NO172549B - Monoklonalt humanurokinase-antistoff, immunoabsorberende middel for rensing av humanurokinase samt anvendelse av antistoffet for detektering av humanurokinase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedører monoklonalt humanurokinase-antistoff, immunoabsorberende middel for rensing av human-urokinase samt anvendelse av nevnte monoklonale antistoff i en dobbelt antistoff-"sandwhich"-metode for detektering eller analyse av et antigen valgt fra humanurokinase og/eller en forløper for denne.

Oppfinnelsen omhandler en klasse nye IgG^ monoklonale antistoffer rettet mot en epitop på humanurokinase, som selektivt bindes til urokinase med høy molekylvekt (54.000), eller en enkeltkjedet forløper derav, uten å bindes til urokinase med lav molekylvekt (33.000), har en affinitetskonstant for urokinase som er egnet for bruk i et immuno-adsorbsjonsbasert rensesystem, og som ikke svekker den enzymatiske aktivitet til urokinase.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen gir, når de er koblet med en egnet matrise, en immunoadsorberende matrise som kan rense humanurokinase eller en enkeltkjedet forløper for denne fra biologiske kilder. Disse immunoadosrberende stoffene er på grunn av den optimale affiniteten til antistoffet for dets antigen særlig egnet for rensing av humanurokinase eller en enkeltkjedet forløper for denne også i industriell målestokk.

Foreliggende monoklonale antistoffer er også egnet for bruk i analytiske metoder for detektering av humanurokinase av høy molekylvekt (HMVJ urokinase) eller en enkeltkjedet forløper for denne, slik som immunofluorecens-baserte analyser, radioimmunoanalyser og enzym-immunoanalyser.

Humanurokinase er en kjent plasminogen-aktivator (PA) som hovedsakelig produseres av nyreceller. Den fysiologiske hovedrolle synes å være som aktivator for det fibrinolytiske system. Urokinase er derfor indikert for behandling av aktutte vaskulære sykdommer slik som myokardialt infarkt, slag, pulmonær embolisme, dypåre-trombose, perifer arteriell okkulsjon, blødning og retinal åreokkulsjon.

Plasminogen-aktivatorer (PA) er serin-proteaser som omdanner plasminogen til plasmin, en protease med høy spesifisitet for fibrin som er hovedbestanddelen i størknet blod. Minst to immunologisk forskjellige typer av PA-materialer har blitt isolert fra dyrkede ondartede cellelinjer; De som er relatert til vevsplasminogen-aktivatoren (TPA) (se Rijken D.C. Wijngaard G. Zaal-d Jong M., Welbergen zj . (1979) Biochim. Biophys Acta 380, 140), og de som er relatert til urin-aktivatoren (UPA) (også betegnet urokinase) (se Williams J.R.B. (1951) Br. J. Exp. Pathol. 32, 540). Urokinasetypen, opprinnelig renset som et tokjedet protein fra urin, har nylig blitt isolert i en proenzymform (betegnet pro-urokinase), for eksempel fra en human epidermoid karsinomcelle-linje EEp3 (se Wun T.D. , Ossowsky L. og Reich E. (1982) J. Biol. Chem. 257, 7262), fra humane glyoblastomaceller (se Nilsen L.S. et al (1982) Biochem 21, 6410), fra urin (se Husain S.C. et al (1983) Arch. Biochem. Biophys 220, 31) og fra den humane permanente nyrecellelinje TCL-598 (se Kohno T. et al (1984) Biotechnol 2, 628). Et proenzym som er immunologisk relatert til urokinase, har nylig blitt identifisert også fra supernatanten til den humane epidermoide karsinom-cellelinjen A431. Dette pro-urokinasezymogenet er et enkeltkjedet protein av 50-54.000 uten noen eller med lav amidolytisk aktivitet og høy fibrin-affinitet, det er resistent overfor diisopropylfluorfosfat-behandling og inaktivering av plasma-inhibitorer (se Gurewich V. et al

(1984) J. Clin. Invest. 73, 1731), og den kan omdannes til det tokjedete aktive enzym (urokinase) ved behandling med plasmin.

Det humane urokinase-molekylet har blitt isolert i flere biologisk aktive former, men det består hovedsakelig av en form av høy molekylvekt (MW ca 54.000) og en form av lav molekylvekt (MW ca 33.000). Formen av lav molekylvekt (LMW) er avledet fra formen av høy molekylvekt (HMW) ved enzymatisk spalting.

HMW-formen består av en 30.000 tung kjede (B-kjede) og en 20.000 lettkjede (A-kjede) sammenbundet med en disulfid-binding. LMW-formen består av hele B-kjeden som inneholder det aktive sete og et lite, proteolytisk resistent fragment (MW = 2.427) avledet ved A-kjeden bundet med en disulfid-binding. A-kjeden spaltes proteolytisk i et 18.000-fragment, og det overfor nevnte 2.427-fragment. Det later til at LMW-urokinasen er mindre aktiv enn HMW-urokinasen når det gjelder å akselerere lysering in vivo av størknet ?d. (M. Samama et al., Thromb. Haemostas. 40, 578-580 (1979) og G. Murano et al., Blood, 55, 430-436 (1980)). Humanurokinase oppnås i dag fra biologiske kilder slik som human-urin, vevskulturer, spesielt normale og tumorale nyrecellekulturer, ved hjelp av konvensjonelle renseteknikker. Humanurokinase-zymogen kan spille en lignende fysiologisk rolle når det først er aktivert til urokinase. Det ble nylig rapportert at human-urokinase var fremstilt ved DNA-teknikk (se EP-patentsøknad publ. nr. 92182).

Monoklonale antistoffer mot urokinase har blitt beskrevet etter pionerarbeidet angående monoklonale antistoff-produserende cellehybrider til C. Milstein og G. Kohler beskrevet i Nature, 256, 495-497 (1975). For eksempel beskriver belgisk patent 896.253 flere monoklonale antistoffer oppnådd ved immunisering av mus med en urokinase av lav molekylvekt (33.000). Disse monoklonale antistoffene er åpenbart rettet mot en epitop på lavmolekylvektformen av urokinase. Et av disse antistoffene, betegnet AAU2, ble valgt og benyttet i rensingen av urokinase (se P. Herion og A. Bollen, Bioscience Eeports 3, 373-379 (1983)). Den oppnådde urokinasen skulle naturligvis inneholde former av både lav og høy molekylvekt. D. Vetterlein og G.J. Colton har beskrevet rensing av urokinase ved hjelp av immobiliserte monoklonale antistoffer mot den lettkjedete urokinasen (Thromb. Haemostas (Stuttgard) 49, 24-27 (1983)). Den beskrevne rensingsfaktor er mindre ennn 2,4 (fra 60.000-70.000 CTA enheter/mg til 142.000-167.000 CTA enheter/mg; se side 25, høyre spalte, linjene 10-11, urokinasen bundet, til immunoadsorbsjonsmidlet i det beskrevne forsøk med urin (300 ml/urin pr 1 ml harpiks, se side 26, annet avsnitt i bemerkningene til fig 2) er ikke egnet for rensing i industriell målestokk. Disse forfattere har dessuten påpekt at problemet med industrill rensing av urokinase ved bruk av et monoklonalt antistoff-immunoadsorberende middel fremdeles mangler løsning. ("However, largescale uses of this affinity technique must still be demonstrated", side 27, venstre spalte, linjer 13-14).

EP-patentsøknad, publ. nr. 84344 beskriver noen anti-urokinase, monoklonale antistoffer i generelle vendinger. Det angis at de er nyttige for rensing av urokinase og for diagnostiske og analytiske formål. Sluttproduktet, urokinase, er imidlertid hverken karakterisert med henblikk på innhold av form av høy eller lav molekylvekt, og heller ikke karakterisert med hensyn til den sinnhold når det gjelder biologisk aktive eller toksiske kontaminanter. G. Salerno et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, sider 110-114 (1984) beskriver andre anti-urokinasemonoklonale antistoffer som, som vist nedenfor, binder begge høy- og lavmolekylvektformene for urokinase og er i besittelse av en affinitetskonstant som ikke er egnet for en effektiv affinitetskromatografi. Andre immunoadsorberende midler som har "anti-urokinase"-monoklonale antistoffer er beskrevet av L.S. Nielsen et al, Biochemistry, 21, 6410-6415 (1982) og K. Katolf et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 3720-3723 (1982). De beskrevne monoklonale antistoffene inhiberer den enzymatiske aktiviteten til en plasminogen-aktivator som de betegner HPA 52. Mengden av antistoff bundet til matrisen pr ml matrise og kapasitetene til den endelige modifiserte matrisen, er imidlertid uegnet for bruk i industriell målestokk. Bruken av to etter hverandre følgende kromatografiske trinn er dessuten nødvendig for å rense HPA 52 for glyoblastoma-cellekultur-medium (se tabell I, side 6412).

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et monoklonalt humanurokinase-antistoff som er kjennetegnet ved følgende egenskaper:

a) det er et IgG^,

b) det har en affinitetskonstant på (1,42 ± 0,71) x IO<7> 1 mol-<1> for immobilisert humanurokinase målt vesentlig

ifølge metoden beskrevet av Tsapis et al i Eur. J. Biochem. 64, 369 (1976),

c) det binder urokinase av høy molekylvekt (54.000) og/eller den enkeltkjedede urokinase-forløper uten å binde

urokinasen av lav molekylvekt (33.000),

d) det binder det 18.000 proteolytiske fragment i urokinasens A-kjede, e) det kryssreagerer ikke med enzymatisk aktive serum- eller urinendopeptidaser andre enn urokinase.

I betrakning av det karakteristiske trekk ved foreliggende monoklonale antistoffer når det gjelder å binde både høymolekylvekt-urokinase og urokinase-forløperen; i det følgende i forbindelse med spsifisitets- og bindingsegen-skapene til foreliggende monoklonale antistoffer omfatter betegnelsen "urokinase" både høymolekylvektformen for urokinase og urokinase-forløperene. Henvisningen, i samme sammenheng, til "urokinase av høy molekylvekt" skal forstås til å omfatte også dens forløpere som likeledes spesifikt bindes av foreliggende monoklonale antistoff. I foreliggende sammenheng refererer betegnelsen "urokinase-forløper" til "naturlige" enkeltkjedete forløpere for urokinase slik som ovennevnte urokinase-zymogen samt til urokinase-forløpere eller relaterte stoffer oppnådd ved rekombinante DNA-teknikker, og som har det felles trekk at de binder et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende monoklonale anti-urokinase-antistoff oppnås ved somatisk cellefusjon av myelomceller fra mus av den "ikke-avsondrede" type, det vil si myelomceller som ikke avsondrer immunoglobeliner, med miltceller fra mus på forhånd immumi-sert med høyt renset 54.000 urokinase og de fjernede miltcellene sammensmeltes med ikke-avsondrende myelomceller som er i besittelse av visse genetiske defekter som gjør dem ute av stand til å overleve i et visst medium, hvilket blir meget nyttig for den etterfølgende isolering av hybridceller. Et eksempel på slik cellelinje, er den som er kjent som X63-Ag8653 som er beskrevet av Kearney et al. i J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979) og som er kjent tilgjengelig for fagmannen på området.

Slike myelomcellelinjer er generelt tilgjengelig for almenheten gjennom mange vitenskapelige institusjoner slik som The Salk Institute, Cell Distribution Center, P.O. Box 1809, San Diego, California 92112, og Institute for Medical Research, NIGMS Cell Repository, Copewood and Davis Street Camden, New Jersey 08103. Cellefusjonen utføres i nærvær av polyetylenglykol, fortrinnsvis polyetylenglykol (PEG) 6.000.

Sterkt renset 54.000 urokinase (HMW urokinase) er kommersielt tilgjengelig fra mange kilder. Et egnet sterkt renset urokinasepreparat har en høy titer i internasjonale enheter (IU) et høyt forhold for fibrinolytisk/esterolytisk aktivitet og meget lave mengder eller praktisk talt fravær av tromboplastiniske kontaminanter. Et foretrukket sterkt renset urokinasepreparat er det som er kommersialisert under varebetegnelsen PERSOLV® (Gruppo Lepetit S.p.A.) som har en fibrinolytisk aktivitet over 100.000 IU/mg et forhold for fibrinolytisk/esterolytisk aktivitet større enn 1,4 er et pyrogen i kaniner ved doser høyere enn 20.000 IU/kg og har en null-koagulant aktivitet ved plasmakonsentrasjoner så høye som 200 IV/ ml.

Immuniseringsplanen er fortrinnsvis kjennetegnet ved en lav administrasjonsdose av urokinase. En typisk immuniseringsplan for mus innbefatter en første administrasjon av en lav dose av høyrenset 54.000 MW urokinase (120.000 IU/mg; ca 10 pg) i komplett Freund-hjelpemiddel 60 dager før fusjon, i.p.; en annen i.p. injeksjon av samme mengde i ufullstendig Freund-hjelpemiddel 30 dager før fusjon og en sluttelig i.v. booster av samme mengde 5 dager før fusjon.

Bare de dyr som ti dager før fusjon har en anti-urokinase-antistof f titer høyere enn 1:10.000 gis den sluttlige booster og behandles videre. Milter fjernes, og miltcellene sammensmeltes med myelomcellene i et forhold fra ca 10<8> til 5 x IO<7 >celler. Etter fusjon dyrkes cellene i et egnet medium slik som Dulbeccos modifiserte Eagle-medium inneholdene ca 10 % kalvefosterserum og de sammensmeltede cellene selekteres på en hypoxantine-, aminoptreidin-, thymidin-medium (HAT). Supernatantene til cellekulturene ble analysert med henblikk på anti-urokinase-antistoffer ved hjelp av ELISA-metoder som innebærer bruk av "konvensjonelt" anti-urokinase-antiserum. Eensingen av de således identifiserte monoklonale anti-urokinase-antistof f ene kan utføres ved hjelp av ioneutvek-slingskromatografi eller ved affinitetskromatografi på en urokinase-agarosekolonne, mens gelelektroforese er et hensiktsmessig middel for bedømmelse av homogeniteten til det oppnådde produkt. Disse preparater av monoklonale anti-urokinase-antistof f er bedømmes deretter med henblikk på klassespesifisitet og affinitetskonstant for antigen immobilisert på agarose. Klassespesifisiteten bestemmes ifølge Outcherlonys dobbelt immunodiffusjonsteknikk (Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26, 507, (1949)); affinitetskonstanten bestemmes ved hjelp av ekvilibrium-bindingsforsøk utført vesentlig ifølge metoden til Tsapis et al (Tsapis A., Rogard N., Alfsen A., og Nihaesco C. (1976) Eur. J. Biochem.

64, 369). I disse forsøk tilsettes økende konsentrasjoner av vesentlig rent monoklonalt antistoff som på forhånd er dialysert i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,2, til en urokinasebærende matrise, slik som en urokinase-agarose-matrise. Konsentrasjonen av det ubundete antistoff bestemmes spektrofotometrisk, konsentrasjonen av bundet antistoff beregnes ut fra forskjellen fra det totale tilsatte antistoff, og bindingsdata utarbeides ifølge de kjente statis-tiske metodene slik som metoden beskrevet av G. Scatchard i Ann. N.Y. Acad. Sei. 51, 660-672 (1949).

Det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen har en aff initetskonstant på (1,42 ± 1,5) x IO<7> 1 mol-<1> i den ovenfor beskrevne analysen.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er bruken av foreliggende monoklonale antistoffer i et immunoadsorbsjonssystem for rensing av urokinase i industriell målestokk. Det vil forstås av fagmannen på området at ikke et hvilket som helst monoklonalt antistoff rettet mot et visst antigen (urokinase, i foreliggende tilfelle) er egnet for bruk i en industriell prosess. Det er således kjent at det er et hull mellom operasjoner i laboratoriemålestokk og industriell målestokk. Endringen i størrelse forsterker faktisk i betydelig grad problemene som skal løses, og i mange tilfeller er en løsning som er tilfredsstillende for operasjon i laboratoriemålestokk uegnet for en operasjon i industriell målestokk.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et immunoadsorberende middel for rensing av humanurokinase som gir et urokinaseprodukt som har følgende egenskaper: a) det har en fibrinolytisk titer høyere enn 130.000 IU/ml, b) det er rikt på urokinase av høy molekylvekt og/eller den

enkeltkjedede urokinase-forløper for denne,

c) det er praktisk talt fritt for urokinase av lav molekylvekt , d) det har fibrinolytisk/esterase-aktivitetsforhold over 2.000 , e) det er praktisk talt fritt for tromboplastiniske kontaminanter (null-koagulantaktivitet ved konsentrasjon på 200

Ul/ml);

og/eller den enkeltkjedede forløper for denne som gir en humanurokinase-forløper som har følgende egenskaper:

a) det er et enkeltkjedet protein med MW 50-54.000,

b) det er nesten fritt for amidolytisk aktivitet,

c) det har høy fibrinaktivitet,

d) det inaktiveres ikke av plasma-inhibitorer,

e) det omdannes til en tokjedet aktiv plasminogen-aktivator

ved behandling med plasmin,

kjennetegnet ved at nevnte immunoadsorberende middel er oppnådd ved binding av det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen til en matrise valgt fra agarose, modifisert og/eller aktivert agarose, tverrbundet dekstran, cellulose og karboksymetylcellulose.

I foreliggende tilfelle bør det egnede monoklonale antistoff ha en optimal affinitet for antigenet for på effektiv måte å binde antigenet ved slike betingelser at det er mulig å skylle det bundete antigen uten i betydelig grad å frigjøre det, og slik at det er mulig å frigjøre det fra matrisen ved betydelig forskjellige betingelser.

Frigjøringsbetingelsene bør videre være milde nok til å unngå noen skade enten på antigenet eller på immunoadsorbsjonsmidlet.

Siden affiniteten til antistoffet for antigenet, i en viss grad, regulerer kapasiteten til det sluttelige immunoadsorberende middel, er en lav affinitet hos antistoffet vanligvis relatert til en for lav kapasitet hos det immunoadsorberende middel med følgende lave rensingsutbytter (for eksempel på grunn av et aktivitetstap under skylling); derimot er en høy affinitet hos antistoffet vanligvis relatert til en for sterk binding av antigenet til det immunoadsorberende middel med følgelig lave utbytter på grunn av for eksempel vanskelig-heter med eluering eller for drastiske (og muligens dena-turende) elueringsbetingelser. Affinitetskonstanten til det monoklonale antistoffet og kapasiteten til det tilsvarende immunoadsorberende middel er imidlertid ikke de eneste kritiske parametre i en industriell rensningsprosess basert på immunoadsorbsjon fordi også selektiviteten til det monoklonale antistoffet spiller en meget viktig rolle i denne sammenheng.

Det er faktisk slik at de monoklonale antistoffnee ifølge oppfinnelsen binder urokinase av høy molekylvekt, men binder ikke lavmolekylvektformen eller noen andre serum- eller urin-enzymatisk aktive former av endopeptidase.

Spesielt kryssreagerer de ikke med de kjente serum- eller urin-tromboplastiniske kontaminantene. I tillegg beholder foreliggende monoklonale antistoffer denne spesifisitet også når de er bundet til matrisen i det endelige immunoadsorbsjonsmidlet. Spesielt har de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved den ovenfor beskrevne spesifisitet, som allerede nevnt, en affinitetskonstant på

(1,42 ± 1,5) x IO<7> 1 mol-<1> i den ovenfor beskrevne analyse, og gir når de er koblet til den egnede matrisen, et immuno-adsorbsjonsmiddel med en kapasitet over 150.000 ITJ/ml.

Monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er derfor IgG^ med en af f initetskonstant på ca (1,42 ± 1,5) x IO<7> 1 mol-<1> i den ovenfor beskrevne analysen som anvender immobilisert urokinase, de har en god spesifisitet for høymolekylvekt-formen av urokinase eller en enkeltkjedet forløper for denne uten å bindes til lavmolelkylvektformen eller kryssbindes med serum- eller urin-endoproteaser andre enn urokinase, og er, når de først er bundet til den egnede matrisen, i stand til å gi immunoadsorberende matriser med kapasitet over 150.000 Ul/mg, og i stand til å binde antigenet ved en pH-verdi mellom 4,5 og 8,0, selv i nærvær av opptil ca 0,5 M vandig natriumklorid, og frigjøre det bundete antistoff ved en pH-verdi mellom 3,0 og 4,0 i 0,5-1 M vandig natriumklorid. Det foretrukne monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen er betegnet 5B4 og har følgende egenskaper:

a) Det tilhører IgG<1->klassen,

b) det har en af f initetskonstant på ca 1,42 x IO<7> 1 mol-<1 >målt vesentlig ifølge metoden beskrevet av Tsapis et al i

Eur. J. Biochem. 64, 369 (1976);

c) det binder spesifikt høymolekylformen (54.000) av urokinase eller en forløper for denne uten å binde

lavmolekylformen (33.000) eller noen serum- eller urin-tromboplastinisk kontaminant av urokinase,

d) det binder det 18.000-proteolytiske pigment i A-kjeden,

e) det svekker ikke den enzymatiske aktiviteten til den desorberte urokinase,

f) det har et isoelektrisk punkt på ca 5,75.

Representative matriser egnet for kobling med foreliggende

monoklonale antistoffer er kryssbundet dekstran og kryssbundet dekstran med regulert porestørrelse, agarose,

modifisert og aktivert agarose slik som karboksylmetyl-agarose, N-hydroksysuksinimidesterderivater av kryssbundet agarose, cellulose og karboksylmetylcellulose. Disse matrisene er i mange tilfeller kommersielt tilgjengelig enten i aktivert eller ikke-aktivert form. De aktiverte matrisene er generelt foretrukket på grunn av de kjente håndteringsfor-delene i koblingsreaksjonen. Den foretrukne matrise for fremstilling av foreliggende immunoadsorberende middel er aktivert agarose. Koblingen av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen til matrisen oppnås ved i og for seg kjente teknikker. Når matrisen benyttes, er ikke-aktivert, oppnås koblingen fortrinnsvis ved hjelp av kjente aktiver-ingsmidler slik som cyanogenbromid, epikloridin, 1,4-bis-(2,3-dieoksypropoksy)butan og 3-aminopropyltrietoksysilan.

En av de foretrukne anvendelser for foreliggende immunoadsorberende middel er rensingen av 54.000 MW urokinase eller en forløper for denne fra biologiske kilder, spesielt i renseprosesser i industriell målestokk. I tillegg kan dette immunoadsorberende middel på nyttig måte anvendes i analytiske testsystemer slik som radioimmunoanalyse, enzymbundet immunoanalyse og andre kjente konkurrerende bindingsanalyser på grunn av affiniteten for antigenet og spesifisiteten til det bundete monoklonale antistoffet.

Et annet formål med oppfinnelsen er en fremgangsmåte for rensing av 54.000 MW urokinase (HMW urokinase) eller en forløper for denne fra biologiske kilder, hvilket innbefatter anbringelse av en biologisk kilde eller en konsentrat av denne i kontakt med foreliggende immunoadsorberende middel ved en pE-verdi mellom 4,5 og 8,0 for selektivt å binde 54.000 MW-urokinasen til foreliggende immunoadsorberende middel, skylling av dette med en bufret oppløsning ved en pH-verdi mellom 6 og 8 og frigjøring av det bundete antigen fra det immunoadsorberende middel ved eluering med en vandig oppløsning ved en pH-verdi mellom 3,0 og 4,0, inneholdene 0,5-1 M vandig natriumklorid.

I denne prosessen kan bindingen av antigenet til det immunoadsorberende middel også oppnås i nærvær av vandig natriumklorid i konsentrasjoner opptil 0,5 M, mens fri-gjøringen av antigenet fra komplekset antigen/immunoadsorberende kan oppnås i nærvær av en konsentrasjon av vandig natriumklorid fra 0,5 til 1 M.

Det vil forstås av fagmannen på området at den vandige natriumkloridoppløsningen kan erstattes med en hvilken som helst vandig oppløsning med ekvivalent styrke som ikke på ugunstig måte forstyrrer renseprosessens forløp.

I foreliggende sammenheng innbefatter uttrykket "biologiske kilder" biologiske fluider slik som urin og blod, vevskultur-fluider og fermentering av genetisk konstruerte mikroorganismer som kan produsere urokinase eller en plasminogen-aktivator som gjennkjennes av foreliggende monoklonale antistoff.

Som allerede nevnt, er foreliggende immunoabsorberende middel i stand til å rense høymolekylvektformen av urokinase direkte fra biologiske kilder; for eksempel når den biologiske kilden er human-urin, oppnås et urokinaseprodukt som har følgende egenskaper:

a) Det har en fibrinolytisk titer større enn 130 IU/ml,

b) det er rikt på høymolekylvekt-urokinase,

c) det er praktisk talt fritt for lavmolekylvekt-urokinase, d) det har et forhold for fibrinolytisk/esterasisk-aktivitet over 2000, e) det er praktisk talt fritt for tromboplastiniske kontaminanter (nullkoalulant aktivitet ved konsentrasjoner på ca

200 IU/ml).

Et urokinaseprodukt med egenskaper i det vesentlige som de ovenfor angitte oppnås med utgangspunkt i hvilken som helst annen biologisk kilde.

I noen tilfeller, ved utførelse av rensinger i industriell målestokk, kan det være hensiktsmessig å underkaste et konsentrat av det biologiske fluidet, i stedet for det biologiske fluid som sådant, for rensing ved hjelp av foreliggende immunoadsorberende middel for å redusere volumene av fluid som skal bringes i kontakt med det immunoadsorberende middel, (eller føres gjennom en kolonne inneholdene det immunoadsorberende middel) og følgelig redusere tiden og kostnadene ved hele operasjonen.

Også i dette tilfelle bibeholder foreliggende immunoadsorberende middel sin effektivitet og gir et renset produkt som har de ovenfor beskrevne egenskaper.

For bedre å klarlegge problemet med valget av det monoklonale antistoffet som er egnet for bruk i rensingsprosessen, hvilket er et av formålene ved foreliggende oppfinnelse, angir nedenstående tabell resultatene fra en sammenligning mellom det foretrukne monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, som er betegnet 5B4, og et monoklonalt antistoff beskrevet av Salerno et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 81, 110 (1954), som er betegnet mAB 105.1F 10, som har en affinitetskonstant lik den til 5B4.

Disse to monoklonale antistoffene, som tilhører den samme klassen (begge er IgG<1>) gir, når de er bundet i like mengder til like mengder aktivert agarose (Affi-gel®10) vensentlig forskjellige resultater i rensingen av preparater av urokinase.

Mer spesielt, når preparater av urokinase av samme renhet (897 esterolytiske enheter) føres gjennom to forskjellige immunoadsorberende midler, er den bundete fraksjon mindre enn 10 % i tilfellet for 105.1F 10 og over 70 SÉ (nemlig 77,5 %) i tilfellet for mAB 5B4.

Foreliggende monoklonale antistoffer kan på grunn av deres affinitet og spesifisitet for antigenet på nyttig måte anvendes i analyse- eller detekteringsmetoder. De kan merkes med forskjellige markører slik som fluorescerende farge-stoffer, radioisotoper og enzymer, og anvendes i immumofluor-escensanalyser, radioimmunoanalyser eller enzym-immunoanalyser.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er derfor en enzymimmunoanalyse, radioimmunoanalyse eller immunofluor-escensalanyse av humanurokinase eller en forløper for denne ved hjelp av foreliggnede monoklonale antistoff. Humanurokinase analyseres vanligvis ved fibrinolytiske eller esteroltyiske metoder. Den første metoden er basert på klump-lyseringen oppnådd ved aktiveringen av plasminogen til plasmin med urokinase, mens den andre metoden er basert på den direkte hydrolyse av det syntetiske substrat acetyl-lysyl-metyl-ester (ALME) med urokinase. Derfor detekterer disse analysene den aktive formen bare for enzymet. Inaktive forløpere av UK, slik som preprourikinase eller prourikinase eller inhibitor-enzymkomplekser unnslipper deteksjon. I motsetning til dette tillater immunologiske analyser som er basert på antigeniske egenskaper til molekylet og ikke dets aktivitet, detektering av aktive og inaktive former for enzymet.

En meget egnet immunoanalysemetode som er nyttig for detektering eller analyse av urokinase eller en "inaktiv" forløper for denne (slik som et urokinase-zymogen eller pro-urokinase), er en dobbelt antistoff-"sandwich"-metode.

Ifølge oppfinnelsen anvendes således foreliggende monoklonale antistoff i en dobbeltantistoff-"sandwich"-metode omfattende

a) bevirkning av reaksjon mellom en testoppløsning inneholdene antigenet og et første urokinase-antistoff

immobilisert på en fastfasebærer for å binde antigenet til den faste fasen,

b) anbringelse av en oppløsning inneholdene et annet urokinase-antistoff hvortil det er bundet en markør som

kan bestemmes, i kontakt med det bundede antigenet, hvor ett av nevnte første og andre antistoffer er et monoklonalt antistoff som har egenskapene til nevnte antistoff ifølge krav 1,

c) detektering eller analyse av antigenet i overensstemmelse med den grad i hvilken markøren som kan bestemmes har

blitt bundet til fastfase-baereren,

for detektering eller analyse av et antigen valgt fra human-urokinase og/eller en forløper for denne.

Det "første" antistoffet velges fortrinnsvis fra et anti-urokinase-antiserum, anti-urokinase-renset immunoglobulin G (IgG^) og et monoklonalt antistoff som er kjent for å bindes til et sete i antigenet som er forskjellig fra bindingsstedet i det "andre" antistoffet (og som åpenbart ikke forstyrrer bindingen av nevnte "andre" antistoff. "Testoppløsningen" kan være en hvilken som helst oppløsning, men som dog inneholder antigenet bundet av foreliggende monoklonale antistoff og innbefatter biologiske fluider, fermenteringsbuljonger, for eksempel av genetisk konstruerte mikroorganismer og celle-kulturbuljonger og ekstrakter. Det "andre" antistoffet er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen bundet til en egnet ligand som kan bestemmes, slik som et enzym, et fluorescerende fargestoff eller en radioaktiv gruppe. En foretrukken markør som kan bestemmes, er et enzym, og den foretrukne "markør" er pepperrotperoksydase. Det foretrukne monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen er det ovenfor beskrevne 5B4 monoklonale antistoffet.

Når både det "første" og det "andre" antistoffet er monoklonale (hvorav ett er et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, mens det andre er et annet anti-human-urokinase-monoklonalt antistoff som binder et sete på antigenet som er forskjellig fra antistoffet ifølge oppfinnelsen, og hvis binding ikke forstyrrer bindingen av foreliggende monoklonale antistoff), så er de generelt ombyttelige i den ovenfor omtalte analysemetoden. Med andre ord, ett av de to monoklonale antistoffene kan være det "første" og det andre det "andre" eller vice versa. I motsetning til dette, i tilfelle av en analyse hvori et av "antistoffene" er representert av et konvensjonelt antiserum, vil det nesten utelukkende benyttes som det "første" antistoffet, fordi effektiviteten til systemet er høyere enn i den motsatte situasjon.

Koblingen av det monoklonale antistoffet med enzym-markøren oppnås ifølge i og for seg kjente teknikker. En foretrukken koblingsreagens er glutaraldehyd. Når den detekterbare markøren er et enzym, benyttes et fargeutviklende, kromogent enzymsubstrat som er et kjent syntetisk substrat for det merkede enzym som, etter inkubering med enzymet, utvikler et farget derivat hvis intensitet detekteres og bedømmes i sammenligning med den farge som utvikles av standard preparater av testforbindelsen. I tillegg til disse kvantitative formål, for ganske enkelt å detektere tilstedeværelsen av antigenet i en ukjent prøve.

Fastfase-bæreren innbefatter partikler av cellulose, polyakrylamid, kryssbundete dekstraner, silikongummi, mikrokrystallinsk glass og plast og fortrinnsvis preformede materialer slik som rør, skiver eller mikroplater støpt fra plast slik som polystyren, polypropylen og polyvinyl. Polyvinyl-mikroplater er den foretrukne fastfase-bæreren. Det foretrukne anvendelsesområdet for foreliggende fremgangsmåte er 15-100 mg/ml av antigen. Når prøver som har en antigen-konsentrasjon som faller utenfor disse grenser, skal testes, må de, slik det er åpenbart for en fagmann på området, på forhånd være fortynnet eller (hvis passende) konsentrerer for forsøksvis å komme inn i dette optimale konsentrasjons-området.

Metoden godkjennes ved å bedømme inter- og intra-analysenøyaktigheten og den prosentvise analytiske gjenvinning. Intra-analysenøyaktighet (CV) er generelt mellom 4 og 8 inter-analysenøyaktighet (CV) er generelt mellom 7 og 23 mens den analytiske gjenvinning er mellom 87 og 114 Spesifisiteten til det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen er også for en urokinaselignende plasminogen-aktivatorforløper (enkeltkjedet forløper) produsert av humane, epidermoide karsinomceller (A43i-celler; Fabricant De Larco, Todaro, 1977, Proe. Nath. Acad. Sei. USA, 74, 565) ble demonstrert og analyse for den dannede forløper foretatt ved bruk av foreliggende fremgangsmåte.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse ytterligere.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av monoklonalt anti- urokinase- antistoff 5B5

a) Fremstilling av monoklonale anti-urokinase-anti-stof f er

Høyrenset 54.000 Dalton urokinse 120.000 IU/mg (PERSOLV®-RICHTER) anvendes for å immunisere 7 uker gamle Balb/C hunnmus. 10 jjg av denne urokinase i komplett Freunds hjelpemiddel injiseres i dyrenes peritoneum 60 dager før fusjon.

Ytterligere 10 pg urokinase gis til mus 30 dager senere. 10 dager før fusjon måles anti-urokinase-antistofftiteren ved konvensjonell ELISÅ-metode i blodprøver tatt fra halevenene og 5 dager før fusjon, en sluttelig booster på 10 jjg urokinase gis endovenisk bare til de dyr som har en anti-stofftiter høyrere enn 1:10.000. Milter fjernes deretter på dagen for fusjonen, og miltceller (ca 1 x 10<8>) sammensmeltes med 5 x IO<7> musemyeloma X63-Ag8653 i 50 % PEG 6000.

Etter fusjon, foretatt vesentlig ifølge metoden til C. Milstein og G. Kohler, resuspenderes cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM)-supplemet med 10 # kalvefosterserum og HAT-medium (0,1 mM hypoksantin, 0,25 mM aminopterin, 0,017 mM thymidin, Flow Laboratories) og anbringes på fem forskjellige Costar-plater inneholdene makrofager fra mus (matelag).

HAT-mediet endres hver 3. dag og fra dag 10 etter fusjon testes supernatantene i en ELISA-immunoanalyse hvor 2-3 dager med henblikk på tilstedeværelsen av monoklonale anti-urokinase-antistof f er .

b) Undersøkelse av monoklonale anti- urokinase- antistoffproduserende hybridomer ved ELISA

Ifølge en modifikasjon av Perlman-metoden (Immunochemistry, 8, 873 (1971)), belegges fleksible mikrotiterplater med 96 brønner (Dynatech) med 50 pl/brønn av en 20 pg/ml oppløsning av urokinase i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,2, 0,05 M natriumfosfat pH 7 som inneholder 0,5 M natriumklorid, og inkuberes i 1 time ved romtemperatur. Etter en grundig vasking med 0,05 # Tween 20 fosfatbuffer-saltoppløsning, mettes brønnene med 3 # bovinserumfosfat-bufret saltopp-løsning i 3 timer ved romtemperatur for å unngå uspesifikke bindinger. Etter forsiktig vasking tilsettes 50 pl av supernatant-hybridomkulturer (eller det samme volum av ascite-fluider til brønnene og hensettes for reaksjon i 2 timer ved romtemperatur. Platene vaskes deretter og inkuberes med 1:1.000 fortynning av kanin-anti-mus lg konjugert med pepperrot-peroksydase (PI61, DAKO) i 90 min. ved romtemperatur. Etter grunding vasking inkuberes platene med 200 pl/brønn av 1 mg/ml oppløsning av kromogene o-fenylendiamin (SIGMA) i 0,1 M citratbuffer pH 5, 1,7 mM H202. Fargen utvikles i 20 min., og den optiske densitet avleses ved 492 nm mot kontrollprøver som hverken inneholder antigen eller antistoff. Brønner med fargenivåer som er 4 ganger høyere enn kontrollprøvene anses som positive.

c) Massedyrking av anti- urokinaseproduserende h<y>bridomer

Anti-urokinase-antistoffproduserende hybridomer velges,

klones ved begrenset fortynning, dyrkes i massekulturer og injiseres i peritoneum hos Blab/c-mus som på forhånd er behandlet med 0,5 ml pristane® (2 ,6,10,14-tetrametylpenta-dekan; Aldrich). Ascite-fluider oppsamles 15 dager senere. Konsentrasjonen av monoklonale anti-urokinase-antistoffer er i området 10-20 mg/ml. De renses enten ved protein-A-sefarose- eller urokinase-sefarose-affinitetskromatografi.

d) Rensing av monoklonale anti- urokinase- antistoffer ved affinitetskormatografi på sefarose®- urokinase

Et sefarose-urokinase-konjugat fremstilles ved reaksjon av CNBr-aktivert sefarose HMW med høyrenset urokinase (120.000 IU/mg). Koblingseffektiviteten. er ca 20 mg urokinase/ml svellet gel. Ascite-fluider oppnådd som angitt ovenfor (1 ml pr produserende hybridom) anbringes deretter på sefarose-urokinase-af f initetskolonnen (1,6 cm x 15 cm) som er likevektsinnstilt på forhånd i 0,01 M natriumfosfatbuffer pH 8,0. Etter skylling med den samme bufferen elueres de selektivt adsorberte monoklonale anti-urokinase-antistoffene med 0,1 M eddiksyre pH 3,0. De antistoffholdige fraksjonene oppsamles og konsentreres ved ultrafiltrering på PSDE 09005 millopore-membraner og lagres i frosset tilstand inntil bruk,

e) Bedømmelse av renheten og homogeniteten til monoklonale antistoffpreparater ved gelelektroforese

Det monoklonale antistoffet oppnådd ovenfor underkastes SDS-P A GE-nat r iumdodey 1 f osf at po lyakrylamidgel - elektroforese ifølge metoden beskrevet av W.K. Laemmli i Nature 227, 680 (1970 ). Bare de bånd som tilsvarer de tunge og de lette kjedene i IgG-materialet er tydelige, hvilket indikerer at eluatet ovenfor inneholder rene immunoglobeliner.

f) Bestemmelse av affinitetskonstanten

Aliquoter av en 20 <& sefarose-urokinasesuspensjon i fosfatbufret saltoppløsning pH 7 (0,5 ml hver) tilsettes til økende konsentrasjoner av rensede preparater av monoklonalt anti-urokinase-antistof f (disse preparater er de som er oppnådd ifølge punkt d) ovenfor dialysert i fosfatbufret saltopp-løsning pH 7). Prøvene veies opp/ned i to timer ved romtemperatur. Kontrollprøvene mottar ingen harpiks.

Konsentrasjonen av det ubundete antistoffet bestemmes spektrofotometrisk ved 280 nm (E 1 # = 14, mens

1 cm

konsentrasjonen av det bundete antistoffet beregnes ved forskjell fra den totale mengde tilsatt antistoff. Alle bindingsdata utarbeides ifølge Scatchard (Amm. N.Y. Acad. Sei. 51, 660-672, 1949). Det monoklonale antistoffet betegnet 5B4 har en affinitetskonstant på 1,42 x IO<7> 1 mol-^.

EKSEMPEL 2

Immobilisering av monoklonalt anti- urokinase- antistoff 5B4 på aktivert agarose

Aktivert agarose (N-hydroksysuksinimid-aktivt esterderivat av kryssbndete agarosekuler med en ladningsfri avstandsarm med en lengde på 10 atomer; Affi-gel 10®, Bio-rad Inc.; 14 g, fuktig) vaskes med 3 volumdeler isoproylalkohol og 3 volumdeler kaldt destillert vann i 20 min. Gelen resuspenderes deretter i 0,1 M natriumbikarbonatbuffer pH 8 (sluttvolum = 20 ml). Høyrenset monoklonalt antistoff 5B4, som oppnådd ovenfor, i 0,1 M natriumbikarbonatbuf f er pH 8 (9,7 ml) tilsettes til gelsuspensjonen. Etter 4 timer ved romtemperatur tilsettes en 1 M vandig etanolaminhydroklorid ved pH 8 (1,5 ml) for å blokkere de ureagerte estergruppene i harpiksen. Blokkeringsreaksjonen er fullendt i løpet av 1 time ved romtemperatur. Gelen pakkes deretter i en kolonne, vaskes med 10 volumdeler koblingsbuffer (0,1 M vandig natriumbikarbonat pH 8), deretter med 0,1 M vandig natriumklorid og til slutt med 0,05 M vandig natriumfosfatbuffer pH 7 inneholdene 0,5 M vandig natriumklorid. Effektiviteten til koblingen bedømmes spektrofotometrisk ved 280 nm i superna-tantprøvene før og etter reaksjon. Disse prøver bringes til pH 2 før analyse for å eliminere forstyrrelse fra N-hydroksysuksinimid i avlesningene.

2,5-4 mg monoklonalt antistoff 5B4 ble immobilisert pr ml harpiks.

EKSEMPEL 3

a) Bedømmelse av kapasiteten til 5B4- agarose- immunoadsorbsjonsmidlet

Den maksimale kapasiteten til 5B4-agarose bedømmes på "rene" og urene preparater av urokinase. En kolonne med 5B4 agarose (1,6 x 10 cm) likevektsinstilles i 0,5 M NaCl, 0,05 M Na-fosfatbuffer pH 7 og tilføres "ren" urokinase (120.000 IU/mg) inntil esterolytisk aktivitet detekteres i avløpet. Kolonnen vaskes deretter med likevektsinstillingsbufferen, og enzymet desorberes ved eluering med 1 M NaCl, 0,1 M eddiksyre. Den totale aktiviteten som gjenvinnes i den bundete fraksjon, tas som kolonnens maksimumskapasitet.

I tilfellet for urokinase (120.000 IU/mg) var kapasiteten til 5B4-agarose 216.000 IU/ml.

Det samme forsøket ble gjenatt for bruk av et urent preparat av urokinase (700 IU/mg), og en kapasitet på 174.000 IU/ml ble oppnådd.

b) Immunoadsorbs. ion av HMW. LMW og 18. 000 urokinase-proteolytisk fragment på 5B4- agarose

Renset HMW-urokinase (30 ml) inkuberes i 8 timer i 1 ml 50 mM natriumfosfatbuffer pH 8 inneholdene 0,2 NaCl HMW, LMW og 18.000 proteolytisk fragment, oppnås i et forhold på ca 4:4:2, respektivt. Disse produkter separeres og isoleres ved gelfiltrering på en kryssbundet polydekstran med regulert porestørrelse (sefadex®G 100, superfin; 1,5 x 100 cm) likevektsinnstilt i 5 mM natriumfosfatbuffer pH 4 inneholdene 0,2 M NaCl og elueres med den samme blandingen ved en strømningshastighet på 3 ml/time. De eluerte fraksjonene som inneholder de enkelte produktene blir deretter oppsamlet. Suspensjoner av skalare mengder av 5B4-agarose (fremstilt som beskrevet ovenfor) i fosfatbufret saltoppløsning pH 7,5 inneholdene 0,1 % (v/v) Tween®20, tilsettes til reagensrør inneholdene 0,5 ml av oppløsninger av HMW, LMW eller 18.000 urokinase-proteolytisk fragment (250 jig/ml hver) i den samme bufferen, og sluttvolumet bringes til 1,5 ml med den samme bufferen. Alle prøver dreies opp/ned i 1 time ved romtemperatur og sentrifugeres deretter i 5 min. ved 2.000 omdr./min. Det ubundete matriale bestemmes ved avlesning av superna-tantens optiske densitet ved 280 nm; det bundete materialet bestemmes ved forsjkell med den tilsatte totalmengde.

I disse forsøk blir mer enn 90 # av HMW-urokinasen og det 18.000 proteolytiske fragment immunoadsorbert på 5B4-agarose, mens LMW urokinase derimot ikke immunoadsorberes.

EKSEMPEL 4

Rensing av urokinase ved immunoaffinitet på 4B5- agarose

En kromatigrafikolonne (1,6 x 9 cm) fylles med 5B4-agarose-immunoadsorberende middel som oppnådd ifølge eksempel 2 og likevektsinnstilles med 0,5 M vandig natriumklorid og 0,05 M vandig fosfatbuffer pH 7. Et urent urin-konsentrat tilføres deretter ved en strømningshastighet på 60 ml/time. Etter vasking med likevektsinnstillingsbufferet elueres urokinase med 1 M vandig natriumklorid og 0,1 M vandig eddiksyre. De urokinaseholdige fraksjonene oppsamles, nøytraliseres og frysetørkes.

Den spesifikke aktivitet til den utvunnede urokinase var alltid større enn 130.000 IU/mg. De kvantitative data er angitt ifølgende tabell: HPLC-analysen viste tilstedeværelsen av urokinase av høy molekylvekt (54.000) og fravær av urokinase av lav molekylvekt (33.000). Eenheten for den oppnådde urokinasen ble også bekreftet ved gelelektroforese på natriumdodecylsulfatpoly-akrylamid. Også denne test bekrefter faktisk at urokinase-produktet renset på 5B4-agarose er vesentlig 54.000 MW urokinase.

Forsøkene ble gjentatt flere ganger (mer enn 50 cykler) uten noen signifikant endring i resultatene.

70-80 io av den fibrinolytiske aktivitet påført på kolonnen detekteres følgelig i de bundete fraksjonene. Når de ubundete fraksjonene anbringes på nytt på kolonnen, deteketeres all aktiviteten i gjennomstrømningen hvilket antyder at denne aktivitet ikke kan skyldes urokinase, men snarere aspesifikke proteaser med fibrinolytisk aktivitet som ikke er beslektet med den til urokinase.

Ved i det vesentlige å følge metoden ovenfor, men ved anvendelse av urin (4 liter) i stedet for et urinkonsentrat, oppnås en urokinase som i det vesentlige har den ovenfor angitte egenskaper.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av A431 cellesupernatant

-^431 celler dyrkes til sammenløping i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium inneholdene 10 % kalvefosterserum (Flow Laboratories), 100 enheter jjI penicillin, 100 jjg/ml strepto-mycin (Flow Labs.) og 2 mM glutamin (Flow Labs.) i kultur-kolber av plast med en vektoverf late på 150 cm<2> (NTJNC). Supernatantene blir deretter oppsamlet, sentrifugert for å eliminere uvedkommende materiale og lagret ved -80"C i nærvær av en protease-inhibitor (aprotinin, 10 jjg/ml) inntil bruk.

EKSEMPEL 6

Rensing av enkeltk. iedet urokinase- forløper fra A431 celler ved h. ielp av immunoaffinitet på 5B4 agarose

1,5 1 av den sentrifugerte supernatanten oppnådd i det foregående eksempel 5, anbringes på en 5B4 agarose-immunoadsorberende kolonne (10 mm x 30 mm) oppnådd vesentlig ved å følge metoden i eksempel 2, på forhånd likevektsinnstilt med 0,15 M NaCl, 0,05 M Na-fosfatbuffer pH 7, ved en strømnings-hastighet på 40 ml/time. Kolonnen vaskes med 50 ml av likevektsinnstillingsbufferen og elueres med 1 M NaCl, 0,1 M eddiksyre. Fraksjoner testes med henblikk på tilstedeværelsen av urokinase-antigen ved dobbelt antistoff-"sandwich"-immunoanalyse som innebærer monoklonalt 5B4-antistoff (se nedenstående eksempel 7). Det oppnådde produkt (enkeltkjedet urokinase-forløper; SC-UK) lagres ved -80°C ved pH 4,8.

Den fibrinolytiske aktiviteten til dette produktet bestemmes ved fibrinplate-metoden (se Plough J. et al (1957) Biochim Biophys Acta 24, 278) mens den amidolytiske aktiviteten på acetyl-lycyl-metyl-ester (ALME) bedømmes med en modifikasjon av metoden til Sherry et al (1964 ) J. Lab. Clin. Med. 64, 145. Aktivering oppnås ved blanding av renset SC-UK (10 jjg) med plasmin (4 jjg) (SIGMA) til et sluttvolum på 0,4 ml i 0,5 M NaCl, 0,05 M Na-fosfat, pH 6, fulgt av inkubering ved romtemperatur.

Prøver bedømmes ved forskjellig tidspunkt med henblikk på amidolytisk aktivitet. Plasminreaksjonen stoppes ved tilsetning av 10 pg aprotinin (Richter) i 10 pl buffer.

SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) under reduserende og ikke-reduserende betingelser, ble utført ifølge Laemmli U.K. (1970) Nature 227, 680; immunoblottingsforsøk ble utført vesentlig som beskrevet tidligere (Salerno G. et al (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 110) ved bruk av ren MAB 5B4, anti-urokinase og anti-vev PA antisera i immunreak-sjonen.

Immunoblottingsmønsteret for MAB 5B4 indikerer reaksjon mellom HMW-urokinase og det proteolytiske fragment (18.000) avledet fra A-kjeden i HMW-urokinase. Dette indikerer at Epitopen må befinne seg på A-kjeden. Det faktum at ingen gjensidig påvirkning observeres ved reduksjon av HMW-urokinase med p-merkaptoetanol tyder på at de strukturelle endringer som er indusert i den reduktive reagens, ødelegger epitopen.

SDS-PAGE analysen av produktet viste et hovedbånd tilsvarende en enkelt polypeptidkjede på 52.000. Denne verdi er litt lavere enn den tilsynelatende molekylvekten for humanurokinase (54.000), som bestemt ved SDS-PAGE. Immunoblotting av SC-UK med monoklonale anti-urokinase-antistoffer eller polyklonale antistoffer indikerte at proteinet var immunologisk relatert til urokinase. Ingen reaksjon ble observert med anti-vev PA.

SC-UKL ble ytterligere karakterisert for dens fibrinolytiske og aminolytiske aktivitet. Den fibrinolytiske aktiviteten for SC-UK, bestemt ved hjelp av fibrinplatemetoden, ga et resultat på 18.823 IU/ml (ODgso)» det vil si 7 ganger lavere enn den spesifikke aktiviteten for ren 54.000 urokinase. Også den amidolytiske aktiviteten til det syntetiske substrat ALME ga også et resultat som var ca 12 ganger lavere enn det for urokinase. Den amidolytiske aktiviteten økte imidlertid 8 ganger etter behandling med plasmin. En slik økning er forbundet med en omdannelse fra det enkeltkj" edete til et dobbeltkjedet protein som elektroforetisk er lik humanurokinase hvilket bekrefter at SC-UK er en forløper for humanurokinase.

Noen kvantitative data som er relatert til denne rensing, er angitt i nedenstående tabell:

EKSEMPEL 7

Dobbeltantistoff-" sandwich"- LISA

Fleksible mikrotiterplater med 96 brønner (FALCON 3912) belegges med 100 pl/brønn av renset anti-UK IgGs (en metode for dets fremstilling er angitt nedenfor i eksempel 8) fortynnet 1:200 i PBS pH 7,2 (10 pg/ml IgGs) og inkubert i 1 time ved 37 'C. Etter vasking med PBS-BSA-Tween 0,05 %, bringes brønnene i kontakt med 250 pl/brønn av PSB-BSA 3 % i 2 timer ved romtemperatur for blokkering av ubelagt plast-overflate. Etter kassering av denne oppløsning blir 100 pl av den hensiktsmessig fortynning av standard urokinase i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Flow Labs.) supplert med 10 % FCS (kalvefosterserum) eller 100 pl A431 cellesupernatant, tilsatt til hver brønn og hensatt for å reagere natten over ved 4°C. Mikrotitere ble deretter vasket med PBS-Tewwn 0,05 % og inkubert med 100 pl/brønn av 5B4-ERP konjugat (en metode for dets fremstilling er angitt nedenfor i eksempel 9) fortynnet 1:100 i PBS-BSA 0,3 1», Tween 0,05 % 30 min. ved 37°C. Etter vasking inkuberes mikrotiterne med 200 pl/brønn av en 1 mg/ml oppløsning av o-fenylendiamin i 0,1 M natriumcitrat pE 5 inneholdene 5 mM H2O2 i 30 min. ved 37° C. Reaksjonen stoppes med 4,5 M H2SO4, og den optiske densitet avleses ved 492 nm. Middelverdiene for den optiske densitet for kontrollprøven, standardoppløsningene og testprøvene bestemmes separat. Etter subtrahering av verdien for den optiske densitet for kontrollprøven fra standarden samt testprøvene, oppnås urokinaseinnholdet i testprøvene ved interpolasjon av de tilsvarende konkurrerende forholdsverdier på kalibreringskurven. Kalibreringskurven trekkes hensiktsmessig på et semilogpapir ved plotting av den optiske densitet ved 492 nm for hver standardprøve mot den tilsvarende urokinase-konsentrasjone. Validitetsforsøk indikerer at innen-analysenøyaktighet (CV) varierer fra 4 til 8 %, mens mellom-analysenøyaktighet (CV) generelt er fra 7 til 23 %. Analytisk utvinning varierte fra 87 til 114 %>. Anvendelsesområdet er fra 15 til 100 mg/ml antigen.

EKSEMPEL 8

Rensing av anti- urokinase- immunoglobelin ( IgGs) fra et konvens. ionelt anti- UK- antiserum

Anti-UK-kaninserum ble oppnådd ifølge vanlige immuniserings-metoder ved bruk av høyrenset 54.000 urokinase (ca 120.000 IU/mg). Mer spesielt immuniseres friske hvite New Zealand-kaniner med 500/pg høyrenset 54.000 urokinase (ca 120.000 IU/mg) i komplett Freunds hjelpemiddel.

Booster-injeksjoner av den samme mengden antigen i ukomplett Freunds hjelpemiddel administreres etter 4, 6 og 8 uker. Blodprøve tas fra dyrene ukentlig, og anti-urokinase-antistof f titere bestemmes ved bruk av antiserumenzym-immunoanalyse for anti-urokinase. Etter 12 uker tappes alt blod fra dyrene, og IgG-immunoglobelinfraksjon renses ved affinitetskromatografi på protein-A sefarose.

1 ml av det oppnådde antiserum anbringes på en protein A-sefarosekolonne (kolonnestørrelse: 1,6 cm x 4 cm) på forhånd likevektsinnstilt med 0,1 M natriumfosfatbuffer pH 8,0 ved en strømningshastighet på 20 ml/time. Etter vasking med den samme bufferen elueres IgGs med 0,1 M eddiksyre pH 3. Fraksjoner av 2 ml oppsamles, og IgGs-tilstedeværelse overvåkes ved enzym-immunoanalyse. Fraksjoner inneholdene IgGs justeres til pH 7,2 og lagres i frossen tilstand ved

-20°C inntil bruk.

EKSEMPEL 9

Merking av monoklonalt antistoff 5B4 med pepperrot- peroksydase

MAB 5B4 merkes med pepperrot-peroksydase (HRP) ved bruk av glutaradlehyd som kryssbindingsmiddel ifølge følgende metode. En 10 mg porsjon av HRP oppløses i 200 pl 0,1 M natriumfosfat pH 6,8 inneholdene 1 # glutaraldehyd og hensettes til å reagere ved romtemperatur i 18 timer. Reaksjonsblandingen dialyseres mot 0,9 NaCl og bringes til 1 ml med den samme oppløsningen. Deretter tilsettes 1 ml 0,9 % NaCl inneholdene 5 mg MAB 5B4 og 2 pl natriumkarbonat 0,5 M pH 9,5 og får reagere i 4 timer ved 4°C. For å blokkere den gjenværende aktive gruppe tilsettes 100 pl 0,2 M lysin, og det hele hensettes ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen dialyseres deretter natten over mot 0,9 % NaCl og gelfiltreres gjennom en Sephacryl® S-200 kolonne (kolonnestørrelse: 1,6 x 100 cm) på forhånd likevektsinnstilt med fysiologisk oppløsning (strømningshastighet 14 ml/time). Kromatografien overvåkes ved å følge transmittansen ved 280 nm. Toppen som eulerer ved kolonnens tomvolum oppsamles og holdes frosset ved -20" C inntil bruk.

Claims (9)

1. Monoklonalt humanurokinase-antistoff, karakterisert ved følgende egenskaper: a) det er et IgG^, b) det har en af f initetskonstant på (1,42 + 0,71) x IO<7> 1 mol-l for immobilisert humanurokinase målt vesentlig ifølge metoden beskrevet av Tsapis et al i Eur. J. Biochem. 64, 369 (1976), c) det binder urokinase av høy molekylvekt (54.000) og/eller den enkeltkjedede urokinase-forløper uten å binde urokinasen av lav molekylvekt (33.000), d) det binder det 18.000 proteolytiske fragment i urokinasens Å-kjede, e) det kryssreagerer ikke med enzymatisk aktive serum- eller urinendopeptidaser andre enn urokinase.

2. Monoklonalt humanurokinase-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at a) det ikke svekker urokinasens enzymatiske aktivitet, b) det har et isoelektrisk punkt på ca 5,75.

3. Monoklonalt humanurokinase-antistoff ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det, når det er koblet til en egnet matrise, kan binde humanurokinase ved en pE-verdi mellom 4,5 og 8,0 selv i nærvær av 0,5 M vandig natriumklorid, og frigjøre den bundede humanurokinase ved en pH-verdi mellom 3,0 og 4,0 i 0,5-1 M vandig natriumklorid.

4 . Immunoadsorberende middel for rensing av humanurokinase som gir et urokinaseprodukt som har følgende egenskaper: a) det har en fibrinolytisk titer høyere enn 130.000 IU/ml, b) det er rikt på urokinase av høy molekylvekt og/eller den enkeltkjedede urokinase-forløper for denne, c) det er praktisk talt fritt for urokinase av lav molekylvekt , d) det har fibrinolytisk/esterase-aktivitetsforhold over 2.000, e) det er praktisk talt fritt for tromboplastiniske kontaminanter (null-koagulantaktivitet ved konsentrasjon på 200 Ul/ml); og/eller den enkeltkjedede forløper for denne som gir en humanurokinase-forløper som har følgende egenskaper: a) det er et enkeltkjedet protein med MW 50-54.000, b) det er nesten fritt for amidolytisk aktivitet, c) det har høy fibrinaktivitet, d) det inaktiveres ikke av plasma-inhibitorer, e) det omdannes til en tokjedet aktiv plasminogen-aktivator ved behandling med plasmin, karakterisert ved at nevnte immunoadsorberende middel er oppnådd ved binding av det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 til en matrise valgt fra agarose, modifisert og/eller aktivert agarose, tverrbundet dekstran, cellulose og karboksymetylcellulose.

5. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge krav 1, i en dobbeltantistoff-"sandwich"-metode omfattende a) bevirkning av reaksjon mellom en testoppløsning inneholdene antigenet og et første urokinase-antistoff immobilisert på en fastfasebærer for å binde antigenet til den faste fasen, b) anbringelse av en oppløsning inneholdene et annet urokinase-antistoff hvortil det er bundet en markør som kan bestemmes, i kontakt med det bundede antigenet, hvor ett av nevnte første og andre antistoffer er et monoklonalt antistoff som har egenskapene til nevnte antistoff ifølge krav 1, c) detektering eller analyse av antigenet i overensstemmelse med den grad i hvilken markøren som kan bestemmes har blitt bundet til fastfase-bæreren, for detektering eller analyse av et antigen valgt fra human-urokinase og/eller en forløper for denne.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte monoklonale antistoff ikke svekker urokinasens aktivitet, har et isoelektrisk punkt på ca 5,75.

7. Anvendelse Ifølge krav 5 hvor det "første" antistoffet velges fra et anti-urokinase-antiserum, et anti-urokinase-renset immunoglobulin G og et monoklonalt antistoff som er kjent for å bindes til et sete i antigenet som er forskjellig fra bindingssetet i det "andre" monoklonale antistoffet, og at det andre antistoffet er et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller 2.

8. Anvendelse ifølge krav 5, hvor markøren som kan bestemmes, og er bundet til det "andre" antistoffet er et enzym, fortrinnsvis pepperrot-peroksydase.

9. Anvendelse ifølge krav 5, hvor fastfase-bæreren er en preformet polyvinyl-mikroplate.