랭크), 표준 용액 및 피검 시료의 흡광도의 평균값을 분리하여 평가하였다. 표준 및 피검 시료로부터 맹검 시료(블랭크)의 흡광도를 뺀후, 피검 시료의 유로키나제 함량을 검정 곡선에서 대응하는 경쟁비 값을 보간법에 의하여 얻었다. 검정 곡선은 대응하는 유로키나제 농도에 대해 각 표준 시료의 492㎚에서의 흡광도를 반 로그 모눈 종이에 도시하는 것이 편리하다. 유효 실험은 분석내 정밀도(CV)가 4% 내지 8%인 한편, 분석간 정밀도(CV)는 일반적으로 7 내지 23%인 것으로 나타났다. 분석 회수율은 87 내지 114%의 범위이다. 항원의 사용 범위는 15 내지 100㎎/ml이다.

[실시예 8]

항 UK 통상의 항혈청으로부터의 항유로키나제 면역 글로블린(IgGs)의 정제

고도로 정제된 54,000 유로키나제(약 120,000IU/㎎)를 사용하는 통상의 고정방법에 의해 토끼의 항 UK 항혈청을 얻었다.

더욱 상세히 말하자면, 건강한 뉴질랜드산 백색종 토끼를 완전 프로인드 보조제 중의 고도로 정제시킨 54,000 유로키나제(약 120,000IU/㎎) 500/㎍으로 고정시켰다.

불완전 프로인드 보조제 중의 동량의 항원 부스터 주사액을 4주, 6주 및 8주 후에 투여하였다. 동물들은 주단위로 혈액을 채취하여, 항유로키나제 항체 역가를 항유로키나제 항혈청 효소 면역 분석법을 사용해서 측정하였다. 12주 후, 동물들의 혈액을 완전히 채취하여 프로테인-A Sepharose를 사용하는 친화력 크로마토그라피에 의해 IgG면역 글로블린 분획을 정제시켰다.

얻어진 항혈청 1ml를 20ml/시간의 유량으로 0.1M 인산염 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형시킨 프로테인 A-Sepharose 컬럼(컬럼 크기 : 1.6㎝×4㎝)에 적용시켰다. 동량의 완충액으로 세척한 후, IgGs를 0.1M 초산(pH 3)으로 용출시켰다. 분획 2ml를 한데 모으고, IgGs 존재를 효소 면역 분석법으로 관찰했다. IgG를 함유하는 분획물을 pH 7.2로 조절시키고, 사용할때까지 -20℃에서 동결 저장했다.

[실시예 9]

고추냉이 퍼옥시다제를 사용한 모노클론 항체 5B4의 표지화

MAB 5B4를 다음 방법에 의해 가교제로서 글루타르알데히드를 사용하여 고추 냉이 퍼옥시다제(HRP)로 표지를 붙혔다. HRP의 분획 10㎎을 1% 글루타르알데히드를 함유하는 0.1M인산나트륨(pH 6.8) 200μl중에 용해시키고, 실온에서 18시간 동안 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 0.9% NaCl에 투석시키고, 동일한 용액을 사용하여 1ml로 하였다. 이어서, MAB 5B4 5㎎을 함유하는 0.9% NaCl 1ml 및 0.5M 탄산나트륨(pH9.5) 200μl를 첨가하고, 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 잔류하는 활성기를 차단시키기 위하여 여기에 0.2M리진 100μl를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 방치시켰다.

이어서, 이혼합물을 0.9% NaCl에 대해 철야 투석시키고, 생리액(유량 14ml/시간)으로 미리 평형시킨 Sephacryl

S-200 컬럼(컬럼 크기 : 1.6㎝×100㎝)을 통해서 겔 여과시켰다. 이 크로마토그라피를 280㎚에서의 투광도에 따라 관찰하였다.

비어 있는 컬럼에서 용출된 피이크를 모으고, 사용할 때까지 -20℃에서 동결저장했다.

Claims

아가로오스, 개질 및 활성화된 아가로오스, 가교 결합 덱스트란, 셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스로부터 선택된 매트릭스에 다음의 특성을 갖는 모노클론 항체를 결합시켜서 얻은, 인체 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 유로키나제 전구체를 정제시키기 위한 면역 흡착제.

a) 이 항체는 IgGl이다.

b) 고정된 인체의 유로키나제에 대한 이 항체의 친화력 상수는(1.42±1.5) ×10⁷lㆍmole^-1이다.

c) 이 항체는 저분자량(33,000MW) 유로키나제에 결합됨이 없이 고분자량(54,000MW) 유로키나제 또는 단일 사슬 유로키나제 전구체에 결합된다.

d) 이 항체는 유로키나제 A-사슬의 18,000 단백질 분해 단편에 결합된다.

e) 이 항체는 유로키나제 이외의 혈청 또는 뇨의 효소적으로 활성인 단백질 분해 효소와 교차 반응하지 않는다.
제 1 항에 있어서, 아가로오스인 매트릭스에 모노클론 항체를 결합시켜서 얻은, 인체 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 유로키나제 전구체를 정제시키기 위한 면역 흡착제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유로키나제 정제 공정에 사용할 경우, 다음의 특성을 갖는 유로키나제 생성물을 얻는 것을 추가 특징으로 하는 면역 흡착제.

a) 피브린 용해역가는 130,000IU/ml 이상이다.

b) 고분자량 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 유로키나제 전구체가 다량 들어 있다.

c) 실제적으로 저분자량의 유로키나제는 없다.

d) 피브린 용해/에스테르 분해 활성비가 2,000 이상이다.

e) 실제적으로 트롬보플라스틴 오염 물질이 없다(200IU/ml 농도에서 응집 활성이 0임).
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단일 사슬 인체 유로키나제 전구체의 정제 공정에 사용될 경우, 다음의 특성을 갖는 인체 유로키나제 전구체를 얻는 것을 추가 특징으로 하는 면역 흡착제.

a) 50 내지 54,000MW의 단일 사슬 프로테인이다.

b) 아미드 분해 활성이 거의 없다.

c) 높은 피브린 활성이 있다.

d) 혈장 억제제에 의해 불활성되지 않는다.

e) 플라스민으로 처리시킴으로써 2-사슬의 활성 플라스미노겐 활성화제로 전환된다.
54,000 MW 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 유로키나제 전구체를 면역 흡착제에 선택적으로 결합시키기 위하여 pH 4.5 내지 8.0 에서 생물학적 공급원 또는 그 농축물을 제4 또는 5항의 면역 흡착제와 접촉시키고, pH 6 내지 8의 완충액으로 씻어낸 후, pH 3.0 내지 4.0의 0.5M 내지 1M 염화나트륨 수용액을 임의로 함유하는 용출액으로 용출시켜서 면역 흡착제로부터 결합된 항원을 방출시키는 것을 특징으로 하는 생물학적 공급원으로부터 54,000 MW 유로키나제 또는 그의 단일사슬 유로키나제 전국체의 정제 방법.
제 5 항에 있어서, 면역 흡착제에 대한 항원의 결합이 최대 농도 0.5M의 염화나트륨 수용액 존재하에서 이루어지는 방법.
제 6 항에 있어서, 다음과 같은 특성을 갖는 유로키나제 생성물을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.

a) 이 생성물의 피브린 용해 역가는 130,000 IU/ml 이상이다.

b) 이 생성물에는 고분자량 유로키나제 또는 그의 단일 사슬 유로키나제 전구체가 다량 들어 있다.

c) 이 생성물에는 실질적으로 저분자량의 유로키나제가 없다.

d) 이 생성물의 피브린 용해/에스테르 분해 활성비는 2,000 이상이다.

e) 이 생성물에는 실질적으로 트롬보플라스틴 오염 물질이 없다(200IU/ml의 농도에서 응집 활성이 0임).

d) 이 생성물의 섬유소 용해/에스테르 분해 활성비는 2,000 이상이다.

e) 이 생성물에는 실질적으로 트롬보플라스틴 오염 물질이 없다(200IU/ml의 농도에서 응집 활성이 0임).