DK171826B1 - Ca2+-afhængigt monoklonalt antistof mod protein C, hybridomacellelinie til produktion af antistoffet, fremgangsmåde til isolation af protein C, fremgangsmåde til fremstilling af antistoffet og polypeptid til brug ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 171826 B1

Den foreliggende opfindelse angår et Ca2+-afhængigt mono-klonalt antistof rettet mod en epitop i aktiveringspeptidregionen i den tunge ende af protein C i kombination med calcium, hvilket antistof er ejendommeligt ved, at det er produ-5 ceret af hybridomacellelinien HPC-4 deponeret hos the

American Type Culture Collection 2. november 1988 og tildelt nummeret ATCC 9892. Opfindelsen angår endvidere denne hybri-domacellelinie til produktion af antistoffet, en fremgangsmåde til isolation af protein C, en fremgangsmåde til 10 fremstilling af antistoffet og et polypeptid til brug ved fremgangsmåden.

Protein C er et vitamin K-afhængigt plasmaproteinzymogen til en serinprotease. Efter aktivering bliver det et kraftigt virkende antikoagulationsmiddel. Aktiveret protein C virker 15 gennem den specifikke proteolyse af prokoagulations-cofak torerne, faktor Villa og faktor Va. Denne aktivitet nødvendiggør tilstedeværelsen af et andet vitamin K-afhængigt protein, protein S, calcium og en phospholipidoverflade (antagelig cellulær) . Det ses af fig. 1 fra Hemostasis and 20 Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 2.

udgave, Colman, R.W. et al., side 263 (J.B. Lippincott,

Philadelphia, PA 1987), at protein C cirkulerer i en to-kæde-form, idet den større, tunge kæde binder sig til den mindre, lette kæde gennem en enkelt disulfidbinding. En lille andel 25 af proteinet cirkulerer også i enkeltkaedeform, hvor et lys-arg-dipeptid i molekylet forbinder den lette kæde direkte til den tunge kæde. Protein C aktiveres til aktiveret protein C (APC). Thrombin er i stand til at aktivere protein C ved den specifikke kløvning af Arg12-Leu13-bindingen i den tunge 30 kæde. In vivo i nærværelse af fysiologiske koncentrationer af calcium forøges graden af denne aktivering dramatisk, når thrombin er bundet til endothelialcelle-cofaktoren thrombomodulin. Matschiner et al., Current Advances in Vitamin K Research, side 135-140, udgivet af John W. Suttie (Elsevier 35 Science Publishing Co., Inc. 1988), har endvidere undersøgt rollen, som de vitamin K-afhængige proteiner spiller ved koa- 2 DK 171826 B1 gulation.

Protein C har vist sig at have væsentlig betydning in vivo. Patienter, som udviser mangler med hensyn til protein C eller dettes cofaktor, protein S, udviste udprægede thrombotiske 5 tendenser. Spædbørn, som er blevet født med fuldstændig mangel på protein C, udviser en massiv dissemineret intravasku-lær koagulation (DIC) og et nekrotisk syndrom, som ubehandlet fører til død inden for de første få leveuger. Aktiveret protein C er også blevet vist at beskytte dyr over for de koagu-10 lopatiske og letale virkninger af endotoksin-shock, som beskrevet af Taylor et al. , i J. Clin. Invest. 79, 918-925 (1987) .

Som først beskrevet af Kisiel i J. Clin. Invest. 64, 761-769 (1979) blev protein C oprindeligt isoleret i semi-ren form ud 15 fra plasma under anvendelse af klassiske proteinoprensnings-teknikker omfattende bariumcitratadsorption og eluering, ammoniumsulfatfraktionering, DEAE-Sephadex-kromatografi, dex-transulfat-agarosekromatografi og præparativ polyacrylamid-gelelektroforese. Denne procedure blev i høj grad forbedret 20 og lettet ved opdagelsen af et unikt antistof over for protein C, betegnet HPC-4, beskrevet af Stearns et al. i J.

Biol. Chem 263 (2), 826-832 (1988). Som beskrevet i detaljer af Esmon et al. ved det forenede IABS/CSL-symposium om standardisering inden for blodfraktionering omfattende koagula-25 tionsfaktorer i Melbourne, Australien, 1986 (rapporteret i Develop, biol. Standard., 67, 51-57 (S. Karger, Basel, 1987)), kan protein C isoleres fra humant plasma ved batch-adsorption af fortyndet hepariniseret plasma på QAE Sephadex, vask med bufferholdigt NaCl og eluering med 0,5 M NaCl, gen-30 forkalkning (eng: recalcifying) og batch-adsorption med HPC-4, derefter vask med en Ca2+-holdig buffer og en endelig eluering af protein C med en EDTA-holdig buffer.

HPC-4 er et calcium-afhængigt monoklonalt antistof til humant protein C. Epitopen, som genkendes af antistoffet, er blevet DK 171826 B1 3 identificeret og svarer til den række af aminosyrer i zymogenet af protein C, som spænder over thrombin-kløvnings-stedet. Aktiveret protein C genkendes ikke af HPC-4.

Der er blevet rapporteret flere antistoffer til humant 5 protein C, f.eks. af Laurell et al., FEBS Letts. 191(1), 75-81 (1985); Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261, 11097- 11105 (1986); Sugo et al., Thromb. Hemost. Abstrs.,

Brussells, 229 (1987); og Ohlin, et al., J. Biol. Chem. 262, 13798-13804 (1988). Nogle af disse er calciumafhængige, 10 f.eks. et af antistofferne rapporteret af Laurell et al. I den udstrækning, som det kan bestemmes udfra de publicerede rapporter, skyldes denne afhængighed imidlertid nødvendigheden af calciumbinding til den lette kæde i protein C, og antistofferne genkender epitoper på den lette kæde. Andre 15 antistoffer genkender regionen omkring thrombin-kløv-ningsstedet på den tunge kæde, men disse er ikke calciumafhængige, herunder HPC-4, som er beskrevet af Ohlin et al. HPC-4-antistof fet beskrevet af Ohlin et al. er ikke både Ca2+-afhængigt og rettet mod aktiveringsregionen og er derfor 20 forskelligt fra antistoffet ifølge den foreliggende opfindelse .

Ingen af de andre antistoffer, som binder sig til Ca2+-bindingsregionen hos protein C, genkender udelukkende protein C og ikke den aktiverede form. Situationer kan opstå, hvor 25 proteinet ønskes uden forurening med dets aktive form. Dette er særligt tilfældet med hensyn til terapeutiske anvendelser af antistoffet til inhibering af protein C-aktivering.

Selvom brugen af antistoffet ifølge den foreliggende opfindelse, og på det seneste også egenskaberne, er blevet 30 rapporteret i litteraturen, har det uheldigvis ikke været almindeligt tilgængeligt til brug inden for isoleringsmetodologi, diagnostiske eller terapeutiske metodologier.

4 DK 171826 B1

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et Ca2+-afhaengigt antistof, som binder sig til aktiveringsregionen i protein C.

Det er et yderligere formål med den foreliggende opfindelse 5 at tilvejebringe en fremgangsmåde og midler til brug af et område i dette Ca2+-afhængige antistof til isolation af andre ikke-metalbindende peptider eller proteiner ved metalafhængig affinitetskromatografi.

Det er endvidere et formål med den foreliggende opfindelse at 10 tilvejebringe en fremgangsmåde, hvormed man kan anvende dette Ca2+-afhængige antistof til terapeutiske formål.

Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe dette Ca2+-afhængige antistof samt antistoffer, derivater og konjugater deraf til diagnostiske formål.

15 Med opfindelsen tilvejebringes et Ca2+-afhængigt monoklonalt antistof, som specifikt binder sig til en specifik sekvens på 12 peptider (EDQVDPRLIDGK) i aktiveringsregionen hos protein C af ikke-bovin oprindelse, omfattende menneske-, svine-, bavian- og hundeprotein C. Antistoffet binder sig 20 ikke til aktiveret protein C og kan anvendes til at inhibere den aktivering af protein C, som skyldes thrombin-thrombomodulin. Antistoffet kan isoleres fra cellekultur eller ascitesvæske i store mængder ved affinitetskromatografi under anvendelse af den ovenfor beskrevne peptidsekvens bundet til 25 et immobiliseret substrat.

Antistoffet har en lang række specifikke anvendelser inden for isolation og karakterisering af protein C, som et diagnostisk middel, og som et terapeutisk middel til forhindring af aktivering af protein C. Protein C kan fremstil-30 les naturligt eller ved ekspression af det rekombinante gen. Fordelene ved antistoffet ved oprensning af protein C omfatter specificiteten for protein C og ikke-aktiveret protein C

DK 171826 B1 5 og evnen til at beskytte antigenbindingsstedet i antistoffet med det definerede epitoppeptid og calcium under immobilisering af antistoffet til den kromatografiske bærer. In vivo er antistoffet blevet vist at inhibere tumorvækst.

5 Endvidere kan antistoffet, protein S-antistoffer og C4B-bin-dingsprotein, alene eller i kombination, være effektivt til at fremme størkning hos patienter med store mængder faktor VIII-inhibitorer, hæmofili, blodplademangler (thrombocytopenia) og andre størkningsforstyrrelser, hvor det er 10 ønskeligt at forøge størkningen. Endvidere har anvendelsen af den definerede epitop til oprensning af antistoffet i stor målestok og stabiliteten af antistoffet over for virale inaktiveringsprocedurer ikke tidligere været beskrevet.

Kort beskrivelse af tegningen 15 Fig. 1 er et skematisk diagram af protein C, som viser de tunge og lette kæder, der er bundet ved hjælp af en enkelt disulfidbinding, og hvor Gla-regionen, den vækstfaktorlignende region, serinproteaseregionen og aktiveringspeptidregionen er angivet.

20 Fig. 2 er en graf over metalionafhængige ændringer i den indre fluorescens af HPC-4 i nærværelse og fravær af peptid P(6-17), F/Fo versus mM metalionkoncentration. 1 μΜ HPC-4 blev titreret med metalioner i nærværelse eller fravær af 2 μΜ P(6-17). Tryptophan-emissionsændringerne blev overvåget.

25 Fo repræsenterer HPC-4-emmisionstoparealet (± peptid) ved fravær af tilsat metal. · og ° er henholdsvis Ca2+-titrering af HPC-4 og af HPC-4 + peptid, og □ er henholdsvis Mg2 + -titrering af HPC-4 og af HPC-4 + peptid.

Egenskaberne hos det monoklonale antistof HPC-4, som gør det 30 enestående anvendeligt, er følgende: 6 DK 171826 B1

Antistoffet binder protein C, ikke-aktiveret protein C (APC) og kun i nærværelse af calcium. Således kan protein C, når antistoffet er immobiliseret på en affinitetsbærer, isoleres fra enten plasma-afledte kilder eller fra vævskulturekspres-5 sionssystemer under yderst milde betingelser. Dette er vigtigt til bevarelse af produktets biologiske aktivitet og stabiliteten af den faste bærerharpiks. På grund af, at aktiveret protein C ikke bindes under nogen som helst betingelser, er det opnåede produkt fuldstændigt frit for APC.

10 Antistoffet binder sig til aktiveringsstedet på protein C og kan derfor anvendes til at blokere dannelsen af antikoagula-tionsproteinet APC in vivo. På grund af, at det ikke binder sig til eller inhiberer APC, kan de inhiberende virkninger in vivo ændres ved indgivelse af APC.

15 Antistoffet binder sig til en defineret region i protein C-molekylet, som er indeholdt inden for resterne 6 til 17 i den tunge kæde, nærmere bestemt EDQVDPRLIDGK. Dette peptid kan immobiliseres direkte på en fast bærerharpiks og kan anvendes til at isolere antistoffet i høje kon-20 centrationer fra museascitesvæske eller vævskultursupernatan-ter. Denne metode muliggør isolering af antistoffet i ekstremt ren form i højt udbytte, selv fra meget fortyndede opløsninger.

Antistoffet kan fjernes fra det faste bærerpeptid, enten ved 25 fjernelse af calciumioner, hvis dette ønskes, eller ved hjælp af 1,5 M guanidin, som ikke påvirker funktionen af det opren-sede monoklonale antistof. Dette kan være signifikant, idet guanidin af myndighederne anerkendes som et legitimt middel til deaktivering af virus. Efter eluering eller behandling 30 med dette middel vil antistoffet ikke indeholde noget levende virus, som kan være til stede enten i ascitesvæsken hidrørende fra musen, som blev anvendt til at fremstille det monoklonale antistof, eller i kultursupernatanter, hvis der anvendes vævskultur fra hybridoma. Virus vil således ikke DK 171826 B1 7 blive indført i protein C-produktet fra antistoffet, der blev anvendt til at fremstille det.

Antistoffet genkender protein C hidrørende fra mennesker, svin og hunde, men ikke protein C af bovin oprindelse.

5 Således vil protein C, som er til stede i kalvefosterserum, som kan anvendes til at dyrke celler, der producerer protein C gennem rekombinantteknologi, ikke forurene det humane protein C-produkt.

Det monoklonale antistof ifølge den foreliggende opfindelse 10 udskilles af hybridoma HPC-4, som blev fremstillet på følgende måde:

Fremstilling af monoklonalt antistof BALB/c-mus blev injiceret intraperitonealt med 50-100 μg oprenset humant protein C (HuPC) i fuldstændig Freund's 15 adjuvans. Musene blev igen immuniseret efter 3 uger med HuPC, der var emulgeret i ufuldstændig Freund's adjuvans og efter 6 uger med HuPC i TBS (0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH-værdi 7,5). Fire dage senere blev miltceller sammensluttet med musemyelomacellelinien P3X63AG8-653 under anvendelse af 35% 20 polyethylenglycol 1450 under anvendelse af standardteknikker som beskrevet af Laurell, Μ., K. Ikeda, S. Lindgren, J. Sten-flo, FEBS Letters, 191, 75-81 (1985); Wakabayashi, K. , Y.

Sakata, N. Aoki, J. Biol. Chem. 261, 11097-11105 (1986);

Borrebaeck, C.A.K., M.E. Etzler, J. Biol. Chem. 256, 4723- 25 4725 (1981); Kohier, G., C. Milstein, Nature 256, 495-497 (1975) .

Celler blev dyrket i HAT-medium til udvælgelse af hybrido-maer. Efter fire uger blev supernatanter fra sammensluttede celler screenet for antistofproduktion ved enzymkoblet immun-3 0 adsorbentanalyse i fast fase i nærværelse og fravær af 5 mM Ca2+.

8 DK 171826 B1

Kultursupernatanter blev fortyndet 1:4 i buffer indeholdende enten 5 mM CaCl2 eller 5 mM EDTA til analyse. Alle reagenser (antigen, vaskebuffere, påvisningsantistoffer) indeholdt de passende calcium- eller EDTA-koncentrationer.

5 Positive kloner af interesse, som bestemt på basis af reaktiviteten med protein C, blev igen klonet, i det mindste to gange ved begrænset fortynding på murine peritoneale udskylningsf ødeceller .

BALB/c-musen primes indledningsvis med pristan ti induktion 10 af ascitesvæskeproduktion og injiceres 14 dage senere intraperitonealt med 0,1 ml 10 mg/ml cyklophosphamid for at f.

immunokompromittere dyret. Efter 74 timer injiceres 3-6 x 10 celler intraperitonealt. Efter 7-10 dage opsamles ascites-væske og monoklonale HPC-4 antistoffer oprenses fra ascites-15 væsken. Antistof er normalt til stede i mængder på 8-15 mg antistof/ml ascitesvæske. Der kan anvendes tre forskellige metoder til at oprense antistoffet: (1) NH4S04-fraktionering efterfulgt af QAE-Sephadex-kromatografi; (2) affinitetskroma tografi på human protein C-Affi-gel 15; eller (3) affinitets-20 kromatografi på peptidet genkendt af HPC-4, EDQVDPRLI D G K (Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Ile-Asp-Gly-Lys).

Alternativt kan udvalgte hybridomaer opformeres in vitro i laboratoriekulturbeholdere, hvorfra de monoklonale antistoffer til det udvalgte antigen kan indsamles ved dekantering og 25 oprenses som beskrevet for ascitesvæsken. Epitopaffinitets-harpiksen kan også anvendes til at isolere HPC-4 fra hybrido-mavævskultursupernatanter. Materialet føres direkte til søjlen. Antistofkoncentrationen i en eksponentielt voksende kultur er ca. 25 μg/ml.

30 Det monoklonale antistof HPC-4 oprenses fra ascitesvæske ved NH4S04-fraktionering (ascitesvæsken er fortyndet 1:1 med vand, derefter præcipiteret ved tilsætning af tilsvarende DK 171826 B1 9 voluminer mættet NH4S04) efterfulgt af kromatografi på QAE-Sephadex Q-50 (ammoniumsulfatpræcipitat opsamlet ved centrifugering, afsaltet i 0,027 M Tris P04, pH-værdi 6,3, kromatograferet på en søjle ved et forhold på 1 ml harpiks/ml 5 ascitesvæske, ækvilibreret i 0,027 M Tris P04, pH-værdi 6,3, udviklet med en 5 x søjlevolumen lineær gradient af 0 til 0,4 M NaCl i løbet af ca. 8 timer), efterfulgt af præcipitering af antistoffet med 50% NH4S04 og Sephadex G200 søjle-kromatografi i 0,1 M NaCl, 1 mM MOPS, pH 7,5.

10 Antistoffet kan også isoleres ved HuPC-Affi-Gel- eller pep-tid-Affi-Gel-affinitetskromatografi. Epitopen, genkendt af HPC-4, er en sekvens på 12 peptider inden i aktiveringsregionen i den tunge kæde af protein C, EDQVDPRLIDG K, eller en immunologisk lignende sekvens. Peptidet kobles 15 til Affi-Gel 15 til opnåelse af en slutkoncentration på ca.

1,0 mg/ml. Koblingen af epitoppeptidet udføres i 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS, pH 7,5, ved 4°C som beskrevet af fremstilleren (Bio-Rad, Richmond, CA). Affi-Gel'en vaskes med iskoldt vand umiddelbart før brug til fjernelse af det organiske opløs-20 ningsmiddel. Epitoppeptidet fremstilles i en koncentration på 1-2 mg/ml i 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS, pH-værdi 7,5 og blandes med tilstrækkelig Affi-gel 15 til opnåelse af et slutforhold mellem peptid og gel på 1 mg/ml. Peptidet og gelen blendes natten over (12-18 timer) på et blidt virkende vuggeapparat 25 til kobling af peptidet til gelen. Efter at koblingsreaktionen er afsluttet hældes harpiksen på en glassøjle og vaskes med 0,1 M NaCl, 0,01 M MOPS, pH 7,5. 100 ml harpiks har en kapacitet på mindst 1,5 g HPC-4.

Humant protein C kan kobles til Affi-Gel ved hjælp af den 30 samme metode. 3-5 mg protein C/ml af den ovenfor beskrevne buffer blandes med tilstrækkelig Affi-Gel 15 til opnåelse af et slutforhold mellem humant protein C og gel på 3-5 mg protein/ml gel.

DK 171826 Bl 10

Den afsaltede ammoniumsulfatfraktion fra ascitesvæsken fyldes på epitopaffinitetssøjlen, og søjlen vaskes med mindst 4 søj-levoluminer 0,4 M NaCl, 0,02 M Tris HC1, 1 mM CaC^, pH 7,5. HPC-4 elueres derefter fra søjlen på en af de følgende måder:

5 (1) 2 M NaCl, 0,02 M Tris HC1, 2 mM EDTA; (2) 2 M NaCl, 1,5 M

guanidin HC1, 0,02 M Tris HCl, 2 mM EDTA. Fordelen ved den sidstnævnte er, at proteinet elueres som en meget skarpere top med koncentrationer højere end 25 mg/ml, når 200 ml as-citesvæske føres til en 100 ml harpikssøjle. Antistoffet 10 bevarer mere end 95% af kapaciteten til at binde sig til epi-topen efter eluering under disse betingelser. HPC-4 enten dialyseres eller afsaltes derefter ind i den passende buffer til yderligere anvendelser. Der kan ikke påvises forureninger af HPC-4'et ved SDS-gelelektroforese. Yderligere HPC-4 kan 15 opnås ved at føre gennembrudsmaterialet tilbage til søjlen, hvis søjlen er overbelastet over sin kapacitet.

HPC-4-antistoffet er stabilt i mindst 2 timer ved 22°C over for guanidin til koncentrationer på mindst 2,6 M eller 2 M kaliumthiocyanat og bevarer mere end 95% af sin kapacitet til 20 at binde sig til epitopen efter behandling under disse betingelser. Behandling med det ene eller det andet af disse reagenser efter eluering af peptidaffinitetssøjlen garanterer, at mulige virale midler, som kan være til stede i antistofholdige udgangsopløsninger, inaktiveres, og at prote-25 in C-slutproduktet ikke er forurenet med virus stammende fra antistoffet, der blev anvendt til at fremstille det.

Hybridomacellelinien, som udskiller det monoklonale antistof ifølge den foreliggende opfindelse, er betegnet HPC-4 og blev deponeret hos the American type Culture Collection, Rock-30 ville, MD, den 2. november 1988, hvor den blev givet ATCC-nummeret HB 9892.

DK 171826 Bl 11

Kobling af monoklonalt protein C-antistof til harpiks

Kobling af antistoffet udføres i 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS, pH-værdi 7,4 ved 4°C som beskrevet af fremstilleren (Bio-Rad, Richmond, CA) . Affi-Gel'en vaskes med iskoldt vand umiddel-5 bart før brug til fjernelse af det organiske opløsningsmiddel. HPC-4 fremstilles i en koncentration på 3-5 mg/ml i 0,1 M NaCl, 0,1 M MOPS pH 7,5 og blandes med tilstrækkeligt Affi-Gel 10 til opnåelse af et slutforhold mellem HPC-4 og gel på 5 mg/ml. Antistoffet og gelen blandes natten over (12-18 ti-10 mer) på et blidt virkende vuggeapparat for at muliggøre koblingsreaktionen. Sædvanligvis bindes mere end 90% af antistoffet. Efter at koblingsreaktionen er afsluttet, hældes harpiksen i en glassøjle og vaskes med 0,1 M NaCl, 0,01 M MOPS, pH 7,5. Harpiksen er stabil ved 4°C under disse betin-15 gelser i det mindste i et år.

Karakterisering af det monoklonale antistof

En detaljeret analyse af egenskaberne af det monoklonale HPC-4 antistof er givet af Stearns et al., "The Interaction of a Ca2+-Dependent Monoclonal Antibody with the Protein C Ac-20 tivation Peptide Region," J. Biol. Chem. 263, 826-832 (1988).

De monoklonale HPC-4-antistoffer, der er fremstillet som ovenfor beskrevet, er rettet mod en peptidsekvens, som er til stede i aktiveringsregionen af den tunge kæde i protein C og Ca2+. Antistoffet ser ud til at have i det mindste et metal-25 ionbindingssted ud over peptidbindingsstedet. Peptidbindingsaktiviteten reagerer på eller "er afhængig af" binding på metalionbindingsstedet. Metalionbindingsstedet er i stand til binding med en divalent metalkation, såsom calcium, eller et metal med lignende ionradius og koordinationsegenskaber, 30 såsom Tb2+.

Når calcium binder sig til metalionbindingsstedet, bliver det monoklonale antistof signifikant mere modtageligt for binding ti peptidet. Når der ikke er bundet en metalion til metalion- DK 171826 B1 12 bindingsstedet i det monoklonale antistof, er antigenbindingsstedet relativt uimodtageligt for binding af antigenet. Således kan antistof-antigen-bindingen reguleres ved at ændre metalionkoncentrationen i mediet, som omgiver antistoffet.

5 Denne egenskab hos det monoklonale antistof har en række fordele, som nedenfor beskrevet.

Bindingen af HPC-4 til protein C reguleres af tilstedeværelsen af calciumioner ved calciumionbindingsstedet på både HPC-4 og protein C. For at afgøre, hvilken del af det humane pro-10 tein C (HuPC) , som indeholdt HPC-4-bindingsstedet, blev HuPC reduceret og carboxymethyleret (RCM) til frembringelse af RCM-tunge og RCM-lette kæder under anvendelse af metoderne beskrevet af Esmon et al., J. Biol. Chem. 258, 554-556 (1983). Kæderne blev dialyseret mod 0,1 M NaCl, 0,02 M Tris 15 HC1, 2 mM CaCl2, pH-værdi 7,5 og ført til en HPC-4-Affi-Gel 10-søjle (1,5 x 18 cm, 0,2 ml/minut, 2 ml fraktioner) ækvilibreret i den samme buffer. Bundet protein blev elueret med den samme buffer bortset fra, at 2 mM EDTA blev anvendt i stedet for 2 mM CaCl2· De proteinholdige fraktioner blev ana-20 lyseret ved 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelek-troforese.

Resultaterne viste, at den lette kæde i protein C, som er den kæde hos protein C, som binder calcium, ikke blev tilbageholdt af søjlen, og at den tunge kæde, som i sig selv var 25 ude af stand til at binde calcium, blev tilbageholdt og elueret med den EDTA-holdige buffer.

Aktiveringspeptidregionens rolle blev undersøgt ved affinitetskromatografi på en HPC-4-Affi-Gel 10 søjle. HuPC og RCM tung kæde i en opløsning af 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl2, 0,1 M 30 MOPS, pH 7,5, blev fortyndet til 0,2 absorbansenhed/ml og 1 ml prøver blev ført til en HPC-4-Affi-Gel 10-søjle (0,5 cm x 6 cm) ækvilibreret i den samme buffer. Bundet protein blev elueret med 0,1 M NaCl, 2 mM EDTA, 0,1 M MOPS, pH 7,5 i 0,7 ml fraktioner. De eluerede fraktioner 23-25 af HuPC eller DK 171826 B1 13 RCM-tung kæde blev bragt sammen, og aktiveringspeptidet blev frigivet ved thrombinproteolyse (10%, vægt/vægt, 4 timer, 37°C). Der blev tilsat et overskud af antithrombin III for at standse reaktionen, hvorefter opløsningen blev genforkalket 5 til 5 mM CaCl2 og ført til den samme søjle. Udvindingen af proteiner for hvert krotamogram var mere end 98% baseret på udvinding af A280-absorberende materiale.

Disse resultater viste, at HPC-4-bindingsstedet på protein C var ved eller i nærheden af aktiveringsstedet, at HuPC bandt 10 sig til antistofsøjlen på en Ca2 + -afhængig måde, og at HuPC efter aktivering til APC ikke længere bandt sig til HPC-4.

Den RCM-tunge kæde bandt sig også til HPC-4-søjlen i nærværelse af Ca2 + og kunne elueres med EDTA. Når eluatet var behandlet med thrombin til frigivelse af aktiveringspeptidet 15 og genpåført HPC-4-søjlen, bandt den RCM-tunge kæde sig ikke længere til HPC-4.

Ca2+-afhængigheden af HPC-4-antigenbindingen blev undersøgt ved inkubering af 12^I-mærkede antigener: RCM-tung kæde, HuPC og HuPC uden gamma-carboxyglutaminsyreområde (HuGDPC) med 20 HPC-4 immobiliseret på immunoperler (Bio-rad). HPC-4 koblet til immunoperler blev inkuberet natten over ved 4°C i TBS, 0,1% gelatine, 1 mM EDTA, pH 7,5 og blev derefter vasket omhyggeligt med TBS, 0,1% gelatine, pH-værdi 7,5 (Chelex-be-handlet). De radiomærkede proteiner blev sat til 100 μΐ HPC-25 4-koblede perler med stigende koncentrationer af Ca2+ i TBS, 0,1% gelatine, pH 7,5. Det samlede volumen var 200 μΐ. Opløsningerne blev inkuberet under blanding i 2 timer ved 25°C og vasket med gelatinebuffer indeholdende den passende mængde Ca2+, og perlerne blev talt i en NE 1600 gammatæller (Nuclear 30 Enterprises, Ltd.). Kontrolprøver omfattede opløsninger henholdsvis uden tilsat Ca2+ og 1 mM EDTA. De endelige antigenkoncentrationer lå i intervallet fra 0,04 til 0,1 μΜ, hvilket var tilstrækkelig lavt til at sikre et overskud af antistofbindingssteder. Basislinietællinger/minut bestemt i 35 nærværelse af 1 mM EDTA (5-15% samlede tællinger tilsat) blev DK 171826 B1 14 trukket fra det bundne samlede antal tællinger/minut.

Den maksimale binding af 125I-mærket RCM-tung kæde var 80-90% af den samlede tilsatte mængde og 60-70% af det tilsatte 125I-mærkede HuPC eller HuGDPC. Ca2+-koncentrationen, som 5 resulterede i halvdelen af den maksimale binding til HPC-4, var ca. 3 6 (± 5) μΜ for RCM-tung kæde, 110 (± 29) μΜ for

HuGDPC og 205 (±23) μΜ for HuPC.

Der blev ikke påvist noget Ca2+-bindingssted med høj affinitet i nogen af proteinerne, når ækvilibreringsdialyse-10 forsøg med 45Ca2+ blev udført med enten HPC-4 (50 μΜ) eller RCM-tung kæde (35 μΜ). Når der blev dialyseret sammen (30 μΜ RCM-tung kæde, 15 μΜ HPC-4), viste resultaterne imidlertid mellem 2 og 3 mol bundet Ca2+ pr. mol kompleks ved 2 mM Ca2+, idet der antages at være en 2:1 støkiometri mellem RCM-tung 15 kæde og HPC-4 i komplekset.

Da aktiveringspeptidregionen var nødvendig forantistofbindin-gen, blev der fremstillet tre overlappende syntetiske peptider for at dække dette område: 15 10 15 20 25 20 *

DTEDQEDQVDPRLIDGKMTRRGDSPWQV

<----- P (1-12) ------> <----P (6-17) --------> <-----P (15-27) ---------> 25 hvor D er asparaginsyre, T er threonin, E er glutaminsyre, Q er glutamin, V er valin, P er prolin, R er arginin, L er leu-cin, I er isoleucin, G er glycin, K er lysin, M er methionin, S er serin og W er tryptophan. Pilene angiver thrombinkløv-ningsstedet.

30 De syntetiske peptider blev fremstillet ved fastfasesyntese, der blev udført med et Applied Biosystems 430A peptidsyn- DK 171826 B1 15 teseapparat under anvendelse af t-butoxycarbonylkemi, beskrevet af Dr. Kenneth Jackson, St. Francis Hospital, Tulsa Health Science Center, Oklahoma City. Peptiderne blev kløvet ved behandling med vandfrit hydrogenfluorid. Peptidernes ren-5 hed var >90%, som bedømt ved højtryksvæskekromatografi i omvendt fase. Peptidernes molekylvægt blev bedømt ved opsummering af de individuelle vandfrie aminosyremolekyl-vægte, idet der blev korrigeret for dannelse af peptidbindinger. Peptidkoncentrationerne blev bedømt i forhold til 10 absorbansen ved 220 nm af 1 mM peptidopløsninger i renset vand.

i λ r

De tre peptider blev analyseret for deres virkning på ølmærket HPC-4-binding til fastfase-HuPC, hvor HuPC var overtrukket på brønde i en mikrotiterplade. P(l-12) inhi- 15 berede ikke HPC-4-bindingen til HuPC; P(15-27) inhiberede kun HPC-4-bindingen med ca. 30%, men P(6-17) inhiberede bindingen af HPC-4 til HuPC med' halv-maksimal inhibering forekommende ved ca. 0,5 μΜ peptid.

HPC-4-vekselvirkningen med de tre syntetiske peptider blev 20 også undersøgt ved at iagttage den indre proteinfluorescens i nærværelse og fravær af Ca^+ ifølge metoderne beskrevet af Velick, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46, 1470-1482 81960) og Steward, et al., Antibody Affinity: Thermodynamic Aspects and Bioloical Significance, 76-77 (1983).

25 Til undersøgelse af den indre fluorescens blev 1 μΜ HPC-4-antistof i TBS, pH-værdi 7,5 (Chelax-behandlet) i nærværelse eller fravær af 2 μΜ P(6-17) titreret med CaCl2 eller MgCl2, som var fortyndet i den samme buffer. HPC-4, som var titreret med det syntetiske peptid P(l-12), P(6-17) eller P(15-27), 30 var i en slutkoncentration på 5 μΜ i en opløsning indeholdende enten 1 mM EDTA eller 1 mM CaCl2 før tilsætning af peptider. Emissionsintensiteten (305-400 nm) blev iagttaget 5 minutter efter hver tilsætning af titreringsmiddel. Under alle forsøgsbetingelser bidrog den fortynding af prøven, som DK 171826 B1 16 skyldtes tilsætning af titreringsmidlet, med <4% af den iagttagne ændring i signalet.

Da peptidet, som binder sig, ikke indeholder aromatiske aminosyrer, kan eventuelle ændringer i den indre fluorescens, 5 som iagttages, direkte tillægges ændringer i antistoffet som et resultat af peptidbinding. Den indre fluorescens af HPC-4 blev forøget ved titrering med P(6-17) i nærværelse af 1 mM Ca2+, idet der blev nået et maksimum ved det forventede 2:1-forhold mellem peptid og antistof. I 1 mM EDTA steg 10 fluorescensen også, men dette nødvendiggjorde højere peptidkoncentrationer. De syntetiske peptider P(l-12) og P(15-27) ændrede ikke på signifikant måde HPC-4-fluorescensen i nærværelse af Ca2+.

Ca2+-afhængigheden af HPC-4-P(6-17)-bindingen blev også 15 undersøgt under anvendelse af fluorescensmetoder. Den indre fluorescens af HPC-4 i nærværelse af P(6-17) forøgedes ved titrering med Ca2+ med den halve maksimale ændring forekommende ved 6,5 ± 1,2 μΜ Ca2+. 1 μΜ HPC-4 blev titreret med metalioner i nærværelse eller fravær af 2 μΜ P(6-17).

20 Ændringer i emissionen af tryptophan blev overvåget som tidligere beskrevet. Mg2+ havde ingen indvirkning på den indre fluorescens af HPC-4 i nærværelse eller fravær af peptidet. Ca2+-titrering af antistoffet i fravær af peptid viste kun 5% udslukning af den indre fluorescens, hvilket 25 indikerer en mulig Ca2+-vekselvirkning med antistoffet ved lav affinitet.

Tb3+ blev anvendt til at undersøge Ca2+-bindingsstedet, da Tb3+-fluorescensemissionen i høj grad forøges, når det binder sig til et sted på et protein tæt nok på en tryptophan- eller 30 tyrosinrest til at muliggøre effektiv singlet-singlet-over-gang. P(6-17) indeholder ikke aromatiske donoraminosyrer for forøget fluorescens, mens HPC-4 gør. 1 μΜ HPC-4 i 0,1 M MES, 0,1% gelatine, 0,02% NaN3, pH-værdi 6,0, blev titreret med Tb3+ i nærværelse eller fravær af 4 μΜ P(6-17). HPC-4- DK 171826 B1 17 tryptophan blev exciteret ved 285 nm under anvendelse af et SB 300 UV bånd-passagefilter (Oriel) i excitationsvejen. Tb3+-ionemissionsintensiteten blev iagttaget med intervaller på 2 nm og integreret fra 53 8 til 552 nm. Bidrag fra 5 lysspredningen blev målt som oversvingningen af ex-citationsbølgelængden optaget ved 570-580 nm. For hver Tb3 + -koncentration blev emissionsintensiteten af opløsningsmiddelværdien, som var titreret parallelt med prøven, trukket fra intensiteten for proteinopløsningen til opnåelse af den pro-10 teinafhængige Tb3 + -fluorescens alene.

Titrering af HPC-4 med Tb3 + resulterede i en forøget Tb3 + -fluorescens, som var den halv-maksimale ved en Tb3+-koncentration på 34 ± 11 μΜ. Tb3 + - titrering af HPC-4 under tilstedeværelse af P(6-17) resulterede også i en forøget 15 Tb3+-fluorescens, men den halv-maksimale frie Tb3+-kon- centration faldt til 2 ± 0,9 μΜ. Kontrolforsøg, hvor peptidet blev titreret under de samme betingelser, viste ingen forøgelse af Tb3+-fluorescensen, hvilket således viste, at peptidet ikke alene var ansvarligt for ændringer i 20 fluorescensen. Forøgelsen i affinitet for Tb3+ af peptid-HPC- 4-komplekset på 17 gange viste transformationen af et lavaffinitetssted for binding af metalioner i HPC-4 til et høj affinitetssted. Disse resultater blev bekræftet med hensyn til Ca2+-binding til antistofpeptidkomplekset under 25 anvendelse af Hummel-Dreyer-gelfiltreringsteknikken, Biochem. Biophys. Act 63, 530-532 (1962). P(6-17), HPC-4 og blandinger deraf blev ført til søjlen, og deres evne til at binde Ca2 + blev bestemt. P(6-17) bandt ikke Ca2+. HPC-4 og et 3,5 gange molært overskud af P(6-17) viste en Ca2+-bindingsforøgelse 30 til 1,76 mol Ca2+/mol HPC-4. Mg2+ havde ingen virkning på Ca2+-bindingen af HPC-4/P(6-17)-komplekset (1,41 og 1,52 mol Ca2+/mol HPC-4 i henholdsvis 0,01 mM Ca2+ og 0,02 mM Ca2+).

Den foreliggende opfindelse omfatter et immunologisk aktivt fragment (epitop) af protein C, som binder antistoffet HPC-4, 35 omfattende i det mindste en del af aminosyresekvensen DK 171826 B1 18 glutaminsyre-asparaginsyre-glutamin-valin-asparaginsyre-prolin-arginin-leucin-isoleucin-asparaginsyre-glycin-lysin, som vist i fig. 1 i resterne 6 til 17 i den tunge kæde.

Som ovenfor beskrevet kan peptidet anvendes ved isolering og 5 oprensning af HPC-4 ved affinitetskromatografi. På en lignende måde kan peptidet anvendes til midlertidigt at "beskytte" bindingsstedet under processen, hvor antistoffet bindes til det kromatografiske substrat for at sikre, at den maksimale mængde af bundet antistof er tilgængelig for bin-10 ding til proteinet, som skal isoleres. De reaktive grupper i peptidet, som er i stand til at reagere med kromatografisubstratet (aminoterminal, lysin-sidekæde), som ikke er nødvendigt for genkendelsen hos HPC-4, blokeres først ved omsætning af peptidet med eddikesyreanhydrid under anvendelse af 15 standardmetoder, som er velkendte for fagmanden inden for området. Efter at HPC-4 er koblet til harpiksen, fjernes peptidet, som er bundet i antigenbindingsstedet hos antistoffet, ved vask af harpiksen med 1,5 M guanidin HCl, 2 mM EDTA, 0,02 M Tris HCl, pH-værdi 7,5.

20 Antistoffet og peptidet kan bindes til en lang række substrater til brug ved oprensning og isolering af henholdsvis protein C og antistoffet omfattende agarose, acryl-amid og andre typer af konventionelle kromatografiharpikser, filtre, osv. Disse materialer er kendte for fagmanden på om-25 rådet, hvilket også gælder fremgangsmåderne til binding af proteinet til materialerne. Udvælgelsen af materialet vil i stor grad afhænge af målestokken for oprensningen eller prøven, som skal analyseres, såvel som bioforligeligheden og myndighedernes godkendelse, hvor slutproduktet er til farma-30 ceutisk brug. På lignende måde er fremgangsmåder og midler til mærkning af antistoffet til brug som et diagnostisk middel kendte for fagmanden inden for området, herunder mærkning med et radioaktivt, fluorescerende, selvlysende eller enzymatisk molekyle.

DK 171826 B1 19

Antiaenudvinding under anvendelse af immobiliserede antistoffer med metal-afhængige antioenbindingssteder

Det monoklonale antistof ifølge den foreliggende opfindelse er blevet vist at have et antigenbindingssted og i det 5 mindste et metalionbindingssted. Det er nødvendigt at hensyn til høj affinitetsbinding af antigenet, at ionbindingsstedet besættes. Aminosyresekvensen for metalionbindingsregionen i antistoffet kan bestemmes, eller også kan genet for den variable region bestemmes ud fra kloning og cDNA-sekvensbe-10 stemmelse. Dette segment af cDNA'et kan derefter indsættes i gener, som koder for andre proteiner, især antistoffer, til bibringelse af metalbindingskapacitet hos det opnåede protein. Disse kimære antistoffer kan derefter anvendes til at isolere andre molekyler, som ikke selv undergår metalafhæn-15 gige konformationsændringer. Dette er en stor fordel ved proteinoprensning, idet det at finde et monoklonalt antistof, som har milde elueringsbetingelser, ofte er uhyre vanskeligt, hvilket fører til en manglende evne til at eluere proteinerne, som har interesse, i funktionel form. Som et resultat 20 heraf er potentialet for monoklonale antistoffer inden for proteinoprensning ikke blevet fuldstændig indset.

Antistoffer, som binder sig til et antigen på metalafhængig måde på grund af antistoffets evne til at binde metal snarere end nødvendigheden af, at antigenet selv undergår metalaf-25 hængige konformationsændringer, kan anvendes inden for affinitetskromatografi under meget milde betingelser, idet antigenet elueres med en chelaterende eller metalholdig opløsning.

Metalbindingsregionen hos HPC-4 kan lokaliseres under 30 anvendelse af begrænsede proteolyseteknikker til frembrin gelse af små fragmenter af antistoffet. Fragmentet, der er i stand til at binde metalioner, kan identificeres ved dets evne til at forøge Tb3 + -f luorescensen, da denne ion har tilstrækkelig affinitet over for antistoffet i fravær af 35 antigen til at påvise dets binding. Fab-, Fab'- og Fc-frag- DK 171826 B1 20 menter af antistoffet kan fremstilles af fagmanden inden for området ved standardteknikker under anvendelse af pepsin- og papainfordøj else. Mindre fragmenter kan fremstilles ud fra den passende del af antistoffet ved CNBr-kløvning såvel som 5 ved fordøjelse med andre proteolytiske enzymer, som beskrevet af Kurosawa, s., et al., J. Biol. Chem., 263:5993-5996, 1988; Ohlin, A-K og J. Stenflo, J. Biol. chem., 263:7411-4717, 1988; Stearns, D.J. et al., J. Biol. Chem., "Micro- thrombomodulin; Residues 310-486 from the epidermal growth 10 factor precursor-homology domain of thrombomodulin will accelerate protein C activation" (in press 1989); indtil det mindste fragment, som bevarer ionbindingsfunktion opnås. HPC- 4-cDNA kan klones og sekvensbestemmes ved fremgangsmåder, som er kendte for fagmanden inden for området. cDNA kan fremstil-15 les ud fra hybridomacellelinie HPC-4 (ATCC nr. 9892) , hvorefter der kan konstrueres et lambda gtll-ekspressionsbibliotek (T.v. Huynh, et al., i DNA cloning: a practical approach, bind 1, (D.M. Glover, ed.), IRL Press, Oxford, 1985, side 49- 78). Biblioteket kan screenes under anvendelse af affinitets-20 oprenset gede-anti-HPC-4-antistof. Passende kloner ekspanderes, hvorefter cDNA'et udskæres og indsættes i M13 til standard DNA-sekvensbestemmelse (M13 cloning and sequencing handbook, Amersham; Messing, J., "New M13 vectors for cloning, "Methods in Enzymology-Recombinant DNA techniques, 25 101, del C:20-78, 1983).

Endvidere kan fragmenter, som udtrykkes af kloner, der reagerer positivt med anti-HPC-4, også oprenses og undersøges for evnen til at binde Tb3+, hvilket muliggør en yderligere metode til at finde regionen, som har interesse i HPC-4-30 molekylet. Så snart fragmentet i DNA'et, som svarer til det passende ionbindingsfragment hos HPC-4-antistofgenet, er lokaliseret, anvendes det passende restriktionsenzym, såsom EcoRI, til at udskære dette fragment. Fremgangsmåder til konstruktion af kimære gener er beskrevet af f.eks. Kobilka, 35 B.K. et al., "Chimeric α2“' ^2-A^rener9·*-0 Receptors:

Delineation of Domains Involved in Effector Coupling and DK 171826 B1 21

Ligand Binding Specificity" Science 240:1310-1316, 1988;

Verhoeyen, M., C. Milstein, G. Winter, "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity," Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann, L., M. Clark, H. Waldmann, G.

5 Winter, "Reshaping human antibodies for therapy," Nature, 332:323-327, 1988. Mål-DNA'et indeholdende genet for det mo- noklonale antistof, som har interesse, vil blive behandlet på lignende måde som kilde-DNA'et med et restriktionsenzym, således at pladsen for indsættelse af cDNA-fragmentet er til-10 gængelig. Linkere med forligelige ender ligeres derefter til det indsatte fragment (f.eks. Sall), og ligeringen udføres.

Det kimære cDNA kan derefter klones ind i en passende ekspressionsvektor, såsom Baculovirus, ifølge de af Summers, M.D. og G.E. Smith beskrevne procedurer "A Manual of methods 15 for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures", Texas Agricultural Experimental Station (1987). Ekspression af det rekombinerede gen kan opnås ved de deri beskrevne metoder. Screening for det ønskede produkt kan foretages ved ELISA-analyse, hvor det frigivne protein undersøges for dets 20 evne til at genkende antigenet, over for hvilket målimmuno-globulinet var specifikt på en metalafhængig måde. Hvorvidt tilstedeværelsen eller fraværet af en metalion er nødvendig for genkendelse af antigenet vil mest sandsynligt afhænge af det bestemte antistof-antigenpar.

25 I det tilfælde, at metalbindingsregionen hos HPC-4 ikke befinder sig i en enkelt strækning af aminosyrer, f.eks. hvis segmenter af både den tunge og lette kæde hos immuno-globulinet bidrager til dette sted, vil det være nødvendigt at gentage proceduren for hvert sådant segment, som beskrevet 30 af Verhoeyen, M., et al., Science, 1988; Riechmann, L., et al., Nature, 1988. Det vil forstås af fagmanden inden for området, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til brugen af bestemte nucleaser, vektorer eller ekspressionssystemer på et hvilket som helst punkt af den ovenfor 35 beskrevne procedure, og at den omfatter en hvilken som helst kombination, som til slut fører til produktionen af funk- DK 171826 B1 22 tionelt antistof, der er i stand til at binde antigenet, der har interesse, på en metalafhængig måde på grund af indsættelsen af den eller de passende peptidsekvenser fra HPC-4.

Terapeutiske anvendelser af HPC-4 5 Koagulations- og anti-koagulationssystemerne hos pattedyr giver et følsomt kontrol- og balancesystem, som opretholder blodet i dets rette flydende tilstand. Ændring af et hvilket som helst enkelt element i dette system kan have en meget stor indflydelse på evnen hos pattedyret til at opretholde 10 hæmostase.

Protein C-systemet er et antikoagulerende regulatorisk system, som inhiberer blodkoagulation og stimulerer fribino-lyse. Dette system aktiveres af thrombin, et enzym, som omdanner fibrinogen til fibrin i den koagulative proces. Frit 15 thrombin eller et overskud af thrombin binder sig til thrombomodulin, et protein på endothelcellerne. Thrombin/-thrombomodulin-komplekset formindsker evnen hos thrombin til at katalysere dannelse af størknet blod og omdanner thrombin til en kraftig protein C-aktivator. Aktiveret protein C 20 virker på sin side i kombination med protein S og en mebran-overflade til inaktivering af faktor Va og faktor Villa ved begrænset proteolyse. Den inaktiverede faktor Va mister evnen til at reagere effektivt med enzymfaktoren Xa eller substratet prothrombin.

25 Tilsætning af et antistof til protein C, et antistof til thrombomodulin, et antistof til protein S eller C4b-bin-dingsproteinet, som binder protein S, hvorved det inaktiveres som en cofaktor i en passende form, kan anvendes til at fremme blodstørkning hos individer, hvor det er ønsket at 30 gøre sådan. Patienter med FVIII-inhibitorer er repræsentative for denne gruppe af patienter. Ved at forhindre faktoren Va i at blive inaktiveret fortsætter koagulationen, selv i relativt fravær af faktor VIII.

DK 171826 B1 23

Virkningen af at indgive disse inhibitorer for protein C-antikogulationssystemet kan vendes om ved indgivelse af overskydende mængder af aktiveret protein C eller protein S afhængig af midlet, som anvendes til at blokere vejen. Den 5 passende mængde er baseret på beregninger, som angår de relative molære mængder af proteinerne til stede i blodet.

Gennemførligheden af denne metode til frembringelse af en hyperkoagulerbar tilstand er blevet vist ved indgivelse af HPC-4 til bavianer (Taylor, et al., J. Clin. Invest., 79, 10 918-925 (1987)). Når HPC-4 var til stede, udviklede dyrene et massivt koagulationsrespons, som var karakteriseret ved et fuldstændigt fibrinogenforbrug, over for infusionen af små mængder bakterier. De udviklede ikke dette respons i fravær af antistoffet. Næsten identiske resultater opnås, når C4bBP-15 niveauerne forhøjes til ca. 1 mg/ml plasma. Selvom disse responser er skadelige for dyrene, illustrerer de, at enhver af disse metoder vil fremme koaguleringssystemet. Dette er gunstigt i situationer, hvor normal hæmostase er hæmmet.

Denne metode kan også anvendes ved behandling af andre 20 størkningsfaktor-mangeltilstande omfattende thrombocytopenia, f.eks. som induceret af heparin eller strålebehandling, leversygdom og hjerneblødning, både akut og til at mindske genblødning efter det akutte tilfælde.

HPC-4 kan også anvendes til at inducere mikrovaskulær 25 størkning i et fast tumorleje. I en fast tumor-hundemodel har dette vist sig i høj grad at hindre tumorvækst. Kombinationen af dette antistof og/eller de andre midler angivet ovenfor, som er i stand til at blokere virkningen af protein C-anti-koagulationsvejen, med andre behandlinger, der for tiden er i 30 brug, såsom tumornecrosefaktor eller bestråling, kan føre til en mere effektiv behandling af faste tumorer.

Farmaceutisk acceptable bærere til administration af disse midler omfatter en steril normal saltopløsning ved fysiolo- DK 171826 B1 24 gisk pH-værdi. Ved den foretrukne administrationsmetode injiceres midlet i individet, fortrinsvis intravenøst. De foretrukne doser er på mellem ca. 5 og ca. 2 0 μg HPC-4/ml plasma, som er tilstrækkelige til at blokere mere end 90% af 5 det endogene protein C.

Eksempel 1

Hurtig isolering af protein C fra plasma i stor målestok

Hurtig isolering af protein C blev foretaget ved at følge det nedenfor illustrerede strømningsdiagram. Kort beskrevet 10 bliver protein C og de andre vitamin K-afhængige proteiner adsorberet batch-vis på QAE-Sephadex Q50 (30 g opkvældet i 0,1 M NaCl, 0,02 Tris HCl, pH-værdi 7,5) fra 30 liter humant plasma fortyndet 1:1 med 0,02 M Tris HCl, pH 7,5, heparin (1 U/ml slutvolumen) og benzamidin HCl (10 mM slutvolumen) i 1 15 time ved stuetemperatur, og de får lov til at sætte sig i 30-60 minutter, hvorefter supernatanten bortledes gennem en hævert. Sephadex-materialet pakkes i en 10 x 60 cm søjle, vaskes med 1 1 0,15 M NaCl, 0,02 M Tris HCl og 10 mM benzamidin HCl, pH 7,5, før eluering af protein C med 0,5 M 20 NaCl i den samme buffer. Voluminet af det sammenbragte materiale formindskes til ca. 600 ml. Til dette volumen sættes heparin til 10 U/ml, Ca2+ til 10 mM, DFP til 1 mM og ca.

100 ml HPC-4 Affi-Gel 10. Denne blanding omrøres i 1 time, får lov til at sætte sig, pakkes i en 2,5 x 20 cm søjle og 25 vaskes med 1,0 1 0,5 M NaCl, 0,02 M Tris HCl, 5 mM benzamidin HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,5, og derefter med 100 ml 0,1 M NaCl, 0,02 Tris HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,5, før eluering af protein C med den samme buffer, indeholdende 2 mM EDTA i stedet for Ca2+.

30 Forurening med serumamyloid P, et protein, som binder Sepha-dex i nærværelse af Ca2+, fjernes ved ionbytterkromatografi på QAE-Sephadex Q50. Søjlen (0,9 x 3 0 cm) udvikles i en lineær gradient fra 0,1 til 0,6 M NaCl i 0,02 M Tris HCl, pH

DK 171826 Bl 25 7,5. Protein C elueres som den sidste top fra søjlen. Dette kan bekræftes ved SDS-gelelektroforese, protein C-antigenana-lyse og protein C-funktionelle analyser. Denne fremstilling giver enkeltkædet og tokædet protein C i de omtrentlige 5 andele, som findes i humant plasma.

PROTEIN C-OPRENSNING

Batch-adsorption af fortyndet 10 hepariniseret plasma på QAE-Sephadex

Vask med bufret 0,15 M NaCl Eluering med bufret 0,5 M NaCl

Genforkalkning og batch-adsorption med HPC-4

Vask med Ca2+-holdig buffer 15 Eluering med EDTA-holdig buffer Når kommercielt fremstillede vitamin K-afhængige plasma-proteinkoncentrater, såsom Konyne (Cutter Labs), Proplex (Hyland) eller FEIBA (IMMUNO, Østrig) anvendes i stedet for 20 plasma, rekonstitueres koncentraterne i en buffer, som er forligelig med HPC-4-binding af protein C (dvs. en buffer indstillet til pH 6-7,5 indeholdende 2 mM CaCl2, antikoagu-lationsmidler, såsom heparin i mængder på 5-10 enheder/ml og antithrombin III (10-100 /xg/ml) , og proteaseinhibitorer, 25 såsom benzamidin og DFP i mængder på 1 mM hver) og påføres direkte på HPC-4-Affi-Gel 10-harpiksen, enten i batch eller i en søjle. De vaske- og elueringsbetingelser, som anvendes, er de samme som ovenfor beskrevet. QAE-kromatografi efter eluering af protein C fra HPC-4-harpiksen er kun nødvendig, hvis 30 serumamyloid P er til stede i materialet, som føres til affinitetsharpiksen .

DK 171826 B1 26 Når en supernatant fra vævskulturceller, som er genetisk manipuleret til fremstilling af humant protein C, anvendes i stedet for plasma eller koncentrat, kan denne direkte blandes med HPC-4-affinitetsharpiksen, enten efter tilsætning af 2 mM 5 CaCl2 og proteaseinhibitorer eller efter koncentrering og resuspendering i en buffer, der er forligelig med protein C-binding til HPC-4, såsom ovenfor beskrevet. Supernatanten kan koncentreres ved hjælp af 50% NH4S04-præcipitation eller ionbytning, som tidligere beskrevet med henvisning til 10 plasma. Det sædvanlige udbytte af protein C er 0,04 mg protein C/mg antistof.

Eksempel 2

Anvendelse af HPC-4 som et diagnostisk middel til bestemmelse af protein C

15 HPC-4 kan anvendes til at analysere protein C i humant plasma. Protein C kan adsorberes kvantitativt og elueres reproducerbart fra immobiliseret HPC-4. Det opnåede protein C kan analyseres for funktionelle egenskaber. Dette er anvendeligt til den entydige påvisning af protein C-mangel hos udvalgte 20 patienter med tilbagevendende thrombose og abnorme protein C-molekyler. Eksempler på brugen af protein C-antistoffer til diagnostiske formål er angivet af D'Angelo, S.V., et al., J.

Clin. Invest., 77:416-425, 1986 og Faioni, E., et al., Blood, 71:940-946, 1988.

25 Endvidere kan antistoffet mærkes med et sporingsstof, såsom 12^I, under anvendelse af enzymperler, "Enzymobeads" (Bio-Rad), biotin (Shattil, S., et al., Blood, 70:307-315, 1987) eller andre passende mærkninger, som kendes af fagmanden inden for området, med det formål at udvikle immunologiske 30 rutineanalyser til brug i kliniske laboratorier, såsom enzymkoblet immunoanalyse (ELISA) eller radioimmunoanalyse (RIA) med det formål at bestemme de antigene niveauer af protein C i kliniske plasmaprøver.

DK 171826 B1 27

Det bør imidlertid bemærkes, at selvom beskrivelsen af metoder under anvendelse af antistoffer er omtalt tidligere, har det monoklonale antistof ifølge opfindelsen ikke været almindeligt tilgængeligt.

Claims (6)

1. 2. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 10 det yderligere omfatter en mærkning valgt blandt radioaktive molekyler, chemiluminescerende molekyler, fluorescerende molekyler, luminescerende molekyler og enzymer.
2. 3. Hybridomacellelinien HPC-4 deponeret hos the American Type Culture Collection 2. november 1988 og tildelt ATCC nr. 15 9892.
3. 4. Fremgangsmåde til isolation af protein C, kende tegnet ved, at man anvender et Ca2+-afhængigt monoklonalt antistof ifølge krav 1.
4. 5. Polypeptid, kendetegnet ved, at det omfatter 20 et immunologisk aktivt fragment af protein C, som binder antistoffet HPC-4.
5. 6. Polypeptid ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det immunologisk aktive fragment omfatter i det mindste en del af aminosyresekvensen glutaminsyre-asparaginsyre-gluta- 25 min-valin-asparaginsyre-prolin-arginin-leucin-isoleucin-asparaginsyre-glycin-lysin. DK 171826 B1 29
6. 7. Fremgangsmåde til isolation af et Ca2+-afhængigt monoklonalt antistof rettet mod en epitop i aktiveringspeptidregionen i den tunge kæde af protein C, kendeteg net ved, at man anvender et polypeptid ifølge krav 6. 5