TW202300168A - Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物 - Google Patents

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加藤淳彦
林修次
栁澤和泉
今野良
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Abstract

本發明係提供對於新穎的IL-8相關疾病，使用IL-8訊息阻礙劑的治療方法等。或者，提供例如對於習知或新穎的IL-8相關疾病，使用新穎的抗IL-8抗體的治療方法等。

Description

IL-8相關疾病之治療用或預防用組成物
本發明係關於IL-8相關疾病的治療用或預防用組成物等。
子宮內膜異位症(endometriosis)不僅為雌激素依賴性的(非專利文獻1及2)，亦已知為炎症性疾患(非專利文獻3)。
子宮內膜異位症雖不意圖限定，於一面向中，係存在於子宮的內膜組織，於子宮外的異位性(通常於骨盆內，有時於腹腔，少見於胸腔)產生、增殖的疾病。雖不為惡性腫瘤，但為歷時的進行，帶來腫瘤形成與周圍的沾黏、月經時及其以外的重度腹痛及骨盆痛，乃至於不孕症(懷孕能力降低)的疾病。主要發生於20歲以上的生殖年齡女性，因痛等生活品質(QOL)降低，因沾黏的重症化而造成疼痛的慢性化及不孕症。子宮腺肌症(Adenomyosis)雖不意圖限定，於一面向中，係內膜症的類似疾病，有內膜產生於子宮內的肌肉層者。帶來重度的月經痛、過多月經乃至於貧血、慢性疼痛。(又，本說明書所記載關於子宮內膜異位症及子宮腺肌症的用語，於後述用於實施發明的態樣中所記述而賦予定義)。 以往所使用，作為子宮內膜異位症或子宮腺肌症的治療法，有鎮痛劑、荷爾蒙療法、手術療法。鎮痛劑除了效果為限定的之外，無法防止病態的進行。荷爾蒙療法的情況，對於疼痛的減輕及病態進行的延遲雖有效果，但因為停止月經，因此治療中成為沒有懷孕能力，中止治療時再度的病態進行的可能性高，進一步地，有荷爾蒙劑的副作用等為問題點。再者，沒有藉由荷爾蒙劑的投予、在投予後改善懷孕能力的報告。手術療法的情況，3至5年中約50%復發的可能性高(非專利文獻4及5)，於預防術後復發時，必須耐受副作用而持續服用荷爾蒙劑。
IL-8(介白素8，Interleukin 8)為一種趨化介素(chemokine)，是已知存在有72胺基酸型及77胺基酸型的蛋白質。IL-8亦稱為CXCL8。IL-8單體，標記為72胺基酸型時，於半胱胺酸7及半胱胺酸34之間，以及半胱胺酸9及半胱胺酸50之間有2個雙硫鍵。亦已知IL-8於溶液中亦可作為同質二聚體存在，該等同質二聚體的分子間不存在共價鍵，藉由2個單體的β摺板間的非共價鍵的相互作用而安定化。 IL-8藉由炎症性細胞因子等的刺激，由末梢血單核球、組織巨噬細胞、NK細胞、纖維母細胞、血管內皮細胞等各種細胞而產生(非專利文獻6)。IL-8主要活化嗜中性球，亢進細胞接著分子的表現，而謂具有提高嗜中性球對血管內皮細胞的接著的作用。再者，IL-8具有嗜中性球趨化能力，於損傷組織所產生的IL-8促進接著於血管內皮細胞的嗜中性球對組織的移轉，引起伴隨嗜中性球浸潤的炎症。進一步地，IL-8是對於內皮細胞為有力的血管新生因子，又，亦已知與腫瘤的血管新生相關。
至今為止，已有報告於切除卵巢之經移植雌二醇釋放膠囊的裸鼠中，將增殖期的人類子宮組織內膜移植腹腔後，投予抗IL-8抗體時，發現子宮內膜病變的退縮(專利文獻1)。 然而，由於與人類同樣的月經不存在於靈長類以外的實驗動物模型，對於人類子宮內膜異位症的原因究明，於大鼠、小鼠等無法獲得人類子宮內膜異位症的真實意義的動物模型。首先，大鼠、小鼠中不存在IL-8。再者，亦有最近為止沒有可正確評價人類子宮內膜異位症的非人類靈長類的活體內模型，最近為止對於子宮內膜異位症的IL-8訊息的影響，不存在實際上經以非人類靈長類活體內模型確認的報告。
再者，因外科手術等的沾黏，於各種病理狀態中成為問題。作為沾黏等的治療或預防法，有沾黏防止片。沾黏防止片雖然有術後沾黏減低效果，但仍以15%的頻率形成強固的沾黏(dense adhesion)(非專利文獻7)，效果仍未充分。 [先前技術文獻] 專利文獻
專利文獻1: WO 2009/026117 非專利文獻
非專利文獻1: Bulun et al., Endometriosis. N Engl J Med 2009; 360: 268-279 非專利文獻2: Giudice et al., Endometriosis. Lancet 2004; 364: 1789-1799 非專利文獻3: Donnez et al., Gynecol Obstet Invest 2002; 54 Suppl 1: 52-58; discussion 59-62 非專利文獻4: Vercellini et al., Am J Obstet Gynecol. 2008 May; 198(5): 504.el-5 非專利文獻5: Guo et al., Hum Reprod Update. 2009 Jul-Aug; 15(4): 441-461 非專利文獻6: Remo et al., Expert Rev. Clin. Immunol. 2014 10(5): 593-619 非專利文獻7: Becker et al., J Am Coll Surg. 1996 Oct; 183(4): 297-306
發明欲解決之課題
本發明有鑑於包含上述各種狀況，其目的，於非限定的一面向中，對於IL-8相關疾病，使用IL-8訊息阻礙劑，提供新穎的治療方法等。 更具體而言，本發明於非限定的一實施態樣中，對於新穎的IL-8相關疾病，使用IL-8訊息阻礙劑，提供新穎的治療方法等。或者，本發明於非限定的另外的實施態樣中，對於新穎或已知的IL-8相關疾病，使用新穎的抗IL-8抗體，提供新穎的治療方法等。 用於解決課題之手段
雖不意圖必然為拘束於理論，本發明者們提倡子宮內膜異位症的真實病理狀態已經報告(Odagiri, Fertil Steril. 2009; 92(5): 1525-31)為如同慢性炎症性增殖疾病的概念。子宮內膜異位症的病態病理為持續引發慢性炎症的免疫反應，呈現為纖維化、平滑肌變形、神經再生、血管新生等。慢性炎症機制的重要部分與IL-8有關，基於子宮內膜異位症為慢性炎症性疾病的概念，進行藥效的病理學評價以及臨床評價(利用腹腔鏡或MR的觀察)。 雖不意圖限定，本發明係由子宮內膜異位症等的病態解明用的非人類靈長類模型的製作，另一方面為高功能抗IL-8抗體的作成及改良，進行抗體的藥理效果評價，為基於處理由基礎至動物模型臨床為止的概括性研究者。由於人類子宮相關疾病的真實評價，於大鼠、小鼠、其他小動物的模型實驗為不可能，本發明者們，製作經以外科性誘發的子宮內膜異位症模型食蟹獼猴，互相參照包含食蟹獼猴之靈長類的生殖基礎研究，以及，人類子宮內膜異位症等的病理學的病態概念及評價與臨床(腹腔鏡手術與觀察、MRI(核磁共振造影)評價等)管理等優異的技術與發現等，嘗試錯誤與致力研究的結果而完成本發明。
亦即，於非限定的一態樣中，本發明者們，對於子宮內膜異位症或子宮腺肌症，與現存的荷爾蒙療法不同，作為對於性週期不賦予影響而致力於病態的改善的治療藥，進行著眼於子宮內膜異位症中主要的炎症性細胞因子的IL-8之由抗炎症的面向的方案，驚訝地發現以投予IL-8訊息阻礙劑而改善病態。 再者，於非限定的另外實施態樣中，本發明者們對於因外科手術等所發生的沾黏進行由抗炎症的面向的方案，驚訝地發現以投予IL-8阻礙劑而改善沾黏。 進一步地，於非限定的另外的實施態樣中，本發明者們推知本揭露之高功能抗IL-8抗體，有用於新穎或已知的IL-8相關疾病的治療等。作為該等高功能抗IL-8抗體，亦可為pH依賴性抗IL-8抗體(pH依賴性地結合於IL-8的抗IL-8抗體)。該pH依賴性抗IL-8抗體，與經投予至個體的對照抗體比較，由於可具有以下之至少1種以上的特性而為有利的：使IL-8快速消失，安定地維持中和IL-8的活性，免疫原性低，表現量高。或者，該等高功能抗IL-8抗體，亦可為具有以下之至少一種以上的特性的抗體：包含於酸性pH對於FcRn的結合親和性係較對於天然型的Fc區域的FcRn的結合親和性更增大的Fc區域的抗IL-8抗體，包含對於既存的ADA的結合親和性係較對於天然型的Fc區域既存的ADA的結合親和性更降低的Fc區域的抗IL-8抗體，包含於血漿中的半衰期係較天然型的Fc區域的血漿中的半衰期更增大的Fc區域的抗IL-8抗體，包含對於效應受體的結合親和性係較對於天然型的Fc區域的效應受體的結合親和性更為降低的Fc區域的pH依賴性抗IL8抗體。
本發明於非限定的具體一實施態樣中，係關於下述者： [1] 一種IL-8相關疾病的治療用或預防用組成物，其包含結合於IL-8的經單離抗IL-8抗體作為有效成分，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇， 前述抗IL-8抗體係由以下(1)至(7)所組成之群組選擇： (1) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3； (2) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 25的胺基酸序列的3位的酪胺酸、序列編號: 27的胺基酸序列的1位的天冬醯胺及5位的白胺酸、序列編號: 28的胺基酸序列的1位的麩胺醯胺的胺基酸置換； (3) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 24的胺基酸序列的9位的酪胺酸與11位的精胺酸、及序列編號: 25的胺基酸序列的3位的酪胺酸的胺基酸置換； (4) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 24的胺基酸序列的6位的丙胺酸、8位的甘胺酸、9位的酪胺酸及11位的精胺酸，及序列編號: 25的胺基酸序列的3位的酪胺酸的胺基酸置換； (5) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 27的胺基酸序列的1位的天冬醯胺及5位的白胺酸、及序列編號: 28的胺基酸序列的1位的麩胺醯胺的胺基酸置換； (6) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 24的胺基酸序列的9位的酪胺酸及11位的精胺酸，序列編號: 25的胺基酸序列的3位的酪胺酸，序列編號: 27的胺基酸序列的1位的天冬醯胺及5位的白胺酸，及序列編號: 28的胺基酸序列的1位的麩胺醯胺的胺基酸置換；以及 (7) 於以下(a)至(f)之至少一者中，包含至少一個胺基酸置換，pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3 其中，該抗IL-8抗體亦包含至少分別於序列編號: 24的胺基酸序列的6位的丙胺酸、8位的甘胺酸、9位的酪胺酸及11位的精胺酸，序列編號: 25的胺基酸序列的3位的酪胺酸，序列編號: 27的胺基酸序列的1位的天冬醯胺及5位的白胺酸，及序列編號: 28的胺基酸序列的1位的麩胺醯胺的胺基酸置換。 [2] 如[1]記載的組成物，其中，該抗IL-8抗體係由以下(8)至(19)所組成之群組選擇， (8) 包含：(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 29的胺基酸序列作為HVR-H2，及(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (9) 包含：(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 31的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (10) 包含：(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列作為HVR-H2，及(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (11) 包含：(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 107的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (12) 包含：(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 29的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 31的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (13) 包含：(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 107的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的[1]之(1)或(2)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (14) 包含：包含序列編號: 34的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 35的胺基酸序列的輕鏈可變區域的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (15) 包含：包含序列編號: 108的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 109的胺基酸序列的輕鏈可變區域的[1]之(1)或(2)之任一者所記載的抗IL-8抗體； (16)包含與(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 29的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 31的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3分別具有至少80%的(胺基酸)序列同一性的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體(其中，該抗體亦可為與包含：(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 29的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 31的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的抗體為功能性同等)； (17)包含與(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 107的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3分別具有至少80%的(胺基酸)序列同一性的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體(其中，該抗體亦可為與包含(a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列作為HVR-H1，(b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列作為HVR-H2，(c) 包含序列編號: 30的胺基酸序列作為HVR-H3，(d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列作為HVR-L1，(e) 包含序列編號: 107的胺基酸序列作為HVR-L2，及(f) 包含序列編號: 32的胺基酸序列作為HVR-L3的抗體為功能性同等)； (18) 包含分別與包含序列編號: 34的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 35的胺基酸序列的輕鏈可變區域具有至少80%的序列同一性的重鏈可變區域及輕鏈可變區域的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體(其中，該抗體亦可為與包含：包含序列編號: 34的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 35的胺基酸序列的輕鏈可變區域的抗體為功能性同等)；以及 (19) 包含分別與包含序列編號: 108的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 109的胺基酸序列的輕鏈可變區域具有至少80%的序列同一性的重鏈可變區域及輕鏈可變區域的[1]之(1)至(7)之任一者所記載的抗IL-8抗體(其中，該抗體亦可為與包含：包含序列編號: 108的胺基酸序列的重鏈可變區域及包含序列編號: 109的胺基酸序列的輕鏈可變區域的抗體為功能性同等)。 [3] 一種IL-8相關疾病的治療用或預防用組成物，其係含有結合於人類IL-8的經單離抗IL-8抗體作為有效成分，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇， 該抗IL-8抗體係由以下(I)至(VIII)所組成之群組選擇： (I) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含於由以EU編號所表示之235位、236位、239位、327位、330位、331位、428位、434位、436位、438位、及440位所成群組選擇之一個以上的位置的胺基酸置換； (II) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含於以EU編號所表示之434位、438位、及440位所成群組之全部位置的胺基酸置換； (III) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含於以EU編號所表示之434位為Ala；438位為Glu、Arg、Ser或Lys；及440位為Glu、Asp或Gln的全部的胺基酸置換； (IV) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含於以EU編號所表示之434位為Ala；438位為Glu、Arg、Ser或Lys；及440位為Glu、Asp或Gln的全部的胺基酸置換，進一步地，包含428位為Ile或Leu、及436位為Ile、Leu、Val、Thr、或Phe； (V) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含於由以EU編號所表示之L235R、G236R、S239K、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及S440E所成群組選擇之胺基酸置換一個以上； (VI) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含由以EU編號表示之 N434A/Q438R/S440E；N434A/Q438R/S440D； N434A/Q438K/S440E；N434A/Q438K/S440D； N434A/Y436T/Q438R/S440E；N434A/Y436T/Q438R/S440D； N434A/Y436T/Q438K/S440E；N434A/Y436T/Q438K/S440D； N434A/Y436V/Q438R/S440E；N434A/Y436V/Q438R/S440D； N434A/Y436V/Q438K/S440E；N434A/Y436V/Q438K/S440D； N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D； N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D； N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D； N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D； M428L/N434A/Q438R/S440E；M428L/N434A/Q438R/S440D； M428L/N434A/Q438K/S440E；M428L/N434A/Q438K/S440D； M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D； M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D； M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D； M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；及M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D所成群組選擇之胺基酸置換的組合； (VII) 包含Fc區域的抗IL-8抗體，該Fc區域包含以EU編號所表示之 L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；或 L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E 的胺基酸置換的組合；以及 (VIII) 抗IL-8抗體，其包含前述(I)至(VII)中任一項所記載的Fc區域，該Fc區域具有由以下(a)至(e)所成群組選擇的性質之至少一種： (a) 酸性pH中，該Fc區域的對於FcRn的結合親和性，比天然型Fc區域的對於FcRn的結合親和性更為增大， (b) 對於既存的ADA之該Fc區域的結合親和性比天然型Fc區域之對於既存的ADA的結合親和性更為降低， (c) 該Fc區域中的血漿中半衰期比天然型Fc區域的血漿中半衰期更為增大， (d) 該Fc區域的血漿中廓清率比天然型Fc區域的血漿中廓清率更為減少，及 (e) 對於效應受體之該Fc區域的結合親和性比天然型Fc區域的對於效應受體的結合親和性更為降低。 [4] 一種IL-8相關疾病的治療用或預防用組成物，其係含有結合於人類IL-8的經單離抗IL-8抗體作為有效成分，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所成群組選擇， 該抗IL-8抗體係由以下(A)至(F)所成群組選擇： (A) 抗IL-8抗體，其包含：包含序列編號: 36的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈； (B) 抗IL-8抗體，其包含：包含序列編號: 37的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈； (C) 抗IL-8抗體，其包含：包含序列編號: 106的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 44的胺基酸序列的輕鏈； (D) 抗IL-8抗體，其包含與：包含序列編號: 36的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈分別具有至少80%序列同一性的重鏈及輕鏈(其中，該抗體亦可為與包含：包含序列編號: 36的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈的抗體為功能性同等)； (E) 抗IL-8抗體，其包含與：包含序列編號: 37的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈分別具有至少80%序列同一性的重鏈及輕鏈(其中，該抗體亦可為與包含：包含序列編號: 37的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 38的胺基酸序列的輕鏈的抗體為功能性同等)； (F) 抗IL-8抗體，其包含與：包含序列編號: 106的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 44的胺基酸序列的輕鏈分別具有至少80%序列同一性的重鏈及輕鏈(其中，該抗體亦可為與包含：包含序列編號: 106的胺基酸序列的重鏈及包含序列編號: 44的胺基酸序列的輕鏈的抗體為功能性同等)。 [5] 如[1]至[4]中任一項所記載的組成物，其中，纖維化疾病係由子宮內膜異位症或子宮腺肌症的纖維化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊胞性纖維症、乾癬、肝纖維症、腎纖維症、及肺纖維症所成群組選擇。 [6] 一種IL-8相關疾病的治療用或預防用組成物，其係含有IL-8訊息阻礙劑(較佳為人類IL-8訊息阻礙劑)作為有效成分，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所成群組選擇。 [7] 如[6]所記載的組成物，其係用於抑制免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤。 [8] 如[6]或[7]所記載的組成物，其係用於阻礙芳香酶(Aromatase)或纖維化因子的產生。 [9] 如[6]至[8]中任一項所記載的組成物，其對於性週期不賦予影響。 [10] 如[6]至[9]中任一項所記載的組成物，其係用於使子宮內膜異位症或子宮腺肌症之沾黏或纖維化受到抑制。 [11] 如[6]至[10]中任一項所記載的組成物，其係用於(1)使子宮內膜異位症或子宮腺肌症的患者中之子宮內膜上皮細胞或基質(stroma)細胞萎縮，或(2)使子宮內膜異位症中的子宮內膜的組織間隙(interstitium)減少。 [12] 如[6]至[11]中任一項所記載的組成物，其中，月經困難症為具有子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症，或疑為子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症。 [13] 如[6]所記載的組成物，其中，沾黏為手術後所產生的沾黏。 [14] 如[6]至[13]中任一項所記載的組成物，其中，IL-8訊息阻礙劑為IL-8阻礙劑(較佳為人類IL-8阻礙劑)、CXCR1阻礙劑(較佳為人類CXCR1阻礙劑)、或CXCR2阻礙劑(較佳為人類CXCR阻礙劑)。 [15] 如[14]項所記載的組成物，其中，IL-8阻礙劑、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑分別為抗IL-8抗體(較佳為抗人類IL-8抗體)、抗CXCR1抗體(較佳為抗人類CXCR1抗體)、或抗CXCR2抗體(較佳為抗人類CXCR2抗體)。 [16] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其係用於抑制免疫細胞的IL-8相關疾病的病變部或其對其周邊環境的浸潤。 [17] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其係用於阻礙芳香酶或纖維化因子的產生。 [18] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其對於性週期不賦予影響。 [19] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其係用於使子宮內膜異位症或子宮腺肌症之沾黏或纖維化受到抑制。 [20] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其係用於(1)使子宮內膜異位症或子宮腺肌症的患者中之子宮內膜上皮細胞或基質(stroma)細胞萎縮，或(2)使子宮內膜異位症中的子宮內膜的組織間隙(interstitium)減少。 [21] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其中，月經困難症為具有子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症，或疑為子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症。 [22] 如[1]至[5]中任一項所記載的組成物，其中，沾黏為手術後所產生的沾黏。 [23] 如[1]至[22]中任一項所記載的組成物，其中，IL-8相關疾病對於IL-8訊息顯示回應性。 [24] 如[1]至[23]中任一項所記載的組成物，其進一步包含藥學上容許的載體。 [25] 如[1]至[5]、[16]至[24]中任一項所記載的組成物，其中，子宮內膜異位症為人類子宮內膜異位症。 [A1] 如[1]至[5]、[16]至[25]中任一項所規定的抗IL-8抗體，其係用於由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成群群組選擇的IL-8相關疾病的治療或預防的使用。 [A2] 如[6]至[15]、[23]至[25]中任一項所規定的IL-8訊息阻礙劑，其係用於人類子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；因人類子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇的IL-8相關疾病的治療或預防的使用。 [A3] 一種IL-8相關疾病的治療或預防方法，其係包含將[1]至[5]、[16]至[25]中任一項所規定的抗IL-8抗體或[1]至[5]、[16]至[25]中任一項所記載的組成物，投予至有其需要的對象，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇(其中，有其需要的對象可為已罹患該IL-8相關疾病，或亦可為有疑慮罹患該IL-8相關疾病的對象)。 [A4] 一種IL-8相關疾病的治療或預防方法，其係包含將[6]至[15]、[23]至[25]中任一項所規定的IL-8訊息阻礙劑或[6]至[15]、[23]至[25]中任一項所規定的組成物，投予至有其需要的對象，該IL-8相關疾病係由人類子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；因人類子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇(其中，有其需要的對象可為已罹患該IL-8相關疾病，或亦可為有疑慮罹患該IL-8相關疾病的對象)。 [A5] 一種[1]至[5]、[16]至[25]中任一項所規定的抗IL-8抗體的用途，其係用於製造用於IL-8相關疾病的治療或預防的醫藥，該IL-8相關疾病係由子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；纖維化疾病；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所組成之群組選擇。 [A6] 一種[6]至[15]、[23]至[25]中任一項所規定的IL-8訊息阻礙劑的用途，其係用於製造用於IL-8相關疾病的治療或預防的醫藥，該IL-8相關疾病係由人類子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；沾黏；因人類子宮內膜異位症、子宮腺肌症或月經困難症之疼痛；不孕症；及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛所成群組選擇。 任意地組合該等之任一項所記載的一個或複數個要件(element)的一部分或全部者，只要與所屬技術領中具有通常知識者的技術常識沒有技術上的矛盾，本發明亦涵括該等，且可為該領域業者所理解。
以下，說明本發明之較佳的非限定性實施態樣。
後述之本實施例所記載的一切要件(element)，於意圖本專利申請的權利化範圍中，不侷限於實施例所記載的內容的限定性解釋所能獲得的專利實務、習慣、法令等的限制，本「發明之實施方式」為均等的記載理所當然亦為意圖所記載。
任意地組合本揭露之任一記載的一個或複數個要件(element)的一部分或全部者，只要與該領域業者的技術常識沒有技術上的矛盾，本發明亦涵括該等，且可為該領域業者所理解。
本說明書中「抗體」意指使用於最廣泛的意義，只要顯示所期望的抗原結合活性，包含但不限定，單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段。
本揭露中，相對於所期望的參照抗體(例如成為參照之抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)的「結合於相同抗原決定基的抗體」意指，一實施態樣中，係指阻止結合於所期望抗原(例如IL-8、CXCR1、或CXCR2)的參照抗體的對該抗原的結合為例如50%、60%、70%、80%、90%、95%或其以上的抗體，相反地，參照抗體係阻礙抗體對該抗原的結合為例如50%、60%、70%、80%、90%、95%或其以上。此處，可使用典型的競爭分析但不限定於此。
本說明書之「單株抗體」意指由實質上均一的抗體的集團所獲得的抗體，亦即，例如包含天然發生的變異、或單株抗體製劑的製造時產生者，除去一般少量存在的變異體等潛在的變異體抗體，構成集團的各個抗體為相同，及/或結合於相同的抗原決定基。相對於一般包含針對不同的抗原決定基(epitope)的不同抗體之多株抗體調製物，單株抗體調製物的各單株抗體，係針對抗原上的單一決定基者。因此，修飾語「單株」，顯示由實質上均一的抗體集團獲得抗體的特徵，不應解釋為必須由任意的特定方法之抗體產生。例如，本揭露之單株抗體，包含但不限定，可為融合瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法、利用包含人類免疫球蛋白基因座的全部或部分的基因轉殖動物的方法之各種各樣的技術所製作。一實施態樣中，本揭露之抗體亦可為單株抗體。
本說明書之「天然型抗體」意指具有天然所產生之各種各樣構造的免疫球蛋白分子。例如，於一面向之天然型IgG抗體為以雙硫鍵結合的2個相同的輕鏈與2個相同的重鏈所成的約150,000道爾頓的異四聚體醣蛋白，但不限定於此。由N端朝向C端，各重鏈連續地具有可變區域(VH)，3個恆定區域(CH1、CH2及CH3)。同樣地，由N端朝向C端，各輕鏈連續地具有可變區域(VL)、恆定區域(CL)。抗體的輕鏈，基於其恆定區域的胺基酸序列，稱為卡帕(κ)及拉目達(λ)，可分配為2種型態的任一者。此處所使用之恆定區域，亦可使用被報告之任何異型(allotype，allele)或任何次型(subclass)/同型(isotype)者。例如作為重鏈恆定區域，雖不限定，可使用天然型IgG抗體(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恆定區域。例如作為IgG1的異型，已知IGHG1*01至05(參照http://www.imgt.org/)，可使用該等之任一者作為人類天然型IgG1序列。再者，恆定區域的序列，可為源自單一的異型或次型/同型，亦可為源自複數的異型或次型/同型。亦即，雖不限定，亦包含例如CH1源自IGHG1*01，CH2源自IGHG1*02，CH3源自IGHG1*03的抗體。作為天然型人類IgG抗體的重鏈恆定區域的一例，可列舉人類IgG恆定區域(序列編號: 100)、人類IgG2恆定區域(序列編號: 101)、人類IgG3恆定區域(序列編號: 102)、人類IgG4恆定區域(序列編號: 103)等。再者，作為天然型人類IgG抗體的輕鏈恆定區域的一例，可列舉人類κ鏈恆定區域(序列編號: 104)、人類λ鏈恆定區域(序列編號: 105)等。
本說明書之「框架」或「FR」意指超可變區域(HVR)殘基以外的可變區域部分。通常，可變區域的FR包含4個FR功能域(domain)：FR1、FR2、FR3、FR4。因此，HVR及FR的序列，通常以下述方式的序列呈現於VH(或VL)：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本說明書之「人類共通框架」(human consensus framework)意指於人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選別中，通常，表示最共通呈現的胺基酸殘基的框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列，由可變區域序列的亞群選別。通常，序列的亞群係根據Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)之亞群。一實施態樣中，關於VL的亞群可為根據上述Kabat et al.之亞群κI。再者，一實施態樣中，關於VH的亞群可為根據上述Kabat et al之亞群III。
本說明書之「受體人類框架」(acceptor human framework)意指含有由人類免疫球蛋白框架或人類共同框架所獲得之VL或VH框架的胺基酸序列之框架。由人類免疫球蛋白框架或人類共通框架「所獲得」之受體人類框架，含有與人類免疫球蛋白框架或人類共通框架為相同的胺基酸序列，亦可含有既存的胺基酸置換。一實施態樣中，既存的胺基酸置換的數為10、9、8、7、6、5、4、3、或2以下。一實施態樣中，VL受體人類框架係與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共同框架序列為相同序列。
本發明之「可變區域」意指相關於對所期望的抗原之抗體結合，抗體的重鏈或輕鏈的功能域。天然抗體的重鏈及輕鏈的可變區域(分別為VH及VL)，通常，具有包含4個經保存的框架區域(FRs)及3個超可變區域(HVRs)之與各功能域類似的構造(Kindt et al. Kuby Immunology. 6th ed., W. H. Freeman and Co., 2007 p.91)。一實施態樣中，雖然一個VH或VL功能域賦予抗原結合特異性即為充分，但不限定為此。進一步地，結合於某特定抗原的抗體，為了篩選VL或VH功能域的互補庫，亦可由結合於該抗原之抗體使VH或VL功能域經單離(例如，Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 1991 352: 624-628)。
本說明書之「超可變區域」或「HVR」意指於序列中包含超可變(「互補性決定區域」或「CDR」(complementarity determining region))、及/或形成規定構造的環(「超可變環」)、及/或抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之抗體的可變功能域的各區域。通常，抗體包含6個HVR：3個VH(H1、H2、H3)及3個VL(L1、L2、L3)。作為例示性HVR可列舉以下： (a) 於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)處產生的超可變環(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))； (b) 於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)處產生的CDR(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5 thEd. Public Health Service, National Instituted of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、88-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及93-101(H3)處產生的抗原接觸(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；以及 (d) 包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、及94-102(H3)，(a)、(b)、及/或(c)的組合。 若無特別指明，HVR殘基及可變區域中的其他殘基(例如，FR殘基)，於本說明書中係根據上述Kabat et al給予編號。
本說明書之「個體」意指哺乳類。哺乳類，雖不限定於其等，包含被飼養動物(例如，牛、羊、貓、狗、馬)、靈長類(例如，人類、或如猴等非人類靈長類)、兔、或齧齒類(小鼠或大鼠等)。一實施態樣中，「個體」較佳為生物體內天然地具有IL-8的哺乳類，與人類同樣地具有月經的動物，例如，更佳為非人類靈長類，人類為再較佳。本說明書中，以不使文章敘述的矛盾為限，個體可與「對象」互換使用。
本說明書之「經單離」抗體意指經由其天然環境的構成要件分離者。一實施態樣中，例如可於液相層析(例如，離子交換或逆相HPLC)、或電泳(例如，SDS-PAGE、等電點電泳(IEF)、毛細管電泳)，精製至例如95%或99%以上的純度。抗體純度的測定法例如參照Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007)。本揭露之「經單離」抗體，一面向中，可變換為「經精製」抗體。
本說明書之「經單離」核酸意指。經由其天然環境的構成要件分離的核酸分子。核酸，通常包括包含核酸分子的細胞中所包含之該核酸分子，但亦包括存在於染色體外者及與天然染色體位置為不同位置存在者。
本說明書之「親和性」典型地意指，分子(例如，抗體或化合物)的單一結合部位與其結合配偶體(partner)(例如，抗原)之間的非共價結合的相互作用的總合計強度。除非另行指明，本揭露之「結合親和性」意指，反映結合配對的成員(例如，抗體或化合物，與抗原)間的1:1的相互作用的固有的結合親和性。分子X對於其配偶體的親和性，一般而言，可表示為解離常數(KD)。結合親和性可以本揭露記載的方法等該領域業者習知的方法測定。
一實施態樣中，結合於IL-8、CXCR1或CXCR2等抗原的抗體，可具有解離常數(KD)為例如≦1000nM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、或≦0.001nM(例如，10 -8M以下、10 -8M至10 -13M、10 -9M至10 -13M等)。
本說明書之「宿主細胞」、「宿主細胞株」，可相互地交換使用，意指經導入外來核酸的細胞(包含此等細胞之後代細胞)。宿主細胞包含「形質轉換體」及「形質轉換細胞」，包含初代的形質轉換細胞及無關於其繼代數源自於此等之細胞的後代細胞。後代細胞與親代細胞於核酸的內容可不完全相同，亦可包含變異。亦包含與初始的形質轉換細胞經篩選或選擇時所使用者具有相同功能或生物學活性的變異體後代細胞。
本說明書之「載體」意指，能夠將連結至此等的別的核酸擴增的核酸分子，包含作為自我複製核酸構造的載體，及將其導入宿主細胞的基因體中重組的載體。某載體，可使以本身可動作的方式連結的核酸表現。該等載體於本說明書中亦稱為「表現載體」。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)亦可為抗體片段。抗體片段，例如，亦可包含Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) 2、Fv、scFv片段、雙功能抗體(diabody)、單一功能域抗體(single domain antibody)等抗體片段。抗體片段的總論，參照Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134 (2003)。scFv片段的總論，例如，參照Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)、WO93/16185、美國專利號5,571,894、美國專利號5,587,458。
本說明書之「雙功能抗體」為二價或雙特異性，具有2個抗原結合部位的抗體片段(例如，歐洲專利404,097；WO1993/01161；Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003)；Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))。三功能抗體或四功能抗體記載於例如Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003)。
本說明書之「單一功能域抗體」意指包含抗體的重鏈可變區域的全部或一部分，或輕鏈可變區域的全部或一部分的抗體片段。一實施態樣中，本揭露之抗體為單一功能域抗體的情況，其亦可為人類單一功能域抗體(例如，Domantis, Inc., Waltham, MA; 美國專利號6,248,516)。抗體片段，雖不限定，除了使用本說明書記載之重組宿主細胞產生之外，例如亦可利用酵素分解全長抗體等各種各樣的方法製作。
本說明書之「嵌合抗體」意指重鏈及/或輕鏈的一部分係特定的來源或物種，其餘的部分係不同的來源或物種的抗體。
本說明書之「人源化」抗體意指具有源自非人類HVR的胺基酸殘基，與源自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。一實施態樣中，人源化抗體，實質上包含至少一個，典型地為二個可變區域，該可變區域中，全部的(或實質上全部的)HVR，係相當於非人類抗體的HVR(例如CDR)，全部的(或實質上全部的)FR，係相當於人類抗體的FR。人源化抗體，根據情況，至少亦可包含源自人類抗體的抗體恆定區域的一部分。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)亦可為嵌合抗體。嵌合抗體，例如，記載於美國專利號4,816,567或Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)。嵌合抗體亦可包含非人類可變區域(例如，源自猴等非人類靈長類、或小鼠、大鼠、倉鼠、或兔等之可變區域)及人類的恆定區域。 一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)亦可為人源化抗體。典型地，非人類抗體係為了維持親代的非人類抗體的特異性及親和性，同時減少於人類的免疫原性而使其人源化。典型地，人源化抗體包含一個以上的可變區域，其中係存在HVR，例如源自非人類抗體的CDR(或其一部分)，及源自人類抗體序列的FR(或其一部分)。人源化抗體可任意地包含人類恆定區域的至少一部分。一實施態樣中，人源化抗體內FR的胺基酸殘基，例如，為了維持或改善抗體的特異性及親和性，亦可與非人類抗體(例如，源自HVR殘基所成抗體)的對應胺基酸殘基置換。 人源化抗體及其製作方法，例如於以下之總論(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008))，進一步例如以下所記載：Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)；Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)；美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321、及7,087,409；Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005)(敘述特異性決定區域(SDR)接枝)；Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991)(敘述表面重整(resurfacing))；Dall’Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005)(敘述FR混排(shuffling))；及Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005)及Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000)(敘述對FR混排之導向選擇方案)。
一實施態樣中，人源化所使用的人類框架，例如，亦可包含使用「最適配法」(Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)所選擇的框架、源自重鏈或輕鏈之可變區域的某特定亞群的人類抗體的共通序列的框架(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992)及Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993))、源自FR庫的篩選的框架區域(Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997)及Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996))。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)亦可為人類抗體。人類抗體可使用各種各樣的技術製作。人類抗體例如概說於van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001)及Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)。人類抗體亦可藉由將免疫原投予至已經能夠回應抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)、產生完整人類抗體或伴有人類可變區域之完整抗體的改變的基因轉殖動物而調製。該等動物，典型地包含人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，置換為內因性免疫球蛋白基因座，或於染色體外或以隨機併入該動物的染色體內基因體的狀態存在。該等基因轉殖小鼠中，內因性免疫球蛋白基因座，通常不活化。作為由基因轉殖動物獲得人類抗體的方法的總論，參照Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005)。再者，例如，參照美國專利號6,075,181、6,150,581所記載的Xenomouse(商標)技術；美國專利號5,770,429所記載的HUMAB(註冊商標)技術；美國專利號7,041,870所記載的K-M MOUSE(註冊商標)技術；以及美國專利號公開案2007/0061900所記載的VELOCIMOUSE(註冊商標)技術。由藉由該等動物所生成的完整抗體的人類可變區域，例如，亦可與不同的人類恆定區域組合，進一步使其修飾。
另外的實施態樣中，人類抗體可利用基於融合瘤的方法製作。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤細胞及小鼠-人類異種骨髓瘤細胞株記載於以下(例如，Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. New York, 1987)；及Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991))。經由人類B細胞融合瘤技術所生成之人類抗體記述於Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006)。作為其他的方法，亦可列舉例如美國專利號7,189,826 (記載由融合瘤細胞株之單株人類IgM抗體的製造)，及Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006)(記載人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三瘤體(trioma)技術)，係記載於Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005)及Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)。 另外的實施態樣中，人類抗體亦可將源自人類的噬菌體展示庫所選擇的Fv純株(clone)可變功能域序列單離而生成。該等可變區域序列，然後能夠與所期望的人類恆定區域組合。由抗體庫選擇人類抗體的手法參照以下。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)，亦可藉由篩選組合庫(combinatorial library)而單離具有所期望的一個或複數個活性的抗體。例如，噬菌體展示庫的製作方法、及篩選此庫得到具有所期望的結合特性的抗體等的方法，為該領域業者所習知。該等方法係總論於Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)，進一步例如記載於McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991): Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)。
一實施態樣中，特定的噬菌體展示法中，VH及VL的抗體庫(repertoire)，可經由聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction: PCR)分別選殖，再使其隨機於噬菌體庫中再結合，該噬菌體庫，如Winter et al., Ann. Immunol., 12: 433-455 (1994)所記載的方式進行，亦可篩選抗原結合噬菌體。噬菌體，例如呈示scFv或Fab抗體片段。來自經免疫化供給源的庫，可不需要構築融合瘤而提供針對免疫原的高親和性抗體。另外的實施態樣中，如Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)所記載的方式，不進行免疫化，選殖初始組庫(naive repertoire) (例如由人類)，亦可提供廣泛非本身或對本身抗原的單一來源的抗體。進一步的另外的實施態樣中，初始組庫如Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 277: 381-388 (1992)所記載的方式，由幹細胞選殖再編成前的V基因片段(segment)，藉由編碼超可變區域CDR3且使用包含於活體外達成再構成用的隨機序列的PCR引子，亦可合成性製作。記載人類抗體噬菌體庫的專利文獻，可列舉美國專利號5,750,373、美國專利號公開案US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936、US2009/0002360。
由人類抗體庫所單離的抗體或抗體片段，本說明書中係作為人類抗體或人類抗體片段。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)，為多重特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。多重特異性抗體為具有至少2個不同部位的結合特異性的抗體(例如，單株抗體)。一實施態樣中，結合特異性的一者係針對抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)者，另一者係針對此等以外的抗原。另外的實施態樣中，雙特異性抗體，亦可結合於抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)的不同2個抗原決定基。雙特異性抗體，亦可使用於使細胞傷害劑局部化於表現抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)的細胞。雙特異性抗體，可調製為全長抗體或抗體片段。
作為多重特異性抗體的製作手法，雖不限定，可列舉具有不同特異性的2個免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對的重組共表現(例如，Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO 93/08829、及Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991))、及knob-in-hole技術(例如，美國專利號5,731,168)。多重特異性抗體亦可經由下述方法而製作：為了製作Fc異二聚體而操作靜電轉向效果(electrostatic steering effects)(例如，WO2009/089004A1)；交聯2個以上的抗體或抗體片段(例如，美國專利號4,676,980及Brennan et al., Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鍊(leucine zipper)製作具有2個特異性的抗體(例如，Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992))；使用「雙功能抗體」技術製作雙特異性抗體片段(例如，Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993))；使用scFv二聚體(例如，Gruber et al., J. Immuol., 152: 5368 (1994))；調製三重特異性抗體(例如，Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991))。進一步地，亦可為包含「章魚抗體」之具有3個以上的功能性抗原結合部位方式所操作的抗體(例如，美國專利號公開案2006/0025576)。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)或其抗體片段，包含與抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)為不同的抗原的1個抗原結合部位，亦可為「雙活化(dual-acting)Fab」或「DAF」(例如，美國專利號公開案US2008/006982)。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)的胺基酸序列的改變體(變異體)，可於編碼抗體分子的核酸導入適當的修飾，或利用合成胜肽而調製。該等修飾，可對胺基酸序列中，任意的胺基酸(殘基)的任意的缺失、插入、置換之一個或複數個適宜組合而進行。以最終構築之物具有所期望的特徵(例如，抗原結合性)為限，可利用缺失、插入、置換的任意組合。 一實施態樣中，提供經進行一個或複數個胺基酸置換的抗體改變體(變異體)的情況，置換的變異導入的目的部位，可包含HVR及FR。 一實施態樣之保存的置換，示於表1之「較佳置換」，更實質的變更，示於表1之「例示的置換」，而提到進一步的胺基酸側鏈的性質係述於以下。胺基酸置換亦可使其導入於目的抗體，由此所得的產物，例如，亦可篩選保持/改善抗原結合性、減少免疫原性、或改善ADCC或CDC等所期望的活性。
[表1]
Figure 02_image001
胺基酸基於共通的側鏈特性可分類為以下： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性的親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈配向的殘基：Gly、Pro (6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe 非保存的置換，意指該等分類中的一個成員交換為其他分類。
一實施態樣中，胺基酸的插入，亦意指對胺基酸序列中的一個或複數個胺基酸殘基的插入，亦可於N末端及/或C末端，使其融合包含1、2、或3至100或其以上的殘基的多胜肽。作為末端插入的例，可列舉N末端具有甲硫胺醯基(methionyl)的抗體。作為其他的插入改變體(變異體)的例，可列舉於抗體的N端及/或C端，融合酵素(例如，ADEPT用酵素)或使抗體的血漿半衰期增加的多胜肽者。
本說明書中，對於參照多胜肽序列的「百分比(%)胺基酸序列同一性」，定義為以可獲得最大百分比的序列同一性的方式對準序列且若有必要則導入間隙後，且不考慮所有的保存置換亦為序列同一性的一部分時，參照多胜肽序列中的胺基酸殘基與同一候補序列中的胺基酸殘基的百分比。決定%胺基酸序列同一性之目的之對準(alignment)，可經由使用所屬技術領域中的各種方法，例如，BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體、或GENETYX(註冊商標)等，可公開取得的電腦軟體而達成。該領域業者，為了達成整體比較序列的全長之最大的對準，包含必要之任意的演算法，為了得到序列的對準能夠決定適當的參數。
ALIGN-2序列比較電腦程式為Geneetech公司的著作，其源碼(source code)與使用者文件同時對美國著作權局提出，登錄為美國著作權登錄編號TXU510087。ALIGN-2程式可由Genentech公司(Genentech, Inc., South San Francisco, California)公開地取得，亦可由源碼編譯(compile)。ALIGN-2程式，可編譯為用於包含Digital UNIX V4.0D之UNIX(註冊商標)操作系統上的使用。全部的序列比較參數，可根據ALIGN-2程式而設定，不變動。 於胺基酸序列比較使用ALIGN-2的情況，規定的胺基酸序列A，對規定的胺基酸序列B之、或與其之、或針對其之%胺基酸序列同一性(或，亦可稱為對規定的胺基酸序列B、或與其之、或針對其之具有或包含某%胺基酸序列同一性的胺基酸序列A)，係如下述方式計算：分率X/Y的100倍。此處，為經由序列對準程式ALIGN-2之該程式的A及B的對準中，評比為相同且一致的胺基酸殘基數，Y為B中的胺基酸殘基的全數。胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不同的情況，可理解A之對B的%胺基酸序列同一性與B之對A的%胺基酸同一性為不同。除非另行指明，本說明書所使用的所有的%胺基酸序列同一性值，可使用上述ALIGN-2電腦程式獲得。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)的CDR區域、重鏈可變區域、輕鏈可變區域、重鏈恆定區域、輕鏈恆定區域、重鏈全長區域、輕鏈全長區域、或其等之任意的特定區域的胺基酸序列中一個或複數個胺基酸經適宜地置換、缺失、插入，且對於抗原(例如，IL-8、CXCR1、或CXCR2)具有結合活性的胺基酸序列，亦可由包含編碼該等區域的胺基酸序列的鹼基序列的核酸，於嚴苛(stringent)條件下雜交的核酸獲得。單離嚴苛條件下雜交的核酸用的嚴苛的雜交條件，例示6M尿素、0.4%SDS、0.5 x SSC、37℃的條件，或與其同等或為基準的條件。更嚴苛的高條件，例如，使用6M尿素、0.4%SDS、0.1 x SSC、42℃的條件，可期待一致性更高的核酸的單離。作為雜交後的洗淨條件，例如，可列舉於0.5xSSC(此處，1xSSC為例如於0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0)、0.1%SDS、60℃洗淨，較佳於0.2xSSC、0.1%SDS、60℃洗淨，更佳於0.2xSSC、0.1%SDS、62℃洗淨，再佳於0.2xSSC、0.1%SDS、65℃洗淨，進一步較佳於0.1xSSC、0.1%SDS、65℃洗淨。洗淨時間及次數可適宜調節，例如可實施20分鐘3次。經單離的核酸序列的決定可藉由習知的方法進行。 另外的實施態樣中，替代該等雜交技術，可基於編碼CDR區域、重鏈可變區域、輕鏈可變區域、重鏈恆定區域、輕鏈恆定區域、重鏈全長區域、輕鏈全長區域、或其等之任意的特定區域的胺基酸序列的鹼基序列資訊，使用合成的引子的基因擴增法，例如利用PCR法，亦可單離包含編碼該區域的胺基酸序列的鹼基序列的核酸，與嚴苛條件下雜交的核酸。 依該方式所單離的核酸，對於成為對象的區域的鹼基序列，於鹼基序列全體，具有至少50%以上，較佳為70%以上、75%以上、80%以上、85%以上，進一步較佳為90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上)的序列同一性。具有由該方式之經單離核酸所編碼的胺基酸序列的抗體，以與具有成為對象之區域的胺基酸序列的抗體，為功能性(實質的)同等(例如，抗原結合性或血中滯留性之任意的1種以上的指標或特性為(實質的)同等)為有利而不限定於其等。此處，實質的意指與具有成為對象之區域的胺基酸序列的抗體所具有的功能(例如，可著眼於抗原結合性或血中滯留性等任意的1種以上的指標或特性)比較時，以該領域業者習知的方法測定時，意圖保持至少50%以上，較佳為70%以上、75%以上、80%以上、85%以上，進一步較佳90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上)的功能。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)亦可使其醣化(glycosylation)。對抗體的醣化部位的追加或缺失，作出醣化部位，或以去除的方式改變胺基酸序列可容易地達成。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)包含Fc區域的情況，可附加於該區域之醣鏈可為多種多樣。經由動物細胞所生成的初始抗體，典型地包含經分支為二分支的寡糖，該寡糖係經由Fc區域CH2功能域的Asn297的N連結(N-link)而附加(Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997))。寡糖除了二分支寡糖構造的「主幹」GlcNAc附加海藻糖之外，例如，包含甘露糖、N乙醯化葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖、或唾液酸。某實施態樣中，本揭露之抗體的寡糖修飾，亦可利用於具有某經改良特性之抗體改變體的製作。
本說明書之「效應功能(effector function)」意指，歸屬於抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)的Fc區域的生物學活性，可經由改變抗體的同型獲得。作為抗體的效應之例，包含Clq結合或補體依賴性細胞障礙(CDC)；Fc受體結合性；抗體依賴性細胞媒介性細胞障礙(ADCC)；吞噬作用(phagocytosis)；細胞表面受體(例如，B細胞受體)的向下調控：或B細胞活性化，但不限定為該等。
本說明書之「Fc區域」，使用於用以定義至少包含一部分的恆定區域的免疫球蛋白重鏈的C末端區域。該用語包天然Fc區域及改變體Fc區域(Fc區域改變體)二者。天然Fc區域，表示天然型抗體的Fc區域。作為天然型人類IgG的Fc區域之例，如上述，亦可為包含於人類IgG1恆定區域(序列編號: 100)、人類IgG2恆定區域(序列編號: 101)、人類IgG3恆定區域(序列編號: 102)、或人類IgG4恆定區域(序列編號: 103)的Fc區域。一實施態樣中，人類IgG重鏈Fc區域，係由Cys226的位置或Pro230的位置的胺基酸殘基延長至其重鏈的C末端為止。然而，Fc區域的C末端離胺酸(Lys447)、或C末端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(Lys447)亦可不存在。除非另有說明，本說明書之Fc區域或恆定區域的胺基酸殘基的附帶編號，係以如以下出處所述的方式，Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)，亦稱為EU指數，依循EU編號系統。
本說明書之「FcRn」，與屬於免疫球蛋白超家族的FcγR不同，FcRn，特別是人類FcRn係構造性類似於主要組織不相容性複合體(MHC)第I型的多肽，與第I型的MHC分子具有22至29%的序列同一性(Ghetie et al., Immunol. Today (1997) 18(12), 592-598)。FcRn以與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)複合體化之膜貫通α或重鏈所成之雜二聚體的方式表現。如同MHC一般，FcRn的α鏈係由3個細胞外功能域(α1、α2、α3)所形成，短的細胞質功能域係將蛋白質繫留於細胞表面。α1及α2功能域與抗體Fc區域中的FcRn結合功能域相互作用(Ragha van et al (Immunity (1994) 1, 303-315)。FcRn表現於哺乳動物的母性胎盤或卵黃囊，與自母親向胎兒的IgG的移動相關。此外，表現FcRn的齧齒類新生兒的小腸中，FcRn與來自所攝取的初乳或乳之母性IgG的刷狀緣上皮的橫切移動相關。FcRn表現遍布於多數種的多數的其他組織，以及於各種的內皮細胞系。其亦表現於人類成人血管內皮、肌肉血管系、及肝臟竇狀毛細管。咸信FcRn結合於IgG，於血清中循環，藉此扮演維持IgG的血漿中濃度的功能。FcRn對IgG分子的結合，通常為嚴格的pH依賴性，確認最適結合為未達7.0的酸性pH。作為一例，人類FcRn的多核苷酸序列及胺基酸序列亦可源自於分別記載於NM_004107.4及NP_004098.1(包含訊息序列)的前驅物(括號內表示RefSeq登錄編號)。該前驅物於活體內係與人類β2微球蛋白形成複合體。因此，使用習知的重組表現手法製造可與人類β2微球蛋白形成複合體的可溶型人類FcRn，亦可適宜地使用於各種實驗系統。使用該等與β2微球蛋白可形成複合體的可溶型人類FcRn，可評價抗體或Fc區域改變體對於FcRn的結合活性。FcRn只要為可獲得結合於FcRn結合功能域的形態者並無特別限定，較佳為人類FcRn。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)或其Fc區域改變體對於FcRn具有結合活性的情況，該等具有「FcRn結合功能域」，較佳為具有人類FcRn結合功能域。FcRn結合功能域，只要抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)於酸性pH及/或中性pH中對於FcRn具有結合活性或親和性即可，並無特別限定，或者亦可為直接或間接的對於FcRn具有結合活性的功能域。作為該等功能域，例如，可列舉對直接的對於FcRn具有結合活性的IgG型免疫球蛋白的Fc區域、白蛋白、白蛋白功能域3、抗FcRn抗體、抗FcRn肽、抗FcRn支架分子等，或間接的對於FcRn具有結合活性之結合於IgG或白蛋白的分子等，但不限定為該等。再者，例如，亦可使用於酸性pH及/或中性pH中具有FcRn結合活性的功能域。該功能域只要為預先於酸性pH及/或中性pH中具有FcRn結合活性的功能域亦可以其原樣使用。該功能域於酸性pH及/或中性pH中不具有FcRn結合活性或結合活性弱的情況，改變抗體或Fc區域改變體中的FcRn結合功能域中的胺基酸殘基，亦可獲得於酸性pH及/或中性pH中的FcRn結合活性。再者，改變預先於酸性pH及/或中性pH中具有FcRn結合活性的功能域中的胺基酸，亦可進一步提高FcRn結合活性。FcRn結合功能域的胺基酸改變，可經由比較胺基酸改變前與改變後的於酸性pH及/或中性pH中的FcRn結合活性，而發現目標的改變。 FcRn結合功能域，較佳為直接與FcRn結合的區域。作為FcRn結合區域的較佳例，可列舉抗體的恆定區域或Fc區域。然而，可結合於具有與白蛋白或IgG等的FcRn之結合活性的多肽的區域，可經由白蛋白或IgG等而間接地與FcRn結合。因此，FcRn結合區域亦可為結合於具有與白蛋白或IgG結合活性的多肽的區域。雖不限定，為了促進自血漿中的抗原消失，FcRn結合功能域，於中性pH中的FcRn結合活性越高越佳，再者，為了提升抗體的血漿中滯留性，FcRn結合功能域於酸性pH中的FcRn結合活性越高越佳。例如，亦可選擇使用預先於中性pH或酸性pH中的FcRn結合活性高的FcRn結合功能域，或者，亦可改變抗體或Fc區域中的胺基酸而賦予於中性pH或酸性pH中的FcRn結合活性，或者，亦可使已經存在的於中性pH或酸性pH的FcRn結合活性增大。
抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR23抗體)或Fc區域(改變體)之對於FcRn的結合活性，與改變前的抗體或Fc區域比較，為增大、(實質的)維持、或減少，只要為該領域業者習知的方法並無特別限定，亦可使用本實施例所記載的方法，例如可使用BICACORE、斯卡查德圖(Scatchard plot)、流式細胞儀等(WO2013/046722)。該等分析中亦可使用人類FcRn的細胞外功能域作為可溶性抗原。測定抗體或Fc區域(改變體)之對於FcRn的結合活性時的pH以外的條件，該領域業者可適宜選擇，並無特別限定。例如，如WO2009/125825所記載的方式，可於MES緩衝液、37℃的條件中測定。抗體或Fc區域(改變體)與FcRn的結合活性的測定，例如，將FcRn作為分析物流經將抗體固定化的晶片的等而評價。 再者，抗體或Fc區域(改變體)之對於FcRn的結合活性，亦可作為KD(Dissociation constant: 解離常數)、表觀的KD (Apparent dissociation constant: 表觀的解離常數)、解離速度之kd(Dissociation rate: 解離速度)、或表觀的kd(Apparent dissociation constant: 表觀的解離常數)等予以評價。
測定包含於抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)或Fc區域(改變體)的FcRn結合功能域，與FcRn的結合活性的pH條件，可適宜使用酸性pH或中性pH的條件。作為測定條件所使用的溫度，FcRn結合功能域與FcRn的結合活性(結合親和性)，可於10℃至50℃的任意溫度予以評價。較佳地，為了決定人類FcRn結合功能域與FcRn的結合活性(結合親和性)，係使用15℃至40℃的溫度。更佳的為如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃之任一者方式之20℃至35℃的任意溫度同樣地，使用用於決定FcRn結合功能域與FcRn結合活性(結合親和性)，但不限定為該等。25℃的溫度為非限定性的一例。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)的胺基酸序列所包含之胺基酸，亦有接受轉譯後修飾(例如，N末端的麩胺醯胺經由焦麩胺醯胺化修飾為焦麩胺酸為該領域業者所習知的修飾)的情況，即使於該等方式之胺基酸經轉譯後修飾的情況，當然包含作為與本揭露所記載的胺基酸序列為同等者。
一實施態樣中，本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)，追加性地包含非蛋白質性部分、且亦可進一步地使其衍生物化(derivatization)。作為抗體衍生物化的較佳部分(moiety)，例如可列舉水溶性聚合物。作為水溶性聚合物之例，包含聚乙二醇(PEG)、乙二醇及丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚1,3-二氧雜環戊烷(Dioxolane)、聚1,3,6-三氧雜環己烷(trioxane)、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規聚合物之任一者)、聚葡萄糖或聚(正乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烯(polypropylene oxide)/環氧乙烷共聚物、聚環氧乙烷化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及該等之任意混合物。作為該部分(moiety)之一例，聚乙二醇丙醛，由於其對於水的安定性而於製造中為有利的。聚合物可為任何分子量，可為分支亦可不為分支。抗體所附加的聚合物的數目可為廣範圍的，附加1個以上的聚合物可為相同分子，亦可為不同分子。一般而言，衍生物化所使用的聚合物的數目及/或類型，例如，考慮抗體衍生物於規定的條件下的療法使用時，是否必須改善抗體的特定特性或功能等而決定。
一實施態樣中，係提供本揭露之抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、或抗CXCR2抗體)，與可經由暴露於放射線而選擇性加熱的非蛋白質部分的接合體(conjugate)。非蛋白質部分，例如可為奈米碳管(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。以達到所期望的目的為限，放射線可為任何波長，例如，可為以對通常的細胞不賦予傷害但使接近抗體-非蛋白質部分的細胞死亡的溫度加熱非蛋白質部分的方式的波長。
本揭露之「IL-8」，無特別限制，意指源自所有的脊椎動物、靈長類(例如，人類、食蟹獼猴、或恆河猴)、或其他的哺乳類(例如，兔或狗。惟，小鼠或大鼠中不存在內生性IL-8)的天然IL-8。IL-8亦包含全長的IL-8、活體內所修飾的任何形態的IL-8、天然存在的IL-8的衍生物，例如，剪切變異體或對偶基因變異體的方式者。人類IL-8的胺基酸序列的典型例表示於序列編號: 22。再者，關於非限定性的人類IL-8的胺基酸序列之一例，作為人類介白素-8前驅物於NCBI登錄為NP_000575.1。再者，作為非限定性的食蟹獼猴IL-8的胺基酸序列之一例，於NCBI登錄為XP_005555144.1。
CXCR1為介白素-8受體，又稱為α、IL8RA或CD181，又CXCR2為為介白素-8受體，又稱為β或IL8RB，為趨化介素(chemokine)受體。已知IL-8與受體CXCR1、CXCR2結合，產生生理學作用(Science. 1991; 253: 1278-80, Science. 1991; 253: 1280-3)。已有報告CXCR1僅藉由IL-8及顆粒性趨化蛋白質-2(granulocyte chemostatic protein-2)活化，CXCR2與IL-8以外之GROα、β、γ或嗜中性球活化肽(neutrophil- activating peptide)、顆粒性趨化蛋白質-2等複數的分子結合而活化(Neuro-oncol. 2005; 7: 122-33)，截至今日IL-8的受體沒有報告CXCR1、CXCR2以外者。如本實施例所記載的方式，本發明者們，確認於嗜中性球中對於IL-8的轉移能力係於IL-8中和抗體及CXCR2阻礙劑，亦為同等受到阻礙，容易地預測對於本實施例所記載之子宮內膜異位症、沾黏、子宮腺肌症，不僅抗IL-8抗體，包含CXCR1阻礙劑、CXCR2阻礙劑之IL-8訊息阻礙劑為有用的。
本揭露之「CXCR1」，無特別限制，意指源自所有的脊椎動物、靈長類(例如，人類、食蟹獼猴、或恆河猴)、或其他的哺乳類(例如，兔或狗)的天然CXCR1。CXCR1亦包含全長的CXCR1、活體內所修飾的任何形態的CXCR1、天然存在的CXCR1的衍生物，例如，剪切變異體或對偶基因變異體的方式者。非限定性人類CXCR1的胺基酸序列之一例，於NCBI登錄為NP_000625.1。 本揭露之「CXCR2」，無特別限制，意指源自所有的脊椎動物、靈長類(例如，人類、食蟹獼猴、或恆河猴)、或其他的哺乳類(例如，兔或狗)的天然CXCR2。CXCR2亦包含全長的CXCR2、活體內所修飾的任何形態的CXCR2、天然存在的CXCR2的衍生物，例如，剪切變異體或對偶基因變異體的方式者。非限定性人類CXCR2的胺基酸序列之一例，於NCBI登錄為NP_001161770.1或NP_001548.1。
單核球、巨噬細胞、嗜中性球、淋巴球等免疫細胞，皮膚纖維母細胞，角質細胞，血管內皮細胞，黑色素細胞，肝細胞，及多種的腫瘤細胞株，產生IL-8。IL-8為強力的嗜中性球趨化介素，參與嗜中性球對炎症部位的轉移。已有報告指出IL-8與存在於嗜中性球表面上的高親和性受體(CXCR1及CXCR2)結合，經由促進去顆粒作用(degranulation)，使細胞質內的游離Ca 2+濃度上升，活化嗜中性球的同時，誘導嗜中性球的轉移，破壞受到浸潤的組織(WO2004/058797)。 如本實施例所記載的方式，本發明者們發現，CXCR1及CXCR2表現於嗜中性球、單核球、巨噬細胞之免疫細胞，子宮內膜異位症上皮細胞，及血管內皮細胞，但不表現於基質細胞及肌纖維母細胞。進一步地，即使由子宮內膜異位症人類患者所採取培養的源自子宮內膜異位症的基質細胞及肌纖維母細胞中添加IL-8或抗IL-8抗體，也未觀察到任何細胞增殖或萎縮等變化(未顯示數據)。 該等結果，與Ulukus et al., Human Reproduction 2005 20(3): 794-801中，CXCR1大量表現於子宮內膜組織的上皮、基質、經纖維化部分的報告不一致。Ulukus的論文中，全體的染色強度高。CXCR2亦為弱陽性的使血管內皮細胞及基質細胞染色。此外，與Iwabe et al., Fertility and Sterility 1998 69(5): 924-930中，活體內實驗中，源自子宮內膜異位症患者的基質細胞的增殖係經由IL-8促進，經由抗IL-8抗體的添加而受到抑制的報告不一致。Iwabe的論文中，由源自子宮內膜異位症人類患者的內膜症病變去除上皮細胞，成為基質細胞後，研究添加IL-8的細胞增殖，為20%左右的弱反應。 另外，如本實施例所記載的方式，本發明者們證實，於非人類靈長類子宮內膜異位症模型中，經由投予抗體H1009/L395-F1974m之IL-8訊息阻礙劑的投予，觀察到顯示增殖性的上皮細胞及基質細胞的萎縮性變化。 雖不意圖受到理論的拘束，一面向中，由於Iwabe的論文中，細胞繼代後立刻實施實驗，推定有混有免疫細胞的可能性。由於CXCR1、CXCR2不表現於基質細胞，咸信經由CXCR1、CXCR2的IL-8訊息，不直接作用於作為標的基質細胞，而作用於作為直接標的的子宮內膜細胞或免疫細胞，對於基質細胞為該等子宮內膜上皮及免疫細胞之經由訊息而間接作用者。
本揭露之「IL-8訊息阻礙劑」，只要可直接或間接、部分或完全地阻礙IL-8訊息者即可，無特別限定，例如，可為核酸(例如，siRNA等雙股核酸)、蛋白質(包含抗體或抗體片段)、胜肽、或其以外的化合物(例如，低分子化合物)。某面向中，IL-8訊息阻礙劑可為IL-8阻礙劑、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑，該情況時，該等亦可為核酸(例如，siRNA等雙股核酸)、蛋白質(包含抗體或抗體片段，更具體地可為抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體、抗CXCR2抗體、或部分或完全地保持其等之功能的抗體片段。)、胜肽、或其以外的化合物(例如，低分子化合物)。 IL-8訊息阻礙劑對於IL-8之受體之CXCR1及/或CXCR2的結合為部分或完全地阻礙的情況，經由IL-8的阻礙，較佳為無阻礙的IL-8與其受體結合時所產生的正常程度或種類的活性為降低或變化。該降低或變化，例如，亦可觀察到IL-8誘導性彈性蛋白酶釋放或鈣流通的阻礙、IL-8誘導性CD11b(Mac-1)表現增加的阻礙、或L-選滯蛋白(L-selectin)表現減少的阻礙等。該等阻礙，與IL-8訊息阻礙劑不存在下比較時，至少包含，例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%之上述程度或種類的活性降低或變化。
一實施態樣中，本揭露之CXCR1阻礙劑，可為結合於CXCR1(有特異性)但不結合於CXCR2者，亦可為結合於CXCR1及CXCR2二者(有特異性)者(亦稱為CXCR1/CXCR2阻礙劑)。 一實施態樣中，本揭露之CXCR2阻礙劑，可為結合於CXCR2(有特異性)但不結合於CXCR1者，亦可為結合於CXCR1及CXCR2二者(有特異性)者(亦稱為CXCR1/CXCR2阻礙劑)。 一實施態樣中，作為本揭露之CXCR1阻礙劑及/或CXCR2阻礙劑的具體例，可列舉WO2010/056753所揭示的抗CXCR1抗體、或、瑞帕辛(Repartaxin)或瑞帕辛衍生物；WO2011/042466所揭示的CXCR1及/或CXCR2阻礙藥；WO2005/113534及WO2003/057676所揭示的CXCR1或CXCR2趨化介素拮抗劑；WO2012/062713及WO2013/168108所揭示的CXCR2結合多肽；WO2008/061740、WO2008/061741、WO2008/062026、WO2009/106539、WO2010/015613及WO2013/030803所揭示的CXCR2阻礙劑。
一實施態樣中，作為本揭露之IL-8阻礙劑的具體例，可為日本專利JP2006-117633A所記載的IL-8模擬劑；日本專利JP2013-180992A(或JP5496232B)所揭示的IL-8表現抑制劑；日本專利JPH9-2954A(或JP3008010B)所揭示的IL-8產生抑制劑；WO1998/037200所揭示的抗體片段聚合物複合體；WO1995/023865、WO2009/026117、WO2013/166099、WO2006/113643、WO2004/058797、WO2008/130969、WO2011/100271、WO98/58671、WO2014/149733、美國專利號公開案2003/0077283A1等所揭示的抗IL-8抗體，結合於包含IL-8之抗原的多重特異性抗體、或其等之改變體的任一者。又另外的實施態樣中，作為該等抗IL-8抗體的改變體，作為高功能抗IL-8抗體，亦可進一步賦予所記載的後述特徵之一者或複數者。
一實施態樣中，本揭露之「抗IL-8抗體」或「結合於IL-8的抗體」，意指以充分的親和性與IL-8結合的抗體，其結果，經由該抗體以IL-8為標的，有用於作為檢出用、診斷用、治療用、及/或預防用組成物方式之抗體。 一實施態樣中，對於非特異性之無關係的非IL-8蛋白質的抗IL-8抗體的結合程度，相對於IL-8的抗體結合程度亦可為例如為未達10%。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，具有IL-8中和活性。IL-8中和活性意指阻礙IL-8顯示生物學活性的活性，亦可意指阻礙IL-8與其受體(CXCR1或CXCR2)結合的活性。 一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，可為嵌合抗體、人源化抗體、或人類抗體。 一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，較佳為與具有IL-8內生性動物(例如，兔)有交叉性，進一步地，根據情況，更佳為抗靈長類IL-8抗體(較佳為與人類同樣具有月經，例如，針對食蟹獼猴或狒狒等抗非人類靈長類IL-8抗體或抗人類IL-8抗體(例如，抗人類IL-8中和抗體))。
本研究者們，雖不限定，但如本實施例具體顯現的方式，發現可於抗體(例如，抗IL-8抗體、抗CXCR1抗體或抗CXCR2抗體)附加高功能的氨基酸改變技術，以及基於上述所想到之高功能抗IL-8抗體，其非限定性之一例示於以下：
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體可為針對IL-8具有pH依賴性的親和性，亦可為抗IL-8抗體，例如，該抗IL-8抗體包含以下(a)至(f)的胺基酸序列中至少一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、或八個以上的胺基酸置換的序列： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 24的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 25的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 27的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f) 包含序列編號: 28的胺基酸序列的HVR-L3。 胺基酸，以不特別的指定為限，亦可置換為其他的任何胺基酸。進一步的實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體進一步亦可包含分別至少，於由以下的位置所組成之群組所選擇的位置成為其他胺基酸的置換，或於該位置成為下述指定的胺基酸的置換： (1) 序列編號: 26的序列之8位的絲胺酸、序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺及5位的白胺酸、以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺； (2) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬醯胺的置換，及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，以及序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (3) 序列編號: 24的序列之8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換及9位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (4) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬醯胺的置換、8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換、9位的酪胺酸成為組胺酸的置換、及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，以及序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (5) 序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換； (6) 序列編號: 26的序列之8位的絲胺酸成為麩胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換； (7) 序列編號: 24的序列之9位的酪胺酸成為組胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換；以及 (8) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬胺酸的置換及8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換及9位的酪胺酸成為組胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換。
進一步或另外的實施態樣中，本揭露之針對IL-8亦可具有pH依賴性親和性的抗IL-8抗體，包含由以下所組成之群組所選擇之一個或任意複數個的胺基酸序列： (a) 包含序列編號: 23的胺基酸序列的HVR-H1，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-H1； (b) 包含序列編號: 24或29的胺基酸序列的HVR-H2，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-H2； (c) 包含序列編號: 25或30的胺基酸序列的HVR-H3，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-H3； (d) 包含序列編號: 26的胺基酸序列的HVR-L1，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-L1； (e) 包含序列編號: 27、31或107的胺基酸序列的HVR-L2，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-L2；以及 (f) 包含序列編號: 28或32的胺基酸序列的HVR-L3，或具有至少65%、70%或75%以上，較佳80%、85%或90%以上，更佳95%以上的序列同一性的HVR-L3。 此處，與參照胺基酸序列具有特定%的序列同一性的HVR，亦可為與具有參照胺基酸序列的HVR為功能性同等。再者，例如，該抗IL-8抗體，亦可包含：包含序列編號: 29的胺基酸序列的HVR-H2及包含序列編號: 30的胺基酸序列的HVR-H3，及/或亦可包含：包含序列編號: 31的胺基酸序列的HVR-L2及包含序列編號: 32的胺基酸序列的HVR-L3。進一步地，該抗IL-8抗體，進一步亦可包含分別至少，由以下位置所組成之群組選擇的位置成為其他胺基酸的置換，或於該位置成為下述指定的胺基酸的置換： (1) 序列編號: 26的序列之8位的絲胺酸、序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺及5位的白胺酸、以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺； (2) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，以及序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (3) 序列編號: 24的序列之8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換及9位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (4) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬胺酸的置換、8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換、9位的酪胺酸成為組胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，以及序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換； (5) 序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換； (6) 序列編號: 26的序列之8位的絲胺酸成為麩胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換； (7) 序列編號: 24的序列之9位的酪胺酸成為組胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換；以及 (8) 序列編號: 24的序列之6位的丙胺酸成為天冬胺酸的置換、8位的甘胺酸成為酪胺酸的置換、9位的酪胺酸成為組胺酸的置換及11位的精胺酸成為脯胺酸的置換，序列編號: 25的序列之3位的酪胺酸成為組胺酸的置換，序列編號: 27的序列之1位的天冬醯胺成為離胺酸的置換及5位的白胺酸成為組胺酸的置換，以及序列編號: 28的序列之1位的麩胺醯胺成為離胺酸的置換。 此處所記載、推定之所有胺基酸序列的組合，理所當然的為該領域業者所理解。
一實施態樣中，本揭露之「功能性同等」，以無特別指定為限，與具有包含參照胺基酸序列的抗體，比較物理化學的特性及/或生物學的活性等所表示的功能(例如，亦可著眼於抗原結合性或血中滯留性等任意1種以上的指標或特性)，以該領域業者習知的方法測定的情況，意圖保持至少50%以上，較佳為70%以上、75%以上、80%以上、85%以上，進一步較佳為90%以上(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上)的功能。
進一步另外的實施態樣中，本揭露之對於IL-8亦可具有pH依賴性的親和性的抗IL-8抗體，包含由以下所組成之群組選擇之一個或任意複數個的胺基酸序列： (A) 包含序列編號: 33、34、或108的胺基酸序列的重鏈可變區域，或具有與該等序列至少65%、70%、或75%以上，較佳為80%、85%、或90%以上，更佳為95%以上的序列同一性的重鏈可變區域；以及 (B) 包含序列編號: 35或109的胺基酸序列的輕鏈可變區域，或具有與該等序列至少65%、70%、或75%以上，較佳為80%、85%、或90%以上，更佳為95%以上的序列同一性的輕鏈可變區域。 此處，與參照胺基酸序列具有特定%的序列同一性的可變區域，亦可與具有參照胺基酸序列的可變區域為功能性同等。再者，例如，該抗IL-8抗體亦可含有：包含序列編號: 34的胺基酸序列的重鏈可變區域以及包含序列編號: 35的胺基酸序列的輕鏈可變區域，由於抗體於活體內(例如，血漿中)安定地保有IL-8中和活性而可為有利的，或由於免疫原性低而可為有利的。進一步地，該抗IL-8抗體包含序列編號: 33的胺基酸序列的改變體的情況，該抗體亦可至少進一步含有由以下位置所組成之群組選擇一種以上的位置成為其他的胺基酸的置換，或於該位置成為下述指定的胺基酸的置換： (i) 序列編號: 33的胺基酸序列之55位的丙胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為天冬胺酸的置換； (ii) 序列編號: 33的胺基酸序列之57位的甘胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為酪胺酸的置換； (iii) 序列編號: 33的胺基酸序列之58位的酪胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為組胺酸的置換； (iv) 序列編號: 33的胺基酸序列之60位的精胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為脯胺酸的置換； (v) 序列編號: 33的胺基酸序列之84位的麩胺醯胺成為其他的胺基酸的置換，例如，成為蘇胺酸的置換； (vi) 序列編號: 33的胺基酸序列之87位的絲胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為天冬胺酸的置換；以及 (vii) 序列編號: 33的胺基酸序列之103位的酪胺酸成為其他的胺基酸的置換，例如，成為組胺酸的置換。 此處所記載、推定之所有胺基酸序列的組合，理所當然的為該領域業者所理解。
另外的實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，為包含以下(1)至(7)所分別記載的(a)至(f)的胺基酸序列的至少一個以上至六個的抗體，或亦可為於分別記載於(a)至(f)之任一者的至少一個以上的胺基酸序列中包含至少一個胺基酸的置換的抗體。該抗體亦可為於IL-8具有pH依賴性的親和性的抗IL-8抗體。胺基酸，以無特別的指定為限，亦可置換成為其他的任何胺基酸。 (1) (a) 包含序列編號: 58的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 59的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 60的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 61的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 62的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 63的胺基酸序列的HVR-L3。 (2) (a) 包含序列編號: 64的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 65的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 66的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 67的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 68的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 69的胺基酸序列的HVR-L3。 (3) (a) 包含序列編號: 70的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 71的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 72的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 73的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 74的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 75的胺基酸序列的HVR-L3。 (4) (a) 包含序列編號: 76的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 77的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 78的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 79的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 80的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 81的胺基酸序列的HVR-L3。 (5) (a) 包含序列編號: 82的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 83的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 84的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 85的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 86的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 87的胺基酸序列的HVR-L3。 (6) (a) 包含序列編號: 88的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 89的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 90的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 91的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 92的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 93的胺基酸序列的HVR-L3。 (7) (a) 包含序列編號: 94的胺基酸序列的HVR-H1， (b) 包含序列編號: 95的胺基酸序列的HVR-H2， (c) 包含序列編號: 96的胺基酸序列的HVR-H3， (d) 包含序列編號: 97的胺基酸序列的HVR-L1， (e) 包含序列編號: 98的胺基酸序列的HVR-L2，以及 (f) 包含序列編號: 99的胺基酸序列的HVR-L3。
本說明書之「酸性pH」，意指例如由pH4.0至pH6.5之間所選擇的pH。一實施態樣中，意指pH4.0、pH4.1、pH4.2、pH4.3、pH4.4、pH4.5、pH4.6、pH4.7、pH4.8、pH4.9、pH5.0、pH5.1、pH5.2、pH5.3、pH5.4、pH5.5、pH5.6、pH5.7、pH5.8、pH5.9、pH6.0、pH6.1、pH6.2、pH6.3、pH6.4、或pH6.5，但不限定為該等。
本說明書之「中性pH」，意指例如由pH6.7至pH10.0之間所選擇的pH。一實施態樣中，意指pH6.7、pH6.8、pH6.9、pH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、pH7.5、pH7.6、pH7.7、pH7.8、pH7.9、pH8.0、pH8.1、pH8.2、pH8.3、pH8.4、pH8.5、pH8.6、pH8.7、pH8.8、pH8.9、pH9.0、pH9.5、或pH10.0，但不限定為該等。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，為pH依賴性地結合於IL-8的抗IL-8抗體。本揭露之一面向中，為pH依賴性結合於IL-8的抗IL-8抗體，意指與在中性pH之對IL-8的結合親和性相比，在酸性pH之對IL-8結合親和性係減少的抗體。例如，pH依賴性的抗IL-8抗體包含，在中性pH相較於酸性pH之對於IL-8為具有高親和性的抗體。一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，相對於於IL-8之酸性pH的親和性，在中性pH的親和性高至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、200倍、400倍、1000倍、10000倍、或其以上。為了測定結合親和性，雖不限定，可使用表面電漿共振(BIACORE等)。結合速度常數(kon)及解離速度常數(koff)，可經由使用同時符合(fit)結合及解離的感應圖譜的單純一對一蘭格交爾結合模型(simple one-to-one Langmuir binding model) Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)算出。平衡解離常數(KD)係以koff/kon算出。為了篩選藉由pH之結合親和性不同的抗體，雖不特別限定，除了表面電漿共振法(BIACORE等)之外，亦可使用ELISA法及結合平衡除外法(Kinetic Exclusion Assay；KinExA™)等。pH依賴性的IL-8結合能力，意指pH依賴性的結合於IL-8的性質。再者，抗體是否可複數次的結合於IL-8，可藉由WO2009/125825所記載的方法，予以判斷。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，在中性pH(例如，pH7.4)之對於IL-8的解離常數(KD)越小越佳。例如，該抗體在中性pH(例如，pH7.4)之對於IL-8的解離常數可為0.3nM以下，0.1nM以下或0.03nM以下。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，在酸性pH(例如，pH5.8)之對於IL-8的解離常數(KD)越大越佳。例如，該抗體在酸性pH(例如，pH5.8)之對於IL-8的解離常數可為3nM以上，10nM以上，或30nM以上。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，相對於在中性pH(例如，pH7.4)之解離常數、在酸性pH(例如，pH5.8)之解離常數的比[KD(酸性pH)/KD(中性pH)](例如[KD(pH5.8)/ KD(pH7.4)])，例如，為30以上，50以上，或例如100以上，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、或9500以上。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，在酸性pH(例如，pH5.8)之解離速度常數(koff)越大越佳。例如，該抗體之酸性pH(例如，pH5.8)之解離速度常數，例如可為0.003(1/s)以上，0.005(1/s)以上，或0.01(1/s)以上。
WO2013/046704已報告經合併導入在酸性pH中使對於FcRn的結合增大的變異，以及規定的變異(作為代表例，以EU編號表示，Q438R/S440E之2殘基改變)的Fc區域改變體，顯示類風濕性因子結合的顯著降低。然而，WO2013/046704中，經由Q438R/S440E的改變而使類風濕性因子結合降低的Fc區域改變體，與具有天然型Fc區域的抗體比較，則未顯示血漿中滯留性為優異。因此，期望不顯示對既存的ADA的結合，可進一步提升血漿中滯留性，為安全而有利的Fc區域改變體。作為不顯示對於抗醫藥品抗體(既存的ADA等)的結合，可進一步提升血漿中滯留性，為安全而有利的Fc區域改變體，本研究者們想到，包含以EU編號表示之434為的胺基酸置換為Ala(A)，及作為胺基酸殘基的變異組合之規定的2殘基變異(作為代表性者，Q438R/S440E)的Fc區域改變體為較佳。
因此，進一步之另外的實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，包含FcRn結合功能域的Fc區域改變體，前述FcRn結合功能域，例如，與天然型Fc區域比較，以EU編號表示，亦可為包含434位成為Ala；438位成為Glu、Arg、Ser或Lys；以及440位成為Glu、Asp或Gln的Fc區域改變體。該抗IL-8抗體，可得酸性pH及中性pH，特別是在酸性pH中FcRn結合活性經增大的FcRn結合功能域。或者，該抗體，其FcRn結合功能域較佳係包含Fc區域改變體，其包含以EU編號表示之434位成為Ala；438位成為Glu、Arg、Ser或Lys；以及440位成為Glu、Asp或Gln，更佳為434位成為Ala；438位成為Arg或Lys；以及440位成為Glu或Asp。或者，進一步地，以EU編號表示，較佳包含428位成為Ile或Leu；及/或436位成為Ile、Leu、Val、Thr或Phe，更佳為包含428位成為Leu；及/或436位成為Val或Thr。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，較佳為天然型Ig抗體的Fc區域改變體，更佳為天然型的IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4型)抗體的Fc區域改變體，再更佳為源自天然型人類的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。例如，其等亦可源自人類IgG1。
天然型的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型的抗體的Fc區域中，上述的改變部位，以EU編號表示之428位、434位、436位、438位、440位中，除436位以外，全部共通於天然型人類的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型的抗體的Fc區域。另一方面，於436位，天然型人類的IgG1、IgG2、IgG4型的抗體的Fc區域之任一者皆為Tyr(Y)，天然型人類的IgG3型的抗體的Fc區域中為Phe(F)。然而，Stapleton et al., Competition for FcRn-mediated transport gives rise to short half-life of human IgG3 and offers therapeutic potential, Nature Communications, 2011, Dec, number 599係報告，具有以EU編號表示之R435H的胺基酸置換的人類IgG3異型，於人類中顯示可與IgG1相當的血漿中半衰期。因此，除了436位的胺基酸置換以外，以導入R435H的胺基酸置換，亦可能使酸性條件下對於FcRn的結合增大，提升血漿中滯留性。 再者，WO2013/046704中，與可能使酸性pH下對於FcRn的結合增大的胺基酸置換組合的情況，作為可使類風濕性因子顯著的降低的2殘基胺基酸的置換，具體而言，有報告以EU編號表示之Q438R/S440E、Q438R/S440D、Q438K/S440E、Q438K/S440D。
因此，一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體的胺基酸序列，與天然型Fc區域比較，FcRn結合功能域亦可包含由下述所成群組選擇之經置換胺基酸的組合，以EU編號表示之 N434A/Q438R/S440E；N434A/Q438R/S440D； N434A/Q438K/S440E；N434A/Q438K/S440D； N434A/Y436T/Q438R/S440E；N434A/Y436T/Q438R/S440D； N434A/Y436T/Q438K/S440E；N434A/Y436T/Q438K/S440D； N434A/Y436V/Q438R/S440E；N434A/Y436V/Q438R/S440D； N434A/Y436V/Q438K/S440E；N434A/Y436V/Q438K/S440D； N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E；N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D； N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E；N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D； N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E；N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D； N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E；N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D； M428L/N434A/Q438R/S440E；M428L/N434A/Q438R/S440D； M428L/N434A/Q438K/S440E；M428L/N434A/Q438K/S440D； M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D； M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E；M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D； M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E；M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D； M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E；及M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D； L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E；以及 L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E。 某另外的實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，與天然型Fc區域比較，亦可含有由以EU編號表示之235位、236位、239位、327位、330位、331位、428位、434位、436位、438位、及440位所成群組選擇一個以上(例如，六個、七個或全部)的位置成為其他的胺基酸的置換，例如，亦可含有L235R、G236R、S239K、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及S440E所成群組選擇之一個以上(例如，六個、七個或全部)的胺基酸置換。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，與天然型IgG的Fc區域比較，較佳為使酸性條件下對於FcRn的結合活性增大。 某pH下之對於FcRn的FcRn結合功能域的結合親和性增大，亦可相當於與關於天然型FcRn結合功能域所測定的FcRn結合親和性比較，所測定的FcRn結合親和性的增大。該情況中，為結合親和性的差異之KD(天然型Fc區域)/KD(本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體)，亦可為至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、70倍、80倍、100倍、500倍、或1000倍。對於FcRn之FcRn結合功能域的結合親和性的增大，雖可為在酸性pH及/或中性pH者，特別較佳為在酸性pH條件下對於FcRn之結合活性增大。 再者，酸性pH下對FcRn之結合親和性增大之本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，比天然型IgG的Fc區域對於FcRn的結合親和性，例如在pH6.0及25℃，例如，亦可為強1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍以上。
本說明書之「抗醫藥品抗體」或「ADA」意指，對於位於治療用抗體上的抗原決定基具有結合親和性(結合活性)，藉此可與該治療用抗體結合的內因性抗體。本說明書之「既存的抗醫藥品抗體」或「既存的ADA」意指，自治療用抗體投予至患者以前，在患者的血中可存在、檢出的抗醫藥品抗體。一實施態樣中，既存的ADA是類風濕性因子、對於人類IgG抗體的Fc區域的多株或單株本身抗體。類風濕性因子的抗原決定基位於CH2/CH3界面區域及CH3功能域中，根據純株(clone)而有不同。對於既存的ADA的結合親和性低的FcRn區域改變體，與包含天然型IgG的Fc區域的抗體的ADA結合親和性進行比較，例如，可降低10分之1以下，50分之1以下，或100分之1以下。
一實施態樣中，對於既存的ADA的抗體的Fc區域(改變體)的結合親和性，在酸性pH及/或中性pH中可以電化學發光(ECL)反應表示；然而，該領域業者，亦可利用其它的適當方法決定對於既存的ADA的結合親和性用。ECL分析，例如，Moxoness et al(Clin Chem, 2005, 51: 1983-85)及本實施例所記載。測定，例如，可於MES緩衝液及37℃的條件下進行。抗體的抗原結合活性，例如，亦可使用Biacore。一實施態樣中，對於既存的ADA的結合親和性，可於10℃至50℃的任意溫度評價。較佳地，為了決定人類Fc區域與人類既存的ADA之間的結合活性，係使用15℃至40℃的溫度。該溫度較佳為20℃至25℃，更佳為25℃。可於pH7.4(或pH7.0)、25℃測定。 一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，與天然型IgG的Fc區域比較，較佳為在中性pH下，對於既存的ADA，較佳為類風濕性因子(RF)的結合親和性沒有顯著地增大，及/或，在酸性pH下對於FcRn的結合活性增大，血漿中廓清率(CL)減少，血漿中滯留時間增大，或血漿中半衰期(t1/2)增大。抗體的血漿中廓清率(CL)、血漿中滯留時間、血漿中半衰期(t1/2)互相的關係為該領域業者所習知。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體中的Fc區域改變體，與包含以EU編號表示之N434Y/Y436V/Q438R/S440E經置換胺基酸的組合的參照Fc區域改變體比較，血漿中滯留性提升。 本實施例1至3中，比較WO2013/046704所記載的F1718之Fc區域改變體(Fc區域導入N434Y/Y436V/Q438R/S440E之4處的變異)、及Fc區域改變體F1848m(導入N434A/Y436V/ Q438R/S440E之4處的變異)之2個Fc區域改變體的血漿中滯留性。二者的Fc區域改變體的胺基酸變異的不同點，僅在於以EU編號之434號導入的胺基酸變異，F1718為Y(酪胺酸)，F1848m為A(丙胺酸)。與其無關，F1848m與天然型IgG1的情況相比，確認血漿中滯留性的提升，另一方面，F1718則無法確認血漿中滯留性的提升(特別地，參照本實施例(3-2))。再者，由本實施例(1-2)及本實施例(3-3)的結果，各種Fc區域改變體中，確認F1847m、F1886m、F1889m、F1927m，比F1848m，確認血漿中滯留性的提升。因此，不僅F1848m，包含F1847m、F1886m、F1889m、F1927m的Fc區域改變體，與包含以EU編號表示之N434Y/Y436V/Q438R/S440E之經置換胺基酸的組合的參照Fc區域改變體比較，只要為該領域業者，當然可預期血漿中滯留性提升。
血漿中半衰期上升，酸性pH之對於FcRn的結合提升的抗體，亦記載於美國專利號公開案US2005/0014934 (Hinton et al.)。該抗體包含Fc區域改變體，其包含Fc區域對FcRn的結合上升方式之一個以上的胺基酸置換，亦可含有由238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、及434位(EU編號)中選擇1個以上的胺基酸置換，例如Fc區域之434位的胺基酸置換。關於Fc區域改變體的其他例，參照Ducan & Winter, Nature 322: 738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；WO 94/29351。本揭露之抗IL-8抗體的Fc區域(改變體)，適宜地，亦可組入該等的胺基酸殘基的改變。
再者，對FcγR或補體蛋白質的結合，可引起不期望的影響(例如，不適當的血小板活化)。不結合於FcγRIIa受體等效應(effector)受體的Fc區域改變體，可為更安全，且/或更有效。
一實施態樣中，本揭露之包含Fc區域改變體的抗IL-8抗體，對補體蛋白質的結合活性低或不結合於補體蛋白質。較佳地，補體蛋白質為C1q。對補體蛋白質的結合活性低可意指，與包含天然型IgG或天然型IgG的Fc區域的抗體的補體蛋白質比較結合活性，例如，對補體蛋白質的結合活性降低為10分之1以下，50分之1以下，或100分之1以下。對補體蛋白質之Fc區域(改變體)的結合活性，可藉由胺基酸置換、插入、缺失等胺基酸序列的改變而使其降低。 進一步的另外的實施態樣中，本揭露之包含Fc區域改變體的抗IL-8抗體，較佳為對效應受體的結合親和性低或不具有結合親和性。效應受體的例，包含活性化FcγR，特別是包含FcγRI、FcγRII、FcγRIII。FcγRI，例如，包含FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、以及其等的次型(subtype)。FcγRII，例如，包含FcγRIIa(2個異型R131、H131)及FcγRIIb。FcγRIII，例如，包含FcγRIIIa(2個異型V158、F158)及FcγRIIIb(2個異型FcγIIIb-NA1、FcγIIIb-NA2)。對效應結合親和性低或不具有結合親和性的抗體意指，與包含天然型IgG的Fc區域的抗體的結合親和性比較，例如，包含Fc區域改變體的抗體降低為10分之1以下、50分之1以下、或100分之1以下。作為具體例，例如，可列舉包含靜默(silent)Fc區域的抗體、或不包含Fc區域的抗體(例如，Fab、F(ab)' 2、scFv、sc(Fv) 2、雙功能抗體)。
對效應受體的結合親和性低或不具有結合親和性的Fc區域改變體之例，記載於Strohl et al., (Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691)，例如，經脫醣化的Fc區域(N297A、N297Q)，或使效應功能靜默化(或免疫抑制)方式操作之Fc區域的靜默Fc區域之例(IgG1-L234A/L235A、IgG1-H268Q/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/ C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG2- V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4- L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E)所記載。WO2008/092117揭示包含靜默Fc區域的抗體，該靜默Fc區域包含置換G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、或N325L/L328R (根據EU編號)。WO2000/042072揭示包含靜默Fc區域的抗體，該靜默Fc區域包含於EU233位、EU234位、EU235位、及EU237位中之一個或複數個的置換。WO2009/011941揭示包含靜默Fc區域的抗體，該靜默Fc區域包含EU231至EU238殘基的缺失。Davis et al, Journal of Rheumatology (2007) 34(11): 2204-2210，揭示包含靜默Fc區域的抗體，該靜默Fc區域包含置換C220S/C226S/C229S/P238S。Shields et al, Journal of Biological Chemistry (2001) 276(9), 6591-6604，揭示包含靜默Fc區域的抗體，該靜默Fc區域包含置換D265A。美國專利號6,737,056記載包含EU238、EU265、EU269、EU270、EU297、EU327、EU329之1個以上的胺基酸置換的效應功能經減少的抗體。美國專利號7,332,581記載除了EU265及EU297置換成為丙胺酸的「DANA」Fc區域改變體外，包含EU265、EU269、EU270、EU297、EU327之2個以上的胺基酸置換的Fc區域改變體。本揭露之抗IL-8抗體的Fc區域改變體，適宜地，亦可組入其等之胺基酸殘基的改變。
「對效應受體的低結合」意指，對效應受體的天然型IgG(或包含天然型IgG的Fc區域的抗體)的結合活性，例如，為95%以下，較佳為90、85、80或75%以下，更佳為70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1%以下的結合活性。對FcγR的結合活性，與對效應受體之天然型IgG(或包含天然型IgG的Fc區域的抗體)的結合活性，例如，可降低為10分之1以下、50分之1以下、或100分之1以下。
本說明書中，靜默Fc區域，為與天然型Fc區域比較，對效應受體的結合降低之包含一個或複數個胺基酸置換、插入、缺失等之Fc區域改變體。為了獲得對效應受體的結合活性大幅降低的Fc區域改變體，不與效應受體(實質的)結合。作為靜默Fc區域之例，含有包含由EU234、EU235、EU236、EU237、EU238、EU239、EU265、EU266、EU267、EU269、EU270、EU271、EU295、EU296、EU297、EU298、EU300、EU324、EU325、EU327、EU328、EU329、EU331、及EU332所組成之群組選擇一個或複數個位置之胺基酸置換的Fc區域(改變體)。一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體的Fc區域(改變體)，適宜地，亦可組入其等之胺基酸殘基的改變。
一實施態樣中，用於製作本揭露之抗IL-8抗體的Fc區域改變體的抗體恆定區域的改變方法，例如，可選擇將恆定區域的同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)進行複數檢討，於其適宜的序列中例如導入胺基酸置換，酸性pH下的抗原結合活性降低，及/或酸性pH下的解離速度變快的同型。
另外的進一步實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體亦可包含 (A) 包含序列編號: 36、37或106的胺基酸序列的重鏈，或具有與其至少為65%、70%、或75%以上，較佳為80%、85%、或90%以上，更佳為95%以上的序列同一性的重鏈；及/或 (B) 包含序列編號: 38或44的胺基酸序列的輕鏈，或具有與其至少為65%、70%、或75%以上，較佳為80%、85%、或90%以上，更佳為95%以上的序列同一性的輕鏈。此處，與參照胺基酸序列具有特定%的序列同一性的重鏈或輕鏈，亦可為與具有參照胺基酸序列的重鏈或輕鏈為功能性同等。進一步地，該抗IL-8抗體亦可包含具有以下5個性質中至少一個性質的Fc區域改變體： (a) 酸性pH之Fc區域改變體對FcRn的結合親和性，比天然型Fc區域對FcRn的結合親和性更為增大， (b) 對既存的ADA之Fc區域改變體的結合親和性，比天然型Fc區域對既存的ADA的結合親和性更為降低， (c) Fc區域改變體的血漿中半衰期比天然型Fc區域的血漿中半衰期更為增大， (d) Fc區域改變體的血漿中廓清率比天然型Fc區域的血漿中廓清率更為減少， (e) Fc區域改變體對效應受體的結合親和性比天然型Fc區域對效應受體的結合親和性更為降低， (f) 可pH依賴性結合於IL-8。 此處所記載、推定之所有胺基酸序列的組合，理所當然的為該領域業者所理解。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，例如，可使用美國專利號4,816,567所記載的方法製作。一實施態樣中，係提供編碼本揭露之抗IL-8抗體的經單離核酸。該等核酸，亦可編碼包含抗體VL的胺基酸序列及/或包含VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕鏈及/或重鏈)。經單離之編碼抗IL-8抗體的核酸，於宿主細胞內亦可進一步的選殖及/或插入至表現用的一個以上的載體。該等核酸，可利用以往的手法(例如，使用與編碼抗體的重鏈及/或輕鏈的基因特異性地結合之寡核酸探針)容易地將其單離、決定序列。 進一步的實施態樣中，係提供包含該等核酸一個以上的載體(例如，表現載體)。一實施態樣中，係提供包含該等核酸的宿主細胞。該宿主細胞包含，(1) 包含編碼含抗體的VL的胺基酸序列及/或含VH的胺基酸序列的核酸的載體，或(2) 包含編碼含抗體的VL的胺基酸序列的核酸的第一載體及包含編碼含抗體的VH的胺基酸序列的核酸的第二載體(例如，利用該等載體使細胞形質轉換)。 一實施態樣中，宿主為真核細胞(例如，CHO細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、SP20細胞))。 一實施態樣中，係提供本揭露之抗IL-8抗體的製造方法，該製造方法，例如，包含將含有上述核酸的宿主細胞，以適合抗體表現的條件培養，任意地由宿主細胞(或宿主細胞的培養基)回收該抗體。
作為適合於編碼抗體的載體的表現或選殖的宿主細胞，例如，包含原核細胞或真核細胞。為了表現經醣化抗體，亦可使用源自多細胞生物(無脊椎動物或脊椎動物)的細胞。無脊椎動物之例為植物細胞或昆蟲細胞。
一實施態樣中，包含編碼抗IL-8抗體的核酸的宿主細胞，以適合於抗體表現的條件培養所產生的抗體，由宿主細胞內或細胞外(培養基、乳汁等)單離，可精製為實質純粹的均一抗體。抗體的分離、精製，可適宜地使用通常於多肽的精製中所使用的分離、精製方法，但不限定為該等。例如，可適宜選擇、組合層析管柱、過濾器、超微過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，可使抗體適合地分離、及精製。作為層析，例如，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等。該等層析，可使用液相層析，例如，HPLC、FPLC等液相層析而進行。作為親和性層析使用的管柱，例如可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱等。例如，作為蛋白質A所使用的管柱，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F. F.(Pharmacia公司製造)。
一實施態樣中，著眼於對細胞外基質的結合性增大，及IL-8與抗IL-8抗體的複合體對細胞內攝入的增加之抗IL-8抗體的性質，本揭露係關於增大對細胞外基質的結合性的抗體及增加細胞內攝入的抗體的選擇方法。一實施態樣中，本揭露為包含對IL-8的結合活性為pH依賴性之可變區域的抗體的製造方法，係關於包含以下步驟的抗IL-8抗體的製造方法：(i) 評價抗IL-8抗體與細胞外基質的結合的步驟，(ii) 選擇與細胞外基質(matrix)的結合為高的抗IL-8抗體的步驟，(iii) 培養包含載體的宿主的步驟，該載體包含編碼該抗體的核酸，及(iv) 由培養液(培養上清等)單離該抗體的步驟。與細胞外基質的結合的評價，例如，可藉由於將細胞外基質固相化的盤添加抗體，經由添加針對該抗體的標識抗體，經由ELISA系檢出抗體及細胞外基質的結合而測定。或者，例如，可於細胞外基質經固相化的盤，添加抗體及釕抗體的混合物，抗體與細胞外基質的結合藉由測定釕的電化學發光的電化學發光法(ECL法)而測定。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，期望於溶液中(例如，PBS中)安定地保持IL-8中和活性。溶液中該活性是否安定地保持，可藉由測定添加於該溶液的本揭露的抗體的IL-8中和活性，於某期間、某溫度保管之前與之後是否變化而可確認。一實施態樣中，保管期間，例如，為1至4週間，保管溫度，例如為25度、30度、35度、40度、或50度。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，期望於活體內(例如，血漿中)安定地保持IL-8中和活性。活體內該活性是否安定地保持，可藉由測定添加於非人類動物(例如，小鼠)或人類的血漿之本揭露之抗IL-8抗體的IL-8中和活性，於某期間、某溫度保管之前與之後是否變化而可確認。一實施態樣中，保管期間，例如，為1至4週間，保管溫度，例如為25度、30度、35度、或40度。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體的被細胞攝入的速度，相較於抗體單獨時，經與IL-8形成複合體時為大。
一實施態樣中，本揭露之抗IL-8抗體，較佳為於人類宿主中所預測的免疫原性為降低。「低免疫原性」可意指，例如，達成治療效果的充分時間中，在投予充分量的抗體的個體的至少過半數中，不因所投予的抗IL-8抗體於活體內引起免疫回應。免疫回應的引起可包含抗醫藥品抗體的產生。「抗醫藥品抗體的產生少」與「免疫原性低」可為互換用語。人類之免疫原性的程度，亦可能利用T細胞抗原決定基預測程式預測，該T細胞抗原決定基預測程式包含Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)、EpiMatrix (EpiVax)等。例如，可使用T細胞抗原決定基預測程式解析，設計免疫原性經降低的序列。作為該等胺基酸改變部位的非限定例，可列舉序列編號: 34所表示的抗IL-8抗體的重鏈序列中的Kabat編號表示之81位及/或82b位。
一實施態樣中，本揭露記載的抗IL-8抗體的功能比較時的參照抗體，可為包含序列編號: 39及40的胺基酸序列的抗體。特定的實施態樣中，PK試驗所使用的參照抗體，可為包含序列編號: 43及45的胺基酸序列的抗體。
複數的實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)，藉由習知的各種各樣方法，鑑定、篩選或特徵化物理化學的特性及/或生物學的活性為指標。
結合測定、其他的測定 某面向中，本揭露之抗體，例如，可以如ELISA或西方墨漬法、結合平衡除外法(Kinetic Exclusion Assay；KinExA TM)、或使用BIACORE(GE Healthcare)等裝置的表面電漿共振法等方法，研究抗原結合活性。
一實施態樣中，結合親和性可使用Biacore T200 (GE Healthcare)如以下方式測定。感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法(amine coupling)適當量固定化補充用蛋白質(例如，蛋白質A/G(PIERCE))，於該處捕捉目的抗體。其次，注入經稀釋抗原液及運行緩衝液(作為參照溶液：例如，0.05% tween 20、20mM ACES、150mM NaCl，pH7.4)，經捕捉於感應晶片上的抗體，與抗原分子互相作用。感應晶片的再生係使用10mM甘胺酸-HCl溶液(pH 1.5)，測定係於指定的溫度(例如，37℃、25℃、或20℃)實施。由測定所得感測圖譜所算出的動力參數之結合速度常數kon(1/Ms)及解離速度常數koff(1/s)，算出各抗體對於抗原的KD(M)。各參數的計算係使用Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare)。
一實施態樣中，IL-8的定量可如以下的方式實施。作成具有小鼠IgG恆定區域的抗IL-8抗體經固相化的盤。包含與前述抗人類IL-8抗體不競爭之與人源化IL-8抗體結合的IL-8的溶液，分注、攪拌於前述固相化盤。之後，添加經生物素(biotin)化抗人類Igκ輕鏈抗體，使其反應一定時間，進一步添加經SULFO-Tag標示之鏈親和素(streptavidin)，使其反應一定時間。測定用緩衝液添加後，立即於SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)測計。
活性評價分析 某面向中，測定係提供用於鑑定具有生物學的活性的抗體。生物學的活性，例如，包含中和抗原(例如，IL-8)活性，或阻斷抗原(例如，IL-8)的訊息的活性。
一實施態樣中，決定IL-8的中和活性程度的方法，例如，亦可依以下的方法測定。PathHunter(註冊商標) CHO-K1 CXCR2 β-Arrestin細胞株(DiscoveRx公司，Cat.# 93-0202C2)係表現作為人類IL-8受體之一的人類CXCR2，經由人類IL-8傳達訊息時呈現化學發光的方式，人工作成的細胞株。於該細胞的培養液添加人類IL-8，依賴於所添加的IL-8的濃度，該細胞呈現化學發光。於培養液中添加合併人類IL-8及抗人類IL-8抗體的情況，由於抗人類IL-8抗體可阻斷IL-8之訊息傳達，該細胞的化學發光，與不添加抗體的情況相比為弱，或完全未檢出。亦即，抗體具有的人類IL-8中和活性越強、則化學發光的程度越弱，抗體具有的人類IL-8中和活性越弱、則化學發光的程度越強。經由確認該差異，能夠評價抗人類IL-8抗體，對人類IL-8的中和活性。
本說明書中，「診斷用組成物」、「治療用組成物」、「預防用組成物」，分別可與「診斷劑」、「治療劑」、「預防劑」互換使用。一實施態樣中，治療用組成物、預防用組成物係意圖於所期望對象的疾病或症狀的治療或預防的情況，該等組成物亦稱為醫藥組成物，醫藥組成物通常意指疾病或症狀的治療或預防用的藥劑。 本說明書之「藥學上容許的載劑(carrier)」意指，醫藥組成物中存在的有效成分以外的構成要素，典型地選擇對於對象為無害者，根據目的考慮風險、利益而決定。藥學上容許的載劑，例如，包含緩衝液、賦形劑、安定劑、或保存劑。 一實施態樣中，本揭露之治療用組成物或預防用組成物包含藥學上容許的載劑，可以凍結乾燥製劑或水溶液製劑的形態調製。
一實施態樣中，藥學上容許的載劑，典型地，使用的用量及濃度對於接受者為非毒性，例如，包含磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸等緩衝液；包含抗壞血酸及甲硫胺酸的抗氧化劑；保存劑(例如，氯化十八基二甲基苄基銨；氯化六羥甲季銨(hexamethonium chloride)；氯化苄二甲羥胺；氯化苯索寧；酚、丁基或苄基醇；對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯等對羥基苯甲酸烷基酯類；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(約未滿10殘基)的多肽；血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等蛋白質；聚乙烯吡咯啶酮等親水性聚合物；甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸；包含葡萄糖、甘露糖、或糊精的單糖類、雙糖類、及其他碳水化合物；EDTA等螯合劑；砂糖、甘露醇、海藻糖及山梨醇等糖；鈉等鹽形成相對離子；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質複合體)；及/或TWEENTM、PLURONICS TM或聚乙二醇(PEG)等非離子性界面活性劑。或者，例如，亦可包含可溶性玻尿酸脢醣蛋白質(sHASEGP)方式之組織間隙性藥劑分散劑(美國專利號US 2005/0260186，US2006/0104968)。亦可將sHASEGP與如軟骨素酶(chondroitinase)之一個以上的醣胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)組合。
本說明書中，醫藥組成物中的有效成分(IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑等IL-8訊息阻礙劑)的「有效量(effective amount)」意指，達成所期望的治療性或預防性結果的必要期間、必要用量之有效量。 某面向中，本揭露係基於IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)可利用作為醫藥組成物。本揭露之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)，例如，有益於IL-8過剩存在的疾病的診斷、治療或預防。
一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)，係以非經口投予、肺內投予、鼻腔內投予、期望為局部處置的情況為病灶內投予等，任意的適宜手段投予。作為非經口注入之例，可列舉肌肉內投予、靜脈內投予、動脈內投予、腹腔內投予或皮下投予。根據投予為短期或長期，例如，亦可以靜脈內注射或皮下注射的方式注射等適切的路徑投藥。可進行各種各樣的投藥方案。 一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑，可以配合醫學的實用性的樣式，予以製劑化、用量設定、投予。 一實施態樣中，本揭露係關於本說明書所揭示之疾病用的診斷、治療、及/或預防有用的包含IL-8訊息阻礙劑的製品。該製品包含容器、附隨於該容器之標籤(仿單)或附加文件。適切的容器，例如，包含瓶、小瓶、靜脈注射用溶液袋。
疾病的治療或預防中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)的適當投予量及投予間隔，可根據治療對象的疾病類型、阻礙劑類型、疾病的重症度及歷程、投予目的、至今的治療、患者的臨床歷程及對於阻礙劑反應、以及醫師的裁量等而適宜設定。
一實施態樣中，作為治療效果，例如，包含疾病的發生或復發的防止、症狀的緩解、疾病的任意的直接或間接的病理結果的減低、轉移的防止、疾病進行速度的減低、疾病狀態的回復、緩和、緩解或經改善的預後。
一實施態樣中，本揭露中，IL-8過剩存在的疾病或症狀，或IL-8訊息為病態的發症、進行、惡化、復發等相關或可相關的疾病，包括性地，稱為「IL-8相關疾病」。 某面向之一實施態樣中，本揭露係關於含有IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)作為有效成分之IL-8相關疾病的治療用組成物或預防用組成物。進一步的實施態樣中，該組成物亦可進一步包含藥學上容許的載劑。 某面向之一實施態樣中，本揭露係關於用於IL-8相關疾病(例如，子宮內膜異位症、子宮腺肌症、月經困難症、沾黏、纖維化疾病)的治療或預防的用途之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)。 某面向之一實施態樣中，本揭露係關於作為對於IL-8相關疾病(例如，子宮內膜異位症、子宮腺肌症、月經困難症、沾黏、纖維化疾病)的診斷用組成物、治療用組成物、或預防用組成物之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)的用途。 某面向之一實施態樣中，本揭露係關於包含將IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)或包含其之治療用組成物或預防用組成物投予至有其需要的對象(以有效量)，治療或預防IL-8相關疾病(例如，子宮內膜異位症、子宮腺肌症、月經困難症、沾黏、纖維化疾病等)的方法。此處，有其需要的對象，可為已罹患該IL-8相關疾病，或有罹患之虞的對象。進一步的實施態樣中，該組成物亦可進一步包含藥學上容許的載劑。 某面向之一實施態樣中，本揭露係關於用於IL-8相關疾病(例如，子宮內膜異位症、子宮腺肌症、月經困難症、沾黏、纖維化疾病等)的治療或預防用的醫藥的製造，本揭露之IL-8訊息阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)或包含其之治療用組成物或預防用組成物的用途。進一步的實施態樣中，該組成物亦可進一步包含藥學上容許的載劑。
一實施態樣中，作為本揭露之IL-8阻礙劑(例如，IL-8阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)、CXCR1阻礙劑、或CXCR2阻礙劑)所治療或預防的對象之IL-8相關疾病，例如，可列舉子宮內膜異位症；子宮腺肌症；月經困難症；阿休曼症候群(Asherman’s syndrome)等的沾黏；不孕症；因子宮內膜異位症、子宮腺肌症、或月經困難症之疼痛；以及因沾黏、纖維化或炎症之疼痛；炎症性角化症、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、掌蹠膿疱症、乾癬等炎症性皮膚疾病；慢性類風濕性關節、全身性紅斑性狼瘡、貝塞特氏症(Behcet’s syndrome)等慢性炎症性疾病之自體免疫疾病；克隆氏症、潰瘍性大腸炎等炎症性腸疾病；B型肝炎、C型肝炎、酒精性肝炎、藥物過敏性肝炎等炎症性肝疾病；腎絲球腎炎、ANCA相關腎炎等炎症性腎疾病；支氣管炎、氣喘等炎症性呼吸器官疾病；動脈粥狀瘤性動脈硬化等炎症性慢性血管疾病；多發性硬化症；口內炎；聲帶炎；器官移植時的缺血再灌流；人工器官、人工血管使用時引起的炎症；卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、乳癌、黑色素瘤(惡性黑色腫瘤)、頭頸癌、腎臟癌、膀胱癌、神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)等惡性腫瘤；感染等造成的敗血症(包含敗血症休克)；急性肺損傷；子宮內膜異位症或子宮腺肌症之纖維化、囊胞性纖維症、肝纖維症、腎纖維症、及慢性阻塞性肺疾病(COPD)等肺纖維症等的纖維化；由腦中風、腦梗塞(例如，缺血性腦梗塞)、腦血栓症、腦栓塞症、出血性腦血管障礙、腦內出血、及蜘蛛膜下出血選擇的腦障礙；心肌梗塞(包含急性心肌梗塞、不安定狹心症、心肌區血再灌流障礙等)等(作為參照，例如，本實施例；本說明書記載的文獻；Remo et al., Expert Rev. Clin. Immunol. 10(5), pp. 593-619, 2014；Mian et al., Clin Cancer Res. 2003 Aug 1; 9(8): 3167-75; Huang et al., Am J Pathol. 2002 Jul; 161(1): 125-34; WO97/49426；WO97/39775；日本專利JP10-045622；JP10-182488；JP10-053536)。IL-8相關疾病可為哺乳動物的疾病，較佳為靈長類的疾病，更佳為人類的疾病(例如，子宮內膜異位症為人類子宮內膜異位症；子宮腺肌症為人類子宮腺肌症等，以下相同)。 一實施態樣中，本揭露之成為I-8訊息阻礙劑的治療或預防的對象的IL-8相關疾病的患者(對象)，可為已罹患該IL-8相關疾病，或有罹患之虞的對象。此處，IL-8相關疾病有罹患之虞的某對象，雖不限定，可為過去罹患IL-8相關疾病而有症狀復發之虞的對象，或者，亦可為IL-8相關疾病之例如因病理所見而由醫師給予確定診斷之前，疑似發生IL-8相關疾病的對象。一實施態樣中，IL-8相關疾病的預防及治療根據情況亦可理解為同義。或者，IL-8相關疾病的預防，於適切的情況，亦可以該領域業者所習知的一般性的觀念理解。 一實施態樣中，本揭露之IL-8相關疾病顯示IL-8訊息回應性。
本說明書中，子宮內膜異位症，雖不意圖限定，為具有與子宮內膜組織相同或類似的形態與功能的組織，發生於子宮外的異位性(通常於骨盆內，有時於腹腔，稀少於胸腔)，具有增殖症候的疾病(日本產科婦人科學會，1993)。雖不為惡性腫瘤，但經時性的進行，帶來腫瘍形成與周圍的沾黏、月經時極其以外的重度腹痛或骨盆痛、性交痛、排便痛、以及不孕症(妊娠能力降低)的疾病。主要發生於20歲以上的生育年齡的女性，因疼痛等之QOL降低、甚至因沾黏的重症化而造成疼痛的慢性化及不孕症。子宮內膜異位症的病變部位(疾病部位)中，產生沾黏部分的病態進行時引起纖維化。經纖維化部分生成膠原蛋白，成為纖維化的原因。子宮內膜異位症之纖維化的進行，一般理解為不可逆的。因此，至今未有報告可中止或改善子宮內膜異位症之纖維化進行。如此所述，子宮內膜異位症，雖將由病態的發生至進行的過程中呈現的多樣病理的觀察之各種各樣的階段、一邊持續惡化的疾病，統稱為子宮內膜異位症，近來，已製作與人類同樣具有月經的非人類靈長類的子宮內膜異位症活體內模型，為病態的解明逐漸進展的疾病。本發明者們，外科性的誘導製作與人類同樣具有月經的食蟹獼猴的子宮內膜異位症活體內模型，對活體投予IL-8訊息阻礙劑，子宮內膜異位症的病變部位之上皮細胞及基質細胞係萎縮性變化，或，子宮內膜異位症的組織間隙(interstitium)減少而至平滑肌亦縮小而可抑制子宮內膜症的病變部位的增殖，為世界上首次使用可信賴的活體內模型實證成功。子宮內膜異位症組織，特別是組織間隙的減少，可期待異位性神經細胞的細小化。再者，本發明者們研究，於IL-8訊息阻礙劑的投予群，確認媒劑(vehicle)群中未觀察到的肌肉組織的再生，至肌肉層的經浸潤病變退縮，肌肉組織的置換回復。即使利用有無浸潤至腹壁肌肉層的子宮內膜異位症腺管而確認有無深在性病變(deep lesion)情況，顯示IL-8訊息阻礙劑可抑制深在性病變的形成。進一步令人驚訝地，本發明者們首先實證以該IL-8訊息阻礙劑，亦可抑制子宮內膜異位症之沾黏及纖維化。因此，一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑，對於稱為子宮內膜異位症之特定階段的纖維化、可考慮為纖維化疾病的症狀可治療或預防。再者，食蟹獼猴活體內模型中，考慮一例為以性週期為不定期者所製作的模型的影響，除去一例、性週期為定期的，判斷IL-8訊息阻礙劑對於性週期不賦予影響(參照本實施例)。由此可知，與既存的子宮內膜異位症治療劑比較，IL-8訊息阻礙劑是有期望的治療劑或預防劑。進一步地，即使不與荷爾蒙劑併用，以IL-8訊息阻礙劑單劑可治療或預防子宮內膜異位症亦為令人驚訝。一實施態樣中，本揭露之子宮內膜異位症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，子宮腺肌症，雖不為限定者，但於子宮平滑肌層存在子宮內膜組織、即子宮內膜腺與將其包圍的子宮內膜間質(基質(stroma))的狀態，伴隨周圍的平滑肌肥大與過度形成的疾病，帶來重度的月經痛、過多月經以及貧血、慢性疼痛。子宮腺肌症患者的6至20%係併發子宮內膜異位症(武谷等人，平成9年度厚生省身心障礙研究報告書，1998: 99-104)，但與子宮內膜異位症為疾病學分類上不同的疾病，兩者已區別為個別的疾病為近年來該領域業者的技術常識(Frankl et al., 1925; 10:680-4, Brosens et al., Lancet, 1993 Jan 16: 341 (8838): 181-2, Benagiano et al, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2006 Aug; 20(4): 449-63)。從子宮內膜異位症於異位性產生、發育的觀點，依賴於雌激素而變化的觀點，月經痛為主症狀的觀點而言，與子宮內膜症類似，但子宮腺肌症於疫學上相較於子宮內膜異位症較多發生於比較高齡的經產婦女等為不同。雖不可特定為子宮內膜與基底層及肌層間的邊界破壞的理由，但正提倡因子宮損傷(過度的搔刮、分娩外傷)而將子宮內膜直接押入基層內的發生說(Pappas et al, Obset Gynecol. 1959; 13:714, Benagiano et al, Fertil Steril. 2012 Sep; 98(3): 572-9)。又，內腔側肌層90%為止不存在子宮內膜組織，子宮內膜組織僅分布於漿膜側的肌層的例子，稱為骨盆腹膜子宮內膜異位症(Bergeron et al, Best Pract Res Clin Obset Gynaecol 2006; 20(4): 511-521)。 本發明者們，確認、鑑定上述之食蟹獼猴活體內模型為自然發症的子宮腺肌症，對活體投予IL-8訊息阻礙劑時，為世界上首次成功地證實可抑制子宮腺肌症的病變部的增殖。食蟹獼猴活體內模型中，由於IL-8訊息阻礙劑對於性週期不賦予影響(參照本實施例)，與既存的子宮腺肌症治療劑比較，IL-8訊息阻礙劑是有期望的治療劑或預防劑。進一步地，相對於不與荷爾蒙劑併用，驚訝地以IL-8訊息阻礙劑單劑可治療或預防子宮腺肌症。投予IL-8訊息阻礙劑，於子宮腺肌症能夠使已肥大的子宮壁變薄，而推測於子宮腺肌症對於纖維化的治療或預防效果。一實施態樣中，本揭露之子宮腺肌症對於IL-8顯示回應性。
本說明書中，月經困難症，雖不為限定者，亦可意指特別是於月經時的症狀中對日常生活產生困難程度的症狀。月經困難症已知可與子宮內膜異位症、子宮腺肌症、過多月經等相關，作為其典型的症狀，例如，可列舉月經時的腹痛、特別是下腹痛，此外之腰痛、頭痛、噁心、貧血、倦怠感等。月經困難症由其原因大致分類為功能性(原發性)月經困難症與器質性(續發性)月經困難症2種類。作為功能性月經困難症的原因，例如，可列舉前列腺素的過剩分泌、伴隨子宮肌腫、子宮內膜異位症等疾病的進行所產生者。作為器質性月經困難症的原因，例如，可列舉伴隨子宮肌腫、子宮內膜異位症等疾病的進行所產生者。再者，已知月經困難症亦因子宮內外的炎症而產生，已知IL-8為抗炎症細胞激素。因此，一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑，可治療或預防月經困難症。非限定的較佳實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑，可治療或預防具有子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症、疑似子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症、伴隨有炎症的月經困難症、或、伴隨有因沾黏而疼痛之月經困難症。或者，別的實施態樣中，本揭露之月經困難症對於IL-8訊息顯示回應性。 此處，「疑似子宮內膜異位症或或子宮腺肌症的月經困難症」，雖不限定，可為過去罹患子宮內膜異位症或子宮腺肌症，症狀恐再復發的對象，或者，可為子宮內膜異位症或子宮腺肌症之例如因病理所見而由醫師給予確定診斷之前，疑似發症子宮內膜異位症或子宮腺肌症的對象。 一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑使用於伴隨有子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症、或疑似子宮內膜異位症或子宮腺肌症的月經困難症的治療或預防時，如上所述，由於IL-8訊息阻礙劑不賦予對性週期的影響，即使不與荷爾蒙劑併用之單劑，亦可治療或預防子宮內膜異位症或子宮腺肌症而為有利。 再者，如本實施例所記載，本發明者們實證或想到IL-8訊息阻礙劑，除了子宮內膜異位症、子宮腺肌症之外，可治療或預防沾黏。月經困難症係附有腹痛等疼痛的特徵時，理所當然考慮到不僅是子宮內膜異位症的沾黏，即便為其以外的症狀或疾病所導致的沾黏之組織或器官係接著等而於患者引起疼痛。例如已知骨盆內之沾黏的生殖附屬器官彼此的沾黏雖與疼痛不相關，但直腸子宮陷凹(douglas cavum)的沾黏與疼痛相關(Porpora et al, The Journal of the American Association of Gynecologic Laparoscopists 1999; 6: 429-434)，發生臟器彼此沾黏而引起疼痛。再者，已知子宮內膜異位症中異位性的神經纖維及NGF的產生成為疼痛及疼痛惡化的原因(Anaf et al, Hum Reprod 2000; 15:1744-1750., Berkley et al, Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 11094-11098, Odagiri et al, Fertil Steril 2009; 92: 1525-1531.)。再者亦有報告顯示子宮內膜異位症周圍所具有的平滑肌為發達之組織間隙(interstitium)，於收縮時的疼痛增強(Odagiri et al, Fertil Steril 2009; 92: 1525-1531.)。除了確認藉由本實施例的抗IL-8抗體的投藥造成子宮內膜異位症組織的組織間隙(interstitium)減少之外，由於可期待異位性神經的減少，可期待疼痛改善。 一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑可治療或預防子宮內膜異位症或子宮腺肌症之疼痛(慢性疼痛、月經時的疼痛等)、月經困難症之疼痛、或因沾黏、纖維化或炎症之疼痛。此處，作為該慢性疼痛，雖不意圖限定，可列舉慢性下腹部疼痛或慢性骨盆痛。
一實施態樣中，本揭露之「不賦予對性週期的影響」，可意指對象(人類為女性，非人類動物為雌性)之週期性的月經循環及排卵不受到實質的干涉，其循環的週期性，可由如於本實施例中所觀察的方式之月經時的出血有無決定，亦可由血中或尿中雌激素濃度的變動或黃體素濃度的變動而判定。已知荷爾蒙(例如雌激素/黃體素合劑、黃體素製劑、GnRH促效劑、達那唑(danazol))療法干涉月經循環而阻礙排卵。雖不限定，是否受到實質的干涉，例如，與接受已知對性週期賦予影響的荷爾蒙療法的對照群比較，接受IL-8訊息阻礙劑的投藥群之統計或傾向，亦可判斷月經循環未受到干涉。一實施態樣中，本揭露之IL-8訊息阻礙劑，由於對使其投予之子宮內膜異位症、子宮腺肌症、或月經困難症的對象不賦予對性週期的影響，可想起不阻礙排卵及與以往的荷爾蒙療法的差異之可能妊娠。再者，經由不使用荷爾蒙劑，對象可迴避因低的雌激素狀態所致之更年期障礙等副作用狀態而為有利的。
活體內的細胞、組織、器官或臟器等受到損傷或創傷時，活體具有使該受到損傷或創傷的部位進行創傷治癒功能。然而，創傷治癒的過程理論上不期望，有細胞、組織、器官或臟器間的接著產生。雖不意圖限定，典型地該等接著狀態稱為沾黏。有即使產生沾黏亦無自覺狀的患者，另一方面伴隨有疼痛或不孕、腹部膨脹感等症狀而成為需要治療的患者亦不在少數。作為沾黏之例，可列舉手術後已產生(產生)的沾黏(例如，外科手術時的切開面、縫合部位周圍、紗布等地擦過部位等直接或間接已產生(產生)的沾黏、因子宮內搔刮處理已產生(產生)的子宮腔內沾黏症(阿休曼症候群))；因藥劑(例如對臟器的局部的藥劑投予)的沾黏；因疾病(例如，子宮內膜異位症、子宮腺肌症、或浸潤狀態的癌細胞或癌組織、伴隨感染的炎症性疾病(輸卵管炎、卵巢炎、骨盆腹膜炎等))的沾黏；伴隨沾黏的腸閉塞；自然發症所產生的沾黏等。本發明者們，於食蟹獼猴的子宮內膜異位症活體模型中，偶然地亦發現開腹手術後所產生的子宮內膜異位症對於別的開腹部位的沾黏，因對活體投予IL-8訊息阻礙劑而沾黏減少。一實施態樣中，本揭露之沾黏對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，不孕症，雖不意圖限定，不論期望懷孕的健康男女是否進行不避孕的性交，意指一定期間(一般而言為一年)未懷孕者(日本產科婦人科學會，2016)。雖不限定，一面向中，該不孕症，可為沾黏後產生(特別是沾黏為起因)的不孕症，或因腹腔內的炎症所致之不孕症。一實施態樣中，本揭露之不孕症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，掌蹠膿疱症，雖不意圖限定，意指皮疹(膿疱)可無數地發生於手掌或腳底。膿疱為無細菌或黴菌的無菌性者，因嗜中性球累積於皮膚的角質的狀態，IL-8為高濃度(Skov et al, J Immunol 2008; 181: 669-679)。長期間症狀反覆，出現慢性的症狀。以掌蹠膿疱症為對象之臨床試驗中，投予抗IL-8抗體之HuMab10F8改善病態(Skov et al, J Immunol 2008; 181: 669-679)。根據上述，一實施態樣中，本揭露之掌蹠膿疱症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，ANCA關聯腎炎，意指ANCA(anti- neutrophil cytoplasmic antibody: 抗嗜中性球細胞質抗體)為陽性的腎炎。其中ANCA關聯腎炎，係因腎絲球體等腎臟的血管的炎症引發的疾病，典型地病理學上所見顯示為壞死性新月體形成性腎絲球體腎炎，慢性化進行纖維化，腎絲球硬化而達到腎衰竭。(基於證據之快速進行性腎炎症候群(RPGN)診療指南2014，Nature Review Rheumatology 10(2014) 463)。ANCA關聯腎炎中，於病變部為IL-8高表現，患者的嗜中性球藉由ANCA處理而移轉能力提升，藉由抗IL-8抗體處理而使移轉能力受到抑制(Cockwell et al, Kidney Int. 1999 Mar; 55(3): 852-63)。一實施態樣中，本揭露之ANAC關聯腎炎對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，囊胞性纖維症，係囊性纖維化穿膜傳導調節蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR))的基因變異為原因的全身性體染色體隱性遺傳性疾病。氣道內液、腸管內液、胰液等全身的分泌液及黏液顯著地變黏稠，出現管腔容易閉塞感染，胎便性腸閉塞或胰臟萎縮而胰外分泌不全所致之消化吸收不良，反覆的呼吸器感染之呼吸衰竭等症狀。氣道液或支氣管肺泡洗淨液等病變部或其周圍係IL-8為高濃度(Marcos et al, Nat Med. 2010 Sep; 16(9): 1018-23, Khan et al, Am J Respir Crit Care Med. 1995 Apr; 151 (4): 1075-82)，存在多數的藉由IL-8而移轉嗜中性球，咸信過度的炎症係引起持續嗜中性球之彈性蛋白酶(elastase)等酵素產生或NETosis而出現體液的黏性變高的症狀(Cheng et al, Front Immunol. 2013 Jan 24; 4:1)。CXCR2阻礙劑之Elubrixin的囊胞纖維症為對象之臨床試驗亦觀察到對局部的嗜中性球的移轉抑制(J Cyst Fibros. 2013 May; 12(3): 241-8)。藉由IL-8通路的阻礙而阻礙嗜中性球的移轉，推定因酵素產生抑制或NETosis抑制而局部黏度降低，症狀緩和。根據上述，一實施態樣中，本揭露之囊胞性纖維症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，乾癬，雖不意圖限定，亦已知為炎症性疾病。典型地外觀症狀為以銀色的鱗屑覆蓋之邊界明瞭的紅色丘疹或局面。作為常見的誘因，可列舉外傷、感染、某種的藥劑。通常，幾乎無症狀，偶爾有輕度的搔癢，但美容的觀點成為主要的投訴。亦有合併有疼痛的關節炎而成為重症的人。美國專利號US2003/0077283A1中，揭示使用抗IL-8中和抗體之乾癬的局部療法。再者，市售有以Abcream(註冊商標)的名稱的抗IL-8中和抗體的感染治療藥。根據上述，一實施態樣中，本揭露之乾癬對於IL-8訊息顯示回應性。
纖維化的機制，因出血或疾病所致之傷害而觸發炎症，藉由包含IL-8之趨化介素或細胞激素由周圍組織之嗜中性球或單核球等免疫細胞受到誘導，進一步地藉由產生趨化介素或細胞激素，發生肌纖維母細胞(或纖維化細胞)的活化及增殖或膠原蛋白等細胞外基質的過剩產生或分解降低，產生纖維化。該等為各種各樣的臟器中發生的纖維症的共通者(N Engl J Med 2015; 372: 1138-1149 March 19, 2015)。 本揭露中，伴隨該等纖維化之疾病或狀態，辨別其纖維化的態樣，包括性地稱為「纖維化疾病」。 食蟹獼猴活體模型中，IL-8訊息阻礙劑係抑制免疫細胞的浸潤，除了膠原蛋白豐富的組織間隙部位減少(參照本實施例)之外，由於活體外分析中，IL-8訊息阻礙劑顯示產生MCP-1(已知作為巨噬細胞移轉因子及纖維化促進因子)等之嗜中性球的移轉阻礙作用，如上所述，IL-8訊息阻礙劑有期望為纖維化治療劑或預防劑。 此外，如實施例所示方式，活體外試驗中，各種各樣的抗IL-8抗體，抑制纖維化促進因子之結締組織生長因子(connecting tissue growth factor，CTGF)的表現提升。其結果，證實抗IL-8抗體等IL-8訊息阻礙劑對於纖維化疾病唯有期望的治療劑或預防劑。
一實施態樣中，本揭露之子宮內膜異位症至沾黏或纖維化，可為源自子宮的組織，於子宮外(例如，骨盆內臟器、腹腔內、或胸腔內)發生增殖的過程。
本說明書中，肝纖維症，雖不意圖限定，意指因病毒感染或脂肪化等慢性炎症，所觸發之肝臟中膠原蛋白等細胞外基質(ECM)為過剩產生或分解降低，而纖維化之疾病。作為肝纖維症，作為例子可列舉病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝疾病(NAFLD)、原發性膽汁性肝硬化(PBC)等慢性的炎症為原因的肝硬化。 已報告A型及B型病毒性肝炎、酒精性肝炎、原發性膽汁性肝硬化等慢性肝疾病中，IL-8上升(Mediators Inflamm. 2015; 2015: 276850)、慢性肝疾病之血中IL-8濃度高的病態進行的患者中為特別高，受體之CXCR1的表現於單核球為高，IL-8於肝臟中強力的亢進炎症，由該等結果顯示賦予IL-8的纖維化進行(PLoS One. 2011; 6(6):e21381)。 再者，由NASH患者的血漿中IL-8濃度，伴隨有纖維化的患者為顯著的提高(Gastroenterology. 2015 Sep; 149(3): 635-48, e14)，顯示IL-8與纖維化的關聯。一實施態樣中，本揭露之肝纖維症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，腎纖維症，雖不意圖限定，意指由炎症觸發之在腎臟之膠原蛋白等細胞外基質過剩產生或分解降低的纖維化疾病。作為腎纖維症，作為例子可列舉慢性腎炎或糖尿病等慢性炎症為原因的慢性腎臟病。慢性腎臟病進行時，不論其原因疾病所造成的腎臟的纖維化，一時產生的纖維化為不可逆的，關於腎臟有迫切的透析導入或腎移植。 已有報告腎纖維母細胞係經由IL-1增強IL-8的產生(Kidney Int. 1995 Mar; 47(3): 845-54)，抑制MCP-1訊息而改善腎纖維症(Kitagawa et al, Am J Pathol. 2004 Jul; 165(1): 237-46)，使用人纖維細胞，檢討糖尿病狀態中之活化及纖維化機制時，顯示人纖維細胞係經由高血糖及MCP-1/CCR2而相關於糖尿病性腎證的進展(Clin Exp Nephrol. 2013 Dec; 17(6): 793-804)等。由於IL-8訊息阻礙劑阻礙產生MCP-1的嗜中性球於病變部的移轉(參照本實施例)，推測抑制或改善經由MCP-1的腎纖維症的進展。一實施態樣中，本揭露之腎纖維症對於IL-8訊息顯示回應性。
本說明書中，肺纖維症，雖不意圖限定，意指炎症觸發之肺或支氣管之膠原蛋白等細胞外基質為過剩產生或分解降低的纖維化疾病。作為肺纖維症，作為例，可列舉慢性閉塞肺疾病(COPD)、肺纖維化合併肺氣腫(combined pulmonary fibrosis and emphysema; CPFE)、特發性組織間隙性肺炎(idiopathic interstitial pneumonias: IIPs)或特發性肺纖維症(idiopathic pulmonary fibrosis: IPF)。
慢性閉塞肺疾病(COPD)，雖不意圖限定，意指長期吸入暴露於以香菸為主的有害物質所產生的肺的炎症性疾病(COPD(慢性閉塞性肺疾病)診斷與治療用的指南第4版)。經由慢性的氣道或肺的炎症，發生肺泡的彈性降低或支氣管內腔的狹窄，由於發生對肺的空氣流動變差的氣流閉塞，出現呼吸困難或慢性的咳嗽、痰等。已有報告COPD之患者痰中的IL-8高，嗜中性球多，患者嗜中性球轉移分析之趨化性指數與肺功能FEV1/FVC有相關(Yamamoto et al, Chest. 1997 Aug; 112(2): 505-10., Wu et al, PLoS One. 2015 May 11; 10(5):)。再者，已有報告以CXCR2阻礙劑之MK7123的COPD患者為對象之臨床試驗中，相對於偽藥群的惡化，實藥群的肺功能(FEV1)改善(Am J Respir Crit Care Med. 2015 May 1; 191(9): 1001-11)。
肺纖維化合併肺氣腫(combined pulmonary fibrosis and emphysema; CPFE)，雖不意圖限定，意指肺氣腫之肺破壞擴大的病變，與肺纖維症合併之預後不良的疾病(Cottin et al, Eur Respir J. 2005 Oct; 26(4): 586-93)。亦有報告顯示CPFE之患者支氣管肺泡洗淨液中的IL-8高，支氣管肺泡洗淨液中的IL-8濃度與胸部CT顯示氣腫性病變與低濃度吸收值領域(LAA)相關(Respirology. 2012 Jul; 17(5): 814-20)，或胸部CT顯示氣腫性病變與LAA及預後的相關(Johannessen A, et al. Am J Respir Crit Care Med 2013; 187: 602-8)。
IIPs為無特定原因之各種組織間隙性肺炎的總稱，於肺泡壁發生炎症或損傷，肺泡壁變厚變硬而纖維化，氣體交換功能降低的疾病(特發性組織間隙性肺炎 診斷與治療的手冊 改訂第2版; Travis et al, Am J Respir Crit Care Med. 2013 Sep 15; 188(6): 733-48)。IPF為IIPs中頻率高最難治療，依循慢性且進行性的過程，進行高度纖維化招致不可逆性的蜂巢肺形成之預後不良的肺疾病(特發性組織間隙性肺炎 診斷與治療的手冊 改訂第2版; Raghu et al, Am J Respir Crit Care Med. 2011 Mar 15; 183(6): 788-824)。IPF中，疾病患者的血清及支氣管肺泡洗淨液中的IL-8為高值(Car et al, Am J Respir Crit Care Med 1994; 149: 655-659, Ziegenhagen et al, Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 762-768)，由支氣管肺泡洗淨液中藉由IL-8移轉之嗜中性球增加而顯示高值者為預後不良(Haslam et al, Thorax 1980; 35: 328-339, Turner-Warwick M et al, Am Rev Respire Dis 1987; 135:26-34)，顯示IL-8及嗜中性球與IPF的病態有深的關係。再者，由IPF患者的IL-8有SNIP的局部IL-8為高濃度(Ahn et al, Respir Res. 2011 Jun 8; 12:73)，亦可推測IL-8為疾病的原因。一實施態樣中，本揭露之肺纖維症、COPD、CPFE、IIPs或IPF對於IL-8訊息顯示回應性。
進一步或別的實施態樣中，本揭露係關於用於纖維化因子的產生阻礙中使用之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於包含將有效量IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)投予至對象，對象之纖維化因子的產生阻礙方法，或用於該方法使用之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於包含有效量之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)之纖維化因子的產生阻礙用的醫藥組成物。或者，本揭露係關於纖維化因子的產生阻礙用的醫藥製造中的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於纖維化因子的產生阻礙中IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於，包含混合IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)及藥學上容許的擔體的步驟，纖維化因子的產生阻礙用的醫藥組成物的製造方法。某實施態樣中，作為纖維化因子，例如，可列舉MCP-1(Monocyte Chemotactic Protein-1)。該等纖維化因子的產生阻礙，例如，亦可於嗜中性球等免疫細胞中產生。
進一步或別的實施態樣中，本揭露係關於用於血管新生阻礙中所使用的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於包含將有效量之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)投予至對象，對象之血管新生阻礙方法，或用於該方法中所使用的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於，包含有效量之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)，血管新生阻礙用的醫藥組成物。或者，本揭露係關於，血管新生阻礙用的醫藥的製造中IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於，包含混合IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)及藥學上容許的擔體的步驟，血管新生阻礙用的醫藥組成物的製造方法。
如本實施例可見的方式，活體外試驗中，除了活體內實驗所使用的抗IL-8抗體之外，不僅市售的抗IL-8抗體，即使使用IL-8受體的阻礙劑，亦可確認嗜中性球的移轉阻礙。由上述可知，本實施例的活體內模型的發現，可進行一般化、擴張，擴張至IL-8訊息阻礙劑全部，此為該領域業者理所當然所理解。
因此，進一步或別的實施態樣中，本揭露係關於用於免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤(某面向中，亦有可與移轉交換的情況)的抑制所使用之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於包含將有效量的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)投予至對象，對象之免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤的抑制方法，或用於該方法中所使用的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於，包含有效量之IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)，用於抑制免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤的醫藥組成物。或者，本揭露係關於，抑制免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤用的醫藥的製造中IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於，免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤的抑制中IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於，包含混合IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)及藥學上容許的擔體的步驟，免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部或其周邊環境的浸潤的抑制用的醫藥組成物的製造方法。 某實施態樣中，作為免疫細胞，例如，可列舉嗜中性球、巨噬細胞、單核球、助手T細胞、殺手T細胞、樹狀細胞、NK細胞等，雖不意圖限定，較佳為嗜中性球、巨噬細胞、單核球。免疫細胞對IL-8相關疾病的病變部的浸潤的情況，IL-8相關疾病可為上述之任一疾病，例如，可列舉子宮內膜異位症、子宮腺肌症、月經困難症、沾黏、纖維化疾病等，企圖含括該等IL-8相關疾病的病變部(疾病部位)或對其附近免疫細胞浸潤或移轉。再者，免疫細胞對IL-8相關疾病的周邊環境的浸潤的情況，例如為子宮內膜異位症，企圖含括對腹腔內或腹水的浸潤或移轉等，例如為肺纖維症，企圖含括對胸腔內或胸水的浸潤或移轉等，可為該領域業者所理解。
進一步或別的實施態樣中，本揭露係關於用於子宮內膜異位症或子宮腺肌症的病變部的芳香酶的產生阻礙所使用的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係關於包含將有效量的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)投予至對象，對象之芳香酶的產生阻礙方法，或用於該方法中所使用的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)。或者，本揭露係有關於包含有效量的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)，芳香酶產生阻礙用的醫藥組成物。或者，本揭露係關於芳香酶的產生阻礙用的醫藥製造中的IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於子宮內膜異位症或子宮腺肌症的病變部的芳香酶產生阻礙中IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)的使用。或者本揭露係關於包含混合IL-8訊息阻礙劑(例如，抗IL-8抗體)與藥學上容許的載劑的步驟，子宮內膜異位症或子宮腺肌症的病變部的芳香酶的產生阻礙用的醫藥組成物的製造方法。
任意組合本說明書所記載的一或複數的各種態樣的一部分或全部者，以技術上不與該領域業者的技術常識矛盾為限，該領域業者可理解亦包含於本揭露。
本說明書中所引用的所有先前技術文獻，參照該領域業者的技術常識併入本說明書。
本說明書中，「及/或」用語的意義，為成句「及/或」的前後用語的組合，可理解包含「及」與「或」為適宜組合的各種組合。
第1、第2、第3、第4等等的用語用於表現種種要素而使用的情況，應理解該等要素不可因該等用語而受限定。該等用語係用於區別1個要素與其他要素而使用，例如，第一要素記為第2要素，同樣地，第二要素記為第一要素，應理解為不超出本揭露的範圍。
本說明書中，「1個的(a)」、「1個的(an)」、及「其(該)」的單語，除非另有具體指示，以不與文章脈落矛盾為限，意指「至少1個」。
本說明書中所使用的用語，係用於說明特定的實施態樣所使用，不可理解為限定本發明或本揭露的意圖。以明示為不同定義為限，本說明書中所使用的用語(包含技術用語及科學用語)，與本揭露該領域業者所廣泛理解者為具有相同意義者，且不可解釋為理想化、或過度形式性的意義。
本說明書中所使用的用語「包含」，除了由文章脈絡上明顯理解為不同的情況之外，意指為存在所記述的事項(構件、步驟、要素、數字等)者，不排除存在其等以外的事項(構件、步驟、要素、數字等)。
本揭露的實施態樣雖有參照示意圖而說明的情況，亦有為了明確地說明而誇張地表現的情況。
本說明書所記載的數值，以不違反文章脈落為限，根據該領域業者的技術常識，亦可理解為具有一定幅度的值。例如「1mg」的記載，理解為「約1mg」的記載者，理解為包含一定的變動量者。再者，本說明書中，例如，記載為「1至5個」的情況，以不違反文章脈落為限，可理解為「1個、2個、3個、4個、5個」，個別具體地記載為個別值者。 實施例
[實施例1]為了改善血漿中滯留性的酸性pH條件中增大FcRn結合之新穎Fc區域改變體的製作 已知經攝入細胞內的IgG抗體，於胞內體(endosome)內的酸性pH條件下，經由與FcRn結合而回送至血漿中。因此，一般而言，IgG抗體，與未與FcRn結合的蛋白質相比，具有較長的血漿中半衰期。已知利用該性質，於抗體的Fc區域導入胺基酸改變，增大於酸性pH條件中對FcRn的結合能力(結合親和性)，使抗體的血漿中滯留性提升的方法。具體而言，已知經由M252Y/S254T/T256E(YTE)改變(J Biol Chem 2006 281: 23514-23524)或N428L/N434S(LS)改變(Nat Biotechnol, 2010 28: 157-159)、N434H改變(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2): 283-290)等胺基酸改變，增大於酸性pH條件中對FcRn的結合能力，使抗體的血漿中滯留性提升的方法。
另一方面，如上所述，亦已知經增大於酸性pH條件中對FcRn的結合性的Fc區域改變體，顯示對類風濕性因子(RF)的結合性(WO2013046704)。因此，以製作不顯示對類風濕性因子的結合，亦能夠改善血漿中滯留性的Fc區域改變體的為目標，實施以下方式的檢討。
(1-1)包含Fc區域新穎Fc區域改變體的製作 如以下方式製作作為經增大於酸性pH條件中對FcRn結合能力的Fc區域改變體之習知的改變之YTE、LS及N434H，與新發現之數個Fc區域改變體(F1847m、F1848m、F1886m、F1889m、F1927m、F1168m)。 以參考實施例1的方法製作在抗人類IL-6受體抗體之Fv4-IgG1的重鏈(VH3-IgG1m)的Fc區域，導入胺基酸改變的基因。使用該等重鏈，經由參考實施例2的方法，製作以下的抗體。 由VH3-IgG1m(序列編號: 2)為重鏈、VL3-CK(序列編號: 11)為輕鏈所形成的Fv4-IgG1， 由VH3-YTE(序列編號: 3)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-YTE， 由VH3-LS(序列編號: 4)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-LS， 由VH3-N434H(序列編號: 5)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-N434H， 由VH3-F1847m(序列編號: 6)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-F1847m， 由VH3-F1848m(序列編號: 7)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-F1848m， 由VH3-F1886m(序列編號: 8)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-F1886m， 由VH3-F1889m(序列編號: 9)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-F1889m， 由VH3-F1927m(序列編號: 10)為重鏈、VL3-CK為輕鏈所形成的Fv4-F1927m， 由VH3-F1168m(序列編號: 11)為重鏈、VL3-CK\為輕鏈所形成的Fv4-F1168m。
(1-2)對人類FcRn之結合的速度論的解析 包含有VH3-IgG1m或上述改變體作為重鏈，L(WT)(序列編號: 1)作為輕鏈的抗體，以參考實施例2所示方法製作，如下所述方式評價對人類FcRn的結合活性。 使用Biacore T100(GE Healthcare)，進行人類FcRn與各抗體的速度論的解析。於感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化蛋白質L (ACTIGEN)，使目的抗體被捕捉於該處。其次，注入FcRn稀釋液及運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體與人類FcRn相互作用。運行緩衝液係使用50 mM磷酸鈉、150 mM NaCl、0.05%(w/v) Tween20、pH6.0，FcRn的稀釋，係使用各自的緩衝液。感測晶片的再生係使用10 mM甘胺酸-HCl、pH1.5。測定皆於25℃實施。由測定所得之感測圖譜算出動力學參數之結合速度常數ka(1/Ms)，及解離速度常數kd(1/s)，且以其為基礎算出各抗體對於人類FcRn的KD(M)。各參數的算出係使用Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare)。 其結果示於表2。
[表2]
Figure 02_image003
[實施例2]包含酸性pH條件中增大FcRn結合的新穎Fc區域改變體的抗體的對類風濕性因子的結合性評價 抗醫藥品抗體(ADA)係影響及於治療用抗體的效果及藥物動態，由於有時亦帶來嚴重的副作用，因而限制了臨床上的治療用抗體的有用性及藥效ADA的產生。治療用抗體的免疫原性，雖受到多個要因的影響，效應T細胞抗原決定基的存在為其要因之一。此外，在治療用抗體的投予前的患者亦具有ADA(亦稱為「預先存在的ADA」(Pre-existing ADA))的存在，咸信具有同樣的問題。特別地，對於關節風濕(RA)等自體免疫疾病的患者之治療用抗體的情況，對於人類IgG的自體抗體之類風濕性因子(RF)可成為「Pre-existing ADA」的問題。最近，有報告指出具有N434H變異(Asn434His)的人源化抗CD4 IgG1抗體顯著地誘發類風濕性因子結合(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb; 89(2): 283-90)。經由詳細的研究，人類IgG1的N434H變異，與親代人類IgG1比較時，確認對於抗體的Fc區域的類風濕性因子的結合增大。
類風濕性因子係對於人類IgG的多株自體抗體，人類IgG中的該等抗原決定基雖因純株而不同，該等抗原決定基係有位於CH2/CH3界面區域中、及與FcRn結合抗原決定基可重複之CH3功能域中的方式。因此，對於FcRn的結合活性(結合親和性)增大的變異，具有增大對於類風濕性因子的特定純株的結合活性(結合親和性)的可能性。
實際上，酸性pH或中性pH中對於FcRn的結合性經增大的Fc，不限定為N434H改變，已知藉由其以外的多個胺基酸改變亦同樣增大對類風濕性因子的結合(WO2013/ 046704)。 另一方面，同樣的專利WO2013/046704之中，例示對FcRn的結合性不影響之對類風濕性因子的結合性選擇性抑制的數個胺基酸改變，其中顯示2個胺基酸變異的組合之Q438R/S440E、Q438R/S440D、Q438K/S440E或Q438K/S440D。此處，驗證對於此次新製作之在酸性pH條件中結合能力經增大之Fc，藉由導入Q438R/S440E是否能夠降低對於類風濕性因子的結合性。
(2-1)包含新穎Fc區域改變體的抗體的對類風濕性因子的結合試驗 對類風濕性因子的結合分析，係使用30名RA患者之個別的血清(Proteogenex)，經由在pH7.4之電化學發光(ECL)進行。混合經稀釋50倍的血清試料、經生物素標識的各試驗抗體(1μg/mL)、及經SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)標識的各試驗抗體(1μg/mL)，於室溫培養3小時。之後，將混合物添加至以鏈黴親和素(Streptavidin)被覆的MULTI-ARRAY 96孔盤(Meso Scale Discovery)，將此盤於室溫培養2小時後，洗淨。於各孔添加Read Buffer T (×4) (Meso Scale Discovery)後，立即將盤設置於SECTOR imager 2400 Reader(Meso Scale Discovery)，測定化學發光。
該試驗的結果示於圖1至圖10。具有天然人類IgG1的Fv4-IgG1(圖1)，顯示弱的類風濕性因子結合，相對於此既存的FcRn結合增大Fc區域改變體之Fv4-YTE(圖2)、F4-LS(圖3)、Fv4-N434H(圖4)之任一者，於複數的捐贈者中類風濕性因子結合為顯著地增大。另一方面，新穎的FcRn結合增大Fc區域改變體之Fv4-F1847m(圖5)、Fv4-F1848m(圖6)、Fv4-F1886m(圖7)、Fv4-F1889m(圖8)、Fv4-F1927m(圖9)、Fv4-F1168m(圖10)，任一者均顯示弱的類風濕性因子結合，表示經由FcRn結合增大改變可顯著地抑制類風濕性因子結合。 再者，圖11係顯示關於各自的改變體，30名的RA患者的血液中對類風濕性因子的結合性的平均值者。6種類的新穎的改變體之任一者，顯示比3種既存的改變體(YTE、LS、N434H)為更低的結合性，進一步地與天然型IgG1比較，顯示對類風濕性因子更低的結合性。由以上可知，關於關節風濕等自體免疫疾病，考慮對FcRn的結合能力經改善的治療用抗體的臨床開發的情況，既存的Fc區域改變體中所在意的相關於類風濕性因子的風險，於此次新穎製作的Fc區域改變體中受到抑制，咸信可更安全地使用。
[實施例3]酸性pH條件之FcRn結合經增大之新穎Fc區域改變體於食蟹獼猴的PK評價 實施例3中，使用包含經確認對類風濕性因子的結合受到抑制的新穎Fc區域改變體的抗體，依以下的方法評價食蟹獼猴之血漿中滯留性的改善效果。
(3-1)包含新穎Fc區域改變體的抗體的製作 製作以下的抗人類IgE抗體。 由OHBH-IgG1(序列編號: 12)為重鏈、OHBL-CK(序列編號: 13)為輕鏈所形成的OHB-IgG1， 由OHBH-LS(序列編號: 14)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-LS， 由OHBH-N434A(序列編號: 15)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-N434A， 由OHBH-F1847m(序列編號: 16)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-F1847m， 由OHBH-F1848m(序列編號: 17)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-F1848m， 由OHBH-F1886m(序列編號: 18)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-F1886m， 由OHBH-F1889m(序列編號: 19)為重鏈、OHBL-CK為輕鏈所形成的OHB-F1889m， 由OHBH-F1927m(序列編號: 20)為重鏈、OHBL-CK(序列編號: 13)為輕鏈所形成的OHB-F1927m。
(3-2)包含新穎Fc區域改變體的抗體的猴PK試驗 評價對食蟹獼猴投予人類IgE抗體後之血漿中抗人類IgE抗體的體內動態。抗人類IgE抗體的溶液以2mg/kg單次靜脈內投予。於投予後5分鐘、(2小時)、7小時、1日、2日、3日、(4日)、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日進行採血。所採取的血液立即於4℃、以15,000rpm離心分離5分鐘，獲得血漿。經分離的血漿，至實施測定為止，保存於經設定為-80℃以下的冷凍庫。作為抗人類IgE抗體，係使用OHB-IgG1、OHB-LS、OHB-N434A、OHB-F1847m、OHB-F1848m、OHB-F1886m、OHB-F1889m、OHB-F1927m的8種類。
(3-3)經由ELISA法之血漿中抗人類IgE抗體的濃度測定 食蟹獼猴血漿中的抗人類IgE抗體濃度係藉由進行ELISA法測定。首先，將抗人類IgG kappa鏈抗體(Antibody Solution)分注於Nunc-Immuno Plate, Maxi Soup (Nalge nunc International)，於4℃靜置1夜製作抗人類IgG kappa鏈抗體固相化盤。作為血漿中濃度，調製640、320、160、80、40、20、10 ng/mL的檢測線試料與100倍以上稀釋的食蟹獼猴血漿測定試料。該等檢測線試料及血漿測定試料係以1 μg/mL的濃度添加食蟹獼猴IgE(公司內調製品)的方式製作。之後，分注於抗人類IgG kappa鏈抗體固相化盤，於室溫靜置2小時。之後分注HRP-抗人類IgG gamma鏈抗體(Southern Biotech)，於室溫靜置1小時。之後，使用TMB Chromogen Solution (Life Technologies)作為基質進行呈色反應，以1N-硫酸(Wako)停止反應後，於微量盤分析儀(microplate reader)測定450nm的吸光度。猴血漿中抗人類IgE抗體濃度係由檢測線的吸光度使用軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算出。所測定的猴血漿中抗人類IgE抗體的濃度推移示於圖12。再者，由所測定的猴血漿中抗人類IgE抗體的濃度推移，經由使用Phoenix WinNonlin Ver.6.2(Pharsight Corporation)的動量解析算出消失廓清率。所算出的藥物動態學的參數示於表3。血漿中抗投予檢體抗體係顯示陽性的個體，由猴血漿中抗人類IgE抗體的濃度推移及廓清率的計算中排除。
[表3] 抗人類IgE抗體投予後之各投予檢體的消失廓清率。
檢體名 消失廓清率(mL/日/kg)
OHB-IgG1 9.33
OHB-F1847m 2.83
OHB-F1848m 4.02
OHB-F1886m 1.92
OHB-F1889m 2.39
OHB-F1927m 1.51
OHB-LS 1.80
OHB-N434A 4.36
(3-4)經由電化學發光法之血漿中抗投予檢體抗體的測定 猴的血漿中抗投予檢體抗體係以電化學發光法測定。等量混合以SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery)釕化投予檢體、以EZ-Link Micro Sulfo-NHS-Biotinylation Kit(Pierce)生物素化的投予檢體及食蟹獼猴血漿測定試料，於4℃靜置1夜。於MULTI ARRAY 96-孔Streptavidin Gold Plate(Meso Scale Discovery)添加試料後，於室溫使其反應2小時，洗淨後，分注Read Buffer T (X4)(Meso Scale Discovery)，立即以SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)進行測定。
結果，新穎Fc區域改變體之任一者，與天然型IgG1的情況比較時，確認大幅地血漿中滯留性的改善。
(3-5)Fc區域改變體的小鼠PK試驗 作為酸性pH中FcRn結合增大用的Fc區域改變體，為了比較專利WO2013/046704所記載的Fc區域改變體之F1718，與此次新穎發現之Fc區域改變體之F1848m，實施以下方式的實驗。
以參考實施例1的方法製作抗人類IL-6受體抗體之Fv4-IgG1的重鏈(VH3-IgG1)的Fc區域導入胺基酸改變的基因。使用該等重鏈，經由參考實施例2的方法，製作以下的抗體。 包含VH3-IgG1為重鏈、VL3-CK為輕鏈的Fv4-IgG1， 包含VH3-F1718(序列編號: 21)為重鏈、VL3-CK為輕鏈的Fv4-F1718。
將上述抗人類IL-6受體抗體以1 mg/kg單次投予至人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg Line 32+/+小鼠，Jackson Laboratories，Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)的尾靜脈。於抗人類IL-6受體抗體的投予後15分鐘、7小時、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日的時點進行採血。所採取的血液立即藉由於4℃、以15,000rpm離心分離15分鐘，獲得血漿。經分離的血漿，直到實施測定為止保存於經設定為-20℃以下的冷凍庫。
(3-6)經由ELISA法之血漿中抗人類IL-6受體抗體的濃度測定 小鼠血漿中的抗IL-6受體抗體的濃度係以ELISA法測定。首先，於Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International)分注Anti-Human IgG (gamma-chain specific)F(ab’)2 fragment of Antibody (SIGMA)，藉由於4℃靜置一夜而製作抗人類IgG固相化盤。調製包含血漿中濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL的抗人類IL-6受體抗體的檢測線試料及經稀釋100倍以上的小鼠血漿測定試料。將該等檢測線試料及血漿測定試料100μL之經添加20 ng/mL的可溶型人類IL-6受體200μL的混合液於室溫靜置1小時。之後，該混合液分注於Anti-Human IgG固相化盤的各孔且進一步使其於室溫靜置1小時。之後，於室溫與Biotinylated Anti-Human IL-6 R Antibody (R&D)反應1小時，進一步於室溫與Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies)反應之反應液的呈色，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratoried)作為基質進行。經藉由添加1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止的各孔的反應液450nm的吸光度，以微量盤分析儀測定。小鼠血漿中的抗體濃度由檢測線的吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算出。
結果示於圖13。WO2013/046704中記載，酸性pH之FcRn結合增大用的Fc區域改變體之F1718，未顯示抗體PK的延長效果，顯示與天然型IgG1的情況為同等的血漿中滯留性。 此處，WO2013/046704記載的F1718，係於Fc區域導入N434Y/Y436V/Q438R/S440E之四個位置的變異。另一方面，此次新發現的F1848m，係導入N434A/Y436V/Q438R/S440E之四個位置的變異。該二種類的導入Fc的胺基酸變異不同只在於，EU編號434號導入的胺基酸變異，F1718為Y(酪胺酸)，F1848m為A(丙胺酸)之點而已。實施例(3-2)中，F1848m與天然型IgG1的情況相比，確認血漿中滯留性的提升，而另一方面F1718未確認血漿中滯留性的提升。由此可知，雖不為特別地限定，作為用於血漿中滯留性的提升所使用的胺基酸變異，於第434號導入胺基酸變異，顯示較佳為A(丙胺酸)。
[實施例4]人源化抗人類IL-8抗體的製作 (4-1)人源化抗人類IL-8抗體hWS-4的製作 美國專利號US6245894(WO1996/002576)中所揭示之人源化抗IL-8抗體，係經由與人類IL-8(以下，亦表示為hIL-8)結合，阻斷其生理作用。人源化抗IL-8抗體，可組合美國專利號US6245894所揭示的重鏈及輕鏈的可變區域序列，以及任意的人類抗體的恆定區域序列而作成。作為人類抗體的恆定區域序列，雖不特別限定，可使用天然型人類IgG1序列或天然型人類IgG4序列作為重鏈恆定區域，天然型人類Kappa序列作為輕鏈恆定區域序列。 此處，美國專利號US6245894中所揭示的人源化抗IL-8抗體中，組合重鏈可變區域RVHg與作為重鏈恆定區域的天然型人類抗IgG1序列的hWS4H-IgG1(序列編號: 39)的基因，以參考實施例1的方法作成。進一步地，組合輕鏈可變區域RVLa與作為輕鏈恆定區域的天然型人類Kappa序列的hWS4L-k0MT(序列編號: 40)的基因，以參考實施例1的方法作成。組合上述的重鏈及輕鏈所製作的抗體，作為人源化WS-4抗體(以下，稱為hWS-4)。
(4-2)人源化抗人類IL-8抗體Hr9的製作 使用與hWS-4所使用的FR為不同的人類共通框架序列(human consensus framework)，製作新的人源化抗體。 具體而言，使用VH3-23及VH3-64的雜合序列作為重鏈的FR1，可見於VH3-15或VH3-49等的序列作為FR2，可見於VH3-72的序列(惟，Kabat編號82a除外)作為FR3，可見於JH1等的序列作為FR4，將其等與hWS-4重鏈的CDR序列連結，製作新穎的人源化抗體的重鏈之Hr9-IgG1(序列編號: 41)。 其次，製作具有hWS4H-IgG1作為重鏈，hWS4L-k0MT作為輕鏈的hWS-4，以及具有Hr9-IgG1作為重鏈，hWS4L-k0MT作為輕鏈的Hr9的2種抗體。又，本揭露中，無特別載明輕鏈的情況中，Hr9(其重鏈可變區域的序列示於序列編號: 33)亦標記為Hr9/hWS4L。抗體係使用FreeStyle 293細胞(Invitrogen)，根據製品所附的方案(protocol)使其表現。由培養上清的抗體精製係以參考實施例2的方法進行。其結果，取得示於表4的量的抗體。驚訝地，Hr9的表現量，與hWS-4的表現量相比為約8倍。
[表4]
   每1mL培養基的抗體收量(μg)
hWS-4 6.4
Hr9 50
(4-3)hWS-4及Hr9的人類IL-8結合活性 hWS-4及Hr9對人類IL-8的結合親和性，係使用Biacore T200 (GE Healthcare)如下述方式測定。 運行緩衝液係使用0.05% tween20、20mM ACES、150mM NaCl (pH 7.4)的組成者。 感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化蛋白質A/G(PEIRCE)，於該處捕捉目的抗體。其次，注入人類IL-8稀釋液與運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體與人類IL-8相互作用。又，運行緩衝液係使用上述組成的溶液，人類IL-8的稀釋亦使用該緩衝液。感測晶片的再生係使用10 mM甘胺酸-HCl、pH1.5。測定皆於37℃實施。由測定所得感測圖譜所算出的動力參數之結合速度常數kon(1/Ms)及解離速度常數koff(1/s)，計算出各抗體對於人類IL-8的KD(M)。各參數的計算係使用Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare)。
[表5]
抗體名 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
hWS-4 9.74E+05 2.03E-04 2.09E-10
Hr9 1.11E+06 2.17E-04 1.95E-10
抗體醫藥品的開發中，抗體分子的產生量為重要的因子，一般期望高產生量。經由上述的檢討，與hWS-4的HVR序列組合，選擇更適當的源自人類共通框架的序列，維持對人類IL-8的結合親和性且可獲得產生量經改善的Hr9為特別值得注意的點。
[實施例5]具有pH依賴性的IL-8結合能力的抗體的取得 (5-1)pH依賴性賦予用的Hr9改變抗體的製作 以對於實施例4所製得之Hr9賦予pH依賴性的IL-8結合能力為目的，進行研究。 雖不受特定的理論所拘束，對IL-8具有pH依賴性的結合能力的抗體，咸信於活體內顯示其次所述方式的舉動。對活體投予該抗體，於維持中性pH的環境(例如，血漿中)中，對IL-8為強力結合，可阻斷其功能。該方式之IL-8與抗體的複合體的一部分，藉由與細胞膜之非特異性的相互作用(胞飲作用(pinocytosis))攝入細胞(以下，稱為非特異性攝入)。胞內體內的酸性pH條件下，由於前述抗體對IL-8的結合親和性弱，前述抗體解離IL-8。之後，經解離IL-8的前述抗體，經由FcRn可回送至細胞外。依此方式回送至細胞外(血漿中)的前述抗體，再度與另外的IL-8結合，可阻斷其功能。對IL-8具有pH依賴性的結合能力的抗體，亦藉由上述方式的機制，咸信可對IL-8進行複數次結合。 另一方面，不具有前述抗體方式之性質的抗體的情況，1分子的抗體僅可中和抗原1次，無法複數次中和抗原。通常，由於IgG抗體具有2個Fab，1個抗體分子可中和2分子的IL-8。另一方面，可複數次結合IL-8的抗體，以滯留於活體內為限，可無數次的結合IL-8。例如，自投予至消失為止的期間，經10次攝入細胞內的pH依賴性的IL-8結合抗體，1分子最多可中和20分子的IL-8。因此，可複數次結合IL-8的抗體，具有即使為更少量的抗體，可中和多數的IL-8的有利點。於別的觀點中，可複數次結合IL-8的抗體，以相同量的抗體投予的情況，具有能夠維持歷經更長期間能夠中和IL-8的狀態的有利點。再者，由進一步的別的觀點，可複數次結合IL-8的抗體，以相同量的抗體投予的情況，具有可更強力的阻斷IL-8的生物學活性的有利點。 為了實現該等有利點，以製造可複數次結合IL-8的抗體為目的，對於Hr9-IgG1及WS4L-k0MT的可變區域，導入以組胺酸為主的胺基酸變異。具體而言，以參考實施例1及2的方法製作示於表6的改變體。 又，表6所示「Y97H」方式的標記，係表示經由Kabat編號所定義的變異導入位置，與變異導入前的胺基酸、變異導入後的胺基酸。具體而言，標記為「Y97H」的情況，表示Kabat編號第97號的胺基酸殘基，由Y(酪胺酸)置換為H(組胺酸)。進一步地，經組合導入複數的胺基酸置換的情況，以如「N50H/L54H」的方式記載。
[表6]
抗體名 經導入重鏈的變異 經導入輕鏈的變異
Hr9/WS4L 無 無
Hr9/L16 無 L54H
H89/WS4L Y97H 無
H89/L12 Y97H N50H
H89/L16 Y97H L54H
(5-2)pH依賴性的IL-8結合能力 實施例5-1所作成的抗體的IL-8結合親和性，係使用Biacore T200(GE Healthcare)如以下的方式測定。運行緩衝液係使用以下的2種。 ‧0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 7.4 ‧0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 5.8 感測晶片CM4 (GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化蛋白質A/G(PEIRCE)，於該處捕捉目的抗體。其次，注入人類IL-8稀釋液與運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體與人類IL-8相互作用。又，運行緩衝液係使用上述的任一者，人類IL-8的稀釋亦使用個別的緩衝液。感測晶片的再生係使用10 mM甘胺酸-HCl、pH1.5。測定皆於37℃實施。由測定所得感測圖譜所算出的動力參數之結合速度常數kon(1/Ms)及解離速度常數koff(1/s)，算出各抗體對於人類IL-8的KD(M)。各參數的算出係使用Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare)。 結果示於表7。首先，輕鏈包含L54H改變的Hr9/L16，於中性pH(pH 7.4)的人類IL-8結合親和性比Hr9稍微增強，而在酸性pH(pH 5.8)的人類IL-8結合親和性則降低。另一方面，重鏈包含Y97H改變的H89與各種輕鏈組合的抗IL-8抗體(H89/WS4L、H89/L12、及H89/L16)之任一者，於酸性pH之人類IL-8結合親和性為降低之同時，於中性pH之人類IL-8結合親和性亦降低。
[表7]
Figure 02_image005
(5-3)pH依賴性賦予用的進一步改變抗體的製作與評價 此處接著，將5-2所見到的有希望的改變的組合，進行新的胺基酸變異的探索，其結果，可見到以下的組合。
[表7-2]
抗體名 經導入重鏈的變異 經導入輕鏈的變異
H89/L63 Y97H N50H/L54H
H89/L118 Y97H N50H/L54H/Q89K
該等改變體以參考實施例1及2的方法作成，以與實施例5-2同樣的方法評價對人類IL-8的結合親和性。 其結果合併記載於表7。具有H89-IgG1(序列編號: 42)作為重鏈，L63-k0MT(序列編號: 43)作為輕鏈的H89/L63，於中性pH(pH 7.4)之人類IL-8結合親和性與Hr9幾乎同等，於酸性pH(pH 5.8)之人類IL-8結合親和性則降低。具體而言，H89/L63於pH 5.8之koff(解離速度常數)及KD(解離常數)二者，成為比Hr9為更大。此意味於胞內體內的酸性pH條件下，H89/L63具有容易解離人類IL-8的性質。 進一步地，驚訝地，具有H89-IgG1作為重鏈、L118-k0MT (序列編號: 44)作為輕鏈之H89/L118，於中性pH條件之人類IL-8結合親和性(KD)比Hr9更為增強，相對於此，於酸性pH條件之人類IL-8結合親和性(KD)則比Hr9更為減弱。雖不特別限定，一般而言，可複數次與抗原結合之抗體作為醫藥品使用之際，pH依賴性的抗原結合抗體，較佳係於中性pH條件下(例如，血漿中)可強力地中和抗原的方式，具有強的結合親和性(KD為小)。另一方面，於酸性pH條件下(例如，胞內體內)，抗原可快速地解離的方式，較佳為解離速度常數(koff)為大，及/或具有弱的結合親和性(KD為大)。H89/L118，於該等中性pH與酸性pH之任一者中，獲得與Hr9比較為較佳性質。 亦即，對於Hr9的重鏈之Y97H，對於輕鏈之N50H/L54H/ Q89K可觀察為有用的胺基酸改變。雖不特別限定，藉由將由該等之中所選擇的胺基酸改變以單獨、或複數組合的方式導入，顯示可製作做為醫藥品為優異的pH依賴性的IL-8結合抗體。 雖不欲受特定的理論拘束，利用pH依賴性的抗原結合抗體作為醫藥品之際地重點，咸信為經投予至活體內的抗體，於胞內體內是否能夠與抗原解離。因此，於酸性pH條件下，充分地結合為弱的(解離常數；KD為大)，或充分地解離速度為快(解離速度常數；koff為大)，咸信為重要的。此處，經由Biacore所獲得H89/L118的KD或koff，於活體內的胞內體內解離抗原是否為充分者，以下文所示的實驗驗證。
[實施例6]小鼠PK試驗用之高親和性抗體的製作 經由抗體，作為小鼠中對於人類IL-8的消失速度的效果地確認方法，雖不特別限定，例如，以抗體與人類IL-8混合的狀態投予至小鼠，之後比較由小鼠的血漿中之人類IL-8地消失速度的方法。 此處，使用於小鼠的PK試驗用的參照抗體，於中性pH及酸性pH條件下，期望任一者均具有充分地強的結合親和性。此處，對於Hr9賦予高親和性的改變的研究結果，創製具有H998-IgG1(序列編號: 45)作為重鏈，L63-k0MT作為輕鏈的H998/L63。 使用H998/L63，以與實施例5-2同樣的方法評價人類IL-8結合親和性。作為結果所得感測圖譜示於圖14。 H998/L63，於中性pH及酸性pH之任一條件中，解離速度顯著延遲，顯示具有比Hr9為更強的IL-8結合親和性。惟，由於Biacore裝置上的限制，如此的解離速度緩慢的蛋白質-蛋白質間相互作用的情況，已知無法正確地算出解離速度常數(koff)、解離常數(KD)等解析值。於H998/L63的情況，由於無法取得正確的解析值，此處未顯示解析值。然而，由該實驗的結果可知，H998/L63於中性及酸性之任一者的pH中皆具有非常強的結合親和性，確認為適用於小鼠PK試驗中作為比較對象使用之抗體。
[實施例7]使用pH依賴性的IL-8結合抗體H89/L118的小鼠PK試驗 (7-1)使用H89/L118的小鼠PK試驗 使用實施例5作成之H89/L118，與實施例6作成之H998/L63，實施活體內的人類IL-8消失速度的評價。 對小鼠(C57BL/6J, Charles river)，同時地投予人類IL-8與抗人類IL-8抗體後，評價人類IL-8的體內動態。人類IL-8、抗人類IL-8抗體的混合溶液(各自為10μg/mL, 200μg/mL)以10 mL/kg單次投予至尾靜脈。此時，由於相對於人類IL-8、抗人類IL-8抗體為充分量過剩存在，咸信人類IL-8幾乎全部與抗體結合。於投予5分鐘後、2小時後、4小時後、7小時後、1日後、2日後、3日後、7日後、14日後、21日後、28日後採取血液。所採取的血液立即於4℃、以15,000rpm離心分離15分鐘，獲得血漿。經分離的血漿，直到實施測定為止保存於設定為-20℃以下的冷凍庫。
(7-2)血漿中的人類IL-8濃度的測定 小鼠血漿中的人類IL-8濃度以電化學發光法測定。首先，將具有小鼠IgG的恆定區域的抗人類IL-8抗體(公司內調製品)分注於MULTI-ARRAY 96-孔盤(Meso Scale Discovery)，於室溫靜置1小時後，藉由使用含有5%BSA(w/v)地PBS-Tween溶液於室溫阻斷(blocking)2小時作成抗人類IL-8抗體固相化盤。調製血漿中濃度包含275、91.7、30.6、10.2、3.40、1.13、0.377 ng/mL的人類IL-8的檢測線試料與經稀釋25倍以上的小鼠血漿測定試料，與hWS-4混合、於37℃使其反應1夜後，於抗人類IL-8抗體固相化盤的各孔分注50μL，於室溫攪拌1小時。調製使hWS-4的終濃度成為25 μg/mL。之後，於室溫使其與Biotin Mouse Anti-Human Ig k Light Chain (BD Pharmingen)反應1小時，進一步地於室溫使其與SULFO-TAG Labeled Steprtavidin (Meso Scale Discovery)反應1小時，分注Read Buffer T (×1)(Meso Scale Discovery)，即刻於SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)進行測定。人類IL-8濃度係由檢測線的回應(response)使用解析軟體SOFT Max PRO (Molecular Devices)算出。 作為所得結果，血漿中人類IL-8濃度的數據示於圖15，而由小鼠血漿中的人類IL-8廓清率(CL)的數值示於表8。
[表8]
   人類IL-8 CL (mL/d/kg)
   H998/L63 H89/L118
#1 21.4 472.2
#2 27.5 447.2
#3 24.7 476.0
平均(N=3) 24.5 465.1
標準偏差 3.0 15.6
由圖15清楚可知，與H998/L63同時投予的人類IL-8相比，與H89/L118同時投予的人類IL-8，顯示由血漿中的消失顯著為快。再者，由自小鼠血漿中的人類IL-8消失速度定量地表示的CL數值，H89/L118與H998/L63比較，顯示人類IL-8的消失速度增加19倍左右。 雖不欲受特定的理論拘束，由此次所得數據，亦可能考察為如下所述者。與抗體同時投予的人類IL-8，於血漿中大部分與抗體結合，以複合體狀態存在。與H998/L63結合的人類IL-8，即使於酸性pH條件下之胞內體內，經由強的結合親和性而以與抗體結合的狀態存在。之後H998/L63，維持與人類IL-8形成的複合體的狀態經由FcRn直接回送至血漿中，所以此時人類IL-8同時地回送至血漿中。因此，經攝入至細胞內的人類IL-8中的大部分，再次回送至血漿中。亦即，人類IL-8自血漿中的消失速度，經由與H998/L63同時投予，顯著降低。另一方面，如先前所述，以與pH依賴性的IL-8結合抗體之H89/L118形成複合體的狀態、攝入細胞內的人類IL-8，於胞內體內的酸性pH條件下，自抗體解離。自抗體解離的人類IL-8，移行至溶酶體而分解。因此，pH依賴性的IL-8結合抗體，相較於如H998/L63般、與酸性pH及中性pH中皆具有強的結合親和性的IL-8結合抗體，顯著地可加快人類IL-8的消失。
(7-3)使H89/L118的投予量增加的小鼠PK試驗 其次，驗證變化H89/L118的投予量的情況的影響的實驗，如以下的方式實施。對小鼠(C57BL/6J, Charles river)，同時地投予人類IL-8與H89/L118(2 mg/kg或8 mg/kg)後，評價人類IL-8的體內動態。人類IL-8(2.5 μg/mL)、抗人類IL-8抗體(200 μg/mL或800 μg/mL)的混合溶液以10 mL/kg單次投予至尾靜脈。此時，由於相對於人類IL-8、抗人類IL-8抗體為充分量過剩存在，咸信人類IL-8幾乎全部與抗體結合。於投予5分鐘後、7小時後、1日後、2日後、3日後、7日後、14日後、21日後、28日後採取血液。所採取的血液立即於4℃、以15,000rpm離心分離15分鐘，獲得血漿。經分離的血漿，直到實施測定為止保存於設定為-20℃以下的冷凍庫。 小鼠血漿中的人類IL-8濃度測定，係以與實施例7-2同樣的方法實施。作為所得結果，血漿中人類IL-8濃度的數據示於圖16，而自小鼠血漿中的人類IL-8廓清率(CL)的數值示於表9。
[表9]
   人類IL-8 CL (mL/d/kg)
抗體名 H89/L118 H89/L118
投予量 2 mg/kg 8 mg/kg
#1 181.2 93.0
#2 237 101.6
#3 247 114.5
平均(N=3) 221.8 103.0
標準偏差 35.6 10.8
作為結果，與以2 mg/kg投予H89/L118之群相比，投予8 mg/kg的抗體之群，確認人類IL-8的消失速度延遲2倍左右。 以下，雖不意圖為理論所拘束，記述推察造成前述結果的可能性之重要因素之一的內容。 由胞內體內經由FcRn回送至血漿中的抗體中，較佳為人類IL-8結合者的比例為低。另一方面，著眼於存在於胞內體內的人類IL-8，期望該等為不與抗體結合的游離型的比例高。與不具有pH依賴性的IL-8結合能力的抗體一起投予的情況，咸信於胞內體內，大部分的(接近100%)人類IL-8以與抗體形成複合體的狀態存在，咸信游離型少(接近0%)。另一方面，與pH依賴性的IL-8結合抗體(例如，H89/L118)一起投予的情況，於胞內體內，某程度比例的人類IL-8以游離型存在。此時游離型的比例，雖為推測性的，可能為以下的方式所理解。 [胞內體內的游離型人類IL-8的比例(%)] = [胞內體內游離型人類IL-8濃度]÷[胞內體內的全部人類IL-8濃度]×100 依上述方式所理解，胞內體內的游離型人類IL-8的比例，期望為更高，例如20%比0%為佳，40%比20%為佳，60%比40%為佳，80%比60%為佳，100%比80%為佳。 如上述之胞內體內游離型人類IL-8的比例，與酸性pH之對於人類IL-8的結合親和性(KD)及/或解離速度常數(koff)有相關是適當合理的考慮。亦即，酸性pH之對人類IL-8的結合親和性越弱，及/或解離速度越快，胞內體內游離型人類IL-8的比例增加。然而，於胞內體內游離型人類IL-8的比例已成為接近100%的pH依賴性的IL-8結合抗體中，其等以上之酸性pH之結合親和性若，及/或解離速度快，未必會使游離型人類IL-8的比例有效果的增加。例如，游離型人類IL-8的比例，即使由99.9%的狀態改善為99.99%，可容易理解該改善的程度不一定為顯著者。 再者，就一般性的化學平衡理論原則，抗IL-8抗體與人類IL-8共存，於其等的結合反應與解離反應達到平衡的情況，游離型人類IL-8的比例，可由抗體濃度與抗原濃度、解離常數(KD)3者無疑義的決定。此處，抗體濃度高的情況、抗原濃度高的情況、或解離常數(KD)小的情況，複合體的形成變容易，游離型人類IL-8的比例降低。另一方面，抗體濃度低的情況、抗原濃度低的情況、或解離常數(KD)大的情況，複合體的形成變困難，游離型人類IL-8的比例增加。 此處，於此次的試驗中，將H89/L118投予8 mg/kg的情況之人類IL-8的消失速度，與投予2 mg/kg的抗體的情況相比變延遲。此亦即顯示，胞內體內，投予8 mg/kg抗體的情況之游離型人類IL-8的比例，與投予2 mg/kg抗體的情況相比為降低。其理由推測為藉由使抗體的投予量增加4倍，胞內體內的抗體濃度增加，胞內體內的人類IL-8與抗體的複合體的形成變容易。亦即，咸信於在使抗體的投予量增加的投予群，由於胞內體內的游離型人類IL-8的比例降低，人類IL-8的消失速度降低。再者，於8 mg/kg的抗體投予時，H89/L118的酸性pH條件下的解離常數(KD)的大小，對於為了使游離型人類IL-8接近於100%而言為不充分。換言之，酸性pH條件下，只要是具有更大解離常數(KD)(結合更弱)的抗體，即使投予8 mg/kg的情況，咸信實現游離型IL-8的比例接近100%，而與投予2 mg/kg的抗體的情況顯示同等的人類IL-8消失速度。 由上述可知，目的之pH依賴性的IL-8結合抗體，為了確認是否可達成上述方式之游離型人類IL-8的比例接近100%，雖不特別限定，可藉由檢驗是否有使活體內的抗原消失效果的程度上升的餘地。例如，比較使用H89/L118以上的酸性pH的結合親和性弱，及/或酸性pH的解離速度快的新的pH依賴性的IL-8抗體時的人類IL-8消失速度，與使用H89/L118時的IL-8消失速度的方法。前述之新的pH依賴性的IL-8抗體，顯示與H89/L118為同等的IL-8消失速度的情況，H89/L118的酸性pH之結合親和性及/或解離速度，由於胞內體內的游離型人類IL-8的比例已接近100%而可謂顯示為具有充分的程度。另一方面，前述新的pH依賴性的IL-8抗體，顯示更高的人類IL-8消失速度的情況，H89/L118的酸性pH之結合親和性及/或解離速度，可謂顯示具有改善的餘地。
[實施例8]pH依賴性的IL-8抗體H553/L118的製作及評價 (8-1)具有pH依賴性的IL-8結合能力的新的H553/L118的製作 此處，再次嘗試製作經由H89/L118，於酸性pH條件下之減弱人類IL-8結合親和性，及/或加速解離速度的抗體。 以H89/L118為基礎，以組胺酸為主而導入胺基酸改變，以與實施例5同樣的方法製作示於表10的改變抗體。再者，以與實施例5-2同樣的方法，測定該等抗體的人類IL-8結合親和性。 結果的一部分示於表10。具有H553-IgG1(序列編號: 46)為重鏈，L118-k0MT為輕鏈的H553/L118，與具有H496-IgG1(序列編號: 57)為重鏈，L118-k0MT為輕鏈的H496/L118，顯示比H89/L118更為增大的pH依賴性。
[表10]
Figure 02_image007
此處，所取得的H553/L118，係對於H89/L118的重鏈導入Y55H及R57P的2種類胺基酸改變。另一方面，對於H89/L118的重鏈僅導入R57P的H496/L118，與H89/L118比較時，則中性pH的人類IL-8結合親和性雖增強，酸性pH的人類IL-8結合親和性則幾乎無變化。亦即，於H89/L118經導入R57P改變，酸性pH的人類IL-8結合親和性無變化，僅有中性pH的結合親和性增強的改變。進一步地，對H496/L118的重鏈經導入Y55H改變的H553/L118，與H89/L118比較時，則中性pH的結合親和性係維持或稍微增強，但酸性pH的結合親和性則降低。亦即，對H89/L118導入組合Y55H及R57P之2種類胺基酸改變，可更為增強對中性pH的結合親和性係維持或稍微增強，酸性pH的結合親和性降低的性質。
(8-2)使用H553/L118的小鼠PK試驗 使用H553/L118，以與實施例7-2同樣的方法實施小鼠中人類IL-8消失速度的評價。作為所得結果，血漿中人類IL-8的數據示於圖17，再者，自小鼠血漿中的人類IL-8廓清率(CL)的數值示於表11。
[表11]
   人類IL-8廓清率(CL)
抗體名 H89/L118 H89/L118 H553/L118 H553/L118
抗體投予量 2 mg/kg 8 mg/kg 2 mg/kg 8 mg/kg
#1 181.2 93.0 250 256.6
#2 237 101.6 245 248.4
#3 247 114.5 249 244.1
平均(N=3) 221.8 103.0 248 249.7
標準偏差 35.6 10.8 3 6.4
作為結果，投予2 mg/kg的抗體的群比較時，雖未觀察到H553/L118與H89/L118之間的大差異，但比較投予8 mg/kg的抗體的群時，與H89/L118相比，確認H553/L118的人類IL-8的消失為快2.5倍左右。由別的觀點而言，H553/L118於2 mg/kg與8 mg/kg的比較中，未觀察到人類IL-8消失速度的差異，未觀察到如同於H89/L118所觀察到之使抗體的投予量增加時的抗原消失速度的降低。 雖不特別限定，得到該等結果的理由之一，可能考察係如下述者。 H553/L118，投予2 mg/kg的抗體的情況與投予8 mg/kg的情況，顯示同等的人類IL-8消失速度。此係由於H553/L118於酸性pH之IL-8結合為充分的弱，即使於8 mg/kg投予的條件，顯示胞內體內的游離型IL-8的比例達成接近100%的程度。亦即，H89/L118於2 mg/kg左右的用量中，能夠達成最大限度的人類IL-8消失速度，但於8 mg/kg左右的高用量時，顯示其效果減弱的可能性。另一方面，H553/L118即使於8 mg/kg左右的高用量，亦能夠達成最大限度的人類IL-8消失效果。
(8-3)使用H553/L118的安定性評價 H553/L118顯示為於小鼠中顯著地比H89/L118更快使人類IL-8消失的抗體。另一方面，為了維持該抗體於活體內歷經長期間的人類IL-8的阻礙效果，投予的抗體於存在於活體內(例如，血漿中)的期間中，保持安定的IL-8中和活性(該抗體之IL-8中和活性的安定性)亦為重要的。此處，以示於以下的方法，評價該等抗體之小鼠血漿中的安定性。 小鼠血漿係由C57BL/6J(Charles river)的血液以該領域業者習知的方法採取。對小鼠血漿800μL，添加200 mM PBS (Sigma, P4417)200 μL成為1 mL。再者，作為防腐劑以成為終濃度0.1%的方式添加疊氮化鈉。進一步地，以成為終濃度0.2 mg/mL的方式將各抗體(Hr9、H89/L118、H553/L118)，添加至上述的小鼠血漿。此時點採取一部分，作為起始樣品。其餘的樣品於保管於40℃。自保管開始經過1週間及2週間的時點，分別採取一部分，作為1週間保存樣品及2週間保存樣品。又，全部的樣品至各分析為止於-80℃凍結保管。 其次如下述方式進行小鼠血漿中所包含之抗IL-8抗體對人類IL-8的中和活性的評價。 作為人類IL-8受體，已知CXCR1及CXCR2。PathHunter(r) CHO-K1 CXCR2 β-Arrestin Cell Line(DiscoveRx公司，Cat.# 93-0202C2)細胞是表現人類CXCR2、經由人類IL-8之訊息傳達時呈現化學發光的方式，由人工作成的細胞株。雖不特別限定，使用該細胞，可評價抗人類IL-8抗體所具有之對人類IL-8的中和活性。首先，於該細胞的培養液中，添加人類IL-8，依賴於所添加的人類IL-8的濃度，呈現某種程度的化學發光。此處，人類IL-8與抗人類IL-8抗體合併添加於培養液中的情況，經由抗人類IL-8抗體與人類IL-8結合，可阻斷人類IL-8的訊息傳達。作為其結果，藉由添加人類IL-8所引起的化學發光係經由抗人類IL-8抗體所阻斷，與不添加抗體的情況相比，顯示弱的化學發光，或完全不顯示化學發光。因此，抗體所具有的人類IL-8中和活性越強，化學發光的程度越弱，抗體所具有的人類IL-8中和活性越弱，則化學發光的程度變強。 在此、添加於小鼠血漿中且保存一定期間的抗體亦相同。藉由於小鼠血漿中保存，只要為中和活性無變化的抗體，上述的化學發光程度於保存的前後應無變化。另一方面，藉由保存於小鼠血漿中，中和活性降低的抗體的情況，使用保存後的抗體的情況的化學發光程度，與保存前相比為增加。 此處，使用上述細胞株，驗證經保存於小鼠血漿中的抗體是否維持中和活性。首先，將細胞株懸濁於AssayComplete (tm) Cell Plating 0 Reagent，以每孔5000個細胞接種於384孔盤。自細胞的培養開始1日後，依以下的方式進行用於決定人類IL-8添加濃度的試驗。以最終人類IL-8濃度包含45nM(400 ng/mL)至0.098nM(0.1 ng/mL)的方式，將經連續稀釋的人類IL-8溶液添加至細胞培養液。其次，根據製品方案添加檢出試劑，使用化學發光檢出裝置，檢出相對化學發光量。藉此，確認細胞對於人類IL-8的反應性，設定用於確認抗人類IL-8抗體的中和活性的適當的人類IL-8濃度。此處，人類IL-8濃度為2 nM。 其次，使用先前所述之經添加抗人類IL-8抗體的小鼠血漿，進行包含於其中之抗體的中和活性的評價。上述所決定濃度的人類IL-8，以及先前所述之包含抗人類IL-8抗體的小鼠血漿，添加至細胞培養液。此處，添加小鼠血漿的量，以抗人類IL-8抗體濃度為2μg/mL(13.3 nM)至0.016μg/mL(0.1 nM)的範圍連續式地包含的方式決定。其次，根據製品方案添加檢出試劑，使用化學發光檢出裝置，檢出相對化學發光量。 此處，未添加人類IL-8及抗體的孔的相對化學發光量平均作為0%，僅添加IL-8、未添加抗體的孔的相對化學發光量的平均作為100%時，算出各抗體濃度之相對化學發光量的相對值。 使用人類CXCR2表現細胞之人類IL-8阻礙分析的結果，各別地將起始(不經小鼠血漿中的保存處理)示於圖18-1，40℃1週間保存的樣品結果示於圖18-2，40℃2週間保存的樣品結果示於圖18-3。 其結果，Hr9及H89/L118於小鼠血漿中保存前後之人類IL-8中和活性未觀察到差異。另一方面，H553/L118經由於2週間保存，可觀察到人類IL-8中和活性的降低。由此可知，H553/L118，與Hr9或H89/L118比較時，小鼠血漿中的人類IL-8中和活性容易降低，顯示為IL-8中和活性方面具有不安定性質的抗體。
[實施例9]使經由電腦系統(in silico system)之免疫原性預測分數減低的抗體的製作 (9-1)各種IL-8結合抗體之免疫原性預測分數 抗醫藥品抗體(ADA)的產生，係影響及於治療用抗體的效果及藥物動態，由於有時帶來嚴重的副作用，臨床上治療用抗體的有用性，因ADA的產生而受到限制。治療用抗體的免疫原性，已知受到多種重要因素的影響，特別是有多數的報告指出治療用抗體所具有的效應T細胞抗原決定基的重要性。 做為用於預測T細胞抗原決定基的電腦工具(in silico tool)，已經開發Epibase (Lonza)、iTope/TCED(Antitope)、及EpiMatrix (EpiVax)等。使用該等in silico工具，可預測各胺基酸序列中的T細胞抗原決定基(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18)，能夠評價治療用抗體的潛在性免疫原性。 此處，使用EpiMatrix，算出各抗IL-8抗體的免疫原性分數。EpiMatrix係機械性地設計將欲預測免疫原性的蛋白質的胺基酸，切成9個胺基酸的胜肽片段的序列，對於該等，計算對於8種主要的MHC Class II對偶基因(allel)(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)的結合能力，預測目的蛋白質的免疫原性的系統(Clin Imminol. 2009 May; 131(2): 189-201)。 上述方式所算出的各IL-8抗體的重鏈及輕鏈的免疫原性分數(score)，係示於表12的「EpiMatrix分數」的欄。進一步地，關於EpiMatrix分數，考慮Tregitope的含有而經補正的免疫原性分數，係示於「tReg Adjusted Epx分數」的欄。Tregitope意指主要於天然型的抗體序列中多數包含的胜肽片段序列，藉由抑制性T細胞(Treg)而活性化，被認為是抑制免疫原性的序列。 再者，關於該等分數，重鏈與輕鏈的分數之合計者，係示於合計欄。
[表12]
Figure 02_image009
由該結果，觀察「EpiMatrix分數」及「tReg Adjusted Epx分數」之任一者，H89/L118、H496/L118及H553/L118的免疫原性分數，與習知的人源化抗人類IL-8抗體之hWS-4比較為降低。 進一步地，EpiMatrix中，考慮重鏈與輕鏈的分數之外，作為抗體分子全體所預測的ADA發生頻率，亦可與各種市售抗體的實際ADA發生頻率比較。實施該等方式解析的結果，係示於圖19。又，系統的關係上，圖19中，分別地將hWS-4標記為「WS4」，Hr9標記為「HR9」，H89/L118標記為「H89L118」，H496/L118標記為「H498L118」，H553/L118標記為「H553L118」。 如圖19所示方式，已知各種市售抗體之人的ADA發生頻率的值，Campath (Alemtuzumab)為45%，Rituxan(Rituximab)為27%，Zenapax(Daclizumab)為14%。另一方面，習知的人源化抗人類IL-8抗體之hWS-4的胺基酸序列所預測的ADA發生頻率為10.42%，此次新發現的H89/L118(5.52%)，H496/L118(4.67%)，H553/L118(3.45%)，與hWS-4比較則為顯著降低。
(9-2)免疫原性預測分數經減低的改變抗體的製作 如上所述，H89/L118、H496/L118及H553/L118免疫原性分數，與hWS-4比較為降低，如同由表12明顯可知，重鏈的免疫原性分數比輕鏈高，特別是顯示重鏈的胺基酸序列，以免疫原性的觀點尚有改善的餘地。因此，由H496的重鏈可變區域，進行能使免疫原性分數降低的胺基酸改變的探索。進行致力研究的結果，發現Kabat編號第52號的丙胺酸經置換為天冬胺酸的H496v1，第81號的麩胺醯胺經置換為蘇胺酸的H496v2，第82b號的絲胺酸經置換為天冬胺酸的H496v3的3種改變體。再者，作成將該等3種改變全導入之H1004。 以與實施例9-1同樣的方法，算出免疫原性分數的結果示於表13。
[表13]
Figure 02_image011
包含單一改變的H496v1、H496v2、H496v3的3種重鏈，任一者與H496比較皆為免疫原性分數降低。進一步地，經導入組合3種的改變的H1004中，達成顯著的免疫原性分數的改善。 此處，作為與H1004組合的適當輕鏈，除了L118，亦可發現L395。因此，於免疫原性分數的算出中，算出L118及L395二者組合者。如示於表13所示方式，作為重鏈與輕鏈組合時的免疫原性分數，H1004/L118及H1004/L395，顯示非常低的免疫原性分數。 其次，該等與實施例9-1同樣的方式預測ADA發生頻率。其結果示於圖20。又，圖20中，分別地將H496v1/L118標記為「V1」，H496v2/L118標記為「V2」，H496v3/L118標記為「V3」，H1004/L118標記為「H1004L118」，H1004/L395標記為「H1004L395」。 驚訝地，免疫原性分數顯著降低的H1004/L118及H1004/L395，關於ADA發生頻率的預測值亦有改善，顯示為0%的預測值。
(9-3)H1004/L395的IL-8結合親和性的測定 製作具有H1004-IgG1m(序列編號: 47)作為重鏈，L395-k0MT(序列編號: 38)作為輕鏈之抗體H1004/L395。H1004/L395對人類IL-8的結合親和性，使用Biacore T200(GE Healthcare)如以下所述方式測定。 運行緩衝液係使用以下2種，設定各別的溫度進行測定。 ‧0.05% tween 20, 40 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 40℃ ‧0.05% tween 20, 40 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 5.8, 37℃ 於感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化蛋白質A/G (PIERCE)，使目的抗體捕捉於該處。其次，注入人類IL-8稀釋液及運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體與人類IL-8相互作用。運行緩衝液係使用上述之任一者，人類IL-8的稀釋，係使用各別的緩衝液。感測晶片的再生係使用25mM NaOH及10 mM甘胺酸-HCl、pH1.5。測定皆於25℃實施。由測定所得之感測圖譜算出動力學參數之結合速度常數kon(1/Ms)，及解離速度常數koff(1/s)，且以其為基礎算出各抗體對於人類IL-8的KD(M)。各參數的算出係使用Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare)。 測定結果示於表14。免疫原性分數減低的H1004/L395，與H89/L118比較，中性pH中對人類IL-8的KD為相同，酸性pH中的KD及koff增加，顯示具有於胞內體內容易解離IL-8的性質。
[表14]
Figure 02_image013
[實施例10]pH依賴性的IL-8結合抗體H1009/ L395的製作與評價 (10-1)各種pH依賴性的IL-8結合抗體的製作 經由示於實施例9的檢討，取得具有pH依賴性的IL-8結合能力，且免疫原性分數減低的H1004/L395。其次，以兼具該等較佳性質，以及小鼠血漿中的安定性的改變體的創製為目標，進行致力的研究。 基於H1004/L395、導入各種改變，製作以下的改變抗體。
[表14-2] 重鏈
Figure 02_image015
[表14-3]
Figure 02_image017
進一步地，將上述18種的重鏈與2種輕鏈組合，製作合計36種的抗體。關於該等抗體如以下方式實施各種評價。 中性及酸性pH條件下的人類IL-8結合親和性，與實施例9-3同樣的方法測定。其結果中，pH 7.4之KD、pH5.8之KD及koff的值，示於表15。 其次，依以下所示方法實施於PBS中保存的情況的IL-8結合的安定性評價。 各別的抗體對DPBS(Sigma-Aldrich)進行一夜透析後，調製各抗體的濃度成為0.1 mg/mL。此時點採取一部分，作為起始樣品。其餘的樣品於50℃1週間保管後，回收做為熱加速試驗用樣品。 其次，使用起始樣品及熱加速試驗用樣品，經由Biacore如以下方式實施IL-8結合親和性的測定。 使用Biacore T200 (GE Healthcare)，進行對改變抗體之人類IL-8結合量解析。作為運行緩衝液，使用0.05% tween 20, 40 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 7.4，於40℃進行測定。 於感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化蛋白質A/G (PIERCE)，使目的抗體捕捉於該處。其次，注入人類IL-8稀釋液及運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體與人類IL-8相互作用。人類IL-8的稀釋亦使用運行緩衝液。感測晶片的再生係使用25mM NaOH及10 mM甘胺酸-HCl、pH1.5。測定所得之人類IL-8的結合量以及獲得該結合量時的抗體捕捉量使用Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare)抽出。 關於起始樣品及熱加速試驗用樣品，算出抗體捕捉量每1000RU的人類IL-8結合量。進一步地，算出相對於起始樣品的人類IL-8結合量之熱加速試驗用樣品的人類IL-8結合量。 作為結果所得之起始樣品與熱加速試驗用樣品的IL-8結合量的比，合併示於表15。
[表15]
Figure 02_image019
由上述檢討，獲得具有H1009-IgG1m(序列編號: 48)作為重鏈，及L395-k0MT作為輕鏈的抗體之H1009/L395。 如表15所示，H1009/L395與H89/L118相比，中性pH的人類IL-8結合親和性稍微增強，另一方面，酸性pH的結合親和性則降低，pH依賴性更為增強。再者，暴露於PBS中50℃之嚴苛條件的情況的IL-8結合的安定性，H1009/L395比H89/L118稍微改善。 由該等可知，H1009/L395係經選定作為具有pH依賴性的IL-8結合能力，且小鼠血漿中的中和活性亦有可安定地保持的可能性的抗體。
(10-2)H1009/L395的安定性評價 其次，與實施例8-3同樣的方法，評價H1009/L395的IL-8中和活性是否於小鼠血漿中安定地保持。此處，後述的實施例15中，係使用後述詳細記述的H1009/L395-F1886s。該抗體具有與H1009/L395相同的可變區域，恆定區域與天然型人類IgG1相比，為具有酸性pH條件下增強FcRn結合的改變，及用於減低對FcγR結合的改變的恆定區域。H1009/L395的人類IL-8結合及IL-8中和活性，咸信為該抗體的可變區域，特別是以HVR為中心的區域所負責，經導入至恆定區域的改變不賦予影響。 小鼠血漿中的安定性評價，如下述方式實施。對小鼠血漿585μL，添加200 mM磷酸緩衝液(pH 6.7)150μL。再者，以成為終濃度0.1%的方式添加疊氮化鈉作為防腐劑。各抗體(Hr9、H89/L118、H1009/L395-F1886s)以成為終濃度0.4 mg/mL的方式，添加至上述小鼠血漿。於該時點採取一部分，作為起始樣品。其餘的樣品保管於40℃。自保管開始經過1週間及2週間的時點，分別採取一部分，作為1週間保存樣品及2週間保存樣品。又，全部的樣品直至各分析為止於-80℃凍結保管。 使用人類CXCR2表現細胞之人類IL-8中和活性測定，以與實施例8-3同樣的方法實施。惟，用於確認抗人類IL-8抗體的中和活性的人類IL-8濃度，此次以1.2nM實施。 使用上述所獲得的抗體，作為使用人類CXCR2表現細胞之人類IL-8阻礙分析的結果，分別將起始(未經小鼠血漿中的保存處理)的結果示於圖21-1，於40℃1週間保存的樣品的結果示於圖21-2，於40℃2週間保存的樣品的結果示於圖21-3。 其結果，驚訝地，H1009/L395-F1886s即使於小鼠的血漿中以40℃保存2週間的情況中，仍維持人類IL-8的中和活性，比H533/L118更安定地保有IL-8中和活性。
(10-3)使用H1009/L395小鼠PK試驗 H1009/L395的小鼠之人類IL-8消失速度的評價，以其次所示的方法實施。使用H1009/L395、H553/L118及H998/L63作為抗體。對小鼠的投予及採血，小鼠血漿中的人類IL-8濃度測定係以示於實施例7的方法實施。 作為所得結果，血漿中人類IL-8濃度的數據示於圖22，再者，由小鼠血漿中的人類IL-8廓清率(CL)的數值示於表16。
[表16]
   人類IL-8 CL(mL/d/kg)
抗體名 H998/L63 H553/L118 H1009/L395
#1 21.4 773.2 705.0
#2 27.5 497.6 777.3
#3 24.7 879.8 737.7
平均(N=3) 24.5 716.9 740.0
標準偏差 3.0 197.2 36.2
結果，H1009/L395，於小鼠中人類IL-8消失速度於2 mg/kg投予時，與H553/L118為相同程度，顯示於胞內體內之游離型IL-8可達成接近100%。再者，自小鼠血漿中的人類IL-8消失速度定量地表示之廓清率(CL)的值，顯示比H998/L63高出約30倍。 雖不特別限定，關於使人類IL-8的消失速度增加的效果，能夠以如下述方式解釋。一般而言，抗原濃度幾乎保持一定的活體內，抗原的產生速度與消失速度，成為幾乎保持一定。於該狀態投予抗體，即使於抗原的產生速度不受影響的情況，抗原的消失速度，可經由抗原形成與抗體的複合體而變化。一般而言，由於抗原的消失速度比抗體的消失速度大，於該等狀況，與抗體形成複合體的抗原的消失速度降低。抗原的消失速度降低時，血漿中的抗原濃度上升，其此時的上升程度亦可規定為藉由抗原單獨時的消失速度與複合體形成時的消失速度的比。亦即，相比於抗原單獨時的消失速度，複合體形成時的消失速度降低為10分之1的情況時，經投予抗體的活體的血漿中的抗原濃度上升至抗體投予前的約10倍為止。此處，作為該等消失速度，能夠使用廓清率(CL)。亦即對活體投予抗體後所引起的抗原濃度的上升(抗原的累積)，咸信可藉由抗體投予前與投予後之各別的狀態之抗原CL而規定。 此處，投予H998/L63與H1009/L395時的人類IL-8的CL具有約30倍的差異，顯示人類於經投予該等抗體時所引起的血漿中人類IL-8濃度的上升程度，產生約30倍的差異。進一步地，所產生之血漿中人類IL-8濃度的30倍差異，於各別的狀況中，意指完全地阻斷人類IL-8的生物學活性所必要的抗體的量，亦產生約30倍的差異。亦即，H1009/L395，與H998/L63相比，以約30分之1的極少量的抗體，可阻斷血漿中IL-8的生物學活性。再者，H1009/L395與H998/L63各別以相同的投予量投予人類的情況，H1009/L395為更強力，且可歷經長期間的阻斷IL-8的生物學活性。再者，為了歷經長期間阻斷IL-8的生物學活性，必須安定地維持其IL-8中和活性。如示於實施例10的方式，H1009/L395由使用小鼠血漿的實驗，清楚可知可歷經長期間維持其人類IL-8中和活性。包含該等特別性質的H1009/L395，顯示即使由活體內中和IL-8的效果的觀點亦具有優異效果的抗體。
[實施例11]使用pH依賴性的IL-8結合抗體H1009/L395的細胞外基質結合性評價 如實施例10所示，H1009/L395之30倍優異的人類IL-8消失效果，為令人驚奇的效果。已知投予pH依賴性抗原結合抗體時的抗原消失速度，依賴於抗體與抗原的複合體被攝入細胞內的速度。亦即，形成與抗原的複合體時，相較於不形成時，攝入細胞內的速度增大的話，亦可能提高經由pH依賴性抗體的抗原消失效果。作為使抗體攝入至細胞內的速度增強的方法，已知賦予抗體於中性pH條件之對FcRn結合能力的方法(WO 2011/122011)或增強抗體之對FcγR的結合能力的方法(WO 2013/047752)、利用包含多價抗體與多價抗原之複合體的形成的促進的方法(WO 2013/081143)等。 然而，於H1009/L395的恆定區域不使用上述技術。再者，已知IL-8形成同元二聚物(homo dimer)，由於H1009/L395辨識人類IL-8的同元二聚物的形成面，可清楚知道與H1009/L395結合之人類IL-8為單體狀態。因此，該等抗體不形成多價的複合體。 亦即，對於H1009/L395，雖不使用上述技術，H1009/L395係顯示30倍之人類IL-8消失效果。 以下，雖不意圖為理論所拘束，列舉造成H1009/L395所代表之pH依賴性的IL-8結合抗體的前述特性的可能性之重要因素之一者。 人類IL-8係具有高的等電點(pI)的蛋白質，以習知的方法所計算之理論等電點為約10。亦即，中性pH條件下，人類IL-8係偏向正電荷之具有電荷的蛋白質。再者，H1009/L395所代表之pH依賴性的IL-8結合抗體，為偏向正電荷之具有電荷的蛋白質，H1009/L395的理論等電點為約9。亦即，原本具有高等電點，富含正電荷之蛋白質之H1009/L395，與具有高等電點之人類IL-8結合產生的複合體，比H1009/L395單獨之等電點更為上升。 包含抗體的正電荷的數增加時，及/或，負電荷的數減少時，抗體的等電點的增加，咸信亦可能使抗體‧抗原複合體對細胞內之非特異性之攝入增加。抗IL-8抗體與具有高等電點的IL-8的複合體，咸信比抗IL-8抗體單獨之等電點更為增大，有成為容易攝入細胞的可能性。 再者，如先前所述，再者，對細胞外基質的結合性，亦為影響細胞內攝入之可能性的因素之一。此處，對於細胞外基質的抗體單獨的結合性，驗證使否與人類I-8與抗體的複合體的結合性不同。
(11-1)經由ECL(電化學發光)法對細胞外基質的抗體結合性的評價 使用TBS(Takara，T903)，將細胞外基質(BDmatrigel基底膜基質/BD公司製)稀釋為2 mg/mL。經稀釋的細胞外基質於MULTI-ARRAY 96孔盤，High bind, Bare (Meso Scale Discovery: MSD公司製造)，每1孔分注5μL，於4℃一夜固相化。之後，使用包含150 mM NaCl，0.05% Tween20，0.5% BSA，0.01% NaN 3的20 mM ACES緩衝液，pH7.4，進行阻斷。 再者，提供於評價的抗體係以下述方式調整。做為抗體單獨添加的樣品，係使用以下所示緩衝液-1將抗體各別稀釋為9 μg/mL後，進一步使用緩衝液-2稀釋，最終濃度各別為3μg/mL。 緩衝液-1：包含150 mM NaCl，0.05% Tween20，0.01% NaN 3的20 mM ACES緩衝液，pH7.4 緩衝液-2：包含150 mM NaCl，0.05% Tween20，0.1% BSA，0.01% NaN 3的20 mM ACES緩衝液，pH7.4 另一方面，抗體與人類IL-8的複合體的添加樣品，除了於抗體樣品添加抗體的10倍莫耳濃度的人類IL-8以外，使用緩衝液-1以抗體濃度成為9μg/mL的方式各別稀釋後，以最終抗體濃度各別成為3μg/mL的方式，藉由緩衝液-2進一步稀釋。又，此時的人類IL-8成為約0.6μg/mL。為了形成複合體，於室溫振盪1小時。 其次，於經去除阻斷溶液的盤，添加抗體單獨或複合體的溶液，於室溫振盪1小時。之後，去除抗體單獨或複合體的溶液，添加包含0.25%戊二醛(glutaraldehyde)的緩衝液-1靜置10分鐘後，以包含0.05% Tween20的DPBS(和光純藥工業公司製)洗淨。ECL檢出抗體係將山羊抗人IgG(γ)(Zymed Laboratories公司製造)之使用Sulfo-Tag NHS Ester(MSD公司製)進行Sulfo-Tag化而調製。以ECL檢出用抗體成為1μg/mL的方式以緩衝液-2稀釋後添加於盤，遮光下，於室溫振盪1小時。去除檢出用抗體，添加以超純水將MSD Read緩衝液(4×)(MSD公司製) 2被稀釋的溶液後，使用SECTOR Imager 2400(MSD公司製)測定發光量。 結果示於圖23。深感興趣的是H1009/L395等抗人類IL-8抗體之任一者，以抗體單獨(-IL-8)幾乎未見到對細胞外基質的結合，但與人類IL-8(+hIL8)形成複合體，則清楚可見到對細胞外基質的結合。 抗IL-8抗體，如上所述方式經由與人類IL-8的結合，成為具有對細胞外基質具有結合性等性質，係無法由先前技術所得知。再者，雖不限定，該等性質與pH依賴性的IL-8結合抗體組合，亦能夠更有效率地增大IL-8的消失速度。
[實施例12]使用FcRn非結合抗體之小鼠PK試驗 依以下所示方法確認小鼠的活體內，pH依賴性的IL-8結合抗體與人類IL-8形成複合體，是否增加該複合體對細胞內的攝入。 首先，作成H1009/L395可變區域，與具有對各種Fc受體的結合親和性缺損的Fc區域的改變體。具體而言，作為酸性pH條件下之對FcRn的結合能力缺失的改變，對於重鏈之H1009-IgG1，係將EU編號第253號的異白胺酸置換為丙胺酸，第254號的絲胺酸置換為天冬胺酸。再者，作對小鼠FcγR的結合缺失的改變，係將第235號的白胺酸置換為精胺酸，第236號的甘胺酸置換為精胺酸，第239號的絲胺酸置換為離胺酸。作為包含該等4個改變的重鏈，製作1009-F1942m(序列編號: 49)。再者，製作具有H1009-F1942m作為重鏈，L395-k0MT作為輕鏈的H1009/L395-F1942m。 具有該Fc區域的抗體，由於酸性pH條件下的FcRn結合親和性缺損，不引起自胞內體內對血漿中的移行。因此，該等抗體於活體內，與具有天然型Fc區域的抗體相比，快速地自血漿中消失。此時，具有天然型Fc區域的抗體經攝入至細胞內後，僅有不受到經由FcRn的再利用(salvage)的一部分抗體移行至溶酶體而分解，具有對FcRn不具結合親和性的Fc區域的抗體的情況，經攝入至細胞內的抗體全部於溶酶體受到分解。換言之，具有該等改變之Fc區域的抗體的情況，經投予的抗體自血漿中的消失速度，咸信可與攝入至細胞內的速度相等。亦即，藉由測定對FcRn的結合親和性缺損的抗體之自血漿中的消失速度，可確認該抗體之攝入至細胞內的速度。 此處，驗證該H1009/L395-F1942m與人類IL-8結合之複合體的細胞內的攝入，是否比H1009/L395-F1942m的攝入更為增加。具體而言，驗證該抗體單獨投予的情況，以及與人類IL-8形成複合體投予的情況，該抗體之自血漿中的消失速度是否變化。 於人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg Line 32+/+ 小鼠，Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104)，分別以僅投予抗人類IL-8抗體的情況，以及人類IL-8與抗人類IL-8抗體同時投予的情況，評價抗人類IL-8抗體的體內動態。抗人類IL-8抗體溶液(200 μg/mL)及人類IL-8(10 μg/mL)與抗人類IL-8抗體(200 μg/mL)的混合溶液之各別，於尾靜脈以10mL/kg單次投予。此時，對於人類IL-8，抗人類IL-8抗體為充分量過剩存在，咸信人類IL-8幾乎全部與抗體結合。投予5分鐘後、2小時後、7小時後、1日後、2日後，採取血液。所採取的血液立即於4℃以15,000rpm離心分離15分鐘，獲得血漿。經分離的血漿，直到實施測定為止保存於設定為-20℃以下的冷凍庫。 小鼠血漿中的抗人類IL-8抗體濃度係藉由電化學發光法測定。首先，於使用含有5%BSA(w/v)的PBS-Tween溶液於室溫阻斷一夜的Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate (Meso Scale Discovery)，使抗人類kappa輕鏈山羊IgG生物素(IBL)於室溫使其反應1小時作成抗人類抗體固相化盤。調製包含血漿中濃度為3.20、1.60、0.800、0.400、0.200、0.100、0.0500 μg/mL的抗人類IL-8抗體的檢量線用試料及經稀釋100倍以上的小鼠血漿測定用試料。各試料與人類IL-8混合後，以50μL分注於抗人類抗體固相化盤的各孔，於室溫使其攪拌1小時。以人類IL-8的終濃度為333 ng/mL的方式調製。 之後，於前述盤中，添加具有小鼠IgG恆定區域的抗人類IL-8抗體(公司內調製品)，於室溫使其反應1小時。進一步地，於前述盤添加以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)經釕化的抗小鼠IgG(BECKMAN COULTER)使其反應1小時後，分注Read Buffer T(×1)(Meso Scale Discovery)，即刻於SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)進行測定。抗人類IL-8抗體濃度係由檢量線的回應使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算出。 作為結果，小鼠血漿中的抗體濃度示於圖24，再者，各別的條件之抗體的廓清率示於表17。
[表17]
抗體名 IL8 CL
μg/kg mL/d/kg
H1009/L395-F1942m - 134
H1009/L395-F1942m 100 291
H1009/L395-F1942m與人類IL-8的複合體的對細胞內的攝入速度顯示比H1009/L395-F1942m的攝入速度至少上升2.2倍。又，標記為「至少2.2倍」，實際上為5倍、10倍或30倍的數值之可能性之一亦可列舉如以下的理由。自小鼠血漿中的人類IL-8的消失速度，由於與H1009/L395-F1942m的消失速度相比為非常快，血漿中結合人類IL-8的H1009/L395-F1942m的比例，在投予後係迅速降低。亦即，即使於與人類IL-8同時投予的情況中，與其說血漿中存在的H1009/L395-F1942m全部為與IL-8結合的狀態，寧可謂於投予後約7小時的時點，已經大半成為游離型抗體存在。由於以該等條件實施攝入速度的評價，H1009/L395-F1942m與人類IL-8的複合體的細胞內攝入速度比H1009/L395-F1942m的攝入速度，即使實際上為5倍、10倍或30倍增大，由於該實驗系中僅反映其一部分的結果，亦有產生顯示約2.2倍效果的可能性。亦即，由此處所得結果，H1009/L395與人類IL-8的複合體對細胞內的攝入速度，顯示比活體內實際的H1009/L395的細胞內攝入速度更為增加，另一方面，其效果之2.2倍數值非為任何限定者。 雖不特別限定，由至此所得的發現，亦可進行下述方式的解釋。pH依賴性的IL-8結合抗體之H1009/L395，與人類IL-8形成複合體時，該複合體與抗體單獨存在的情況相比，等電點更高，成為偏向正電荷的狀態。同時，該複合體的對細胞外基質的結合性比抗體單獨的結合性更增大。等電點的上升，或對細胞外基質的結合增強的性質，咸信可作為於活體內對細胞內攝入的促進因子。進一步地，由使用小鼠的實驗，顯示H1009/L395與人類IL-8的複合體之對細胞內的攝入速度比H1009/L395的攝入速度更為增大2.2倍。由以上可知，附帶理論性的說明的活體外的性質，與活體內的現象有一貫性，支持H1009/L395與人類IL-8形成複合體，促進對細胞內的攝入，顯著地增加人類IL-8的消失的假說。 目前為止，有數個對於IL-8的抗體的報告，但目前為止未有與IL-8形成複合體時之對細胞外基質的結合性增大，前述複合體之對細胞內的攝入增加的報告。 再者，抗IL-8抗體之對細胞內的攝入的增加是見於與IL-8形成複合體時，血漿中之與IL-8形成複合體之抗IL-8抗體快速地被攝入於細胞內，另一方面，不與IL-8形成複合體之游離型抗體，亦可能不攝入細胞內而容易滯留。此時，抗IL-8抗體為pH依賴性時，一旦經攝入細胞內之抗IL-8抗體於細胞內與IL-8分子解離後再回送至細胞外，由於可能與另外的IL-8分子結合，複合體形成時之對細胞內的攝入增加，咸信亦可能具有更強力的進一步去除IL-8的效果。換言之，本揭露之別的面向為選擇增大對細胞外基質的結合之抗IL-8抗體或增加細胞內攝入之抗IL-8抗體。
[實施例13]pH依賴性的IL-8結合抗體H1009/L395的經由電腦(in silico)系統的免疫原性預測 其次，關於H1009/L395，以與實施例9-1同樣的方法進行免疫原性分數及ADA發生頻率的預測。其結果示於表18及圖25。又，圖25中，H1009/L395係標記為「H1009L395」。
[表18]
Figure 02_image021
由表18的結果可知，H1009/L395，與H1004/L395為同程度，顯示免疫原性分數為低。再者，由圖25的結果，H1009/L395中預測的ADA發生頻率為0%，該等亦與H1004/L395相同。 由以上可知，H1009/L395中所預測的免疫原性，與習知的抗人類IL-8抗體之hWS-4比較時，大幅地降低。由此可知，H1009/L395於人類中的免疫原性為極低，咸信可歷經長期而安全地持續抗IL-8中和活性。
[實施例14]使用酸性pH條件下使FcRn結合能力增強的H89/L118改變體的食蟹獼猴PK試驗 如至此的實施例所記載，pH依賴性的IL-8結合抗體H1009/L395，於具有天然型IgG1的恆定區域的情況，為具有非常優異性質的抗體。然而，於恆定區域包含胺基酸置換的抗體，例如於實施例5所例示，亦可利用作為包含在酸性pH使FcRn結合增強的Fc區域的抗體。此處，酸性pH中使FcRn結合增強的Fc區域於pH依賴性的IL-8結合抗體中亦發揮作用，使用H89/L118確認。
(14-1)酸性pH中使FcRn結合增強的H89/L118的Fc區域改變抗體的製作 對於H89/L118的Fc區域，導入實施例5-1所記載之各種FcRn結合增強改變。具體而言，對於H89-IgG1的Fc區域，導入使用於F1847m、F1848m、F1886m、F1889m、F1927m、F1168m的改變，製作以下的改變體。 具有H89-IgG1m(序列編號: 50)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118-IgG1， 具有H89-F1168m(序列編號: 51)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118- F1168m， 具有H89-F1847m(序列編號: 52)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118- F1847m， 具有H89-F1848m(序列編號: 53)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118- F1848m， 具有H89-F1886m(序列編號: 54)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118- F1886m， 具有H89-F1889m(序列編號: 55)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118-I F1889m， 具有H89-F1927m(序列編號: 56)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈之H89/L118- F1927m， 使用該等，以其次所示方法實施食蟹獼猴PK試驗。 又，於後述的實施例所記載的H89/L118-F22亦以同樣的方式製作(具有H89-F22(序列編號: 106)為重鏈，L118-K0MT為輕鏈)。
(14-2)包含新穎Fc區域改變體的抗體的食蟹獼猴PK試驗 於食蟹獼猴，評價經投予抗人類IL-8抗體後的抗人類IL-8抗體的體內動態。抗人類IL-8抗體溶液以2 mg/kg單次靜脈內投予。投予5分鐘後、4小時後、1日後、2日後、3日後、7日後、10日後、14日後、21日後、28日後、35日後、42日後、49日後、56日後，採取血液。經採取的血液立即於4℃以15,000rpm離心分離10分鐘，獲得血漿。經分離之血漿，至實施測定為止保存於經設定為-60℃以下的冷凍庫。 食蟹獼猴血漿中的抗人類IL-8抗體濃度係藉由電化學發光法測定。首先，將Anti-hKappa Capture Ab(Antibody Solutions)分注於MULTI ARRAY 96-孔盤(Meso Scale Discovery)，於室溫使其攪拌1小時。之後，使用含有5%BSA(w/v)之PBS-Tween溶液於室溫阻斷2小時作成抗人類抗體固相化盤。調製包含血漿中濃度為40.0、13.3、4.44、1.48、0.494、0.165、0.0549μg/mL的抗人類IL-8抗體的檢量線用試料及經稀釋500倍以上的食蟹獼猴血漿測定用試料，於抗人類抗體固相化盤之各孔分注50μL，於室溫使其攪拌1小時。之後，於前述盤添加Anti-hKappa Reporter Ab, Biotin conjugate(Anbtibody Solutions)，於室溫使其反應1小時。進一步地，添加SULFO-TAG Labeled Streptavidin (Meso Scale Discovery)於室溫使其反應1小時後，分注Read Buffer T(×1)(Meso Scale Discovery)，即刻以SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)進行測定。抗人類IL-8抗體濃度係由檢量線的回應使用解析軟體SOFT Max PRO(Molecular Devices)算出。 作為結果分別地，所得之各抗體的半衰期(t1/2)及廓清率(CL)示於表19，食蟹獼猴血漿中抗體濃度推移示於圖26。
[表19]
抗體名 t1/2 日 CL mL/d/kg
H89/L118-IgG1 11.9 2.95
H89/L118-F1168m 24.1 3.21
H89/L118-F1847m 27.9 2.09
H89/L118-F1848m 25.3 1.74
H89/L118-F1886m 45.1 1.34
H89/L118-F1889m 39.5 1.75
H89/L118-F1927m 30.3 2.13
由以上的結果，任一Fc區域改變體，與具有天然型IgG1的Fc區域的抗體相比，確認血漿中滯留性的改善。特別地，H89/L118-F1886m顯示最為期望的血中動態。
[實施例15]對FcγR的結合能力降低的Fc區域 已知天然型人類IgG1，其Fc區域與各種的免疫系細胞上的Fcγ受體(以下標記為FcγR)結合，對於成為對象之細胞顯示發揮ADCC或ADCP之效應作用。 另一方面，IL-8為可溶型細胞激素，作為醫藥品使用之抗IL-8抗體，主要係於IL-8過剩存在的部位中和其功能，期待顯示藥理作用。如此地IL-8過剩存在的部位，雖不特別限定，例如可推定為炎症部位。一般而言，已知該等炎症部位中，聚集各種免疫系細胞，而且使其活化。對於該等免疫系細胞，經由Fc受體傳達非預期的活化訊息，對於非預期的的細胞引起ADCC、ADCP等活性，未必為較佳。因此，雖不特別限定，由安全性的觀點，於活體投予抗IL-8抗體，咸信對於FcγR的結合能力越低越佳。
(15-1)對於FcγR的結合能力降低的改變抗體的製作 以使對於各種人類及食蟹獼猴的FcγR結合能力降低為目的，對於H1009/L395-F1886m的Fc區域進一步導入胺基酸改變。具體而言，對於重鏈之H1009-F1886m，分別地進行於EU編號第235號的L置換為R，第236號的G置換為R，第239號的S置換為K，製作H1009-F1886s(序列編號: 37)。同樣地，對於H1009-F1886m，於EU編號第235號的L置換為R，第236號的G置換為R，進一步地於EU編號第327號至第331號為止的區域為人類天然型IgG4序列，製作H1009-F1974m(序列編號: 36)。作為具有該等重鏈及輕鏈的L395-k0MT的抗體，製作H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m。
(15-2)對於各種人類FcγR之結合性的確認 其次，以下述所示方法確認所製作之H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m，對人類及食蟹獼猴之各別的可溶型FcγRIa及FcγRIIIa的結合性。 關於所製作之H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m，使用Biacore T200 (GE Healthcare)，進行與人類及食蟹獼猴之各別的可溶型FcγRIa及FcγRIIIa的結合實驗。人類及食蟹獼猴之各別的可溶型FcγRIa及FcγRIIIa，係以該領域業者所習知的方法製作為賦予His標籤的分子形。於感測晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶合法適當量固定化rProtein L (BioVision)，使目的抗體捕捉於該處。其次，注入可溶型FcγRIa或FcγRIIIa及運行緩衝液(作為參照溶液)，使經捕捉於感測晶片上的抗體相互作用。運行緩衝液係使用HBS-EP+(GE Healthcare)，可溶型FcγRIa或FcγRIIIa的稀釋，亦使用HBS-EP+。感測晶片的再生係使用10 mM glycine-HCl、pH1.5。測定皆於20℃實施。 結果示於圖27。此處，依照人類FcγRIa、人類FcγRIIIa、食蟹獼猴FcγRIa、食蟹獼猴FcγRIIIa的順序，記載為hFcγRIa、hFcγRIIIa、cynoFcγRIa、cynoFcγRIIIa。H1009/L395-F1886m對於任一者的FcγR均顯示結合，相對於此，新製作的H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m，確認對於任一者的FcγR均不結合。
(15-3)Fc區域改變體的小鼠IL-8消失試驗 其次，依以下所示實驗確認所製作之H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m之小鼠中，人類IL-8消失速度及抗體的血漿中滯留性。又，此處，由於亦包含評價經由增加H1009/L395-F1886s的抗體投予量的影響，關於H1009/L395-F1886s以投予量2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg之3點進行評價。 於人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg Line 32+/+小鼠，Jackson Laboratories，Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104)，同時地投予人類IL-8、抗人類IL-8抗體後評價人類IL-8的體內動態。人類IL-8(10 μg/mL)、抗人類IL-8抗體(200 μg/mL、500μg/mL或1000μg/mL)的混合溶液於尾靜脈以10 mL/kg單次投予。此時，由於相對於人類IL-8、抗人類IL-8抗體為充分過剩量存在，咸信人類IL-8幾乎全部與抗體結合。投予5分鐘後、2小時後、4小時後、7小時後、1日後、2日後、3日後、7日後、14日後、21日後、28日後，採取血液。經採取的血液立即於4℃以15,000rpm離心分離15分鐘，獲得血漿。經分離之血漿，直到實施測定為止保存於經設定於-20℃以下的冷凍庫。 小鼠血漿中的人類IL-8濃度測定，係以與實施例7同樣的方法實施。作為結果，將得到之血漿中人類IL-8濃度的數據示於圖28，再者自小鼠血漿中的人類IL-8廓清率(CL)的數值示於表20。 首先，於2 mg/kg投予群的比較中，具有天然型IgG1的Fc區域的H1009/395，與具有改變Fc區域的H1009/L395-F1886s，顯示具有同等的人類IL-8消失效果。 其次，使H1009/L395-F1886s的投予量變化的情況，於投予後1日的時點雖可觀察到血漿中IL-8濃度的若干差異，但人類IL-8廓清率的值則為2 mg/kg與10 mg/kg未觀察到顯著差異。此係強力的顯示包含H1009/L395的可變區域的抗體，即使以高用量投予的情況亦顯示充分的IL-8消失效果。
[表20]
抗體名 投予量 人類IL-8 CL(mL/d/kg)
H1009/L395 2 mg/kg 740
H1009/L395-F1886s 2 mg/kg 628
H1009/L395-F1886s 5 mg/kg 458
H1009/L395-F1886s 10 mg/kg 560
(15-4)Fc區域改變體的食蟹獼猴PK試驗 其次，使用H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m，依以下所示方法驗證食蟹獼猴中抗體的血漿中滯留性。 於食蟹獼猴，單獨投予抗人類IL-8抗體，或同時地投予人類IL-8及抗人類IL-8抗體後，評價抗人類IL-8抗體的體內動態。抗人類IL-8抗體溶液(2 mg/mL)，或人類IL-8(100 μg/kg)及抗人類IL-8抗體(2 mg/mL)的混合溶液，以1 mL/kg單次靜脈內投予。投予5分鐘後、4小時後、1日後、2日後、3日後、7日後、10日後、14日後、21日後、28日後、35日後、42日後、49日後、56日後，採取血液。經採取的血液立即於4℃，以15,000rpm離心分離10分鐘，獲得血漿。經分離的血漿直到實施測定為止保存於經設定為-60℃以下的冷凍庫。 食蟹獼猴血漿中的抗人類IL-8抗體濃度的測定，係以實施例14記載的方法實施。作為所得結果，將血漿中抗人類IL-8抗體濃度的數據示於圖29，再者，自食蟹獼猴血漿中的抗人類IL-8抗體的半衰期(t1/2)及廓清率(CL)的數值示於表21。 首先，與具有天然型人類IgG1的Fc區域的Hr9及H89/L118比較時，具有功能經改良的Fc區域的H1009/L395-F1886s，顯示血漿中滯留性顯著提升。 進一步地，H1009/L395-F1886s，即使與人類IL-8同時投予的情況，血漿中濃度推移顯示與抗體單獨投予的情況為相同。雖無特別限定，由此可知，可能如同下述的考察。如前文所述，H1009/L395與人類IL-8的複合體的細胞內攝入顯示比H1009/L395單獨的攝入更為增加。一般而言，咸信高分子量的蛋白質，非特異性地或受體依賴性地經攝入至細胞內後，向溶酶體移行，藉由存在於溶酶體的各種分解酵素而受到分解。因此，該蛋白質向細胞內的攝入速度上升時，咸信其血漿中滯留性亦朝向惡化的方向進行。然而，抗體的情況，由於具有藉由存在於胞內體內的FcRn而回送至血漿中的性質，經由充分地發揮FcRn的再利用功能，即使於細胞內攝入速度增加的情況，咸信不影響血漿中滯留性。此處，H1009/L395-F1886s，即使與人類IL-8同時地投予至食蟹獼猴的情況，亦未觀察到對血漿中滯留性的影響。此係顯示，H1009/L395-F1886s即使於抗體的細胞內攝入速度增加時，藉由FcRn之充分地再利用，能夠回送至血漿中之可能性。 進一步地，另一種的Fc區域改變體之H1009/L395- F1974m，亦顯示與H1009/L395-F1886s為同等的血漿中滯留性。如前文所述，該等Fc區域改變體雖然是為了降低對各種FcγR的結合能力，而導入不同之物，該等對抗體本身之血漿中滯留性不賦予影響。由以上可知，H1009/L395-F1886s及H1009/L395-F1974m之任一者，於食蟹獼猴中的血漿中滯留性，與具有天然型IgG1的Fc區域的抗體比較時，顯示顯著地改善，極為良好。
[表21]
   t1/2 CL
   日 mL/d/kg
Hr9 20.26 3.72
H89/L118 11.88 2.95
H1009/L395-F1886s 35.75 1.64
H1009/L395-F1886s+hIL-8 72.24 1.11
H1009/L395-F1974m+hIL-8 43.78 1.60
如以上的實施例所示方式，H1009/L395為首次實現藉由具有pH依賴性的IL-8結合能力，或具有與IL-8的複合體係快速地攝入細胞內的性質，可做為使人類IL-8之活體內的消失速度顯著地上升的抗體。進一步地，中性pH條件下對IL-8的結合親和性與習知的hWS-4抗體比較時亦為上升，於血漿中等中性pH條件下可更強力地中和人類IL-8。此外，是在血漿中的條件下具有優異的安定性，經投予至活體內後亦不降低IL-8中和活性的抗體。再者，與hWS-4比較時，基於產量大幅經改善之Hr9所製作的H1009/L395，由產量的觀點而言成為適合製造的抗體。進一步地，於電腦的免疫原性預測中，其免疫原性分數顯示為非常低，與習知的hWS-4抗體或數種既存的市售抗體比較時亦大幅地為低。亦即，H1009/L395於人類中難以成為ADA，期待為可歷時長期而安全地使用的抗體。由此可知，H1009/L395與習知的抗人類IL-8抗體比較時，由各種各樣觀點而言，係顯示為改善的抗體，非常有用於作為醫藥品。 具有天然型IgG的Fc區域的H1009/L395，如上所述為充分地有用，包含功能經改良的Fc區域的H1009/L395改變體，可適宜使用作為其有用性經提升的抗體。具體而言，使酸性pH條件下的FcRn結合增強，改善血漿中滯留性，亦可能歷經更長期間而持續效果。再者，包含導入使對FcγR的結合能力降低的改變的Fc區域的改變體，經投予至活體內而可迴避非預期的免疫系細胞的活化或細胞傷害活性等的發生，可使用作為安全性高的抗體醫藥品。作為該等Fc，特別較佳使用本說明書中實施之F1886s或F1974m，但不限定為該等Fc，以具有同樣的功能為限，包含其他改變Fc區域的抗體醫藥品亦使用作為本揭露之一實施態樣。 作為結果，包含H1009/L395-F1886s、H1009/L395-F1974m等之本揭露之抗體，可維持歷經長期間，且安全地，可強力地阻礙人類IL-8的生物學活性的狀態。實現了既存的抗IL-8抗體無法達成的程度，作為完成度極高的抗IL-8抗體醫藥品，可為期待其使用者。
[實施例16]子宮內膜異位症患者的囊胞液中的IL-8濃度測定 為了確認子宮內膜異位症之IL-8的關聯，測定子宮內膜異位症患者的囊胞液中的IL-8濃度。樣品係回收自治醫科大學中由適合手術的子宮內膜異位症患者的術後組織的囊胞液，於1次匿名化中，於中外製藥進行2次匿名化。囊胞液中的IL-8濃度係進行電化學發光法測定。首先，抗人類IL-8抗體(Hycult Biotech)經生物素標識後，分注於經使用含有5%BSA(w/v)的PBS-Tween溶液阻斷2小時的MSD GOLD 96-孔Streptavidin SECTOR Plate (Meso Scale Discovery)，藉由於室溫、暗處攪拌1小時，作成抗人類IL-8抗體固相化盤。調製包含囊胞液中濃度為900、300、100、33.3、11.1、3.70、1.23 pg/mL的人類IL-8(參照NP_000575.1之公司內調整)的檢量線試料及經稀釋5倍以上的囊胞液測定試料，以25μL分注於抗人類IL-8抗體固相化盤的各孔，於室溫、暗處使其攪拌1小時。之後，使SULFO-TAG labeled抗人類IL-8抗體(公司內調製品)於室溫、暗處使其反應1小時後，分注Read Buffer T(×1)(Meso Scale Discovery)，即刻於SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)進行測定。人類IL-8濃度係由檢量線的回應使用解析軟體SOFT Max PRO (Molecular Devices)算出。 其結果，如圖30所示方式，判明子宮內膜異位症患者的囊胞液中的IL-8濃度為10000 pg/mL以上之非常高濃度，顯示子宮內膜異位症中IL-8的重要性。
[實施例17]子宮內膜異位症外科性誘導猴模型的製作與病態評價 為了評價子宮內膜異位症之抗IL-8抗體的藥效，製作子宮內膜異位症外科性誘導模型，進行評價。病態模型的製作係如以下的方式進行。 對於性週期為定期的8至14歲齡的雌性食蟹獼猴(由醫藥基盤‧健康‧營養研究所 靈長類醫科學研究中心取得)，於相當於黃體期間中於麻醉下進行開腹，將子宮體部以V字形切開而切除。其次，將殘餘的子宮平滑肌層修整為5mm至10mm四方型，子宮內膜部分以連接於腹膜的方式，於右腹壁腹膜的1個位點，左腹壁腹膜的2個位點(頭側、尾側)與吸收線縫合，作為移植部。切除後的子宮以吸收線縫合。進一步地，細切殘餘的內膜組織且懸濁於5mL的2 ng/mL肝細胞生長因子溶液(R&D systems公司製)，播種移植於腹腔內，然後閉腹。麻醉係使用克他明/甲苯噻嗪(ketamine/xylazine)的平衡麻醉(以2:1的比率為目標混合)，藉由異氟醚(isoflurane)而維持麻醉時間。手術中經由熱加熱墊進行體溫維持管理，經由心電圖管理狀態。術後的覺醒時投予拮抗藥的安醒順(antisedan)(目標為與甲苯噻嗪量為同量)與抗生劑之頭孢拉丁(cephradine)，術後2日間投予鎮痛劑之紮露班(zaruban)，以每日的定期觀察確認術後無異常。又，腹腔鏡觀察時亦同樣地實施麻醉與術後管理。
經由上述手術之子宮內膜異位症的外科性誘導4個月後，9個月後(投予3個月後)、12個月後(投予6個月後)進行腹腔鏡觀察，依以下方式評價子宮內膜異位症的病態。 腹腔鏡觀察，係於麻醉下切開腹部正中，刺入連針套管(trocar)，再插入腹腔鏡。腹腔鏡係連接影像系統(KARL STORAZE公司製)以及監視器，腹腔鏡的觀察係以監視器進行，記錄係以影像系統進行。其次，使用高速氣腹裝置(OLYMPUS公司製)於腹腔內充滿二氧化碳氣體而擴張腹部，由腹側部插入附有刻度的棒或鉗子。病變的尺寸係使用附有刻度的棒或附有刻度的鉗子測定。 測定藉由子宮內膜組織的縫合所形成的結節性病變(nodular lesion)的尺寸(長、寬、高)，由長(mm)×寬(mm)×高(mm)算出體積。對於子宮內膜組織的細切後，藉由播種所形成的病變部位與沾黏，依據臨床所使用的r-AFS分數改變為猴子用的修飾r-AFS分數，於腹腔鏡觀察時評價沾黏的部位、範圍、深度及病變的尺寸。修飾r-AFS分數，如示於圖31的方式，猴子用則進行以下2點的改變。 1. 由於猴模型中對膀胱的沾黏頻率比人類更高，追加對膀胱子宮窩的沾黏項目。對膀胱的沾黏的評價方法，與直腸子宮陷凹的沾黏同樣的方式給分數。 2. 由於猴子比起人類，身體及臟器的大小較小，病變尺寸的準則變更為＜3mm、3-10mm、＞10mm給分數。 確認後日使用影像系統所錄影的腹腔鏡觀察視頻而經由腹腔鏡最終化評價。 基於誘導4個月後的腹腔鏡觀察結果，選擇滿足基準的個體，進行分群。採用基準如以下所述方式。 1. 誘導4個月後，進行腹腔鏡觀察可確認移植內膜的發生 2. 誘導後投予前期間中可確認3次以上的月經出血 分群係分開實施2次，基於各個體的結節性病變的平均體積與可測定的病變數進行隨機化，最終劃分為媒劑(vehicle)群6隻，抗體H1009/L395-F1974m投予群7隻。使用最終劃分的所有個體的數據，經Kraskal-Wallis檢定確認群間無偏差。項目為確認為結節性病變的體積(各病變)、體重、尺寸r-AFS分數、沾黏r-AFS分數。
[表22]
群 劑量 投予方法 動物ID
媒劑群 - s.c., q4w #101、#102、#103、#110、 #115、#120
H1009/L395- F1974m群 10 mg/kg i.v., q4w #105、#106、#112、#117、 #119、#121、#123
由誘導6個月後開始每4週投予，進行6個月、6次投予。作為抗體投予群H1009/L395-F1974m以10mg/kg靜脈注射，作為媒劑群His Buffer (20mM His-Asp, 150mM Arg-Asp (pH6.0))以皮下投予。由投予開始每3個月的初次投予後3個月、6個月時進行腹腔鏡觀察，評價子宮內膜異位症的病態。 由投予開始6個月後的最終腹腔鏡觀察後，追加麻醉、放血、安樂死處置後，進行解剖。採取包含移植部的骨盆內臟器官(左右卵巢、左右輸卵管、左右輸卵管間膜、左右輸卵管傘、左右子宮間膜、子宮、陰道、直腸子宮陷凹、膀胱子宮窩)。經採取的組織以10%中性緩衝福馬林液固定，於石蠟包埋薄切組織標本實施蘇木精伊紅[H‧E]染色。源自組織及縫合的病變進入切割囊胞液而貯留的情況亦採取囊胞液。
腹腔鏡觀察的結果，於媒劑對照群中，觀察到誘導4個月後藉由子宮內膜組織的縫合所形成的結節性病變的形成，進一步地，觀察到誘導12個月後(投予6個月後)，在結節性病變與其附近有黑色的囊胞的形成。再者，子宮內膜組織的細切後，藉由播種，確認於直腸子宮陷凹及膀胱之沾黏的形成(圖32)。再者，誘導12個月後的解剖時所採取的媒劑群的組織標本，進行H‧E染色時，如圖33所示，確認於經移植的子宮內膜組織(初期移植片)的附近高度地形成顯示增殖性之內膜上皮，形成至腹壁肌層為止的事實。內膜上皮的周圍係由多層的基質(stroma)細胞及膠原纖維豐富的組織間隙(interstitium)所構成，觀察到與人類的子宮內膜異位症組織構造類似的構造形態。由該等結果，確認本模型於作為子宮內膜模型是有用的(12 thWorld Congress on Endometriosis, 2014, P-221)。同樣地，作為子宮內膜異位症的外科性誘導模型，亦有報告使用狒狒的方法(Fertil Steril. 2013; 99(3): 783-789, Fertil steril. 2013; 100(4): 1144-50)。
再者，誘導12個月後(投予6個月後)的最終腹腔鏡觀察後，進行解剖。採取經貯留的囊胞液，媒劑群的囊胞液中的IL-8濃度經由電化學發光法測定。首先，將抗體H1009/L395-F1974m溶液分注於MULTI-ARRAY 96-孔Plate (Meso Scale Discovery)藉由於4℃靜置一夜，製作抗體H1009/L395-F1974m固相化盤。調製包含緩衝液中濃度為269、108、43.0、17.2、6.89、2.75、1.10 pg/mL的猴IL-8(參照XM_005555087.1公司內調整)的檢量線試料及經稀釋50倍以上的猴囊胞液測定試料，分注於抗體H1009/L395-F1974m固相化盤的各孔後，於室溫、暗處使其攪拌2小時。之後，於室溫、暗處使兔抗IL-8抗體(Hycult Biotech)反應1小時。接著，於室溫、暗處與SULFO-TAG Labeled抗兔抗體(Meso Scale Discovery)反應1小時後，分注Read Buffer T(×1)(Meso Scale Discovery)，立刻以SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)進行測定。猴IL-8濃度由檢量線的回應使用解析軟體SOFT Max PRO(Molecular Devices)算出。其結果，如表23所示、子宮內膜異位症外科性誘導猴模型的囊胞液中，確認到與人類子宮內膜異位症患者的囊胞液同樣地IL-8為非常高濃度。此觀察支持本發明之猴模型對於人類子宮內膜異位症的外推性高。進一步地，研究各個體的囊胞液中的IL-8濃度與沾黏r-AFS分數的相關性時，深感興趣的是如圖34-1所示，可觀察到囊胞液中的IL-8濃度與沾黏r-AFS分數的相關傾向。又，於各個體可測定複數的囊胞液中IL-8濃度的情況，以最高值作為代表值。由該結果，顯示對於子宮內膜異位症的沾黏之IL-8的相關。
[表23]
   囊胞液中IL-8濃度(ng/mL)
#101 46.4      
#102 0.726      
#103 9.83      
#110 58.3      
#115 476 28.8 25.0
#120 417      
抗體H1009/L395-F1974m投予群與媒劑投予群中，投予開始6個月後，經由腹腔鏡觀察檢討藥效。每次解析，關於6個月的投予期間中的月經出血未達3次的個體，從解析的對象除外。本試驗的個體中，抗體H1009/L395-F1974m投予群#117(10 mg/kg群)的1隻，係排除於解析外。又，依據該領域業者習知的方法，於抗體H1009/L395-F1974m投予群中進行抗抗體的檢出時，6隻中有2隻檢出抗抗體，確認最低(trough)血中API濃度的降低。以下的解析，亦包含抗抗體陽性的個體而實施。 首先，算出藉由子宮內膜組織的縫合所形成之各結節性病變各個的體積，藉由經時的變化及大小依以下的表24的方式分類。因沾黏而無法評價等，無法經時的評價的情況，不包含解析該位置。
[表24]
類型   
A：增殖，≧500mm3 投予6個月時增殖大小為500mm3以上
B：增殖，＜500mm3 投予6個月時未達500mm3，相對於投予前顯示投予後的增殖傾向
C：無變化 投予期間中有增減但無大的變化
D：減少 相對於投予前顯示投予後的減少傾向
其結果，如表25所示，得到媒劑群中顯示增殖為類型A及類型B的頻率高至54%(7/13病變)，顯示減少的類型D減低至15%(2/13病變)，相對於此，抗體H1009/L395-F1974m投予群中，顯示減少的類型D的頻率提高至58%(7/12病變)的結果，顯示經由抗體H1009/L395-F1974m投予之結節性病變的縮小效果。
[表25]
群 A：增殖，≧500mm3 B：增殖，＜500mm3 C：無變化 D：減少
媒劑 8% (1/13) 46% (6/13) 31% (4/13) 15% (2/13)
H1009/L395-F1974m 10 mg/kg 0% (0/12) 8% (1/12) 33% (4/12) 58% (7/12)
再者，以其次的計算方法算出每個體的結節性病變的相對體積，評價抗體H1009/L395-F1974m的結節性病變的藥效(結節性病變的相對體積(%) = 投予開始後6個月的採用病變的體積合計/投予開始2個月前的採用病變的體積合計)×100)。其結果示於圖34-2。媒劑群的結節性病變的相對體積為141%(67-331)(中間值(最小值-最大值))。再者，抗體H1009/L395-F1974m投予群為49%(15-156)。與媒劑群比較，經由抗體H1009/L395-F1974m的投予，確認結節性病變的顯著縮小(P = 0.0492)。又，作為統計解析，使用有母數(parametric)t檢定(顯著水準為P＜0.05)。由其結果，顯示經由抗IL-8抗體之結節性病變的體積的增殖抑制效果。
接著，對於子宮內膜組織的細切後，藉由播種所形成之病變部位與沾黏，根據修飾r-AFS分數進行評價，檢討抗體H1009/L395-F1974m投予群(N=6)與媒劑群(N=6)的藥效。各個體之抗體投予前與抗體投予後為何種程度的變化，以下述方式算出修飾r-AFS分數的變化，其結果示於圖35-1。 總r-AFS分數的變化 = 總r-AFS分數(投予後)-總r-AFS分數(投予前) 沾黏r-AFS分數的變化 = 沾黏r-AFS分數(投予後)-沾黏-AFS分數(投予前) 尺寸r-AFS分數的變化 = 尺寸r-AFS分數(投予後)- 尺寸-AFS分數(投予前)
抗體H1009/L395-F1974m投予群的總r-AFS分數的變化與沾黏分數的變化，與媒劑群比較明顯可知顯示減少(p = 0.0070，p = 0.0096)。對於尺寸r-AFS分數的變化，與媒劑群比較，於抗體H1009/L395-F1974m投予群亦可觀察到減少傾向。統計解析係使用解析軟體(SAS Institute公司製)的無母數Steel檢定(顯著水準為兩側5%)。本結果中，經由抗體H1009/L395-F1974m投予可觀察到沾黏分數的顯著減少，以及，如先前示於圖34-1，由可觀察到囊胞液中的IL-8濃度與沾黏r-AFS分數的相關傾向，顯示IL-8對於子宮內膜異位症的沾黏有強力的相關，抗IL-8抗體對於子宮內膜異位症的沾黏改善為有用的。
圖35-1中，顯示基於腹腔鏡手術時所攝影的影像評價修飾r-AFS分數的變化。基於腹腔鏡手術時經由施術者所記述的分數值之總修飾r-AFS分數示於圖35-2。又，初次投予2個月前的分數值，使用作為投予前分數。每群的投予前後的總修飾r-AFS分數的變化，對於對應的成對以Wilcoxon符號順位檢定實施統計解析的結果(顯著水準P＜0.05)，於媒劑群投予後的分數雖為顯著增加(P = 0.0313)，抗體H1009/L395- F1974m投予群中則分數無變化(P = 0.875)。由總修飾r-AFS分數顯示子宮內膜異位症的病態的惡性度，由該結果，經由抗IL-8抗體，顯示對於子宮內膜異位症的病態惡化的抑制效果。
最終腹腔鏡觀察後，係將解剖時所採取的移植部及移植片以H‧E染色，以光學顯微鏡觀察病理組織學。其結果，如圖36所示，與媒劑群比較，抗體H1009/L395-F1974m投予群確認顯示增殖性的上皮及基質(stroma)細胞的萎縮性變化及以膠原纖維為主體的組織間隙(interstitium)的減少，特別是於可維持抗抗體陰性的血中API濃度的個體可觀察到強力的效果(表26)。媒劑群中雖有結節性病變的體積顯示減少傾向的類型D的病變(#102-L2，#115-R)，由結節性病變的病理結果未確認萎縮或組織間隙減少而維持病變。抗體H1009/L395-F1974m投予群中雖有結節性病變的體積顯示增加傾向的類型B者，由結節性病變的病理結果確認#106-L1為基質的萎縮性變化及組織間隙減少，可確認病態的改善。再者，由於含鐵血黃素(hemosiderin)於媒劑群可觀察到56%(9/16)，於抗體投予群僅觀察到為24%(4/17)，顯示巨噬細胞或單核球係藉由抗體投予而浸潤受到抑制。進一步地，抗體投予群中由於可觀察到媒劑群中未觀察到的肌組織再生，顯示浸潤至肌層為止的病態退縮，置換回復為肌肉組織的數據。浸潤至腹壁肌層為止的子宮內膜異位症腺管的有無，確認深在性病變(deep lesion)的有無時，媒劑群與包含抗抗體陽性個體的抗體H1009/L395-F1974m投予群中雖未觀察到有差異，但除了抗抗體陽性個體，對於媒劑群確認5/18的病變，於抗體H1009/L394-F1974m投予群為1/11病變，頻率減少。顯示對於深在性病變的形成亦有抑制效果。
[表26]
Figure 02_image023
進一步地，關於相當於抗體H1009/L395-F1974m的改變前抗體的抗體H89/L118-F22，同樣地於外科性誘導猴模型進行藥效評價時，於抗體H89/L118-F22投予群中，亦確認顯示增殖性的上皮及基質細胞的萎縮，以膠原纖維為主體的組織間隙的減少。 由該等結果，確認抗IL-8/抗體對於子宮內膜異位症病變體積的縮小、沾黏的改善、上皮及基質細胞的萎縮性變化、免疫細胞的浸潤減少、纖維化改善具有藥效，顯示抗IL-8抗體對於作為子宮內膜異位症治療劑是有用的。由該結果，該領域業者當然可理解IL-8訊息阻礙劑對於作為子宮內膜異位症的治療劑或預防劑是有用的。
[實施例18]對於子宮腺肌症之抗IL-8抗體的藥效 於子宮內膜異位症外科性誘導猴模型中，自抗體投予開始6個月後的最終腹腔鏡觀察後，將解剖所採取的子宮以10%中性緩衝福馬林液固定，H‧E染色後觀察。各於媒劑群中1例，抗體投予群中1例強力的確認子宮內，與子宮腺肌症類似的子宮內膜組織。該2例的食蟹獼猴中確認的子宮內膜組織，於子宮肌層內存在子宮內膜腺與圍繞其的子宮內膜組織間隙，由於具有於人類子宮可觀察到子宮腺肌症的病理學特徵而判斷為人類子宮腺肌症併發模型，比較該等各1例的子宮肌層內的子宮內膜組織。如圖37所示，與媒劑群比較，抗體H1009/L395- F1974m投予群中，確認子宮腺肌症病變部的內膜上皮的萎縮以及基質細胞的減少及萎縮。由此觀察顯示，抗IL-8抗體對於子宮腺肌症亦有抑制效果。由該結果，該領域業者當然可理解IL-8訊息阻礙劑對於作為子宮腺肌症的治療劑或預防劑是有用的。
[實施例19]子宮內膜異位症組織的CXCR1、CXCR2表現解析 作為人類IL-8受體，已知有CXCR1及CXCR2。於子宮內膜異位症病變部，為了研究IL-8產生作用的細胞，使用小鼠抗人類CXCR1單株抗體(R&D System，商品目錄編號: 42705)及小鼠抗人類CXCR2單株抗體(Abcam，商品目錄編號: 19)，使用手術取出人類子宮內膜異位症組織的石蠟包埋塊，進行免疫組織化學的染色。由該等石蠟塊作成薄切組織切片，與作為一次抗體之上述抗CXCR1及抗CXCR2抗體培養後，與作為二次抗體的聚合物-HRP結合的山羊抗小鼠IgG抗體(Dako)反應，以二胺基聯苯胺(和光純藥工業股份有限公司)進行可見化。其結果，如表27所示，確認CXCR1及CXCR2於基質細胞中為陰性。另一方面，確認組織內浸潤的嗜中性球及沉澱含鐵血黃素的巨噬細胞、單核球中CXCR1、CXCR2皆為陽性，上皮細胞中亦表現為弱陽性至陽性。再者，血管內皮細胞中，確認CXCR1、CXCR2皆為弱陽性。由此觀察顯示，對於子宮內膜異位症上皮細胞之IL-8的直接藥理作用，以及經由嗜中性球或巨噬細胞等浸潤免疫細胞之藥理作用的可能性。
[表27]
   CXCR1(IL-8RA) CXCR2(IL-8RB)
No.1 No.2 No.3 No.1 No.2 No.3
具有基質(stromal)細胞的子宮內膜上皮 ± ± - - ± -
不具有基質(stromal)細胞的子宮內膜上皮 + + + + + +
基質(stromal)細胞 - - - - - -
嗜中性球 + + + + + +
含鐵血黃素沉澱巨噬細胞 + + + + + +
單核球* + + + + + +
血管內皮細胞 ± ± ± ± ± ±
*：類巨噬細胞的細胞 NA：未應用 -陰性，+陽性，±部分陽性
[實施例20]對於外科手術後的沾黏之抗IL-8抗體的藥效 上述的子宮內膜異位症外科性誘導食蟹獼猴模型中，誘導用的開腹手術後所產生，因子宮內膜異位症之沾黏係對別的腹壁切開部位周圍的沾黏，於誘導4個月後(抗體投予2個月前)的腹腔鏡觀察時可見於全個體。為了研究抗IL-8抗體對於外科手術後的沾黏之藥效，將個體編號匿名化，比較投予前2個月的腹腔鏡觀察所見與投予開始6個月後的最終腹腔鏡觀察的照片，實施對腹壁切開部位周圍的沾黏的評價。具體而言，於投予前後比較對腹壁切開部位周圍的沾黏，以5人的評價者進行(1)改善(Improved)、(2)不變(Stable)、(3)惡化(Progressed)的三階段評價。判定係採用評價者5人中之3人以上的評價為一致者，其以外者為(2)不變。評價媒劑群6隻，與抗體H1009/L395-F1974m投予群7隻。圖38顯示媒劑群與抗體H1009/L395-F1974m投予群的代表性腹腔內影像。如表28所示，相對於媒劑群的6隻中有5隻不變，1隻惡化，抗體H1009/L395-F1974m的7隻中有1隻惡化但6隻改善。惡化1隻係產生抗抗體、血中的H1009/L395- F1974m抗體濃度降低的個體。由此觀察顯示，抗IL-8抗體對於作為外科性手術後的沾黏改善治療藥或沾黏預防劑是有用的。由該結果，該領域業者當然可理解IL-8訊息阻礙劑對於作為沾黏治療劑或預防劑是有用的。
[表28]
群組 改善 不變 惡化
媒劑 0/6 5/6 1/6
H1009/L395-F1974m 10mg/kg 6/7 0/7 1/7
[實施例21]嗜中性球的單離及因IL-8之嗜中性球的移轉性評價 IL-8具有嗜中性球趨化能，於損傷組織所產生的IL-8係促進接著於血管內皮組織的嗜中性球對組織的移轉，可謂引起伴隨嗜中性球浸潤的炎症。如表27所示，於子宮內膜異位症病變部位，確認到嗜中性球或巨噬細胞、單核球的浸潤，於該等免疫細胞中CXCR1、CXCR2表現皆為陽性。再者，由於上皮細胞中亦表現為弱陽性至陽性，顯示具有對於子宮內膜異位症上皮細胞之IL-8的直接藥理作用，與經由嗜中性球或巨噬細胞等的浸潤免疫細胞的藥理作用的可能性。此處，首先，評價嗜中性球之對IL-8的移轉性。由健康人的末梢血液，如下述方式進行採取、單離、精製嗜中性球。 於經肝素處理的全血添加1/5量的HetaSep(STEMCELL Technologies公司製)，根據製品方案，回收包含有核細胞的上清，添加ACK solution (GIBCO公司製)進行溶血。溶血後，懸濁於0.1%BSA/PBS，計測細胞數。細胞數計測後，調整細胞數，使用EasySep(註冊商標) Human Neutrophil Enrichment Kit (STEMCELL technologies公司製)，根據製品方案，經由EasySep(註冊商標) Magnet(STEMCELL technologies公司製)單離嗜中性球。單離後的嗜中性球，使用抗CD66b抗體、抗CD45RA抗體，經由FACS確認精製度沒有問題。 經單離的嗜中性球，使用CytoSelect(註冊商標)96-孔Cell Migration Assay (Cell Biolabs公司製，商品目錄編號: CBA-104)的Migration Plate評價移轉性。膜下層的feeder tray的1%FBS或1%FBS+IL-8(100 ng/mL)中，添加150 μL經添加各種抗體、化合物或溶媒對照的RPMI-1640培養基(SIGMA公司製)。作為評價對象，抗體係H1009/L395-F1974m以外，設置抗IL-8中和抗體之Anti-IL-8抗體[807](abcam公司製，商品目錄編號: ab18672)、Anti-IL-8抗體[6217](abcam公司製，商品目錄編號: ab10768)、作陰性對照之IgG1(SIGMA公司製，商品目錄編號: I5154)分別為10 μg/mL，化合物係CXCR2阻礙劑之SRT3109 (Shanghai Haoyuan Chemexpress公司製，商品目錄編號: HY-15462)10 μΜ，作為對照溶媒之PBS、DMSO。於膜上層的膜腔室(membrane chamber)以成為50000細胞/孔的方式播種經懸濁於無血清的RPMI-1640培養基的嗜中性球細胞。2小時的培養後，使用CellTiter-Glo(註冊商標)Luminescent Cell Viability Assay (Promega公司製)由相對化學發光量檢出下層feeder tray中的經移轉的活細胞數(嗜中性球)。以不添加IL-8的孔的相對化學發光量平均作為1，算出各試藥添加時相對化學發光量的相對值的結果示於圖39。 其結果，確認經由IL-8之嗜中性球的移轉促進，以及經由各種抗IL-8中和抗體及CXCR2阻礙劑之嗜中性球的移轉阻礙。由本結果支持，不僅IL-8阻礙劑，已知有關IL-8訊息阻礙之CXCR1阻礙劑或CXCR2阻礙劑等IL-8訊息阻礙劑具有大幅地抑制嗜中性球移轉的高可能性。因此，顯示IL-8訊息阻礙劑，對於浸潤於以子宮內膜異位症為主的IL-8為高濃度之病變部的嗜中性球，亦具有同樣地浸潤抑制的高可能性。因此，該領域業者可一般化、擴張化而充分地理解，由IL-8訊息阻礙劑可預防子宮內膜異位症以及已知IL-8為高濃度之炎症疾病之結果。
[實施例22]對於子宮內膜異位症細胞之嗜中性球的作用 其次，研究浸潤於子宮內膜異位症病變部的嗜中性球，對於子宮內膜異位症細胞係以何種方式作用。子宮內膜異位症細胞係以下述方式獲得。手術取出的人類子宮內膜異位症組織，在包含0.5 mg/mL膠原蛋白酶、0.1 mg/mL DNase1的DMEM/F-12、HEPES(GIBCO公司製)培養基內細切，於37℃培養後回收細胞。細胞懸濁液通過100μm的細胞過濾器(cell strainer)後，經由Lysing Buffer (BD Biosciences)進行溶血。溶血後，播種細胞，經繼代者作為子宮內膜異位症細胞於液態氮中冷凍保存。培養係使用於DMEM/F-12、HEPES經添加10%FBS、2.5 μg/mL雙性殺黴素B、100U/mL盤尼西林、100μg/mL鏈黴素者。實驗係將經凍結保存的細胞復活使用。 對於以上述方法所得子宮內膜異位症細胞，添加嗜中性球培養上清，研究子宮內膜異位症細胞之反應性。嗜中性球培養上清，將嗜中性球單離後，懸濁於包含1%FBS的RPMI-1640培養基、以3.0×10 6細胞/孔播種於6孔盤，回收經1日培養的培養上清。於96孔盤以10000細胞/孔播種子宮內膜異位症細胞，以成為培養基半量的方式添加經回收之嗜中性球培養上清。對照群(本實施例中，亦稱為「Ctrl」)亦同樣地添加培養基半量之包含1%FBS的RPMI-1640培養基。8小時後，去除培養基，使用RNeasy 96 Kit(QIAGEN公司製)，根據製品方案精製RNA。精製RNA使用SuperScript(註冊商標)VILO(註冊商標)MaterMix(Invitrogen公司製)合成cDNA，經由real-time PCR法比較芳香酶的mRNA表現量。芳香酶的探針，係使用Taqman探針之Hs00903411_m1(Thermo Fisher公司製)，GAPDH的測定係使用Human GAPD(GAPDH) Endogenous Control(Applied Biosystem公司製，商品目錄編號: 4326317E)。 圖40中，顯示將芳香酶的表現量以GAPDH校正後，Ctrl為1時的芳香酶的相對表現量。經添加嗜中性球的培養上清的子宮內膜異位症細胞，確認芳香酶表現量的亢進。 已知芳香酶係雌激素合成酵素，雌激素促進子宮內膜異位症上皮細胞的增殖。經由嗜中性球培養上清的添加，由於子宮內膜症細胞中的芳香酶表現亢進，顯示因嗜中性球浸潤於子宮內膜異位症病變部，子宮內膜異位症細胞中芳香酶表現量亢進，而子宮內膜異位症上皮細胞的增殖亢進。因此，經由IL-8訊息阻礙劑，抑制對子宮內膜異位症病變部的嗜中性球浸潤，推測子宮內膜異位症上皮細胞的增殖受到抑制。於子宮內膜異位症的外科性誘導猴模型中，抗體H1009/L395-F1974m投予群中亦確認顯示增殖性的上皮細胞的萎縮，支持上述推測。
[實施例23]嗜中性球產生趨化介素、細胞激素的解析 其次，於IL-8添加、非添加時、抗IL-8抗體添加時，解析嗜中性球中產生何種趨化介素或細胞激素、增殖因子。經單離的嗜中性球，懸濁於包含1%FBS的RPMI-1640培養基，以1.5×10 6細胞/孔各播種於6-孔盤。對其添加、非添加IL-8、或添加IL-8與各種抗體，培養1日。抗體係分別以終濃度為10μg/mL的方式添加H1009/L395-F1974m、Anti-IL-8抗體[807](ab18672)、IgG1，IL-8以終濃度為100 ng/mL的方式添加。1日後，回收細胞培養液，使用Cytokine Human Magnetic 30-Plex Panel for the Luminex (註冊商標) platform (Thermo Fisher公司製)，根據製品方案調查細胞培養液中的複數的各種趨化介素、細胞激素及增殖因子的濃度。 其結果，如圖41所示，細胞培養液中的MCP-1(單核球趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1)濃度中，可觀察到藉由IL-8添加強力上升，經由抗IL-8中和抗體則上升受到抑制。 MCP-1亦稱為CCL2，具有單核球趨化能，意味促進對炎症局部的單核球的移轉及浸潤。如表26所示，於子宮內膜異位症的外科性誘導猴模型的結節性病變部，由於含鐵血黃素於抗體H1009/L395-F1974m投予群減少，顯示巨噬細胞或單核球藉由抗體投予於受到浸潤抑制。由本結果顯示，由於因IL-8刺激嗜中性球而使具有單核球趨化能的MCP-1產生，經由IL-8，嗜中性球於子宮內膜異位症病變部浸潤，進一步地產生MCP-1，單核球及巨噬細胞進一步對病變部位移轉、浸潤的可能性。 進一步地，已知MCP-1作用於纖維母細胞促進膠原蛋白產生而作用(J Biol Chem. 1996 Jul 26; 271(30): 17779-84)，亦有多數報告於活體內亢進組織的纖維化(J Immunol. 1994 Nov 15; 153(10): 4733-41，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004 May; 286(5): L1038-44，J Invest Dermatol. 2003 Sep; 121(3): 510-6)。經由IL-8，嗜中性球於子宮內膜異位症病變部浸潤，進一步地嗜中性球產生MCP-1，除了促進單核球及巨噬細胞的移轉、浸潤之外，顯示亦有促進對於子宮內膜異位症病變部的纖維化的可能性。由本結果，經由IL-8訊息阻礙劑，經由抑制嗜中性球浸潤，顯示於子宮內膜異位症病變部的纖維化經改善。實際上，於子宮內膜異位症外科性誘導猴模型的結節性病變部，如圖36及表26所示，抗體H1009/L395-F1974m投予群中確認以膠原纖維為主體的組織間隙(interstitium)的減少，確認具有對於纖維化改善的藥效。由以上可知，IL-8訊息阻礙劑對於子宮內膜異位症纖維化為有用的係具高可能性受到支持。該領域業者可一般化、擴張化的充分地理解，由IL-8訊息阻礙劑對於子宮內膜異位症的纖維化、進一步地對於各種纖維化症可治療或預防的結果。
[實施例24]術後沾黏誘導猴模型的製作與病態評價 (24-1)術後沾黏誘導猴模型的製作 為了製作術後沾黏誘導猴模型，對於9至16歲齡的雌性食蟹獼猴(由醫藥基盤‧健康‧營養研究所 靈長類醫科學研究中心取得)，於麻醉下進行以下的作業。麻醉係使用克他明/甲苯噻嗪(ketamine/xylazine)的平衡麻醉(以2:1的比率為目標混合)與異氟醚(isoflurane)。腹壁正中線切開5公分至6公分開腹後，子宮體部切開1公分以單線縫合4針後以紗布擦拭子宮全體5次。其次由切開的腹壁正中線2公分的右腹壁腹膜部分切開1公分，以吸收線4針連續縫合。再者，縫合後以紗布擦拭縫合部分5次。同樣地亦將左腹壁腹膜切開、縫合、以紗布擦拭。最後將腹壁正中線以連續縫合方式縫合10針至11針，所有的作業於1小時以內完成。術後的覺醒時投予拮抗藥的安醒順(antisedan)(目標為與甲苯噻嗪量為同量)與抗生劑之頭孢拉丁(cephradine)。再者，術後2日間投予鎮痛劑之紮露班(zaruban)，以每日的定期觀察確認術後無異常。又，腹腔鏡觀察時亦同樣地實施麻醉與術後管理。
(24-2)術後沾黏誘導模型中抗IL-8抗體的藥效評價 對於抗IL-8抗體投予群的動物，於上述的術後沾黏誘導手術後，一小時以內以10 mg/kg靜脈內投予抗IL-8抗體之H1009/L395-F1974m。對照群為無處置。由抗IL-8抗體的投予24日至35日後進行腹腔鏡觀察，觀察藉由切開、縫合、紗布擦拭的作業所形成的沾黏。腹腔鏡觀察，係於麻醉下切開腹部正中，刺入連針套管(trocar)，插入腹腔鏡。腹腔鏡係連接影像系統(KARL STORAZE)以及監視器，記錄係以影像系統進行，腹腔鏡的觀察係以監視器進行。沾黏的尺寸係使用附有刻度的棒或附有刻度的鉗子測定。沾黏的有無、範圍及沾黏的位置於腹腔鏡觀察時評價。結果示於表29。腹腔鏡觀察的結果，無處置群的2隻猴中，確認切開部位全部沾黏。抗IL-8抗體投予群中，個體No.206雖然確認有沾黏，個體No.201於左右腹壁腹膜及子宮切開部未確認有沾黏，顯示經由抗IL-8抗體的沾黏預防效果。由該結果，顯示抗IL-8抗體對於做為沾黏預防劑為有用。只要為該領域業者，當然可理解適宜變更投予時點等，經由抗IL-8抗體，可發揮更高的預防沾黏形成效果。再者，由該結果，該領域業者當然可理解，IL-8訊息阻礙劑有用於作為沾黏預防劑。
[表29]
   切開部位
腹壁 子宮
正中線 腹膜(R) 腹膜(L)
無處置 #202 ○ ○ ○ ○
#204 ○ ○ ○ ○
抗IL-8抗體 #201 ○ × × ×
#206 ○ ○ ○ ○
○=有沾黏 ×=無沾黏
[實施例25]由單核球分化之巨噬細胞之IL-8的功能解析與抗IL-8抗體的藥效評價 購入由健康人末梢血液CD14陽性劃分所分離之單核球(All Cells公司，商品目錄編號: PB011-P-F-2)，保管於-80℃。使用於實驗之際，以下述方式解凍使用細胞。於經37℃水浴解凍之細胞添加包含DNaseI(STEMCELL Technologies公司製，商品目錄編號: 07900)及10%FBS的培養基，以高速離心機離心後，去除上清。重複該作業後，將細胞懸濁於適量的培養基，計測細胞數。單核球於活體外進行成為巨噬細胞的分化培養，研究於IL-8存在下以及非存在下的結締組織生長因子(Connecting tissue growth factor (CTGF))的表現變化。CTGF係促進纖維化的因子。單核球懸濁於包含10%FBS及25 ng/mL GM-CSF(SIGMA公司製)的RPMI-1640(SIGMA公司製)培養基，播種於培養用盤。每2日或3日各交換半量培養上清，培養7日期間。7日後，去除培養上清，於包含10%FBS及20 ng/mL IFN-γ(SIGMA公司製)、10 pg/mL LPS(和光純藥工業公司製)的RPMI-1640培養基添加100 ng/mL的IL-8及各種抗體，培養3日期間。 經評價的抗體為H1009/L395-F1974m抗體、Anti-IL-8抗體[807](abcam公司製，商品目錄編號: ab18672)、Anti-IL-8抗體[6217](abcam公司製，商品目錄編號: ab10768)、Anti-IL-8抗體(Becton Dickinson公司製，商品目錄編號: BD554726)、Anti-IL-8抗體(Becton Dickinson公司製，商品目錄編號: BD555717)，以10 μg/mL的濃度使用。作為陰性對象以10 μg/mL的濃度使用IgG1(SIGMA公司製，商品目錄編號: I5154)。 培養3日後，回收細胞，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製)，根據製品方案精製RNA。精製RNA係使用SuperScript VILO Master Mix (Thermo Fisher公司製)合成cDNA，經由real-timePCR法評價CTGF的mRNA表現量。CTGF的探針，使用Taqman探針的Hs00170014_m1(Thermo Fisher 公司製)，18SrRNA的測定係使用Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control (Thermo Fisher公司製，商品目錄編號: E4319413E)。 圖42中，顯示以18S rRNA校正的CTGF的表現量的值。IL-8無添加條件中，由單核球分化之巨噬細胞中完全未確認CTGF的表現。另一方面，於經添加IL-8的條件中，於經分化的巨噬細胞中確認CTGF表現上升。由該結果，顯示IL-8對於自單核球分化為巨噬細胞，具有誘導CTGF的表現上升的功能。進一步地，IL-8與抗IL-8抗體同時添加，未確認CTGF的表現上升。顯示經由IL-8之CTGF的表現上升，藉由各種各樣的抗IL-8抗體受到抑制。由該結果，所屬技術領域中具通常知識者當然可理解IL-8為纖維化的進行的相關因子，以及抗IL-8抗體等IL-8訊息阻礙劑對於纖維化及病友對於作為治療劑或預防劑是有用的。
[參考實施例1]胺基酸經置換之IgG抗體的表現載體的構築 使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)，藉由將以隨附說明書記載的方法所製作之包含改變體的質體片段插入至動物細胞表現載體，製作目的之H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得之表現載體的鹼基序列可以該領域業者習知的方法決定。
[參考實施例2]IgG抗體的表現與精製 抗體的表現係使用以下的方法進行。源自人類胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸濁於包含10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6×10 6細胞/mL的細胞密度於貼附細胞用培養皿(直徑10cm，CORNING)的各盤各接種10 mL後於CO 2培養箱(37℃，5%CO 2)內培養一晝夜後，吸引去除培養基，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9 mL。經調製的質體經由Lipofection法導入至細胞。回收所得培養上清後，離心分離(約2000 g，5分鐘，室溫)去除細胞，進一步地通過0.22 μm過濾器MILLEX®-GV(Millipore)滅菌獲得培養上清。所得培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences)以該領域業者習知的方法精製。精製抗體的濃度，使用分光光度計測定280nm的吸光度。由所得之值使用經由Protein Science 1995; 4: 2411-2423所記述的方法算出吸光係數而算出抗體濃度。 [產業上可利用性]
經由本發明，顯示抗IL-8抗體等對於作為子宮內膜異位症等的治療劑及/或預防劑是有用的。本發明對於子宮內膜異位症病變體積的縮小、沾黏的改善、上皮及基質細胞的萎縮性變化、免疫細胞的浸潤減少、纖維化的改善等是有用的。
無
圖1為顯示具有天然人類IgG1的Fc區域的Fv4-IgG1之對於RA患者血清中類風濕性因子的結合程度。 圖2為顯示Fv4-YTE之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖3為顯示Fv4-LS之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖4為顯示Fv4-N434H之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖5為顯示Fv4-F1847m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖6為顯示Fv4-F1848m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖7為顯示Fv4-F1886m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖8為顯示Fv4-F1889m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖9為顯示Fv4-F1927m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖10為顯示Fv4-F1168m之對於RA患者血清中的類風濕性因子的結合程度。 圖11為顯示Fv4-IgG1及包含各種FcRn結合增大Fc區域改變體的抗體之各者，對於RA患者血液的類風濕性因子的結合性的平均值。 圖12為顯示抗人類IgE抗體之具有天然人類IgG1的Fc區域的OHB-IgG1，及包含各種FcRn結合增大Fc區域改變體的抗體(OHB-LS、OHB-N434A、OHB-F1847m、OHB-F1848m、OHB-F1886m、OHB-F1889m、OHB-F1927m)分別投予至食蟹獼猴的情況，該食蟹獼猴的血漿中的各種抗人類IgE抗體的濃度推移。 圖13為顯示抗人類IL-6受體抗體之Fv4-IgG1與該抗體於酸性pH中對FcRn的結合性增大之Fv4-F1718，分別投予至人類FcRn基因轉殖小鼠的情況，該小鼠血漿中的抗體的濃度推移。 圖14為顯示於pH7.4與pH5.8，H998/L63及Hr9之對於IL-8的結合以Biacore測定時所獲得的感應圖譜。 圖15為顯示經與人類IL-8混合之H998/L63及H89/L118，分別以2mg/kg投予小鼠的情況，該小鼠血漿中人類IL-8的濃度推移。 圖16為顯示經與人類IL-8混合之H89/L118，分別以2mg/kg或8mg/kg投予小鼠的情況，該小鼠血漿中人類IL-8的濃度推移。 圖17為顯示經與人類IL-8混合之H89/L118及H553/L118，分別以2mg/kg或8mg/kg投予小鼠的情況，該小鼠血漿中人類IL-8的濃度推移。 圖18-1為顯示於Hr9、H89/L118、及H553/L118之血漿中來自保存前的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖18-2為顯示Hr9、H89/L118、及H553/L118之血漿中來自保存1週後的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖18-3為顯示Hr9、H89/L118、及H553/L118之血漿中來自保存2週後的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖19為顯示以EpiMatrix所預測之各IL-8抗體(hWS4、Hr9、H89/L118、H496/L118、H553/L118)的ADA發生預測頻率與其他既存的抗體醫藥的ADA發生預測頻率。 圖20為顯示以EpiMatrix所預測之各IL-8抗體(H496/L118、H496v1/L118、H496v2/L118、H496v3/L118、H1004/L118、H1004/L395)的ADA發生預測頻率與其他既存的抗體醫藥的ADA發生預測頻率。 圖21-1為顯示於Hr9、H89/L118、及H1009/L395-F1886s之血漿中來自保存前的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖21-2為顯示Hr9、H89/L118、及H1009/L395-F1886s之血漿中來自保存1週後的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖21-3為顯示Hr9、H89/L118、及H1009/L395-F1886s之血漿中來自保存2週後的抗體的化學發光量的相對值，因抗體濃度的推移。 圖22為顯示經與人類IL-8混合之H1009/L395、H553/L118及H998/L63，分別投予至小鼠的情況，該小鼠血漿中人類IL-8的濃度推移。 圖23為顯示將Hr9、H89/L118及H1009/L395，單獨添加於細胞外基質的情況，與人類IL-8混合而添加的情況，對於細胞外基質的結合量。 圖24為顯示具有含有H1009/L395可變區域且具有不結合於FcRn的Fc區域(F1942m)的抗體，單獨投予至人類FcRn基因轉殖小鼠的情況，與人類IL-8混合而投予至人類FcRn基因轉殖小鼠的情況，該各小鼠的血漿中抗體的濃度推移。 圖25為顯示以EpiMatrix預測之H1009/L395及H1004/L395的ADA發生預測頻率與其他既存的抗體醫藥的ADA發生預測頻率。 圖26為顯示具有H89/L118的可變區域，具有天然人類IgG1的Fc區域的H89/L118-IgG1，及包含各種FcRn結合增大Fc區域改變體的抗體(H89/L118-F1168m、H89/L118-F1847m、H89/L118-F1848m、H89/L118-F1886m、H89/L118-F1889m、H89/L118/F1927m)分別投予至食蟹獼猴的情況，該食蟹獼猴的血漿中各種抗人類Il-8抗體的濃度推移。 圖27為顯示具有H1009/L395的可變區域的抗體，Fc區域為改變體(F1886m、F1886s、F1974m)的抗體，對於各種FcγR的結合性。 圖28為顯示經與人類IL-8混合之抗IL-8抗體投予至人類FcRn基因轉殖小鼠的情況，該小鼠血漿中人類IL-8的濃度推移。該抗IL-8抗體為包含H1009/L395的可變區域及天然人類IgG1的Fc區域的H1009/L395-IgG1(2 mg/kg)，與包含H1009/ L395的可變區域及經改變的Fc區域的H1009/L395-F1886s (2、5或10 mg/kg)。 圖29為表示包含天然人類IgG1的Fc區域之Hr9-IgG1、H89/L118-IgG1，與包含經改變的Fc區域之H1009/L395- F1886s、H1009/L395-F1974m，分別投予至食蟹獼猴的情況，該食蟹獼猴的血漿中各抗體的濃度推移。 圖30為顯示子宮內膜異位症患者的囊胞液中的IL-8濃度圖。 圖31為顯示記錄了子宮內膜組織細切後，由接種所形成之病變部位及由沾黏及縫合所形成的病變部位的腹腔鏡觀察記錄用紙圖。 圖32為顯示誘導4個月後及誘導12個月後(投予6個月後)，結節性病變的形成及沾黏的形成的影像圖。 圖33為顯示誘導12個月後(投予6個月後)，顯示所形成的增殖性的類子宮內膜異位症內膜上皮及基質的影像圖。 圖34-1為顯示於猴的子宮內膜異位症模型中，囊胞液中的IL-8濃度及沾黏r-AFS分數顯示高相關關係的圖。 圖34-2為顯示投予媒劑或抗體H1009/L395-F1974m的情況，子宮內膜異位症的結節性病變的相對體積圖。 圖35-1為顯示媒劑或抗體H1009/L395-F1974m投予的前後，總r-AFS分數、沾黏r-AFS分數、尺寸r-AFS分數的變化圖。 圖35-2為顯示媒劑或抗體H1009/L395-F1974m投予的前後，總r-AFS分數的變化圖。 圖36為顯示誘導12個月後(投予6個月後)，於媒劑及抗體H1009/L395-F1974m投予群中，移植部的病理組織影像。與媒劑群比較，於抗體H1009/L395-F1974m投予群中，確認顯示增殖性的上皮及基質細胞的萎縮或組織間隙的減少。 圖37為顯示於併發子宮腺肌症的猴子的媒劑與抗體H1009/L395-F1974m投予群中，子宮內膜組織的影像圖。與媒劑群比較，抗體H1009/L395-F1974m投予群中，確認內膜上皮的萎縮以及基質細胞的減少與萎縮。 圖38為顯示關於外科手術後的沾黏，猴子的子宮內膜異位症模型中媒劑群與抗體H1009/L395-F1974m投予群的代表性腹腔內的影像圖。 圖39為顯示相對於不添加IL-8的孔中，嗜中性球的轉移能力，各種藥物添加時之各孔中嗜中性球的轉移能力的相對於評價結果。 圖40為顯示於子宮內膜異位症細胞經添加嗜中性球培養上清液的情況，解析芳香酶表現量的結果。 圖41為顯示經添加IL-8或抗IL-8抗體時，解析嗜中性球培養液中的MCP-1濃度的結果。 圖42為顯示經添加IL-8或抗IL-8抗體時，解析巨噬細胞之CTGF的表現結果。
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  1. 一種如說明書及圖式所述之結合於人類IL-8之經單離抗IL-8抗體。
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