CN1019132B - 抗尿激酶单克隆抗体,带有它的基质,其试验方法和使用它的生化试验药盒 - Google Patents
抗尿激酶单克隆抗体,带有它的基质,其试验方法和使用它的生化试验药盒Info
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Abstract
本发明涉及一类新的IgGl单克隆抗体,其针对人尿激酶抗原决定部位,选择性地结合高分子量尿激酶(54000)或其单链前体,而不与低分子量(33000)尿激酶结合,其对尿激酶的亲和常数适用于以免疫吸附为基硅的提纯系统而不影响尿激酶的酶学活性。该抗体在免疫检定中也是有用的。
Description
本发明涉及一类新的Ig G1单克隆抗体,它们针对人类尿激酶上的抗原决定部位,选择性地与高分子量的尿激酶(5400)或其单链前体相结合,而不与小分子量的尿激酶(3300)结合,并具有对尿激酶的恒定的亲和性,该亲和性适用于以免疫吸附为基础的纯化系统而不损害尿激酶的酶活性。
本发明的单克隆抗体,当与适宜的基质结合时,就会给出一种能从生物原料中提纯出人类尿激酶或其单链前体的免疫吸附剂基质。这些免疫吸附剂,因为具有抗体对其抗原的最佳的亲和力,所以也特别适于工业上提纯人类尿激酶或其单链前体。
本发明的单克隆抗体,还特别适用于检测大分子量人类尿激酶(HMW尿激酶)或其单链前体的分析方法。例如以免疫荧光为基础的检测方法,放射性免疫检测方法和酶学免疫检测方法。
人类尿激酶是已知的血纤维蛋白溶酶原的激活物(PA),主要由肾细胞产生。
其主要生理学作用可能是作为血纤维蛋白系统的一种激活物,因而可用尿激酶治疗急性的血管病。例如心肌梗死,中风,肺栓塞,深部静脉血栓形成,外周动脉阻塞,出血及视网膜静脉阻塞。
血纤维蛋白溶酶原激活物(PA)是可将血纤维蛋白溶酶原转变成血纤维蛋白溶酶的丝氨酸蛋白酶,其为一种对血凝块的主要成分血纤维蛋白有高度特异性的蛋白酶。至少已自培养的肿瘤细胞系中分离出的两种不同类型的免疫学的PA:即与组织血纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)有关的PA(参见Rijken D.C.,Wijngaard G.Iaal-de Jong M.
,Welbergen J[1979]Biochim Biophys Acta 380,140)和与尿的激活物(UPA)有关的PA(又称尿激酶)(参见Williams J.R.B.[1951] Br.J.Exp.Pathol 39.530)。
这一种尿激酶类型物最初是以两条链之蛋白质的形式从尿中提纯出来的,而近来则以酶原形式(称作原尿激酶),从人类表皮样癌细胞株HEp3(参见Wun T.D.,Ossowsky L.和Reich E.[1982]J.Biol Chem,257,7262)glyoblastoma 细胞(参见Nielsen L.S.等人,[1982]Biochem 21,6410)尿(参见Husain S.C.等人,[1983]AArch Biochem Biophys 220,31)以及人肾永久细胞系TCL-598(参见Kohno T.等人[1984]Biotechnol 2,628)中分离得到。最近,也已从人类拟表皮癌细胞系A431的上清液中鉴定出了一种免疫学上与尿激酶有关的酶原。
这种原尿激酶酶原是一种分子量为50-54000的单链蛋白质,没有或有很低的酰胺基分解活性,具有高度血纤维蛋白亲和力,它对二异丙基氟磷酸盐的处理有抗性,可被血浆抑制剂失活(参见Gurewich等人[1984]J.Clin Invest 73 1731),并且用血纤维蛋白溶酶处理可转换成有两条链的活性酶(尿激酶)。
人类尿激酶分子已被以几种活性形式分离出来,但主要是高分子量形式(分子量约54000)和低分子量形式的(分子量约33000)。低分子量形式(LMW)是由大分子量形式(HMW)经酶切转换而来的。
高分子量形式由分子量为30,000的重链(B链)和分子量为20,000的轻链(A链)以二硫链连接而成。低分子量形式则由包含活性位点的整个B链和一条由A链转化而来的蛋白水解抗性小片段(MW=2427)以二硫链连接而成。A链经蛋白水解而分成一条分子量18000的片段和一条分子量大于2427道尔顿的片段。
就其在体内促进血块分解的活性而言,似乎低分子量的尿激酶不如高分子量尿激酶(M.Samama等人,Thromb.Haemostas.40,578-580,[1979]和G.Hurano等人,Blood,55,430-436[1980])。目前,人类尿激酶主要是用常规纯化技术从生物原料中获得,例如从人尿,组织培养物,特别是正常的或肿瘤性的肾细胞培养物中得到。人类尿激酶酶原一旦被激活,可以起到与尿激酶相类似的生理学作用。近来,对用DNA技术制备人类尿激酶已有报道(参见欧洲公开专利申请92182号(Eur.Pat.Appln.Publ)]。
自从C.Milstein和G.Kohler(Natyre,256,495-497[1975])有关能产生单克隆抗体的细胞杂交的开创性工作以来,对抗尿激酶单克隆抗体已有了描述。例如,比利时专利896253号(Belgian Patent N896253)公开了从用低分子量尿激酶(33000)免疫的小鼠中获取几种单克隆抗体。这些单克隆抗体显然直接针对低分子量尿激酶之抗原决定部位。这些抗体中的一种,定名为AAU2的,被选用来提纯尿激酶(参见P.Herion和A.Bollen,Bioscience Reports 3,373-379[1983])。所获取的尿激酶,当然含有低分子量和高分子量两种形式。D.Vetterlein和G.J.Colton描述了用固相单克隆抗体提纯尿激酶的方法(Thromb Haemostas [Stuttgard] 49,24-27[1983])。所述的提纯因数小于2.4(从60000-70000 CTA单位/毫克到142000-167000 CTA单位/毫克,见第25页右边一栏,第10~11行),在所述的使用尿的实验(每1毫升树脂300毫升/尿;见第26页,图2注释的第2段)中与免疫吸附剂相结合的尿激酶,并不适于工业规模上的提纯,但这些作者指出,使用单克隆抗体免疫吸附剂进行工业化提纯尿激酶的问题尚待解决。(然而,大规模地使用这种亲和技术,尚待证实,第27页,左边一栏第13-14行)。
欧洲公开专利申请84344号,从广意上公开了某些抗尿激酶单克隆抗
体。声称这些单克隆抗体适用于提纯尿激酶并用于诊断和分析目的。然而,对其终产物尿激酶,即没给出高分子量或低分子量尿激酶的含量,也没说明其生物活性物或毒性污染的含量。G.Salerni等人,描述了(Proc Natl Acad Sci Usa 81,第110-114页[1984]),另外如下所示的一些另外抗尿激酶单克隆抗体,它们与高分子量和低分子量尿激酶均有结合,并且具有一个并不适用于高效亲和层析的亲和常数。其它免疫吸附剂所带的“抗尿激酶”单克隆抗体是由L.S.Nielsen等人,(Biochemistry,21,第6410-6415页[1982])和K.Kaltoft等人,(Proc Natl Acad Sci USA,79,第3720-3723页[1982])描述的,所述的单克隆抗体抑制被定名为HPA52的血纤维蛋白溶酶原激活物的酶学活性。但是,每1毫升基质所结合的抗体量,以及经最终修饰过的基质的能力,均不适宜于工业上的应用。而且还必须使用连续的两步骤层析法,从成胶质细胞瘤细胞培养基中提纯HPA52(参见表1,第6412页)。
本发明提供了一种抗人类尿激酶单克隆抗体,它具有如下特征:
a)它是一种Ig Gl
b)当基本上按照Tsapis等人(Eur J.Biochen 64 369页[1976]所述的方法测定时,它对于固定尿激酶的亲和常数为(1.42±1.5)×107/每摩尔。
c)它与高分子量(54000)尿激酶或其单链前体结合,而不与低分子量(33000)尿激酶结合。
d)它与A链的18000水解片段相结合
e)除了尿激酶以外,它不与血清或有酶活性的尿内肽酶起交叉反应。
在以下的描述和权项中,当涉及本发明的单克隆抗体的特异性及结合性质时,从本发明的单克隆抗体结合高分子量尿激酶和尿激酶前体的特征的角度看,“尿激酶”包括高分子量形式的尿激酶以及尿激酶前体。同样
对文中所说的“高分子量形式的尿激酶”,应当理解为也包括其以相似方式与本发明的单克隆抗体相特异连接的前体。在本说明书和权利要求书中,“尿激酶前体”一词,指的是与上述尿激酶酶原相同的“天然”单链尿激酶前体,以及尿激酶前体类或由重组DNA(rec-DNA)技术获取的有关物质,该前体具有结合本发明的单克隆抗体的共同性质。
本发明的一种抗尿激酶单克隆抗体,是从由“非分泌”型的鼠骨髓瘤细胞,即不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞,与预先用尿激酶免疫的小鼠之脾细胞进行融合体细胞而获得的。
简言之,即用高度纯化的54000尿激酶免疫Bal b/c小鼠,取出的脾细胞与具有某些遗传缺陷的非分泌骨髓瘤细胞相融合,这些缺陷使它们在某些对于以后分离杂交细胞很有用的培养基中无法存活。这种细胞系的一个例子是被称作为X63-Ag 8653的细胞系,是由Kearney等人(J.Immunol123第1548-1550页[1979])所描述的,该细胞系是本专业领域的技术人员所熟知的并且是可以得到的。
对于公众来讲,这样的骨髓瘤细胞一般是通过许多科学团体的研究所而获得,如The Salk Institute Cell Distribution Center,P.O.Box 1809,Sau Diego Califernia 92112,和Institute forMedical Research,N IGMS Cell Deposi tory,Copewood and Davis Streets,Camden,New Jersey 08103。细胞融合是在有聚乙二醇存在下进行的,而优先选用的是聚乙二醇(PEG)6000。
高度纯化的54000尿激酶(HMW尿激酶)可从很多地方购得。一种适宜的高度纯化的尿激酶制剂应具有滴定国际单位(IU),高比率血纤维蛋白溶解/酯水解活性,并且很少或实际上没有凝血致活酶污染物。优先选用的一种高纯尿激酶制剂是商品名为PERSOLV
的商品化的制剂(Gvuppo Lepetit S.P.A),其血纤维蛋白溶解活性大于10.0000IU/mg,血纤维蛋白溶解/酯水解的比率大于1.4,当剂量大于20000
IU/mg时,对兔不表现热原性,当血浆浓度高达200 IU/ml时,其促凝血活性为零。优先选用的是使用低剂量尿激酶的免疫程序。一个典型的小鼠免疫程序包括,第一次免疫是在融合前60天,给予腹膜内注射低剂量的高纯度分子量为54000的尿激酶(120000 IU/mg;约10微克),使用完全弗氏佐剂;第二次是在融合前30天,腹膜内注射相同剂量,使用不完全弗氏佐剂,最后,在融合前5天,静脉内注射相同剂量以加强免疫。
只对那些在融合前10天其抗尿激酶抗体滴定高于1∶10000的动物,给予最后的加强免疫和进一步的处理。
取出脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞按大约108比5×107的比例融合。融合之后,将细胞放入适宜的培养基中培养,如用含有约10%牛胎血清的Dulbecco改良的Eagle培养基,并且使融合的细胞在次黄嘌呤,氨基蝶呤,胸腺嘧啶脱氧核苷培养基(HAT)上进行选择。使用包括有抗尿激酶“常规”抗血清的ELISA方法,对细胞培养上清液进行分析以检测抗尿激酶抗体。可使用离子交换层析或尿激酶-琼脂糖柱亲合层析法,对这样鉴定的抗尿激酶单克隆抗体进行提纯,测定所获产物的均质性,使用凝胶电泳法则很方便。之后再对这些抗尿激酶单克隆抗体的制剂,进行类别特异性和固定在琼脂糖上的抗原的亲和常数的检测。对类别特异性的检测,是根据Outcherlony的双向免疫扩散技术(Acta Pathol Microbiol Scand,26,507[1949])进行;亲和常数则基本上是按照Tsapis等人的方法(Tsepis A;Rogavol Ni Alfsen A;和Nihaesco C [1976] Eur J.Biochem 64 369),通过平衡结合实验而确定的。这些实验中,将预先用磷酸缓冲盐水(PH7.2)透析过的,基本纯净的单克隆抗体,以逐增浓度加入到带有尿激酶的基质,如尿激酶-琼脂糖基质中。未结合的抗体的浓度是用分光光度法确定的。结合的抗体的浓度是根据与所加入的总抗体的差数来计算的,而结合数据则是根据已知的统计学方法,如按G.Scatchard(Amn.N.Y.Acad Sci 5
1 660-672[1949]所述的作图法得出的。
在上述的检测中所得出的本发明之单克隆抗体的亲和常数为(1.42±1.5)×107/1摩尔。
本发明的一个目的就是将本发明之单克隆抗体应用于工业化提纯尿激酶的免疫吸收系统。
本专业领域的技术人员会意识到,并不是任何针对某一抗原(此处为尿激酶)的单克隆抗体都适用于工业化过程。众所周知,在实验室规模与工业规模的操作之间,通常有很大距离。这种显著的差别,便在事实上增大了解决问题的难度,在很多情况下,一种在实验室规模操作中令人满意的解决方案却不适用于工业规模的操作。
在本例中,适宜的单克隆抗体应当对抗原具有极好的亲和性,以能有效地结合抗原,这样便能冲洗所结合的抗原而又不会明显地释放掉,而当使用显然不同的条件洗脱时,方可使之从基质上释放。
而所用的释放条件应当足够地温和,以避免损害抗原或免疫吸附剂。
由于抗体对抗原的亲和力在某种程度上控制着最终吸附剂容量,所以亲和力低的抗体一般都是免疫吸附能力很低,而且最后提纯的产率很低(因为在冲洗中损失了活性);另一方面亲和力高的抗体一般都涉及抗原与免疫吸附剂的结合都太紧,且产率很低,其原因可能是难于洗脱或洗脱的条件太剧烈(或可能使之变性)。然而,单克隆抗体的亲和常数以及相应的免疫吸附能力,对于建立在免疫吸附基础上的工业化的提纯过程来说,并不是唯一重要的参数,因为在该解决方案中,单克隆抗体的选择也起着很重要的作用。
事实上,本发明的单克隆抗体可与高分子量尿激酶结合,而不与低分子量形式的尿激酶或任何其它的血清或尿内肽酶结合。
特别是它们与已知的血清或尿的凝血激酶污染物无交叉反应。此外,本发明的单克隆抗体当与制成的免疫吸附剂中的基质结合时,仍然保持着
这种特异性。
具有上述的特异性的本发明之单克隆抗体,如前所述在上述的检测中其亲和常数为(1.42±1.5)×107/1摩尔,当与合适的基质结合时,其免疫吸附容量大于150000 IU/ml。
因此,本发明的单克隆抗体是具有Ig Gl(用上述固相尿激酶检测)亲和常数约为(1.42±1.5)×107/1摩尔的Ig Gl。其对高分子量形式的尿激酶或其单链前体有着很好的特异性,不与低分子量形式的尿激酶结合,也不与血清或尿激酶以外的其它尿内肽酶产生交叉反应,当与适宜的基质连接时,免疫吸附容量大于150000 IU/ml,它们能在PH4.5-8.0时,甚至在有高达0.5M氯化钠水溶液存在时与抗原结合,而在PH为3.0-4.0,在0.5-1M氯化钠水溶液中,则释放所结合的抗体。优先选用的本发明的单克隆抗体是5B4,它具有如下的特征:
a)它属于Ig Gl类
b)当基本上按照Tsapis等人(Eur.J.Biochem.64 369 [1976])所述的方法测定时,其亲和常数约为1.42×10/1摩尔。
c)它特异性地结合高分子形式(54000)的尿激酶或其前体,而不与低分子形式(33000)的尿激酶或任何血清,或促凝血酶尿污染物结合
d)它与A链18000蛋白水解色素相结合
e)它并不损害解吸附的尿激酶的酶活性
f)它的等电点约为5.75
适宜于与本发明的单克隆抗体相结合的基质有交联葡聚糖,可控制孔径的交联葡聚糖,琼脂糖、修饰的和活化的琼脂糖,如羧甲基琼脂糖,交联琼脂糖的N-羟基琥珀酰酯衍生物纤维素和羧甲基纤维素。这些基质,无论活化形式的或非活化形式的,在很多情况下均可购得。活化的基质,因为在连接反应中具有已知的操作上的优点,而被优先选用。
制备本发明免疫吸附剂,优先选用的基质是活化的琼脂糖。本发明的
单克隆抗体与基质的结合,可用已知的技术完成。当使用非活化基质时,则这种连接以使用已知的活化剂来完成为好,如使用溴化氰(epichloridin)表氯定1.4-双-(2,3-二环氧丙氧基)丁烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷。
从生物源中提纯分子量为54000的尿激酶或其前体,特别是在工业规模的提纯中优先使用本发明免疫吸附剂。此外,这种免疫吸附剂由于其对抗原的亲和性和连接单克隆抗体的特异性而可以用于分析试验系统,例如可用于放射性免疫测定,酶联免疫测定以及其它已知的竞争性结合测定法中。
本发明的进一步目的是提供一种从生物源中提纯分子量为54000的尿激酶(HMW尿激酶)或其前体的方法,其特征在于它包括将生物源或其浓缩物与本发明的免疫吸附剂在PH4.5-8.0时相接触,以选择性地使分子量为54000的尿激酶结合于本发明的免疫吸附剂,用PH6-8的缓冲液浸洗之,并用PH3.0-4.0,含有0.5-1M氯化钠的水溶液洗脱,使结合的抗原从免疫吸附剂上释放下来。
在此方法中,抗原与免疫吸附剂的结合,也可以在有浓度为0.5M的氯化钠水溶液存在下进行,而要从抗原/免疫吸附剂复合体上释放抗原,则可于有浓度为0.5-1M的氯化钠水溶液存在下完成。
正如本专业技术人员将会理解到的,可用任何有同等强度的而又不会不利于提纯过程的溶液代替氯化钠水溶液。
在本说明书和权利要求书中,“生物源”包括如尿和血,组织培养液等生物体液以及能够生产尿激酶的遗传工程化的微生物的发酵汁液,或者由本发明的单克隆抗体所识别的血纤维蛋白溶酶原激活物。
正如前已述及的,本发明的免疫吸附剂能直接从生物源中提纯高分子量形式的尿激酶;例如,当生物源为人尿时,则可获得具有如下特征的尿激酶产物:
a)血纤维蛋白水解滴度高于130000 IU/ml
b)富含高分子量尿激酶
c)实际上没有低分子量尿激酶
d)血纤维蛋白水解酶/酯酶活性比率大于2000
e)实际上不含促凝血酶污染物(在浓度为大约200 IU/ml时,凝固活性为零。)
具有上述特征的尿激酶,是从任何其它生物源材料获取的。
在工业性的提纯过程中,有时使用浓缩的生物体液代替其原液,对于使用本发明的免疫吸附剂提纯更为方便,目的是减少与免疫吸附剂相接触的液体的体积(或减少通过含有免疫吸附剂的柱的液体体积),从而降低整个过程的时间和花费。
同样,在这种情况下,本发明的免疫吸附剂保护了它的效率,并能得到具有上述特征的纯化产物。
为了更好地阐明选择适用于提纯过程的单克隆抗体的问题,(这也是本发明目的之一),兹通过下表比较本发明优先选用的定名为5B4的单克隆抗体与Salerno等人(Proc,Natl Acod Sci USA,81 110[1984])所述的定名为105.1 F10并具有与5B4相似的亲和常数的单克隆抗体之间的差异
表Ⅰ
单克隆抗体5B4和105.1 F10的亲和常数
单克隆抗体 Ka(每摩尔)
105.1 F10 4.92×106
5B4 1.42×107
具体地讲,当纯度相等的尿激酶制剂(897酯水解单位)分别通过两种不同的免疫吸附剂时,105.1 F10的结合部分占不到10%,而单克隆抗体5B4则高于70%(即77.5%)
本发明的单克隆抗体,由于它们对抗原的亲和性及特异性,则可用于分析或检测过程,可用不同的标记物标记之,例如用荧光染料,放射性同位素和酶,并于免疫荧光法,放射免疫分析法,酶联免疫分析法中使用之。
本发明的另一个目的在于,使用本发明的单克隆抗体对人尿激酶或其前体进行酶联分析放射免疫分析或免疫荧光分析。人尿激酶通常是用血纤维蛋白水解或酯水解的方法进行检测的,第一种方法是基于用尿激酶将血纤维蛋白溶原酶激活为血纤维蛋白溶酶,从而导致凝血块的溶解,第二种方法是建立在用尿激酶直接水解合成底物乙酰基-赖氨酰基-甲基-酯(ALME)的基础之上的。因而,这些分析法只检测有活性的酶,尿激酶(UK)的非活性前体,例如早期前体尿激酶,原尿激酶,或酶-抑制剂复合物则无法检测。相反,那种建立在分子的抗原性而不是其活性基础上的免疫检测方法,却对酶的活性形式及非活性形式都能检测。
检测或分析尿激酶或其“非活性”前体(例如尿激酶酶原或原尿激酶)的一种很方便的免疫分析方法,是双抗体夹心法,其包括:
a)使含有抗原的受试溶液与固定在固相载体上的第一抗尿激酶抗体作用,以使抗原结合到固相上,
b)使含有带可识别的标记物的第二抗尿激酶抗体的溶液与已结合到固相上的抗原相接触,在所说的第一和第二抗体中,有一种是本发明的单克隆抗体,
c)根据已与固相载体相结合的可识别标记物检测或分析抗原。
“第一”抗体优先选自抗尿激酶抗血清纯化的抗尿激酶免疫球蛋白G(Ig Gl)以及已知与“第二”抗体在不同的位点同抗原相结合的单克隆抗体(并且非常明确是不干扰所述的“第二”抗体的结合)。“试验溶液”
可以是任何含有能与本发明的单克隆抗体相结合的抗原的溶液,且包括生物体液,发酵汁液如遗传工程化的微生物的发酵汁液,细胞培养液与浸出物。“第二”种抗体优先选自可与适当的可识别配体如酶、荧光染料或放射活性基团相连接的本发明之单克隆抗体。优先选用的可识别标记物是一种酶,而且最好是辣根过氧化物酶。优先选用的本发明的单克隆抗体是上述的单克隆抗体5B4。当所述的“第一”和“第二”抗体均为单克隆抗体时(其中的一种是本发明的单克隆抗体,而另一种是其它的抗人尿激酶单克隆抗体,且其在与本发明的抗体于不相同的抗原结合位点上同抗原结合,并且也不影响本发明的单克隆抗体的结合),则它们在上述的分析方法中是可以互换的。换句话说,即两种单克隆抗体中一种可以是“第一”抗体;而另一种为“第二”抗体,或反之。相反地,当在分析中,其中的一种抗体为一种常规抗血清时,这种情况下就必须使其作为“第一”抗体,因为这种系统比相反情况下的系统的效率高。
单克隆抗体与酶标记物的偶联,可按已知的技术来完成。优先选用的偶联剂是戊二醛。当可识别的标记物是一种酶时,使用某一产生颜色的显色酶底物且其为标记酶的一种已知的合成底物,当与酶一起温育后,就生成一种有颜色的衍生物,与被试化合物标准制剂比较颜色强度所产生的,以检定和定量计算。除了这些定量的方面以外,本方法可以在任何情况下用于定性测定,即仅确定在未知样品中有无抗原。
固相载体包括纤维素颗粒,聚丙烯酰胺,交联葡聚糖,硅橡胶,微晶玻璃和塑料,并且优先的预加工材料是试管,盘,或由诸如聚苯乙烯,聚乙烯这样的塑料模铸成的微量滴定板,聚乙烯微量滴定板是优先的固相载体。本发明方法的优选使用范围为15~100毫克/毫升抗原。正如本专业技术人员所熟知的,当受试样品的抗原浓度落在这个范围以外时,就要先行稀释或(如果适合)浓缩,以便使其暂时落在这个最适浓度范围内。本方法的可用性通过对组部和组间分析的精密度及分析百分回收率的统计学
分析而得以证实。一般组内精密度(变异系数CV)为4-8%,组间精密度(CV)为7-23%,而分析性回收率一般为81-114%。还证实了本发明的单克隆抗体对由人表皮样癌细胞(A431细胞,Fabricant,De.Larco Todaro,1977,Proc Nath Acad Sci USA 74 565)产生的尿激酶样血纤维蛋白激活物前体的特异性,并可使用本发明的方法对所产生的前体进行分析。
以下的实施例旨在详细地阐明本发明,而不应理解为对本发明范围的限制。
实施例1
抗尿激酶单克隆抗体5B4的制备
a)抗尿激酶单克隆抗体的产生
用高纯度54000道尔顿尿激酶120000 IU/mg(PERSOLV
RICHTER)免疫7周龄雌性Balb/C小鼠。在融合前60天,将10微克这种尿激酶与完全弗氏佐剂混合后注射进动物腹膜内,30天后,再给小鼠10微克这种尿激酶。融合前10天,用常规ELISA方法测定从尾静脉所取血样中抗尿激酶抗体的效价,并仅对融合前5天抗体效价高于1∶10000的动物静脉内给以10微克尿激酶作最后的加强免疫。融合当天分离脾脏,将脾细胞(大约1×108)与5×107鼠骨髓瘤细胞X63-Ag8653在50%PEG6000中融合。
当基本上按照C.Milstein和G.Kohler的方法进行融合以后,将细胞重新悬于Dulbeccos改良的Eagle培养基(DMEM)中,并辅以10%胎牛血清和HAT培养基(0.1毫摩尔次黄嘌呤,0.25毫摩尔氨基蝶呤,0.017毫摩尔的胸腺嘧啶脱氧核苷,Flow实验室)并加到5个不同的含有鼠巨噬细胞(饲养层)的Coster平板上。
每3天换HAT培养基,从融合后的第10天起,每2-3天用ELISA免疫检测法测定上清液中有无抗尿激酶单克隆抗体。
b)用ELISA法筛选产生抗尿激酶单克隆抗体的杂交瘤细胞。
根据改进的Perlman方法(Immunochemistry 8,8731 [1971]),使用96孔微量滴定板(Dynatech),以50微升/每孔加进溶于PH7.2磷酸缓冲盐水和含0.5摩尔氯化钠的0.05摩尔磷酸钠溶液PH7中的浓度为20微克/毫升的尿激酶,并在室温下温育1小时。用0.05% Tween20磷酸缓冲盐水彻底清洗后,各孔中填满3%,牛血清白蛋白磷酸缓冲盐水,于室温下放置3小时以避免非特异性结合。小心清洗后,各孔中加以50微升杂交细胞培养物的上清液(或等体积的腹水),并使其在室温下作用2小时,然后洗板,并与1∶1000稀释的结合有辣根过氧化物酶(P I61.DAKO)的兔抗鼠免疫球蛋白稀释液于室温下温育90分钟。彻底清洗后,将板用浓度为1毫克/毫升的溶于0.1摩尔柠檬酸盐缓冲液(PH5)及1.7毫摩尔H2O2的色素原邻苯二胺(SIGMA)溶液,(200微升/每孔)温育。20分钟内显色,对照没有抗原和抗体的空白于492nm处读出光密度值。孔中颜色水平比空白高4倍的被认是阳性。
c)生物量培养产生抗尿激酶的杂交瘤细胞
用有限稀释法选择并克隆化产生抗尿激酶抗体的杂交瘤细胞,以生物量培养物进行培养并腹膜注射于预先用0.5毫升降植烷(Pristane)(2.6,10,14-四甲基正十五烷;Aldrich)处理过的Balb/c小鼠。15天后收集腹水。抗尿激酶单克隆抗体的浓度在10-20毫克/毫升的范围以内。使用A蛋白琼脂糖或尿激酶-琼脂糖亲和层析柱对其进行纯化。
以CNBr-活化的琼脂糖HMW与高纯度的尿激酶(120000 IU/mg)反应,制备琼脂糖-尿激酶结合物。结合效率约为20毫克尿激酶/毫升膨胀凝胶。然后将上述获取的腹水(由杂化细胞产生的1毫升)在预先用0.01摩尔磷酸钠缓冲液PH8.0平衡过的琼脂糖-尿激酶亲和柱(1.6厘米×15厘米)上过柱。在用同样的缓冲液洗过之后,用0.1摩尔乙酸PH3.0
洗脱选择吸附的抗尿激酶单克隆抗体。收集含抗体的部分,用PSDE09005微孔膜超滤浓缩,冷冻保藏备用。
e)用凝胶电泳法测定单克隆抗体的纯度和均质性。
按W.K.Laemmli[Nature 227 680[1970]]所描述的方法,将上述获取的单克隆抗体进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。只根据相对应于Ig G重链和轻链的带来证明上述的洗脱物中含有纯的免疫球蛋白。
f)亲和常数的确定
加入悬浮于PH7磷酸盐缓冲盐水的2%琼脂糖-尿激酶等分悬浮(各0.5毫升),以提高纯的抗尿激酶单克隆抗体制剂的浓度(这些制剂是根据上述方法d),在PH7磷酸盐缓冲盐水中透析而制取的)。在室温下将样品顶底相倒地旋转2小时,对照组则不加树脂。
于280nm(E1% 1cm=14)经分光光度法测定未结合的抗体浓度,结合的抗体浓度由其与所加入抗体总量的差值而得出。全部结合的数据按照Scatchard(Amm N.Y.Acad Sci,51 660-672[1949])作图法而得出。定名为5B4的单克隆抗体的亲和常数为1.42×107/摩尔。
实施例2
抗尿激酶单克隆抗体5B4在活化琼脂糖上的固定。
用3体积的异丙醇和3体积的冷蒸馏水洗活化的琼脂糖(具有不带电的10个原子长的隔离臂的交联琼脂糖球的N-羟基琥珀酰胺活性酯衍生物;Affi-gel 10
;Bio-rad Inc;14克,湿重)。然后将凝胶再悬浮于PH8.0的0.1摩尔碳酸氢钠缓冲液中(终体积为20毫升)。将溶于0.1摩尔碳酸氢钠缓冲液中PH8.0的如上获得的高纯单克隆抗体5B4(9.7毫升)加到凝胶悬浮液中。置于室温下4小时后,加入1摩尔乙醇胺盐酸盐水液(PH8.0,1.5毫升)中,以封闭树脂的未反应的酯基。封闭反应于室温进行1小时。然后将凝胶装入柱内,先用10体积的偶联缓冲液
(0.1摩尔碳酸氢钠水溶液,PH8.0)洗,之后用0.1摩尔的乙酸水溶液,接着再用含有1摩尔氯化钠水溶液的0.1摩尔乙酸水溶液,最后用含有0.5摩尔氯化钠水溶液的0.05摩尔磷酸钠缓冲液PH7.0洗。偶联的效率是在反应前及反应后,于280nm对上清液样品进行分光光度测定而得出的。在分析前将这些样品调至PH2,以消除N-羟基琥珀酰亚胺对读数的干扰。
每毫升树脂固定2.5-4毫克单克隆抗体5B4。
实施例3
a)对5B4-琼脂糖免疫吸附剂容量的判定
5B4-琼脂糖的最大容量是用“纯的”和粗的尿激酶制剂进行评价的。5B4琼脂糖柱(1.6×10厘米)用0.5摩尔氯化钠,0.05摩尔磷酸钠缓冲液(PH7.0)平衡,加入“纯的”尿激酶(120000 IU/mg)直至在流出液中可检测出酯水解活性。然后用平衡缓冲液洗柱,用1摩尔氯化钠,0.1摩尔乙酸洗脱使酶解吸附。将结合部分中回收到的总活性作为柱的最大容量。
在使用尿激酶(120000 IU/mg)的情况下,5B4琼脂糖的容量为216000 IU/ml。
使用粗尿激酶制剂(700 IU/mg)重复该实验,得出容量为174000 IU/ml。
b)5B4琼脂糖对HMW,LMW及18000尿激酶的免疫吸附。
纯的HMW尿激酶(30毫克)在1毫升含有0.2摩尔氯化钠的50毫摩尔磷酸钠缓冲液(PH8.0)中温育8小时,所获取的HMW,LMW和18000蛋白水解片段的比率大约为4∶4∶2。这些产物在可控制孔径的交联多葡聚糖柱(Sephcdex
G100,Superfine;1.5×100cm)上凝胶过滤分离,柱预先用含有0.2摩尔氯化钠的5毫摩尔磷酸钠缓冲液(PH4)平衡,并用同样的混合物以3毫升/小时的流速洗脱。然后收集含单一产品的洗脱组分。将存在于含0.1%(v/v)Tween18 20的磷酸缓冲液中盐水(
PH7.5)中的无标量5B4-琼脂糖(按上述制备)悬浮液,分别加到各含有溶于同样缓冲液中的0.5毫升HMW,LMW或18000尿激酶蛋白水解片段之溶液(各为250微克/毫升),并用同样的缓冲液将终体积调至1.5毫升。
所有样品均底对底地于室温下旋转1小时,然后以每分钟2000转离心。通过在280nm处读出上清液的光密度来测定未结合材料的量;结合材料的量则由其与加入的总量之差而确定。
在这些实验中,90%以上的HMW尿激酶和18000蛋白水解片段被吸附于5B4-琼脂糖柱上而LMW尿激酶则不被吸附。
实施例4
用5B4-琼脂糖免疫亲和提纯尿激酶
在一个层析柱(1.6×9cm)中装以按照实施例2所述方法得到的5B4-琼脂糖免疫吸附剂,用0.5摩尔氯化钠水溶液和0.05磷酸盐缓冲液(PH7.0)平衡。然后以60毫升/小时的流速加入粗的尿液浓缩物。用平衡缓冲液洗过之后,用1摩尔氯化钠水溶液和0.1摩尔乙酸水溶液洗脱尿激酶。收集含尿激酶的各部分,调至中性并冰冻干燥。回收的尿激酶的比活性总是大于130000 IU/mg。
表中给出定量分析数据:
表Ⅲ
组织促凝血酶原激酶污染物:193 IU/ml血浆时凝结作用为零(零
凝结作用值:80 IU/ml血浆美国国家
心脏研究所)
对鼠的急性毒性作用,在100000 IU/kg时,无毒性,e.v.
狗的全身耐受性:20000 IU/kg,动脉血压无显著变化
通过高效液相层析(HPLC)分析,证明存在有高分子量(54000)尿激酶,而没有低分子量(33000)尿激酶。
所获尿激酶的纯度,也用在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺上的凝胶电泳来进一步确定。在这个试验中,事实上已肯定了用5B4-琼脂糖纯化的尿激酶产物基本上是分子量为54000的尿激酶。
这些实验重复进行了多次(50次以上)而其结果没有显著的变化。
与此相一致,负载于柱上的血纤维蛋白溶解活性,70-80%是在结合组分中检测到的。当把未结合组分重新装载于柱上的时候,在流出物中检测出的全部活性提示,这种活性可能不是来自尿激酶,而可能是因为存在与尿激酶无关的非特异性血纤维蛋白溶解活性。
基本按上述方法,用尿(4升)代替尿的浓缩物,制得了基本具有上述特征的尿激酶。
实施例5
制备A431细胞液
A431细胞在Dulbecco氏改进的Eagle培养基中生长至融合;培养基中含有10%胎牛血清(Flow Laboratories),100单位/微升青霉素,100微克/毫升链霉素(Flow Lab)和2mM谷氨酰胺装入生长面为150平方厘米的塑料培养瓶中(NUNC)。收集上清液,经离心以除去碎片,在有蛋白酶抑制剂(aprotinin,10微克/摩尔)存在的条件下于-80℃保藏备用。
实施例6
在5B4-琼脂糖柱上用免疫亲和方法从A431细胞中提纯单链尿激酶前体。
将1.5升按上述实施例5方法制备的并经过离心的上清液,加入到基本上按实施例2方法获取的5B4-琼脂糖免疫吸附柱(10毫米×30毫米)上,柱预先用0.15摩尔氯化钠,0.05磷酸钠缓冲液(PH7.0),以40毫升/小时的流速平衡。用50毫升平衡缓冲液洗柱,然后用1摩尔氯化钠,0.1摩尔乙酸进行洗脱。用包括5B4单克隆抗体的双抗体夹心免疫分析法
检测各洗脱部分中尿激酶抗原的存在(参见下述实施例7)。将所获的产物[单链尿激酶前体(SC-UK)]在-80℃ PH4.8条件下储存。
该产物的血纤维蛋白溶解活性是用血纤维蛋白单体平板方法(参见Plough J.等人,[1975]Biochem Biophys Acta 24,278)来确定,而对乙酰基-赖氨酰基-甲基-酯(ALME)的酰胺基水解活性则是用Sheery等人的改进方法[(1964)].Lab Clin Med 64,145)判定的。将纯的SC-UK(10微克)与血纤维蛋白溶酶(4微克)(Sigma)在0.5摩尔氯化钠,0.05磷酸钠(PH6.0)相混合,(终体积为0.4毫升)之后于室温下温育,即可得到活化。血纤维蛋白溶酶反应经加入溶于10微升缓冲液的100微克aprotinin(Richter)而终止。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是在还原或非还原条件下,根据Laemmli(UK[1970]Nature 227,680)的方法进行的。免疫印迹实验是基本上按照前述方法(Salerno G等人[1984]Proc Acad Sci USA 81 110)进行的,免疫反应中使用纯的MAB5B4,抗尿激酶和抗组织PA抗血清。
MAB,5B4的免疫印迹图谱表明了其与HMW-尿激酶和由HMW-尿激酶的A链衍生物的蛋白水解性(18000)片段相互作用。这一事实表明,抗原决定部位一定是定位于A链上。而在HMW-尿激酶与β-巯基乙醇的还原剂引起的构象改变破坏了抗原决定部位。
用SDS-PAGE对产品进行分析,揭示了一个与52000的单个多肽链相应的主要谱带。正如用SDS-PAGE测定的那样,这个数值稍低于人尿激酶(54000)的表观分子量。SC-UK与抗尿激酶单克隆抗体或多克隆抗体的免疫印迹表明这种蛋白质免疫学上是与尿激酶相关的。但没见到与抗组织PA的反应。
SC-UK则进一步由其血纤维蛋白溶解活性和酰胺水解活性而特征
化。用血纤维蛋白平板方法检定SC-UK的血纤维蛋白溶解活性,结果为18823 IU/ml(OD280),即比纯54000尿激酶的特异活性低7倍。此外,对合成底物ALME的酰胺分解活性比尿激酶约低12倍。然而,在用血纤维蛋白溶酶处理后,酰胺分解活性则提高8倍。这种增高与由单链转变为与人尿激酶电泳相似的双链蛋白质有关,从而进一步证实SC-UK是人尿激酶的前体。
有关这一提纯的某些定量数据在下表中给出:
实施例7
双抗体夹心ELISA
柔韧的96孔微量滴定板(FALCON 3912)以100微升/每孔加入溶于PBS(PH7.2)中的1∶200稀释的纯净抗UK Ig G(其制备方法见下述实施例8),并在37℃温育1小时。用0.05% PBS-Tween洗过之后,各孔按250微升/每孔加入PBS-BSA3%,于室温下处理2小时,以封闭未被包被的塑料表面。弃去该溶液后,每孔中加入溶于Dul
becco氏改进Eagle培养基(DMEM,Flow Labs)培养基中辅以10%胎牛血清(FCS)中的标准尿激酶的稀释液100微升,或100微升A431细胞上清液,然后在4℃反应过夜。用PBS-Tween 0.05%洗板,之后加溶于PBS-BSA0.3% Tween0.05%中的1∶100稀释的5B4-HRP结合物(100微升/每孔),于37℃,温育30分钟。清洗后,加入溶于含有5毫摩尔H2O2的0.1摩尔柠檬酸钠(PH5.0)中的邻-苯二胺1mg/ml溶液(200微升/孔),于37℃温育30分钟。用4.5摩尔H2SO4终止反应,并于492nm读出光密度值。分别计算空白,标准溶液及各被试样品孔的平均光密度值。用标准以及样品孔的光密度值减去空白的光密度值之后,在校正曲线上内推出相应的竞争率值而获得样品的尿激酶含量。校正曲线是在半对数座标纸上将各标准样品在492nm的光密度值对相应的尿激酶浓度作图便很容易得到。实验结果表明,组内精密度(CV)在4-8%之间变化;而组间精密度(CV)一般在7-23%之间变化。分析性回收率为87-114%。应用范围是15-100毫克/毫升抗原。
实施例8
从抗-UK常规抗血清中提纯抗-尿激酶免疫球蛋白(Ig Gs)
用高纯度54000尿激酶(约120000 IU/mg)按一般免疫过程获得兔抗-UK抗血清。具体地讲,是用500/μg高纯度54000尿激酶(约120000 IU/mg)于完全弗氏佐剂中免疫健康新西兰白兔。
在4、6、8周后,注射相同剂量抗原(于不完全弗氏佐剂中)加强免疫。每星期给动物放血一次,并使用抗尿激酶抗血清酶-免疫分析法测定抗尿激酶抗体的效价。十二周后,将动物完全放血,在A蛋白琼脂糖柱上以亲合层析法对Ig G免疫球蛋白进行提纯。
将1毫升抗血清过A蛋白-琼脂糖柱(1.6cm×4cm),该柱用0.1摩尔磷酸钠缓冲液(PH8.0)以20毫升/小时的流速予平衡。用同样的缓冲液洗过之后,用0.1摩尔乙酸(PH3.0)洗脱Ig G。每管收集2毫升,用
酶免疫分析法监测Ig G。将含有Ig G的各管调PH至7.2,置于-20℃冷冻保存备用。
实施例9
用辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体5B4
用辣根过氧化物标记MAB 5B4,使用戊二醛作为交联剂,依下述方法进行,将10毫克HRP溶于200微升含有1%戊二醛的0.1摩尔磷酸钠(PH6.8)内,于室温下放置18小时。反应混合物用0.9%氯化钠溶液透析,并用相同的溶液调至1毫升。然后加入0.9%氯化钠溶液1毫升[其中含有5毫克MAB 5B4及200微升0.5摩尔碳酸钠溶液(PH9.5),并于4℃反应24小时。为了封闭其余的活性基团,则加入了100微升0.2摩尔的溶血素,并于室温下静止2小时。然后将混合物用0.9%氯化钠溶液透析过夜,并用一个Sephacryl
-S-200柱凝胶过滤(柱床体积:1.6×100cm),该柱用生理溶液(流速为14毫升/小时)预平衡,测定280nm的透光率以监测层析。
收集柱床外水体积的洗脱峰,并于-20℃冷冻保存备用。
Claims (15)
1、一种制备能产生抗尿激酶单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法,经过培养,该杂交瘤细胞能够产生具有如下特征的抗尿激酶抗体:
a)其为IgG1,
b)当基本上按照Tsapis等人(Eur.J.Biochem64,369[1976])所述的方法测定时,其固定人尿激酶的亲和常数为(1.42±1.5)×107/摩尔,
c)它结合高分子量(54000)尿激酶和/或单链尿激酶前体,而不与低分子量(33000)尿激酶结合,
d)它结合尿激酶A链的18000蛋白水解片段,
e)除了尿激酶以外,它不与血清或尿的活性内肽酶结合,
它包括将被分子量为54000的尿激酶免疫的宿主细胞与同种动物的骨髓瘤细胞在有融合促进剂存在的条件下进行体细胞融合,用酶联免疫分析法并使用常规抗尿激酶抗血清筛选所要的能产生抗尿激酶抗体的杂交瘤细胞,检测其免疫学类别特异性、亲和常数,及所产生的抗体的特异性抗原决定部位。
2、根据权利要求1所述的方法,其中所述的体细胞是鼠脾细胞,且骨髓瘤细胞是鼠骨髓瘤细胞。
3、根据权利要求1所述的方法,其中所述的骨髓瘤细胞是鼠骨髓瘤细胞X63-Ag8653。
4、根据权利要求1所述的方法,其中被尿激酶所免疫的宿主是兔。
5、根据权利要求1所述的方法,其中所述的融合促进剂是聚乙二醇。
6、根据权利要求5所述的方法,其中所述的融合促进剂是聚乙二醇6000(PEG6000)。
7、制备权利要求1所述的抗尿激酶单克隆抗体的方法,它包括在合适的宿主或培养基中培养按照权利要求1的方法所获得的杂交瘤。
8、制备权利要求1所述的抗人尿激酶单克隆抗体的方法,该抗体另外的特征在于:
a)它不损害尿激酶的酶学活性;
b)其等电点约为5.75。
9、根据权利要求1所述的制备抗人尿激酶单克隆抗体的方法,其中单克隆抗体进一步的特征在于,当其与适宜的基质结合时,它能在pH4.5-8.0时,甚至在有0.5摩尔氯化钠水溶液存在时结合抗原,并在0.5-1摩尔氯化钠水溶液中于pH3.0-4.0时释放出所结合的抗原。
10、一种从生物来源纯化54,000MW尿激酶或其单链尿激酶前体的方法,它包括将一种生物源或其浓缩物在pH4.5~8.0时与一种通过将抗尿激酶抗体与选自琼脂糖、改进的或活化的琼脂糖、交联葡聚糖、纤维素或羧甲基纤维素的基质交联而获得的免疫吸附剂接触以将54,000MW尿激酶或其单链尿激酶前体选择性地与免疫吸附剂结合,用pH6-8的缓冲液冲洗,用含有或不含有0.5-1摩尔NaCl水溶液(pH3.0-4.0)的洗脱液洗脱,将所结合的抗原从免疫吸附剂上释放下来,其中所说的抗体具有如下特征:
a)其为IgGl,
b)当基本上按照Tsapis等人(Eur.J.Biochem 64,369〔1976〕)所述的方法测定时,其固定人尿激酶的亲和常数为(1.42±1.5)×107/摩尔,
c)它结合高分子量(54000)尿激酶和/或单链尿激酶前体,而不与低分子量(33000)尿激酶结合,
d)它结合尿激酶A链的18000蛋白水解片段,
e)除了尿激酶以外,它不与血清或尿的活性内肽酶结合。
11、根据权利要求10所述的方法,其中抗原与免疫吸附剂的结合也可以在有浓度高达0.5摩尔的氯化钠水溶液存在时完成。
12、根据权利要求10所述的方法,其中所获的尿激酶产物具有下述性质:
a)它的血纤维蛋白的溶解值高于130000Iu/ml,
b)它富含有高分子量尿激酶或其单链尿激酶前体,
c)实际上不含低分子量尿激酶,
d)它的血纤维蛋白溶解活性/酯酶分解活性的比值高于2000,
e)它实际上没有促凝血酶原激酶污染物(在浓度为200Iu/ml时凝血活性为零)。
13、根据权利要求10所述的方法,其进一步特征在于,所获得人尿激酶前体具有下述性质:
a)它是分子量为50-54000的单链蛋白质,
b)它几乎不具有酰胺基分解活性,
c)它具有高的血纤维蛋白活性,
d)它不被血浆抑制剂灭活,
e)用血纤维蛋白溶酶处理,转变成双链活性血纤维蛋白溶酶原激活剂。
14、根据权利要求10所述的方法,其中用于纯化人尿激酶和/或其单链尿激酶前体的免疫吸附剂是由权项1所述的单克隆抗体与基质即琼脂糖相连接而制得。
15、根据权利要求10所述的方法,其中单克隆抗体另外的特征在于:
a)它不损害尿激酶的酶学活性。
b)其等电点约为5.75。
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Legal Events
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