JPH1033171A - モノクローナル抗体および抗線溶剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規有用なモノクローナル抗体および抗線溶
剤の提供 【解決手段】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよび
ヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのミニ−プラスミノー
ゲンを認識し、ε−アミノカプロン酸によって結合を阻
害されず、かつヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラ
スミンへの活性化を阻害するモノクローナル抗体、およ
び該モノクローナル抗体を有効成分として含有する抗線
溶剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒトプラスミノーゲ
ンを抗原として作製されたハイブリドーマの産生するモ
ノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体を有効
成分として含有する抗線溶剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】プラスミノーゲンは肝臓で生産され、ヒ
ト血漿中には１０〜１７ｍｇ／ｄｌ、すなわち１．２〜
２μＭ含まれ、７９１個のアミノ酸からなる一本鎖糖蛋
白質で糖含量は約２％と報告されている。プラスミノー
ゲンにはＮ−末端にグルタミン酸をもつＧｌｕ−プラス
ミノーゲン（Ｇｌｕ−Ｐｇ）とＮ−末端にリジンをもつ
Ｌｙｓ−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−Ｐｇ）があるが、
前者は天然のプラスミノーゲンで、後者は、活性化の過
程でＮ−末端のペプチドがプラスミンにより切り出され
た中間的産物である。詳細には、Ｇｌｕ−プラスミノー
ゲンのＮ−末端から７６番目のＬｙｓと７７番目のＬｙ
ｓの結合箇所が、プラスミンによって切断される。１〜
７６番目のペプチドが遊離され、７７番目以降のものが
Ｌｙｓ−プラスミノーゲンである。一方、プラスミノー
ゲンは、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−Ｐ
Ａ）あるいはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（ｕ−ＰＡ）などのアクチベータにより、Ｇｌｕ−
プラスミノーゲンのアミノ酸配列番号として５６０番目
のＡｒｇと５６１番目のＶａｌの結合箇所が限定分解を
受け、２本鎖のプラスミンになる。

【０００３】このプラスミンのＮ−末端側をＨ鎖、Ｃ−
末端側をＬ鎖と呼び、Ｈ鎖にそれぞれが３５％近いホモ
ロジーを有し、３個のＳ−Ｓ結合で結ばれた５つの繰り
返し構造（クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）構造、Ｋ１、
Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５）が存在する（Ｗｉｒｎ，Ｅ．
Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
４，５７９〜５８６，１９８０）。Ｋ１〜Ｋ４には、リ
ジンセファロースなどに強い親和性のあるリジン結合部
位（ＬＢＳ）があり、フィブリンの特定のリジン残基、
プラスミノーゲンの活性化に伴い遊離されるペプチド、
あるいはα２−プラスミンインヒビターなどと結合する
（Ｍｏｒｉ，Ｍ．ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５９５６〜５９６５，１９７
６）。抗線溶薬のε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）は
リジンと類似した構造をもち、プラスミノーゲンのＬＢ
Ｓに結合してその分子構造を変化させ、プラスミノーゲ
ンのフィブリンへの結合およびα２−プラスミンインヒ
ビターへの結合を阻止する（Ｍａｒｋｕｓ，Ｇ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５３，７２７〜
７３２，１９７８）。ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲン
およびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対するモノク
ローナル抗体として特定の性質を有するものが知られて
いる（特公平７−４２７０号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ヒト血液中のプラスミ
ノーゲン量を測定できれば、生体内の凝固線溶の状態を
把握し、また血栓症等を診断するのに有効であると考え
られ、上記特公平７−４２７０号公報には該モノクロー
ナル抗体をそのために使用し得ることが記載されてい
る。しかしながら、該モノクローナル抗体とは異なるヒ
トプラスミノーゲン上の抗原決定基を認識するモノクロ
ーナル抗体を提供できれば、測定を多様化できる。ま
た、ヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル抗体
自体が、ヒトプラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
を阻害することができれば、抗線溶剤として利用するこ
とができる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる課題を解決する本
発明は、（１）ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよび
ヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのミニ−プラスミノー
ゲン（以下、「ｍｉｎｉ−Ｐｇ」という；Ｋ１〜Ｋ４ド
メインを除去したヒトプラスミノーゲンで、Ｋ５とＬ鎖
の一部を含む）を認識し、ε−アミノカプロン酸（以
下、「ＥＡＣＡ」という）によって結合を阻害されず、
かつヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの
活性化を阻害するモノクローナル抗体、および（２）ヒ
トーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プ
ラスミノーゲンのミニ−プラスミノーゲンを認識し、ε
−アミノカプロン酸によって結合を阻害されず、かつヒ
トーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化
を阻害するモノクローナル抗体を有効成分として含有す
る抗線溶剤に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４
９７，１９７５）によって産生することができる。すな
わち、ヒトプラスミノーゲンで免疫した動物の脾細胞と
骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ細胞」という）とを細
胞融合させ、得られたハイブリドーマからヒトプラスミ
ノーゲンに対して特異的な抗ヒトプラスミノーゲンモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選
ばれたハイブリドーマからヒトｍｉｎｉ−Ｐｇを認識
し、かつＥＡＣＡによって結合を阻害されない抗ヒトプ
ラスミノーゲンモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択し、このハイブリドーマを大量培養あるい
は動物の腹腔内で増殖させ、この培養液あるいは腹水か
ら該モノクローナル抗体を分離することにより製造する
ことができる。

【０００７】以下、本発明のモノクローナル抗体を得る
ための方法について詳細に説明する。 （１）抗原と免疫工程 抗原ヒトプラスミノーゲンはウオーレンとウイーマンの
方法（Ｗａｌｌｅｎ＆ Ｗｉｍａｎ， Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２５７， １２
２−１３４， １９７２）に従い、リジンセファロース
カラムクロマトグラフィーとイオン交換カラムクロマト
グラフィーにより、ヒト血漿中から分離精製される。た
だし、抗原は必ずしも精製標品である必要はない。上記
のようにして得られるヒトプラスミノーゲンは通常ヒト
ーＧｌｕ−プラスミノーゲンである。ヒトーＬｙｓ−プ
ラスミノーゲンを得るには、ヒトーＧｌｕ−プラスミノ
ーゲンをプラスミンと混合すればよい。なお、ヒト−Ｇ
ｌｕ−プラスミノーゲンもヒトーＬｙｓ−プラスミノー
ゲンも市販品（例えばアメリカンダイアグノスティカ社
製）があり、抗原として用いることができる。免疫され
る哺乳動物は、細胞融合しようとするミエローマ細胞株
との組み合わせを配慮して、一般には、マウス、ラット
等が好ましい。

【０００８】抗原は、哺乳動物の皮下、皮内、腹腔ある
いは静脈等に注射等により投与することができる。具体
的には、ヒトプラスミノーゲンをリン酸緩衝液（以下、
「ＰＢＳ」という）や生理食塩水等で適当な濃度に希釈
し、これに通常はアジュバントを混合し、１〜３週間毎
に数回投与する。投与量は、毎回１匹当たり、ヒトプラ
スミノーゲンとして、１〜２００μｇ程度とすることが
好ましい。また、最終投与は、融合に使用する３〜５日
前に、アジュバントを用いない静脈注射による投与とす
ることが好ましい。最終免疫の数日後に脾臓細胞を取り
出す。

【０００９】（２）細胞融合工程 この工程においては、免疫した動物の脾臓から取り出し
た抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、融合細
胞を生じさせる。上記の脾細胞と融合させるミエローマ
細胞としては、公知の細胞株、例えば、マウスでは、
「ＮＳ−１／１−Ａｇ−１」（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ６，５１１〜５１９（１９７６））、「ＳＰ
−２／Ｏ−Ａｇ１４」（Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９
〜２７０（１９７８））、「ＦＯ」（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５，１〜２１（１９８
０））、「Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１」（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１，１〜７（１９７
８））等、ラットでは、「ＹＢ２／０」（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１））等のミ
エローマ細胞を使用できる。細胞混合比は、脾細胞：ミ
エローマ細胞＝３〜２０：１、好ましくは５〜１０：１
で行うのが適している。

【００１０】融合の際には、通常、融合促進剤としてポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等
が使用され、また同じ目的でさらにジメチルスルホキシ
ド等を適宜添加することもできる。このＰＥＧの分子量
は、通常、１０００〜６０００位のものが好ましい。融
合時の培地としては、牛胎児血清（ＦＣＳ）等を含有し
ない、ミエローマ細胞の増殖に使用されるＭＥＭ（Ｅａ
ｇｌｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍ
ｅｄｉｕｍ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌ
ｌ ＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ´
ｓ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０）培地等が用いられる。融
合操作は、上記した混合比による脾細胞とミエローマ細
胞の所定量と、例えば３７℃に温めておいた、３０〜５
０％（ｗ／ｖ）程度のＰＥＧを含有する、血清無添加の
培地とを混合し、数分間攪拌することにより行う。

【００１１】（３）ハイブリドーマの選択 上記操作で得られた細胞を、例えば数枚の９６穴マイク
ロプレートに分注し、ＨＡＴ培地（例えば、ＭＥＭ培地
あるいはＲＰＭＩ−１６４０培地に、ヒポキサンチン１
００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μ
ＭおよびＦＣＳ約１５％（ｖ／ｖ）となるように含有さ
せた培地）で培養することにより融合細胞を選択し、さ
らにそれらの培養上清から、ヒトプラスミノーゲンを固
相化したマイクロプレートによるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａ
ｓｓａｙ）により、ヒトプラスミノーゲンに特異的な抗
体を産生する細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニング
することができる。

【００１２】（４）クローニング 前記ハイブリドーマを限界希釈法または寒天法（例え
ば、９６穴マイクロプレートまたは寒天入りシャーレで
希釈して培養し、陽性のものを選ぶ）等に付して、モノ
クローンのハイブリドーマを取得することができる。こ
こで取得したハイブリドーマの培養上清を用いて、ヒト
プラスミノーゲンをエラスターゼ処理して得られる、ク
リングルＫ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、クリングルＫ４お
よびそれ以外のｍｉｎｉ−Ｐｇ（クリングルＫ５ドメイ
ンを含有する）についてもアッセイを行い、培養上清中
の抗体の認識部位を確認することができる。また、これ
らのイムノグロブリンのタイプを、市販のアイソタイピ
ングキットを用いて、決定することができる。

【００１３】（５）モノクローナル抗体の調製 上記のようにして得られた抗体産生ハイブリドーマを動
物の腹腔内に接種し、約１０〜１５日後に腹水を採取
し、その上清から、あるいはこのハイブリドーマを適当
な培地で培養し、その培養上清から、本発明のモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。この際、必要に応
じて、モノクローナル抗体を塩析、アフィニティカラ
ム、ゲル濾過等により精製してもよい。

【００１４】このようにして得られた、ヒトーＧｌｕ−
プラスミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲ
ンのｍｉｎｉ−Ｐｇを認識する、ヒトーＧｌｕ−プラス
ミノーゲンおよびヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンに対
するモノクローナル抗体中に、後述の実施例に示すごと
く、ＥＡＣＡによってこれらのヒトプラスミノーゲンへ
の結合を阻害されないモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３が
見出された。このモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３は、後
述の実施例に示すごとく、ヒトーＧｌｕ−プラスミノー
ゲンのプラスミンへの活性化を阻害する性質を有してい
た。

【００１５】上記から理解されるごとく、本発明のモノ
クローナル抗体は、例えばヒト血液中のプラスミノーゲ
ン量を特異的に測定するために用いることができる。ま
た、本発明のモノクローナル抗体を利用する別の一態様
として、かかる性質を有するモノクローナル抗体を有効
成分として含有する抗線溶剤が挙げられる。すなわち、
本モノクローナル抗体は非経口的（静脈注射、直腸投与
等）または経口的に投与し、各投与方法に適した形態に
製剤化することができる。注射剤としての製剤形態は、
通常滅菌水水溶液を包含する。上記形態の製剤はまた、
常用される緩衝剤、等張化剤、保存剤等の水以外の製薬
補助剤を含有することができる。経口投与剤は胃腸器官
による吸収に適した形態に製剤化する。錠剤、カプセル
剤、顆粒剤、粉末剤等は、常用の製薬補助剤、例えば結
合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤等を含有するこ
とができる。本抗線溶剤は出血性疾患、汎発生静脈血栓
症（ＤＩＣ）等の治療または予防に用いることができ
る。本抗線溶剤の投与量は有効成分として０．１〜２０
ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当である。以下実施例によって
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれによ
って限定されるものではない。

【００１６】

【実施例】

実施例１（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作
製） （１）抗原ヒトプラスミノーゲンの取得 抗原ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンはウオーレンとウ
イーマンの方法（文献名：前出）にしたがって分離、精
製した。すなわち、１００ｍｌのヒト血漿（健常人）
を、トリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、ｐＨ７．
４緩衝液（以下、「ＴＢＳ」という）で平衡化したセフ
ァロース４Ｂカラム（５ｍｌベッド容）に通し、通過し
たヒト血漿をリジンーセファロースカラム（３０ｍｌベ
ッド容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．
０２５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒト−Ｇｌｕ−プラス
ミノーゲンを溶出させ、イオン交換クロマト法（ＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラム）で精製して、ヒト−Ｇｌｕ−プ
ラスミノーゲン８ｍｇを得た。

【００１７】（２）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製 上記（１）で得たヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン１０
０μｇとフロイント完全アジュバント等容量との混合物
をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）１匹、１回当たりの投与量と
し、これを２週間毎に計３回背部に皮下注射した。抗体
価の上昇を、抗原ヒトプラスミノーゲンを固相化したプ
レートを用いて、免疫マウス血清のＥＬＩＳＡにより確
認した。皮下免疫終了後、最終免疫として、生理食塩水
に溶解したヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン５０μｇを
尾静脈に投与し、免疫感作脾細胞を作製した。３日後に
脾臓を取り出し、２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭ
ＥＭ培地にほぐして懸濁し、洗浄した。

【００１８】一方、細胞融合に供するミエローマ細胞と
してマウスミエローマ細胞株ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４を
使用し、これを２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭＥ
Ｍ培地中で増殖させた。得られた２種類の細胞を次の要
領で融合した。すなわち、４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレ
ングリコール（分子量１５４０）と１２．５％（ｖ／
ｖ）ジメチルスルホキシドとを含有するＤＭＥＭ培地
０．５ｍｌ中で、遠心分離で集めた上記脾細胞２×１０
⁷ 個と、遠心分離で集めた対数増殖期にある上記ミエ
ローマ細胞４×１０⁶ 個とを混合して細胞融合を行っ
た。細胞融合の温度は３７℃近傍で時間は４分であっ
た。

【００１９】融合された細胞から融合用培地を除去後、
９６穴マイクロプレート４枚に分注して、ハイブリドー
マの選択培養を行った。すなわち、融合細胞を各２％
（ｗ／ｖ）のヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジンを添加した２０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清入りＤＭ
ＥＭ培地で培養した。１〜３日間隔で培地交換を行い、
２週間でハイブリドーマのコロニーの形成を認めた。培
養上清を、ヒトプラスミノーゲン５μｇ／ｍｌ濃度で固
相化したプレートにおけるＥＬＩＳＡ（第二抗体として
パーオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社
製）を使用）によって検査し、ヒトプラスミノーゲンに
強い反応性を示すコロニー６個を選択した。こうして得
られたコロニーを拡大培養した後、プレートのウェル１
穴当たり細胞が１個となるようＤＭＥＭ培地で限界希釈
を行った。２週間後、コロニーの形成を確認し、再びＥ
ＬＩＳＡにより、培養上清に産生された抗体のヒトプラ
スミノーゲンに対する反応性を確認した。さらに、ハイ
ブリドーマの限界希釈によるクローニングをもう一度行
うことにより得られるハイブリドーマを単一のハイブリ
ドーマ株であるとみなし、また産生した抗体のアイソタ
イピングを行った。その結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】表１ 産生抗体のアイソタイピング

【００２１】実施例２（モノクローナル抗体の反応性） 実施例１で得られたハイブリドーマ株のそれぞれをマウ
ス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に接種し、１２日後に腹水
を採取し、遠心分離し、上清をアフィニティクロマトグ
ラフィー（ＭＡｂ．ＴｒａｐＧ、ファルマシア社製）に
て精製し、モノクローナル抗体を得た。得られた各モノ
クローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。すなわ
ち、ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを５μｇ／ｍｌ濃
度、５０μｌ／ウェルで固相化したプレートに、ヒトプ
ラスミノーゲンのリジン結合部位ＬＢＳＩ（Ｋ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン：ＳＩＧＭＡ社製）、ＬＢＳＩＩ（Ｋ４
ドメイン：ＳＩＧＭＡ社製）またはｍｉｎｉ−Ｐｇ（Ｋ
１〜Ｋ４ドメインを含まず、Ｋ５ドメインとＬ鎖の一部
を含むヒトプラスミノーゲン：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）を５μｇ／ｍｌになるよう、
５０ｍＭ ＥＡＣＡを含むＴＢＳまたはそれを含まない
ＴＢＳで希釈し、希釈液をそれぞれ５０μｌ／ウェルで
添加した。

【００２２】さらに、０．１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した
精製モノクローナル抗体溶液を５０μｌ／ウェルで添加
し、室温で２時間反応させた。洗浄後、１％牛血清アル
ブミンを含むＴＢＳを用いて２０００倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社製）を５
０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。洗
浄後、１ｍｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ基質溶液を５０
μｌ／ウェルで添加し、５分経過後、１Ｎ硫酸を５０μ
ｌ／ウェルで添加し、波長４９０ｎｍにおける吸光度を
測定した。なお、発色される場合は、モノクローナル抗
体が固相ヒトプラスミノーゲンと結合し、ＬＢＳＩ、Ｌ
ＢＳＩＩまたはｍｉｎｉ−Ｐｇとは結合しないことを意
味する。 この結果、ヒトプラスミノーゲンのｍｉｎｉ
−Ｐｇを認識し、かつＥＡＣＡによって結合を阻害され
ないモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３を得た。その結果を
表２に示す。表２中のモノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３が
本発明の抗体であり、他は本発明外の抗体である。モノ
クローナル抗体Ｆ１１Ｐ３を産生したハイブリドーマは
工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５７２３として寄託されている。

【００２３】

【表２】表２ モノクローナル抗体のヒトプラスミノー
ゲンのクリングルドメインとの反応性

【００２４】実施例３（モノクローナル抗体の反応性） ウオーレンとウイーマンの方法（文献名：前出）に準じ
て、ヒトプラスミノーゲンから、クリングルＫ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ドメインおよびｍｉｎｉ−Ｐｇを
分離精製した。すなわち、ヒト−Ｌｙｓ−プラスミノー
ゲン １８０μＭをブタ膵臓由来のエラスターゼ１５０
単位（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）で室温で４時間半処
理し、フルオロリン酸ジイソプロピル（和光純薬工業社
製）を終濃度１ｍＭになるように添加して、反応を停止
させた。これを、リジンーセファロースカラムおよびセ
ファクリルＳ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）を用いて、Ｋ１＋Ｋ２＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４ドメイ
ンおよびｍｉｎｉ−Ｐｇに分離精製した。さらに、１０
０ｍｌのヒト血漿（健常人）にｕ−ＰＡ（ＪＲＣ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を１０００Ｉ．Ｕ／
ｍｌとなるように添加し、２５℃で１時間保温した。１
時間後にフルオロリン酸ジイソプロピル（和光純薬社
製）を１ｍＭ、アプロチニン（和光純薬社製）を１００
Ｕ／ｍｌ、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）
を５ｍＭとなるように添加し２５℃で１時間保温し、反
応を停止した。このウロキナ−ゼ処理血漿をＴＢＳで平
衡化したリジン−セファロ−スカラム（３０ｍｌベッド
容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．０２
５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒトプラスミン−α２プラ
スミンインヒビタ−複合体を溶出させ、イオン交換クロ
マト法（ＤＥＡＥ−セファロ−スカラム）で精製して、
ヒトプラスミン−α２プラスミンインヒビタ−複合体１
ｍｇを得た。

【００２５】これらの各試料（タンパク質量０．５μ
ｇ）を、非還元処理液［終濃度で、１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ６．８）、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン］と１：
１（ｖ／ｖ）で混合し、９５℃で５分間煮沸した。つい
で各反応液を、１２．５％（ｗ／ｖ）ゲル濃度のＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動で展開し、ついでポリフ
ッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社
製）に、電気的に５０Ｖ、１時間で、ブロッティングし
た。このＰＶＤＦ膜を、５％（ｗ／ｖ）カゼインを含む
ＴＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングし、１０μｇ
の１次抗体Ｆ１１Ｐ３を、室温で２時間反応させ、０．
０５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００および０．５％
（ｗ／ｖ）カゼインを含むＴＢＳで３回洗浄し、２次抗
体として、０．０５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００
および０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むＴＢＳで２０
００倍希釈したペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗
体（ＴＡＧＯ社製）を添加し、室温で１時間反応させ、
同様に洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液で
発色させた。この結果、モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３
はヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合
体およびｍｉｎｉ−Ｐｇを認識することが判明した。結
果を発色バンドの位置として図１に示す。

【００２６】実施例４（ヒトプラスミノーゲンのヒトプ
ラスミンへの活性化に及ぼすモノクローナル抗体の影
響） ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノ−ゲンとモノクロ−ナル抗体
Ｆ１１Ｐ３とをモル比１：１０で混合し、３７℃で２時
間反応させ、２時間後、５０ｎＭのｕ−ＰＡ（持田製薬
社製）、７００Ｉ．ＵのＳＫ（ストレプトキナーゼ；ア
メリカンダイアグノスティカ社製）をそれぞれ別々に３
７℃、５分反応させ、その後１ｍＭのＳ−２２５１（発
色性合成基質：第一化学薬品社製）を添加し、ｐ−ニト
ロアニリンの遊離量を波長４０５ｎｍにて比色定量し
た。対照抗体として正常マウスＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ
ＩｇＧ）を使用した。この結果、Ｆ１１Ｐ３が存在する
と、ヒト−Ｇｌｕ−プラスミノ−ゲン（Ｐｇ）ではｕ−
ＰＡ、ＳＫによるプラスミンへの活性化を阻害すること
が判明した。その結果を表３に示す。

【００２７】

【表３】

【００２８】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いてヒ
ト血液中のプラスミノーゲン量を測定することができ
る。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトーＧｌ
ｕ−プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を阻害す
る作用を有するので抗線溶剤として利用することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトプラスミノーゲンのクリングルＫ１＋Ｋ２
＋Ｋ３ドメイン、Ｋ４およびｍｉｎｉ−Ｐｇ、およびヒ
トプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を
それぞれ非還元処理したものを電気泳動し、ウエスタン
ブロットし、モノクローナル抗体Ｆ１１Ｐ３と反応さ
せ、発色させた場合の発色バンドを示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年１０月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】

【表２】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
   びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのミニ−プラスミノ
   ーゲンを認識し、ε−アミノカプロン酸によって結合を
   阻害されず、かつヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプ
   ラスミンへの活性化を阻害するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 Ｆ１１Ｐ３ハイブリドーマ（工業技術
   院生命工学工業技術研究所の寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
   ５７２３）から得られる請求項１記載のモノクローナル
   抗体。
3. 【請求項３】 ヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンおよ
   びヒトーＬｙｓ−プラスミノーゲンのミニ−プラスミノ
   ーゲンを認識し、ε−アミノカプロン酸によって結合を
   阻害されず、かつヒトーＧｌｕ−プラスミノーゲンのプ
   ラスミンへの活性化を阻害するモノクローナル抗体を有
   効成分として含有する抗線溶剤。