FI86255C - Monoklonal antiurokinase-antikropp, den innehaollande matris och biokemiska testpackningar, i vilka den anvaendes. - Google Patents

Description

1 86255

MONOKLONAALINEN ANTIUROKINAASI-VASTA-AINE, SITÄ SISÄLTÄVÄ MATRIISI JA BIOKEMIALLISET TESTIPAKKAUKSET, JOISSA SITÄ KÄYTETÄÄN

Tämä keksintö koskee monoklonaaliSten uusien I G, vasta- 9 5 aineiden luokkaa, joka kohdistuu humaaniurokinaasin epi -tooppiin ja joka selektiivisesti sitoutuu suuren molekyy-lipainon omaavaan urokinaasiin (54 000) tai sen yksiket-juiseen prekursoriin ilman, että se sitoutuu alhaisen molekyyli pa i non omaavaan urokinaasiin (33 000) ja jolla on 10 affiniteettivakio urokinaasil1 e ja joka on sopiva käytettäväksi immunoadsorptio-perustaisessa puhdistussysteemissä ja joka ei heikennä urokinaasin entsymaattista aktiivisuutta.

Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, kytket-15 tynä sopivaan matriisiin, muodostavat immunoadsorbentti-matriisin, joka kykenee puhdistamaan humaaniurokinaasia tai sen yksiketjuista prekursoria biologisista lähteistä. Nämä immunoadsorbentit, koska niillä on vasta-aineen optimaalinen affiniteetti sen antigeenille, ovat erityisen so-20 pivia puhdistamaan humaaniurokinaasia tai sen yksiketjuis-: ta prekursoria myös teollisessa mittakaavassa.

;·. Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat myös sopivia käytettäväksi analyyttisissä menetelmissä tutkittaessa suurimolekyylistä humaaniurokinaasia (high molecu-25 lar weight human urokinase = HMW urokinaasi) tai sen yksi-ketjuista prekursoria kuten immunofl uoresenss i-perusta i-sissa testeissä, radioimmunotesteissä ja entyysmi-immuno- :/.: testeissä.

• · · « · ·

Humaaniurokinaasi on tunnettu plasminogeeni aktivaattori : *.* 30 (PA), jota tuottavat pääasiassa munua i ssol ut.

Sen pääasiallinen fysiologinen rooli näyttää olevan fib-*’··' rinolyyttisen systeemin aktivaattorina toimiminen. Sen 2 86255 tähden urokinaasia käytetään hoidettaessa akuutteja verisuonisairauksia, kuten sydäninfarktia (myocardial infarct), halvausta, keuhkoveritulppaa, syvien verisuonten verisuonitukoksia, ääreisverenkierron tukkeumia, verenvuotoa ja 5 verkkokalvoiaskimon tukkeumaa.

Plasminogeeniaktivaattorit (PA) ovat seriiniproteaaseja , jotka muuttavat plasminogeenin plasmiiniksi , joka on pro-teaasi, jolla on erittäin suuri spesifisyys fibriiniin, joka on veritukosten pääasiallisesti olennaisin osa. Ai-10 nakin kaksi immunologisesti selvästi erilaista PA-tyyp-piä on eristetty viljellyistä pahanlaatuisista solulin-joista: sellaiset, jotka liittyvät kudos-plasminogeeni-aktivaattoriin (the tissue plasminogen activator = ΤΡΑ) (kts. Rijken D.C., Wijngaard G. Zaal-de Jong M., Wel-15 bergen J. (1979) Biochim.Biophys Acta 380, 140) ja sellaiset, jotka liittyvät uriiniaktivaattoriin (the urinary activator = UPA) (myös kutsuttu urokinaasiksi) (kts. Williams J.R.B. (1951) Br. J. Exp.Pathol. 32 , 530). Uro-kinaasityyppi , alkuaan puhdistettu kaksiketjuisena pro-20 teiinina virtsasta, on äskettäin eristetty proentsyymi-muodossa (nimeltään pro-urokinaasi), esimerkiksi ihmisen epidermoidi-syöpäsoluiinjasta (a human epidermoid carci-..: i noma cell line = HEp^) (kts. Wun T.D., Ossowsky L. ja "*' Reich E. ( 1982) J. Biol. Chem. 257 , 7262), ihmisen glyo- 25 blasmato-soluista (kts. Nielsen L.S. et al . ( 1982) Bio- ·;·· chem 21, 6410), virtsasta (kts. Husain S.C. et al . ( 1983) . Arch. Biochem. Biophys. 220 , 31 ) ja ihmisen pysyvien mu- nuaissolujen linjasta TCL-598 (kts. Kohno T. et al .

(1984) Biotehnol 2, 628). Proentsyymi, joka immunologises-. . 30 ti liittyy urokinaasiin, on äskettäin identifioitu myös *// ihmisen epidermoidi-syöpäsoluiinjan A431 supernatant!sta.

Tämä pro-uroki naas i tsymogeeni on yks i ket ju i nen proteiini, *./ jonka molekyyl ipaino on 50 000 - 54 000 ja jolla ei ole tai on alhainen amidolyyttinen aktiivisuus ja suuri fib-35 riiniaffiniteetti, se on resistentti di - i sopropyyl if 1 uori - 3 86255 fosfaattikäsittelylle ja plasmainhibiittoreiden inakti-vaatiolle (kts. Gurewich et ai. (1984) J. Clin. Invest.

73, 1731 ) ja se voidaan muuttaa kaksiketjuiseksi , aktiiviseksi entsyymiksi (urokinaasiksi) käsittelemällä plas-5 mi ini 11 a.

Humaaniurokinaasimolekyyli on eristetty useissa, biologisesti aktiivisissa muodoissa, mutta pääasiallisesti se muodostuu suuren molekyylipainon omaavasta (molekyylipa!-no noin 54 000) ja alhaisen molekyylipainon omaavasta 10 (molekyylipaino noin 33 000) muodosta. Alhaisen molekyy-lipainon omaava muoto (LMW) johdetaan suuren molekyyli-painon omaavasta muodosta (HMW) entsymaattisesti lohkaisemalla.

HMW-muoto koostuu raskaasta 30 000-ketjusta (B-ketju) ja 15 kevyestä 20 000-ketjusta (A-ketju), jotka ovat sitoutuneet disulfidisidoksella . LMW-muoto koostuu kokonaisesta B-ketjusta, joka sisältää aktiivikohdan ja pienen, pro-teolyyttisesti resistentin fragmentin (molekyylipaino = 2,427), joka on johdettu disulfidisidoksella sitoutunees-20 ta A-ketjusta. A-ketju on proteolyyttisesti pilkkoutunut 18 000-fragmenttiin ja edellä mainittuun 2,427-fragment-: tiin. Näyttää siltä, että LMU-urokinaasi on vähemmän ak- "‘I tiivinen kuin HMW-urokinaasi nopeutettaessa hyytymän liu kenemista in vivo (M. Samama et ai., Thromb. Haemostas.

25 4_0 , 578-580 ( 1979) ja G. Murano et ai., Blood, 55 , 430- -436 (1980)). Humaaniurokinaasia saadaan tällä hetkellä -- pääasiallisesti biologisista lähteistä, kuten ihmisen virt- sasta, kudosvi 1 jel mi stä , erityisesti munuaisten normaaleista ja tuumori soluvi1jelmistä, tavanomaisilla puhdistusmene-30 tel millä. Humaaniurokinaasi-tsymogeenil 1 a voi olla saman- ;*·*: lainen fysiologinen osa, heti kun se on aktivoitu uroki naasiksi.

: Äskettäin on ilmoitettu, että humaaniurokinaasia on tuotet- . *·. tu DNA-teknol og ial 1 a (kts. EPO-patenttihakemus julkaisu- 35 numero 92182).

-t 86255

Monoklonaalisiä vasta-aineita urokinaasia vastaan on kuvattu siitä lähtien, kun pioneerityön monoklonaalisis ta , vasta-ainetta tuottavista soiuhybrideistä esitettiin C. Milstein ja G.Köhler julkaisussa Nature, 256 , 495-497 5 (1975). Esimerkiksi BE-patentissa No 896,253 kuvataan useita monoklonaalisiä vasta-aineita, jotka saadaan immu-noimalla hiiret alhaisen molekyylipainon omaavalla uroki-naasilla (33 000). Nämä monoklonaaliset vasta-aineet ilmeisesti kohdistuvat alhaisen molekyylipainon omaavan uro-10 kinaasin epitooppiin. Näistä vasta-aineista valittiin yksi, nimetty AAU2, ja sitä käytettiin urokinaasin puhdistuksessa (kts. P. Herion ja A. Bollen, Bioscience Reports 2, 373-379, (1983)). Saadun urokinaasin tulisi tietysti sisältää sekä alhaisen että suuren molekyylipainon omaavat 15 muodot. D. Vetterlain ja G.J. Colton kuvaavat urokinaasin puhdistamista immobi1isoitujen , monoklonaaliSten , urokinaasin kevyen ketjun vasta-aineilla. (Thromb. Haemosta s (Stuttgart) 4^> 24-27 (1983). Kuvattu puhdistustekijä on vähemmän kuin 2,4 (alkaen 60 000-70 000 CTA-yksikköä/mg 20 - aina 142 000- 167 000 CTA-yksikköä/mg; kts. sivu 25, oi kea palsta, rivit 10-11), urokinaasisidos immunoadsorbent-tiin kuvatussa kokeessa virtsan kanssa (300 ml virtsaa per 1 ml hartsia); kts. sivu 26, huomautusten toinen kappale ku-•*: ·* vioon 2) ei ole sopiva teollisessa mittakaavassa tapahtu- 25 vaan puhdistamiseen. Lisäksi nämä kirjoittajat tähdentä-· vät, että urokinaasin teollisen puhdistamisen ongelma, käytettäessä monoklonaalista vasta-aine-immunoadsorbent-• tia, on yhä ratkaisematta. ("Kuitenkin tämän affiniteetti- •Y: tekniikan suuremmassa mittakaavassa tapahtuvia käyttöjä 30 täytyy vielä kehittää", sivu 27, vasen palsta, rivit 13-.·. : -14).

* * · 5 86255 EPO-hakemuksessa julkaisunumero 84344 kuvataan eräitä monoklonaalisiä antiurokinaasi-vasta-aineita laveasti ilmaistuina. Esitetään, että ne ovat käyttökelpoisia uroki-naasin puhdistuksessa ja diagnostisissa ja analyyttisissä 5 tarkoituksissa. Kuitenkaan lopullista tuotetta, urokinaa-sia, ei karakterisoida sen sisältämän suuren tai alhaisen molekyylipainon muodolla, eikä sitä karakterisoida sen sisältämän biologisen aktiivisuuden tai myrkyllisyyden avulla. G. Salerno et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 10 sivut 110-114 (1984) kuvaavat muita monoklonaalisiä anti-urokinaasi-vasta-aineita, jotka, kuten myöhemmin esitetään, sitoutuvat sekä suuren että alhaisen molekyylipainon omaaviin urokinaasi-muotoihin ja omaavat affiniteettivakion, joka ei sovellu tehokkaaseen affiniteettikromatografiaan.

15 Muita immunoadsorbentteja , jotka sisältävät monoklonaali-siä "antiurokinaasi"-vasta-aineita, ovat kuvanneet L.S. Nielsen et ai., Biochemistry, 2J_, 6410-6415 ( 1982) ja K. Kaltoft et ai., Proc. Natl . Acad. Sei. USA 7j), 3720-3723 (1982). Kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet estävät plas-20 minogeeni-aktivaattorin, jota he nimittävät HPA 52, entsy-maattisen aktiivisuuden. Kuitenkin matriisiin sitoutuneen vasta-aineen määrä matriis imi 11i1itraa kohti ja lopullisesti modifioidun matriisin kapasiteetit eivät sovellu käytet- • » : täväksi teollisessa mittakaavassa. Lisäksi on tarpeen käyt- 25 tää kahta peräkkäistä kromatografiavaihetta HPA 52:n puh-distami seksi glyopl astoma-sol uvi 1 jel män kasvatusaineesta (katso Taukukko I, sivu 6412).

Tämä keksintö koskee monokl onaal i sta antihumaaniurokinaasi-vasta-ainetta, jolla on seuraavat tunnusmerkit: : 30 a) se on IgG, • · ’ -* * b) sillä on affiniteetti väki o (1,42+ 0,71) x 10^ 1 -1 — :·: moolia immobilisoidul1 e urokinaasi11 e , mitat- taessa olennaisesti menetelmällä, jonka on esittänyt Tsapis et ai. julkaisussa Eur. J. Biochem. 64, • . 35 369 ( 1976) 6 86255 c) se sitoutuu suuren molekyylipainon (54 000) omaa vaan urokinaasiin tai sen yksiketjuiseen prekur-soriin ilman, että se sitoutuu alhaisen molekyy-lipainon (33 000) omaavaan urokinaasiin 5 d) se sitoutuu A-ketjun proteolyyttiseen 18 000- -fragmenttiin e) se ei reagoi ristiin seerumin tai virtsan muiden entsymaattisesti aktiivisten endopeptidaasien kuin urokinaasin kanssa.

10 Koska keksinnön mukaisille monoklonaalisi11 e vasta-aineille on tunnusomaista, että ne sitoutuvat sekä suuren mole-kyylipainon omaavaan urokinaasiin että urokinaasin prekur-soriin, seuraavassa selityksessä ja vaatimuksissa, käsiteltäessä keksinnön mukaisten monoklonaaliSten vasta-aineiden 15 spesifisyyttä ja sitoutumisominaisuuksia , käsitteellä "uro-kinaasi" tarkoitetaan sekä urokinaasin suuren molekyylipai-non omaavaa muotoa että urokinaasi-prekursoreita. Samassa yhteydessä, viitteellä "suuren molekyylipainon omaava uro-kinaasi" on ymmärrettävä tarkoitettavan myös sen prekurso-20 reita, jotka ovat samalla tavalla spesifisesti sitoutuneet keksinnön mukaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa käsitteellä "urokinaa-:·. sin prekursorit" tarkoitetaan urokinaasin "luonnollisia" . yksi keijuisi a prekursoreita, kuten edellä mainittua uroki- 25 naas i-tsymogeen i a sekä uro kinaasi-prekursoreita tai vastaa-via aineita, jotka saadaan rec-DNA-menetelmi 11 ä ja joilla -'·* on yhteisenä piirteenä sitoutuminen keksinnön mukaiseen mo nokl onaal i seen vasta-aineeseen.

Keksinnön mukainen monokl onaal i nen antiurokinaasi-vasta- 30 aine saadaan hiiren "non-secreting"-tyyppisten myelomaso- : ." lujen somaattisesta soi uf uus i osta , t.s. myel omasol u i sta , 1,1 jotka eivät eritä immunogl obul i i ne ja , yhdessä hiiren perna-. solujen kanssa, jotka edeltä käsin on immunoitu urokinaa- silla.

7 86255

Balb/c-hiiret immunoidaan erittäin puhdistetulla 54 000-urokinaasilla ja pernasolut poistetaan ja yhdistetään "non-secreting"-myelomasolujen kanssa, joilla on tietyt geneettiset vaikutukset, jotka tekevät ne kykenemättömik-5 si elämään tietyssä kasvualustassa, joka on erittäin käyttökelpoinen myöhemmin tapahtuvalle hybridisoiujen eristämiselle. Esimerkki tällaisesta solulinjasta on sellainen, joka tunnetaan merkinnällä X63-Ag8653 ja jonka ovat esittäneet Kearney et ai., julkaisussa J. Immunol. 123, 1548-10 -1550 (1979) ja joka on tunnettu ja alan ammattimiehen saatavissa.

Tällaisia myelomasoluiinjoja on yleisesti saatavissa useiden tieteellisten yhdistysten instituuttien välityksellä, tällaisia insituutteja ovat The Salk Institute, Cell 15 Distribution Center, P.O.Box 1809, San Diego, Kalifornia 92112 ja Institute for Medical Research, NI6MS Cell Repository, Copewood and Davis Streets, Camden, New Jersey 08103.

Solufuusio tapahtuu polyetyleeniglykolin, mieluimmin poly-20 etyleeniglykoli (PEG) 6 0 0 0 : n läsnäollessa.

; Erittäin puhdistettua 54 000-urokinaasia (HMW-urokinaasi) ' on kaupallisesti saatavissa monista lähteistä. Sopivalla, erittäin puhdistetulla urokinaasivalmi steel 1 a on korkea tiitteri kansainvälisissä yksiköissä (International Units 25 IU) ilmoitettuna, fibrinolyyttinen/esterolyyttinen aktiivi suussuhde on korkea ja siinä on hyvin alhaisia määriä tai käytännöllisesti katsoen siitä puuttuvat tromboplas-tiiniset epäpuhtaudet. Edullinen erittäin puhdistettu uro-kinaasivalmiste on sellainen, jota myydään kauppanimellä 30 PERSOLV® (Gruppo Lopetit S.p.A.), jonka fibrinolyytti-nen aktiivisuus on korkeampi kuin 100 000 IU/ml, fibrinolyyttinen/ ' esterolyyttinen aktiivisuussuhde on suurempi kuin 1,4, se aikaansaa jäniksillä kuumeen annoksilla, jotka ovat yli 20 000 IU/kg ja sillä : on nolla-koagulantti-aktiivisuus plasmakonsentraatioissa, jotka ovat 35 niinkin korkeita kuin 200 Ul/ml.

s 86255

Immunisaatiokaaviolle on tunnusomaista, että annetaan mieluimmin alhainen annos urokinaasia. Tyypillinen immunisaa-tiokaavio hiirillä on, että ensin annostetaan i.p. alhainen annos erittäin puhdistettua urokinaasia, jonka mole-5 kyylipaino on 54 000 ( 1 20 000 IU/mg; noin 10 yjg) täydellisessä Freundin apuaineessa 60 päivää ennen fuusiota, toinen, yhtä suuri i. p.-injektio epätäydellisessä Freundin apuaineessa annetaan 30 päivää ennen fuusiota ja lopullinen, saman määrän sisältävä i.v.-lisäys 5 päivää ennen fuusiota. 10 Ainoastaan niille eläimille, joilla 10 päivää ennen fuusiota on antiurokinaasi-vasta-aineen tiitteri korkeampi kuin 1:10 000, annetaan lopullinen lisäys ja jatketaan menetelmää .

Pernat poistetaan ja pernasolut yhdistetään myelomasoluihin o η 15 suhteen ollessa noin 10 - 5 x 10 solua. Fuusion jälkeen soluja viljellään sopivassa kasvualustassa, kuten Dulbeccon muunnetussa Eagle-kasvualustassa, joka sisältää noin 10 % kuolleen vasikan seerumia, ja fuusioituneet solut valitaan hypoksantiini-, aminopteriini-, thymidiini-kasvualustal1 a 20 (HAT). Soluviljelmien supernatanttien antiurokinaasi-vasta- aineet testataan ELISA-menetelmi 11ä, joka sisältää "tavanomaisen" antiurokinaasi-antiseerumin. Tällä tavalla identi-fioitujen monoklonaal isten antiurokinaasi-vasta-aineiden puhdistaminen voidaan tehdä ioninvaihtokromatografisesti 25 tai affiniteettikromatografisesti urokinaasi-agaroosipyl- väässä kun taas geel ielektroforeesi on kätevin tapa saadun tuotteen homogeenisuuden arvioimiseksi. Sen jälkeen mono-*.·. klonaalisten antiurokinaasi-vasta-aineiden tällaisten tuot teiden 1uokkaspesifisyys ja affiniteettivakio arvioidaan . . 30 antigeenille, joka on immobi1isoituva agaroosilla. Luokka- spesifisyys arvioidaan Out.cherl onyn kaksoisimmunodiffuusio-tekniikalla (Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26^, 507 (1949)); . V affineettivakio määritetään tasapaino-sitoutumiskokei11 a, jotka suoritetaan olennaisesti menetelmällä, jonka ovat 35 esittäneet Tsapis et ai. (Tsapis A., Rogard N., Alfsen A., 9 86255 ja Nihaesco C. (1976) Eur. J. Biochem. £4, 369). Näissä kokeissa olennaisesti puhtaan, monoklonaalisen vasta-aineen lisääntyvät konsentraatiot, jotka edeltä käsin on dialysoitu fosfaatti puskuroidussa suolaliuoksessa, pH 5 7,2, lisätään urokinaasia sisältävään matriisiin, kuten urokinaasi-agaroosi-matriisiin. Sitoutumattoman vasta-aineen konsentraatio määritetään spektrofotometrisesti, sitoutuneen vasta-aineen konsentraatio lasketaan erotuksena lisätystä kokonaisvasta-ainemäärästä , ja sitoutumisarvot 10 käsitellään lopuksi tunnettujen, tilastollisten menetelmien mukaisesti, kuten menetelmällä, jonka on esittänyt G. Scatchard julkaisussa Ann. N.Y. Acad. Sei. £1^, 660-672 (1949).

Edellä esitetyssä kokeessa tämän keksinnön mukaisella, mo-15 nokionaalisei 1 a vasta-aineella on affiniteettivakio (1,42 - 0,71)x 107 1 mooli'1.

Tämän keksinnön yhtenä kohteena on keksinnön mukaisten monoklo-naalisten vasta-aineiden käyttö immunoadsorptiosysteemissä urokinaasin puhdistamiseksi teollisessa mittakaavassa.

20 Alan ammattimiehelle on selvää, että mikä tahansa mono-klonaalinen vasta-aine, joka kohdistuu tiettyyn antigeeniin (tässä tapauksessa urokinaasiin) ei ole sopiva käy-: tettäväksi teollisessa mittakaavassa. Itse asiassa tiede- tään, että tavallisesti on olemassa kuilu "laboratorio" :*·.. 25 mittakaavan ja "teollisen" mittakaavan menetelmien välil- lä. Muutos suuruusluokassa itse asiassa huomattavasti suu-. .·. rentaa ratkaistavia ongelmia ja monissa tapauksissa liuos, joka on riittävä 1 abaratoriomittakaavaan on sopimaton teollisessa mittakaavassa suoritettavaan menetelmään.

30 Tässä tapauksessa sopivalla, monokl onaal i sei 1 a vasta-ai- neliä tulisi olla optimaalinen affiniteetti antigeenille,1 .·]·. jotta se tehokkaasti sitoisi antigeenin sellaisissa olosuh- teissä, joissa on mahdollista huuhtoa sitoutunut antigeeni *:* ilman, että merkittävästi sitä vapautetaan ja on mahdollista · · • * · ····*· 10 86255 vapauttaa se matriisista merkittävästi erilaisissa olosuhteissa .

Vapauttamisoiosuhteet puolestaan tulisivat olla tarpeeksi lievät, jotta vältettäisiin kaikenlainen antigeenin 5 tai immunoadsorbentin vahingoittuminen.

Koska vasta-aineen affiniteetti antigeenikontrol1 ei 11 e tiettyyn laajuuteen saakka, lopullisen immunoadsorbentin kapasiteetti, vasta-aineen alhainen affiniteetti yleensä liittyy immunoadsorbentin liian alhaiseen kapasiteettiin, 10 jonka seurauksena alhaiset saannot puhdistuksessa (esim. koska aktiviteetti vähenee huuhtomisen aikana); sitä vastoin vasta-aineen korkeaan affiniteettiin liittyy antigeenin liian voimakas sitoutuminen immunoadsorbenttiin, jonka seurauksena alhaiset saannot, johtuen esim. eluoin-15 tivaikeuksista tai liian voimakkaista (ja mahdollisesti denaturoivista) eluointiolosuhteista. Kuitenkin monoklo-naalisen vasta-aineen affiniteettivakio ja vastaavan immunoadsorbentin kapasiteetti eivät yksistään ole kriittisiä parametrejä teollisessa mittakaavassa suoritetussa 20 puhdistusmenetelmässä, joka perustuu immunoadsorptioon, koska myös monoklonaalisen vasta-aineen seiektiivisyys näyttelee erittäin tärkeätä roolia tässä yhteydessä.

:: Itse asiassa keksinnön mukaiset, monoklonaaliset vasta-ai- neet sitovat suuren molekyylipainon omaavan urokinaasin, 25 mutta eivät sido alhaisen molekyylipainon omaavaa muotoa tai seerumin tai virtsan mitään muuta endopeptidaasin entsymaattisesti aktiivista muotoa.

Erityisesti ne eivät reagoi ristiin tunnettujen seerumin tai virtsan tromboplastiinisten epäpuhtauksien kanssa.

r. 30 Lisäksi keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet säilyttävät tämän spesifisyytensä myös sitoutuessaan mat-·' riisiin lopullisessa immunoadsorbenti ssa .

86255

Erityisesti keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on karakterisoitu edellä kuvatulla spesifisyydellä, omaavat kuten jo edellä mainittiin affiniteet-tivakion (1,42 — 0,71)x 10^ 1 moolia"^ edellä kuvatussa 5 kokeessa, kun ne on kytketty sopivaan matriisiin, jolloin saadaan immunoadsorbentti , jonka kapasiteetti on yli 150 000 IU/ml.

Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet kuuluvat siksi IgG^-luokkaan, niillä on affiniteetti vakio noin 10 (1,42 — 0,71)x 10 ^ 1 moolia1^ edellä kuvatussa kokeessa, käytettäessä immobilisoitua urokinaasia, niillä on hyvä spesifisyys suuren molekyylipainon omaavalle urokinaasil-le tai sen yksi ketjuisei 1 e prekursori11 e ilman, että ne sitoutuvat alhaisen molekyylipainon omaavaan muotoon tai 15 reagoisivat ristiin seerumin tai virtsan muiden endopro-teaasien kuin urokinaasin kanssa ja heti kun ne liitetään sopivaan matriisiin, ne pystyvät muodostamaan immunoad-sorbenttimatriiseja, joiden kapasiteetti on yli 150 000 Ul/mg, ja ne pystyvät sitoutumaan antigeeniin pH-arvossa 20 4,5 - 8,0, myös silloin kun läsnä on jopa noin 0,5 M ve sipitoista natriumkloridia ja vapauttavat pH-arvossa 3,0 -- 4,0 sitoutuneen antigeenin 0,5 - 1 M vesipitoiseen natriumklori diin. Keksinnön mukainen, edullinen monoklo- • :1: naalinen vasta-aine on merkitty 5B4 ja se omaa seuraavat ·:**: 25 tunnusmerkit: a) se kuuluu luokkaan IgG^ : b) sillä on affiniteettivakio noin 1,42 x 10^ 1 moo- lia ^ mitattaessa olennaisesti menetelmällä, jonka ovat esittäneet Tsapis et ai. julkaisussa Eur. J.

: 30 Biochem. 64. 369 ( 1976) : c) se sitoo spesifisesti suuren mol ekyyl i pai non (54 000) omaavan urokinaasin tai sen prekursorin ilman, että .1. se sitoo alhaisen mol ekyyl i pa i non (33 000) omaavaa muotoa tai mitään muuta urokinaasissa esiintyvää • · · ·«·»· '2 86255 seerumin tai virtsan tromboplastiinista epäpuhtautta d) se sitoo A-ketjun proteolyyttisen 18 000-fragmentin e) se ei heikennä desorboituneen urokinaasin entsymaat- 5 tista aktiivisuutta f) sillä on isoelektrinen piste noin 5,75.

Tyypillisiä matriiseja, jotka ovat sopivia kytkettäväksi keksinnön mukaisten, monoklonaaliSten vasta-aineiden kanssa, ovat ristiinkytketty dekstraani ja kontrolloidun huo-10 koskoon omaava ristiinkytketty dekstraani, agaroosi, muunnettu ja aktivoitu agaroosi, kuten karboksimetyyliagaroosi, ristiinkytketyn agaroosin N-hydroksisukkinimidiesteri-johdannaiset, selluloosa ja karboksimetyylisei 1 uioosa.

Nämä matriisit ovat useissa tapauksissa kaupallisesti saa-15 tavissa olevia joko aktivoidussa tai ei-aktivoidussa muodossa. Aktivoidut matriisit ovat yleensä edullisia, johtuen tunnetuista kytkentäreaktiossa esiintyvistä edullisista käsittelyeduista.

Edullinen matriisi keksinnön mukaisen immunoadsorbentin 20 valmistamiseksi on aktivoitu agaroosi. Keksinnön mukaisen • .·, monokl onaal i sen vasta-aineen kytkeminen matriisiin voidaan tehdä sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Kun käytetty matriisi on ei-aktivoidussa muodossa, kytkentä suoritetaan : " mieluimmin tunnettujen aktivointi aineiden , kuten syanogee- 25 nibromidin, epikloridiinin, 1 ,4-bis-(2,3-diepoksipropoksi)-butaanin ja 3-ami nopropyyl i tri etoks i s i 1 aani n avulla.

Sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyydestä ; ja antigeeni-affiniteetista johtuen keksinnön mukaisen im- munoadsorbentin yhtenä edullisena käyttömuotona on molekyy-30 lipainon 54 000 omaavan urokinaasin tai sen prekursorin | V puhdistaminen biologisista lähteistä, erityisesti teolli- *: sessa mittakaavassa tapahtuvissa puhdistusmenetelmissä. 1 • · ΐ3 86255

Lisäksi tämä immunoadsorbentti voi olla käyttökelpoinen analyyttisissä testisysteemeissä, kuten radioimmunotes-teissä, entsyymi-sidos-immunotesteissä ja muissa tunnetuissa, kilpailevissa (competitive) sitoutumistesteissä.

5 Tämän keksinnön kohteena on myös menetelmä molekyylipai-non 54 000 omaavan urokinaasin (HMW urokinaasin) tai sen prekursorin puhdistamiseksi biologisista lähteistä, jossa menetelmässä biologinen lähde tai sen konsentraatti saatetaan kosketukseen keksinnön mukaisen immunoadsorben-10 tin kanssa pH-arvossa 4,5 - 8,0, molekyylipainoltaan 54 000 urokinaasin sitomiseksi selektiivisesti keksinnön mukaiseen immunoadsorbenttiin, joka huuhdotaan puskuri-liuoksella pH:n ollessa välillä 6 - 8 ja sitoutunut antigeeni vapautetaan immunoadsorbentistä eluoimalla vesipi-15 toisella liuoksella pH:n ollessa välillä 3,0 - 4,0 ja eluointiliuoksen sisältäessä 0,5 - 1 M vesipitoista nat-riumkloridia.

Tässä menetelmässä antigeenin sitoutuminen immunoadsorbent-tiin voi tapahtua myös vesipitoisen natriumkloridin, jonka 20 konsentraatio on korkeintaan 0,5 M, läsnäollessa, kun taas antigeenin vapauttaminen antigeeni/immunoadsorbentti-komp-leksista voi tapahtua vesipitoisen natriumkloridin, jonka konsentraatio on 0,5 - 1 m, läsnäollessa.

Alan ammattimiehelle on selvää, että vesipitoinen natrium-25 kloridi liuos voidaan korvata millä tahansa vesipitoisella, yhtä vahvalla liuoksella, joka ei epäedullisesti häiritse .·. puhdistusmenetelmän suorittamista.

:A: Tässä selityksessä ja vaatimuksissa termillä "biologiset lähteet" tarkoitetaan biologisia nesteitä, kuten virtsaa 30 ja verta, kudosvi 1 jelynesteitä ja yleisesti käytettyjen mikro-organismien, jotka pystyvät tuottamaan urokinaasia tai plasminogeeniaktivaattoria, jonka keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa, viljely!iemiä.

14 86255

Kuten edellä jo mainittiin keksinnön mukainen immunoad-sorbentti kykenee puhdistamaan suuren molekyylipainon omaavan urokinaasin suoraan biologisista lähteistä; esimerkiksi biologisen lähteen ollessa ihmisen virtsa, saa-5 daan urokinaasi tuote, jolla on seuraavat tunnusmerkit: a) sen fibrinolyyttinen tiitteri on yli 130 000 IU/ml b) siinä on runsaasti suuren molekyylipainon omaavaa urokinaasia c) siitä käytännöllisesti katsoen puuttuu alhaisen mo- 10 1ekyylipainon omaava urokinaasi d) sillä fibrinolyyttinen/esterolyyttinen aktiivisuus- suhde on yli 2 000 e) siitä käytännöllisesti katsoen puuttuvat tromboplas-tiiniset epäpuhtaudet (nolla-koagulantti-aktiivisuus 15 konsentraatioissa noin 200 IU/ml.

Urokinaasituote, jolla on olennaisesti edellä mainitut tunnusmerkit, saadaan lähtemällä mistä tahansa muusta biologisesta lähteestä.

Eräissä tapauksissa, teollisessa mittakaavassa tapahtuvien • 20 puhdistusmenetelmien toteutuksessa, voi olla edullista, että käytetään biologisen nesteen konstraattia itse biol o-gisen nesteen sijasta keksinnön mukaisen immunoadsorbentin ‘ : avulla tapahtuvaan puhdistukseen, jolloin voidaan pienen tää nesteti1avuuksia , jotka saatetaan kosketukseen immuno-25 adsorbentin kanssa (tai jotka valutetaan immunoadsorbenti n sisältävästä pylväästä läpi) ja näin myös vähenee koko menetelmään kuluva aika ja kustannukset pienenevät.

« * · * · * is 86255

Myös tässä tapauksessa keksinnön mukainen immunoadsor-bentti säilyttää tehokkuutensa ja tuottaa puhdistetun tuotteen, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit.

Jotta paremmin voidaan selventää monoklonaalisen vasta-5 aineen valintaan liittyvää ongelmaa, joka vasta-aine on sopiva käytettäväksi puhdistusmenetelmässä, joka on eräs tämän keksinnön kohteista, esitetään seuraavassa taulukossa tulokset, jotka on saatu vertailemalla keksinnön mukaista edullista, monoklonaalista vasta-ainetta, joka 10 on merkitty 5B4, monoklonaaliseen vasta-aineeseen, jonka ovat kuvanneet Salerno et ai.; Proc. Natl . Acad. Sei. USA, 81 , 1 10 ( 1984) ja joka on merkitty (mAB) 105.1F 10, jonka affiniteettivakio on sama kuin 5B4:n.

TAULUKKO I

15 Monoklonaaliset vasta-aineen (mAB) 5B4 ja 105. 1F 10 affiniteettivakiot MAB Ka (1 mooli"^) 105.1F 10 4,92 x 106 5B4 1,42 x 107 20 Nämä kaksi monoklonaalista vasta-ainetta, jotka kuuluvat samaan luokkaan (molemmat ovat IgG^), tuottavat sitoutues-saan yhtä suurissa määrissä yhtä suuriin määriin aktivoi- dö : ·/; tua agaroosia (Affΐ-gel ^ 10) olennaisesti erilaiset tu- .·.·. lokset uroki naas i tuotteiden puhdistuksessa.

25 Erityisesti kun valmisteet, joissa on sama urokinaasipuh-·.*·: taus (897 esterolyyttistä yksikköä), valutetaan läpi kah- ·.·' · desta erilaisesta immunoadsobentistä, sitoutunutta fraktio- ta on vähemmän kuin 10 % kun kyseessä on mAB 105.1F 10 ja yli 70 ¾ (nimittäin 77,5 %) kun kyseessä on mAB 5B4.

: 30 Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, johtuen 16 86255 niiden affiniteetista ja spesifisyydestä tietyn antigeenin suhteen, voivat olla käyttökelpoisia testi- ja havain-tomenetelmissä. Ne voidaan leimata erilaisilla markkereil-la, kuten fluoresoivilla väriaineilla, radioisotoopei11 a 5 ja entsyymeillä ja käyttää immunof1uorosenssi-, radioim-munotesteissä tai entsyymi-immunotesteissä.

Sen tähden tämän keksinnön eräänä toisena kohteena on hu-maaniurokinaasin tai sen prekursorin entsyymi-immunotesti, radioimmunotesti tai immunof1uoresenssitesti tämän keksin-10 nön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen avulla. Humaani-urokinaasi testataan tavallisesti fibrinolyyttisillä tai esterolyyttisillä menetelmillä. Ensiksi mainittu menetelmä perustuu hyytymän liuottamiseen, joka tapahtuu aktivoimalla plasminogeeni plasmiiniksi urokinaasi11 a , kun taas 15 toinen mainituista testeistä perustuu synteettisen substraatin asetyyli-lysyyli-metyyli-esterin (ALME) suoraan hydrolyysiin urokinaasil1 a. Näin ollen nämä testit havaitsevat ainoastaan entsyymin aktiivisen muodon. Urokinaasin inaktiiviset prekursorit, kuten preprourokinaasi tai pro-20 urokinaasi tai inhibiittori-entsyymi-kömpieksit jäävät havaitsematta. Sitä vastoin immunologiet testit, jotka perustuvat molekyylin antigeenisiin ominaisuuksiin eikä sen aktiivisuuteen, mahdollistavat entsyymin aktiivisten ja inaktiivisten muotojen havaitsemisen.

_ 25 Erittäin edullinen immunotestimenetelmä, joka on käyttö- ; “ kelpoinen urokinaasin tai sen "inaktiivisen" prekursorin r ' (kuten urokinaasi-tsymogeenin tai prourokinaasin) havaitse. : semiseksi tai testaamiseksi on kaksoisvasta-aine "sand- : : : wich"-menetelmä, jossa . . 30 a) antigeenin sisältävä testiliuos saatetaan reagoimaan ensimmäisen antiurokinaasi-vasta-aineen kanssa, joka '·* ‘ on immobi 1 i soi tu kiinteälle f aas i kantoa i neel 1 e , anti- Γ-*: geenin sitomiseksi kiinteään faasiin, ,7 86255 b) sitoutunut antigeeni saatetaan kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää toisen antiurokinaasi-vasta-aineen, joka lisäksi on sitoutunut määritettävissä olevaan markkeriin, jossa menetelmässä toinen 5 mainituista ensimmäisestä tai toisesta vasta-ai neesta on keksinnön mukainen, monoklonaalinen vasta-aine, c) antigeeni havaitaan tai testataan sen mukaisesti, missä määrin määritettävissä oleva markkeri on si- 10 toutunut kiinteäfaasiseen kantoaineeseen .

"Ensimmäinen" vasta-aine on mieluimmin antiurokinaasi-antiseerumi, puhdistettu antiurokinaasi-immunoglobuliini 6 (IgG^) tai monoklonaalinen vasta-aine, jonka tiedetään sitoutuvan sellaiseen antigeenin kohtaan, joka eroaa "toisen" 15 vasta-aineen sitoutumiskohdasta (ja joka ilmeisesti ei häiritse mainitun "toisen" vasta-aineen sitoutumista). "Tes-tiliuos" voi olla mikä tahansa liuos, tosin sen tulee sisältää keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen sitoma antigeeni ja sen tulee olla biologinen neste, käymis-20 liemi esim. geneettisesti tuotettujen mikro-organismien käymisliemi tai soluviljelyliemi tai uute. "Toinen" vasta-aine on mieluimmin keksinnön mukainen monoklonaalinen vas-: ta-aine, joka on sitoutunut sopivaan määritettävissä ole- vaan ligandiin, kuten entsyymiin, fluoresoivaan väriai nee-25 seen tai radioaktiiviseen ryhmään. Edullinen, määritettä vissä oleva markkeri on entsyymi ja edullinen "markkeri" on piparjuuriperoksidaasi. Keksinnön mukainen, edullinen monokl onaal i nen vasta-aine on edellä kuvattu, monoklonaa-*V.: linen vasta-aine 5B4.

,·, : 30 Kun sekä "ensimmäinen" että "toinen" vasta-aine ovat mono- » « · klonaalisia (joista toinen on keksinnön mukainen, monoklo-naalinen vasta-aine kun taas toinen on jokin muu monoklo-: naalinen antihumaaniurokinaasi-vasta-aine, joka sitoutuu sellaiseen antigeenin kohtaan, joka eroaa keksinnön mukai- • t I » • · t is 86255 sen vasta-aineen kohdasta, ja jonka sitoutuminen ei häiritse keksinnön mukaisen, monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumista) ovat ne yleensä vaihdettavissa olevia edellä kuvatussa testimenetelmässä. Toisin sanoen toinen näis-5 tä kahdesta, monoklonaalisesta vasta-aineesta voi olla "ensimmäinen" ja toinen voi olla "toinen" tai päinvastoin. Sitä vastoin kun kyseessä on testi, jossa yksi "vasta-aine" on tavanomainen antiseerumi, sitä on melkein yksinomaan käytettävä "ensimmäisenä" vasta-aineena, koska sys-10 teemin tehokkuus on suurempi kuin käänteisessä tilanteessa.

Monoklonaalisen vasta-aineen kytkeytyminen entsyymimarkke-riin tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti. Edullinen kytkentäreagenssi on glutaarialdehydi. Kun määritettävissä oleva markkeri on entsyymi, käytetään väriä 15 kehittävää kromogeenista entsyymisubstraattia, joka on leimatun entsyymin tunnettu synteettinen substraatti, joka entsyymin kanssa inkuboinnin jälkeen muodostaa värillisen johdannaisen, jonka intensiteetti voidaan havaita ja arvioida verrattaessa väriin, joka saadaan testiyhdisteen 20 standardivai mistei11 a. Näiden kvantitatiivisten menetelmien lisäksi, tätä menetelmää voidaan kaikissa tapauksissa käyttää myös kvalitatiivisiin tarkoituksiin, yksinkertaisesti antigeenin läsnäolon havaitsemiseksi tuntemattomassa : näytteessä .

25 Kiinteäfaasinen kantoaine voi olla selluloosakappaleita, ' . polyakryyl iamidi, ristiinkytketty dekstraani , si1ikonikumi , mikrokiteinen lasi ja muovi ja mieluimmin edeltä käsin muo- » * · *”*' toiltu aine, kuten putki, kiekko tai mikrolevy, jotka on • · # valmistettu muovista, kuten pol ystyreen i stä , polypropyl ee-30 nistä tai polyvinyyl istä. Pol yvinyyl imikrol evyt ovat edul- • « V·· linen kiinteäfaasinen kantoaine. Keksinnön mukaisen menetel- ϊΤ: män edullinen käyttöalue on 15 - 100 mg/ml antigeeniä.

;·*·. Alan ammattimiehelle on selvää, että kun testattavissa näyt- 7.1^ teissä antigeenikonsentraatio ei ole näissä rajoissa, näyt- 7* 35 teet täytyy ensin laimentaa tai (jos on tarpeen) konsentroida » • · » • « « « · · 19 86255 jotta vähitellen päästään tähän optimaaliseen konsentraa-tioalueeseen. Sen jälkeen menetelmä osoitetaan oikeaksi arvioimalla inter- ja intra-testin tarkkuus ja analyyttisen saannon prosenttiosuus. Intra-testitarkkuus (CV) on 5 yleensä 4 - 8 %, inter-testitarkkuus (CV) on yleensä 7 - 23 %, kun taas analyyttinen saanto on 87 - 114 %. Keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyys myös urokinaasin kaltaiselle plasminogeeniaktivaatto-riprekursori11 e (yksiketjuinen prekursori), jota tuotta-10 vat humaani-epidermoidiset syöpäsolut (A^ j _sol ut; Fab-ricant, De Larco, Todaro, 1 977 , Proc. Nath. Acad. Sei.

USA 7_4, 565), esitettiin ja testattiin tuotetun prekurso-rin avulla käyttäen keksinnön mukaista menetelmää.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tätä keksintöä, 15 niiden tarkoituksena ei kuitenkaan ole rajoittaa keksintöä.

* 1 • · · · 1 • · · 20 86255 ESIMERKKI 1

MONOKLONAALISEN ANTIUROKINAASI-VASTA-AINEEN 5B4 VALMISTUS

a) MonoklonaaliSten antiurokinaasi-vasta-aineiden tuottaminen 5 Erittäin puhdistettua 54 000 Dalton urokinaasia 120 000 IU/ml (PERSOLV ® RICHTER) käytetään immunoitaessa 7 viikon ikäisiä naaras Balb/C-hiiriä. 10 pg tätä urokinaasia täydellisessä Freundin apuaineessa injektoidaan eläimien vatsakalvoon 60 päivää ennen fuusiota.

10 Hiirille annetaan toinen 10 pg urokinaasia 30 päivää myöhemmin. 10 päivää ennen fuusiota mitataan antiurokinaasi-vasta-aineen tiitteri tavanomaisella ELISA-menetelmäl1ä verinäytteistä, jotka otetaan häntäleskimoista, ja 5 päivää ennen fuusiota annetaan viimeinen annos 10 pg uroki-15 naasia ainoastaan niille eläimille, joilla vasta-aineen tiitteri on enemmän kuin 1:10 000. Sen jälkeen pernat pois- g tetaan fuusiopäivänä ja pernasolut (noin 1x10) yhdistetään 5 x 107 hiiren myelooma X63-Ag8653-soluun 50-prosentti-sessa PEG 6000 : ssa .

·· ; 20 Fuusion jälkeen, joka suoritetaan olennaisesti menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet C. Milstein ja G. Köhler, solut suspendoidaan uudestaan Dulbeccon muunnettuun Eagle-kasvualustaan (DMEM), joka on täydennetty 10 prosentilla kuolleen vasikan seerumia ja HAT-kasvual ustaan (0,1 mmoolia 2 5 hy po k s a n t i i n i a , 0,25 mmoolia aminopteri in ia , 0,017 mmoolia thymidiiniä, Flow laboratories) ja laitetaan viidelle eri : Costar-1 evyl 1 e , jotka sisältävät hiiren makrofaageja (syöt- tökerros).

I"·*: HAT-kasvualusta vaihdetaan joka 3. päivä ja 10 päivää fuu- -***. 30 sion jälkeen joka 2.-3. päivä supernatantit testataan EL ISA-immunotestillä monoklonaaliSten antiurokinaasi-vasta-aineiden toteamiseksi.

21 86255 b) Monoklonaalisen antiurokinaasi-vasta-aineen tuottavien hybridoomien testaus EL. I SA-menetel mä 11 ä

Perlmanin menetelmän muunnoksen mukaisesti (Immunoche-mistry, 8, 873 (1971)), taipuisat 96 koloa sisältävät 5 mi krot i i tter i 1 evy t (Dynatech) päällystetään 50 /j 1 /koi o käyttäen urokinaasin 20 ^g/ml liuosta fosfaatti puskuroi -dussa suolaliuoksessa, pH 7,2, 0,05 M natriumfosfaatissa , pH 7, joka sisältää 0,5 M natriumkloridia, ja inkuboidaan 1 tunti huoneen lämpötilassa. Pestään hyvin 0,05-prosent-10 tisella Tween 20 fosfaattipuskuroidul 1 a suolaliuoksella, kolot kyllästetään 3 % naudan seerumialbumiinia sisältävällä fosfaattipuskuroidul1 a suolaliuoksella 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa epäspesifisten sitoutumisten välttämiseksi. Pestään varovasti, jonka jälkeen 50 μΐ hybridooma-15 viljelmien supernatanttia (tai sama tilavuus askiittines-tettä) lisätään koloihin ja annetaan reagoida kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen levyt pestään ja inkuboidaan 90 minuutin ajan huoneen lämpötilassa kaniini-anti-h i i ri-Ig:n , joka on konjugoitu piparjuuri peroksidaasin 20 (P161 , DAKO) kanssa, 1:1 000 laimennoksen kanssa. Pestään hyvin, jonka jälkeen levyjä inkuboidaan siten, että jokaisessa kolossa on 200 /jl kromogeenin o-f enyl een i d i ami i ni n (SIGMA) 1 mg/ml liuosta 0,1 M sitraattipuskurissa pH 5, 1,7 mM vetyperoksidissa. Väri kehittyy 20 minuutissa ja '·· 25 optinen tiheys luetaan aallonpituudella 492 nm nollakokei-ta vastaan, jotka eivät sisällä antigeeniä eivätkä vasta-ainetta. Kolot, joissa väripitoisuus on 4 kertaa korkeampi kuin nollakokeissa, katsotaan positiivisiksi.

c) Antiurokinaasia tuottavien hybridomien massaviljely 30 Antiurokinaasi- vasta-ainetta tuottavat hybridoomat valitaan, kloonataan rajoittamalla laimennusta, kasvatetaan massavil-• ; missä ja injektoidaan Balb/c hiirten vatsakalvoon ennen kuin hiiret käsitellään 0,5 ml :11a Pristane ® (2 ,6,10,14-: tetrametyyl i pentadekaan i; Aldrich).

22 86255

Aski i ttinesteet kerätään 15 päivän kuluttua. Monoklonaa-listen antiurokinaasi-vas ta-aineiden konsentraatio on 10-20 mg/ml. Ne puhdistetaan joko proteiini-A Sepharose-tai urokinaasi-Sepharose-affini teetti kromatografi sesti.

5 d) Monoklonaalisten antiurokinaasi-vas ta-aineiden puhdistaminen affiniteettikromatografisesti Sepharose ® -urokinaasi 11a

Sepharose-urokinaasi-konjugaatti valmistetaan saattamalla CNBr-aktivoitu Sepharose HMW reagoimaan erittäin puhdiste-10 tun urokinaasin (120 000 IU/ml) kanssa. Kytkeytyrnisteho on noin 20 mg urokinaasia/ml turvotettua geeliä. Edellä saadut askiittinesteet (1 ml per tuottava hybridoma) laitetaan sen jälkeen Sepharose-urokinaasi-affinitettipyi vää-seen (1,6 cm x 15 cm), joka on etukäteen tasapainotettu 15 0,01 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 8,0. Huuhdotaan sa malla puskurilla, jonka jälkeen selektiivisesti adsorboituneet, monoklonaaliset antiurokinaasi-vasta-aineet eluoi-daan 0,1 M etikkahapolla pH 3,0. Vasta-aineen sisältävät fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan uitrasuodatuksel1 a 20 PSDE 09005 Mi 11ipore-membraanei11 a ja säilytetään pakastettuna kunnes sitä käytetään.

e) MonoklonaaliSten vasta-ainevalmisteiden puhteuden ja homogeenisuuden arvioiminen geeli-elektroforeesi11 a

Edellä saadulle monok1onaa1isei 1 e vas ta-aineel1 e suorite-25 taan SDS-PAGE (natrium-dodekyy1ifosfaatti-polyakryy1iamidi-geelielektroforeesei) menetelmän mukaan, jonka on esittänyt W.K. Laemml i julkaisussa Nature 227 , 680 ( 1 970 ). Ainoastaan juovat, jotka vastaavat IgG:n raskasta ja kevyttä ketjua ovat läsnä osoittaen, että edellä saatu eluaatti sisältää 30 puhtaat immunoglobuliinit.

--· f) Affiniteetti vakion määrittäminen • Annokset, joissa on 20 % Sepharose-urokinaasisuspensiota —: fosfaatti puskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7, (jokainen 23 86255 0,5 ml), lisätään puhdistettujen, monoklonaaliSten anti-urokinaasi-vasta-ainevalmisteiden konsentraation lisäämiseksi (nämä valmisteet ovat niitä, jotka saadaan edellä esitetyn d) kohdan mukaisesti ja jotka on dialysoitu fos-5 faattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7). Näytteitä hämmennetään pohjasta ylöspäin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Kontrol1inäytteet eivät sisällä hartsia.

Sitoutumattoman vasta-aineen konsentraatio määritetään spektrofotometrisesti aallonpituudella 280 nm (Ej^m - M), 10 kun taas sitoutuneen vasta-aineen konsentraatio lasketaan erotuksena lisätyn vasta-aineen kokonaismäärästä. Kaikki sitoutumisarvot käsitellään Scatchardin mukaisesti (Amm.

N.Y. Acad. Sei., 5_1_, 660-672, 1949). Monoklonaalisen vasta-aineen, joka merkitään 5B4, affiniteettivakio on 1 5 1 ,42 x 1 07 1 moolia'1.

ESIMERKKI 2

MONOKLONAALISEN ANTIUROKINAASI-VASTA-AINEEN 5B4 IMMOBILI-SOIMINEN AKTIVOIDULLE AGAROOSILLE

Aktivoitu agaroosi (ristiinkytketyn agaroosin N-hydroksi-20 sukkinimidillä aktivoidun esteri johdannaisen helmet, joissa on vapaa, 10 atomia pitkä sivuketju /a charge free 10 atom long spacer arm/; Affi-gel 10 ® ; Bio-Rad Inc.; 14 g, kostea) pestään 3 tilavuudella isopropyylia 1koholia ja 3 tilavuudella kylmää, tislattua vettä 20 minuutin ajan. Sen jäi -25 keen geeli suspendoidaan uudestaan 0,1 M natriumbikarbonaatti puskuri in, pH 8 (lopullinen tilavuus = 20 ml). Erittäin puhdistettu, monoklonaalinen vasta-aine 5B4, joka edellä saatiin, lisätään 0,1 M natriumbikarbonaattipuskurissa , pH 8, (9,7 ml) geelisuspensioon. Neljän tunnin kuluttua huoneen 30 lämpötilassa 1 M vesipitoista etanoliamiini-hydrokloridia pH-arvossa 8 (1,5 ml) lisätään hartsin reagoimattomien es-teriryhmien saipaamiseksi. Saipausreaktio tapahtuu täydellisesti tunnissa huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen geeli 2“ 86255 pakataan pylvääseen, pestään 10 tilavuudella kytkentäpus-kuria (0,1 M vesipitoinen natriumbikarbonaatti, pH 8), sen jälkeen 0,1 M vesipitoisella etikkahapolla, jonka jälkeen 0,1 M vesipitoisella etikkahapolla, joka sisältää 1 M vesi-5 pitoista natriumkloridia, ja lopuksi pestään 0,05 M vesipitoisella natriumfosfaattipuskurilla, pH 7, joka sisältää 0,5 M vesipitoista natriumkloridia. Kytkennän tehokkuus arvioidaan spektrofotometrisesti aallonpituudella 280 nm supernatanttinäytteistä ennen reaktiota ja sen jälkeen.

10 Näiden näytteiden pH säädetään arvoon 2 ennen mittausta, jolloin eliminoidaan N-hydroksisukkinimidin häiriö lukemista .

2,5 - 4 mg monoklonaalista vasta-ainetta 5B4 immobilisoi-tiin hartsimillilitraa kohti.

15 ESIMERKKI 3

a) 5B4-AGAR00SI-IMMUN0ADS0RBENTIN KAPASITEETIN ARVIOIMINEN

5B4-agaroosin maksimi kapasiteetti arvioidaan urokinaasin "puhtailla" ja raaoilla valmisteilla. 5B4-agaroosipyiväs 20 (1,6 x 10 cm) tasapainoitetaan 0,5 M natriumkloridiin , 0,05 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 7, ja lisätään "puhdasta" urokina a siä (120 000 IU/mg), kunnes effluentissa havaitaan esterolyyttinen aktiivisuus. Sen jälkeen pylväs pestään tasapainoituspuskurilla ja entsyymi desorboidaan 25 e 1u o i m a 11 a 1 M natrium kloridi 11a, 0,1 M etikkahapolla.

Kokonaisaktiivisuus, joka saadaan sitoutuneessa fraktiossa, katsotaan pylvään maksimikapasiteetik si.

Urokinaasin (120 000 IU/mg) ollessa kyseessä, 5B4 agaroo-sin kapasiteetti oli 21 6 000 IU/ml .

30 Sama koe toistettiin käyttäen urokinaasin raakaa valmistetta (700 IU/mg) ja kapasiteetiksi saatiin 174 000 IU/ml.

25 86255

b) HMW- , LMW-UROKINAASIN JA UROKI NAAS I N PROTEOLYYTTISEN 18 000-FRAGMENTIN IMMUNOADSORPTIO 5B4 AGAROOSILLA

Puhdistettua HMW-urokinaasia (30 mg) inkuboidaan 8 tuntia 1 ml:ssa 50 mM natriumfosfaattipuskuria , pH 8, joka sisäl -5 tää 0,2 M natriumkloridia , saadaan HMW-, LMW-urokinaasi ja proteolyyttinen 18 000-fragmentti suhteissa noin 4:4:2. Nämä tuotteet erotetaan ja eristetään geelisuodatuksel1 a ris-tiinkytketyllä, kontrolloidun huokoskoon omaavalla poly-doks traani 1 la (Sephadex 100, superfine; 1,5 x 100 cm), 10 tasapaino!tettu 5 mM natriumfosfaattipuskuriin , pH 4, joka sisältää 0,2 M natriumkloridia, ja eluoidaan samalla seoksella virtausnopeuden ollessa 3 ml/tunti. Sen jälkeen eluoi-dut fraktiot, jotka sisältävät yksittäiset tuotteet, kerätään. 5B4-agaroosin (valmistettu edellä esitetyllä tavalla) 15 skalaariset määrät suspensiota fosfaatti puskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7,5, sisältäen 0,1 % (til./til.) Tween ^ 20:tä, lisätään koeputkiin, jotka sisältävät 0,5 ml HMW-, LMW-urokinaasi1iuosta tai urokinaasin proteolyyttistä 1 8 000-fragmentti 1 iuosta ( 250 /jg/ml kulloinkin) samassa pus-20 kurissa ja lopullinen tilavuus säädetään 1,5 millilitraan samalla puskurilla.

Kaikkia näytteitä hämmennetään pohjasta ylöspäin 1 tunti huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen sentrifugoidaan 5 minuuttia 2 000 kierr./min. Sitoutumaton aine määritetään 25 lukemalla supernatanttien optinen tiheys aallonpituudella 280 nm; sitoutumaton aine määritetään erotuksena lisätystä kokonaismäärästä.

Näissä kokeissa yli 90 % HMW-urokinaa sis ta ja proteolyytti-sestä 18 0 0 0 - fragmentis ta immunoadsorboituu 5B4-agaroosi11 e , 30 kun taas LMW-urokinaasi ei immunoadsorboidu.

ESIMERKKI 4 26 86255

UROKINAASIN PUHDISTAMINEN IMMUNOAFFINITE ET I LL A 5B4-AGA-ROOSILLA

Kromatografiapylväs (1,6 x 9 cm) täytetään 5B4-agaroosi-5 immunoadsorbentil1 a , joka saadaan esimerkin 2 mukaisesti, ja tasapainotetaan 0,5 M vesipitoisella natriumkloridil-la ja 0,05 M vesipitoisella fosfaattipuskurilla, pH 7. Raaka virtsakonsentraatti valutetaan sen jälkeen pylvääseen, nopeuden ollessa 60 ml/tunti. Pestään tasapainoitus-10 puskurilla, jonka jälkeen urokinaasi eluoidaan 1 M vesipitoisella natriumkloridilla ja 0,1 M vesipitoisella etikka-h a p o 11 a .

Urokinaasin sisältävät fraktiot yhdistetään, neutraloidaan ja jäädytys kuivataan .

15 Saadun urokinaasin spesifinen aktiivisuus oli aina yli 130 000 IU/mg.

Kvantitatiiviset arvot on annettu seuraavassa taulukossa.

27 86255 Ό"

VO

cd ln => -o- LU CO CM *— \ — X> CO ο ε >—· CM X «3-

x) vo I

c <u ·>

"O

T3 Ό I <C CL) 00 s:

=3 CD

I— '<C I—. * oo x) co cd c

I—( t—» I I VO ^ T

DiC ^ r—

X LU fO O

X) I— CD

Q. O

CL X) O (0 00 O _l Z X) to

LU X) E

ZW S- X3 I—I I—t CD to

Li_ > E CO CO JC *> I—I I—· “v. 00 I UO Q_ · I/)h 3 00 CO I— LU (— ·—> «ej- JZ ΙΟ O. iZ l/l (/) < *— -I- X> +-> CL) X >1

1 I—I CM GO X

wz vn οι—I I—I »'(Οφ

<H t"- CD CO X

Z LU CD O </> CO

o I— ε cd I x O CM 1/) 4-* o ac ·!- cu t—* yC Q- fO 0)

·—I -V C

>— :ro O X X> *—· ·η +-> I I X) -Γ- X) I—I 00 >> to

_l I— I—I 00 X> CD

X) I— <C X) x> < >-za cd x> I— >- O 00 X> to _I *—* —. 1"» *0- CO ’ r > 00>r^ CD VO 00 too

DC iX I—t LU 00 r— VO CD

LU I—· to

)— Z I— fO -iC

(/) LU iX _y C

LUZ< O O

•r-3 *r—3

LO

« A » - ” - cd co r-^ :to :to ' cp? O P-- I— I— :ig :to e e

ZfO CD CD

I LU x> +J

co z co a» cd ·—I t—1 X) c c

U_ I— X) Q) CD

(/0 h— (/0 .- CX B E

·—1 >- M X3 CD CD

*t >- > _ CO CM ·!—·<- Z _IH CM «— ^}- X> X> O O ·—1 r-~. tovo

y Zl— f-', r— CO CD CD

o ►—I yz -— to to y oc< ·.- -γιο to c c c c

Z <D CD

O I- I- Ή VO O VO o o

I— _I I— 00 r~- ID

y ή ε cm x x <C X> X» DC -r- -Γ-

Lx O O

Z Ο Ο ·Γ-·ι- I O I—I I W > >

C X) I— I— X3 I— I— XX

y ui o<tiZ oay toto *=T I— I— 2Ö «I -—· I— Z «t -—» <X H3o:< m X CC 03

Cd X) CO X- ------ OO I— Lx--- tO-Q

TAULUKKO III

28 8 6 2 £ 5

Tromboplastiiniset epäpuhtaudet: nol1a-koaguloituminen 193 IU/plasma-ml (National Heart and Lung 5 Institute, USA: nolla-koa- guloituminen: 80 IU/plasma-ml )

Akuutti myrkyllisyys hiirellä: ei myrkyllinen annoksella 100 000 IU/kg e.v.

10 Systeemin siedettävyys koiralla: annoksella 20 000 IU/kg vaiti mo veren pa i nees sa ei havaittu minkäänlaista merkittävää muutosta HPLC-analyysi osoitti, että läsnä oli suuren molekyylipa!-15 non (54 000) omaava urokinaasi ja alhaisen molekyylipainon (33 000) omaava urokinaasi puuttui.

Saadun urokinaasin puhtaus vahvistettiin myös geelielektro-foreesilla natrium-dodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi 11 a. Myös tämä testi vahvisti, että urokinaasituote, joka puh-20 distettiin 5B4-agaroosi 11 a, oli olennaisesti 54 000 HMW-urokinaasia.

Kokeet toistettiin useita kertoja (yli 50 kertaa) ilman, että tuloksissa havaittiin mitään merkittävää muutosta.

Sen mukaisesti 70-80 % fibrinolyyttisesta aktiivisuudesta, 25 joka pylvääseen laitettiin, havaitaan sitoutuneissa fraktioissa. Kun sitoutumattomat fraktiot laitetaan uudestaan pylvääseen kaikki aktiivisuus löydetään läpivirtauksessa, jolloin mieleen johtuu, että tämä aktiivisuus ei ehkä johdu urokinaasista vaan p i kemmi n k in ei-spesifisistä proteaa-seista, joilla on fibrinolyyttinen aktiivisuus, joka ei ole sukua urokinaasille.

29 86255

Seuraten olennaisesti edellä esitettyä menetelmää, mutta käyttäen virtsakonsentraatin sijasta virtsaa (41), saadaan urokinaasi, jolla on olennaisesti edellä esitetyt tunnusmerkit.

5 ESIMERKKI 5

A431-SOLUSUPERNATANTIN VALMISTUS

A43|-soluja kasvatetaan niiden yhtymiseksi Dulbeccon muunnetussa Eagle-kasvatusalustassa, joka sisältää 10 % kuolleen vasikan seerumia (Flow Laboratories) , 100 yksikköä/^il 10 penisilliiniä, 100 pg/ml streptomysiiniä (Flow Labs.) ja 2 mM glutamiinia (Flow Labs.) muovisissa vi1jelypul1 oissa , kasvupinta-alan ollessa 150 cm (NUNC).

Sen jälkeen supernatant!t kerätään, sentrifugoidaan jäännösten poistamiseksi ja varastoidaan -80°C:ssa proteaasi-15 inhibiittorin (aprotiinin 10 ^ig/ml ) läsnäollessa, kunnes sitä käytetään.

ESIMERKKI 6

YKSIKETJUISEN UROKINAASI-PREKURSORIN PUHDISTAMINEN A^-SOLUISTA IMMUNOAFFINITEETIN AVULLA 5B4-AGAROOSILLA

20 1,5 litraa sentrifugoitua supernatanttia , joka saadaan edellä olevan esimerkin 5 mukaisesti, valutetaan 5B4-aga-roosi-immunoadsorbenttipyivääseen (10 mm x 30 mm), joka saadaan olennaisesti esimerkin 2 mukaisella menetelmällä ja joka etukäteen tasapainoitetaan 0,15 M natriumkloridi1 -25 la, 0,05 M natriumfosfaattipuskurilla , pH 7, virtausnopeuden ollessa 40 ml/tunti. Pylväs pestään 50 ml :11a tasapaino! tuspuskuria, eluoidaan 1 M natriumkloridi11 a , 0,1 M etikkahapol 1 a. Fraktiot testataan urokinaasiantigeenin läsnäolon toteamiseksi kaksoisvasta-aine "sandwich" immunoko-30 keella, jossa käytetään monoklonaalista 5B4 vasta-ainetta (katso esimerkki 7 jäljempänä). Saatu tuote (yksiketjuinen 30 86255 urokinaasi-prekursori; single chain urokinase precursor = SC-UK) varastoidaan -80°C:ssa, pH-arvossa 4,8.

Tämän tuotteen fibrinolyyttinen aktiivisuus määritetään fibriini1evymenetelmällä (katso Plough, J. et ai. ( 1 957 ) 5 Biochim. Biophys Acta 24, 278), kun taas amidolyyttinen aktiivisuus asetyyli-1ysyyli-metyyliesteri 11ä (ALME)a rvioi-daan muunnoksella menetelmästä, jonka ovat esittäneet Sherry et ai. (1946) J. Lab . Cli n.Med. 64 , 145. Aktivointi suoritetaan sekoittamalla puhdistettu SC-UK (10 jjg) plas-10 miinin (4 ;jg) (Sigma) kanssa, lopullisen tilavuuden ollessa 0,4 ml 0,5 M natriumkloridissa, 0,05 M natriumfosfaatti-puskurissa, pH 6, jonka jälkeen inkuboidaan huoneen lämpötilassa. Näytteet tutkitaan eri aikoina amidolyyttisen aktiivisuuden toteamiseksi. P1a smiinireaktio pysäytetään li-15 säämällä 100 jug aprotiinia (Richter) 10 piissä puskuria.

SDS-polyakryyliamidi-geeliel ektroforeesi (SDS-PAGE) pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa suoritettiin menetelmän mukaan, jonka on esittänyt Laemmli U.K. (1970)

Nature 227 , 680 ; immunoväl ityskokeet suoritettiin olennai-20 sesti edellä esitetyllä tavalla (Salerno G. et ai. (1984) Proc. N a 11. Acad. Sei. USA 81, 110) käyttäen immunoreak-tiossa puhdasta, monokl onaal ista vasta-ainetta (MAB) 5B4:ää, antiurokinaasia ja antikudos PA-antiseerumia.

MAB 5B4:n immunovälitteinen malli osoittaa, että HMW-uro-25 kinaasin ja HMW-urokinaasin A-ketjusta johdetun proteolyyt-tisen fragmentin (18 000) välillä on vuorovaikutusta. Tämä osoittaa, että epitoopin täytyy sijaita A-ketjussa. Se tosi seikka, että minkäänlaista vuorovaikutusta ei havaita pelkistettäessä HMW-u rok i naa s i / "λ-merkaptoetanol i Π a osoittaa, 30 että rakenteelliset muutokset, jotka aikaansaadaan pelkistävällä reagenssilla, tuhoavat epitoopin.

Tuotteen SDS-PAGE-analyysi todistaa, että pääjuova vastaa yksittäistä polypeptidiketjua , jonka molekyylipaino . 52 000. Tämä arvo on hiukan pienempi kuin humaaniurokinaasin 31 86255 ilmeinen molekyylipaino (54 000), joka todettiin SDS--PAG E: 11 ä . SC-UK:n immunovälitys monoklonaali sella anti-urokinaasi- tai polyklonaalisella vasta-aineella osoittaa, että proteiini on immunologisesti sukua urokinaasi11 e.

5 Minkäänlaista reaktiota ei havaittu antikudos-PA:n kanssa.

SC-UK karakterisoitiin edelleen sen fibrinolyyttisen ja amidolyyttisen aktiivisuuden perusteella. SC-UK:n fibrino-lyyttinen aktiivisuus arvioitiin fibriini1evymenetelmäl1ä, tuloksena saatiin 18 823 IU/ml (O^gg), tämä on 7 kertaa 10 alhaisempi kuin puhtaan 54 000-urokinaasin spesifinen aktiivisuus, Myös amidolyyttinen aktiivisuus synteettisellä substraatilla ALME antoi tulokseksi noin 12 kertaa alhaisemman arvon kuin mitä saadaan urokinaasi11 a. Kuitenkin amidolyyttinen aktiivisuus nousi kahdeksan kertaiseksi 15 plasmiini-käsittelyn jälkeen. Tällainen lisäys osoittaa, että yksiketjuinen muuttuu kaksiketjuiseksi proteiiniksi, joka on elektroforeettisesti samanlainen kuin humaani-urokinaasi, vahvistaen, että SC-UK on humaaniurokinaasin prekursori.

20 Eräitä kvantitatiivisia arvoja, jotka liittyvät tähän puhdistukseen, on esitetty seuraavassa taulukossa.

32 86255

CD CO

00 C\J

CM I I CO

μ Ω CO

ZD O *-

C

Φ «/) £ sf

c >, c CO

•r* a; I I o <T5 -M _C O *

-M CLT- CO O

on O -Pcvj

(1) I I

4_> .,- C l/> -Ml ro O -M T- 4- > O >> > ίϋ i- >>·»- C fO I— ·*- ^

5- on O +-> f— O

Φ (0 C E I I 03 Q, I ·γ- Π3 \ VO r- 3 «xf S- to I—· I— on CO -O C 13 ZD <u

3 LO -r- Φ ---- <U

I— u_ c: on ►—· o ··“ o

·—· on -M

•—I I on O

*- <D <o c O CO to *r- 3 «3- ·«- c e ^ <c μ- φ e ZD 03 <U CD LO Γ“-- ·ι—

_ICS- CD ·» « * I

ZD (U CD *<~ O CM CO =

«£ CO 4-> O VO -C

h- ·»— -*-> C O

E (T3 Π3 03 E I 5

-MO··- “O

on £- co c •I- Pö ro Ό ··— Π3 on _c-M c ° r- = 3 +-> 'i—CJ) Λ * *» Q_ <D :r0 3^ LO vO VO <1> a; on o ' vo r-x c . * C -M on L· CM *— ·«— • · ··— :o zd

^ c :(0 I

ZD --- > Π3 I Vj_ i— 4-> O M- >> on on

CO <T3 Q- 3 fO

3 ^ > > I— CD CD vo vo fC E CD LO *1—

r- ^ O

•r- X— <— L0 I— «3 C 03 o c a> -m +-> zs

C 03 3 -M

‘.: o ··— ε c -m *·- Π3 3 O 3 Ο 03 -M I 4-) -r- 4-> -f- 4-> ^ 03 3 -M 3 +-> T-

<o CD O E

, . S- (O +J (tj P iO

Li_ ro *r- s- ·Γ- C- QC on 4— (/14- Π3 ESIMERKKI 7 33 86255

KAKSOISVASTA-AINE "SANDWICH” ELISA

Taipuisat 96 koloa sisältävät mikrotiitterilevyt (FALCON 3912) päällystetään käyttäen 100 pl/kolo puhdistettua anti-5 UK IgGs:ää (menetelmä tämän valmistamiseksi on esitetty jäljempänä esimerkissä 8) laimennettuna 1:200 PBSrssä pH

7,2 (10 pg/ml IgGs:ää) ja inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Pestään PBS-Tween'in 0,05-prosenttisel1 a liuoksella, jonka jälkeen kolot saatetaan kosketukseen 250 yUl/kolo PBS-10 -BSA:ta 3 I 2 tuntia huoneen lämpötilassa päällystämättömän muovipinnan sulkemiseksi. Sen jälkeen kun tämä liuos on hylätty, jokaiseen koloon lisätään 100 pl standardi-urokinaasin sopivaa laimennosta Dulbeccon muunnetussa Eagle-kasvatusalustassa (DMEM, Flow Labs.) täydennettynä 15 10 % FCS:ää (kuolleen vasikan seerumia), tai 100 pl soiusupernatanttia ja jätetään reagoimaan yön yli 4°C:ssa. Sen jälkeen mikrotiitterit pestään 0,05-prosenttisei 1 a PBS-Tween-1 iuoksel 1 a ja inkuboidaan käyttäen 100 pl/kolo 5B4-HRP-konjugaattia (menetelmä tämän valmistamiseksi on 20 esitetty jäljempänä esimerkissä 9) laimennettuna 1:100 PBS-BSA:ta 0,03 %, Tween 0,05 % 30 minuutin ajan 37°C:ssa.

Pestään, jonka jälkeen mikrotiittereitä inkuboidaan lisäten 200 pl/kolo o-fenyleenidiamiinin 1 mg/ml-1iuosta 0,1 M natriumsitraati ssa, pH 5, sisältäen 5 mM vetyperoksidia, 30 25 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään 4,5 M rikkihapolla ja optinen tiheys luetaan aallonpituudella 492 nm. Nollakokeen, standardiliuosten ja testinäytteiden optisten tiheyksien keskiarvot arvioidaan erikseen. Sen jälkeen kun nollakokeen optinen tiheysarvo on vähennetty standardiar-30 voista sekä testinäytteiden arvoista, saadaan testinäytteiden urokinaasipi toisuus interpoloimal1 a vastaavat vertailuarvot kaiibrointikäyrältä. Ka 1 ibrointikäyrä piirretään tavallisesti puoli1ogaritmi paperi 11 e, asettaen jokaista 34 86255 standardinäytteen aallonpituudella 492 nm luettua optista tiheyttä vastaamaan vastaava urokinaasikonsentraatio. Pätevät kokeet osoittavat, että kokeessa tarkkuu (CV) vaih-telee 4 % - 8 %; kun taas kokeiden välillä tarkkuus (CV) 5 on yleensä 7 - 23 %. Analyyttinen saanto oli 87 - 114 %. Käyttäalue on 15 - 100 mg/ml antigeeniä ESIMERKKI 8

ANTIUROKINAASI-IMMUNOGLOBULIININ (IgGs) PUHDISTAMINEN TAVALLISESTA ANTI-UK-ANTISEERUMISTA

10 Kaniinin anti-UK-antiseerumi saatiin tavallisten immunoin-timenetelmien mukaisesti käyttäen erittäin puhdistettua 54 000-urokinaasia (noin 120 000 IU/mg).

Tarkemmin sanottuna terveet, valkoiset New Zealand-kanii-nit immunoiti in 500 /jg:lla erittäin puhdasta 54 000-uro-15 kinaasia (noin 120 000 IU/mg) täydellisessä Freundin apu-a i neessa.

Viimeiset injektiot, joissa on sama määrä antigeeniä epätäydellisessä Freundin apuaineessa, annostetaan 4,6 ja 8 viikon kuluttua. Eläimiltä otetaan verta jonkin verran ja 20 antiurokinaasi-vasta-ainetiitterit määritetään käyttäen antiurokinaasi-antiseerumientsyymi-immunokoetta. 12 viikon kuluttua eläimiltä otetaan kaikki veri ja IgG-immuno-globuliinifraktio puhdistetaan affiniteettikromatografial-la proteiini-A-Sepharosella.

25 Yksi ml saatua antiseerumia laitetaan proteiini-A-Sepharose-pylvääseen (pylvään koko: 1,6 cm x 4 cm), pylväs on etukäteen tasapainoitettu 0,1 M natriumfosfaattipuskuri 11 a , pH 8, virtausnopeuden ollessa PO ml/tunti. Pestään samalla puskurilla, jonka jälkeen IgGs eluoidaan 0,1 M etikkahapol-30 la, pH 3. Kerätään 2 ml:n fraktiot ja IgGs:n läsnäolo todetaan entsyymi-immunokokeel1 a. Fraktioiden, jotka sisältävät IgGs:ää, pH säädetään arvoon 7,2 ja säilytetään pakastettuna -20°C:ssa, kunnes ne käytetään.

ESIMERKKI 9 35 86255

MONOKLONAALISEN VASTA-AINEEN 5B4 LEIMAAMINEN PIPARJUURI-PEROKSIDAASILLA

MAB 5B4 (monok1onaa1inen vasta-aine 5B4) leimataan pipar-5 juuriperoksidaasilla (horse-radish peroxidase = HRP) käyttäen glutaarialdehydiä ristiinkytkevänä reagenssina seuraavan menetelmän mukaisesti. 10 mg:n annos HRP:tä liuotetaan 200 ^1 :aan 0,1 M natriumfosfaattia , pH 6,8, joka sisältää 1 % glutaarialdehydiä, ja jätetään reagoimaan huo-10 neen lämpötilaan 18 tunnin ajaksi. Reaktioseos dialysoi-daan 0,9 % natriumkloridia vastaan ja tilavuus säädetään 1 ml:k s i samalla liuoksella. Sen jälkeen 1 ml 0,9 % natrium-kloridia, joka sisältää 5 mg MAB 5B4:ää ja 200 μΐ 0,5 M natriumkarbonaattia, pH 9,5, lisätään ja annetaan reagoida 15 24 tuntia 4°C:ssa. Jäljellä olevan aktiiviryhmän salpaami- seksi lisätään 100 μΐ 0,2 M lysiiniä ja annetaan seistä huoneen lämpötilassa 2 tuntia.

Sen jälkeen seos dialysoidaan yön yli 0,9 % natriumkloridia 65) vastaan ja geelisuodatetaan Sephacryl S-200-pylväästä lä-20 pi (pylvään koko: 1,6 cm x 100 cm), pylväs on etukäteen tasapainoitettu fysiologisella liuoksella (virtausnopeus 14 ml/tunti). Kromatografiaa tarkkaillaan seuraamalla transmittanssia aallonpituudella 280 nm.

Piikki, joka eluoituu pylvään tilavuudella, kerätään ja pi-25 detään pakastettuna -20°C:ssa kunnes käytetään.

Claims (12)

36 80255

1. Monoklonaalinen antihumaaniurokinaasi-vasta-aine, jolla on seuraavat tunnusmerkit: 5 a) se on IgGlf b) sillä on affiniteettivakio (1,42 ± 0,71) x 107 1 mooli'1 immobilisoidulle humaaniurokinaasille, 10 c) se sitoo suuren molekyylipainon (54 000) omaavan urokinaasin ja/tai sen yksiketjuisen urokinaasiprekurso-rin, ilman että se sitoo alhaisen molekyylipainon (33 000) omaavaa urokinaasia, 15 d) se sitoo urokinaasin A-ketjun proteolyyttisen 18 000 -fragmentin, e) se ei reagoi ristiin muiden seerumissa tai virtsassa 20 esiintyvien entsymaattisesti aktiivisten endopeptidaasien kuin urokinaasin kanssa, f) se ei vähennä urokinaasin entsymaattista aktiivisuutta, 25 g) sillä on isoelektrinen piste noin 5,75, h) se saadaan viljelemällä hiiressä tai sopivassa vilje-lyalustassa hybridoomaa, joka on valmistettu suorittamal- 30 la hiiren, joka on immunisoitu urokinaasilla, jonka mole-kyylipaino on 54 000, solujen somaattinen fuusio hiiren myeloomasolujen kanssa fuusiopromoottorin läsnäollessa, ja seulomalla toivotut tuottavat hybridoomat suorittamalla ELISA-määritys tavanomaisella antiurokinaasi-antisee-35 rumilla, ja määrittämällä tuotetun vasta-aineen luokka-spesifisyys, affiniteettivakio ja spesifinen epitooppi. 37 86255

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen antihu-maaniurokinaasi-vasta-aine, tunnettu siitä, että kun se kytketään sopivaan matriisiin, se kykenee sitomaan antigeenin pH-arvossa 4,5 - 8,0, vieläpä kun läsnä on 0,5 5. vesipitoista natriumkloridia ja vapauttaa sitoutuneen antigeenin pH-arvossa 3,0 - 4,0 0,5 - IM vesipitoiseen natriumkloridiin.

3. Immunoadsorbentti humaaniurokinaasin ja/tai sen yksi-10 ketjuisen urokinaasi-prekursorin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se saadaan yhdistämällä patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine matriisiin, joka on agaroosi, muunnettu tai aktivoitu agaroosi, ristiinkytketty dekstraani, selluloosa tai 15 karboksimetyyliselluloosa.

4. Menetelmä urokinaasin, jonka molekyylipaino on 54 000, tai sen yksiketjuisen urokinaasi-prekursorin puhdistamiseksi biologisista lähteistä, tunnettu siitä, 20 että biologinen lähde tai sen konsentraatti saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 3 mukaisen immunoadsor-bentin kanssa pH-arvossa 4,5 - 8,0 urokinaasin, jonka molekyylipaino on 54 000, tai sen yksiketjuisen urokinaasi-prekursorin sitomiseksi selektiivisesti immunoadsor-25 benttiin, huuhdotaan immunoadsorbentti puskuroidulla liuoksella pH-arvossa 6-8, ja sitoutunut antigeeni vapautetaan immunoadsorbentista eluoimalla eluenttiliuok-sella, joka mahdollisesti sisältää 0,5 - 1 M vesipitoista natriumkloridia pH-arvossa 3,0 - 4,0. 30

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenin sitoutuminen immunoad-sorbenttiin tapahtuu vesipitoisen natriumkloridin, jonka konsentraatio on enintään 0,5 M, läsnäollessa. 35 38 8 6 2 ϋ 5

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadulla urokinaasituotteella on seuraavat tunnusmerkit: 5 a) sen fibrinolyyttinen tiitteri on yli 130 000 IU/ml, b) siinä on runsaasti suuren molekyylipainon omaavaa urokinaasia tai sen yksiketjuista urokinaasi-prekursoria, 10 c) siitä käytännöllisesti katsoen puuttuu alhaisen molekyylipainon omaava urokinaasi, d) sen fibrinolyyttinen/esterolyyttinen aktiivisuussuhde on yli 2000, 15 e) siitä käytännöllisesti katsoen puuttuvat tromboplas-tiiniset epäpuhtaudet (nolla-koaguloitumisaktiivisuus konsentraatiossa 200 IU/ml).

7. Menetelmä monoklonaalista antiurokinaasi-vasta-ainetta tuottavien hybridoomien valmistamiseksi, jotka viljelemisen jälkeen kykenevät tuottamaan patenttivaatimuksen 1 mukaista antiurokinaasi-vasta-ainetta, tunnettu siitä, että suoritetaan hiiren, joka on immunisoitu uro-25 kinaasilla, jonka molekyylipaino on 54 000, pernasolujen fuusio hiiren X63-Ag8653-myeloomasolujen kanssa fuusio-promoottorin läsnäollessa, ja toivotut tuottavat hybri-doomat seulotaan suorittamalla ELISA-määritys tavanomaisella antiurokinaasi-antiseerumilla, ja määrittämällä 30 tuotetun vasta-aineen luokkaspesifisyys, affiniteettiva-kio ja spesifinen epitooppi.

8. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen monoklonaali-sen antiurokinaasi-vasta-aineen valmistamiseksi, t u n -35 n e t t u siitä, että viljellään hiiressä tai sopivassa viljelyalustassa patenttivaatimuksen 7 mukaisesti saatua hybridomaa. 39 86255

9. Kaksoisvasta-aine-"sandwich"-menetelmä antigeenin detektoimiseksi tai määrittämiseksi, joka antigeeni on humaaniurokinaasi tai sen prekursori, tunnettu siitä, että 5 a) antigeenin sisältävä testattava liuos saatetaan reagoimaan ensimmäisen antiurokinaasi-vasta-aineen kanssa, joka on immobilisoitu kiinteäfaasi-kantoaineelle, antigeenin sitomiseksi kiinteään faasiin, 10 b) sitoutunut antigeeni saatetaan kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää toisen antiurokinaasi-vasta-aineen, johon on lisäksi liitetty määritettävissä oleva markkeri, jolloin toinen mainituista ensimmäisestä ja toisesta 15 vasta-aineesta on patenttivaatimuksen 1 mukainen mono-klonaalinen vasta-aine, c) antigeeni detektoidaan tai määritetään sen mukaisesti, miten suuri määrä määritettävissä olevasta markkerista on 20 sitoutunut kiinteäfaasi-kantoaineeseen.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty ensimmäinen vasta-aine on antiurokinaasi-antiseerumi, puhdistettu antiurokinaasi- 25 immunoglobuliini G (IgGs) tai monoklonaalinen vasta-aine, jonka tiedetään sitoutuvan sellaiseen kohtaan antigeeniä, joka eroaa toisen monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumiskohdasta, ja käytetty toinen vasta-aine on patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine. 30

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteäfaasi-kantoaine koostuu selluloosakappaleista tai on polyakryyliamidi, ristiinkytketty dekstraani, silikonikumi, mikrokiteinen lasi tai 35 muovi. « 86255

12. Biologinen testipakkaus (kit) suuren molekyylipainon (HMW) omaavan humaaniurokinaasin tai sen yksiketjuisen prekursorin testaamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää 5 a) kiinteäfaasi-kantoaineen, joka on immobilisoinut pinnalleen ensimmäisen antiurokinaasi-vasta-aineen, joka on antiurokinaasi-antiseerumi, puhdistettu antiurokinaa-si-IgG(s) tai monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu 10 antigeenissä kohtaan, joka eroaa toisen vasta-aineen sitoutumiskohdasta, ja b) liuoksena tai lyofilisoituna valmisteena toisen antiurokinaasi-vasta-aineen, johon on sitoutunut määritet- 15 tävissä oleva markkeri ja joka on patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine.