BR112014007353B1 - Biblioteca de anticorpos dependentes de concentração de íon - Google Patents

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Abstract

BIBLIOTECA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AS REFERIDAS MOLÉCULAS, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA BIBLIOTECA, PARA SELECIONAR UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO E DE PRODUÇÃO DE MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, A REFERIDA MOLÉCULA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO AS MESMAS. A presente invenção refere-se a uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas d e ligação de antígeno que se diferem na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon. Da mesma forma descrita é uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo cada qual codificando as moléculas de ligação de antígeno, uma composição que compreende uma pluralidade de vetores cada qual compreendendo as moléculas de polinucleotídeo, um método para selecionar as moléculas de ligação de antígeno, um método para isolar as moléculas de polinucleotídeo, um método para produzir as moléculas de ligação de antígeno, e uma composição farmacêutica que compreende qualquer dentre as moléculas de ligação de antígeno.

Description

CAMPO TÉCNICO PEDIDO RELACIONADO
[001] O presente pedido reivindica a prioridade com base no Pedido de Patente Japonês Nos 2011-218006 (depositado em 30 de setembro de 2011) e 2012-123479 (depositado em 30 de maio de 2012), os conteúdos dos quais estão aqui incorporados por em sua totalidade.
CAMPO DE INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a uma biblioteca de moléculas de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, um método para produzir a biblioteca, um método para selecionar uma tal molécula de ligação de antígeno, um método para produzir uma tal molécula de ligação de antígeno, e uma composição farmacêutica que compreende uma tal molécula de ligação de antígeno.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[003] Os anticorpos receberam atenção como agentes farmacêuticos por causa de sua estabilidade alta no plasma e poucas reações adversas. Entre outros, muitos fármacos de anticorpo de IgG já foram lançados, e um número grande de fármaco de anticorpo ainda está sob desenvolvimento (Literaturas de Não Patente 1 e 2). Enquanto isso, várias técnicas aplicáveis ao fármaco de anticorpo de segundo-geração foram desenvolvidas. Por exemplo, técnicas de melhorar as funções efetoras, capacidade de ligação de antígeno, farmacocinética, ou estabilidade de reduzir o risco de imunogenicidade foram relacionadas (Literatura de Não Patente 3). Possíveis problemas de tais fármacos de anticorpo são a preparação difícil de preparações de administração subcutâneas (isto é porque os fármacos de anticorpo geralmente são administrados em doses muito altas), custo de produção alto, etc. Métodos para melhorar a farmacocinética dos anticorpos e métodos para melhorar a afinidade de anticorpos pelos antígenos podem ser usados para reduzir as doses dos fármacos de anticorpo.
[004] A substituição artificial de aminoácidos em regiões constantes foi relacionada como um método para melhorar a farmacocinética de anticorpos (Literaturas de Não Patente 4 e 5). A maturação da afinidade previamente relacionada, uma técnica de realçar a capacidade de ligação de antígeno e capacidade de neutralização de antígeno (Literatura de Não Patente 6), envolve a transformação dos aminoácidos em, por exemplo, regiões de CDR de regiões variáveis, para desse modo alcançar a atividade de ligação de antígeno realçada. Tal realce na capacidade de ligação de antígeno pode melhorar a atividade biológica in vitro ou reduzir doses e melhorar a eficácia de fármaco também in vivo (Literatura de Não Patente 7).
[005] A quantidade de um antígeno que pode ser neutralizado por uma molécula de anticorpo depende da afinidade. A afinidade mais forte permite o anticorpo em uma quantidade menor neutralizar o antígeno. A afinidade de anticorpo pode ser realçada por vários métodos (Literatura de Não Patente 6). Um anticorpo capaz de covalentemente ligar-se a um antígeno com afinidade infinita poderia neutralizar, por uma molécula, uma molécula de antígeno (ou dois antígenos no caso de um anticorpo divalente). Entretanto, os métodos prévios têm uma limitação estequiométrica de reação de neutralização até uma molécula de antígeno (ou dois antígenos no caso de um anticorpo divalente) por molécula de anticorpo e não pode neutralizar completamente um antígeno que usa um anticorpo em uma quantidade abaixo da quantidade do antígeno. Em resumo, há uma limitação do efeito do realce da atividade (Literatura de Não Patente 9). Uma determinada duração do efeito de neutralização de um anticorpo de neutralização requer a administração do anticorpo em uma quantidade acima da quantidade de um antígeno produzido in vivo durante o período. Apenas a técnica supracitada para melhoria nas farmacocinéticas de anticorpos ou maturação de afinidade não é suficiente para reduzir as doses de anticorpo necessárias. Neste respeito, um anticorpo tem que neutralizar uma pluralidade de antígenos para sustentar seu efeito de neutralização de antígeno durante o período de interesse em uma quantidade abaixo da quantidade do antígeno.
[006] Para atingir este objetivo, um anticorpo que liga-se a um antígeno de uma maneira dependente do pH foi relacionado recentemente como um novo método (Literatura de Patente 1). Esta literatura descreve que o resíduo de histidina é introduzido a uma molécula de ligação de antígeno para preparar um anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH, cuja propriedade é alterada entre as condições de de pH neutro e de pH ácido. Este anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH liga-se ao antígeno fortemente sob a condição neutra no plasma e dissociado do antígeno sob a condição ácida no endossoma. Desse modo, o anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH pode ser dissociado do antígeno no endossoma. O anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH desse modo dissociado do antígeno pode ligar-se a um antígeno após ser novamente reciclado ao plasma por FcRn. Isto permite um anticorpo ligar-se repetidamente a uma pluralidade de antígenos.
[007] Os antígenos têm retenção de plasma muito curta, em comparação com anticorpos que são reciclados através da ligação ao FcRn. Complexos de anticorpo-antígeno de anticorpos que têm meia- vida longa no plasma (retenção de plasma longa) e tais antígenos que têm meia-vida no plasma (retenção de plasma curta) têm retenção de plasma tão longa quanto aquela dos anticorpos. A ligação de um antígeno para um anticorpo prolonga sua retenção de plasma e aumenta a concentração de antígeno de aumentos no plasma. Em um tal caso, mesmo a melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno não pode promover a depuração do antígeno do plasma. Segundo relatos, o anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH mencionado acima é da mesma forma mais eficaz como um método para promover a depuração de antígeno do plasma do que os anticorpos convencionais (Literatura de Patente 1).
[008] Desse modo, o anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH pode ligar-se a uma pluralidade de antígenos por uma molécula de anticorpo para promover a depuração dos antígenos do plasma, em comparação com os anticorpos convencionais, e como tal, tem efeitos que não podem ser obtido pelos anticorpos convencionais. Um aminoácido em uma sequência de anticorpo existente pode ser substituído para desse modo conceder a este atividade de ligação de antígeno dependente do pH. Enquanto isso, um método para obter anticorpos a partir de animais imunizados ou um método para obter anticorpos a partir de uma biblioteca de anticorpo humana pode ser usado para obter um tal anticorpo novo, porém, tem possíveis limitações como descrito abaixo.
[009] Um método que envolve a imunização de animais não humanos poderia produzir o anticorpo de ligação dependente do pH, porém raramente pode raramente produzir anticorpos de ligação de antígeno dependentes do pH junto a vários tipos de antígenos em um curto tempo ou seletivamente produzir anticorpos que especificamente ligam-se a epítopos particulares. Alternativamente, um anticorpo pode ser enriquecido a partir de uma biblioteca de anticorpo humana com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice. A frequência do aparecimento de resíduos de histidina nas regiões variáveis de um anticorpo humano (registrado no banco de dados de Kabat), entretanto, geralmente é conhecida por não ser alta, como visto a partir de 5,9% para cadeia pesada CDR1, 1,4% para cadeia pesada CDR2, 1,6% para cadeia pesada CDR3, 1,5% para CDR1 de cadeia leve, 0,5% para cadeia leve CDR2, e 2,2% para cadeia leve CDR3, sugerindo que a biblioteca de anticorpo humana contenha apenas um número muito pequeno de sequências que pode ter capacidade de ligação de antígeno dependente do pH. Consequentemente, houve uma demanda para fornecer uma biblioteca de anticorpo que tem a frequência aumentada de aparecimento de histidina em sítios de ligação de antígeno e é rico em sequências que podem ter capacidade de ligação de antígeno dependente do pH.
[0010] Efeitos tal como a promoção da depuração de antígeno do plasma podem ser obtidos se a dependência de capacidade de ligação de antígeno em um fator (diferente de pH) diferente entre os ambientes de plasma e endossoma precoce puder ser conferida ao anticorpo.
[0011] As listas de citação da presente invenção serão produzidas abaixo.
LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA PATENTE
[0012] Literatura de Patente 1: WO2009125825 LITERATURA DE NÃO PATENTE Literatura de Não Patente 1: Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 Literatura de Não Patente 2: Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008, Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396. Literatura de Não Patente 3: Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies, Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29 Literatura de Não Patente 4: Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life, J Immunol. (2006) 176 (1), 346356 Literatura de Não Patente 5: Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640 Literatura de Não Patente 6: Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2005) 102 (24), 8466-8471 Literatura de Não Patente 7: Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract, J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665 Literatura de Não Patente 8: Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol, (2005) 16 (6), 631-6 Literatura de Não Patente 9: Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 100413.
SUMÁRIO DE INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[0013] A presente invenção foi feita levando em consideração uma tal situação, e um objetivo da presente invenção é fornecer uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos de um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon, uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo cada qual codificando as moléculas de ligação de antígeno, uma composição que compreende uma pluralidade de vetores cada qual compreendendo as moléculas de polinucleotídeo, um método para selecionar as moléculas de ligação de antígeno, um método para isolar as moléculas de polinucleotídeo, um método para produzir as moléculas de ligação de antígeno, e uma composição farmacêutica que compreende quaisquer das moléculas de ligação de antígeno.
SOLUÇÃO PARA PROBLEMA
[0014] Os presentes inventores conduziram estudos diligentes em uma biblioteca que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo da diferença no fator ambiental in vivo. Como resultado, os presentes inventores focalizaram-se na diferença em concentração de íon, particularmente, concentração de íon de cálcio, entre plasma e endossoma precoce ou nos pHs destes ambientes e constataram que o uso de moléculas de ligação de antígeno que têm atividade de ligação de antígeno dependente de cálcio ou dependente do pH permite a promoção da captação celular de antígenos pelas moléculas de ligação de antígeno e preparação de uma biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que reduzem a concentração de antígeno no plasma.
[0015] Especificamente, a presente invenção refere-se a uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon, uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo cada qual codificando as moléculas de ligação de antígeno, uma composição que compreende uma pluralidade de vetores cada qual compreendendo as moléculas de polinucleotídeo, um método para selecionar as moléculas de ligação de antígeno, um método para isolar as moléculas de polinucleotídeo, um método para produzir as moléculas de ligação de antígeno, uma composição farmacêutica que compreende quaisquer das moléculas de ligação de antígeno, etc.. Mais especificamente, a presente invenção refere-se aos seguintes:
[0016] [1] Uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon.
[0017] [2] A biblioteca de acordo com [1], em que a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio.
[0018] [3] A biblioteca de acordo com [2], em que o resíduo de aminoácido está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno.
[0019] [4] A biblioteca de acordo com [3], em que o domínio de ligação de antígeno em uma cadeia pesada é uma região variável de cadeia pesada.
[0020] [5] A biblioteca de acordo com [4], em que o resíduo de aminoácido está contido em CDR3 da região variável de cadeia pesada.
[0021] [6] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [2] a [5], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 95, 96, 100a, e 101 definidas pela numeração de Kabat na cadeia pesada CDR3.
[0022] [7] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [2] a [6], em que uma sequência de aminoácido com exceção do resíduo de aminoácido compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
[0023] [8] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [3] a [7], em que uma região variável de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
[0024] [9] A biblioteca de acordo com [2], em que o resíduo de aminoácido está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia leve da molécula de ligação de antígeno.
[0025] [10] A biblioteca de acordo com [9], em que o domínio de ligação de antígeno em uma cadeia leve é uma região variável de cadeia leve.
[0026] [11] A biblioteca de acordo com [10], em que o resíduo de aminoácido está contido em CDR1 da região variável de cadeia leve.
[0027] [12] A biblioteca de acordo com [11], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 30, 31, e 32 definidas pela numeração de Kabat na CDR1.
[0028] [13] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [10] a [12], em que o resíduo de aminoácido está contido em CDR2 da região variável de cadeia leve.
[0029] [14] A biblioteca de acordo com [13], em que o resíduo de aminoácido fica localizado na posição 50 definida pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR2.
[0030] [15] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [10] a [14], em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia leve CDR3.
[0031] [16] A biblioteca de acordo com [15], em que o resíduo de aminoácido fica localizado na posição 92 definida pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR3.
[0032] [17] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [2] e [9] a [16], em que uma região de estrutura de cadeia leve na molécula de ligação de antígeno compreende uma sequência de estrutura de linhagem germinativa.
[0033] [18] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [2] e [9] a [17], em que uma região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
[0034] [19] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [1] a [18], em que o resíduo de aminoácido forma um motivo de ligação de cálcio.
[0035] [20] A biblioteca de acordo com [19], em que o motivo de ligação de cálcio é qualquer motivo de ligação de cálcio selecionado a partir de um domínio de caderina, um EF hand, um domínio de C2, um domínio de Gla, uma lectina tipo C, domínio A, uma anexina, um domínio tipo 3 de trombospondina, um domínio tipo EGF, um domínio de Vk5, um domínio representado por SEQ ID N°: 10, e um domínio representado por SEQ ID N°: 11.
[0036] [21] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [2] a [20], em que o resíduo de aminoácido é um aminoácido que tem um efeito de quelação de metal.
[0037] [22] A biblioteca de acordo com [21], em que o aminoácido que tem um efeito de quelação de metal é qualquer um ou mais aminoácido(s) selecionado(s) a partir de serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, e ácido glutâmico.
[0038] [23] A biblioteca de acordo com [1], em que as condições da concentração de íon são condições de pH.
[0039] [24] A biblioteca de acordo com [23], em que o resíduo de aminoácido está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno.
[0040] [25] A biblioteca de acordo com [24], em que o domínio de ligação de antígeno em uma cadeia pesada é uma região variável de cadeia pesada.
[0041] [26] A biblioteca de acordo com [25], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 27, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 95, 96, 97, 98, 99, 100a, 100b, 100d, 100f, 100h, 102, e 107 definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada.
[0042] [27] A biblioteca de acordo com [26], em que uma sequência de aminoácido com exceção do resíduo de aminoácido em qualquer uma ou mais dentre as posições 27, 31, 32, 33, 35, 50, 52, 53, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 95, 96, 97, 98, 99, 100a, 100b, 100d, 100f, 100h, 102, e 107 definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
[0043] [28] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [23] a [27], em que uma região variável de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno compreende uma sequência de linhagem germinativa.
[0044] [29] A biblioteca de acordo com [23], em que o resíduo de aminoácido está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia leve da molécula de ligação de antígeno.
[0045] [30] A biblioteca de acordo com [29], em que o domínio de ligação de antígeno em uma cadeia leve é uma região variável de cadeia leve.
[0046] [31] A biblioteca de acordo com [30], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 24, 27, 28, 30, 31, 32, 34, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 89, 90, 91, 92, 93, 94, e 95a definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve.
[0047] [32] A biblioteca de acordo com [30] ou [31], em que o resíduo de aminoácido está contido em CDR1 da região variável de cadeia leve.
[0048] [33] A biblioteca de acordo com [32], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 24, 27, 28, 30, 31, 32, e 34 definidas pela numeração de Kabat na CDR1 de cadeia leve.
[0049] [34] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [30] a [33], em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia leve CDR2.
[0050] [35] A biblioteca de acordo com [34], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 50, 51, 52, 53, 54, 55, e 56 definidas pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR2.
[0051] [36] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [30] a [35], em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia leve CDR3.
[0052] [37] A biblioteca de acordo com [36], em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 89, 90, 91, 92, 93, 94, e 95a definidas pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR3.
[0053] [38] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [29] a [37], em que uma região de estrutura de cadeia leve compreende uma sequência de estrutura de linhagem germinativa.
[0054] [39] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [29] a [38], em que uma região variável de cadeia pesada tem uma sequência não tratada.
[0055] [40] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [23] a [39], em que o resíduo de aminoácido é um aminoácido que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0.
[0056] [41] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [23] a [40], em que o resíduo de aminoácido é ácido glutâmico.
[0057] [42] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [23] a [39], em que o resíduo de aminoácido é um aminoácido que tem um pKa de cadeia lateral de 5,5 a 7,0.
[0058] [43] A biblioteca de acordo com qualquer dentre [23] a [40] e [42], em que o resíduo de aminoácido é histidina.
[0059] [44] Uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de polipeptídeos de fusão cada qual compreendendo moléculas de ligação de antígeno de acordo com qualquer dentre [1] a [43], em que cada um dos polipeptídeos de fusão é um produto de fusão de uma região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno e pelo menos uma porção de uma proteína do envoltório viral.
[0060] [45] A biblioteca de acordo com [44], em que a proteína do envoltório viral é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína pIII , proteína do envoltório principal pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pv1, e variantes das mesmas.
[0061] [46] Uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo cada qual codificando moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45].
[0062] [47] Uma composição que compreende uma pluralidade de vetores cada qual compreendendo uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo de acordo com [46] em um estado operavelmente ligado.
[0063] [48] A composição de acordo com [47], em que os vetores são vetores de expressão replicáveis.
[0064] [49] A composição de acordo com [48], em que cada um dos vetores de expressão replicáveis é um vetor de expressão, em que o polinucleotídeo é operavelmente ligado a uma região de promotor selecionada a partir do grupo que consiste em um sistema de promotor de lacZ, um promotor de fosfatase alcalina phoA (Ap), um promotor de bacteriófago XPL (promotor sensível à temperatura), um promotor de tac, um promotor de triptofano, um promotor de pBAD, e um promotor de bacteriófago T7.
[0065] [50] A composição de acordo com [48] ou [49], em que cada um dos vetores de expressão replicáveis é um fago M13, f1, fd, ou Pf3 ou um derivado dos mesmos, ou um fago lambdoide ou um derivado dos mesmos.
[0066] [51] Uma composição que compreende uma pluralidade de vírus cada qual compreendendo vetores de acordo com qualquer dentre [47] a [50].
[0067] [52] Uma composição que compreende uma pluralidade de vírus cada qual exibindo sobre sua superfície, moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45].
[0068] [53] Uma biblioteca que compreende moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45], em que a biblioteca tem 1 x 106 a 1 x 1014 sequências de região variável distintas.
[0069] [54] A biblioteca de acordo com [53], em que a biblioteca tem 1 x 108 ou mais sequências de região variável distintas.
[0070] [55] Um método para preparar uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, o método compreendendo produzir uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno projetadas de forma que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreenda pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon.
[0071] [56] O método de preparação de acordo com [55], em que as moléculas de ligação de antígeno são moléculas de ligação de antígeno de acordo com qualquer dentre [2] a [43].
[0072] [57] O método de preparação de acordo com [55] ou [56], em que uma região variável de cadeia pesada de cada uma das moléculas de ligação de antígeno é fundida com pelo menos uma porção de uma proteína do envoltório viral.
[0073] [58] O método de preparação de acordo com qualquer dentre [55] a [57], em que a proteína do envoltório viral é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína pIII, proteína do envoltório principal pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pv1, e variantes das mesmas.
[0074] [59] Um método para selecionar uma molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, o método compreendendo as etapas de: preparar uma biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45]; contatar a biblioteca com antígenos sob duas ou mais condições da concentração de íon diferentes; classificar, a partir da biblioteca, uma subpopulação de moléculas de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon; e isolar cada molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon a partir da subpopulação classificada na etapa c).
[0075] [60] Um método para isolar um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, o método compreendendo as etapas de: preparar uma biblioteca que compreende uma pluralidade de vetores de expressão replicáveis cada qual compreendendo, em um estado operavelmente ligado, uma pluralidade de polinucleotídeos cada qual codificando moléculas de ligação de antígeno que diferem- se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45]; permitir uma pluralidade de vírus cada qual transformado com os vetores de expressão contidos na biblioteca para expressar em sua superfície as moléculas de ligação de antígeno ou os polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente codificada pelos polinucleotídeos; contatar a pluralidade de vírus com antígenos sob duas ou mais condições da concentração de íon diferentes; classificar, a partir da biblioteca, uma subpopulação de vírus, cuja atividade de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon é mudada; isolar cada vírus, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon a partir da subpopulação de vírus classificada na etapa d); e isolar os polinucleotídeos a partir do vírus isolado.
[0076] [61] O método de acordo com [60], em que as etapas c) e d) são adicionalmente repetidas pelo menos uma vez.
[0077] [62] O método de acordo com qualquer dentre [59] a [61], em que a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio.
[0078] [63] O método de acordo com [62], em que uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de antígeno mais baixa sob uma condição da concentração com baixo teor de cálcio do que aquela sob uma condição de concentração com alto teor de cálcio é selecionada.
[0079] [64] O método de acordo com [63], em que a condição da concentração com baixo teor de cálcio é 0,1 μM a 30 μM.
[0080] [65] O método de acordo com [63] ou [64], em que a condição de concentração com alto teor de cálcio é 100 μM a 10 mM.
[0081] [66] O método de acordo com qualquer dentre [59] a [61], em que as condições da concentração de íon são condições de pH.
[0082] [67] O método de acordo com [66], em que uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de antígeno mais baixa em uma condição de pH ácido do que aquela em uma condição de pH neutro é selecionada.
[0083] [68] O método de acordo com [66], em que a condição de pH ácido é pH 4,0 a 6,5.
[0084] [69] O método de acordo com [67] ou [68], em que a condição de pH neutro é pH 6,7 a 10,0.
[0085] [70] Um método para produzir uma molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, o método compreendendo as etapas de: preparar uma biblioteca que compreende uma pluralidade de vetores de expressão replicáveis cada qual compreendendo, em um estado operavelmente ligado, uma pluralidade de polinucleotídeos cada qual codificando moléculas de ligação de antígeno que diferem- se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45]; permitir uma pluralidade de vírus cada qual transformado com os vetores de expressão contidos na biblioteca para expressar em sua superfície as moléculas de ligação de antígeno ou os polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente codificada pelos polinucleotídeos; contatar a pluralidade de vírus com antígenos sob duas ou mais condições da concentração de íon diferentes; classificar, a partir da biblioteca, uma subpopulação de vírus, cuja atividade de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon é mudada; isolar cada vírus, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon a partir da subpopulação de vírus classificada na etapa d); isolar o polinucleotídeo a partir do vírus isolado; cultivar uma célula hospedeira transfectada com um vetor que tem uma inserção operavelmente ligada do polinucleotídeos isolado; e coletar as moléculas de ligação de antígeno a partir das culturas da célula cultivadas na etapa g).
[0086] [71] Um método para produzir uma molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, o método compreendendo as etapas de: preparar uma biblioteca que compreende uma pluralidade de vetores de expressão replicáveis cada qual compreendendo, em um estado operavelmente ligado, uma pluralidade de polinucleotídeos cada qual codificando moléculas de ligação de antígeno que diferem- se na sequência mutuamente de acordo com qualquer dentre [1] a [43] ou polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente de acordo com [44] ou [45]; permitir uma pluralidade de vírus cada qual transformado com os vetores de expressão contidos na biblioteca para expressar em sua superfície, as moléculas de ligação de antígeno ou os polipeptídeos de fusão que diferem-se na sequência mutuamente codificada pelos polinucleotídeos; contatar a pluralidade de vírus com antígenos sob duas ou mais condições da concentração de íon diferentes; classificar, a partir da biblioteca, uma subpopulação de vírus, cuja atividade de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon é mudada; isolar cada vírus, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon a partir da subpopulação de vírus classificada na etapa d); isolar os polinucleotídeos a partir do vírus isolado; ligar os polinucleotídeos isolados na estrutura com um polinucleotídeo que codifica uma região constante de anticorpo; cultivar uma célula hospedeira transfectada com um vetor que tem uma inserção operavelmente ligada dos polinucleotídeos ligados na etapa g); e recuperar as moléculas de ligação de antígeno a partir das culturas da célula cultivadas na etapa h).
[0087] [72] O método de produção de acordo com [70] ou [71], em que as etapas c) e d) são adicionalmente repetidas pelo menos uma vez.
[0088] [73] O método de produção de acordo com qualquer dentre [70] a [72], em que a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio.
[0089] [74] O método de produção de acordo com [73], em que uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de antígeno mais baixa sob uma condição da concentração com baixo teor de cálcio do que aquela sob uma condição de concentração com alto teor de cálcio é selecionada.
[0090] [75] O método de produção de acordo com [74], em que a condição da concentração com baixo teor de cálcio é 0,1 μM a 30 μM.
[0091] [76] O método de produção de acordo com [74] ou [75], em que a condição de concentração com alto teor de cálcio é 100 μM a 10 mM.
[0092] [77] O método de produção de acordo com qualquer dentre [70] a [72], em que as condições da concentração de íon são condições de pH.
[0093] [78] O método de produção de acordo com [77], em que uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de antígeno mais baixa em uma condição de pH ácido do que aquela em uma condição de pH neutro é selecionada.
[0094] [79] O método de produção de acordo com [78], em que a condição de pH ácido é pH 4,0 a 6,5.
[0095] [80] O método de produção de acordo com [78] ou [79], em que a condição de pH neutro é pH 6,7 a 10,0.
[0096] [81] Uma molécula de ligação de antígeno produzida por um método de produção de acordo com qualquer dentre [70] a [80].
[0097] [82] Uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de ligação de antígeno de acordo com [81] ou uma forma modificada da mesma.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0098] [Figura 1] A Figura 1 é um gráfico que mostra a relação entre a distribuição de aminoácido (indicada por Biblioteca) da informação de sequência de cerca de 132 clones isolados de E. coli transformada com uma biblioteca de genes de anticorpos que ligam-se a antígenos de uma maneira dependente do pH e uma distribuição de aminoácido projetada (indicada por Projeto). A abscissa representa uma posição de aminoácido definido pela numeração de Kabat. A ordenada representa a relação de cada aminoácido na distribuição.
[0099] [Figura 2] A Figura 2 mostra os sensorgramas de um anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), um anticorpo 6RpH#01, um anticorpo 6RpH#02, e um anticorpo 6RpH#03 ao pH 7,4. A abscissa representa tempo. A ordenada representa valores de RU.
[00100] [Figura 3] A Figura 3 mostra os sensorgramas do anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), o anticorpo 6RpH#01, o anticorpo 6RpH#02, e o anticorpo 6RpH#03 ao pH 6,0. A abscissa representa tempo. A ordenada representa valores de RU.
[00101] [Figura 4A] A Figura 4A é um diagrama exibindo o padrão da interação entre um anticorpo de ligação dependente do pH e seu antígeno no plasma (pH 7,4) e no endossoma (pH 6,0).
[00102] [Figura 4B] A Figura 4B é um diagrama exibindo o padrão da interação entre um anticorpo de ligação dependente de cálcio e seu antígeno no plasma (2 mM de Ca2+) e no endossoma (3 μM de Ca2+).
[00103] [Figura 4C] A Figura 4C é um diagrama exibindo o padrão da interação entre um anticorpo de ligação dependente de cálcio e pH e seu antígeno no plasma (2 mM de Ca2+) e no endossoma (3 μM de Ca2+).
[00104] [Figura 5] A Figura 5 mostra os cromatogramas de troca de íon de um anticorpo que compreende uma sequência de Vk5-2 humana e um anticorpo que compreende uma sequência de hVk5- 2_L65 modificada a partir da sequência de Vk5-2 humana à sequência de glicosilação. A linha sólida representa o cromatograma do anticorpo que compreende uma sequência de Vk5-2 humana (cadeia pesada: CIM_H (SEQ ID N°: 4) e cadeia leve: hVk5-2 (SEQ ID N°: 1 fundida com SEQ ID N°: 26)). A linha quebrada representa o cromatograma do anticorpo que tem uma sequência de hVk5-2_L65 (cadeia pesada: CIM_H (SEQ ID N°: 4) e cadeia leve: hVk5-2_L65 (SEQ ID N°: 5)).
[00105] [Figura 6] A Figura 6 mostra os cromatogramas de troca de íon de um anticorpo que compreende uma sequência de LfVk1_Ca (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID N°: 48) e cadeia leve: LfVk1_Ca (SEQ ID N°: 43)) e um anticorpo que compreende uma sequência modificada a partir da sequência de LfVk1_Ca pela substituição de um resíduo de Asp (D) com o resíduo de Ala (A) depois do armazenamento a 5°C (linha sólida) ou depois do armazenamento a 50°C (linha pontilhada). O pico mais alto em cada cromatograma de troca de íon após armazenamento a 5°C é definido como um pico principal. No diagrama, o eixo y foi normalizado com o pico principal.
[00106] [Figura 7] A Figura 7 mostra os cromatogramas de troca de íon de um anticorpo que compreende uma sequência de LfVk1_Ca (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID N°: 48) e cadeia leve: LfVk1_Ca (SEQ ID N°: 43)) e um anticorpo que compreende uma sequência de LfVk1_Ca6 (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID N°: 48) e cadeia leve: LfVk1_Ca6 (SEQ ID N°: 49)) modificada a partir da sequência de LfVk1_Ca pela substituição de um resíduo de Asp (D) na posição 30 (definida pela numeração de Kabat) com um resíduo de Ser (S) após o armazenamento a 5°C (linha sólida) ou após o armazenamento a 50°C (linha pontilhada). O pico mais alto em cada cromatograma de troca de íon após armazenamento a 5°C é definido como um pico principal. No diagrama, o eixo y foi normalizado com o pico principal.
[00107] [Figura 8] A Figura 8 é um gráfico que mostra a relação entre a distribuição de aminoácido (indicada por Biblioteca) de informação de sequência a cerca de 290 clones isolados a partir de E. coli transformada com uma biblioteca de genes de anticorpos que ligam-se a antígenos de uma maneira dependente de Ca e uma distribuição de aminoácido projetada (indicada por Projeto). A abscissa representa uma posição de aminoácido definido pela numeração de Kabat. A ordenada representa a relação de cada aminoácido na distribuição.
[00108] [Figura 9] A Figura 9 mostra os sensorgramas de um anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), um anticorpo 6RC1IgG_010, um anticorpo 6RC1IgG_012, e um anticorpo 6RC1IgG_019 sob uma condição de concentração com alto teor de íon de cálcio (1,2 mM). A abscissa representa tempo. A ordenada representa valores de RU.
[00109] [Figura 10] A Figura 10 mostra os sensorgramas do anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), o anticorpo 6RC1IgG_010, o anticorpo 6RC1IgG_012, e o anticorpo 6RC1IgG_019 sob uma condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio (3 μM). A abscissa representa tempo. A ordenada representa valores de RU.
[00110] [Figura 11] A Figura 11 mostra a estrutura de cadeia pesada CDR3 no fragmento Fab de um anticorpo 6RL#9 determinado por análise de estrutura de cristal de raios X. Figura 11(i) é um diagrama exibindo cadeia pesada CDR3 com uma estrutura de cristal obtida sob condições de cristalização na presença de íons de cálcio. Figura 11(ii) é um diagrama exibindo cadeia pesada CDR3 com uma estrutura de cristal obtida sob condições de cristalização na ausência de íons de cálcio.
[00111] [Figura 12] A Figura 12 mostra um sensorgrama que descreve a interação entre um anticorpo de IgA anti-humano e IgA humano em 1,2 mM de Ca2+ e em 3 μM de Ca2+ usando Biacore.
[00112] [Figura 13] A Figura 13 mostra um diagrama que descreve a interação entre um anticorpo de glipicano 3 anti-humano e glipicano 3 humano recombinante em 1,2 mM de Ca2+ e em 3 μM de Ca2+ usando ELISA.
[00113] [Figura 14] A Figura 14 mostra um sensorgrama que descreve a interação entre um anticorpo de IgA anti-camundongo e de IgA de camundongo ao pH 7,4 e em pH 5,8 usando Biacore. A linha sólida representa os resultados a cerca da condição de pH 7,4. A linha quebrada representa os resultados a cerca da condição de pH 5,8.
[00114] [Figura 15] A Figura 15 mostra um sensorgrama que descreve a interação entre um anticorpo HMGB1 anti-humano e de HMGB1 humano ao pH 7,4 e em pH 5,8 usando Biacore. A linha sólida representa os resultados a cerca da condição de pH 7,4. A linha quebrada representa os resultados a cerca da condição de pH 5,8.
[00115] [Figura 16] A Figura 16 é um diagrama mostrando a concentração de plasma de um anticorpo H54/L28-IgG1, um anticorpo FH4-IgG1, e um anticorpo 6RL#9-IgG1 em camundongo normal.
[00116] [Figura 17] A Figura 17 é um diagrama mostrando a concentração de um receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) no plasma de um camundongo normal que recebeu o anticorpo H54/L28- IgG1, o anticorpo FH4-IgG1, ou o anticorpo 6RL#9-IgG1.
[00117] [Figura 18] A Figura 18 é um diagrama mostrando as concentrações de plasma de um anticorpo H54/L28-N434W, um anticorpo FH4-N434W, e um anticorpo 6RL#9-N434W em camundongo normal.
[00118] [Figura 19] A Figura 19 é um diagrama mostrando a concentração de um receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) no plasma de um camundongo normal que recebeu o anticorpo H54/L28- N434W, o anticorpo FH4-N434W, e o anticorpo 6RL#9-N434W.
[00119] Descrição das Modalidades
[00120] A descrição da presente invenção fornece uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon é alterada ou similar. A descrição da presente invenção da mesma forma fornece um novo método sistêmico para produzir uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon de metal e/ou concentração de íon de hidrogênio. Uma tal biblioteca pode ser usada como uma biblioteca combinatorial que ajuda a selecionar e/ou avaliar um clone de molécula de ligação de antígeno sintético com atividade desejável, por exemplo, afinidade de ligação e avidez, apropriada para, por exemplo, condições da concentração de íon de metal e/ou concentração de íon de hidrogênio.
[00121] Estas bibliotecas são úteis para identificar a sequência de polipeptídeo de uma molécula de ligação de antígeno que pode interagir com quaisquer dos antígenos alvos de vários tipos. Por exemplo, uma biblioteca compreendendo os polipeptídeos de moléculas de ligação de antígeno diversificadas da presente invenção expressa por exibição de fago é particularmente útil para selecionar e/ou avaliar a molécula de ligação de antígeno de interesse. A presente invenção da mesma forma fornece um sistema automático de alto rendimento eficiente para este. O método da presente invenção pode fornecer uma molécula de ligação de antígeno ligando-se a um antígeno alvo de uma maneira dependente de condição. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação de antígeno como um ingrediente ativo também.
DEFINIÇÃO AMINOÁCIDO
[00122] Cada aminoácido é indicado aqui por código de única letra ou código de três letras, ou ambos, como representado por, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, e Val/V.
NUMERAÇÃO EU E NUMERAÇÃO DE KABAT
[00123] De acordo com um método usado na presente invenção, as posições de aminoácido nomeadas para CDRs e FRs de anticorpo são definidas de acordo com o método de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991). Quando a molécula de ligação de antígeno descrita aqui é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno, aminoácidos em regiões variáveis são indicados de acordo com a numeração de Kabat e aminoácidos em regiões constantes são indicados de acordo com a numeração EU conformando-se às posições de aminoácido de Kabat.
MODIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDO
[00124] Aminoácidos nas sequências de aminoácido de moléculas de ligação de antígeno podem ser modificados por um método apropriadamente adotado conhecido na técnica tal como mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) ou PCR de extensão de sobreposição. Da mesma forma, os aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos não naturais por uso de uma pluralidade de métodos de modificação conhecido na técnica (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de translação livre de célula contendo tRNA (Clover Direct (Protein Express, an R & D oriented company)) compreendendo um aminoácido não natural ligado com um tRNA supressor ambarino complementar ao códon de UAG (códon ambarino) que é um códon de interrupção é da mesma forma preferivelmente usado. Da mesma forma, a expressão na qual os códigos de única letra de aminoácidos antes e depois da modificação são usados antes e em seguida a um número que representa uma posição particular pode ser usada apropriadamente para representar a modificação de aminoácido. Por exemplo, uma modificação de P238D usada para adicionar uma substituição de aminoácido a uma região Fc contida em uma região constante de anticorpo representa a substituição de Pro na posição 238 definida pela numeração EU por Asp. Especificamente, o número representa uma posição de aminoácido definida pela numeração EU; o código de única letra do aminoácido anterior ao número representa o aminoácido antes da substituição; e os códigos de única letra do aminoácido em seguida ao número representa o aminoácido depois da substituição.
[00125] E/Ou
[00126] O termo "e/ou" descrito aqui é significado incluir toda combinação representada por "e" e "ou". Especificamente, por exemplo, frase "aminoácidos 33, 55 e/ou 96 são substituídos" inclui as seguintes variações de modificação de aminoácido: (a) posição 33, (b) posição 55, (c) posição 96, (d) posições 33 e 55, (e) posições 33 e 96, (f) posições 55 e 96, e (g) posições 33, 55, e 96.
MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO
[00127] O termo "molécula de ligação de antígeno" descrito aqui é usado para significar uma molécula que compreende um domínio de ligação de antígeno no sentido mais amplo e especificamente inclui várias formas moleculares contanto que estas formas exibam atividade de ligação de antígeno. Os exemplos de uma molécula que compreende um domínio de ligação de antígeno ligado com um domínio de ligação de FcRn incluem anticorpos. Os anticorpos podem incluir anticorpos monoclonal isolados (incluindo anticorpos agonísticos e antagonísticos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e similares. Alternativamente, um fragmento de um tal anticorpo pode ser usado. Os exemplos preferidos do fragmento podem incluir domínios de ligação de antígeno e fragmentos de ligação de antígeno (por exemplo, Fab, F(ab')2, scFv, and Fv). A molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode da mesma forma incluir moléculas de andaime contidas em uma biblioteca para construção de domínios de ligação de antígeno que compreendem apenas estruturas parciais de conformações estáveis existentes (por exemplo, estrutura de proteína de tambor α/β) usadas como andaimes.
[00128] O "domínio de ligação de antígeno" descrito aqui pode ser um domínio que tem qualquer estrutura contanto que o domínio usado ligue-se ao antígeno de interesse. Os exemplos preferidos de um tal domínio incluem regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpo, um módulo derivado de proteína de membrana in vivo chamado domínio A de aproximadamente 35 aminoácidos contidos em avimer (WO2004044011 e WO2005040229), Adnectin que compreende um domínio 10Fn3 como um domínio de ligação de proteína derivado de um fibronectina de glicoproteína expressa em membranas de célula (WO2002032925), Affibody que compreende um andaime de domínio de ligação de IgG que constitui um fardo de três hélices composto de 58 aminoácidos de proteína A (WO1995001937), DARPins (designados proteínas de repetição de ancirina) que são regiões expostas à superfície molecular de repetições de ancirina (AR) cada qual tendo uma estrutura de resíduo 33 aminoácidos duplicada em uma subunidade de uma volta, duas hélices antiparalelas, e uma alça (WO2002020565), anticalina que têm quatro regiões de alça que conectam oito filamentos antiparalelos curvados para o eixo central em uma extremidade de uma estrutura de tambor altamente conservada em moléculas de lipocalina tal como lipocalina associada ao neutrófilo gelatinase (NGAL) (WO2003029462), e uma região deprimida na estrutura de folha paralela interna de uma duplicação em forma de ferradura composta de módulos de repetição ricos em leucina repetida (LRR) de um receptor de linfócito variável livre de estrutura de imunoglobulina (VLR) como visto nos sistemas imunes adquiridos de vertebrados sem maxilares tal como lampreia ou mixinídeo (WO2008016854). Os exemplos preferidos do domínio de ligação de antígeno da presente invenção incluem domínios de ligação de antígeno que compreendem regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpo.
[00129] O termo "anticorpo" descrito aqui refere-se a uma imunoglobulina natural ou a uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa. O anticorpo pode ser isolado a partir de recursos naturais (por exemplo, plasma ou sero) onde o anticorpo ocorre naturalmente ou do sobrenadante de cultura de células de hibridoma de produção de anticorpo. Alternativamente, o anticorpo pode ser sintetizado parcialmente ou completamente por uso de um método tal como recombinação de gene. Os exemplos preferidos do anticorpo incluem isótipos de imunoglobulina e subclasses destes isótipos. Imunoglobulinas humanas são conhecidos por terem 9 classes (isótipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. O anticorpo da presente invenção pode incluir IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 destes isótipos. Sequências de proteínas de interesse imunológico, Publicação de NIH No. 91-3242 descrevem uma pluralidade de sequências de alótipo atribuído ao polimorfismo como regiões constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e IgG4 humana, quaisquer das quais podem ser usadas na presente invenção. Particularmente, IgG1 humana pode ter uma sequência com DEL ou EEM como a sequência de aminoácido das posições 356 a 358 definidas pela numeração EU. Sequências de proteínas de interesse imunológico, Publicação de NIH No. 91-3242 descrevem uma pluralidade de sequências de alótipo atribuídas ao polimorfismo como regiões constantes de IgK humana (kappa) e IgL7 humana (lambda) quaisquer das quais podem ser usadas na presente invenção. O anticorpo que tem atividade de ligação desejada é preparado por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica.
[00130] O anticorpo pode ser obtido como um anticorpo policlonal ou monoclonal que usa meios conhecidos na técnica. Um anticorpo monoclonal derivado de mamífero pode ser preferivelmente preparado como o anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo monoclonal derivado de mamífero abrange, por exemplo, aqueles produzidos por hibridomas e aqueles produzidos por células hospedeiras mutadas com vetores de expressão que compreendem genes de anticorpo por um método de engenharia genética.
[00131] Os hibridomas de produção de anticorpo monoclonal podem ser preparados por uso de uma técnica conhecida na arte. Especificamente, os mamíferos são imunizados com antígenos de sensibilização de acordo com um método de imunização usual. Os imunócitos obtidos são fundidos com células parentais conhecidas na técnica por um método de fusão de célula usual. Em seguida, estas células fundidas podem ser avaliadas quanto às células de produção de anticorpo monoclonal por um método de análise usual para selecionar anticorpos de produção de hibridoma em comparação aos antígenos de sensibilização.
[00132] Os mamíferos a ser imunizados com os antígenos de sensibilização não são limitados a qualquer animal particular e são selecionados preferivelmente em atenção à compatibilidade com as células parentais para uso na fusão da célula. Em geral, roedores, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, ou coelhos, ou outros mamíferos tais como macacos são preferivelmente usados.
[00133] Estes animais são imunizados com os antígenos de sensibilização de acordo com um método conhecido na técnica. Por exemplo, um método geral pode envolver a imunização dos mamíferos com os antígenos de sensibilização por administração por injeção intraperitoneal ou subcutânea. Especificamente, os antígenos de sensibilização diluídos com PBS (solução salina tamponada por fosfato), solução salina, ou similar a uma relação de diluição apropriada são misturados, se desejado, com um adjuvante usual, por exemplo, o adjuvante completo de Freund e emulsificados, e a emulsão resultante dos antígenos de sensibilização é em seguida administrada aos mamíferos várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Da mesma forma, um veículo apropriado pode ser usado na imunização com os antígenos de sensibilização. Particularmente, no caso de usar peptídeos parciais que têm um peso molecular pequeno como os antígenos de sensibilização, os peptídeos do antígeno de sensibilização ligados com proteínas de veículo tal como albumina ou hemocianina lapa em buraco da fechadura podem ser desejavelmente usados na imunização.
[00134] Os anticorpos de produção de hibridoma em comparação ao polipeptídeo desejado podem ser preparados da mesma forma por imunização de DNA como descrito abaixo. A imunização de DNA refere-se a um método de imunoestimulação que envolve: imunizar animais pela administração de DNAs de vetor que foram construídos em uma forma capaz de expressar genes de codificação de proteína antigênicos nos animais imunizados; e imunoestimulação dos animais pela expressão in vivo dos antígenos de sensibilização. Espera-se que a imunização de DNA seja superior nos pontos seguintes para métodos de imunização gerais que envolvem a imunização de animais pela administração de antígenos de proteína: - quando o antígeno é proteínas de membrana, a imunização de DNA pode fornecer a imunoestimulação enquanto as estruturas de proteínas de membrana são mantidas; e - a imunização de DNA elimina a necessidade de purificar os antígenos de imunização.
[00135] Células de mieloma mamíferas são usadas na fusão da célula com os imunócitos. As células de mieloma têm um marcador de seleção apropriado preferivelmente para análise. O marcador de seleção refere-se a um caráter que pode sobreviver (ou não pode sobreviver) sob condições de cultura particulares. Por exemplo, deficiência de hipoxantiana-guanina fosforibosiltransferase (em seguida, abreviada por deficiência de HGPRT) ou deficiência de timidina cinase (em seguida, abreviada por deficiência de TK) é conhecida na técnica como o marcador de seleção. Células que têm a deficiência de HGPRT ou TK são sensíveis à hipoxantina-aminopterin- timidina (em seguida, abreviada por sensível à HAT). As células sensíveis à HAT são exterminadas em um meio seletivo de HAT porque as células não sintetizam os DNAs. Em comparação, estas células, quando fundidas com células normais, ficam capazes de crescerem até mesmo no meio seletivo de HAT porque as células fundidas podem continuar a síntese de DNA por uso da série de reação de salvamento das células normais.
[00136] As células que têm a deficiência de HGPRT ou TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina ou 8-azaguanina (em seguida, abreviado por 8AG) ou 5'-bromodesoxiuridina, respectivamente. As células normais são exterminadas incorporando-se estes análogos de pirimidina em seus DNAs. Em comparação, as células deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio seletivo porque as células não podem incorporar os análogos de pirimidina nestas. Além disso, um marcador de seleção chamado resistência a G418 confere resistência ao antibiótico de 2-desoxiestreptamina (análogo de gentamicina) por um gene de resistência à neomicina. Várias células de mieloma adequadas para a fusão da célula são conhecidas na técnica.
[00137] Por exemplo, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), ou R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133) podem ser preferivelmente usados como células de mieloma.
[00138] Basicamente, a fusão da célula dos imunócitos com as células de mieloma é realizada de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, o método de Kohler e Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[00139] Mais especificamente, a fusão da célula pode ser realizada, por exemplo, em um meio de cultura de nutriente usual na presença de um promotor de fusão de célula. Por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou vírus de hemaglutinação do Japão (HVJ) pode ser usado como o promotor de fusão. Além disso, um auxiliar tal como dimetil sulfóxido é adicionado a este, se desejado, e usado para realçar a eficiência da fusão.
[00140] A relação entre os imunócitos e as células de mieloma usados pode ser ajustada arbitrariamente. Por exemplo, a quantidade dos imunócitos é preferivelmente ajustada em 1 a 10 vezes do que das células de mieloma. Por exemplo, um médio de RPMI1640 ou MEM adequado para o crescimento da linhagem celular de mieloma ou qualquer outro meio de cultura usual para uso neste tipo de cultura de célula pode ser usado como o meio de cultura na fusão da célula e pode ser suplementado também com uma solução suplementada com soro tal como soro de bezerro fetal (FCS).
[00141] Para a fusão de célula, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturados nas quantidades pré-determinadas no meio de cultura, e uma solução de PEG (por exemplo, tendo um peso molecular médio na ordem de 1000 a 6000) pré-aquecida em aproximadamente 37°C é usualmente adicionada a isto em uma concentração de 30 a 60% de (p/v). A solução misturada é suavemente misturada para formar as células de fusão desejadas (hibridomas) de interesse. Subsequentemente, o meio de cultura apropriado exemplificado acima é adicionado consecutivamente à suspensão da célula, e seu sobrenadante é removido por centrifugação. Este procedimento pode ser repetido para desse modo remover os agentes de fusão da célula ou similar desfavorável para crescimento de hibridoma.
[00142] Os hibridomas desse modo obtidos podem ser cultivados para seleção usando um meio seletivo usual, por exemplo, um meio de HAT (meio de cultura que contém hipoxantina, aminopterina e timidina). A cultura que usa o meio de HAT pode ser continuada durante um tempo longo o suficiente (tipicamente, durante alguns dias a algumas semanas) para exterminar as células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas desejados. Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são avaliados e clonados como clones isolados por um método de diluição de limitação usual.
[00143] Os hibridomas desse modo obtidos podem ser selecionados por uso de um meio seletivo apropriado para o marcador de seleção levado pelas células de mieloma usadas na fusão da célula. Por exemplo, as células que têm a deficiência de HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura em um meio de HAT (meio de cultura que contém hipoxantina, aminopterina e timidina). Especificamente, no caso das células de mieloma sensíveis a HAT usadas na fusão de célula, apenas as células bem sucedidamente fundidas com células normais podem cultivar-se seletivamente no meio de HAT. A cultura que usa o meio de HAT é continuada durante um tempo longo o suficiente para exterminar as células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas desejados. Especificamente, a cultura geralmente pode ser realizada durante alguns dias a algumas semanas para selecionar os hibridomas desejados. Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado podem ser avaliados e clonados como clones isolados por um método de diluição de limitação usual.
[00144] A análise do anticorpo desejado e a clonagem como clones isolados do mesmo pode ser realizada preferivelmente por um método de análise com base em reação de antígeno-anticorpo conhecida na técnica. Um tal anticorpo monoclonal pode ser avaliado por, por exemplo, FACS (classificação de célula ativada por fluorescência). FACS refere-se a um sistema que pode analisar as células contatadas com anticorpos fluorescentes por meio de luz à laser e medir a fluorescência emitida pelas células individuais para desse modo analisar a ligação dos anticorpos à superfície das células.
[00145] Alternativamente, o anticorpo pode ser avaliado quanto a sua atividade de ligação em comparação aos antígenos imobilizados com base nos princípios de ELISA. Por exemplo, antígenos são imobilizados em cavidades de uma placa de ELISA. O sobrenadante de cultura dos hibridomas é contatado com os antígenos nas cavidades para detectar um anticorpo ligado ao antígeno. No caso de um anticorpo monoclonal derivado de camundongo, o anticorpo ligado ao antígeno pode ser detectado usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundongo. Estes hibridomas selecionados por análise que produzem o anticorpo desejado que tem a capacidade de ligação de antígeno podem ser clonados por um método de diluição de limitação ou similar. Os hibridomas de produção de anticorpo monoclonais desse modo preparados podem ser subclonados em um meio de cultura usual. Da mesma forma, os hibridomas podem ser armazenados durante um período longo em nitrogênio líquido.
[00146] Os hibridomas podem ser cultivados de acordo com um método usual. O anticorpo monoclonal desejado pode ser obtido a partir do sobrenadante de cultura do mesmo. Alternativamente, os hibridomas podem ser administrados aos mamíferos compatível com isto e crescidos, e o anticorpo monoclonal pode ser obtido a partir dos fluidos ascéticos dos mesmos. O método anterior é adequado para obter anticorpos altamente puros.
[00147] Os anticorpos codificados por genes de anticorpo clonados a partir das células de produção de anticorpo tais como hibridomas podem da mesma forma ser preferivelmente usados. Os genes de anticorpo clonados são incorporados em vetores apropriados e transferidos aos hospedeiros para expressar anticorpos codificados pelos genes. Métodos para o isolamento de gene de anticorpo, a introdução em vetores, e a transformação das células hospedeiras já foram estabelecidos por, por exemplo, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). Um método para produzir anticorpos recombinantes é da mesma forma conhecido na técnica, como mencionado abaixo.
[00148] Por exemplo, cDNAs que codificam as regiões variáveis (regiões V) do anticorpo de interesse são obtidos a partir das células de hibridoma que produzem este anticorpo. Para este propósito, normalmente, os RNAs totais são primeiro extraídos partir dos hibridomas. Por exemplo, os métodos seguintes podem ser usados para extração de mRNA a partir das células: - método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), e - método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156159).
[00149] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o Kit de Purificação de mRNA (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) ou similar. Alternativamente, um kit para diretamente extrair os mRNAs totais da células está da mesma forma comercialmente disponível, tal como Kit de Purificação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare BioSciences Corp.). Os mRNAs podem ser obtidos a partir dos hibridomas usando um tal kit. Os cDNAs de codificação de região V de anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs obtidos usando a transcriptase reversa. Os cDNAs podem ser sintetizados usando o Kit de Síntese de cDNA de de Primeiro filamento de Transcriptase Reversa de AMV (Seikagaku Corp.) ou similar. Alternativamente, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories, Inc.) e 5'-RACE PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 89989002; e Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932) pode ser usado apropriadamente para a síntese de cDNA e amplificação. No curso de tal síntese de cDNA, sítios de restrição apropriados descritos depois podem ser também introduzidos em ambas extremidades dos cDNAs.
[00150] Os fragmentos de cDNA de interesse são purificados a partir dos produtos de PCR obtidos e subsequentemente ligados aos DNAs do vetor. Os vetores recombinantes desse modo preparados são transferidos para E. coli ou similar, seguido por seleção de colônia. Em seguida, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir de E. coli que formou a colônia. Em seguida, a presença ou ausência da sequência de nucleotídeo do cDNA de interesse no vetor recombinante é confirmada por um método conhecido na técnica, por exemplo, um método de terminação de cadeia de didesoxinucleotídeo.
[00151] Os genes de codificação de região variável são obtidos convenientemente pelo método 5'-RACE usando iniciadores para amplificação de gene de região variável. Primeiro, os cDNAs são sintetizados com RNAs extraídos das células de hibridoma como um padrão para obter uma biblioteca de cDNA de 5'-RACE. Um kit comercialmente disponível tal como kit de amplificação de cDNA SMART RACE é apropriadamente usado na síntese da biblioteca de cDNA de 5'-RACE.
[00152] Genes de anticorpo são amplificados por PCR usando a biblioteca de cDNA de 5'-RACE obtidos como um padrão. Iniciadores para amplificação de gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em uma sequência de gene de anticorpo conhecida na técnica. Estes iniciadores têm uma sequência de nucleotídeo que difere-se com respeito a cada subclasse de imunoglobulina. Desse modo, a subclasse do anticorpo de interesse é desejavelmente determinada antecipadamente usando um kit comercialmente disponível tal como o kit de isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics K.K.).
[00153] Especificamente, os iniciadores capazes de amplificar os genes que codificam as cadeias pesadas y1, y2a, y2b, e y3 e as cadeias leves K e X podem ser usados, por exemplo, com a finalidade de obter os genes de codificação de IgG de camundongo. Os iniciadores que anelam-se para as porções que correspondem às regiões constantes perto das regiões variáveis são geralmente usados como iniciadores 3' para a amplificação de gene de região variável de IgG. Por outro lado, os iniciadores incluíram o kit de preparação de biblioteca de sDNA de 5' RACE são usados como iniciadores 5'.
[00154] Os produtos de PCR desse modo amplificados podem ser usados para reformar as imunoglobulinas compostas de cadeias pesadas e leves em combinação. As imunoglobulinas reformadas podem ser avaliadas quanto ao anticorpo desejado com sua atividade de ligação de antígeno como um índice. Por exemplo, com a finalidade de obter um anticorpo contra um antígeno, mais preferivelmente, o anticorpo liga-se especificamente ao antígeno. O anticorpo de ligação ao antígeno pode ser avaliado, por exemplo, pelas seguintes etapas: contatar os anticorpos que compreendem regiões V codificadas pelos cDNAs obtidos a partir dos hibridomas, com antígenos; detectar a ligação de antígeno-anticorpo; e selecionar o anticorpo de ligação de antígeno.
[00155] A ligação de antígeno-anticorpo é detectada por um método conhecido na técnica. Especificamente, a ligação de antígeno- anticorpo pode ser detectada pelo método tal como FACS ou ELISA descrito acima.
[00156] Depois da obtenção de cada cDNA que codifica a região V de anticorpo de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição inseridos em ambas extremidades do cDNA. Preferivelmente, as enzimas de restrição reconhecem e digerem uma sequência de nucleotídeo que aparece em baixa frequência em sequências de nucleotídeo que constituem os genes de anticorpo. Também preferivelmente, as enzimas de restrição clivam os sítios inseridos nesta para produzir extremidades aderentes, para inserir uma cópia do fragmento digerido na direção correta em um vetor. Os cDNAs de codificação de região V de anticorpo desse modo digeridos podem ser inseridos aos vetores de expressão apropriados para obter os vetores de expressão de anticorpo. Neste caso, os genes de codificação de região constante (região C) de anticorpo são fundidos na estrutura com os genes de codificação de região V para obter os anticorpos quiméricos. Neste contexto, os anticorpos quiméricos referem-se aos anticorpos que compreendem regiões constante e variáveis de origens diferentes. Desse modo, anticorpos quiméricos heterogêneos (por exemplo, camundongo-humano) bem como anticorpos quiméricos homogêneos bumanos-humanos são da mesma forma abrangidos pelo anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção. Os genes da região V podem ser inseridos aos vetores de expressão preliminarmente tendo genes de região constante para construir os vetores de expressão de anticorpo quimérico. Especificamente, por exemplo, as sequências de reconhecimento para enzimas de restrição que digerem os genes de região V podem apropriadamente estar localizadas no lado 5' dos vetores de expressão que levam os DNAs que codificam as regiões constantes (regiões C) do anticorpo desejado. Os vetores de expressão resultantes e os genes de região V digeridos com a mesma combinação das enzimas de restrição são fundidos na estrutura entre si para construir os vetores de expressão de anticorpo quimérico.
[00157] Para produzir o anticorpo desejado, o gene de anticorpo pode ser incorporado em vetores de expressão tal que o gene é operavelmente ligado às sequências de controle. As sequências de controle para expressão de anticorpo abrangem, por exemplo, realçadores e promotores. Da mesma forma, uma sequência de sinal apropriada para secreção extracelular do anticorpo expresso pode ser adicionada ao terminal amino da mesma. Por exemplo, um peptídeo que tem uma sequência de aminoácido MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID N°: 13) pode ser usada como a sequência de sinal. Qualquer outra sequência de sinal adequada pode ser adicionada a isto. O polipeptídeo expresso é clivado ao terminal carboxila da sequência de sinal, e o polipeptídeo clivado pode ser extracelularmente segregado como um polipeptídeo maduro. As células hospedeiras apropriadas podem ser transformadas com estes vetores de expressão para obter células recombinantes que expressam o DNA que codifica o anticorpo desejado.
[00158] Para a expressão de gene de anticorpo, o DNA de codificação de cadeia pesada (cadeia H) e o DNA de codificação de cadeia leve (cadeia L) do anticorpo são separadamente incorporados em vetores de expressão diferentes. A mesma célula hospedeira pode ser cotransfectada com o vetor incorporado em cadeia pesada e o vetor incorporado em cadeia leve e desse modo pode ser permitida expressar moléculas de anticorpo que compreendem as cadeias H e L. Alternativamente, os DNAs de codificação de cadeia leve e de cadeia pesada podem ser incorporados em um único vetor de expressão, com que uma célula hospedeira pode em seguida ser transformada (veja WO1994011523).
[00159] Muitas combinações de células hospedeiras e vetores de expressão são conhecidas na técnica para preparação de anticorpo pela transferência dos genes de anticorpo isolados em hospedeiros apropriados. Todos destes sistemas de expressão podem ser aplicados ao isolamento da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. No caso de usar células eucarióticas como as células hospedeiras, de animal, de planta, ou células de fungo podem apropriadamente ser usadas. Especificamente, exemplos das células animais podem incluir as células seguintes:
[00160] células mamíferas tal como CHO (linhagem celular de ovário de hamster Chinês), COS (linhagem celular de rim de macaco), células de mieloma (Sp2/O, NS0, etc.), BHK (linhagem celular de rim de hamster bebê), HEK293 (linhagem celular de rim embrionária humana com DNA de adenovírus cisalhado (Ad)5), células PER.C6 (linhagem celular retinal embrionária humana transformada com os genes E1A e E1B de adenovírus tipo 5 (Ad5)), Hela, e Vero (Current Protocols in Protein Science, Maio de 2001, Unidade 5.9, Tabela 5.9.1); células de anfíbio tais como oócitos de Xenopus; e células de inseto tais como sf9, sf21, e Tn5.
[00161] Alternativamente, os sistemas de expressão de gene de anticorpo que usam células derivadas do gênero Nicotiana (por exemplo, Nicotiana tabacum) como as células de plantas são conhecidos na técnica. Células de calo cultivadas podem ser apropriadamente usadas para a transformação da célula de planta.
[00162] As células seguintes podem ser usadas como as células de fungo: - células derivadas de fermentos do gênero Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) e do gênero Pichia (por exemplo, Pichia Pastoris), e - células derivadas de fungos filamentosos do gênero Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger).
[00163] Da mesma forma, sistemas de expressão de gene de anticorpo que usam células procarióticas são conhecidos na técnica. No caso de uso, por exemplo, células bacterianas, células de bactérias tal como E. coli e Bacillus subtilis podem ser usadas apropriadamente. Os vetores de expressão que compreendem o gene de anticorpo de interesse são transferidos nestas células por transformação. As células transformadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser obtido a partir das culturas resultantes das células transformadas.
[00164] Além das células hospedeiras, os animais transgênicos podem ser usados para a produção de anticorpo recombinante. Especificamente, o anticorpo desejado pode ser obtido a partir de animais transfectados com o gene que codifica este anticorpo. Por exemplo, os genes de anticorpo podem ser inseridos na estrutura em genes que especificamente codificam proteínas produzidas no leite para construir os genes de fusão. Por exemplo, β caseína de cabra pode ser usada como as proteínas segregadas no leite. Fragmentos de DNA compreendendo os genes de fusão que têm a inserção de gene de anticorpo são injetados em embriões de cabra, que são por sua vez introduzidos em cabras fêmeas. A partir do leite produzido por cabras transgênicas (ou progênie das mesmas) geradas pelas cabras que receberam os embriões, o anticorpo desejado pode ser obtido como uma proteína de fusão com a proteína do leite. Além disso, o hormônio pode ser administrado às cabras transgênicas para aumentar a quantidade de leite que contém o anticorpo desejado produzido a partir das cabras transgênicas (Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
[00165] No caso de administrar a molécula de ligação de antígeno descrita aqui a humanos, um domínio de ligação de antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi criado artificialmente pode ser adotado apropriadamente como um domínio de ligação de antígeno para a molécula, por exemplo, com a finalidade de reduzir a heteroantigenicidade em humanos. O anticorpo geneticamente recombinante abrange, por exemplo, os anticorpos humanizados. Estes anticorpos criados são apropriadamente produzidos usando um método conhecido na técnica.
[00166] Cada região variável de anticorpo usada para preparar o domínio de ligação de antígeno na molécula de ligação de antígeno descrita aqui é tipicamente composta de três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FRs). As CDRs são regiões que substancialmente determinam a especificidade de ligação do anticorpo. As CDRs têm sequências de aminoácido diversas. Por outro lado, as FRs são principalmente constituídas por sequências de aminoácido que são altamente idênticos mesmo entre anticorpos que diferem-se na especificidade de ligação. Portanto, em geral, a especificidade de ligação de um certo anticorpo pode ser transplantada a outros anticorpos por enxerto de CDR.
[00167] Os anticorpos humanizados são da mesma forma chamados de anticorpos humanos reformados. Especificamente, por exemplo, um anticorpo humanizado que consiste em um anticorpo humano enxertado por CDR de anticorpo de animal não humano (por exemplo, camundongo) é conhecido na técnica. Os métodos de recombinação de gene gerais são da mesma forma conhecidos para obter os anticorpos humanizados. Especificamente, por exemplo, a PCR de extensão de sobreposição é conhecida na técnica como um método para enxertar CDRs de anticorpo de camundongo em FRs humanas. Na PCR de extensão de sobreposição, uma sequência de nucleotídeo que codifica cada CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertado é adicionada aos iniciadores para síntese de FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados com respeito a cada dentre as quatro FRs. Para enxertar as CDRs de camundongo para o FRs humano, é considerado geralmente vantajoso selecionar FRs humanas altamente idênticas às FRs de camundongo, para manter as funções de CDR. Especificamente, em geral, FRs humanas que compreendem sequências de aminoácido altamente idêntico àquelas de FRs adjacentes às CDRs de camundongo a ser enxertadas são preferivelmente usadas.
[00168] As sequências de nucleotídeo a ser ligadas são projetadas de forma que as sequências sejam conectadas na estrutura mutuamente. As sequências de nucleotídeo de codificação de FR humanas são individualmente sintetizadas usando seus respectivos iniciadores. Os produtos resultantes contêm o DNA de codificação de CDR de camundongo adicionado a cada sequência de codificação de FR humana. As sequências de nucleotídeo de codificação de CDR de camundongo são projetadas de forma que a sequência de nucleotídeo em cada produto se sobreponha com outro. Subsequentemente, as porções de CDR de sobreposição nos produtos sintetizados com genes de anticorpo humanos como padrões são aneladas mutuamente para reação de síntese de filamento complementar. Por esta reação, as sequências de FR humanas são ligadas por meio de sequências de CDR de camundongo.
[00169] Finalmente, a sequência de tamanho natural do gene da região V compreendendo três CDRs e quatro FRs ligadas é amplificada usando iniciadores que cada qual anelam-se às extremidades 5' e 3' dos mesmos e tem uma sequência de reconhecimento adicionada para uma enzima de restrição apropriada. O DNA desse modo obtido e um DNA de codificação de região C de anticorpo humano pode ser inserido em vetores de expressão tal que estes DNAs são fundidos na estrutura para preparar vetores para expressão de anticorpo humanizado. Estes vetores tendo as inserções são transferidos aos hospedeiros para estabelecer células recombinantes. Em seguida, as células recombinantes são cultivadas para a expressão do DNA de codificação de anticorpo humanizado para produzir os anticorpos humanizados nas culturas das células cultivadas (EP239400 e WO1996002576).
[00170] Os anticorpos humanizados desse modo preparados podem ser avaliados quanto a sua atividade de ligação de antígeno por ensaio qualitativo ou quantitativo para desse modo selecionar as FRs de anticorpo humano adequadas que permitem CDRs para formar um sítio de ligação de antígeno favorável quando ligadas por meio das CDRs. Se necessário, o(s) resíduo(s) de aminoácido de FR pode(m) ser substituído(s) tal que as CDRs do anticorpo humano reformado resultante formam um sítio de ligação de antígeno apropriado. Por exemplo, a sequência de aminoácido de FR pode ser mutada pela aplicação do método de PCR usado no enxerto de CDR de camundongo às FRs humanas. Especificamente, uma mutação de uma sequência de nucleotídeo parcial pode ser introduzida aos iniciadores que anelam-se a uma sequência de nucleotídeo de FR. A sequência de nucleotídeo de FR sintetizada usando tais iniciadores contém a mutação desse modo introduzida. Tais anticorpos variantes que têm o(s) aminoácido(s) substituído ácido(s) pode(m) ser avaliado(s) quanto a sua atividade de ligação de antígeno pelo mesmo ensaio como acima para desse modo selecionar as sequências de FR variantes que têm as propriedades desejadas (Sato et al., Cancer Res (1993) 53, 851-856).
[00171] Alternativamente, o anticorpo humano desejado pode ser obtido por imunização de DNA que usa animais transgênicos que têm todos os repertórios de genes de anticorpo humanos (veja WO1993012227, WO1992003918, WO1994002602, WO1994025585, WO1996034096, e WO1996033735) como animais imunizados.
[00172] Além disso, uma técnica de obter anticorpos humanos por paniculação usando bibliotecas de anticorpo humano é da mesma forma conhecida. Por exemplo, as regiões V de anticorpo humano são expressas como um anticorpo de única cadeia (scFv) na superfície de fagos por um método de exibição de fago. Um fago que expressa scFv de ligação de antígeno pode ser selecionado. O gene do fago selecionado pode ser analisado para determinar as sequências de DNA que codificam as regiões V do anticorpo humano de ligação de antígeno. Depois da determinação da sequência de DNA de scFv de ligação de antígeno, as sequências de região V podem ser fundidas na estrutura com as sequências das regiões C de anticorpo humano desejado, e em seguida inseridas aos vetores de expressão apropriados para preparar os vetores de expressão. Os vetores de expressão são transferidos às células de expressão preferidas como exemplificado acima. Os genes de codificação de anticorpo humano são expressados pelas células para obter os anticorpos humanos. Estes métodos já são conhecidos na técnica (veja WO1992001047, WO19992020791, WO1993006213, WO1993011236, WO1993019172, WO1995001438 e WO1995015388).
[00173] O "domínio de ligação de antígeno" descrito aqui refere-se a uma região que especificamente liga-se a uma porção ou o todo de um antígeno com complementaridade. Os exemplos do domínio de ligação de antígeno podem incluir domínios que têm um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo. Os exemplos do domínio de ligação de antígeno de um anticorpo podem incluir CDRs e regiões variáveis. No caso de usar CDR(s) como o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, o domínio de ligação de antígeno pode compreender todas as 6 CDRs contidas no anticorpo ou pode compreender uma ou duas ou mais das CDRs. Cada CDR contida como a região de ligação de um anticorpo pode ter, por exemplo, deleção de aminoácido, substituição, adição, e/ou inserção, ou uma porção da CDR pode ser usada, contanto que a CDR contida tenha atividade de ligação de antígeno. O anticorpo direcionado junto a um antígeno que tem um peso molecular grande só pode ligar-se a um sítio particular no antígeno. O sítio particular é chamado epítopo. O domínio de ligação de antígeno pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Preferivelmente, o domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH). Os exemplos preferidos de um tal domínio de ligação de antígeno incluem "scFv (Fv de cadeia simples)", "anticorpo de cadeia simples", "Fv", "scFv2 (Fv2 de cadeia simples)", "Fab", "diacorpo", "anticorpo linear" e "F(ab )2."
[00174] A "região variável de anticorpo" quando aqui usado refere- se a uma região que está contida em cada dentre as cadeias leve e pesada de uma molécula de anticorpo e compreende as sequências de aminoácido de regiões de determinação de complementaridade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3) e regiões de estrutura (FRs). VH representa uma região variável de cadeia pesada. VL representa uma região variável de cadeia leve. De acordo com um método usado na presente invenção, posições de aminoácido nomeadas CDRs e FRs são definidas de acordo com o método de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). No presente relatório, os aminoácidos em um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno são da mesma forma numerados de acordo com a numeração de Kabat que conforma-se às posições de aminoácido de Kabat.
[00175] O termo "regiões de determinação de complementaridade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3)" quando aqui usado refere-se a resíduos de aminoácido da região variável de anticorpo requerida para existir a ligação de antígeno. Cada região variável compreende três regiões de CDR geralmente indicadas por CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região de determinação de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácido a partir de uma "região de determinação de complementaridade" como descrito por Kabat (isto é, resíduos 24 a 34 (CDR1), 50 a 56 (CDR2), e 89 a 97 (CDR3) na região variável de cadeia leve e resíduos 31 a 35 (CDR1), 50 a 65 (CDR2), e 95 a 102 (CDR3) na região variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou resíduos de uma "alça hipervariável" (isto é, resíduos 26 a 32 (CDR1), 50 a 52 (CDR2), e 91 a 96 (CDR3) na região variável de cadeia leve e resíduos 26 a 32 (CDR1), 53 a 55 (CDR2), e 96 a 101 (CDR3) na região variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196, 901-917). Em alguns casos, cada região de determinação de complementaridade pode compreender aminoácidos igualmente da região de CDR e da alça hipervariável definidas pelo método de Kabat.
[00176] O termo fragmento "Fab" compreende regiões variáveis e constantes de uma cadeia leve e uma região variável e a primeira região constante (CH1) de uma cadeia pesada. O fragmento de anticorpo F(ab')2 compreende um par de fragmentos Fab tipicamente ligados covalentemente em sítios próximos aos seus terminais carbóxi por cisteína em um região de articulação entre estes. Outras ligações químicas para fragmentos de anticorpo são da mesma forma conhecidas na técnica a qual a presente invenção pertence.
[00177] O termo "Fv de cadeia simples" ou fragmento de anticorpo "scFv" compreende regiões VH e VL de anticorpo, que por sua vez constituem uma cadeia de polipeptídeo simples. Normalmente, o polipeptídeo de Fv também compreende um ligador de polipeptídeo entre as regiões VH e VL. Este ligador permite a formação de uma estrutura desejável para o antígeno de ligação de scFv. O scFv é revisado em, por exemplo, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (1994) Vol. 113, 269-315 (Rosenburg and Moore ed., Springer-Verlag, New York).
[00178] O termo "diacorpo" refere-se a um fragmento de anticorpo pequeno que tem dois sítios de ligação de antígeno. Este fragmento de anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) ligada a uma região variável de cadeia leve (VL) em uma cadeia de polipeptídeo (VH e VL). Um ligador que é muito curto para emparelhar estas duas regiões na mesma cadeia de polipeptídeo é usado para forçadamente emparelhar estas regiões com suas regiões complementares em outra cadeia de polipeptídeo de forma que dois sítios de ligação de antígeno sejam formados. O diacorpo é descrito em detalhes em, por exemplo, literaturas de patente tal como Patente Europeia No. 404097 e WO1993011161 e literaturas de não patente tal como Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 6444-6448.
[00179] O termo "anticorpo linear" refere-se a um anticorpo descrito em Zapata et al., Protein Eng. (1995) 8 (10), 1057-1062. Em resumo, este anticorpo compreende um par de segmentos Fd tandem (VH- CH1-VH-CH1) que formam um par de domínios de ligação de antígeno com um polipeptídeo de cadeia leve complementar. O anticorpo linear pode ser biespecífico ou monoespecífico.
ANTÍGENO
[00180] O "antígeno" descrito aqui não está limitado por uma estrutura particular contanto que o antígeno compreenda um epítopo ao qual o domínio de ligação de antígeno liga-se. Em outro sentido, o antígeno pode ser matéria inorgânica ou pode ser matéria orgânica. Os exemplos do antígeno podem incluir as seguintes moléculas: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1- antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, fator natriurético atrial, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, estimulator de B-linfócito (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, fator neurotrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator complementar 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígenos associados ao câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 protein), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígenos associados ao tumor de citoceratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator acelerador de decadência, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 de cérebro), Dhh, digoxina, DNAM- 1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína ativadora de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio estimulador de folículo, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP- 2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa 1, GFR-alfa 2, GFR- alfa 3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM- CSF, gp130, gp72, GRO, fator liberador de hormônio de crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gB, glicoproteína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus do herpes simples (HSV), glicoproteína HSV gD, HGFA, antigen associado ao melanoma de altopeso molecular (HMW-MAA), HIV gp120, alça HIV IIIB gp 120 V3, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA receptor, IgE, IGF, proteína de ligação de IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL- 1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferona (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A de insulina, cadeia B de insulina, fator 1 de crescimento semelhante à insulina, integrina alfa 2, integrina alfa 3, integrina alfa 4, integrina alfa 4/beta 1, integrina alfa 4/beta 7, integrina alfa 5 (alfa V), integrina alfa 5/beta 1, integrina alfa 5/beta 3, integrina alfa 6, integrina beta 1, integrina beta 2, interferona gama, IP- 10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno de Lewis-Y, antígeno relacionado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, supérfície pulmonar, hormônio luteinizante, beta receptor de linfotoxina, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, metaloproteases, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP- 14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, substância inibidora muleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, aderina de N-C, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4, ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, paratormônio, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placental (PLAP), PlGF, PLP, PP14, pró-insulina, prorrelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia de relaxina A, cadeia de relaxina B, renina, virus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albumina de soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína-72 associada ao tumor), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por exemplo, receptor alfa/beta de célula T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF- beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF- beta 4, TGF-beta 5, trombina, timo Ck-1, hormônio estimulador da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa/beta, TNF-beta 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCER), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligante TRANCE/RANK ODF, ligante OPG), TNFSF12 (ligante TWEAK Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante de AITR de ligante GITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligante OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD154 de ligante CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante de Apo-1 de ligante Fas, ligante de APT1), TNFSF7 (CD70 de ligante CD27), TNFSF8 (CD153 de ligante CD30), TNFSF9 (ligante CD137 de ligante 4-1BB), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado ao tumor CA125, carboidrato relacionado ao Lewis-Y de expressão de antigen associado ao tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-caderina, VE-caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígenos virais, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, fator de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, cromogranina A, cromogranina B, tau, VAP1, cininogênio de alto peso molecular, IL- 31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, sindecana-1, sindecana-2, sindecana-3, sindecana-4, LPA, S1P, receptor de acetilcolina, AdipoR1, AdipoR2, ADP ribosil ciclase-1, alfa-4/beta-7 integrina, alfa-5/beta-1 integrina, alfa-v/beta-6 integrina, alfa-v/beta-1 integrina, ligante-2 de angiopoetina, Angptl2, Anthrax, caderina, anidrase-IX carbônica, CD105, CD155, CD158a, CD37, CD49b, CD51, CD70, CD72, Claudin 18, toxina de Clostridium difficile, CS1, ligante 4 de proteína tipo delta, DHICA oxidase, ligante de Dickkopf-1, dipeptidil peptidase IV, EPOR, proteína F de RSV, fator Ia, FasL, receptor alfa de folato, receptor de glucagon, receptor de peptídeo 1 tipo glucagon, glutamato carboxipeptidase II, GMCSFR, glicoproteína E2 do vírus da hepatite C, hepcidina, receptor IL-17, receptor IL-22, receptor IL-23, receptor IL-3, Kit tirosina cinase, alfa-2- glicoproteína 1 rica em leucina (LRG1), receptor de lisosfingolipídeo, glicoproteína OX2 de membrana, mesotelina, MET, MICA, MUC-16, glicoproteína associada de mielina, neuropilina-1, neuropilina-2, receptor de Nogo, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4A, PLXNA4B, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, ligante 1 de morte celular programada, proproteína convertase PC9, ligante-1 de glicoproteína de P-selectina, RAGE, reticulon 4, RF, RON-8, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A, toxina II tipo Shiga, receptor-1 de fosfato de esfingosina-1, ST2, ácido lipoteicoico de Estafilococo, tenascina, TG2, receptor de linfopoetina estromal tímico, receptor 12A da superfamília de TNF, glicoproteína NMB de transmembrana, TREM-1, TREM-2, glicoproteína de trofoblasto, receptor de TSH, TTR, tubulina, ULBP2, e receptores para hormônios ou fatores de crescimento. Outros exemplos do antígeno podem incluir moléculas solúveis dos receptores descritos acima que residem sem ser ancorado em células em fluidos de corpo in vivo.
[00181] O epítopo, que significa um determinante antigênico, contido no antígeno significa um sítio no antígeno ao qual o domínio de ligação de antígeno na molécula de ligação de antígeno descrito aqui liga-se. Consequentemente, por exemplo, o epítopo pode ser definido por sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido pela atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno que reconhece o epítopo. O epítopo em um peptídeo ou polipeptídeo antigênico pode ser determinado por resíduos de aminoácido que constituem o epítopo. Alternativamente, o epítopo composto de uma cadeia de açúcar pode ser determinado por uma estrutura de cadeia de açúcar particular.
[00182] Um epítopo linear refere-se a um epítopo que compreende um epítopo que é reconhecido por meio de sua sequência primária de aminoácidos. O epítopo linear compreende tipicamente pelo menos 3 e mais geralmente pelo menos 5, por exemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 ou 6 a 20 aminoácidos, em uma sequência única.
[00183] Em comparação ao epítopo linear, um epítopo conformacional refere-se a um epítopo que está contido em uma sequência primária de aminoácidos que compreendem um componente diferente do único componente definido do epítopo a ser reconhecido (por exemplo, um epítopo cuja sequência primária de aminoácidos pode não ser reconhecida por um anticorpo que determina o epítopo). O epítopo conformacional pode conter um número aumentado de aminoácidos, em comparação com o epítopo linear. Um anticorpo reconhece o epítopo conformacional reconhecendo a estrutura tridimensional do peptídeo antigênico ou proteína. Por exemplo, a molécula de proteína pode ser duplicada para formar uma estrutura tridimensional. Em um tal caso, certos aminoácidos e/ou esqueleto de polipeptídeo que constitui o epítopo conformacional são organizados em paralelo para permitir o anticorpo para reconhecer o epítopo. A conformação do epítopo é determinada por um método incluindo, por exemplo, porém não limitado à cristalografia de Raios X, espectroscopia de ressonância magnético nuclear bidimensional, e rotulagem por rotação específica de sítio e espectroscopia de ressonância paramagnética de elétron. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocolos in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris ed.
MÉTODO DE RECOMBINAÇÃO GÊNICA
[00184] O termo "conjunto de códon" refere-se a um conjunto de sequências de tripleto de nucleotídeo diferente que são usadas para codificar um aminoácido desejado. Um conjunto de oligonucleotídeos inclui sequências que representam cada possível combinação de tripletos de nucleotídeo fornecidos pelo conjunto de códon e codificam um grupo de aminoácido desejado. Um tal conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado por, por exemplo, um método de fase sólida. O sistema padrão de designação de códon é fornecido pelo código de IUB. Este código é conhecido na técnica. O conjunto de códon geralmente é indicado por três capitais, por exemplo, NNK, NNS, DVK, ou DVD. Código de IUB G: guanina A: adenina T: timina C: citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A, C ou T) B (C, G ou T) V (A, C ou G) D (A, G ou T) N (A, C, G ou T)
[00185] Por exemplo, em um conjunto de códon DVK, D representa um nucleotídeo A, G ou T; V representa A, G, ou C; e K representa G ou T. Este conjunto de códon representa 18 códons diferentes e codifica os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys.
[00186] Um oligonucleotídeo tendo um "nucleotídeo degenerado" em uma posição particular é projetado por um método conhecido na técnica a qual a presente invenção pertence (por exemplo, Garrard e Henner, Gene (1993) 128, 103-109). Um conjunto de oligonucleotídeos tendo um tal certo tipo de conjunto de códon pode ser sintetizado usando um sintetizador de ácido nucleico comercialmente disponível (disponível a partir de, por exemplo, Applied Biossistemas, Inc., Foster City, CA), ou pode ser obtido como produtos comercialmente disponíveis (por exemplo, Life Technologies, Rockville, MD). Desse modo, um conjunto de oligonucleotídeo sintético tendo um conjunto particular geralmente compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos que diferem-se na sequência. Em um aspecto não limitante da presente invenção, os oligonucleotídeos podem compreender, por exemplo, sítios de enzimas de restrição úteis na clonagem.
[00187] Os termos "célula", "sistema de célula", e "cultura de célula" são sinonimicamente usados. Tais designações podem incluir toda progênie de células ou sistemas de célula. Desse modo, por exemplo, os termos "transformante" e "célula transformada" incluem células alvo primárias e culturas derivadas destas, independente do número de passagem. Deveria ser entendido da mesma forma que toda progênie pode não ter conteúdos de DNA exatamente idênticos, devido à mutação deliberada ou inadvertida. Estes termos podem incluir a progênie de uma variante tendo substancialmente as mesmas funções ou atividade biológica quando avaliadas nas células originalmente transformadas. Se uma designação distinta for planejada, isto ficará evidente a partir do contexto.
[00188] O termo "sequência de controle" usado para mencionar a expressão de uma sequência de codificação refere-se a uma sequência de nucleotídeo de DNA necessária para a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. Sequências de controle adequadas para, por exemplo, procariotas incluem promotores, sequências operadoras opcionais, sítios de ligação ribossômicos, e, provavelmente, outras sequências que ainda permanecem para ser bem entendidas. O uso de um promotor, um sinal de poliadenilação, e um realçador é conhecido na técnica pela expressão da sequência de codificação em células eucarióticas.
[00189] A frase "operavelmente ligada" a um ácido nucleico significa que o ácido nucleico tem uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma pré-sequência ou DNA líder secretório é operavelmente ligado com um DNA de um polipeptídeo, quando expresso como uma proteína precursora envolvida na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou um realçador, ao influenciar a transcrição de uma sequência de codificação, é operavelmente ligado à sequência. Alternativamente, um sítio de ligação ribossômico, quando posicionado para facilitar a translação, é operavelmente ligado à sequência de codificação. Normalmente, a frase "operavelmente ligado" significa que a sequência de DNAs ligados é sucessiva e que uma sequência líder secretória, por exemplo, está consecutivamente presente dentro de uma estrutura de leitura. Entretanto, o realçador não tem que ser sucessivo. Tal ligação é obtida por ligação em sítios de restrição apropriados. Na ausência de tais sítios, um adaptador de oligonucleotídeo sintético ou ligador é usado de acordo com a prática convencional. Alternativamente, os ácidos nucleicos ligados podem ser preparados pelo método de PCR de extensão de sobreposição descrito acima.
[00190] A "ligação" refere-se a um método para formar uma ligação de fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para a ligação de dois fragmentos, as extremidades destes fragmentos devem ser compatíveis entre si. Em alguns casos, estas extremidades têm compatibilidade imediatamente depois da digestão da endonuclease. Entretanto, a compatibilidade para a ligação requer primeiro a terminação cega de uma extremidade coesiva formada por digestão de endonuclease. Para a terminação cega, cada DNA é tratado com aproximadamente 10 unidades de um fragmento de Klenow de DNA polimerase I ou T4 DNA polimerase a 15°C durante pelo menos 15 minutos, na presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo em uma solução de tampão apropriada. Em seguida, o DNA é purificado por extração de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol ou purificação de sílica. Os fragmentos de DNA a ser ligados são adicionados em quantidades equimolares a uma solução. Esta solução contém ATP e um tampão de ligase bem como aproximadamente 10 unidades de ligase (por exemplo, T4 DNA ligase) por 0,5 μg de DNA. No caso de ligar um DNA a um vetor, o vetor é primeiro linearizado pela ação digestiva da endonuclease de restrição apropriada. O fragmento linearizado é tratado em seguida com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase intestinal de bezerro para desse modo prevenir a autoligação do fragmento durante a etapa de ligação.
[00191] O termo "proteína do envoltório" refere-se a uma proteína, pelo menos uma porção da qual está presente na superfície de uma partícula viral. A partir de um ponto de vista funcional, a proteína do envoltório é uma proteína arbitrária que liga-se às partículas virais no curso da construção do vírus em células hospedeiras e mantém seu estado ligado até a infecção viral de outras células hospedeiras. A proteína do envoltório pode ser uma proteína do envoltório principal ou pode ser uma proteína do envoltório secundária. A proteína do envoltório secundária é normalmente uma proteína do envoltório presente no capsídeo viral em preferivelmente pelo menos aproximadamente 5, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 7, também preferivelmente pelo menos aproximadamente 10 ou mais cópias de proteína por vírion. A proteína do envoltório principal pode estar presente a dezenas, centenas, ou milhares de cópias por vírion. Os exemplos da proteína do envoltório principal incluem proteína de fago filamentoso p8.
[00192] O termo "limite de detecção" para um objeto químico tal como um corpo inorgânico, um corpo orgânico, ou um organismo em particular ensaio refere-se à concentração mínima do objeto detectado acima de um nível base para o ensaio. Por exemplo, no ELISA de fago, o "limite de detecção" para um fago particular que exibe um fragmento de ligação de antígeno particular refere-se à concentração de fago a qual o fago particular produz mais sinais de ELISA do que aqueles produzidos por um fago de controle que não exibe o fragmento de ligação de antígeno.
[00193] O termo "exibição de fago" refere-se a um método pelo qual polipeptídeos variantes são exibidos como proteínas de fusão com pelo menos uma porção de proteínas do envoltório na superfície de partícula de fagos, por exemplo, fagos filamentosos. A exibição de fago é útil porque uma biblioteca grande de variantes de proteína randomizadas pode ser rapidamente e eficazmente avaliada para uma sequência de ligação a um antígeno alvo com afinidade alta. A exibição de peptídeo e bibliotecas de proteína nos fagos foi usada para avaliar milhões de polipeptídeos para aqueles com propriedades de ligação específicas. Um método de exibição de fago polivalente foi usado para exibir peptídeos randomizados pequenos e proteínas pequenas por fusões com gene III ou gene VIII de fago filamentoso (Wells e Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. (1992) 3, 355-362; e referências citadas nisto). A exibição de fago monovalente envolve a fusão de uma proteína ou biblioteca de peptídeo para gene III ou uma porção dos mesmos, e expressão de proteínas de fusão em baixos níveis na presença de proteína III de gene tipo selvagem de forma que cada partícula de fago exiba uma cópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Os fagos monovalentes têm um efeito mais baixo de avidez do que o dos fagos polivalentes e são, portanto, avaliados com base na afinidade de ligante endógena usando vetores de fagomídeo, que simplificam a manipulação de DNA (Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methodsin em Enzimology (1991) 3, 205-216).
[00194] O "fagomídeo" refere-se a um vetor de plasmídeo tendo uma origem de replicação bacteriana, por exemplo, Co1E1, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. Qualquer bacteriófago conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, bacteriófagos filamentosos e bacteriófagos lambdoides podem ser apropriadamente usados como o fagomídeo. Normalmente, o plasmídeo também contém um marcador seletivo para resistência antibiótica. Fragmentos de DNA clonados nestes vetores podem ser crescidos como plasmídeos. Quando as células transformadas com estes vetores possuem todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o padrão de replicação de plasmídeos é trocado por replicação de círculo de rotação para formar cópias de um filamento de DNA de plasmídeo e partículas de fago de embalagem. O fagomídeo pode formar partículas de fago infecciosas ou não infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que compreendem um gene de proteína do envoltório de fago ou fragmento dos mesmos ligados com um gene de polipeptídeo heterólogo por fusão de gene tal que o polipeptídeo heterólogo é exibido na superfície da partícula de fago.
[00195] O termo "vetor de fago" significa um bacteriófago replicativo de filamento duplo que compreende um gene heterólogo e é capaz de replicar-se. O vetor de fago tem uma origem de replicação de fago que permite a replicação de fago e formação de partícula de fago. O fago é preferivelmente um bacteriófago filamentoso, por exemplo, um fago M13, f1, fd, ou Pf3 ou um derivado dos mesmos, ou um fago lambdoide, por exemplo, lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, ou qualquer outro fago ou um derivado dos mesmos.
[00196] O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polidesoxinucleotídeo de filamento único ou duplo curto que é sintetizado quimicamente por um método conhecido na técnica (por exemplo, química de fosfotriéster, fosfito, ou fosforamidita usando um método de fase sólida tal como um método descrito em EP266032; ou um método por meio de intermediário de desoxinucleotídeo H- fosfonato descrito em Froeshler et al., Nucl. Acids. Res. (1986) 14, 5399-5407). Outros métodos para síntese de oligonucleotídeo incluem a reação em cadeia da polimerase descrita abaixo e outros métodos de autoiniciador e sínteses de oligonucleotídeo em suportes sólidos. Todos estes métodos são descritos em Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. (1989) 28, 716-734. Estes métodos são usados contanto que a sequência de ácido nucleico total do gene seja conhecida ou contanto que uma sequência de ácido nucleico complementar ao filamento de codificação esteja disponível. Alternativamente, possíveis sequências de ácido nucleico podem ser apropriadamente preditas usando resíduos preferidos e conhecidos que codificam cada resíduo de aminoácido, se a sequência de aminoácido alvo for conhecida. O oligonucleotídeo pode ser purificado usando géis de poliacrilamida ou colunas de delimitação moleculares ou por precipitação.
[00197] O termo "proteína de fusão" e "polipeptídeo de fusão" referem-se a um polipeptídeo que tem dois segmentos covalentemente ligados um ao outro. Este polipeptídeo tem características diferentes derivadas destes segmentos. Estas características podem cada qual ser, por exemplo, uma propriedade biológica tal como atividade in vitro ou in vivo. Alternativamente, estas características podem cada qual ser uma propriedade química ou física única, por exemplo, ligando-se a um antígeno alvo ou catálise de reação. Estes dois segmentos podem ser ligados diretamente por uma única ligação de peptídeo ou por meio de um ligador de peptídeo que compreende um ou mais resíduo(s) de aminoácido. Normalmente, estes dois segmentos e o ligador estão presentes na mesma estrutura de leitura. Preferivelmente, os dois segmentos do polipeptídeo são obtidos a partir de polipeptídeos heterólogos ou diferentes.
[00198] O termo "DNA heterólogo" refere-se a um DNA arbitrário que é transferido às células hospedeiras. O DNA pode ser derivado de várias fontes que incluem os DNAs genômicos, cDNAs, DNAs sintéticos, e fusões ou combinações dos mesmos. O DNA pode incluir os DNAs a partir das mesmas células ou tipo de célula como células hospdeiras ou recipientes ou DNAs de um tipo de célula diferente, por exemplo, de um mamífero ou uma planta. O DNA pode opcionalmente compreender um marcador ou gene seletivo, por exemplo, um gene de resistência à antibiótico ou um gene de resistência à temperatura, e similares.
[00199] O termo "posição altamente diversa" quando aqui usado refere-se a uma posição de aminoácido em regiões variáveis de cadeia leve e pesada que têm vários aminoácidos diferentes apresentados na posição, quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou naturais ou fragmentos de ligação de antígeno são comparados. A posição altamente diversa fica geralmente localizada em regiões CDR. Em um aspecto, a posição altamente diversa em anticorpos conhecidos e/ou naturais é eficazmente determinada com base de dados fornecidos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Uma pluralidade da base de dados (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/e http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) na internet fornece uma coleta extensa de muitas sequências de cadeia leve e pesada humanas e seus alinhamentos. Informação sobre estas sequências e seus alinhamentos é útil na determinação da posição altamente diversa de acordo com a presente invenção. De acordo com a presente invenção, uma posição de aminoácido é considerada como sendo altamente diversa se o aminoácido tiver uma diversidade de preferivelmente aproximadamente 2 a aproximadamente 20, preferivelmente aproximadamente 3 a aproximadamente 19, preferivelmente aproximadamente 4 a aproximadamente 18, preferivelmente 5 a 17, preferivelmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, preferivelmente 8 a 14, preferivelmente 9 a 13, ou preferivelmente 10 a 12 possíveis resíduos de aminoácido diferentes na posição. Em algumas modalidades, uma posição de aminoácido pode ter uma diversidade de pelo menos aproximadamente 2, preferivelmente pelo menos aproximadamente 4, preferivelmente pelo menos aproximadamente 6, preferivelmente pelo menos aproximadamente 8, preferivelmente aproximadamente 10, preferivelmente aproximadamente 12 possíveis resíduos de aminoácido diferentes. No presente relatório, tais resíduos de aminoácido são da mesma forma referidos como resíduos flexíveis. O termo "conjunto de códon não randomizado" refere-se a um conjunto de códon que codifica um aminoácido selecionado que parcialmente (preferivelmente, completamente) satisfaz os critérios para seleção de aminoácido descrita aqui. O termo "conjunto de códon randomizado" quando aqui usado refere-se a um conjunto de códon que tem uma combinação de códons que codificam um aminoácido arbitrário selecionado dentre 20 aminoácidos (Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, e Val/V).
BIBLIOTECA
[00200] De acordo com um aspecto, a presente invenção fornece uma biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada uma das moléculas de ligação de antígeno compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon. Os exemplos preferidos da concentração de íon incluem concentração de íon de metal e concentração de íon de hidrogênio.
[00201] O termo "biblioteca" descrito aqui refere-se a uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno, uma pluralidade de polipeptídeos de fusão cada qual compreendendo as moléculas de ligação de antígeno, ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos cada qual codificando suas sequências. A pluralidade de moléculas de ligação de antígeno contida na biblioteca ou a pluralidade de polipeptídeos de fusão cada qual compreendendo as moléculas de ligação de antígeno não tem sequências simples e são moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente ou polipeptídeos de fusão cada qual compreendendo estas moléculas de ligação de antígeno.
[00202] O termo "íon de metal" descrito aqui refere-se a um íon de um elemento que pertence a qualquer de grupo I incluindo metais de álcali com exceção de hidrogênio e a família de cobre, grupo II que inclui metais alcalinos terrosos e a família de zinco, grupo III com exceção de boro, grupo IV com exceção de carbono e silício, grupo VIII incluindo a família de ferro e a família da platina, e subgrupos A de grupos V, VI, e VII, ou um elemento metálico tal como antimônio, bismuto ou polônio. Átomos metálicos têm a propriedade de liberar elétrons de valência para tornarem-se cátions. Esta propriedade é chamada tendência de ionização. Metais que têm grande tendência à ionização são de acordo com o relato ricos em atividade química.
[00203] Exemplos do íon de metal preferido para a presente invenção incluem íons de cálcio. Os íons de cálcio são envolvidos no regulamento de muitos fenômenos vitais incluindo a contração de músculos tal como musculoesquelético, músculo liso, e músculo cardíaco, a ativação (por exemplo, movimento e fagocitose) de leucócitos, a ativação (por exemplo, deformação e secreção) de plaquetas, a ativação de linfócitos, a ativação (por exemplo, secreção de histamina) de mastócitos, resposta celular mediada por receptor de catecolamina α ou receptor de acetilcolina, exocitose, a liberação de transmissores da terminação neuronal, e o fluxo axonal dos neurônios. Por exemplo, cadeia leve de troponina C, calmodulina, parvalbumina, e miosina tendo vários sítios de ligação de íon de cálcio e provavelmente é derivada de uma origem comum em termos de evolução molecular, é conhecida como receptores de íon de cálcio intracelulares. Um número grande de seus motivos de ligação é da mesma forma conhecido. Motivos de ligação bem conhecidos são, por exemplo, um domínio de caderina, um EF hand contido em calmodulina, um domínio de C2 contido em proteína cinase C, um domínio de Gla contido em um fator IX da proteína de coagulação sanguínea, uma lectina tipo C contida no receptor de asialoglicoproteína ou receptor de ligação de manose, um domínio A contido no receptor de LDL, uma anexina, um domínio tipo 3 de trombospondina, e um domínio tipo EGF.
[00204] Quando o íon de metal de acordo com a presente invenção for um íon de cálcio, exemplos das condições da concentração de íon de cálcio incluem uma condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e uma condição de concentração com alto teor de íon de cálcio. A frase "atividade de ligação é alterada dependendo das condições da concentração de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo da diferença entre a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio. Os exemplos deste caso incluem atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio. Outro exemplo inclui atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno dos mesmos sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio.
[00205] No presente relatório, a concentração com alto teor de íon de cálcio não está particularmente limitada a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente uma concentração selecionada a partir da faixa de 100 μM a 10 mM. Em outro aspecto, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 200 μM a 5 mM. Em um aspecto diferente, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM. Em um aspecto alternativo, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 200 μM a 2 mM. Além disso, esta concentração pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 400 μM a 1,5 mM. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem concentrações selecionadas a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM, que estão perto das concentrações de íon de cálcio in vivo no plasma (sangue).
[00206] No presente relatório, a concentração com baixo teor de íon de cálcio não está particularmente limitada a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,1 μM a 30 μM. Em outro aspecto, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,2 μM a 20 μM. Em um aspecto diferente, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,5 μM a 10 μM. Em um aspecto alternativo, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 1 μM a 5 μM. Além disso, esta concentração pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 2 μM a 4 μM. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem concentrações selecionadas a partir da faixa de 1 μM a 5 μM que está perto das concentrações de cálcio ionizado in vivo no endossoma precoce.
[00207] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,1 μM a 30 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 100 μM a 10 mM. Esta frase preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,5 μM a 10 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 200 μM a 5 mM. A frase particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio in vivo no endossoma precoce é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio in vivo no plasma. Isto especificamente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 1 μM a 5 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM.
[00208] Se ou não a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon de metal, pode ser determinada por uso de um método de ensaio conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é comparada entre a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio para confirmar que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada a um nível mais alto sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio.
[00209] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio" pode ser expressada como "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais alta sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio". Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno é mais baixa sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio" é descrito da mesma forma como "capacidade de ligação de antígeno é mais fraca sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio". Além disso, a frase "atividade de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio é diminuída com respeito àquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio" é descrita da mesma forma como "capacidade de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio é diminuída com respeito àquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio".
[00210] Condições diferentes da concentração de íon de cálcio para analisar a atividade de ligação de antígeno podem ser selecionadas apropriadamente por aqueles versados na técnica sem limitações particulares. A atividade de ligação de antígeno pode ser analisada sob condições de, por exemplo, um tampão de HEPES e 37oC. Da mesma forma, a atividade de ligação de antígeno pode ser analisada usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). No ensaio de atividade de ligação de antígeno, a molécula de ligação de antígeno pode ser avaliada quanto a sua capacidade de ligação junto a, por exemplo, antígenos solúveis, pela injeção dos antígenos como um analisado para um fragmento imobilizado por molécula de ligação de antígeno. Alternativamente, a molécula de ligação de antígeno pode ser avaliada quanto a sua capacidade de ligação junto a, por exemplo, antígenos de membrana, pela injeção da molécula de ligação de antígeno como um analisado a um fragmento imobilizado por antígeno.
[00211] Na molécula de ligação de antígeno da presente invenção, a relação entre a atividade de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e a atividade de ligação de antígeno sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio não está particularmente limitada contanto que a atividade de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio seja mais fraca do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio. A relação de uma constante de dissociação KD sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio para KD sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio (KD (3 μM de Ca)/KD (2 mM de Ca)) para antígenos é preferivelmente 2 ou mais alta, mais preferivelmente 10 ou mais alta, também preferivelmente 40 ou mais alta. O limite superior da relação de KD (3 μM de Ca)/KD (2 mM de Ca) não está particularmente limitado e pode ser qualquer valor que inclui 400, 1000, 10000, etc. contanto que a molécula de ligação de antígeno resultante possa ser preparada tecnicamente por aqueles versados na técnica. Alternativamente, a relação pode ser definida por um valor de KD (3 μM de Ca)/KD (1,2 mM de Ca). Especificamente, a relação de KD (3 μM de Ca)/KD (1,2 mM de Ca) é 2 ou mais alta, mais preferivelmente 10 ou mais alta, também preferivelmente 40 ou mais alto. O limite superior da relação de KD (3 μM de Ca)/KD (1,2 mM de Ca) não está particularmente limitado e pode ser qualquer valor que inclui 400, 1000, 10000, etc. contanto que a molécula de ligação de antígeno resultante possa ser preparada tecnicamente por aqueles versados na técnica.
[00212] A constante de dissociação KD pode ser usada como o valor da atividade de ligação de antígeno para antígenos solúveis. Alternativamente, KD aparente (constante de dissociação aparente) pode ser usada para antígenos de membrana. A KD (constante de dissociação) e a KD aparente (constante de dissociação aparente) podem ser medidas por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), uma plotagem de Scatchard, ou um citômetro de fluxo.
[00213] Alternativamente, por exemplo, uma constante de taxa de dissociação kd pode ser usada preferivelmente como um índice diferente que indica a relação entre a atividade de ligação de antígeno sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio e a atividade de ligação de antígeno sob a condição de concentração com alto teor de cálcio para a molécula de ligação de antígeno da presente invenção. No caso de usar a kd (constante de taxa de dissociação) em vez de KD (constante de dissociação) como um índice para a relação de atividade de ligação, a relação de kd (constante de taxa de dissociação) sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio para kd (constante de taxa de dissociação) sob a condição de concentração com alto teor de cálcio (kd (sob a condição de baixa concentração de cálcio)/kd (sob a condição de concentração com alto teor de cálcio)) para antígenos é preferivelmente 2 ou mais alta, mais preferivelmente 5 ou mais alta, também preferivelmente 10 ou mais alta, ainda também preferivelmente 30 ou mais alta. O limite superior da relação de kd (sob a condição de baixa concentração de cálcio)/kd (sob a condição de concentração com alto teor de cálcio) não está particularmente limitada e pode ser qualquer valor que inclui 50, 100, 200, etc. contanto que a molécula de ligação de antígeno resultante possa ser preparada de acordo com o bom senso técnico daqueles versados na técnica.
[00214] A constante da taxa de dissociação kd pode ser usada constante como o valor da atividade de ligação de antígeno para antígenos solúveis. Alternativamente, kd aparente (constante de taxa de dissociação aparente) pode ser usada para antígenos de membrana. A kd (constante de taxa de dissociação) e a kd aparente (constante de taxa de dissociação aparente) podem ser medidas por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) ou um citômetro de fluxo. Na presente invenção, a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em concentrações de íon de cálcio diferentes é analisada preferivelmente com condições diferentes da concentração de cálcio mantida constante.
[00215] Na presente invenção, as condições da concentração para um próton, isto é, um núcleo atômico de hidrogênio, são tratadas sinonimicamente com condições de expoente de hidrogênio (pH). Quando a massa ativa dos íons de hidrogênio em uma solução aquosa é indicada por aH+, o pH é definido como - log10aH+. Em uma solução aquosa tendo força iônica baixa (por exemplo, menor do que 10-3), aH+ é quase igual à força iônica de hidrogênio. Por exemplo, o produto de íon de água à 25°C e 1 pressão atmosférica é Kw = aH+aOH = 10-14 e é portanto aH+ = aOH = 10-7 para água pura. Neste caso, pH 7 representa uma solução aquosa neutra; um pH menor que 7 representa uma solução aquosa ácida; e um pH maior que 7 representa uma solução aquosa alcalina.
[00216] No caso de usar as condições de pH como as condições da concentração de íon de hidrogênio de acordo com a presente invenção, exemplos das condições de pH incluem uma condição de pH ácido e uma condição de pH neutro. A frase "atividade de ligação é alterada dependendo as condições de pH" significa que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo da diferença entre a condição de pH ácido e a condição de pH neutro. Os exemplos deste caso incluem atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido. Outro exemplo inclui atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno dos mesmos sob a condição de pH ácido do que aquela sob a condição de pH neutro.
[00217] No presente relatório, o pH neutro não está particularmente limitado a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 10,0. Em outro aspecto, o pH neutro pode ser selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 9,5. Em um aspecto diferente, o pH neutro pode ser selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 9,0. Em um aspecto alternativo, este pH pode ser selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 8,0. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem pH 7,4 que está perto do pH in vivo no plasma (sangue).
[00218] No presente relatório, o pH ácido não está particularmente limitado a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente selecionado a partir da faixa de pH 4,0 ao pH 6,5. Em outro aspecto, o pH ácido pode ser selecionado a partir da faixa de pH 4,5 ao pH 6,5. Em um aspecto diferente, o pH ácido pode ser selecionado a partir da faixa de pH 5,0 ao pH 6,5. Em um aspecto alternativo, este pH pode ser selecionado a partir da faixa de pH 5,5 ao pH 6,5. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem pH 5,8 que está perto do pH in vivo no endossoma precoce.
[00219] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob a condição de pH ácido do que aquela sob a condição de pH neutro" significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,0 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 10,0. Esta frase preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,5 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 9,5. A frase mais preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,0 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 9,0. A frase também significa preferivelmente que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,5 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 8,0. A frase particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno em pH in vivo no endossoma precoce é mais fraca do que aquela em pH in vivo no plasma. Isto especificamente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que aquela em pH 7,4.
[00220] Se ou não a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH, pode ser determinada, por exemplo, de acordo com um método de ensaio de atividade de ligação sob condições de pH diferentes descritas acima. Por exemplo, a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é comparada entre a condição de pH ácido e a condição de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada a um nível mais alto sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido.
[00221] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob a condição de pH ácido do que aquela sob a condição de pH neutro" pode ser expressa como "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais alta sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido". Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno é mais baixa sob a condição de pH ácido do que aquela sob a condição de pH neutro" é descrita da mesma forma como "capacidade de ligação de antígeno é mais fraca sob a condição de pH ácido do que aquela sob a condição de pH neutro". Além disso, a frase "atividade de ligação de antígeno sob a condição de pH ácido é diminuída com respeito àquela sob a condição de pH neutro" é descrita da mesma forma como "capacidade de ligação de antígeno sob a condição de pH ácido é diminuída com respeito àquela sob a condição de pH neutro".
[00222] Quando o íon de metal é, por exemplo, um íon de cálcio, o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon como descrito acima não está limitado por seu tipo contanto que o aminoácido forme um motivo de ligação de cálcio. O motivo de ligação de cálcio é bem conhecido por aqueles versados na técnica e é descrito em detalhes (por exemplo, Springer et al., Cell (2000) 102, 275-277; Kawasaki e Kretsinger, Protein Prof. (1995) 2, 305-490; Moncrief et al., J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562; Chauvaux et al., Biochem. J. (1990) 265, 261-265; Bairoch e Cox, FEBS Lett. (1990) 269, 454-456; Davis, New Biol. (1990) 2, 410-419; Schaefer et al., Genomics (1995) 25, 638-643; Economou et al., EMBO J. (1990) 9, 349-354; e Wurzburg et al., Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058). Especificamente, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode compreender qualquer motivo de ligação de cálcio conhecido na técnica, incluindo lectinas tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR, e DC-SINAL. Outros exemplos preferidos de um tal motivo de ligação de cálcio podem incluir um motivo de ligação de cálcio contido em um domínio de Vk5 presente em uma região variável de cadeia leve de anticorpo que tem uma sequência de linhagem germinativa tal como Vk5-2 como descrito depois.
[00223] Como um exemplo alternativo, um aminoácido que tem um efeito de quelação de metal pode ser usado preferivelmente como o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de cálcio. Os exemplos preferidos do aminoácido que tem um efeito de quelação de metal inclui serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)), e ácido glutâmico (Glu (E)).
[00224] A posição do resíduo de aminoácido contida no domínio de ligação de antígeno não está limitada a uma posição particular e pode ser qualquer posição em uma região variável de cadeia pesada ou leve que constitui o domínio de ligação de antígeno contanto que o resíduo de aminoácido resultante altere a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de cálcio. Em um aspecto, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de cálcio está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia pesada. Em outro aspecto, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia pesada CDR3. Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 95, 96, 100a, e 101 definidas pela numeração de Kabat na cadeia pesada CDR3.
[00225] Em um aspecto, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de cálcio está contido no domínio de ligação de antígeno em uma cadeia leve. Em outro aspecto, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido está contido na CDR1 de cadeia leve. Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 30, 31, e 32 definidas pela numeração de Kabat na CDR1 de cadeia leve.
[00226] Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia leve CDR2. Em um aspecto alternativo adicional, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido fica localizado na posição 50 definida pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR2.
[00227] Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido está contido na cadeia leve CDR3. Em um aspecto alternativo adicional, a presente invenção fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido fica localizado na posição 92 definida pela numeração de Kabat na cadeia leve CDR3.
[00228] Em um aspecto diferente, a presente invenção fornece também a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido está contido em duas ou três CDRs selecionadas a partir da CDR1 de cadeia leve, CDR2, e CDR3 descritas aqui. A presente invenção também fornece a biblioteca que consiste essencialmente em moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente, em que o resíduo de aminoácido fica localizado em qualquer uma ou mais dentre as posições 30, 31, 32, 50, e 92 definidas pela numeração de Kabat na cadeia leve.
[00229] Em uma modalidade particularmente preferida, desejavelmente, uma sequência de estrutura nas regiões variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada de cada molécula de ligação de antígeno tem uma sequência de estrutura de linhagem germinativa humana. Desse modo, em um aspecto da presente invenção, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção que tem sequências de estrutura, todas das quais são sequências completamente humanas, provavelmente causa pouca ou nenhuma resposta imunogênica quando administrada a seres humanos (por exemplo, para o tratamento de uma doença). Neste contexto, a frase "que compreende uma sequência de linhagem germinativa" de acordo com a presente invenção significa que pelo menos uma porção da sequência de estrutura da presente invenção é idêntica a uma porção de qualquer sequência de estrutura de linhagem germinativa humana. Por exemplo, a sequência de FR2 de cadeia pesada na molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode ser uma sequência composta de uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada a partir de uma pluralidade de sequências de estrutura de linhagem germinativa humanas diferentes. Uma tal molécula de ligação de antígeno é incluída da mesma forma na molécula de ligação de antígeno "que compreende uma sequência de linhagem germinativa" da presente invenção.
[00230] Exemplos preferidos da região de estrutura incluem as sequências de regiões de estrutura completamente derivadas de humano atualmente conhecidas listadas em uma Website tal como V- Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Quaisquer das sequências destas regiões de estrutura podem ser apropriadamente usadas como a sequência de linhagem germinativa contida na molécula de ligação de antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser classificadas com base em sua analogia (Tomlinson et al., J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798; Williams e Winter, Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461; e Cox et al., Nat. Genetics (1994) 7, 162-168). Uma sequência de linhagem germinativa preferida pode ser apropriadamente selecionada a partir de VK classificado em 7 subgrupos, Vk classificado em 10 subgrupos e VH classificado em 7 subgrupos.
[00231] Exemplos preferidos de sequências de VH completamente derivadas de humano incluem, porém não limitadas às sequências de VH do subgrupo de VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, e VH1-69), o subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26, e VH2-70), o subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, e VH3-74), o subgrupo VH4 (VH4-4, VH4- 28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, e VH4-61), o subgrupo VH5 (VH5-51), o subgrupo VH6 (VH6-1), e o subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7- 81). Estas sequências são descritas da mesma forma em uma literatura pública (Matsuda et al., J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975), etc. Aqueles versados na técnica podem projetar apropriadamente a molécula de ligação de antígeno da presente invenção com base na informação de sequência. Qualquer outra região de estrutura completamente derivada de humano ou sub-região de estrutura pode ser preferivelmente usada.
[00232] Exemplos preferidos de sequências de VK completamente derivadas de humano incluem, porém não limitadas a, A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14, e O18 que pertencem ao subgrupo Vk1, A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1, e O11 que pertence ao subgrupo Vk2, A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, e L25 que pertencem ao subgrupo Vk3, B3 que pertence ao subgrupo Vk4, B2 que pertence ao subgrupo Vk5 (da mesma forma referido como Vk5-2 aqui), e A10, A14, e A26 que pertencem ao subgrupo VK6 (Kawasaki e outro, Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028; Schable e Zachau, Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022; e Brensing-Kuppers et al., Gene (1997) 191, 173-181).
[00233] Exemplos preferidos de sequências de VL completamente derivadas de humano incluem, porém não limitadas a, V1-2, V1-3, V14, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, e V1-22 que pertencem ao subgrupo VL1, V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2- 11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, e V2-19 que pertencem ao subgrupo VL2, V3-2, V3-3, e V3-4 que pertencem ao subgrupo VL3, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, e V4-6 que pertencem ao subgrupo VL4, e V5-1, V5-2, V54, e V5-6 que pertencem ao subgrupo VL5 (Kawasaki et al., Genoma Res. (1997) 7, 250-261).
[00234] Estas sequências de estrutura normalmente diferem-se mutuamente por um ou mais resíduo(s) de aminoácido. Estas sequências de estrutura podem ser usadas juntamente com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" da presente invenção. Os exemplos das regiões de estrutura completamente derivadas de humano usados juntamente com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" da presente invenção incluem, porém não limitados a, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, e POM (por exemplo, Kabat et al., (1991); e Wu et al., J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250).
[00235] Embora a presente invenção não seja ligada a qualquer teoria particular, espera-se que o uso da sequência de linhagem germinativa impeça a resposta imune adversa em quase todas as pessoas, provavelmente em parte por causa do seguinte: mutações somáticas frequentemente ocorrem em regiões variáveis de imunoglobulina como resultado de uma etapa de maturação de afinidade que ocorre durante a resposta imune normal. Estas mutações ocorrem principalmente em torno das CDRs que tem uma sequência hipervariável, porém, da mesma forma influenciam os resíduos em regiões de estrutura. Estas mutações nas regiões de estrutura estão ausentes em genes de linhagem germinativa e não são improváveis de serem imunogênicos a pacientes. Por outro lado, as populações humanas ordinárias são expostas a um número grande de sequências de estrutura expressa por genes de linhagem germinativa. Como um resultado da tolerância imunológica, estas regiões de estrutura de linhagem germinativa são presumidas ser de baixo teor imunogênico ou não imunogênico a pacientes. Para maximizar a possibilidade da tolerância imunológica, a sequência de linhagem germinativa pode ser selecionada a partir de grupos de gene de linhagem germinativa funcionais onde os genes de codificação de região variável estão geralmente presentes.
[00236] Uma molécula de ligação de antígeno que compreende "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" da presente invenção na sequência de estrutura pode ser preparada por um método apropriadamente adotado conhecido na técnica tal como mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) ou PCR de extensão de sobreposição.
[00237] Por exemplo, as regiões variáveis de cadeia leve selecionadas como sequências de estrutura preliminarmente compreendendo "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" podem ser combinadas com regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente. Quando a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de uma tal biblioteca preferivelmente incluem uma biblioteca que compreende em combinação uma sequência de região variável de cadeia leve descrita em SEQ ID N°: 1 (Vk5-2) e regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada. Como um exemplo preferido, a sequência de região variável de cadeia leve descrita em SEQ ID N°: 1 (Vk5-2) bem como variante 1 de Vk5-2 representada por SEQ ID N°: 2 ou variante 2 de Vk5-2 representada por SEQ ID N°: 3 descrita depois é apropriadamente usada como a sequência de região variável de cadeia leve que compreende um domínio de Vk5 presente em uma região variável de cadeia leve de anticorpo que tem uma sequência de linhagem germinativa tal como Vk5-2. O domínio de Vk5-2 que compreende "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" contidas nestas moléculas pode ser usado como um domínio que compreende o motivo de ligação de cálcio da presente invenção. Em um aspecto não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido que forma um motivo de ligação de cálcio pode ser usado como "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" da presente invenção.
[00238] Da mesma forma, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve selecionadas como de sequências de estrutura preliminarmente compreendendo" um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" pelo menos podem ser projetadas para compreender aminoácidos diversos como resíduos diferentes de o resíduo de aminoácido. Na presente invenção, tais resíduos são referidos como resíduos flexíveis. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon. Especificamente, a CDR de cadeia pesada e/ou de cadeia leve e/ou sequências de FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é, por exemplo, uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis apresentados à sequência de região variável de cadeia leve descrita em SEQ ID N°: 1 (Vk5-2) incluem resíduos de aminoácido descritos na Tabelas 13, 14, 17, e 18.
[00239] Alternativamente, regiões variáveis de cadeia leve em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" foi introduzido podem ser combinadas com regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente. Quando a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de uma tal biblioteca preferivelmente incluem uma biblioteca que compreende em combinação sequências de região variável de cadeia leve derivadas a partir de uma sequência de linhagem germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), SEQ ID N°: 9 (Vk4), ou similar pela substituição de um resíduo particular por "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" e regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia leve CDR2. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia leve CDR3.
[00240] Exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na CDR1 de cadeia leve como descrito acima incluem resíduos de aminoácido 30, 31, e/ou 32 definidos pela numeração de Kabat na região variável de CDR1 de cadeia leve. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia leve CDR2 incluem resíduo de aminoácido 50 definido pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve CDR2. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia leve CDR3 incluem o resíduo de aminoácido 92 definido pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve CDR3. Estes resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação de dois ou mais destes aminoácidos contanto que estes resíduos de aminoácido formem motivos de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon de cálcio. Por exemplo, a cadeia leve de troponina C, calmodulina, parvalbumina, e miosina, que tem vários sítios de ligação de íon de cálcio e é provavelmente derivada de uma origem comum em termos de evolução molecular, é conhecida. A CDR1 de cadeia leve, CDR2, e/ou CDR3 pode ser projetado para compreender quaisquer de seus motivos de ligação. Por exemplo, um domínio de caderina, um EF hand contida em calmodulina, um domínio de C2 contido em proteína cinase C, um domínio de Gla contido em um fator IX de proteína de coagulação sanguínea, uma lectina tipo C contida no receptor de asialoglicoproteína ou receptor de ligação de manose, um domínio A contido no receptor de LDL, uma anexina, um domínio tipo 3 de trombospondina, e um domínio tipo EGF podem ser usados apropriadamente para estes propósitos.
[00241] No caso de combinação das regiões variáveis de cadeia leve em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" foi introduzido com as regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para compreender os resíduos flexíveis, como no caso anterior. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon. Especificamente, as sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve CDR e/ou sequências de FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é, por exemplo, uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis apresentados às sequências de região variável de cadeia leve incluem resíduos de aminoácido descritos nas Tabelas 13, 14, 17, e 18.
[00242] Exemplos preferidos das regiões variáveis de cadeia pesada a ser combinadas com estes incluem uma biblioteca de região variável randomizada. A biblioteca de região variável randomizada é preparada por métodos apropriadamente combinados conhecidos na técnica. Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados dos linfócitos de animais imunizados com antígenos particulares, pacientes com doença infecciosa, humanos que têm um título de anticorpo aumentado no sangue como resultado da vacinação, pacientes com câncer, ou doenças autoimunes pode ser preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada.
[00243] Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética obtida pela substituição de sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V funcionais reformados por um conjunto de oligonucleotídeo sintético compreendendo sequências que codificam um conjunto de códon que tem um comprimento apropriado pode da mesma forma ser preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada. Neste caso, apenas sequências de CDR3 podem ser substituídas porque a diversidade é observada na sequência de gene de cadeia pesada CDR3. A diversidade de aminoácido produzido nas regiões variáveis das moléculas de ligação de antígeno é com base na diversidade dada aos resíduos de aminoácido nas posições expostas na superfície das moléculas de ligação de antígeno. As posições expostas na superfície referem-se às posições que são julgadas como sendo exibíveis na superfície e/ou sendo acessíveis a antígenos com base nas estruturas, conjunto de estrutura, e/ou estruturas modeladas das moléculas de ligação de antígeno, e ficam geralmente localizadas em CDRs dos mesmos. Preferivelmente, as posições expostas na superfície são determinadas usando um programa de computação tal como programa Insight II (Accelrys Inc.) e coordenadas de modelos tridimensionais das moléculas de ligação de antígeno. As posições expostas na superfície podem ser determinadas usando um algoritmo conhecido na técnica (por exemplo, Lee e Richards, J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400; e Connolly, J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558). As posições expostas na superfície podem ser determinadas usando o software adequado para modelagem de proteína e informações de estrutura tridimensionais obtidas de anticorpos. Os exemplos preferidos do software que pode ser usado para um tal propósito incluem o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates Inc.). Geralmente e preferivelmente, o "tamanho" de sondas usadas em cálculo é fixado em aproximadamente 1,4 angstroms ou inferiores em termos de raio, quando o algoritmo requer um usuário que introduza parâmetros de tamanho. O método para determinar as regiões expostas à superfície e áreas que usam o software de computador pessoal é descrito em Pacios, Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386, e J. Mol. Modelo. (1995) 1, 46-53.
[00244] Em um outro aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sem tratamento que consiste em sequências sem tratamento que são repertórios de sequência de anticorpo livres de distorções construídos a partir de genes de anticorpo derivados dos linfócitos de pessoas saudáveis pode da mesma forma ser particularmente preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada (Gejima et al., Human Antibodies (2002) 11, 121129; e Cardoso et al., Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344). A sequência de aminoácido que compreende uma sequência não tratada como descrito na presente invenção refere-se a uma sequência de aminoácido obtida a partir de uma tal biblioteca sem tratamento.
[00245] Em um aspecto da presente invenção, regiões variáveis de cadeia pesada selecionadas como sequências de estrutura preliminarmente compreendendo "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" podem ser combinadas com regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente. Quando a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de uma tal biblioteca preferivelmente incluem uma biblioteca que compreende em combinação, uma sequência de região variável de cadeia pesada descrita em SEQ ID N°: 10 (6RL#9H-IgG1) ou SEQ ID N°: 11 (6KC4- 1#85H-IgG1) e regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada. Alternativamente, a biblioteca pode ser preparada usando regiões variáveis de cadeia leve apropriadamente selecionadas que têm uma sequência de linhagem germinativa, em vez das regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada. Os exemplos preferidos dos mesmos incluem uma biblioteca que compreende em combinação, uma sequência de região variável de cadeia pesada descrita em SEQ ID N°: 10 (6RL#9H- IgG1) ou SEQ ID N°: 11 (6KC4-1#85H-IgG1) e regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa.
[00246] Da mesma forma, as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada selecionadas como de sequências de estrutura preliminarmente compreendendo "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" podem ser projetadas para compreender os resíduos flexíveis. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon. Especificamente, as sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve CDR e/ou sequências de FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é, por exemplo, uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis introduzidos à sequência de região variável de cadeia pesada descrita em SEQ ID N°: 10 (6RL#9H-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de cadeia pesada CDR1 e CDR2 bem como resíduos de aminoácido de cadeia pesada CDR3 com exceção das posições 95, 96, e/ou 100a. Alternativamente, exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis introduzidos à sequência de região variável de cadeia pesada descrita em SEQ ID N°: 11 (6KC4- 1#85H-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de cadeia pesada CDR1 e CDR2 bem como resíduos de aminoácido de cadeia pesada CDR3 com exceção das posições 95 e/ou 101.
[00247] Alternativamente, regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" foi introduzido podem ser combinadas com regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente. Quando a concentração de íon for uma concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de uma tal biblioteca preferivelmente incluem uma biblioteca que compreende em combinação, sequências de região variável de cadeia pesada derivadas a partir das regiões variáveis de cadeia pesada pela substituição de um resíduo particular por "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" e regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR1. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR2. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR3. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia pesada CDR3 incluem aminoácidos nas posições 95, 96, 100a, e/ou 101 definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada CDR3. Estes resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação de dois ou mais destes aminoácidos contanto que estes resíduos de aminoácido formem motivos de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno seja alterada dependendo das condições da concentração de íon de cálcio.
[00248] No caso de combinação das regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon" foi introduzido com as regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou as regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa, as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada podem ser projetadas para compreender os resíduos flexíveis, como no caso anterior. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon. Especificamente, as sequências de cadeia pesada CDR e/ou FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Da mesma forma, uma biblioteca de região variável randomizada pode ser usada preferivelmente como as sequências de aminoácido de região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2, e/ou CDR3 com exceção do "resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon". No caso de usar as sequências de linhagem germinativa como as regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes das mesmas podem incluir sequências de linhagem germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), e SEQ ID N°: 9 (Vk4).
[00249] Qualquer resíduo de aminoácido pode ser usado preferivelmente como o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio contanto que o resíduo de aminoácido forme um motivo de ligação de cálcio. Os exemplos específicos de um tal resíduo de aminoácido incluem aminoácidos tendo propriedades de doação de elétron. Os exemplos preferidos dos aminoácidos que têm tais propriedades de doação de elétron incluem serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico.
[00250] Em um aspecto da presente invenção, regiões variáveis de cadeia leve em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio" foi introduzido podem ser combinadas da mesma forma com regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente.
[00251] Exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia leve CDR2. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia leve CDR3.
[00252] Exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na CDR1 de cadeia leve como descrito acima incluem resíduos de aminoácido 24, 27, 28, 30, 31, 32, e/ou 34 definidos pela numeração de Kabat na região variável de CDR1 de cadeia leve. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia leve CDR2 incluem resíduos de aminoácido 50, 51, 52, 53, 54, 55, e/ou 56 definidos pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve CDR2. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia leve CDR3 incluem resíduos de aminoácido 89, 90, 91, 92, 93, 94, e/ou 95a definidos pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve CDR3. Estes resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação de dois ou mais destes aminoácidos contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno que compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido seja alterada dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio.
[00253] No caso de combinação das regiões variáveis de cadeia leve em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio" foi introduzido com as regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para compreender os resíduos flexíveis, como no caso anterior. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon. Especificamente, as sequências de cadeia pesada e/ou cadeia leve CDR e/ou sequências de FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Os exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis introduzidos às sequências de região variável de cadeia leve incluem resíduos de aminoácido descritos na Tabelas 4 e 5. Como um exemplo não limitante, uma sequência de linhagem germinativa de Vk1 (SEQ ID N°: 6), Vk2 (SEQ ID N°: 7), Vk3 (SEQ ID N°: 8), Vk4 (SEQ ID N°: 9), ou similar pode ser usada preferivelmente como as sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve com exceção do resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio ou dos resíduos flexíveis.
[00254] Exemplos preferidos das regiões variáveis de cadeia pesada a seres combinadas com estes incluem uma biblioteca de região variável randomizada. A biblioteca de região variável randomizada é preparada por métodos apropriadamente combinados conhecidos na técnica. Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados dos linfócitos de animais imunizados com antígenos particulares, pacientes com doença infecciosa, humanos que têm um título de anticorpo aumentado no sangue como resultado de vacinação, pacientes com câncer, ou doenças autoimunes pode ser preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada.
[00255] Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética obtida pela substituição de sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V funcionais reformados por um conjunto de oligonucleotídeo sintético compreendendo sequências que codificam um conjunto de códon que tem um comprimento apropriado pode da mesma forma ser preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada, como no caso anterior.
[00256] Em um outro aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sem tratamento que consiste em sequências sem tratamento que são repertórios de sequência de anticorpo livres de distorções construídos a partir de genes de anticorpo derivados dos linfócitos de pessoas saudáveis pode da mesma forma ser particularmente preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada (Gejima et al., Human Antibodies (2002) 11, 121129; e Cardoso et al., Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344).
[00257] Em um aspecto alternativo da presente invenção, regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio" foi introduzido pode ser combinado com regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa para preparar a biblioteca da presente invenção que compreende uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente. Os exemplos não limitantes de uma tal biblioteca incluem preferivelmente uma biblioteca que compreende em combinação, sequências de região variável de cadeia pesada derivadas a partir das regiões variáveis de cadeia pesada pela substituição de um resíduo particular por "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de hidrogênio" e regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR1. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR2. Outros exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido incluem resíduos de aminoácido contidos na cadeia pesada CDR3.
[00258] Exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia pesada CDR1 incluem resíduos de aminoácido 27, 31, 32, 33, e/ou 35 definidos pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada CDR1. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia pesada CDR2 incluem resíduos de aminoácido 50, 52, 53, 55, 57, 58, 59, 61, e/ou 62 definidos pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada CDR2. Os exemplos não limitantes do resíduo de aminoácido contido na cadeia pesada CDR3 incluem resíduos de aminoácido 95, 96, 97, 98, 99, 100a, 100b, 100d, 100f, 100h, 102, e/ou 107 definidos pela numeração de Kabat na região variável de cadeia pesada CDR3. Estes resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação de dois ou mais destes aminoácidos contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno que compreende o(s) resíduo(s) de aminoácido seja alterada dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio.
[00259] No caso de combinação das regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio" foi introduzido com as regiões variáveis de cadeia leve preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada ou as regiões variáveis de cadeia leve que têm uma sequência de linhagem germinativa, as sequências das regiões variáveis de cadeia pesada podem ser projetadas para compreender os resíduos flexíveis, como no caso anterior. O número e posições dos resíduos flexíveis não são limitados a qualquer aspecto particular contanto que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno da presente invenção seja alterada dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, as sequências de cadeia pesada CDR e/ou FR podem cada qual compreender um ou mais resíduos flexíveis. Da mesma forma, uma biblioteca de região variável randomizada pode ser usada preferivelmente como as sequências de aminoácido de região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2, e/ou CDR3 com exceção do "resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio". No caso de usar as sequências de linhagem germinativa como as regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes das mesmas podem incluir sequências de linhagem germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), e SEQ ID N°: 9 (Vk4).
[00260] Qualquer resíduo de aminoácido pode ser usado preferivelmente como o resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon de hidrogênio. Os exemplos específicos de um tal resíduo de aminoácido incluem aminoácidos que têm um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0. Os exemplos preferidos dos aminoácidos que têm tais propriedades de doação de elétron incluem aminoácidos naturais tais como histidina e ácido glutâmico bem como aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US20090035836), m-NO2-Tyr (pKa: 7.45), 3,5- Br2-Tyr (pKa: 7.21), e 3,5-I2-Tyr (pKa: 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Os exemplos particularmente preferidos do resíduo de aminoácido incluem aminoácidos que têm um pKa de cadeia lateral de 5,5 a 7,0. Os exemplos preferidos dos aminoácidos que têm tais propriedades de doação de elétron incluem histidina.
[00261] Aminoácidos em domínios de ligação de antígeno podem ser modificados por um método apropriadamente adotado conhecido na técnica tal como mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) ou PCR de extensão de sobreposição. Da mesma forma, os aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos não naturais por uso de uma pluralidade de métodos de modificação conhecidos na técnica (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de translação livre de célula contendo tRNA (Clover Direct (Protein Express, a R & D oriented company)) compreendendo um aminoácido não natural ligado com um tRNA supressor ambarino complementar ao códon de UAG (códon ambarino) que é um códon de interrupção, é da mesma forma preferivelmente usado.
[00262] Exemplos preferidos das regiões variáveis de cadeia leve a ser combinados com isto incluem uma biblioteca de região variável randomizada. A biblioteca de região variável randomizada é preparada por métodos apropriadamente combinados conhecidos na técnica. Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados dos linfócitos de animais imunizados com antígenos particulares, pacientes com doença infecciosa, humanos que têm um título de anticorpo aumentado no sangue como resultado de vacinação, os pacientes com câncer, ou doenças autoimunes podem ser preferivelmente usados como a biblioteca de região variável randomizada.
[00263] Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética obtida pela substituição de sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V funcionais reformados por um conjunto de oligonucleotídeo sintético compreendendo sequências que codificam um conjunto de códon que tem um comprimento apropriado pode da mesma forma ser preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada. Neste caso, apenas as sequências de CDR3 podem ser substituídas desse modo porque a diversidade é observada na sequência de gene de cadeia pesada CDR3. A diversidade de aminoácido produzida nas regiões variáveis das moléculas de ligação de antígeno é com base na diversidade dada aos resíduos de aminoácido nas posições expostas na superfície das moléculas de ligação de antígeno. As posições expostas na superfície referem-se às posições que são julgadas como sendo exibíveis na superfície e/ou sendo acessíveis a antígenos em base nas estruturas, conjunto de estrutura, e/ou estruturas modeladas das moléculas de ligação de antígeno, e ficam geralmente localizadas em CDRs dos mesmos. Preferivelmente, as posições expostas na superfície são determinadas usando um programa de computação tal como o programa Insight II (Accelrys Inc.) e coordenadas de modelos tridimensionais das moléculas de ligação de antígeno. As posições expostas sobre a superfície podem ser determinadas usando um algoritmo conhecido na técnica (por exemplo, Lee e Richards, J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400; e Connolly, J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548558). As posições expostas na superfície podem ser determinadas usando o software adequado para a modelagem de proteína e informações de estrutura tridimensionais obtidas a partir de anticorpos. Os exemplos preferidos do software que pode ser usado para um tal propósito incluem o software do módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates Inc.). Geralmente e preferivelmente, o "tamanho" de sondas usadas em cálculo é fixado a aproximadamente 1,4 angstroms ou inferiores em termos de raio, quando o algoritmo requer um usuário que introduza parâmetros de tamanho. O método para determinar as áreas e regiões expostas à superfície que usamo software de computador pessoal é descrito em Pacios, Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386, e J. Mol. Modelo. (1995) 1, 46-53.
[00264] Em um outro aspecto não limitante da presente invenção, uma biblioteca sem tratamento que consiste em sequências sem tratamento que são repertórios de sequência de anticorpo livres de distorções construídos a partir de genes de anticorpo derivados dos linfócitos de pessoas saudáveis pode da mesma forma ser particularmente preferivelmente usada como a biblioteca de região variável randomizada (Gejima et al., Human Antibodies (2002) 11, 121- 129;e Cardoso et al., Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344).
[00265] Qualquer aminoácido pode ser usado como aminoácidos diferentes do resíduo de aminoácido que alteram a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon contanto que a molécula de ligação de antígeno da presente invenção ligue-se aos antígenos. Como um exemplo preferido, uma técnica de biblioteca de exibição de fago de anticorpo conhecida na técnica (por exemplo, J. D. Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597) pode ser aplicada apropriadamente a esta. Especificamente, sequências de aminoácido com exceção do resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições da concentração de íon são adotadas pela biblioteca de fago de anticorpo.
[00266] O termo "que difere-se na sequência mutuamente" em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente como descrito na presente invenção significa que as moléculas de ligação de antígeno individuais na biblioteca têm sequências distintas. Especificamente, o número das sequências distintas na biblioteca reflete o número de clones independentes que diferem-se nas sequências na biblioteca e é da mesma forma referido como um "tamanho de biblioteca". O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago usual é 106 a 1012 e pode ser amplificado para 1014 pela aplicação de uma técnica conhecido na arte tal como um método de exibição de ribossoma. O número real de partículas de fago usadas na seleção de paniculação para a biblioteca de fago, entretanto, normalmente é 10 a 10.000 vezes maior que o tamanho de biblioteca. Este múltiplo excessivo, da mesma forma chamado de "número de equivalentes da biblioteca", representa que 10 a 10.000 clones individuais podem ter a mesma sequência de aminoácido. Consequentemente, o termo "que difere em sequência mutuamente" descrito na presente invenção significa que as moléculas de ligação de antígeno individuais na biblioteca que exclui o número de equivalentes da biblioteca têm sequências distintas e mais especificamente significam que a biblioteca tem 106 a 1014, preferivelmente 107 a 1012, mais preferivelmente 108 a 1011, particularmente preferivelmente 108 a 1010 moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na sequência mutuamente.
[00267] O termo "pluralidade de" na biblioteca que consiste essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno como normalmente descrito na presente invenção refere-se a um conjunto de dois ou mais tipos de substâncias de acordo com, por exemplo, a molécula de ligação de antígeno, polipeptídeo de fusão, molécula de polinucleotídeo, vetor, ou vírus da presente invenção. Por exemplo, se duas ou mais substâncias diferirem-se mutuamente na característica particular, as substâncias existem como dois ou mais tipos. Os exemplos dos mesmos podem incluir aminoácidos variantes observados em uma posição de aminoácido particular em uma sequência de aminoácido. Por exemplo, duas ou moléculas de ligação de antígeno da presente invenção que tem substancialmente as mesmas sequências, preferivelmente idênticas com exceção de resíduos flexíveis ou com exceção de aminoácidos variantes particulares nas posições de aminoácido expostas à superfície, altamente diversas são consideradas como uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno da presente invenção. Em outro exemplo, duas ou mais moléculas de polinucleotídeo da presente invenção que tem substancialmente as mesmas sequências, preferivelmente idênticas com exceção da codificação de bases que codificam resíduos flexíveis ou com exceção de bases que codificam aminoácidos variantes particulares nas posições de aminoácido expostas à superfície, altamente diversas são consideradas como uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.
[00268] O termo "consistindo essencialmente em" na biblioteca consistindo essencialmente em uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno como descrito na presente invenção reflete o número de moléculas de ligação de antígeno que diferem em atividade de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon, entre os clones independentes que diferem em sequência na biblioteca. Especificamente, a biblioteca preferivelmente tem pelo menos 104 moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação. Mais preferivelmente, a presente invenção fornece a biblioteca tendo pelo menos 105 moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação. Further preferivelmente, a presente invenção fornece a biblioteca tendo pelo menos 106 moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação. Particularmente preferivelmente, a presente invenção fornece a biblioteca tendo pelo menos 107 moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação. Também preferivelmente, a presente invenção fornece a biblioteca tendo pelo menos 108 moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação. Em outras palavras, o termo pode ser preferivelmente indicado pela relação das moléculas de ligação de antígeno que diferem em atividade de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon para o número dos clones independentes que diferem em sequência na biblioteca. Especificamente, a presente invenção fornece a biblioteca que compreende moléculas de ligação de antígeno que exibem tal atividade de ligação em uma relação de 0,1% a 80%, preferivelmente 0,5% a 60%, mais preferivelmente 1% a 40%, também preferivelmente 2% a 20%, particularmente preferivelmente 4% a 10% para o número dos clones independentes que diferem em sequência na biblioteca. Polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo, ou vetores podem também ser indicados pelo número de moléculas ou a relação para todas as moléculas, como no caso acima. Além disso, viroses podem também ser indicadas pelo número de vírus individuais ou a relação para todos os indivíduos, como no caso acima.
[00269] Polipeptídeo de fusão compreendendo molécula de ligação de antígeno.
[00270] Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de fusão da molécula de ligação de antígeno da presente invenção e um polipeptídeo heterólogo pode ser preparado. Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode ser fundida com pelo menos uma porção de uma proteína de revestimento viral selecionada do grupo que consiste em, por exemplo, proteínas de revestimento viral pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, e pVI, e variantes das mesmas para formar um polipeptídeo de fusão.
[00271] Em uma modalidade, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode ser ScFv, um fragmento Fab, F(ab)2, or F(ab')2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma biblioteca consistindo essencialmente em uma pluralidade de moléculas de fusão que diferem em sequência uma da outra, as moléculas de fusão cada uma compreendendo qualquer destas moléculas de ligação de antígeno e um polipeptídeo heterólogo. Especificamente, a presente invenção fornece uma biblioteca consistindo essencialmente em uma pluralidade de moléculas de fusão que diferem em sequência uma da outra, as proteínas de fusão cada uma compreendendo qualquer destas moléculas de ligação de antígeno e pelo menos uma porção de uma proteína de revestimento viral selecionada do grupo que consiste em, por exemplo, proteínas de revestimento viral pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, e pVI, e variantes das mesmas. A molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode também compreender um domínio de dimerização. Em uma modalidade, o domínio de dimerização pode ser localizado entre a região variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo e pelo menos uma porção da proteína de revestimento viral. Este domínio de dimerização pode compreender pelo menos uma sequência de dimerização e/ou uma sequência compreendendo um ou mais resíduos de cisteína. Este domínio de dimerização pode ser preferivelmente ligado à terminação C da região variável de cadeia pesada ou região constante. O domínio de dimerização pode assumir várias estruturas, dependendo de se a região variável de anticorpo é preparada como um componente de proteína de fusão com o componente de proteína de revestimento viral (um códon de interrupção âmbar seguindo o domínio de dimerização está ausente) ou dependendo se a região variável de anticorpo é preparada predominantemente sem compreender o componente de proteína de revestimento viral (por exemplo, um códon de interrupção âmbar seguindo o domínio de dimerização está presente). Quando a região variável de anticorpo é preparada predominantemente como uma proteína de fusão com o componente de proteína de revestimento viral, exposição bivalente é realizada por uma ou mais ligações de dissulfeto e/ou uma única sequência de dimerização. A molécula de ligação de antígeno da presente invenção preferivelmente tem um domínio de dimerização compreendendo tanto um resíduo de cisteína quanto uma sequência de dimerização, quando sendo a região variável de anticorpo preparada predominantemente sem ser fundida com o componente de proteína de revestimento viral (por exemplo, um códon de interrupção âmbar está presente). Em uma modalidade, cadeias pesadas F(ab)2 são dimerizadas em um domínio de dimerização não compreendendo nenhuma região de articulação. Este domínio de dimerização pode compreender, por exemplo, uma sequência fecho ecler de leucina conhecida na técnica, tal como uma sequência de GCN4:
GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG (SEQ ID N°: 12). MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO CODIFICANDO POLINUCLEOTÍDEO
[00272] Um oligonucleotídeo ou brupo de iniciador para uso na preparação de um polinucleotídeo codificando cada molécula de ligação de antígeno pode ser sintetizado usando um método padrão. Por exemplo, um grupo de oligonucleotídeos compreendendo sequências que incluem toda a combinação possível de tripletos de nucleotídeo fornecida pelo códon estabelece e codifica um grupo de aminoácido desejado pode ser sintetizado pelo método de fase sólida. Desse modo, um grupo de oligonucleotídeo sintético tendo um grupo de códon particular geralmente compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos diferindo em sequência. Esta diferença é atribuída ao grupo de códon em na sequência completa. A síntese de oligonucleotídeos tendo nucleotídeos "degenerados" selecionados em certas posições é conhecida naquela técnica. Tal grupo de nucleotídeos tendo tal certo tipo de grupo de códon pode ser sintetizado usando sintetizador de ácido nucleico comercialmente disponível (Applied Biosystems, Inc.) ou pode ser obtido como produtos comercialmente disponíveis (por exemplo, Life Technologies). Como usado na presente invenção, os oligonucleotídeos têm uma sequência que permite a hibridização para um padrão de ácido nucleico de domínio variável e pode também compreender sítios de enzimas de restrição úteis em clonagem.
[00273] A biblioteca pode ser formada pelo uso de grupos de oligonucleotídeo a montante e a jusante. Cada grupo de oligonucleotídeo tem uma pluralidade de oligonucleotídeos tendo diferentes sequências estabelecidas pelo grupo de códon fornecido dentro da sequência de oligonucleotídeo. Os grupos de oligonucleotídeo a montante e a jusante podem ser usados, juntamente com sequências de ácido nucleico padrão de domínio variável, para preparar uma "biblioteca" de produtos PCR. Os produtos de PCR podem ser fundidos com outras sequências de ácido nucleico relacionados ou não relacionados, por exemplo, sequências de ácido nucleico codificando constituintes de proteína de revestimento viral e domínios de dimerização, usando um método biológico molecular estabelecido. Tal grupo de oligonucleotídeo pode, portanto, ser referido como um "cassete de ácido nucleico".
[00274] A sequência de cada iniciador de PCR compreende um ou mais grupos de códon designados para resíduos flexíveis altamente diversos expostos sobre a superfície da molécula de ligação de antígeno. Como descrito acima, cada grupo de códon é um grupo de diferentes sequências triplo de nucleotídeo que são usadas para codificar aminoácidos de variante desejados. Além disso, o grupo de oligonucleotídeo tem uma sequência de comprimento suficiente para ser hibridizado para um ácido nucleico padrão e pode opcionalmente ter sítios de restrição. Os padrões de DNA são formados por vetores derivados de vetores M13 de bacteriofago ou vetores contendo uma origem de replicação de um fago de filamento único descrito por Viera et al. (Meth. Enzymol. (1987) 153, 3). Desse modo, o DNA a ser mutado é inserido em um destes vetores a fim de formar um padrão de filamento único. A produção do padrão de filamento único é descrita no livro didático de Sambrook et al.
[00275] Métodos para introduzir aminoácidos selecionados em moléculas de ligação de antígeno como descrito em uma modalidade não limitante da presente invenção já foram estabelecidos na técnica. Alguns destes métodos são descritos aqui. Por exemplo, "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" ou resíduos flexíveis altamente diversos podem ser expostos sobre a superfície de pelo menos uma molécula de ligação a antígeno e/ou introduzidos nela usando um método Kunkel fornecido por Kunkel et al. (Methods Enzymol. (1987) 154, 367-382) para preparar uma biblioteca. Tal método pode ser apropriadamente adotado no caso de preparação, por exemplo, da biblioteca da presente invenção, compreendendo uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem em sequência uma da outra pela combinação de regiões variáveis de cadeia leve nas quais "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" da presente invenção foi introduzido com regiões variáveis de cadeia pesada, preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada. Quando o íon de metal é um íon de cálcio, exemplos não limitantes de tal caso incluem a preparação de sequências de região variável de cadeia leve derivadas de uma sequência de linha germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), SEQ ID N°: 9 (Vk4), ou similares pela substituição de um resíduo particular por "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio". O método como descrito acima pode ser adotado para a preparação de tais regiões variáveis de cadeia leve.
[00276] Neste caso, grupos de oligonucleotídeo podem ser usados como iniciadores em reação de PCR usando sequências-padrão de ácido nucleico de região variável como padrões para preparar cassetes de ácido nucleico. Cada sequência-padrão de ácido nucleico de região variável usada é preferivelmente uma sequência que codifica qualquer sítio em uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina e compreende a sequência de ácido nucleico alvo (isto é, uma sequência de ácido nucleico codificando um aminoácido a ser substituído). Referindo-se ao exemplo acima, um ácido nucleico codificando uma região variável em uma sequência de linha germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), SEQ ID N°: 9 (Vk4), ou similares pode ser usado como a sequência padrão. A sequência padrão de ácido nucleico de região variável codifica pelo menos uma porção de uma região variável e codifica pelo menos uma CDR. Em alguns casos, a sequência padrão de ácido nucleico de região variável codifica uma pluralidade de CDRs. Os sítios a montante e a jusante da sequência padrão de ácido nucleico de região variável podem ser alvos a serem hibridizados por membros constituindo os grupos de oligonucleotídeo a montante e a jusante. Um primeiro oligonucleotídeo do grupo de iniciador a montante pode ser hibridizado para o primeiro filamento de ácido nucleico enquanto um segundo oligonucleotídeo do grupo de iniciador a jusante pode ser hibridizado para o segundo filamento de ácido nucleico. Os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser designados a fim de compreender um ou mais grupos de códon e ser hibridizado para uma porção da sequência padrão de ácido nucleico de região variável. Uso destes oligonucleotídeos em PCR pode introduzir dois ou mais grupos de códon no produto de PCR (isto é, o cassete de ácido nucleico). Os iniciadores de oligonucleotídeo que são hibridizados para regiões na sequência de ácido nucleico codificando região variável de anticorpo podem incluir sítios codificando resíduos de CDR a serem substituídos por outros aminoácidos.
[00277] Como descrito aqui, o PCR de extensão de sobreposição pode também ser apropriadamente adotado como um membro para introduzir aminoácidos selecionados em moléculas de ligação de antígeno como descrito em uma modalidade não limitante da presente invenção (WO1993003151). "Pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon", ou resíduos flexíveis altamente diversos podem ser expostos sobre a superfície de pelo menos uma molécula de ligação de antígeno e/ou introduzido nela para preparar uma biblioteca. Grupos de oligonucleotídeo a montante e a jusante usados em PCR de extensão de sobreposição podem compreender uma sequência de estrutura de comprimento suficiente para ser hibridizado para uma sequência padrão de ácido nucleico de região variável, juntamente com uma sequência codificando "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" ou resíduos flexíveis altamente diversos.
[00278] Por exemplo, grupos de oligonucleotídeo codificando grupos de códon para "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" e resíduos flexíveis adicionais são preparados a fim de preparar moléculas de polinucleotídeo cada qual codificando regiões variáveis de cadeia leve nas quais o resíduo de aminoácido foi introduzido, como descrito em uma modalidade não limitante da presente invenção. Uma sequência estrutura sequence de comprimento suficiente para ser hibridizado para uma sequência padrão de ácido nucleico de região variável é ligada a montante ou a jusante em estrutura com os grupos de oligonucleotídeo.
[00279] No caso de introduzir o resíduo de aminoácido ou os resíduos flexíveis adicionais em, por exemplo, região variável de cadeia leve CDR2 e CDR3, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente codificando a sequência de aminoácido de FR2 adjacente a CDR2 é ligado às extremidades 5' de um grupo de oligonucleotídeo, enquanto um oligonucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de FR3 adjacente a CDR2 é ligado às extremidades 3' do mesmo para preparar iniciadores. Além disso, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente codificando a sequência de aminoácido de FR4 adjacente a CDR3 é ligado às extremidades 5' de um grupo de oligonucleotídeo complementar ao grupo acima mencionado de oligonucleotídeo, enquanto um oligonucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de FR3 adjacente a CDR3 é ligado às extremidades 3' do mesmo para preparar iniciadores complementares. Quando o oligonucleotídeo codificando aminoácido de FR3 nos iniciadores e o oligonucleotídeo codificando o aminoácido de FR3 nos iniciadores complementares compreendem sequências de sobreposição de comprimento suficiente a serem hibridizáveis uma da outra, regiões variáveis de cadeia leve compreendendo o resíduo de aminoácido ou os resíduos flexíveis adicionais introduzidos em CDR2 e CDR3 podem ser preparadas por meio de reação de PCR sob condições que não envolvam nenhuma sequência padrão. Quando estes oligonucleotídeos não compreendem nenhuma das tais sequências de sobreposição, regiões variáveis de cadeia leve compreendendo o resíduo de aminoácido ou os resíduos flexíveis adicionais introduzidos em CDR2 e CDR3 podem ser similarmente preparadas através de reação de PCR usando, por exemplo, um ácido nucleico de região variável de uma sequência de linha germinativa de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), SEQ ID N°: 9 (Vk4), ou similares como uma sequência padrão.
[00280] No caso de preparar, por exemplo, uma biblioteca compreendendo regiões variáveis de cadeia leve tendo CDR3 com o resíduo de aminoácido ou os resíduos flexíveis adicionais introduzidos nelas e CDR1 e CDR2 randomizadas, um oligonucleotídeo de comprimento suficiente codificando a sequência de aminoácido de FR4 adjacente a CDR3 é ligado às extremidades 5' de um grupo de oligonucleotídeo complementar ao grupo de oligonucleotídeo, enquanto um oligonucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de FR3 adjacente a CDR3 é ligado às extremidades 3' do mesmo para preparar iniciadores. Uma biblioteca de polinucleotídeos codificando regiões variáveis de cadeia leve tendo CDR3 com o resíduo de aminoácido ou os resíduos flexíveis adicionais introduzidos nelas e CDR1 e CDR2 randomizadas podem ser similarmente preparadas por PCR usando os iniciadores preparados, iniciadores tendo uma sequência de nucleotídeo codificando FR1, e uma biblioteca compreendendo região variável randomizada (por exemplo, sequência não submetida a tratamento) ácidos nucleicos como sequências padrões. Estes métodos para preparar uma biblioteca de polinucleotídeo de cadeias leves nas quais "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" e/ou resíduos flexíveis foram introduzidos são também apropriadamente adotados a fim de preparar uma biblioteca de polinucleotídeo de cadeias pesadas nas quais o resíduo de aminoácido e os resíduos flexíveis adicionais foram introduzidos.
[00281] Alternativamente, os grupos de oligonucleotídeo a montante e a jusante podem ser sintetizados de modo que cada sequência de oligonucleotídeo compreenda sítios de restrição. Estes sítios de restrição facilitam a inserção do cassete de ácido nucleico (isto é, o produto de reação de PCR) nos vetores de expressão tendo sequências de anticorpo adicionais. Preferivelmente, os sítios de restrição são designados a fim de facilitar a clonagem do cassete de ácido nucleico sem introduzir sequências estranhas de ácido nucleico, ou sem remover as sequências de ácido nucleico originais de regiões de CDRs ou de estrutura.
[00282] O cassete de ácido nucleico preparado pode ser clonado em um vetor apropriado para expressão de uma sequência de cadeia leve ou pesada parcial ou total constituindo a molécula de ligação de antígeno da presente invenção. De acordo com um método descrito em detalhes na presente invenção, o cassete de ácido nucleico é clonado em um vetor que permite produção de uma sequência de cadeia leve ou pesada parcial ou total fundido com toda ou uma porção de uma proteína de revestimento viral (isto é, formação de uma proteína de fusão). Tal vetor, como descrito posteriormente, pode ser um vetor de expressão designado de modo que partículas ou células mostrem a proteína de fusão sobre sua superfície. Para tal propósito, diversos tipos de vetores são obtidos e usados para realizar a presente invenção. Vetores fagomídeo são vetores preferivelmente usados aqui. Como geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, os vetores fagomídeo podem geralmente compreender vários constituintes incluindo sequências de controle (por exemplo, sequências promotoras e sinal), genes seletivos fenotípicos, sítios de origem de replicação, e outros constituintes necessários.
[00283] Em uma modalidade não limitante para expressão de aminoácidos variantes particulares em combinação, o cassete de ácido nucleico pode codificar uma região variável de cadeia pesada ou leve total ou parcial. Por exemplo, no caso de designação do cassete de ácido nucleico de modo que cadeia CDR3 pesada compreende "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" e/ou resíduos flexíveis como descrito em um aspecto não limitante da presente invenção, cassetes de ácido nucleico tendo a diversidade de sequência de cadeia CDR3 pesada podem ser preparados e em seguida ligados a cassetes de ácido nucleico codificando região variável randomizada tal como sequência não submetida a tratamentos. Como na biblioteca, os cassetes de ácido nucleico podem ser inseridos em vetores de expressão compreendendo sequências de anticorpo adicionais, por exemplo, regiões de cadeia variável ou constante leve e pesada total ou parcial, a fim de preparar moléculas de ligação de antígeno compreendendo estes aminoácidos variantes ou combinações de aminoácido variante. Estas sequências adicionais em uma molécula de ligação de antígeno podem ser fundidas com outras sequências de ácido nucleico, por exemplo, sequences codificando um constituinte de proteína de revestimento viral. Como resultado, proteínas de fusão podem ser produzidas.
VETOR
[00284] Um aspecto não limitante da presente invenção inclui um vetor de expressão replicável compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um gene de fusão, em que o gene de fusão codifica uma proteína de fusão compreendendo uma região variável da molécula de ligação de antígeno ou uma região variável da molécula de ligação de antígeno e uma região constante, fundidas com toda ou uma porção de uma proteína de revestimento viral. Um aspecto não limitante da presente invenção também inclui uma biblioteca de vetores de expressão replicáveis diversos cada qual compreendendo uma pluralidade de fusion genes cada qual codificando uma pluralidade de diferentes proteínas de fusão compreendendo as regiões variáveis com diversas sequências formadas como descrito acima na pluralidade de moléculas de ligação de antígeno que diferem em sequência uma da outra. Os vetores podem compreender vários constituintes e são preferivelmente construídos de modo que os genes de região variável das moléculas de ligação de antígeno possam ser transferidos entre diferentes vetores e/ou as proteínas de fusão possam ser apresentadas em diferentes formatos.
[00285] Exemplos preferidos dos vetores incluem vetores fago. Os vetores fago têm uma origem de replicação de fago que permite a replicação de fago e formação de partícula de fago. Exemplos preferidos do fago podem incluir bacteriofagos filamentosos incluindo fagos M13, f1, fd, e Pf3 e derivados dos mesmos, e fagos lambdoides incluindo lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, e outros fagos e derivados dos mesmos.
[00286] Exemplos da proteína de revestimento viral incluem proteína infecciosa PIII, proteína de revestimento maior PVIII, pVII, pIX, Soc (T4), Hoc (T4), gpD (bacteriofago X), e proteína de revestimento de bacteriofago menor 6 (pVI) (fago filamentoso (J. Immunol. Methods. (1999) 231 (1-2), 39-51); e variante de proteína de revestimento maior de bacteriofago M13 (P8) (Protein Sci. (2000) 9 (4), 647-654)). A proteína de fusão é mostrada sobre a superfície do fago. Sistemas de fago apropriados incluem fago auxiliar M13KO7, M13R408, M13-VCS, e Phi X 174, sistema de fago pJuFo (J. Virol. (2001) 75 (15), 7107-7113), hiper fago (Nat. Biotechnol. (2001) 19 (1), 75-78), e KM13 (Fold Des. (1998) 3 (5), 321-328). Um fago auxiliar preferido é M13KO7. Uma proteína de revestimento preferida é proteína de revestimento III de gene de fago M13. Um hospedeiro preferido é E. coli, e uma linhagem deficiente de protease de E. coli. Por exemplo, vetores tais como vetores fth1 (Nucleic Acids Res. (2001) 29 (10) e50) podem ser úteis na expressão da proteína de fusão.
[00287] O vetor de expressão pode também compreender uma sequência sinal secretória fundida com um DNA codificando a região variável de cadeia pesada ou leve da molécula de ligação de antígeno ou um fragmento da mesma. Esta sequência é tipicamente localizada no flanco 5' do gene codificando a proteína de fusão e desse modo transcrita na terminação amino da proteína de fusão. Em alguns casos, entretanto, a sequência sinal foi demonstrada estar localizada em uma posição que não o flanco 5' do gene codificando a proteína a ser secretada. Esta sequência alveja a proteína à qual a sequência está ligada através da membrana interna de uma célula bacteriana. O DNA codificando a sequência sinal é obtido como um fragmento de endonuclease de restrição de qualquer gene codificando uma proteína tendo a sequência sinal. Por exemplo, a gene codificando LamB ou OmpF (Wong et al., Gene (1983), 68 (2), 193-203), MalE, ou PhoA e outros genes pode ser usado como sequências sinal procarióticas apropriadas. Uma sequência sinal procariótica preferida para realizar a presente invenção é sequência sinal de enterotoxina II (STII) estável ao calor de E. coli descrita por Chang et al. (Gene (1987) 55 (2-3), 189-196), pelB, ou malE.
[00288] O vetor geralmente compreende um promotor como uma sequência de controle que promove a expressão da proteína de fusão. Promotores geralmente usados em vetores procarióticos incluem um sistema promotor de lacZ, um promotor phoA de fosfatase alcalina (Ap), um promotor XPL de bacteriofago (promotor sensível à temperatura), um promotor tac (promotor trp-lac híbrido que é regulado por repressor lac), um promotor de triptofano, um promotor pBAD, e um promotor T7 de bacteriofago. Os promotores são revistos no livro didático de Sambrook et al. (supra). Embora estes promotores sejam mais comumente usados, outros promotores microbianos apropriados podem ser similarmente usados.
[00289] O vetor pode também compreender outras sequências de ácido nucleico, por exemplo, sequências codificando rótulos gD, epítopos de c-Myc, rótulos de polihistidina, proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), ou proteína de β-galactosidase útil na detecção ou purificação da proteína de fusão expresso no fago ou superfície celular. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico codificando rótulo gD também possibilita seleção positiva ou negativa de células ou viroses expressando a proteína fusão. Em algumas modalidades, o rótulo gD é preferivelmente fundido com uma molécula de ligação de antígeno região variável não fundida com o constituinte de proteína de revestimento viral. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico codificando rótulo de polihistidina é útil para identificar uma proteína de fusão compreendendo uma molécula de ligação de antígeno região variável que se liga a um antígeno específico usando um método imunoistoquímico. Tal rótulo útil na detecção de ligação a antígeno pode ser fundido com uma molécula de ligação de antígeno região variável não fundida com o constituinte de proteína de revestimento viral ou uma molécula de ligação de antígeno região variável fundida com o constituinte de proteína de revestimento viral.
[00290] Exemplos preferidos de outros constituintes úteis no vetor usado para realizar a presente invenção incluem genes seletivos fenotípicos. um gene seletivo fenotípico típico é um gene codificando uma proteína que confere resistência antibiótica às células hospedeiras. Como tal exemplo, um gene de resistência de ampicilina (ampr) e um gene de resistência de tetraciclina (tetr) podem ser preferivelmente usados.
[00291] O vetor pode também compreender uma sequência de ácido nucleico contendo sítios de restrição únicos e um códon de interrupção supressível. Os sítios de restrição únicos são úteis para transferir o gene de região variável da molécula de ligação de antígeno entre diferentes vetores e sistemas de expressão e particularmente úteis para produzir a molécula de ligação de antígeno de tamanho natural ou fragmento de ligação a antígeno por cultura celular. O códon de interrupção supressível é útil para regular O nível de expressão da proteína de fusão e facilitar a purificação de um fragmento solúvel da molécula de ligação de antígeno. Por exemplo, um códon de interrupção âmbar pode ser transladado em Gln em um hospedeiro de supE capaz de exibição de fago, ao passo que o códon é interpretado em um hospedeiro não-supE como um códon de interrupção para produzir um fragmento solúvel da molécula de ligação de antígeno não fundida com a proteína de revestimento de fago. Estas sequências sintéticas podem ser fundidas com genes codificando uma ou mais regiões variáveis da molécula de ligação de antígeno no vetor.
[00292] Um vetor pode ser preferivelmente usado, que permite o ácido nucleico codificando a sequência da molécula de ligação de antígeno de interesse ser facilmente recuperado do vetor e colocado em outro vetor. por exemplo, sítios de restrição apropriados podem ser incorporados no vetor a fim de facilitar a recuperação da sequência de ácido nucleico codificando a molécula de ligação de antígeno da presente invenção ou sua região variável. As sequências de restrição são geralmente selecionadas como as únicas no vetor a fim de facilitar eficiente excisão e ligação em vetores frescos. A molécula de ligação de antígeno ou sua região variável pode então ser expressa a partir dos vetores como uma molécula tendo uma estrutura livre das sequências estranhas fundidas, por exemplo, a proteína de revestimento viral ou outros rótulos de sequência.
[00293] Um DNA que codifica um códon de terminação ou interrupção pode ser inserido entre o ácido nucleico que codifica a região variável ou região constante da molécula de ligação de antígeno (gene 1) e o ácido nucleico que codifica o constituinte da proteína do envoltório viral (gene 2). Um tal um códon de terminação inclui UAG (ambarino), UAA (ocre), e UGA (opel) (Davis et al., Microbiology (1980), p. 237, 245-247, e 374, Harper & Row, New York). O códon de terminação ou interrupção expressos em células hospedeiras tipo selvagem resultam na síntese do produto de proteína de gene 1 não ligado com a proteína de gene 2. A proteína de fusão, entretanto, é sintetizada em uma quantidade detectável por crescimento em células hospedeiras supressoras. Tais células hospedeiras supressoras são conhecidas na técnica e descritas como cepas de gene supressor de E. coli (Bullock et al., BioTechniques (1987) 5, 376-379), etc. Um tal códon de terminação pode ser inserido em um mRNA que codifica o polipeptídeo de fusão.
[00294] O códon supressível pode ser inserido entre o primeiro gene que codifica a região variável ou constante da molécula de ligação de antígeno e um segundo gene que codifica pelo menos uma porção de uma proteína do envoltório de fago. Alternativamente, o códon de terminação supressível pode ser inserido adjacente ao sítio de fusão pela substituição de um tripleto para o último aminoácido na região variável da molécula de ligação de antígeno ou um tripleto para o primeiro aminoácido na proteína do envoltório de fago. O códon de terminação supressível pode ser inserido em ou seguindo uma posição que corresponde ao terminal C de um domínio de dimerização. A replicação de um plasmídeo que contém o códon supressível nas células hospedeiras supressoras produz o polipeptídeo de fusão que compreende o polipeptídeo e a proteína do envoltório em uma quantidade detectável. A replicação do plasmídeo em células hospedeiras não supressor termina a translação no tripleto supressível inserido UAG, UAA, ou UGA e, portanto, resulta na síntese da região variável da molécula de ligação de antígeno substancialmente sem ser fundida com a proteína do envoltório de fago. Consequentemente, a região variável da molécula de ligação de antígeno expressa em células não supressoras é segregada a partir das células hospedeiras depois da síntese, devido à ausência da proteína do envoltório de fago fundida a ser ancorada à membrana hospedeira.
[00295] As regiões constantes ou variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno podem também ser fundidas com uma sequência de peptídeo que permite a interação de um ou mais polipeptídeos de fusão na partícula viral ou superfície celular. Esta sequência de peptídeo é referida como um "domínio de dimerização" aqui. O domínio de dimerização pode compreender pelo menos uma ou mais sequências de dimerização ou pelo menos uma sequência que compreende um resíduo de cisteína, ou ambas. Sequências de dimerização apropriadas incluem aquelas de proteínas que a-hélices anfipáticas que contêm resíduos hidrofóbicos regularmente espaçados e permitem a formação de dímero de pela interação dos resíduos hidrofóbicos de cada proteína. Tais proteínas e porções das proteínas compreendem, por exemplo, regiões de zíper de leucina. O domínio de dimerização pode da mesma forma compreender um ou mais resíduo(s) de cisteína (por exemplo, fornecidos por uma sequência de articulação de anticorpo contida no domínio de dimerização). Os resíduos de cisteína fornecem dimerização pela formação de uma ou mais ligações de dissulfeto. Em uma modalidade em que um códon de interrupção fica localizado a jusante de uma sequência que codifica o domínio de dimerização, o domínio de dimerização compreende pelo menos um resíduo de cisteína. O domínio de dimerização fica preferivelmente localizado entre a variável de anticorpo ou domínio constante e o constituinte da proteína do envoltório viral.
[00296] Em alguns casos, o vetor codifica, por exemplo, um polipeptídeo de fago de uma única molécula de ligação de antígeno em uma forma de cadeia simples que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve fundidas com uma proteína do envoltório. Nestes casos, o vetor é considerado "monocistrônico" de forma que uma cópia seja expressa sob o controle de um certo promotor. Os exemplos de um tal vetor incluem vetores que empregam fosfatase alcalina (AP) ou promotor Tac para promover a expressão de uma sequência monocistrônica que codifica a região variável de cadeia leve (domínio VL) e a região variável de cadeia pesada (domínio de VH) entre a qual um peptídeo ligador está localizado. Uma tal sequência cistrônica é ligada em sua extremidade 5' a uma sequência de sinal de enterotoxina II estável ao calor ou malE de E. coli e em sua extremidade 3' em toda ou em uma porção de uma proteína do envoltório viral (por exemplo, proteína pIII). Em algumas modalidades, o vetor pode também compreender uma sequência que codifica um domínio de dimerização (por exemplo, um zíper de leucina), como mostrado em SEQ ID N°: 12, em sua extremidade 3' entre a segunda sequência de região variável e a sequência de proteína do envoltório viral.
[00297] Em outros casos, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve podem ser expressas como polipeptídeos separados. Um tal vetor é "bicistrônico" e permite a expressão de transcrições separadas. Neste vetor, um promotor apropriado, por exemplo, promotor tac ou PhoA, pode ser usado para promover a expressão de um mRNA bicistrônico. Por exemplo, o primeiro cístron que codifica, por exemplo, regiões constantes e variáveis de cadeia leve são ligadas em sua extremidade 5' a uma sequência de sinal de enterotoxina II (STII) de E. coli malE, pelB ou estável ao calor e em sua extremidade 3' em uma sequência de ácido nucleico de codificação de rótulo de gD. O segundo cístron que codifica, por exemplo, uma região variável e região constante de cadeia pesada CH1, é ligado em sua extremidade 5' a uma sequência de sinal de enterotoxina II estável ao calor ou malE de E. coli e em sua extremidade 3' em toda ou em uma porção de uma proteína do envoltório viral.
[00298] Em um vetor que gera um mRNA bicistrônico e permite a exibição de F(ab')2-pIII, um promotor apropriado, por exemplo, promotor tac ou PhoA (AP), promove a expressão do primeiro cístron que codifica as regiões constantes e variáveis de cadeia leve e é operavelmente ligado em sua extremidade 5' a uma sequência de sinal de enterotoxina II estável ao calor ou malE de E. coli e em sua extremidade 3' em uma sequência de ácido nucleico de codificação de rótulo de gD. Por exemplo, o segundo cístron codificas regiões variáveis e constantes de cadeia pesada e é operavelmente ligado em sua extremidade 5' em uma sequência de sinal de enterotoxina II estável ao calor ou malE de E. coli e em sua extremidade 3' a uma sequência que codifica um domínio de dimerização que compreende uma sequência de articulação de IgG e uma sequência de zíper de leucina seguido por pelo menos uma porção de uma proteína do envoltório viral.
EXIBIÇÃO DE POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO
[00299] O polipeptídeo de fusão da região variável da molécula de ligação de antígeno pode ser exibido em várias formas em célula, vírus, ou superfície de partícula de fagomídeo. Estas formas incluem fragmentos Fv de cadeia simples (scFv), fragmentos F(ab), e formas multivalentes destes fragmentos. As formas multivalentes são preferivelmente um dímero de ScFv, Fab, ou F(ab), que são referidos como (ScFv)2, F(ab)2, e F(ab')2, respectivamente, aqui. A exibição das formas multivalentes é preferida, provavelmente em parte porque as formas multivalentes exibidas normalmente permitem a identificação de clones de baixa afinidade e/ou têm uma pluralidade de sítios de ligação de antígeno que permitem a seleção mais eficiente de clones raros no curso da seleção.
[00300] Métodos para exibir polipeptídeos de fusão que compreendem fragmentos de anticorpo na superfície de bacteriófagos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, WO1992001047 e a presente especificação. Outros métodos relacionados são descritos em WO1992020791, WO1993006213, WO1993011236, e 1993019172. Aqueles versados na técnica podem usar apropriadamente estes métodos. Outras literaturas públicas (H.R. Hoogenboom & G. Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388, WO1993006213, e WO1993011236) descrevem a identificação de anticorpos que usam repertórios de gene de região variável artificialmente rearranjados junto a vários antígenos exibidos na superfície de fagos.
[00301] No caso da construção de um vetor para exibição na forma de scFv, este vetor compreende sequências de ácido nucleico que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada da molécula de ligação de antígeno. Em geral, a sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno é fundida com uma sequência de ácido nucleico que codifica um constituinte da proteína do envoltório viral. A sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno é ligada ao ácido nucleico de região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno por uma sequência de ácido nucleico que codifica um ligador de peptídeo. O ligador de peptídeo geralmente contém aproximadamente 5 a 15 aminoácidos. Opcionalmente, uma codificação de sequência adicional, por exemplo, um rótulo útil na purificação ou detecção, pode ser fundido com a extremidade 3' da sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno ou a sequência de ácido nucleico que codificam a região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno, ou ambas.
[00302] No caso de construir um vetor para exibição na forma de F(ab), este vetor compreende sequências de ácido nucleico que codificam as regiões variáveis e constantes da molécula de ligação de antígeno. A sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve é fundida com a sequência de ácido nucleico que codifica a região constante de cadeia leve. A sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno é fundida com a sequência de ácido nucleico que codifica a região constante CH1 de cadeia pesada. Em geral, a sequência de ácido nucleico que codifica a as regiões variáveis e constantes de cadeia pesada é fundida com uma sequência de ácido nucleico que codifica toda ou uma porção de uma proteína do envoltório viral. As regiões variáveis e constantes de cadeia pesada são preferivelmente expressas como um produto de fusão com pelo menos uma porção da proteína do envoltório viral, enquanto as regiões constantes e variáveis de cadeia leve são separadamente expressadas a partir da proteína de fusão do envoltório viral de cadeia pesada. As cadeias pesadas e leves podem ser associadas entre si por uma ligação covalente ou uma ligação não covalente. Opcionalmente, uma codificando de sequência adicional, por exemplo, um rótulo de polipeptídeo útil na purificação ou detecção, pode ser fundido com a extremidade 3' da sequência de ácido nucleico que codifica a região constante de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno ou a sequência de ácido nucleico que codifica a região constante de cadeia pesada da molécula de ligação de antígeno, ou ambas.
TRANSFIRÊNCIA DE VETOR À CÉLULA HOSPEDEIRA
[00303] Os vetores desse modo construídos são transferidos às células hospedeiras para amplificação e/ou expressão. Os vetores podem ser transferidos às células hospedeiras por métodos de transformação conhecidos na técnica, incluindo eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio e similares. Quando os vetores são partículas infecciosas tal como vírus, os próprios vetores invadem as células hospedeiras. As proteínas de fusão são exibidas na superfície das partículas de fago pela transfecção de células hospedeiras com vetores de expressão replicáveis que têm as inserções dos polinucleotídeos de codificação de proteína de fusão e a produção das partículas de fago por um método conhecido na técnica.
[00304] Os vetores de expressão replicáveis podem ser transferidos às células hospedeiras por uso de vários métodos. Em uma modalidade não limitante, os vetores podem ser transferidos às células por eletroporação como descrito em WO2000106717. As células são cultivadas a 37°C, opcionalmente durante aproximadamente 6 a 48 horas (ou até que a OD em 600 nm alcance 0,6 a 0,8) em um meio de cultura padrão. Em seguida, o meio de cultura é centrifugado, e o sobrenadante de cultura é removido (por exemplo, por decantação). No estágio inicial de purificação, a pélete de célula é preferivelmente ressuspensa em uma solução de tamponamento (por exemplo, HEPES a 1,0 mM (pH 7,4)). Em seguida, a suspensão é centrifugada novamente para remover o sobrenadante. A pélete de célula obtida é ressuspensa em glicerina diluída, por exemplo, 5 a 20% em V/V. A suspensão é centrifugada novamente para remover o sobrenadante, desse modo obtendo uma pélete de célula. A pélete de célula obtida é ressuspensa em água ou glicerina diluída. Com base no valor de medida da concentração de célula obtida, a concentração de célula final é ajustada em uma concentração desejada que usa água ou glicerina diluída.
[00305] Exemplos de células receptoras preferidas incluem uma cepa de E. coli SS320 capaz de responder à eletroporação (Sidhu et al, Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363). A cepa de E. coli SS320 foi preparada pelo acoplamento de células MC1061 com células XL1- BLUE sob condições suficientes para transferir o epissoma de fertilidade (plasmídeo F') ou XL1-BLUE nas células MC1061. A cepa de E. coli SS320 foi depositada com ATCC (10801 University Boulevart, Manassas, Virginia) sob depósito N°. 98795. Qualquer epissoma F' que permite a replicação de fago nesta cepa pode ser usado na presente invenção. O epissoma apropriado pode ser obtido a partir de cepas depositadas com ATCC ou pode ser obtido como produtos comercialmente disponíveis (TG1, CJ236, CSH18, DHF, ER2738, JM101, JM103, JM105, JM107, JM109, JM110, KS1000, XL1-BLUE, 71-18, etc.).
[00306] Uso de concentrações de DNA mais altas (aproximadamente 10 vezes) em eletroporação melhora a frequência da transformação e aumenta a quantidade de DNAs que transformam as células hospedeiras. O uso de concentrações de célula altas também melhora a eficiência (aproximadamente 10 vezes). A quantidade aumentada de DNAs transferidos pode produzir uma biblioteca que tem maior diversidade e um número maior de clones independentes que diferem-se na sequência. As células transformadas são normalmente selecionadas com base na presença ou ausência de crescimento em um meio contendo antibiótico.
[00307] Método para selecionar a molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação é alterada dependendo das condições e método para isolamento do polinucleotídeo que codifica a molécula
[00308] Métodos para usar a exibição de fago para identificar as moléculas de ligação de antígeno que exibem atividade de ligação desejada junto a antígenos já foram estabelecidos na técnica, da mesma forma incluindo métodos variadamente modificado destes. Em um aspecto não limitante, as células hospedeiras apropriadas são transformadas com uma biblioteca de vetores replicáveis construídos para compreender os elementos reguladores transcriptionais operavelmente ligados a genes de fusão que codificam os polipeptídeos de fusão. As células transformadas são cultivadas para formar partículas de fago que exibem os polipeptídeos de fusão em sua superfície. Em seguida, a etapa de "selecionar moléculas de ligação" que requerem seleção e classificação contatando-se as partículas de fago recombinantes com antígenos alvos de forma que pelo menos uma porção das ligações de subpopulação de partícula aos antígenos seja realizada com a finalidade de aumentar as partículas ligadas ao antígeno na subpopulação com respeito às partículas não ligadas ao antígeno no curso da seleção. Para outro ciclo de análise sob as mesmas condições de reação ou diferentes, a subpopulação classificada é amplificada, por exemplo, pela infecção de células hospedeiras frescas tais como células XL1-Blue com a subpopulação. Em seguida, a etapa de contatar a subpopulação desse modo amplificada das moléculas de ligação de antígeno obtidas com antígenos sob concentrações de íon diferentes é realizada para analisar moléculas de ligação de antígeno que ligam-se aos antígenos sob a condição desejada. Esta etapa de contatar a subpopulação com antígenos sob concentrações de íon diferentes pode ser realizada como a etapa inicial do método de seleção. A combinação da etapa de "selecionar moléculas de ligação" e da etapa de selecionar moléculas de ligação cuja atividade de ligação é alterada sob condições da concentração de íon diferentes pode ser apropriadamente alterada. Da mesma forma, a etapa de seleção e classificação pode ser realizada tantas vezes quanto desejado. Estas moléculas de ligação de antígeno que ligam-se aos antígenos sob condições da concentração de íon diferentes são úteis como fármacos terapêuticos capazes de remover rapidamente os antígenos patogênicos de organismos quando administrados aos organismos.
[00309] Polipeptídeos de fusão de regiões variáveis ou porções das mesmas que compreendem o aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon e/ou resíduos flexíveis de acordo com a presente invenção são expressos na superfície de fagos, partículas de fagomídeo, ou células. Em seguida, os membros que constituem a subpopulação de polipeptídeo de fusão podem ser selecionados e/ou classificados quanto à capacidade de ligar-se a antígenos sob concentrações de íon diferentes. O método de seleção, escolha, e análise para os polipeptídeos de fusão também inclui um método de seleção, escolha, e análise em proteínas gerais que têm afinidade pelas regiões variáveis das moléculas de ligação de antígeno, tal como proteína L ou anticorpos rotulados capazes de ligarem-se às moléculas de ligação de antígeno ou seus fragmentos exibidos em fagos. Um tal método pode ser usado para enriquecer o tamanho da biblioteca ou o número de equivalentes de uma biblioteca que exibe fragmentos de moléculas de ligação de antígeno corretamente duplicadas (ou polipeptídeos de fusão que compreende as moléculas).
[00310] Duas estratégias principais podem ser usadas para a seleção, escolha e análise acima. A primeira estratégia é um método de suporte sólido, análise de placa, ou análise de antígeno imobilizado. A segunda estratégia é um método de ligação de solução.
[00311] No "método de suporte sólido", antígenos podem ser ligados a um sólido apropriado ou matriz semissólida conhecida na técnica, por exemplo, contas de agarose, contas de acrilamida, contas de vidro, celulose, vários copolímeros acrílicos, géis de metacrilato de hidroxialquila, copolímeros poliacrílicos e polimetacrílicos, náilon, e veículos neutros e iônicos. A ligação dos antígenos à matriz pode ser obtida por um método descrito em Methods in Enzymology (1976) 44 ou por outros meios conhecidos na técnica.
[00312] Depois da ligação de antígeno à matriz, os antígenos imobilizados são contatados com a biblioteca que expressa os polipeptídeos de fusão sob condições adequadas para a ligação de pelo menos um subconjunto de uma subpopulação de partículas de fago com os antígenos imobilizados. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares, são selecionadas para imitar as condições fisiológicas. Partículas ligadas ("aglutinantes") com os antígenos imobilizados são separadas a partir das partículas não ligadas com o alvo lavando-se com água. As condições de lavagem podem ser ajustadas para remover todos menos os aglutinantes de alta afinidade. Os aglutinantes podem ser dissociados a partir do alvo imobilizado por vários métodos. Estes métodos incluem, por exemplo, dissociação competitiva usando ligantes tipo selvagem (por exemplo, antígenos excessivos), mudança de pH e/ou força iônica, e métodos conhecidos na técnica. Em geral, os aglutinantes podem ser eluídos a partir da matriz de afinidade com um material de eluição apropriado tal como um ácido (por exemplo, HCl a 0,1 M) ou ligantes. A eluição em concentrações de ligante aumentadas pode eluir as moléculas de ligação exibidas com afinidade mais alta.
[00313] As células hospedeiras apropriadas podem ser infectadas com os aglutinantes isoladas, isto é, partículas virais (e, se necessário, fagos auxiliares, por exemplo, quando as partículas virais são partículas de fagomídeo) para reampliar os aglutinantes nas células. As células hospedeiras desse modo obtidas são cultivadas sob condições adequadas para a amplificação das partículas que exibem o polipeptídeo de fusão desejado. Em seguida, as partículas de fago são coletadas, e a etapa de seleção é repetida uma ou mais vezes até os aglutinantes dos antígenos serem enriquecidos para responder por uma proporção considerável. Seleção ou análise pode ser realizada tantas vezes quanto desejado. Um dentre os métodos de seleção ou análise pode envolver o isolamento de aglutinantes que ligam-se às proteínas de afinidade geral tal como a proteína L ou os anticorpos junto aos rótulos de polipeptídeo presentes nos polipeptídeos exibidos, por exemplo, anticorpos junto à proteína gD ou rótulos de polihistidina.
[00314] Em um aspecto da presente invenção, um método de análise de fase de solução chamado "método de ligação de solução" pode ser usado apropriadamente. O método de ligação de solução pode ser usado para encontrar aglutinantes melhorados a partir de uma biblioteca randomizada ou a partir de uma biblioteca apontada na melhoria da atividade de ligação de um clone de ligação desejado ou grupo de clone. Este método envolve contatar uma pluralidade de polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeos exibidos em partículas de fago ou fagomídeo (biblioteca), com antígenos rotulados ou fundidos com moléculas de rótulo. Biotina ou outros aglutinantes específicos podem ser usados como o rótulo. A severidade da fase de solução pode ser variada usando concentrações gradualmente diminuídas de antígenos rotulados ou fundidos na primeira fase de ligação de solução. Para também aumentar a severidade, a ligação aos primeiros antígenos rotulados com moléculas de rótulo ou fundidos com moléculas de rótulo marcadas na primeira fase de solução pode ser seguida apropriadamente por contato adicional com uma segunda fase de solução tendo uma concentração alta de antígenos não rotulados com moléculas de rótulo ou não fundidos com moléculas de rótulo marcadas. Neste caso, os antígenos sem rótulo com moléculas de rótulo ou não fundidos com moléculas de rótulo marcadas são normalmente usadas em uma quantidade de 100 a 1000 vezes a quantidade do alvo rotulado na segunda fase. O tempo de incubação da primeira fase de solução varia de alguns minutos a 1 a 2 horas ou por muito mais tempo até alcançar equilíbrio. Considerando que os aglutinantes que têm uma taxa associada rápida tendem a ter a propriedade de ligar-se em um curto tempo nesta primeira fase, as condições de contato para encurtar o tempo de ligação podem ser adotadas. O tempo de incubação e temperatura da segunda fase podem ser variados para aumentar a severidade. Tais variações nas condições de incubação produzem uma distorção da seleção para os aglutinantes que desprendem-se do alvo a uma taxa lenta (taxa de dissociação). Depois do contato da pluralidade de polipeptídeos exibidos nas partículas de fago ou fagomídeo com os antígenos, as partículas de fago ou fagomídeo ligadas com os antígenos marcados com moléculas de rótulo ou fundidos com moléculas de rótulo marcadas são separadas das partículas de fago ou fagomídeo não ligadas. As misturas de antígeno de partícula de fago ou fagomídeo são isoladas da fase de solução pelo contato das partículas de fago ou fagomídeo com os antígenos por um curto tempo (por exemplo, 2 a 5 minutos) que permite a ligação com os antígenos rotulados com moléculas de rótulo ou fundidos com moléculas de rótulo marcadas. A concentração inicial dos antígenos rotulados com moléculas de rótulo ou fundidos com faixas de moléculas de rótulo marcadas a partir de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 1000 nM. As partículas podem ser eluídas a partir das misturas, e em seguida podem desenvolver para o próximo ciclo de avaliação. Múltiplos ciclos de avaliação são preferivelmente repetidos usando uma concentração mais baixa dos antígenos rotulados com moléculas de rótulo ou fundidos com moléculas de rótulo marcadas dentro cada ciclo de análise. Como descrito depois nos Exemplos, por exemplo, contas magnéticas cobertas com estreptavidina podem ser usadas apropriadamente no método de ligação de solução usando biotina como a molécula de rótulo marcada.
[00315] O método de suporte sólido e o método de ligação de solução podem ser realizados apropriadamente sozinhos ou em combinação para isolar os aglutinantes que têm a característica desejada. Depois de dois, três, ou quatro ciclos repetitivos de seleção e análise para os antígenos, a subpopulação selecionada para identificar os aglutinantes específicos que têm a propriedade ou característica desejada é normalmente avaliada para clones individuais. Preferivelmente, o processo de análise pode ser realizando usando um sistema de automatização que permite a análise alta produtividade da biblioteca.
[00316] Depois da identificação dos aglutinantes com base na ligação de antígeno, ácidos nucleicos podem ser extraídos dos aglutinantes. Os DNAs são em seguida usados para diretamente transformar células hospedeiras de E. coli. Alternativamente, as sequências de codificação dos mesmos podem ser amplificadas, por exemplo, por PCR usando iniciadores apropriados, e em seguida sequenciadas por um método de sequenciamento típico. Em seguida, os DNAs de codificação de região variável dos aglutinantes podem ser inseridos em vetores digeridos com enzimas de restrição para expressão das moléculas de ligação de antígeno codificadas.
[00317] Para selecionar e avaliar as partículas de fago que expressam a molécula de ligação de antígeno da presente invenção cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições da concentração de íon, ou o polipeptídeo de fusão dos mesmos, uma subpopulação de partículas de fago, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada é classificada por condições variantes para contatar os antígenos imobilizados com uma biblioteca que compreende partículas de fago que expressam as moléculas de ligação de antígeno ou polipeptídeos de fusão.
[00318] Empregando-se um íon de cálcio como um exemplo preferido do íon de metal, exemplos das condições da concentração de íon de cálcio incluem uma condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e uma condição de concentração com alto teor de íon de cálcio. A frase "atividade de ligação é alterada dependendo das condições da concentração de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo da diferença entre a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio e a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio. Os exemplos deste caso incluem a atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio. Outro exemplo dos mesmos inclui a atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio.
[00319] No presente relatório, a concentração com alto teor de íon de cálcio não está particularmente limitada a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente uma concentração selecionada a partir da faixa de 100 μM a 10 mM. Em outro aspecto, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 200 μM a 5 mM. Em um aspecto diferente, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM. Em um aspecto alternativo, a concentração com alto teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 200 μM a 2 mM. Além disso, esta concentração pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 400 μM a 1,5 mM. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem concentrações selecionadas a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM que estão perto das concentrações de íon de cálcio in vivo no plasma (sangue).
[00320] No presente relatório, a concentração com baixo teor de íon de cálcio não está particularmente limitada a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,1 μM a 30 μM. Em outro aspecto, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,2 μM a 20 μM. Em um aspecto diferente, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 0,5 μM a 10 μM. Em um aspecto alternativo, a concentração com baixo teor de íon de cálcio pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 1 μM a 5 μM. Além disso, esta concentração pode da mesma forma ser uma concentração selecionada a partir da faixa de 2 μM a 4 μM. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem concentrações selecionadas a partir da faixa de 1 μM a 5 μM que estão perto de concentrações de cálcio ionizado in vivo no endossoma precoce.
[00321] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,1 μM a 30 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 100 μM a 10 mM. Esta frase preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,5 μM a 10 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 200 μM a 5 mM. A frase particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio in vivo no endossoma precoce é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio in vivo no plasma. Isto especificamente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 1 μM a 5 μM é mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM.
[00322] Para selecionar e avaliar, por exemplo, partículas de fago que expressam moléculas de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é mais alta sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio do que aquela sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio ou polipeptídeos de fusão dos mesmos, uma subpopulação de partículas de fago que ligam-se a antígenos imobilizados sob a condição de concentração com alto teor de cálcio é classificada primeiro. Em seguida, a subpopulação classificada (biblioteca que compreende partículas de fago que expressam moléculas de ligação de antígeno ou polipeptídeos de fusão) é contatada com antígenos imobilizados sob a condição de concentração com baixo teor de cálcio. Partículas de fago que não ligam-se aos antígenos imobilizados sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio são classificadas e separadas em um sobrenadante ou lavagens subsequentes. A condição da concentração com alto teor de cálcio e a condição da concentração com baixo teor de cálcio podem ser adotadas apropriadamente dentro das faixas descritas acima. Em um aspecto não limitante, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,1 μM a 30 μM e a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 100 μM a 10 mM. Em outro aspecto não limitante, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 0,5 μM a 10 μM e a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 200 μM a 5 mM. Em um aspecto não limitante alternativo, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio in vivo no endossoma precoce e a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio in vivo no plasma, especificamente, a diferença entre a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 1 μM a 5 μM e a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de íon de cálcio selecionada a partir da faixa de 500 μM a 2,5 mM.
[00323] Empregando-se uma concentração de íon de hidrogênio como um exemplo preferido da concentração de íon, exemplos das condições da concentração de íon de hidrogênio incluem uma condição de pH ácido e uma condição de pH neutro. A frase "atividade de ligação é alterada dependendo das condições de pH" significa que a atividade de ligação de antígeno de cada molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo da diferença entre o pH ácido e o pH neutro. Os exemplos deste caso incluem atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno em pH neutro do que aquela em pH ácido. Outro exemplo dos mesmos inclui a atividade de ligação de antígeno mais alta da molécula de ligação de antígeno ao pH ácido do que aquela em pH neutro.
[00324] No presente relatório, o pH neutro não está particularmente limitado a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 10,0. Em outro aspecto, o pH neutro pode ser selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 9,5. Em um aspecto diferente, o pH neutro pode ser selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 9,0. Em um aspecto alternativo, este pH pode ser selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 8,0. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem pH 7,4 que está perto do pH in vivo no plasma (sangue).
[00325] No presente relatório, o pH ácido não está particularmente limitado a um valor numérico univocal e pode ser preferivelmente selecionado a partir da faixa de pH 4,0 ao pH 6,5. Em outro aspecto, o pH ácido pode ser selecionado a partir da faixa de pH 4,5 ao pH 6,5. Em um aspecto diferente, o pH ácido pode ser selecionado a partir da faixa de pH 5,0 ao pH 6,5. Em um aspecto alternativo, este pH pode ser selecionado a partir da faixa de pH 5,5 ao pH 6,5. Os exemplos particularmente preferidos dos mesmos incluem pH 5,8 que está perto da concentração de cálcio ionizado in vivo no endossoma precoce.
[00326] Na presente invenção, a frase "atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é mais baixa sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido" significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,0 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 10,0. Esta frase preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,5 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 9,5. A frase mais preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,0 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 9,0. A frase também preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,5 ao pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 8,0. A frase particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação de antígeno em pH in vivo no endossoma precoce é mais fraca do que aquela em um pH in vivo no plasma. Isto especificamente significa que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que aquela em pH 7,4.
[00327] Se ou não a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH, pode ser determinada, por exemplo, de acordo com um método de ensaio de atividade de ligação sob condições de pH diferentes descritas acima. Por exemplo, a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é comparada entre a condição de pH ácido e a condição de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno é alterada a um nível mais alto sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido.
[00328] Para selecionar e avaliar, por exemplo, partículas de fago que expressam moléculas de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é mais alta sob a condição de pH neutro do que aquela sob a condição de pH ácido ou polipeptídeos de fusão dos mesmos, uma subpopulação de partículas de fago que ligam-se a antígenos imobilizados sob a condição de pH neutro é classificada primeiro. Em seguida, a subpopulação classificada (biblioteca que compreende partículas de fago que expressam moléculas de ligação de antígeno ou polipeptídeos de fusão) é contatada com antígenos imobilizados sob a condição de pH ácido. Partículas de fago que não ligam aos antígenos imobilizados sob a condição de pH ácido são classificadas e separadas em um sobrenadante ou lavagens subsequentes. A condição de pH neutro e a condição de pH ácido pode ser adotada apropriadamente dentro das faixas descritas acima. Em um aspecto não limitante, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,0 ao pH 6,5 e a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 10,0. Em outro aspecto não limitante, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 4,5 ao pH 6,5 e a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 6,7 ao pH 9,5. Em um aspecto não limitante alternativo, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,0 ao pH 6,5 e a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 9,0. Além disso, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 5,5 ao pH 6,5 e a atividade de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir da faixa de pH 7,0 ao pH 8,0. Em um outro aspecto alternativo não limitante, a subpopulação pode ser classificada com base na diferença entre a atividade de ligação de antígeno em pH in vivo, no endossoma precoce e a atividade de ligação de antígeno em pH in vivo no plasma, especificamente, a diferença entre a atividade de ligação de antígeno em pH 5,8 e a atividade de ligação de antígeno em pH 7,4.
MÉTODO PARA PRODUZIR MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO CUJA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO É ALTERADA DEPENDENDO DAS CONDIÇÕES
[00329] Em um aspecto não limitante da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno desse modo-selecionada, cuja atividade de ligação é alterada dependendo das condições é isolado, e em seguida inserido a um vetor de expressão apropriado. Especificamente, depois da obtenção de cada cDNA que codifica a região variável da molécula de ligação de antígeno de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição inseridos em ambas extremidades do cDNA. Preferivelmente, as enzimas de restrição reconhecem e digerem uma sequência de nucleotídeo que aparece em baixa frequência em sequências de nucleotídeo que constituem os genes de moléculas de ligação de antígeno. Também preferivelmente, as enzimas de restrição clivam os sítios inseridos nisto para produzir extremidades aderentes, para inserir uma cópia do fragmento digerido na direção correta em um vetor. Os cDNAs de codificação de região variável de molécula de ligação de anticorpo desse modo digeridos podem ser inseridos aos vetores de expressão apropriados para obter os vetores de expressão para a molécula de ligação de antígeno da presente invenção. Neste caso, os genes de codificação de região constante de anticorpo (região C) podem ser fundidos na estrutura com os genes de codificação de região variável.
[00330] Para produzir a molécula de ligação de antígeno desejada, o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno é incorporado em vetores de expressão em uma forma operavelmente ligada em sequências de controle. As sequências de controle abrangem, por exemplo, realçadores e promotores. Da mesma forma, uma sequência de sinal apropriada para secreção extracelular da molécula de ligação de antígeno expressa pode ser ligada ao terminal amino da mesma. Por exemplo, um peptídeo que tem uma sequência de aminoácido MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID N°: 13) pode ser usado como a sequência de sinal. Qualquer outra sequência de sinal adequada pode ser ligada a esta. O polipeptídeo expresso é clivado ao terminal carboxila da sequência de sinal, e o polipeptídeo clivado podem ser extracelularmente segregado como um polipeptídeo maduro. Células hospedeiras apropriadas podem ser transformadas com estes vetores de expressão para obter células recombinantes que expressam o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno desejada.
[00331] Para a expressão do polinucleotídeo de codificação de molécula de ligação de antígeno, o polinucleotídeo de codificação de cadeia pesada e o polinucleotídeo de codificação de cadeia leve da molécula de ligação de antígeno são separadamente incorporados em vetores de expressão diferentes. A mesma célula hospedeira pode ser cotransfectada com o vetor incorporado de cadeia pesada e o vetor incorporado de cadeia leve e assim permitida expressar moléculas de ligação de antígeno que compreendem as cadeias pesadas e leves. Alternativamente, os polinucleotídeos de codificação de cadeia pesada e cadeia leve podem ser incorporados em um único vetor de expressão, com o qual uma célula hospedeira pode em seguida ser transformada (veja WO1994011523).
[00332] Muitas combinações de células hospedeiras e de vetores de expressão são conhecidas na técnica para preparação da molécula de ligação de antígeno pela transferência do polinucleotídeo isolado que codifica a molécula de ligação de antígeno em hospedeiros apropriados. Todos estes sistemas de expressão podem ser aplicados ao isolamento da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. No caso de usar células eucarióticas como as células hospedeiras, células de animal, de planta, ou de fungo podem ser usadas apropriadamente. Especificamente, exemplos das células animais podem incluir as seguintes células:
[00333] células mamíferas tal como CHO (linhagem celular de ovário de hamster Chinês), COS (linhagem celular de rim de macaco), células de mieloma (Sp2/O, NS0, etc.), BHK (linhagem celular de rim de hamster bebê), HEK293 (linhagem celular de rim embrionária humana com adenovírus cisalhado (Ad)5 DNA), células PER.C6 (linhagem celular retinal embrionária humana transformada com os genes E1A e E1B de adenovirus tipo 5 (Ad5)), Hela, e Vero (Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)); células de anfíbio tal como oócitos de Xenopus; e células de inseto tais como sf9, sf21, e Tn5.
[00334] Alternativamente, sistemas de expressão de gene de anticorpo que usam células derivadas do gênero Nicotiana (por exemplo, Nicotiana tabacum) como as células de planta são conhecidos na técnica. Células de calo cultivadas podem ser usadas apropriadamente para a transformação de célula de planta.
[00335] As seguintes células podem ser usadas como as células de fungo: - células derivadas de leveduras do gênero Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) e o gênero Pichia (por exemplo, Pichia Pastoris), e - células derivadas de fungos filamentosos do gênero Aspergillus (por exemplo, Aspergillus niger).
[00336] Da mesma forma, sistemas de expressão para polinucleotídeos de codificação de molécula de ligação de antígeno usando células procarióticas são conhecidos na técnica. No caso de usar, por exemplo, células bacterianas, células de bactérias tais como E. coli e Bacillus subtilis podem ser usadas apropriadamente. Os vetores de expressão que compreendem o polinucleotídeo de codificação de molécula de ligação de antígeno de interesse são transferidos nestas células por transformação. As células transformadas são cultivadas in vitro, e a molécula de ligação de antígeno desejada pode ser obtida a partir das culturas resultantes das células transformadas.
[00337] Além das células hospedeiras, animais transgênicos podem ser usados para a produção de molécula de ligação de antígeno recombinante. Especificamente, a molécula de ligação de antígeno desejada pode ser obtida a partir de animais transfectados com o polinucleotídeo que codifica esta molécula de ligação de antígeno. Por exemplo, o polinucleotídeo de codificação de molécula de ligação de antígeno pode ser inserido na estrutura em genes que especificamente codificam proteínas produzidas no leite para construir os genes de fusão. Por exemplo, β caseína de cabra pode ser usada como as proteínas segregadas no leite. Fragmentos de DNA compreendendo os genes de fusão que têm a inserção de polinucleotídeo de codificação de molécula de ligação de antígeno são injetados em embriões de cabra, que são introduzidos por sua vez por cabras femininas. A partir do leite produzido por cabras transgênicas (ou progênie das mesmas) geradas pelas cabras que receberam os embriões, a molécula de ligação de antígeno desejada pode ser obtida como uma proteína de fusão com a proteína de leite. Além disso, o hormônio pode ser administrado às cabras transgênicas para aumentar a quantidade de leite que contém a molécula de ligação de antígeno desejada produzida das cabras transgênicas (Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
[00338] No caso de administrar a molécula de ligação de antígeno descrito aqui em humanos, um domínio de ligação de antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi criado artificialmente pode ser adotado apropriadamente como um domínio de ligação de antígeno para a molécula, por exemplo, com a finalidade de reduzir a heteroantigenicidade em humanos. O anticorpo geneticamente recombinante abrange, por exemplo, os anticorpos humanizados. Estas moléculas de ligação de antígeno criadas são apropriadamente produzidas usando um método conhecido na técnica.
[00339] Cada região variável de molécula de ligação de antígeno usada para preparar o domínio de ligação de antígeno na molécula de ligação de antígeno descrita aqui é tipicamente composta de três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FRs). As CDRs são regiões que substancialmente determinam a especificidade de ligação da molécula de ligação de antígeno. As CDRs têm sequências de aminoácido diversas. Por outro lado, as FRs são principalmente constituídas por sequências de aminoácido que são altamente idênticas mesmo entre as moléculas de ligação de antígeno que diferem-se na especificidade de ligação. Portanto, a especificidade de ligação de uma certa molécula de ligação de antígeno pode ser transplantada a outras moléculas de ligação de antígeno por enxerto de CDR.
[00340] Os anticorpos humanizados são da mesma forma chamados anticorpos humanos reformados. Especificamente, por exemplo, um anticorpo humanizado que consiste em um anticorpo humano enxertado por CDR de anticorpo de animal não humano (por exemplo, camundongo) é conhecido na técnica. Aproximações de recombinação de gene gerais são da mesma forma conhecidas para obter os anticorpos humanizados. Especificamente, por exemplo, a PCR de extensão de sobreposição é conhecida na técnica como um método para enxertar CDRs de anticorpo de camundongos em FRs humanas. Na PCR de extensão de sobreposição, uma sequência de nucleotídeo que codifica cada CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada aos iniciadores para síntese de FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados com respeito a cada das quatro FRs. Para enxertar as CDRs de camundongo às FRs humanas, é considerado geralmente vantajoso selecionar as FRs humanas altamente idênticas em FRs de camundongo, para manter as funções de CDR. Especificamente, em geral, as FRs humanas que compreendem as sequências de aminoácido altamente idênticas àquelas das FRs adjacentes às CDRs de camundongo a ser enxertadas são preferivelmente usadas.
[00341] As sequências de nucleotídeo a serem ligadas são projetadas de forma que as sequências sejam conectadas na estrutura entre si. As sequências de nucleotídeo de codificação de FR humanas são individualmente sintetizadas usando seus iniciadores respectivos. Os produtos resultantes contêm o DNA de codificação de CDR de camundongo adicionado a cada sequência de codificação de FR humana. As sequências de nucleotídeo de codificação de CDR de camundongo são projetadas de forma que a sequência de nucleotídeo em cada produto se sobreponha com outra. Subsequentemente, as porções de CDR de sobreposição nos produtos sintetizados com genes de anticorpo humanos como padrões são aneladas entre si para reação de síntese de filamento complementar. Por esta reação, as sequências de FR humanas são ligadas por meio das sequências de CDR de camundongo.
[00342] Finalmente, a sequência de tamanho natural do gene da região V que compreende três CDRs e quatro FRs ligadas é amplificada usando iniciadores que anelam-se cada qual às extremidades 5' e 3' dos mesmos e têm uma sequência de reconhecimento adicionada para uma enzima de restrição apropriada. O DNA desse modo obtido e um DNA de codificação de região C de anticorpo humano podem ser inseridos em vetores de expressão tal que estes DNAs são fundidos na estrutura para preparar os vetores para expressão de anticorpo humanizado. Estes vetores que têm as inserções são transferidos aos hospedeiros para estabelecer células recombinantes. Em seguida, as células recombinantes são cultivadas para a expressão do DNA de codificação de anticorpo humanizado para produzir os anticorpos humanizados nas culturas das células cultivadas (EP239400 e WO1996002576).
[00343] Os anticorpos humanizados desse modo preparados podem ser avaliados quanto a sua atividade de ligação de antígeno por ensaio qualitativo ou quantitativo para desse modo selecionar as FRs anticorpo humano adequadas que permitem as CDRs formar um sítio de ligação de antígeno favorável quando ligado por meio das CDRs. Se necessário, o(s) resíduo(s) de aminoácido de FR pode(m) ser substituído(s) tal que as CDRs do anticorpo humano reformado resultante forma(m) um sítio de ligação de antígeno apropriado. Por exemplo, a sequência de aminoácido de FR pode ser mutada pela aplicação do método de PCR usado no enxerto de CDR de camundongo às FRs humanas. Especificamente, uma mutação de uma sequência de nucleotídeo parcial pode ser introduzida aos iniciadores que anelam-se a uma sequência de nucleotídeo de FR. A sequência de nucleotídeo de FR sintetizada usando tais iniciadores contém a mutação desse modo introduzida. Tais anticorpos variantes que têm o(s) aminoácido(s) substituído(s) podem ser avaliados quanto a sua atividade de ligação de antígeno pelo mesmo ensaio como acima para desse modo selecionar as sequências de FR variantes que têm as propriedades desejadas (Sato et al., Cancer Res (1993) 53, 851-856).
[00344] Em um aspecto não limitante da presente invenção, uma forma modificada do polinucleotídeo desse modo isolada que codifica a molécula de ligação de antígeno selecionada, cuja atividade de ligação é alterada dependendo das condições é em seguida inserida aos vetores de expressão apropriados. Um exemplo preferido de uma tal forma modificada inclui uma forma humanizada de uma sequência de polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno da presente invenção analisada para usar, como a biblioteca de região variável randomizada, uma biblioteca sintética ou uma biblioteca imune preparada a partir de animais não humanos como uma fonte. A forma humanizada da molécula de ligação de antígeno pode ser preparada pela adoção de um método similar ao método de preparação de anticorpo humanizado descrito acima.
[00345] Em outros aspectos, exemplos preferidos da forma modificada incluem formas modificadas da sequência de polinucleotídeo isolada que foi modificada para realizar o realce na afinidade de ligação de antígeno (maturação de afinidade) da molécula de ligação de antígeno da presente invenção analisada para usar uma biblioteca sintética ou uma biblioteca sem tratamento como a biblioteca de região variável randomizada. Tais formas modificadas podem ser obtidas por vários procedimentos de maturação por afinidade conhecidos na técnica, incluindo mutagênese de CDR (Yang et al., J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403), embaralhamento de cadeia (Marks et al., Bio/Technology (1992) 10, 779-783), uso de cepas de mutador de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733), exibição de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88), e PCR sexual (Clameri et al., Nature (1998) 391, 288-291).
[00346] Exemplos da molécula de ligação de antígeno preparada pelo método de produção da presente invenção incluem moléculas de ligação de antígeno compreendendo um domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano), como descrito acima. O domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano) pode ser usado em várias formas modificadas. Em um aspecto, exemplos preferidos da forma modificada da presente invenção incluem também um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de antígeno que tem uma cadeia pesada, em que um polinucleotídeo que codifica uma tal forma modificada do domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano) é ligado na estrutura com o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno selecionada, cuja atividade de ligação é alterada dependendo das condições.
[00347] Em um aspecto não limitante da presente invenção, exemplos preferidos do domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano) inclui regiões constantes de anticorpos tal como IgG1 representada por SEQ ID N°: 14 (AAC82527.1 com Ala N- terminalmente adicionada), IgG2 representada por SEQ ID N°: 15 (AAB59393.1 com Ala N-terminalmente adicionada), IgG3 representada por SEQ ID N°: 16 (CAA27268.1), e IgG4 representada por SEQ ID N°: 17 (AAB59394.1 com Ala N-terminalmente adicionada). A retenção de plasma relativamente longa das moléculas de IgG (desaparecimento lento do plasma) é atribuída às funções de FcRn conhecidas como um receptor de salvamento nas moléculas de IgG. Moléculas de IgG apreendidas no endossoma por pinocitose ligam-se a FcRn expresso no endossoma sob a condição ácida no endossoma. Moléculas de IgG que não têm ligado a FcRn são movidas ao lisossoma, e em seguida são degradadas nisto, considerando que as moléculas de IgG ligadas ao FcRn são migradas à superfície celular e dissociadas de FcRn sob a condição neutra no plasma para voltar ao plasma.
[00348] A "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" da presente invenção está fortemente associada com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de cálcio no plasma e dissociada do antígeno sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio no endossoma. Desse modo, esta molécula de ligação de antígeno pode ser dissociada do antígeno no endossoma. A "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" da presente invenção que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de cálcio no plasma e dissociada do antígeno sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio no endossoma, é dissociada desse modo a partir do antígeno e pode ser reassociada com um antígeno depois de ser reciclada no plasma por FcRn. Isto permite uma molécula da molécula de ligação de antígeno ligar-se a uma pluralidade de antígenos repetidamente. Da mesma forma, o antígeno ligado com a molécula de ligação de antígeno é dissociado desta no endossoma e, portanto, não é reciclado no plasma. Isto promove a captação celular de antígenos pela molécula de ligação de antígeno. A administração da molécula de ligação de antígeno pode promover a depuração de antígeno e diminuir a concentração de antígeno no plasma.
[00349] A "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH" da presente invenção está fortemente associada com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociada do antígeno sob a condição ácida no endossoma. Desse modo, esta molécula de ligação de antígeno pode ser dissociada do antígeno no endossoma. A "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH" da presente invenção, que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociada do antígeno sob a condição ácida no endossoma, é dissociada desse modo a partir do antígeno e pode ser reassociada com um antígeno depois de ser reciclada no plasma por FcRn. Isto permite uma molécula da molécula de ligação de antígeno ligar-se a uma pluralidade de antígenos repetidamente. Da mesma forma, o antígeno ligado com a molécula de ligação de antígeno é dissociado desta no endossoma e, portanto, não é reciclado no plasma. Isto promove a captação celular de antígenos pela molécula de ligação de antígeno. A administração da molécula de ligação de antígeno pode promover a depuração de antígeno e diminuir a concentração de antígeno no plasma.
[00350] A capacidade de ligar-se a FcRn sob a condição de concentração com alto teor de cálcio no plasma pode ser dada à "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" da presente invenção que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de cálcio no plasma e dissociada do antígeno sob a condição de concentração com baixo teor de cálcio no endossoma. Isto promove a captação celular de um complexo da molécula de ligação de antígeno e o antígeno. Desse modo, a administração da molécula de ligação de antígeno pode promover a depuração de antígeno do plasma e diminuir a concentração de antígeno no plasma.
[00351] A capacidade de ligar-se ao FcRn sob a condição de pH neutro no plasma pode ser conferida à "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH" da presente invenção, que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociada do antígeno sob a condição de pH ácido no endossoma. Isto promove a captação celular de um complexo da molécula de ligação de antígeno e o antígeno. Desse modo, a administração da molécula de ligação de antígeno pode promover a depuração de antígeno do plasma e diminuir a concentração de antígeno no plasma.
[00352] Um anticorpo convencional que compreende uma região Fc não tem nenhuma atividade de ligação de FcRn sob a condição de pH neutro no plasma. O anticorpo convencional e complexo de anticorpo- antígeno são, portanto, apreendidos em células por endocitose não específica e transportados à superfície celular ligando-se a FcRn sob a condição de pH ácido no endossoma. Considerando que FcRn é responsável pelo transporte de anticorpo a partir do endossoma para a superfície celular, é considerado que alguns receptores de FcRn existem da mesma forma na superfície celular. O anticorpo é dissociado de FcRn sob a condição de pH neutro na superfície celular e, portanto, reciclado no plasma.
[00353] Em atenção às cinéticas in vivo do anticorpo que compreende uma região de Fc (domínio de ligação de FcRn), a "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" da presente invenção, que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de cálcio no plasma e dissociada do antígeno sob a condição da concentração com baixo teor de cálcio no endossoma, está associada com o antígeno no plasma e está dissociada do antígeno ligado no endossoma. Desse modo, a taxa da depuração do antígeno é considerada igual à taxa de captação celular por endocitose não específica. No caso de dependência da concentração de íon de cálcio insuficiente da ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno, antígenos não dissociados no endossoma são reciclados no plasma. Em comparação, no caso de dependência da concentração de íon de cálcio suficiente da ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno, a taxa da depuração do antígeno é determinada pela taxa de captação celular por endocitose não específica.
[00354] A "molécula de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de pH" da presente invenção, que está fortemente associada com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociada do antígeno sob a condição de pH ácido no endossoma, está associada com o antígeno no plasma e está dissociada do antígeno ligado no endossoma. Desse modo, a taxa da depuração do antígeno é considerada igual à taxa de captação celular por endocitose não específica. No caso de dependência de pH insuficiente de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno, antígenos não dissociados no endossoma são reciclados no plasma. Em comparação, no caso de dependência de pH suficiente da ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno, a taxa da depuração do antígeno é determinada pela taxa de captação celular por endocitose não específica.
[00355] Consequentemente, a capacidade de ligar-se a FcRn em pH neutro pode ser dada à molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de FcRn. A molécula de ligação de antígeno resultante é apreendida em células de uma maneira dependente de FcRn por ligação ao FcRn presente na superfície celular. A taxa de captação celular mediada por FcRn é mais rápida que a taxa de captação celular por endocitose não específica. Neste respeito, a conferência da capacidade de ligar-se a FcRn em pH neutro pode também acelerar a taxa da depuração do antígeno no plasma. Especificamente, a molécula de ligação de antígeno que tem a capacidade de ligar-se a FcRn em pH neutro libera um antígeno mais rapidamente em células do que a molécula de ligação de antígeno convencional que compreende uma região de Fc (não tendo nenhuma atividade de ligação de FcRn sob a condição de pH neutro no plasma) e dissocia o antígeno no endossoma. A molécula de ligação de antígeno dissociada é reciclada na superfície celular ou plasma onde a molécula é reassociada com um antígeno, resultando novamente na captação celular mediada por FcRn. A capacidade superior de ligar-se a FcRn em pH neutro pode acelerar a taxa de rotação deste ciclo e então pode acelerar a taxa da depuração do antígeno no plasma. A atividade de ligação de antígeno em pH ácido da molécula de ligação de antígeno pode ser diminuída com respeito àquela no pH neutro para desse modo também realçar a eficiência. O número aumentado de rotação deste ciclo por molécula de ligação de antígeno permite provavelmente uma molécula de ligação de antígeno ligar-se a um número maior de antígenos.
[00356] A molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode compreender um domínio de ligação de antígeno e um domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano). O domínio de ligação de FcRn não influencia a ligação de antígeno nem depende do tipo de antígeno, da mesma forma como visto a partir do mecanismo mencionado acima. A atividade de ligação de antígeno (capacidade de ligação) da molécula de ligação de antígeno sob condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio é diminuída com respeito àquela sob condição de concentração com alto teor de íon de cálcio, e/ou a atividade de ligação de FcRn desta molécula em pH neutro no plasma é realçada. Isto pode promover a captação celular de antígenos pela molécula de ligação de antígeno e pode acelerar a taxa da depuração dos antígenos.
[00357] Como descrito acima, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode compreender o domínio de ligação de antígeno e o domínio de ligação de FcRn, que não influencia a ligação de antígeno nem depende do tipo de antígeno, da mesma forma como visto a partir do mecanismo mencionado acima. A atividade de ligação de antígeno (capacidade de ligação) da molécula de ligação de antígeno sob a condição de pH ácido é diminuída com respeito àquela sob a condição de pH neutro, e/ou a atividade de ligação de FcRn desta molécula em pH neutro no plasma é realçada. Isto pode promover a captação celular de antígenos pela molécula de ligação de antígeno e pode acelerar a taxa da depuração dos antígenos.
[00358] A atividade de ligação de FcRn do domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) pode ser analisada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, como mencionado acima no parágrafo sobre atividade de ligação. Condições diferente de pH podem ser determinadas apropriadamente por aqueles versados na técnica. A atividade de ligação de antígeno e atividade de ligação de FcRn humano da molécula de ligação de antígeno pode ser avaliada com base em, por exemplo, KD (constante de dissociação), KD aparente (constante de dissociação aparente), kd (taxa de dissociação), ou kd aparente (taxa de dissociação aparente). Estes índices podem ser medidos por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), uma plotagem de Scatchard, ou um citômetro de fluxo.
[00359] Condições diferentes do pH para analisar a atividade de ligação de FcRn humano do domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica sem limitações particulares. A atividade de ligação de FcRn humano pode ser analisada sob condições de, por exemplo, um tampão de MES e 37°C, como descrito em WO2009125825. Da mesma forma, a atividade de ligação de FcRn humano do domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) pode ser analisada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). No ensaio da atividade de ligação de FcRn humano, o domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) pode ser avaliado quanto a sua capacidade de ligação pela injeção de um FcRn humano do analisado a um fragmento com o domínio de ligação de FcRn immobilizado ou molécula de ligação de antígeno da presente invenção compreendendo o domínio de ligação de FcRn ou pela injeção do domínio de ligação de FcRn do analisado ou molécula de ligação de antígeno da presente invenção compreendendo o domínio de ligação de FcRn a um fragmento imobilizado por FcRn humano.
[00360] O pH neutro como uma condição sob qual o domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) ou a molécula de ligação de antígeno compreendendo o domínio de ligação de FcRn tem a atividade de ligação de FcRn normalmente significa pH 6,7 a pH 10,0. O pH neutro é preferivelmente uma faixa indicada por qualquer valor de pH do pH 7,0 ao pH 8,0 e é preferivelmente selecionado a partir de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, e 8,0, particularmente preferivelmente pH 7,4 que está perto do pH in vivo no plasma (sangue). A afinidade de ligação do domínio de ligação de FcRn humano para FcRn humano em pH 7,4 pode ser difícil de avaliar devido a sua baixa afinidade de ligação. Em um tal caso, o pH 7,0 pode ser usado em vez do pH 7,4. Na presente invenção, o pH ácido como uma condição sob a qual o domínio de ligação de FcRn humano ou a molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio de ligação de FcRn humano normalmente tem atividade de ligação de FcRn significa pH 4,0 ao pH 6,5. O pH ácido preferivelmente significa pH 5,5 ao pH 6,5 e particularmente preferivelmente significa pH 5,8 ao pH 6,0, que estão perto do pH in vivo no endossoma precoce. A temperatura usada em condições de ensaio pode ser qualquer temperatura de 10°C a 50°C em que o domínio de ligação de FcRn humano ou a molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio de ligação de FcRn humano é avaliado quanto a sua afinidade de ligação de FcRn humano. Preferivelmente, uma temperatura de 15°C a 40°C é usada para determinar a afinidade de ligação de FcRn humano do domínio de ligação de FcRn humano ou da molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio de ligação de FcRn humano. Mais preferivelmente, qualquer temperatura de 20°C a 35°C, por exemplo, qualquer uma das temperaturas 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, e 35°C, é da mesma forma usada para determinar a afinidade de ligação de FcRn humano do domínio de ligação de FcRn humano ou da molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio de ligação de FcRn humano. A temperatura 25°C é um exemplo não limitante em um aspecto da presente invenção.
[00361] De acordo com The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671, a atividade de ligação de FcRn humano de IgG1 humana natural é KD 1,7 μM em pH ácido (pH 6,0), porém quase não é detectável ao pH neutro. Consequentemente, em um aspecto preferido, a molécula de ligação de antígeno da presente invenção que tem atividade de ligação de FcRn humano em pH ácido e em pH neutro pode ser analisada, que inclui uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de FcRn humano de KD 20 μM ou mais forte em pH ácido e atividade de ligação de FcRn humano equivalente a ou mais forte do que aquela de IgG humano natural em pH neutro. Em um aspecto mais preferido, uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de FcRn humano de KD 2,0 μM ou mais forte em pH ácido e humano, a atividade de ligação de FcRn de KD 40 μM ou mais forte em pH neutro pode ser analisada. Em um outro aspecto preferido, uma molécula de ligação de antígeno que tem atividade de ligação de FcRn humano de KD 0,5 μM ou mais forte em pH ácido e humano, a atividade de ligação de FcRn de KD 15 μM ou mais forte em pH neutro pode ser analisada. Estes valores de KD são determinados por um método descrito em The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (que envolve a imobilização das moléculas de ligação de antígeno sobre um fragmento e injetando a isto o FcRn humano como um analisado).
[00362] Na presente invenção, o domínio de ligação de FcRn tem preferivelmente atividade de ligação de FcRn humano em pH ácido e em pH neutro. Um domínio de ligação de FcRn que tem naturalmente atividade de ligação de FcRn humano em pH ácido e em pH neutro pode ser usado diretamente como o domínio. Quando o domínio tem ou não a atividade de ligação de FcRn humano fraca em pH ácido e/ou em pH neutro, aminoácido(s) na molécula de ligação de antígeno pode(m) ser modificado(s) para obter um domínio de ligação de FcRn que tem a atividade de ligação de FcRn humano desejada. Alternativamente, aminoácido(s) no domínio de ligação de FcRn humano pode(m) ser preferivelmente modificado(s) para obter um domínio de ligação de FcRn que tem a atividade de ligação de FcRn humano desejada em pH ácido e/ou em pH neutro. Da mesma forma, aminoácido(s) no domínio de ligação de FcRn que tem(têm) naturalmente atividade de ligação de FcRn humano em pH ácido e/ou em pH neutro pode(m) ser modificado(s) para obter um domínio de ligação de FcRn que tem a atividade de ligação de FcRn humano desejada. Tal modificação de aminoácido que confere a atividade de ligação desejada ao domínio de ligação de FcRn humano pode ser encontrada pela comparação da atividade de ligação de FcRn humano em pH ácido e/ou em pH neutro entre antes de e depois da modificação de aminoácido. Aqueles versados na técnica podem apropriadamente realizar a modificação de aminoácido usando um método conhecido na técnica.
[00363] Na presente invenção, o termo "modificação de aminoácido(s)" ou "modificação de aminoácido" no domínio de ligação de FcRn inclui a modificação em uma sequência de aminoácido diferente da sequência de aminoácido de um domínio de ligação de FcRn de partida. Qualquer domínio de ligação de FcRn pode ser usado como o domínio de partida contanto que a forma modificada resultante do domínio de ligação de FcRn de partida possa ligar-se ao FcRn humano em pH ácido e/ou em pH neutro (consequentemente, o domínio de ligação de FcRn de partida não é necessariamente exigido ter atividade de ligação de FcRn humano sob as condições de pH ácido e/ou pH neutro). Os exemplos preferidos do domínio de ligação de FcRn de partida incluem regiões constantes de anticorpo de IgG, isto é, regiões constantes naturais representadas por qualquer dente SEQ ID N°s: 14 a 17. Alternativamente, um domínio de ligação de FcRn também modificado a partir de um domínio de ligação de FcRn já modificado como o domínio de ligação de FcRn de partida pode ser usado preferivelmente como o domínio de ligação de FcRn modificado da presente invenção. O domínio de ligação de FcRn de partida pode significar o próprio polipeptídeo, uma composição que contém o domínio de ligação de FcRn de partida, ou uma sequência de aminoácido que codifica o domínio de ligação de FcRn de partida. O domínio de ligação de FcRn de partida pode incluir domínios de ligação de FcRn de anticorpos de IgG conhecidos na técnica produzida por recombinação revisada no parágrafo sobre anticorpo. O domínio de ligação de FcRn de partida não está limitado por sua origem e pode ser obtido a partir de um organismo animal não humano arbitrário ou um humano. Os exemplos preferidos do organismo arbitrário incluem um organismo selecionado a partir de camundongos, ratos, cobaias, hamsters, gerbils, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelha, gado, cavalos, camelos, e primatas não humanos. Em outro aspecto, o domínio de ligação de FcRn de partida pode ser obtido a partir de um macaco cinomolgo, um sagui, um macaco reso, um chimpanzé, ou um humano. Preferivelmente, a região Fc de partida pode ser obtida a partir de IgG1 humana, entretanto o domínio de ligação de FcRn de partida da presente invenção não está limitado por uma classe particular de IgG. Isto significa que a região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 humano podem ser usados apropriadamente como a região de Fc de partida. Sequências de proteínas de interesse imunológico, NIH Publicação No. 91-3242 descreve uma pluralidade de sequências de alótipo atribuídas ao polimorfismo como regiões de Fc de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e IgG4 humana, quaisquer das quais podem ser usadas na presente invenção. Particularmente, IgG1 humana pode ter uma sequência com DEL ou EEM como a sequência de aminoácido das posições 356 a 358 definidas pela numeração EU. Da mesma maneira, isto significa aqui que o domínio de ligação de FcRn da classe ou subclasse de IgG arbitrária do organismo arbitrário pode ser usado preferivelmente como o domínio de ligação de FcRn de partida. Os exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas manipuladas dos mesmos são descritos nas literaturas públicas (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202; WO2009086320, WO2008092117, WO2007041635, e WO2006105338), entretanto as variantes ou as formas manipuladas da presente invenção não são limitadas àquelas descritas nisto.
[00364] Aminoácido(s) no domínio de ligação de FcRn envolvido em ligação de FcRn é adequadamente mutado a fim de conferir a capacidade para ligar FcRn (particularmente, FcRn humano) em pH neutro à molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio de ligação de FcRn (particularmente, FcRn humano). No caso de usar uma região constante de molécula de anticorpo de IgG como o domínio de ligação de FcRn, exemplos de um tal domínio de ligação de FcRn modificado incluem regiões constantes derivadas a partir de regiões constantes de IgG naturais pela modificação de aminoácidos nas posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 e 442 definidas pela numeração EU em aminoácidos diferentes daqueles de ocorrência natural correspondentes. Mais especificamente, os exemplos dos mesmos incluem formas modificadas de regiões constantes que contêm Pro na posição de aminoácido 256, Lys na posição de aminoácido 280, Thr na posição de aminoácido 339, His na posição de aminoácido 385, Leu na posição de aminoácido 428 e/ou Trp, Tyr, Phe, Ala ou His na posição de aminoácido 434 (todos definidos pela numeração EU). O uso destas formas modificadas pode fortalecer a atividade de ligação de FcRn humano da região Fc de imunoglobulina IgG em pH neutro.
[00365] Alternativamente, uma forma modificada capaz de ligar-se mais fortemente a FcRn humano em pH ácido do que uma região constante de IgG natural, pode ser usada apropriadamente. Uma tal forma modificada pode ser apropriadamente selecionada com base em sua capacidade de ligar-se da mesma forma fortemente a FcRn humano em pH neutro e usada na presente invenção. Os exemplos de uma tal forma modificada incluem regiões constantes derivadas a partir de regiões constantes de IgG naturais pela modificação de aminoácidos definida pela numeração EU em aminoácidos diferentes daqueles de ocorrência natural correspondentes. Como um exemplo de tal modificação de aminoácido, regiões constantes modificadas que compreendem aminoácidos listadas na Tabela 1 podem ser preferivelmente usadas. Tabela 1
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[00366] Exemplos de modificação de aminoácido particularmente preferida incluem modificação que substitui aminoácidos nas posições 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436, definidas pela numeração EU por aminoácidos diferentes a partir dos aminoácidos correspondentes na região constante de IgG natural. Pelo menos um aminoácido selecionado a partir destes aminoácidos pode ser modificado para outro aminoácido, para desse modo realçar a atividade de ligação de FcRn humano do domínio de ligação de FcRn em pH neutro.
[00367] Exemplos de modificação particularmente preferida incluem modificação da região constante de IgG natural que resulta em:
[00368] Met na posição de aminoácido 237,
[00369] Ala na posição de aminoácido 238,
[00370] Lys na posição de aminoácido 239,
[00371] Ile na posição de aminoácido 248,
[00372] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 250,
[00373] Phe, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 252,
[00374] Thr na posição de aminoácido 254,
[00375] Glu na posição de aminoácido 255,
[00376] Asp, Glu ou Gln na posição de aminoácido 256,
[00377] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val na posição de aminoácido 257,
[00378] His na posição de aminoácido 258,
[00379] Ala na posição de aminoácido 265,
[00380] Phe na posição de aminoácido 270,
[00381] Ala ou Glu na posição de aminoácido 286,
[00382] His na posição de aminoácido 289,
[00383] Ala na posição de aminoácido 297,
[00384] Gly na posição de aminoácido 298,
[00385] Ala na posição de aminoácido 303,
[00386] Ala na posição de aminoácido 305,
[00387] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 307,
[00388] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr na posição de aminoácido 308,
[00389] Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg na posição de aminoácido 309,
[00390] Ala, His ou Ile na posição de aminoácido 311,
[00391] Ala ou His na posição de aminoácido 312,
[00392] Lys ou Arg na posição de aminoácido 314,
[00393] Ala ou His na posição de aminoácido 315,
[00394] Ala na posição de aminoácido 317,
[00395] Gly na posição de aminoácido 325,
[00396] Val na posição de aminoácido 332,
[00397] Leu na posição de aminoácido 334,
[00398] His na posição de aminoácido 360,
[00399] Ala na posição de aminoácido 376,
[00400] Ala na posição de aminoácido 380,
[00401] Ala na posição de aminoácido 382,
[00402] Ala na posição de aminoácido 384,
[00403] Asp ou His na posição de aminoácido 385,
[00404] Pro na posição de aminoácido 386,
[00405] Glu na posição de aminoácido 387,
[00406] Ala ou Ser na posição de aminoácido 389,
[00407] Ala na posição de aminoácido 424,
[00408] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 428,
[00409] Lys na posição de aminoácido 433,
[00410] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 434, e
[00411] His na posição de aminoácido 436
[00412] (todos definidos pela numeração EU).
[00413] O número de aminoácidos a ser modificado não é particularmente limitado. Apenas um aminoácido pode ser modificado, ou dois ou mais aminoácidos podem ser modificados. Os exemplos da combinação de dois ou mais aminoácidos a serem modificados incluem combinações como mostrado na Tabela 2.
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[00414] Exemplos da modificação incluem uma ou mais mutação(ões), por exemplo, uma mutação que substitui aminoácido(s) na região Fc de partida por resíduo(s) de aminoácido diferente(s) disto, a inserção de um ou mais resíduo(s) de aminoácido na sequência de aminoácido da região Fc de partida, e a deleção de um ou mais aminoácido(s) a partir da sequência de aminoácido da região Fc de partida. Preferivelmente, a sequência de aminoácido da região Fc desse modo modificada compreende uma sequência de aminoácido que contém pelo menos uma porção não natural da região Fc. Uma tal variante tem inevitavelmente menos de 100% de identidade de sequência ou similaridade à região Fc de partida. Em uma modalidade preferida, a variante tem uma sequência de aminoácido com aproximadamente 75% a menos de 100% de identidade de sequência ou similaridade, mais preferivelmente aproximadamente 80% a menos de 100%, também preferivelmente aproximadamente 85% a menos de 100%, ainda também preferivelmente aproximadamente 90% a menos de 100%, mais preferivelmente aproximadamente 95% a menos de 100% de identidade de sequência ou similaridade à sequência de aminoácido da região Fc de partida. Em um aspecto não limitante da presente invenção, a região Fc de partida e a região Fc modificada da presente invenção difirem por pelo menos um aminoácido. A diferença em aminoácido entre a região Fc de partida e a região Fc modificada pode ser preferivelmente determinada por uma diferença em aminoácido com a posição identificada de seu resíduo de aminoácido definido particularmente pela numeração EU.
[00415] O(s) aminoácido(s) na região Fc pode(m) ser modificado(s) por um método apropriadamente adotado conhecido na técnica, tal como mutagênese direcionada ao sítio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) ou PCR de extensão de sobreposição. Da mesma forma, o(s) aminoácido(s) pode(m) ser substituído(s) por aminoácidos não naturais por uso de uma pluralidade de métodos de modificação conhecidos na técnica (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de translação livre de célula contendo tRNA (Clover Direct (Protein Express, a R & D oriented company)) compreendendo um aminoácido não natural ligado com um tRNA supressor ambarino complementar ao códon de UAG (códon ambarino) que é um códon de interrupção é da mesma forma preferivelmente usado.
[00416] Em um aspecto da forma modificada da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de antígeno que tem uma cadeia pesada é preparado, em que um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação de FcRn modificado que tem o(s) aminoácido(s) desse modo mutado(s) é ligado na estrutura com o polinucleotídeo que codifica a molécula de ligação de antígeno selecionada, cuja atividade de ligação é alterada dependendo das condições.
[00417] A presente invenção fornece um método para produzir uma molécula de ligação de antígeno, compreendendo recuperar a molécula de ligação de antígeno a partir de culturas de uma célula transfectada com um vetor que tem uma inserção operavelmente ligada, em que um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação de FcRn é ligado na estrutura com o polinucleotídeo isolado a partir do vírus da presente invenção. A presente invenção da mesma forma fornece um método para produzir uma molécula de ligação de antígeno, compreendendo recuperar a molécula de ligação de antígeno a partir de culturas de uma célula transfectada com um vetor que tem uma inserção operavelmente ligada, em que um polinucleotídeo de codificação de domínio de ligação de FcRn operavelmente ligado com antecedência no vetor é ligado na estrutura com o polinucleotídeo isolado a partir do vírus da presente invenção.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[00418] Embora a presente invenção não seja ligada a qualquer teoria particular, por exemplo, o número de antígenos que podem ser ligados por molécula de ligação de antígeno é aumentado, e o desaparecimento de antígeno do plasma é promovido, como resultado da captação celular promovida em um organismo que recebeu uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de antígeno, cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo das condições de concentração de íon de forma que a atividade de ligação de antígeno seja mais baixa em uma condição de pH ácido do que aquela em uma condição de pH neutro, e adicionalmente compreendendo um domínio de ligação de FcRn (por exemplo, região constante de anticorpo) tendo atividade de ligação de FcRn humano sob a condição de pH neutro. Isto provavelmente é por causa do seguinte:
[00419] Por exemplo, quando um anticorpo de ligação de antígeno de membrana é administrado como a molécula de ligação de antígeno a um organismo, o anticorpo é associado com o antígeno e em seguida apreendido, juntamente com o antígeno (ao mesmo tempo que mantendo seu estado ligado ao antígeno), no endossoma intracelular por internalização. Em seguida, o anticorpo é migrado para o lisossoma, ao mesmo tempo que mantendo seu estado ligado ao antígeno, e o complexo de antígeno-anticorpo é degradado pelo lisossoma. O desaparecimento mediado por internalização do plasma é chamado desaparecimento dependente de antígeno e foi relatado a muitas moléculas de anticorpo (Drug Discov Today (2006) 11 (1-2), 8188). Uma vez que uma molécula de anticorpo de IgG bivalentemente liga-se a antígenos, esta uma molécula de anticorpo em um estado ligado com duas moléculas de antígeno é interiorizada e degradada neste estado no lisossoma. Desse modo, uma molécula de anticorpo de IgG convencional não pode ligar-se a três ou mais moléculas de antígeno. Por exemplo, uma molécula de anticorpo de IgG tendo atividade neutralizante não pode neutralizar três ou mais moléculas de antígeno.
[00420] A retenção de plasma relativamente longa de moléculas de IgG (desaparecimento lento) é atribuída às funções de FcRn humano conhecidas como um receptor de salvamento nas moléculas de IgG. Moléculas de IgG apreendidas no endossoma por pinocitose ligam-se a FcRn humano expresso no endossoma sob a condição ácida no endossoma. Moléculas de IgG que não têm ligado para o FcRn humano, são em seguida migradas para o lisossoma e são degradadas nele. Por outro lado, as moléculas de IgG ligadas ao FcRn humano são migradas para a superfície celular. As moléculas de IgG são dissociadas a partir de FcRn humano sob a condição neutra em plasma e então recicladas no plasma.
[00421] Quando a molécula de ligação de antígeno for um anticorpo de ligação de antígeno solúvel, o anticorpo administrado a um organismo é associado com o antígeno, e em seguida apreendido em células, ao mesmo tempo que mantendo seu estado ligado ao antígeno. A maioria dos anticorpos desse modo apreendidos em células é associada com FcRn no endossoma, e em seguida migrada para a superfície celular. Estes anticorpos são dissociados a partir de FcRn humano sob a condição neutra no plasma e então liberados a partir das células. Entretanto, o anticorpo que compreende o domínio de ligação de antígeno convencional, cuja atividade de ligação de antígeno não é alterada dependendo das condições de concentração de íon (por exemplo, pH), é liberado a partir das células, ao mesmo tempo que mantendo seu estado ligado ao antígeno. Desse modo, este anticorpo não pode ser reassociado com um antígeno. Desse modo, como no anticorpo de ligação de antígeno de membrana, uma molécula de anticorpo de IgG convencional, cuja atividade de ligação de antígeno não é alterada dependendo das condições de concentração de íon (por exemplo, pH) não pode ligar-se a três ou mais moléculas de antígeno.
[00422] Um anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH que está fortemente associado com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociado do antígeno sob a condição de pH ácido no endossoma (anticorpo capaz de ligar-se a um antígeno sob a condição de pH neutro e chegar o antígeno sob a condição de pH ácido) ou um anticorpo de ligação de antígeno dependente da concentração de íon de cálcio, que está fortemente associado com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio no plasma e dissociado do antígeno sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio no endossoma (anticorpo capaz de ligar-se a um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio e chegar o antígeno sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio) pode ser dissociado do antígeno no endossoma. O anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH ou o anticorpo de ligação de antígeno dependente da concentração de íon de cálcio desse modo dissociado do antígeno, pode ser reassociado com um antígeno depois de ser reciclado no plasma por FcRn. Isto permite uma molécula de anticorpo ligar-se repetidamente a uma pluralidade de moléculas de antígeno. Da mesma forma, o antígeno ligado com a molécula de ligação de antígeno é dissociado do anticorpo no endossoma e é então degradado no lisossoma sem ser reciclado no plasma. A administração de uma tal molécula de ligação de antígeno para um organismo, pode promover a captação celular de antígenos e concentração de antígeno de diminuição no plasma.
[00423] A capacidade de ligar-se a FcRn humano sob a condição de pH neutro (pH 7.4) pode ser conferida ao anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH que está fortemente associado com um antígeno sob a condição de pH neutro no plasma e dissociado do antígeno sob a condição de pH ácido no endossoma (anticorpo capaz de ligar-se a um antígeno sob a condição de pH neutro e chegar o antígeno sob a condição de pH ácido) ou o anticorpo de ligação de antígeno dependente da concentração de íon de cálcio que está fortemente associado com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio no plasma e dissociado do antígeno sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio no endossoma (anticorpo capaz de ligar-se a um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio e chegar o antígeno sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio). A molécula de ligação de antígeno resultante promove também captação celular de antígenos ligados a isto. A administração de uma tal molécula de ligação de antígeno a um organismo, pode promover o desaparecimento de antígeno e diminuir a concentração de antígeno no plasma. Um anticorpo convencional que tem nenhuma capacidade de ligação de antígeno dependente do pH nem capacidade de ligação de antígeno dependente de concentração de íon de cálcio e um complexo de anticorpo-antígeno dos mesmos é apreendido em células por endocitose não específica e transportado para superfície celular ligando-se a FcRn sob a condição de pH ácido no endossoma. O anticorpo é dissociado de FcRn sob a condição de pH neutro na superfície celular e então reciclado no plasma. Quando o anticorpo que liga-se a um antígeno de uma maneira suficientemente dependente do pH (isto é, que está associado com um antígeno sob a condição de pH neutro e dissociado disto sob a condição de pH ácido) ou de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio suficientemente (isto é, que está associado com um antígeno sob a condição de concentração com alto teor de íon de cálcio e dissociado disto sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio) está associado com o antígeno no plasma e dissociado do antígeno ligado no endossoma, a taxa de desaparecimento do antígeno é considerada igual à taxa de captação celular do anticorpo e o complexo de anticorpo-antígeno do mesmo por endocitose não específica. No caso de dependência de pH insuficiente ou dependência de concentração de íon de cálcio de ligação de antígeno do anticorpo, antígenos não dissociados no endossoma são reciclados no plasma, juntamente com o anticorpo. Por contraste, no caso de dependência de pH suficiente da ligação de antígeno, a taxa de desaparecimento do antígeno é determinada pela taxa de captação celular através de endocitose não específica. Considerando que FcRn é responsável pelo transporte de anticorpo do endossoma para a superfície celular, é considerado que alguns receptores de FcRn existem da mesma forma na superfície celular.
[00424] Normalmente, a imunoglobulina IgG, que é uma forma de uma molécula de ligação de antígeno, apenas tem atividade de ligação de FcRn em pH neutro. Os presentes inventores levantaram a hipótese que a imunoglobulina IgG que tem atividade de ligação de FcRn em pH neutro é capaz de ligação a FcRn presente na superfície celular e ser apreendida em células de uma maneira Dependente de FcRn ligando-se a FcRn presente na superfície celular. A taxa de captação celular Mediada por FcRn é mais rápida do que a taxa de captação celular através de endocitose não específica. Isto sugere que a conferência da capacidade de ligar-se a FcRn em pH neutro também possa acelerar a taxa de desaparecimento do antígeno pela molécula de ligação de antígeno. Especificamente, a molécula de ligação de antígeno que tem a capacidade de ligar-se a FcRn em pH neutro libera um antígeno mais rapidamente nas células do que a imunoglobulina IgG habitual (humana natural) e dissocia o antígeno no endossoma. A molécula de ligação de antígeno dissociada é reciclada na superfície celular ou plasma, onde a molécula é reassociada com um antígeno, resultando novamente na captação celular mediada por FcRn. A capacidade superior de ligar-se a FcRn em pH neutro pode acelerar a taxa de rotação deste ciclo e então acelerar a taxa de desaparecimento do antígeno no plasma. A atividade de ligação de antígeno em pH ácido da molécula de ligação de antígeno pode ser diminuída com respeito àquela no pH neutro para desse modo também realçar a taxa de desaparecimento do antígeno no plasma. A taxa aumentada de rotação deste ciclo pode resultar no número aumentado do ciclo que provavelmente permite uma molécula de ligação de antígeno ligar-se a um número maior de moléculas de antígeno. A molécula de ligação de antígeno da presente invenção pode compreender um domínio de ligação de antígeno e um domínio de ligação de FcRn. O domínio de ligação de FcRn nem influencia a ligação de antígeno nem depende do tipo de antígeno, da mesma forma como visto a partir do mecanismo mencionado acima. A atividade de ligação de antígeno (capacidade de ligação) da molécula de ligação de antígeno sob a condição de concentração de íon tal como o pH ácido ou condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio, é diminuída com respeito àquela sob a condição de concentração de íon tal como o pH neutro ou condição de concentração com alto teor de íon de cálcio, e/ou a atividade de ligação de FcRn desta molécula em pH no plasma é realçada. Isto pode promover a captação celular de antígenos pela molécula de ligação de antígeno e pode acelerar a taxa de desaparecimento dos antígenos. Consequentemente, espera-se que a molécula de ligação de antígeno da presente invenção mostre efeitos superiores a anticorpos terapêuticos convencionais, por exemplo, na redução na reação adversa causada por antígenos, uma elevação na dose de anticorpo, e melhoria na cinética de anticorpo in vivo.
[00425] Especificamente, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação de antígeno da presente invenção, a molécula de ligação de antígeno isolada pelo método de avaliação da presente invenção, ou a molécula de ligação de antígeno produzida pelo método de produção da presente invenção. A molécula de ligação de antígeno da presente invenção ou a molécula de ligação de antígeno produzida pelo método de produção da presente invenção é útil como uma composição farmacêutica, porque sua administração produz o alto efeito de diminuição da concentração de antígeno no plasma comparado com moléculas de ligação de antígeno convencionais. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00426] Na presente invenção, a composição farmacêutica refere- se normalmente a um agente para tratamento ou prevenção de uma doença ou para exame ou diagnóstico.
[00427] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada usando um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser parenteralmente usada na forma de uma injeção em uma solução estéril ou suspensão com água ou qualquer outra solução farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser apropriadamente combinado com meios ou veículos farmacologicalmente aceitáveis, especificamente, água estéril ou solução salina, um óleo de planta, um emulsificador, agente de suspensão, um tensoativo, um estabilizador, um aromatizante, um excipiente, um veículo, um antisséptico, um aglutinante, e similares, e misturado com estes em uma forma de dosagem unitária requerida para prática farmacêutica geralmente aceita para produzir preparações. A quantidade do ingrediente ativo nestas preparações é ajustada para produzir um volume apropriado dentro de uma faixa prescrita.
[00428] As composições estéreis para injeção podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica habitual usando um veículo tal como água destilada injetável. Os exemplos de soluções aquosas injetáveis incluem soluções salinas e isotônicas que contêm glicose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D- manitol e cloreto de sódio). Um solubilizador apropriado, por exemplo, um álcool (etanol, etc.), um poliálcool (propileno glicol, polietileno glicol, etc.), ou um tensoativo não iônico (Polysorbate 80(TM), HCO- 50, etc.) pode ser usado em combinação com estes.
[00429] Exemplos de soluções em óleo incluem óleo de gergelim e óleo de soja. Benzoato de benzila e/ou álcool benzílico pode(m) ser usado(s) como um solubilizador em combinação com estes. Estas soluções injetáveis podem ser misturadas com um tampão (por exemplo, uma solução de tamponamento de fosfato e uma solução de tamponamento de acetato de sódio), um agente calmante (por exemplo, cloridrato de procaína), um estabilizador (por exemplo, álcool benzílico e fenol), e um antioxidante. As injeções preparadas normalmente são carregadas em ampolas apropriadas.
[00430] A composição farmacêutica da presente invenção é administrada preferivelmente por uma rotina parenteral. Por exemplo, a composição é administrada em uma forma de dosagem de uma injeção, agente transnasal, agente transpulmonar ou um agente percutâneo. A composição pode ser administrada sistemicamente ou localmente, por exemplo, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal ou injeção subcutânea.
[00431] O método de administração pode ser selecionado apropriadamente de acordo com a idade e sintomas do paciente. A dose única da composição farmacêutica que contém a molécula de ligação de antígeno pode ser ajustada dentro da faixa de, por exemplo, 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, a dose pode ser ajustada, por exemplo, 0,001 a 100000 mg por paciente, entretanto a dose da presente invenção necessariamente não está limitada a estes valores numéricos. A dose e o método de administração variam, dependendo do peso corporal, idade, sintomas, etc. do paciente. Aqueles versados na técnica podem ajustar uma dose apropriada e método de administração em relação a estas condições.
[00432] Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoácido descritas na presente invenção podem sofrer modificação pós- translacional (por exemplo, a modificação de glutamina N-terminal para ácido piroglutâmico por piroglutamilação, que é bem conhecida por aqueles versados na técnica). Até mesmo tais formas tendo os aminoácidos pós-translacionalmente modificados são da mesma forma incluídas nas sequências de aminoácido descritas na presente invenção, como de costume.
[00433] Todos os documentos de técnicas anteriores aqui citados estão aqui incorporados por referência.
[00434] Quando aqui usado, um aspecto representado pela expressão com "compreendendo" abrange um aspecto representado pela expressão com "essencialmente consistindo em" e um aspecto representado através de expressão com "consistindo em".
EXEMPLOS
[00435] Em seguida, a presente invenção mais especificamente será descrita com referência aos Exemplos. Entretanto, não pretende- se que a presente invenção seja limitada por estes Exemplos. Exemplo 1 Projeto de biblioteca de anticorpo de ligação dependente do pH
[00436] O método para obter anticorpo de ligação dependente do pH WO2009125825 descreve que a histidina é introduzida em uma molécula de ligação de antígeno para preparar um anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH, cuja propriedade é alterada entre as regiões de pH neutro e pH ácido. O anticorpo de ligação dependente do pH descrito é obtido por modificação que substitui uma porção da sequência de aminoácido da molécula de ligação de antígeno desejada por histidina. Um possível método para obter o anticorpo de ligação dependente do pH mais eficazmente sem obter a molécula de ligação de antígeno a ser modificada com antecedência, envolve introduzir histidina em regiões variáveis (mais preferivelmente, posições que podem ser envolvidas em ligação de antígeno) e obter uma molécula de ligação de antígeno ligando-se ao antígeno desejado a partir do conjunto resultante de moléculas de ligação de antígeno (chamado uma biblioteca de His). A molécula de ligação de antígeno obtida a partir da biblioteca de His tem frequência superior de aparecimento de histidina do que aquela de bibliotecas de anticorpo habituais, sugerindo que as moléculas de ligação de antígeno que têm a propriedade desejada podem ser eficazmente obtidas.
(1-2) Projeto de conjunto (biblioteca de His) de moléculas de anticorpo que contêm resíduos de histidina em regiões variáveis, que permite a obtenção eficiente de anticorpo de ligação que ligase ao antígeno de maneira dependente do pH
[00437] Primeiro, as posições de introdução de histidina foram selecionadas para a biblioteca de His. WO2009125825 descreve que os anticorpos de ligação de antígeno dependentes do pH foram preparados pela substituição de resíduos de aminoácido nas sequências de um anticorpo do receptor de IL-6, um anticorpo de IL-6, e um anticorpo do receptor de IL-31 por histidina. Além disso, um anticorpo de lisozima anti-clara de ovo (FEBS Letter 11483, 309, 1, 8588) e um anticorpo antiepcidina (WO2009139822) tendo capacidade de ligação de antígeno dependente do pH foram preparados pela substituição de aminoácidos nas sequências de aminoácido de moléculas de ligação de antígeno por histidina. A Tabela 3 mostra as posições de introdução de histidina no anticorpo do receptor de IL-6, no anticorpo de IL-6, no anticorpo do receptor de IL-31, no anticorpo de lisozima de clara de ovo, e o anticorpo de hepcidina. As posições mostradas na Tabela 3 podem servir como candidatos de posições que podem controlar a ligação de antígeno-anticorpo. Além das posições mostradas na Tabela 3, as posições altamente acessíveis ao antígeno foram da mesma forma consideradas apropriadas como posições de introdução de histidina. Tabela 3
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[00438] Na biblioteca de His constituída por regiões variáveis de cadeia pesada e leve, as regiões variáveis de cadeia pesada usadas foram sequências de anticorpo humanas, ao mesmo tempo que histidina foi apresentada às regiões variáveis de cadeia leve. As posições listadas acima e posições que poderiam estar envolvidas na ligação de antígeno, isto é, posições 30, 32, 50, 53, 91, 92 e 93 (definidas pela numeração de Kabat; Kabat EA et al., 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) nas cadeias leves foram selecionadas como as posições de introdução de histidina para a biblioteca de His. Da mesma forma, uma sequência de Vk1 foi selecionada como uma sequência padrão de região variável de cadeia leve para introdução de histidina. Uma pluralidade de aminoácidos foi permitida aparecer a cada determinada posição na sequência padrão para ampliar a diversidade das moléculas de ligação de antígeno que constituem a biblioteca. As posições expostas na superfície nas regiões variáveis, que foram prováveis de interagir com antígenos foram selecionadas como a posição na qual a pluralidade de aminoácidos apareceu. Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 (definidas pela numeração de Kabat; Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) nas cadeias leves foram selecionadas como tais resíduos flexíveis.
[00439] Em seguida, os tipos e incidências dos resíduos de aminoácido que aparecem foram mencionados. Os aminoácidos nos resíduos flexíveis foram analisados quanto à sua frequência de aparecimento nas sequências de hVk1 e hVk3 registradas na base de dados de Kabat (KABAT, E.A. et al.: ‘Sequence of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Com base nos resultados de análise, os tipos de aminoácidos que aparecem na biblioteca de His foram selecionados dentre os aminoácidos com alta frequência de aparecimento em cada posição. Neste procedimento, os aminoácidos confirmados ter baixa frequência de aparecimento a partir dos resultados de análise foram da mesma forma selecionados para impedir as propriedades de aminoácido de ser desequilibradas. A frequência de aparecimento dos aminoácidos selecionados foi ajustada com referência aos resultados de análise da base de dados de Kabat.
[00440] Em relação aos aminoácidos desse modo selecionados e à frequência de aparecimento dos mesmos, duas bibliotecas de His foram projetadas: a biblioteca de His 1 ajustada com a condição de que cada CDR contivesse um resíduo de histidina sem exceção; e a biblioteca de His 2 que colocou mais ênfase na diversidade de sequência do que a biblioteca de His 1. O projeto detalhado da biblioteca de His 1 e da biblioteca de His 2 é mostrado nas Tabelas 4 e 5 ("Posição" em cada tabela representa a numeração de Kabat). A frequência de aparecimento de aminoácido descrita nas Tabelas 4 e 5 pode excluir Ser (S) na posição 94 definida pela numeração de Kabat no caso de Asn (N) na posição 92. Tabela 4
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Exemplo 2 Preparação de biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana (biblioteca de His 1) para obter ligação de anticorpo ao antígeno de maneira dependente do pH
[00441] Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi ampliada por PCR usando RNA de poli-A preparado a partir de PBMC humano, RNA de poli-A humano comercialmente disponível, ou similares como um padrão. Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo projetada como a biblioteca de His 1 descrita no Exemplo 1 foi ampliada usando PCR. Combinações das sequências na biblioteca de or gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e na biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo desse modo preparadas foram inseridas em vetores de fagomídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana que exibe domínios de Fab compostos de sequências de anticorpo humanas. O método de construção foi realizado com referência a Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100. Nesta construção da biblioteca, a sequência de uma biblioteca de exibição de fago foi usada, que compreendeu uma porção de ligador para ligação de proteína de fagomídeo Fab e fago pIII e uma sequência de clivagem tríptica inserida entre os domínios N2 e CT de proteína de fago pIII auxiliar. Porções de gene de anticorpo isoladas a partir de E. coli transformada com a biblioteca de gene de anticorpo foram sequenciadas para obter informação de sequência aproximadamente 132 clones. A Figura 1 mostra a distribuição de aminoácido projetada e uma distribuição de aminoácido na sequência confirmada. Uma biblioteca que compreende diversas sequências que correspondem à distribuição de aminoácido projetada foi construída. Exemplo 3 Obtenção de ligação de anticorpo a IL-6R de maneira dependente do pH
(3-1) Obtenção De Ligação De Fragmento De Anticorpo Ao Antígeno De Maneira Dependente Do Ph A Partir De Biblioteca Através De Paniculação De Conta
[00442] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de His 1 construída foi realizado pelo enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação de antígeno (IL-6R).
[00443] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para a exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionado a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitado foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00444] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM e Tween 20 a 0,1%), e em seguida também lavadas duas vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 7,6). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois de que as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa ER2738 E. coli em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infetada pelos fagos pela cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. O E. coli infetado foi inoculado a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00445] No segundo e subsequente ciclo de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas várias vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno como um índice, as contas suplementadas com 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois de que as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. As contas suplementadas com 0,1 mL de MES a 50 mM/CaCl2 a 1,2 mM/NaCl a 150 mM para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice, (pH 5,5) foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas de pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. Os fagos coletados foram adicionados a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, foram recuperados fagos de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago. Esta paniculação com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice foi realizada em 2 ciclos no total.
(3-2) Avaliação Por Elisa De Fago
[00446] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi recuperado de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida pelo método anterior.
[00447] Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST (PBS contendo Tween 20 a 0,1%) para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 7,6) ou CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 5,5) foi adicionada a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00448] 17 clones foram ELISA positivo especificamente de antígeno como resultado do ELISA de fago de 96 clones (depois de 2 ciclos de paniculação) enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno como um índice. Desse modo, as amostras derivadas a partir de 3 ciclos de paniculação foram analisadas. Por outro lado, 70 clones foram ELISA positivo como resultado do ELISA de fago de 94 clones (depois de 2 ciclos de paniculação) enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice. Desse modo, estas amostras derivadas a partir de 2 ciclos de paniculação foram analisadas.
[00449] Genes dos clones submetidos ao ELISA de fago foram amplificados usando iniciadores específicos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
[00450] Os resultados do ELISA de fago e análise de sequência são mostrados na Tabela 6 seguinte.
Figure img0037
[00451] Anticorpos que têm capacidade de ligação de antígeno dependente do pH foram obtidos por um método similar a partir de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento. 13 tipos de anticorpos de ligação dependentes do pH foram obtidos pela avaliação de 88 clones enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno como um índice. Da mesma forma, 27 tipos de anticorpos de ligação dependentes do pH foram obtidos pela avaliação de 83 clones enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice.
[00452] Estes resultados demonstraram que a biblioteca de His 1 produz mais variações de clones que têm capacidade de ligação de antígeno dependente do pH que aqueles da biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento.
(3-3) Expressão e purificação de anticorpo
[00453] O gene de cada clone julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como resultado do ELISA de fago foi introduzido aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(3-4) Avaliação De Anticorpo Obtido Quanto À Sua Capacidade De Ligação Dependente Do Ph Contra Receptor De Il-6 Humano
[00454] Para julgar a dependência de pH do atividade de ligação de receptor de IL-6 humano de anticorpos 6RpH#01 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 18 e cadeia leve: SEQ ID N°: 19), 6RpH#02 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 20 e cadeia leve: SEQ ID N°: 21) e 6RpH#03 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 22 e cadeia leve: SEQ ID N°: 23) obtidos na etapa (3-3), estes anticorpos foram analisados quanto à sua interação com receptores de IL-6 humanos usando Biacore T100 (GE Healthcare BioSciences Corp.). Tocilizumabe (cadeia pesada: SEQ ID N°: 24 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25) foi usado como um anticorpo de controle que não tem atividade de ligação dependente do pH contra receptores de IL-6 humanos. A interação de reação de antígeno-anticorpo foi analisada em soluções de pH 7,4 e pH 6,0 como condições de pH neutro e pH ácido, respectivamente. Aproximadamente de 300 RU de cada anticorpo de interesse foram capturados no Fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) com proteína A/G (Invitrogen Corp.) imobilizada nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento foram usados como tampões fluentes: ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4); e ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 6,0). Os receptores de IL-6 humanos foram da mesma forma diluídos com cada um destes tampões. O ensaio foi todo realizado a 37°C.
[00455] Na análise sobre a interação de reação de antígeno- anticorpo usando o tocilizumabe de anticorpo de controle, o anticorpo 6RpH#01, o anticorpo 6RpH#02 e o anticorpo 6RpH#03, a solução de receptor de IL-6 diluída ou um tampão fluente em branco foi injetado a uma taxa de fluxo de 5 μL/min durante 3 minutos para interagir os receptores de IL-6 com o anticorpo de tocilizumabe, o anticorpo 6RpH#01, o anticorpo 6RpH#02 ou o anticorpo 6RpH#03 capturados no fragmento de sensor. Em seguida, glicina-HCl a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor.
[00456] A Figura 2 mostra os sensógrafos dos anticorpos analisados em pH 7,4 pelo método anterior. A Figura 3 mostra os sensógrafos dos anticorpos sob a condição de pH 6,0 obtida por um método similar.
[00457] Como resultado, a capacidade de ligação do receptor de IL6 do anticorpo 6RpH#01, do anticorpo 6RpH#02 e do anticorpo 6RpH#03 foi observada ser reduzida drasticamente pela alteração do pH de tampão a partir de pH 7,4 para o pH 6,0. Exemplo 4 Preparação de biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana (biblioteca de His 2) para obter ligação de anticorpo ao antígeno de maneira dependente do pH
[00458] Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada por PCR usando RNA de poli-A preparado a partir de PBMC humano, RNA de poli-A humano comercialmente disponível, ou similares como um padrão. Para melhorar a frequência de aparecimento de anticorpos que têm capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como descrito no Exemplo 1, as porções de cadeia leve de regiões variáveis de anticorpo são projetadas de forma que a frequência de aparecimento dos resíduos de histidina em sítios para provavelmente servir como sítios de contato de antígeno, é realçada nestas porções de cadeia leve. Uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo é projetada, de forma que aminoácidos com alta frequência de aparecimento determinada a partir de informação sobre a frequência de aparecimento de aminoácidos em anticorpos humanos naturais são distribuídos uniformemente como resíduos de aminoácido diferentes dos resíduos introduzidos de histidina entre os resíduos flexíveis. A biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo desse modo projetada é sintetizada. A biblioteca pode ser preparada por terceirização de sua síntese para uma companhia confiada comercial ou similares. As combinações das sequências na biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e na biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo desse modo preparadas são inseridas em vetores de fagomídeo. Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana que exibe domínios de Fab compostos de sequências de anticorpo humanas é construída de acordo com um método conhecido na técnica (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Porções de gene de anticorpo isoladas a partir de E. coli transformada com a biblioteca de gene de anticorpo são sequenciadas de acordo com o método descrito no Exemplo 2. Exemplo 5 Obtenção de ligação de anticorpo a IL-6R de maneira dependente do pH
(5-1) Obtenção De Ligação De Fragmento De Anticorpo Ao Antígeno De Maneira Dependente Do Ph A Partir Da Biblioteca Por Paniculação De Conta
[00459] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de His 2 construída é realizado pelo enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6).
[00460] Os fagos são produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% é adicionado a culturas de E. coli que produziram fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitado é diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Subsequentemente, BSA ou leite desnatado é adicionado como um agente de bloqueio à solução de biblioteca de fago. O método de paniculação é realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas são contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00461] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina são adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas com um agente de bloqueio, os complexos de antígeno-fago são ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas são lavadas três vezes com 1 mL de TBST, e em seguida também lavadas duas vezes com 1 mL de TBS. Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas são suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas são separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada é adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli é infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada é inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos são recuperados a partir das culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00462] Nos segundo e subsequente ciclos de paniculação, os fagos são enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina são adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas com BSA ou leite desnatado, os complexos de antígeno- fago são ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas são lavadas com 1 mL de TBST e TBS. Para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno como um índice, as contas suplementadas com 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina são suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas são separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. As contas suplementadas com 0,1 mL de MES a 50 mM/CaCl2 a 1,2 mM/NaCl a 150 mM para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice, (pH 5,5) são suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas são separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. Os fagos coletados são adicionados a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli é infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada é inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos são coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago. A paniculação com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice é repetida várias vezes. (5-2) Avaliação por ELISA de fago
[00463] Um sobrenadante de cultura contendo fago é coletado de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida pelo método anterior.
[00464] Depois da adição de BSA e CaCl2, o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: a placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) é revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa é lavada com PBST para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade é bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado é adicionado a cada cavidade, e a placa é deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade é lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 7,6) ou CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 5,5) é adicionado a isto. A placa é deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM são adicionados a cada cavidade. A placa é incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) é adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade é terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida é analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00465] Os genes de fragmentos de anticorpo julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como resultado do ELISA de fago são amplificados como um padrão usando iniciadores específicos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
(5-3) Expressão de anticorpo e purificação
[00466] O gene de cada clone julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como resultado do ELISA de fago é apresentado aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo é realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) é suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL é inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade a uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados são transferidos para células por lipofecção. As células são cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos são purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada é medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo é calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(5-4) Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente do pH contra receptor de IL-6 humano
[00467] Para julgar a dependência de pH da atividade de ligação de receptor de IL-6 humano dos anticorpos obtidos no Exemplo 5, estes anticorpos são analisados quanto à sua interação com receptores de IL-6 humanos usando Biacore T100 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Tocilizumabe (cadeia pesada: SEQ ID N°: 24 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25) é usado como um anticorpo de controle que não tem atividade de ligação dependente do pH contra receptores de IL-6 humanos. A interação de reação de antígeno-anticorpo é analisada em soluções de pH 7,4 e pH 6,0 como condições de pH neutro e pH ácido, respectivamente. Cada anticorpo de interesse é capturado no Fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) com proteína A/G (Invitrogen Corp.) imobilizado nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento são usados como tampões fluentes: ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4); e ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 6,0). Oa receptores de IL-6 humanos são da mesma forma diluídos com cada um destes tampões. O ensaio é todo realizado a 37°C.
[00468] Na análise sobre a interação de reação de antígeno- anticorpo usando o tocilizumabe de anticorpo de controle e os anticorpos obtidos no Exemplo 5, a solução de receptor de IL-6 diluída ou um tampão fluente em branco é injetado para interagir os receptores de IL-6 com os anticorpos capturados no fragmento de sensor. Em seguida, glicina-HCl a 10 mM (pH 1,5) é injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor. Sensógrafos sob a condição de pH 6,0 são da mesma forma obtidos por um método similar. Exemplo 6 Pesquisa quanto à ligação de sequência de linha germinativa humana ao íon de cálcio
(6-1) Ligação de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de cálcio
[00469] Um anticorpo que liga-se a um antígeno de uma maneira dependente de cálcio (anticorpo de ligação de antígeno dependente de cálcio) é um anticorpo, cuja interação com o antígeno que depende da concentração de íon de cálcio é alterada. Uma vez que é considerado que o anticorpo de ligação de antígeno dependente de cálcio liga-se ao antígeno por meio de íons de cálcio, aminoácidos que constituem epítopos de antígeno são aminoácidos negativamente carregados capazes de quelar os íons de cálcio ou aminoácidos que podem servir como aceptores de ligação de hidrogênio (Figura 4B). Por causa das propriedades de tais aminoácidos de constituição de epítopo, o anticorpo de ligação de antígeno dependente de cálcio é capaz de alvejar um epítopo diferente daquele para a molécula de ligação de antígeno dependente do pH preparada pela introdução de resíduos de histidina como mostrado na Figura 4A. Além disso, o uso de moléculas de ligação de antígeno que têm a propriedade de ligar-se a antígenos igualmente de maneiras dependentes de cálcio e dependentes do pH como mostrado na Figura 4C, pode obter a preparação de moléculas de ligação de antígeno capazes de alvejar individualmente diversos epítopos que têm uma ampla faixa de propriedades. Isto sugere que o anticorpo de ligação de antígeno dependente de cálcio possa ser eficazmente obtido, se um conjunto de moléculas que compreendem motivos de ligação de cálcio (biblioteca de Ca) é construído e moléculas de ligação de antígeno são obtidas a partir deste conjunto de moléculas.
(6-2) Obtenção de sequência de linha germinativa humana
[00470] Um possível exemplo do conjunto de moléculas que compreendem motivos de ligação de cálcio é um conjunto de anticorpos como as moléculas. Em outras palavras, um possível exemplo da biblioteca de Ca é uma biblioteca de anticorpo que compreende motivos de ligação de cálcio.
[00471] Nenhum de anticorpos previamente relatados que compreendem sequências de linha germinativa humanas liga-se aos íons de cálcio. Desse modo, para determinar se ou não anticorpos que compreendem sequências de linha germinativa humanas ligam-se aos íons de cálcio, os DNAs de sequência de linha germinativa de anticorpos que compreendem sequências de linha germinativa humanas foram clonados usando, como um padrão, cDNAs preparados a partir de Human Fetal Spleen Poly RNA (Clontech Laboratories, Inc.). Os fragmentos de DNA clonados foram inseridos em vetores de expressão para células animais. Os vetores de expressão obtidos foram sequenciados por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. SEQ ID N°s de sequências de aminoácido codificadas pelas determinadas sequências de nucleotídeo são mostradas na Tabela 7. Um polinucleotídeo que codifica a sequência de SEQ ID N°: 6 (Vk1), SEQ ID N°: 7 (Vk2), SEQ ID N°: 8 (Vk3), SEQ ID N°: 9 (Vk4) ou SEQ ID N°: 1 (Vk5) foi ligado por PCR a um polinucleotídeo que codifica uma região constante de cadeia capa natural (SEQ ID N°: 26). Os fragmentos de DNA resultantes foram separadamente incorporados em vetores para expressão em células animais. Da mesma forma, um polinucleotídeo de região variável de cadeia pesada que codifica a sequência de SEQ ID N°: 27 (Vk1), SEQ ID N°: 28 (Vk2), SEQ ID N°: 29 (Vk3) ou SEQ ID N°: 30 (Vk4) foi ligado por PCR a um polinucleotídeo que codifica IgG1 sem 2-aminoácidos de C-terminal na sequência de SEQ ID N°: 14. Os fragmentos de DNA resultantes foram separadamente incorporados em vetores para expressão em células animais. As sequências das formas modificadas preparadas foram confirmadas por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Neste contexto, Vk1 humana é da mesma forma chamada hVk1; Vk2 humana é da mesma forma chamada hVk2; Vk3 humana é da mesma forma chamada hVk3; e Vk4 humana é da mesma forma chamada hVk4. Tabela 7
Figure img0038
(6-3) Purificação e expressão de anticorpo
[00472] Os vetores para expressão em células animais que têm a inserção de fragmento de DNA codificando cada um dos 5 tipos de sequências de linha germinativa humanas desse modo obtidas, foram transfectados para células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transferidos para as células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 24112423).
(6-4) Avaliação de anticorpo que compreende sequência de linha germinativa humana para sua atividade de ligação de íon de cálcio
[00473] Os anticorpos purificados foram avaliados quanto a sua atividade de ligação de íon de cálcio. A temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) foi medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal) como um índice para avaliar a ligação de íon de cálcio dos anticorpos. A temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) serve como um índice para estabilidade e fica mais alta quando uma proteína é estabilizada por ligação de íon de cálcio, comparado com a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de uma proteína não ligada ao íon de cálcio (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Para avaliar a atividade de ligação do anticorpo contra íons de cálcio, a alteração no valor de Tm de cada anticorpo de acordo com a alteração na concentração de íon de cálcio na solução de anticorpo foi avaliada. Os anticorpos purificados foram dialisados (EasySEP, Tomy Seiko Co., Ltd.) contra uma solução que contém Tris- HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 2 mM (pH 7,4) ou contendo Tris-HCl a 20 mM, NaCI a 150 mM e CaCh a 3 μM (pH 7,4) como uma solução externa. Cada solução de anticorpo foi ajustada a aproximadamente 0,1 mg/mL com a solução usada na diálise e submetida como uma substância teste para ensaio de DSC a 20°C a 115°C com a taxa de elevação de temperatura ajustada a 240°C/hr. A Tabela 8 mostra a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de cada domínio de Fab de anticorpo calculada com base na curva de desnaturação de DSC obtida. Tabela 8
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[00474] Como resultado, o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo que compreende a sequência hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 não variou, dependendo da concentração de íons de cálcio na solução que contém o domínio de Fab. Em comparação, o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo que compreende a sequência hVk5 variou, dependendo da concentração de íons de cálcio na solução de anticorpo que contém o domínio de Fab, mostrando que a sequência hVk5 liga-se aos íons de cálcio.
(6-5) Avaliação da sequência hVk5-2 para ligação de cálcio
[00475] Além de Vk5-2 (SEQ ID N°: 1 fundida com SEQ ID N°: 26), variante de Vk5-2 1 (SEQ ID N°: 2) e variante de Vk5-2 2 (SEQ ID N°: 3) classificadas como Vk5-2 foram obtidas no Exemplo 6(6-2). Estas variantes foram avaliadas da mesma forma quanto à sua ligação de cálcio. Os fragmentos de DNA de Vk5-2, variante de Vk5- 2 1 e variante de Vk5-2 2 foram separadamente incorporados em vetores de expressão para células animais. Os vetores de expressão obtidos foram sequenciados por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Células animais foram cotransfectadas com cada vetor de expressão para células animais que têm a inserção do fragmento de DNA de Vk5-2, variante de Vk5- 2 1 ou variante de Vk5-2 2 e um vetor para expressão em células animais que têm uma inserção de DNA que codifica uma CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 4) a ser expressa, pelo método descrito no Exemplo 6(6-3). Os anticorpos obtidos foram purificados. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto a sua atividade de ligação de íon de cálcio. Os anticorpos purificados foram dialisados (EasySEP, Tomy Seiko Co., Ltd.) contra uma solução que contém Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 2 mM (pH 7,5) ou contendo Tris-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 7,5) (a última solução é indicada por "Concentração de íon de cálcio": 0 mM na Tabela 9) como uma solução externa. Cada solução de anticorpo foi ajustada a aproximadamente 0,1 mg/mL com a solução usada na diálise e submetida como uma substância teste a ensaio de DSC a 20°C a 115°C com a taxa de elevação de temperatura ajustada a 240°C/hr. A Tabela 9 mostra a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de cada domínio de Fab de anticorpo calculada com base na curva de desnaturação de DSC obtida.
Figure img0040
[00476] Como resultado, o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo que compreende a sequência Vk5-2, variante de Vk5-2 1 ou variante de Vk5-2 2 variou, dependendo da concentração de íons de cálcio na solução de anticorpo que contém o domínio de Fab, mostrando que o anticorpo que tem a sequência classificada em Vk5-2 liga-se aos íons de cálcio. Exemplo 7 Avaliação da sequência Vk5 humana (hVk5)
(7-1) sequência hVk5
[00477] Apenas a sequência hVk5-2 é registrada como uma sequência hVk5 na base de dados de Kabat. Em seguida, hVk5 e hVk5-2 serão tratadas sinonimicamente. WO2010136598 descreve que a relação de abundância da sequência hVk5-2 é 0,4% dentre sequências de linha germinativa. Outros relatos da mesma forma declaram que a relação de abundância da sequência hVk5-2 é 0 a 0,06% dentre sequências de linha germinativa (J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; e Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). Uma vez que a sequência hVk5-2 tem baixa frequência de aparecimento entre sequências de linha germinativa como descrito acima, a obtenção de anticorpos de ligação de cálcio a partir de uma biblioteca de anticorpo constituída por sequências de linha germinativa humanas ou a partir de células B obtidas pela imunização de camundongos de expressão de anticorpo humano pareceu ser ineficiente. Isto poderia torná-la razoável para projetar uma biblioteca de Ca que compreende sequências hVk5-2 humanas. Bibliotecas de anticorpo sintéticas previamente relatadas (WO2010105256 ou WO2010136598), entretanto, não incluem a sequência hVk5. Além disso, as propriedades fisicoquímicas da sequência hVk5-2 não foram relatadas, e a viabilidade das mesmas foi desconhecida.
(7-2) Construção, expressão e purificação da sequência hVk5-2 não glicosilada
[00478] A sequência hVk5-2 tem uma sequência com um aminoácido N-glicosilado potencial na posição 20 (definida pela numeração de Kabat). É desejável a partir do ponto de vista da homogeneidade de substância, que proteínas deveriam evitar ser glicosiladas, porque as cadeias de açúcar adicionadas às proteínas causam heterogeneidade. Desse modo, uma forma modificada hVk5- 2_L65 (SEQ ID N°: 5) foi preparada pela substituição do resíduo de Asn (N) na posição 20 (definida pela numeração de Kabat) por um resíduo de Thr (T). A substituição de aminoácido foi realizada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.). O DNA que codifica a forma modificada hVk5-2_L65 foi incorporado em vetores para expressão em células animais. As células animais foram cotransfectadas com o vetor preparado para expressão em células animais que têm a inserção de DNA da forma modificada hVk5-2_L65 e um vetor para expressão em células animais que têm uma inserção de DNA que codifica uma CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 4) a ser expressa, pelo método descrito no Exemplo 6. Um anticorpo que compreende hVk5-2_L65 e CIM_H foi expresso pelas células animais transfectadas e purificado pelo método descrito no Exemplo 6.
(7-3) Avaliação de anticorpo que compreende sequência hVk5-2 não glicosilada para suas propriedades fisicoquímicas
[00479] Se ou não a heterogeneidade do anticorpo obtido que compreende a sequência modificada hVk5-2_L65 foi reduzida com respeito àquela de um anticorpo que compreende a sequência hVk5-2 original submetida à modificação, foi analisada usando cromatografia de permuta de íon. A cromatografia de permuta de íon foi realizada por um método mostrado na Tabela 10. Os resultados de análise demonstraram que, como mostrado na Figura 5, hVk5-2_L65 modificada no sítio de glicosilação a partir da sequência hVk5-2 tem menos heterogeneidade do que àquela da sequência hVk5-2 original. Tabela 10
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[00480] Em seguida, o anticorpo que compreende a sequência hVk5- 2_L65 que tem heterogeneidade reduzida foi avaliado quanto à sua capacidade de ligar-se aos íons de cálcio pelo método descrito no Exemplo 6. Como resultado, como mostrado na Tabela 11, o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo que compreende hVk5-2_L65 modificada no sítio de glicosilação da mesma forma variou, dependendo da alteração na concentração de íons de cálcio na solução de anticorpo. Isto mostrou que íons de cálcio ligam-se ao domínio de Fab do anticorpo que compreende hVk5-2_L65 modificada no sítio de glicosilação. Tabela 11
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Exemplo 8 Avaliação da molécula de anticorpo que compreende a sequência de CDR hVk5-2 para sua atividade de ligação de íon de cálcio
(8-1) Preparação, expressão e purificação de anticorpo construído que compreende sequência de CDR hVk5-2
[00481] A sequência hVk5-2_L65 é uma sequência modificada a partir da sequência de Vk5-2 humana por substituição de aminoácido no sítio de glicosilação na região de estrutura. O Exemplo 7 mostrou que íons de cálcio ligam-se até mesmo ao anticorpo que compreende a sequência modificada no sítio de glicosilação. As sequências de linha germinativa foram geralmente desejáveis como sequências de estrutura a partir do ponto de vista de imunogenicidade. Desse modo, um estudo foi feito sobre se ou não pode substituir as sequências de estrutura de um anticorpo por sequências de estrutura de linha germinativa não glicosilada, ao mesmo tempo que a atividade de ligação de íon de cálcio do anticorpo foi mantida.
[00482] Um polinucleotídeo que codifica uma sequência modificada a partir da sequência hVk5-2 quimicamente sintetizada pela substituição de suas sequências de estrutura com sequências hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 (as sequências modificadas foram designadas como CaVkl (SEQ ID N°: 31), CaVk2 (SEQ ID N°: 32), CaVk3 (SEQ ID N°: 33) e CaVk4 (SEQ ID N°: 34), respectivamente) foi ligado por PCR a um polinucleotídeo que codifica uma região constante de cadeia capa natural (SEQ ID N°: 26). Os fragmentos de DNA resultantes foram separadamente incorporados em vetores para expressão em células animais. As sequências das formas modificadas preparadas foram confirmadas por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. As células animais foram desse modo cotransfectadas com cada plasmídeo preparado e um plasmídeo que tem uma inserção de um polinucleotídeo que codifica CIM_H (SEQ ID N°: 4), pelo método descrito no Exemplo 6. As moléculas de anticorpo desejadas desse modo expressas foram purificadas a partir de fluido de cultura das células animais transfectadas.
(8-2) Avaliação de anticorpo construído que compreende a sequência de CDR hVk5-2 para sua atividade de ligação de íon de cálcio
[00483] Os anticorpos construídos que compreendem as sequências de estrutura da sequência de linha germinativa (hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4) diferente da sequência hVk5-2 e das sequências de CDR da sequência hVk5-2 foram avaliadas para à sua capacidade de ligar-se aos íons de cálcio pelo método descrito no Exemplo 6. Os resultados de avaliação são mostrados na Tabela 12. O valor de Tm do domínio de Fab de cada anticorpo construído foram mostrados variar, dependendo da alteração na concentração de íon de cálcio na solução de anticorpo. Estes resultados demonstraram que o anticorpo que compreende as sequências de estrutura diferentes das sequências de estrutura hVk5-2 da mesma forma liga-se aos íons de cálcio. Tabela 12
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[00484] Como também está evidente a partir dos resultados, a temperatura de desnaturação térmica (Tm), um índice para estabilidade térmica, do domínio de Fab de cada anticorpo modificado para compreender as sequências de estrutura da sequência de linha germinativa (hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4) diferente da sequência hVk5-2 e das sequências de CDR da sequência hVk5-2 foi mais alta do que aquela do domínio de Fab do anticorpo que compreende a sequência hVk5-2 original submetida à modificação. A partir deste resultado, o anticorpo que compreende as sequências de estrutura hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 e as sequências de CDR hVk5-2 foi constatado ser uma molécula que teve a propriedade de ligação aos íons de cálcio e foi da mesma forma excelente a partir do ponto de vista de estabilidade térmica. Exemplo 9 Identificação de sítio de ligação de íon de cálcio presente na sequência hVk5-2 de linha germinativa humana
(9-1) Projeto de sítio de mutação na sequência de CDR da sequência hVk5-2
[00485] Como descrito no Exemplo 8, os anticorpos que compreendem cadeias leves com os domínios de CDR da sequência hVk5-2 introduzida nas sequências de estrutura de uma sequência de linha germinativa diferente mostraram da mesma forma ligarem-se aos íons de cálcio. Este resultado sugeriu que o sítio de ligação de íon de cálcio presente em hVk5-2 ficava situado em CDR. Os exemplos de aminoácidos que ligam-se aos íons de cálcio, isto é, quelação de íons de cálcio, incluem aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos que podem servir como aceptores de ligação de hidrogênio. Desse modo, anticorpos que compreendem uma sequência hVk5-2 variante mutada a partir da sequência hVk5-2 pela substituição de resíduos de Asp (D) e/ou Glu (E) nas sequências de CDR pelos resíduos de Ala (A) foram avaliados quanto à sua capacidade de ligar-se aos íons de cálcio.
(9-2) Preparação de variante substituída por Ala de sequência hVk5-2 e expressão e purificação de anticorpo
[00486] As moléculas de anticorpo foram preparadas, as quais compreenderam cadeias leves com resíduos de Ala modificados a partir dos resíduos de Asp e/ou Glu apresentados nas sequências de CDR hVk5-2. Como descrito no Exemplo 7, a forma modificada hVk5- 2_L65 não glicosilada manteve a ligação de íon de cálcio, e portanto parece ser equivalente à sequência hVk5-2 a partir do ponto de vista da propriedade de ligação aos íons de cálcio. Neste Exemplo, a substituição de aminoácido foi realizada com hVk5-2_L65 como uma sequência padrão. As formas modificadas preparadas são mostradas na Tabela 13. A substituição de aminoácido foi realizada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.), PCR, In fusion Advantage PCR cloning kit (Takara Bio Inc.), ou similares. Os vetores de expressão para as cadeias leves modificadas pela substituição de aminoácido foram construídos. Tabela 13
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[00487] Os vetores de expressão obtidos foram sequenciados por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. A linhagem HEK293H derivada de célula de rim embrionária humana (Invitrogen Corp.) ou Células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi transitoriamente cotransfectada com o vetor de expressão preparado para cada cadeia leve modificada e um vetor de expressão para uma CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 4) para expressar anticorpos. Cada anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (GE Healthcare BioSciences Corp.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(9-3) Avaliação de anticorpo que compreende variante substituída por Ala da sequência hVk5-2 para sua atividade de ligação de íon de cálcio
[00488] Se ou não os anticorpos purificados obtidos ligados aos íons de cálcio, foi determinado pelo método descrito no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Tabela 14. Os valores de Tm dos domínios de Fab de alguns anticorpos não variaram, dependendo da alteração na concentração de íon de cálcio nas soluções de anticorpo, como resultado da substituição dos resíduos de Asp e/ou Glu apresentados nas sequências de CDR da sequência hVk5-2 por resíduos de Ala, que não puderam participar na ligação ou quelação de íons de cálcio. Os sítios de substituição que não causaram variações nos valores de Tm até mesmo por substituição por Ala (posições 32 e 92 (definidas pela numeração de Kabat)) mostraram ser particularmente importantes para a ligação de íon de cálcio dos anticorpos. Tabela 14
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Exemplo 10 Avaliação de anticorpo que compreende sequência hVk1 que tem motivo de ligação de íon de cálcio
(10-1) Preparação da sequência hVkl que tem motivo de ligação de íon de cálcio e expressão e purificação de anticorpo
[00489] Os resultados sobre a atividade de ligação de cálcio das variantes substituídas por Ala descritos no Exemplo 9 mostraram que os resíduos de Asp e Glu nas sequências de CDR da sequência hVk5- 2 são importantes para ligação de cálcio. Desse modo, os anticorpos preparados pela introdução de apenas resíduos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidos pela numeração de Kabat) na sequência de região variável de uma sequência de linha germinativa diferente foram avaliados quanto à sua capacidade de ligar-se aos íons de cálcio. Especificamente, uma forma modificada LfVk1_Ca (SEQ ID N°: 43) foi preparada pela substituição de resíduos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidas pela numeração de Kabat) na sequência de linha germinativa humana hVk1 por resíduos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidos pela numeração de Kabat) na sequência hVk5-2. A presença ou ausência de capacidade de ligação de cálcio foi determinada sobre um anticorpo que compreende a sequência hVk1 com apenas estes cinco resíduos derivados da sequência hVk5-2 introduzidos nisso. A preparação da forma modificada foi realizada da mesma maneira como no Exemplo 9. A cadeia leve modificada LfVk1_Ca obtida desse modo ou LfVk1 (SEQ ID N°: 44) compreendendo a sequência hVkl de cadeia leve foi coexpressa com uma CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 4). A expressão e purificação de anticorpo foram realizadas da mesma maneira como no Exemplo 9.
(10-2) Avaliação de anticorpo que compreende sequência hVkl humana que tem motivo de ligação de íon de cálcio para sua atividade de ligação de íon de cálcio
[00490] Se ou não os anticorpos purificados desse modo obtidos ligam-se aos íons de cálcio, foi determinado pelo método descrito no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Tabela 15. O valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo que compreende LfVk1 que tem a sequência hVk1 não variou, dependendo da alteração na concentração de cálcio na solução de anticorpo. Em comparação, o valor de Tm da sequência de anticorpo que compreende LfVk1_Ca foi alterado por 1°C ou mais dependendo da alteração na concentração de cálcio na solução de anticorpo, mostrando que o anticorpo que compreende LfVk1_Ca liga-se ao cálcio. Estes resultados não demonstraram que a sequência de CDR hVk5-2 total é requerida para ligação de íon de cálcio e apenas os resíduos introduzidos por construir a sequência de LfVk1_Ca são suficientes para a ligação. Tabela 15
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(10-3) Construção, expressão e purificação da sequência LfVk1 Ca antidegradação
[00491] No Exemplo 10(10-1), a forma modificada LfVk1_Ca (SEQ ID N°: 43) foi preparada pela substituição de resíduos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidos pela numeração de Kabat) na sequência de linha germinativa humana hVk1 por resíduos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidos pela numeração de Kabat) na sequência hVk5-2, e mostrou ligar-se aos íons de cálcio. Isto poderia torná-la razoável para projetar uma biblioteca de Ca que compreende sequências LfVk1_Ca. Uma vez que as propriedades fisicoquímicas da sequência LfVk1_Ca não foram relatadas, a viabilidade da mesma foi desconhecida. A sequência LfVk1_Ca continha Asp nas posições 30, 31 e 32 (definidas pela numeração de Kabat) e continha, em sua sequência de CDR1, uma sequência de Asp-Asp de acordo com o relato degradável em uma condição ácida (J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47 (1), 23-30). A partir do ponto de vista de estabilidade durante o armazenamento, é desejável evitar a degradação sob a condição ácida. Desse modo, as formas modificadas LfVk1_Ca1 (SEQ ID N°: 45), LfVk1_Ca2 (SEQ ID N°: 46) e LfVk1_Ca3 (SEQ ID N°: 47) foram preparadas pela substituição de resíduos de Asp degradáveis (D) pelos resíduos de Ala (A). A substituição de aminoácido foi realizada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.). DNA que codifica cada forma modificada foi incorporado em vetores para expressão em células animais. As células animais foram cotransfectadas com o vetor preparado para expressão em células animais que têm a inserção de DNA de cada forma modificada e um vetor para expressão em células animais que têm uma inserção de DNA que codifica uma GC_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 48) a ser expressa, pelo método descrito no Exemplo 6. Os anticorpos expressos nas células animais transfectadas foram purificados pelo método descrito no Exemplo 6.
(10-4) Avaliação de estabilidade sobre o anticorpo que compreende a sequência LfVkl Ca antidegradação
[00492] Se ou não a degradação de cada anticorpo obtida no Exemplo 10(10-3) foi reduzida em uma solução de pH 6,0 comparada com um anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca original submetida à modificação, foi avaliado pela comparação de heterogeneidade depois da aceleração térmica entre os anticorpos. Cada anticorpo foi dialisado durante a noite contra uma solução que contém histidina-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 6,0) sob condições de 4°C. O anticorpo dialisado foi ajustado a 0,5 mg/mL e armazenado a 5°C ou 50°C durante 3 dias. Cada anticorpo desse modo armazenado foi submetido à cromatografia de permuta de íon pelo método descrito no Exemplo 7. Os resultados de análise demonstraram que, como mostrado na Figura 6, LfVk1_Ca1 modificada no sítio de degradação tem menos heterogeneidade do que àquela da sequência LfVk1_Ca original e sua degradação por aceleração térmica é significativamente reduzida. Estes resultados demonstraram que a degradação ocorre no resíduo de Asp (D) localizado na posição 30 na sequência LfVk1_Ca e pode ser evitada por modificação de aminoácido.
(10-5) Preparação de sequência LVk1 Ca de cadeia leve de degradação de resíduo anti-Asp30 e expressão e purificação de anticorpo
[00493] Os resultados de antidegradação da variante substituída por Ala descritos no Exemplo 10(10-4) mostraram que a degradação sob a condição ácida ocorre no resíduo de Asp (D) na posição 30 (definida pela numeração de Kabat) na sequência de CDR da sequência LfVk1_Ca e pode ser inibida pela substituição do resíduo 30 (definido pela numeração de Kabat) por outro aminoácido (no Exemplo 10(10-4), por um resíduo de Ala (A)). Desse modo, uma sequência (chamada LfVk1_Ca6; SEQ ID N°: 49) preparada pela substituição do resíduo 30 (definido pela numeração de Kabat) por um resíduo de Ser (S), um resíduo típico capaz de quelação de íons de cálcio, foi avaliado quanto à presença ou ausência de inibição de degradação. A preparação da forma modificada foi realizada da mesma maneira como no Exemplo 10. A LfVk1_Ca6 de cadeia leve modificada obtida ou a sequência LfVk1_Ca de cadeia leve foi coexpressa com uma GC_H de cadeia pesada (SEQ ID N°: 48). As expressão e purificação de anticorpo foram realizadas da mesma maneira como no Exemplo 10.
(10-6) Avaliação da sequência LVk1 Ca de cadeia leve de degradação de resíduo anti-Asp30
[00494] A estabilidade de preservação dos anticorpos purificados desse modo obtida sob a condição ácida foi determinada pelo método descrito no Exemplo 10(10-4). Os resultados demonstraram que, como mostrado na Figura 7, a degradação do anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca6 é mais inibida do que o anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca original.
[00495] Além disso, se ou não o anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca e o anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca6 ligada aos íons de cálcio foi determinado pelo método descrito no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Tabela 16. Os Valores de Tm dos domínios de Fab do anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca e do anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca6 antidegradação são cada qual alterados por 1°C ou mais dependendo da alteração na concentração de cálcio nas soluções de anticorpo. Tabela 16
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Exemplo 11 Projeto de conjunto (biblioteca de Ca) de moléculas de anticorpo que contêm motivos de ligação de íon de cálcio em regiões variáveis que permite obtenção eficiente de anticorpo de ligação que liga-se ao antígeno de maneira dependente da concentração de íon de cálcio
[00496] Exemplos preferidos de motivos de ligação de cálcio incluem uma sequência hVk5-2 e suas sequências de CDR, e também, resíduos reduzidos 30, 31, 32, 50 e 92 (definidos pela numeração de Kabat). Além disso, o motivo EF hand (calmodulina, etc.) de uma proteína de ligação de cálcio e um lectina tipo C (ASGPR, etc.) da mesma forma corresponde aos motivos de ligação de cálcio.
[00497] A biblioteca de Ca é constituída por regiões variáveis de cadeia pesada e leve. As regiões variáveis de cadeia pesada usadas foram sequências de anticorpo humanas, ao mesmo tempo que os motivos de ligação de cálcio foram apresentados às regiões variáveis de cadeia leve. Uma sequência hVk1 foi selecionada como uma sequência padrão de região variável de cadeia leve para introdução de motivo de ligação de cálcio. Como mostrado no Exemplo 10, o anticorpo que compreende a sequência LfVk1_Ca, em que a sequência de CDR hVk5-2 foi introduzida como um motivo de ligação de cálcio na sequência hVk1 mostrou ligar-se aos íons de cálcio. Vários aminoácidos foram permitidos aparecer em cada determinada posição na sequência padrão para ampliar a diversidade das moléculas de ligação de antígeno que constituem a biblioteca. As posições expostas na superfície nas regiões variáveis que foram prováveis de interagir com antígenos foram selecionadas como a posição à qual a pluralidade de aminoácidos apareceu. Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 (definidos pela numeração de Kabat) foram selecionadas como tais resíduos flexíveis.
[00498] Em seguida, os tipos e incidências dos resíduos de aminoácido que aparecem foram mencionados. Os aminoácidos nos resíduos flexíveis foram analisados quanto à sua frequência de aparecimento nas sequências hVk1 e hVk3 registradas na base de dados de Kabat (KABAT, E.A. et al.: ‘Sequence of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Com base nos resultados de análise, os tipos de aminoácidos que aparecem na biblioteca de Ca foram selecionados dentre aminoácidos com alta frequência de aparecimento em cada posição. Neste procedimento, aminoácidos que confirmaram ter baixa frequência de aparecimento a partir dos resultados de análise, foram da mesma forma selecionados para impedir as propriedades de aminoácido de serem desequilibradas. A frequência de aparecimento dos aminoácidos selecionados foi ajustada com referência aos resultados de análise da base de dados de Kabat.
[00499] Em relação aos aminoácidos desse modo selecionados e à frequência de aparecimento dos mesmos, a biblioteca de Ca seguinte foi projetada: uma biblioteca de Ca que colocou ênfase na diversidade de sequência para compreender os motivos de ligação de cálcio e uma pluralidade de aminoácidos em cada resíduo diferente dos motivos. O projeto detalhado da biblioteca de Ca é mostrado nas Tabelas 17 e 18 ("Posição" em cada tabela representa a numeração de Kabat). A frequência de aparecimento de aminoácido descrita nas Tabelas 17 e 18 pode adotar Leu (L) em vez de Ser (S) na posição 94 definida pela numeração de Kabat no caso de Asn (N) na posição 92. Tabela 17
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Exemplo 12 Preparação da biblioteca de Ca
[00500] Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada por PCR usando RNA de poli-A preparado a partir de PBMC humano, RNA de poli-A humano comercialmente disponível, ou similares como um padrão. As porções de cadeia leve de regiões variáveis de anticorpo foram projetadas para realçar a frequência de aparecimento de anticorpos que mantiveram motivos de ligação de cálcio e foram capazes de ligação a antígenos de uma maneira dependente da concentração de cálcio, como descrito no Exemplo 11. Uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo foi projetada com referência a informação sobre a frequência de aparecimento de aminoácidos em anticorpos humanos naturais (KABAT, E.A. et al.:'Sequence of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION) de forma que aminoácidos com alta frequência de aparecimento nas sequências de anticorpo humanas naturais foram uniformemente distribuídos como resíduos de aminoácido diferentes dos resíduos introduzidos em motivo de ligação de cálcio entre os resíduos flexíveis. Combinações das sequências na biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo e na biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo desse modo preparadas foram inseridas em vetores de fagomídeo. Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana que exibe domínios de Fab compostos de sequências de anticorpo humanas (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100) foi construída.
[00501] Porções de gene de anticorpo isoladas a partir de E. coli transformadas com a biblioteca de gene de anticorpo foram sequenciadas de acordo com o método descrito no Exemplo 2. A Figura 8 mostra uma distribuição de aminoácido nas sequências de 290 tipos de clones desse modo obtidos e a distribuição de aminoácido projetada. Exemplo 13 Avaliação de molécula contida na biblioteca de Ca para sua atividade de ligação de íon de cálcio
(13-1) Atividade de ligação de íon de cálcio de molécula contida na biblioteca de Ca
[00502] Uma vez que a sequência hVk5-2 mostrada ligar-se aos íons de cálcio tem baixa frequência de aparecimento entre sequências de linha germinativa como mostrado no Exemplo 7, a obtenção de anticorpos de ligação de cálcio a partir de uma biblioteca de anticorpo constituída por sequências de linha germinativa humanas ou a partir de células B obtidas pela imunização de camundongos de expressão de anticorpo humano pareceu ser ineficiente. Desse modo, a biblioteca de Ca foi construída no Exemplo 12. A biblioteca de Ca construída foi avaliada quanto à presença ou ausência de clones que exibem ligação de cálcio.
(13-2) Expressão e purificação de anticorpo
[00503] O gene de cada clone contido na biblioteca de Ca foi introduzido aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(13-3) Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua ligação de íon de cálcio
[00504] Se ou não os anticorpos purificados desse modo obtidos ligam-se aos íons de cálcio, foi determinado pelo método descrito no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Tabela 19. Os Valores de Tm dos domínios de Fab de uma pluralidade de anticorpos contidos na biblioteca de Ca variaram, dependendo da concentração de íon de cálcio, mostrando que a biblioteca de Ca contém moléculas que ligam- se aos íons de cálcio. Tabela 19
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Exemplo 14 Obtenção de ligação de anticorpo ao receptor de IL-6 de maneira dependente de Ca
(14-1) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca por método de paniculação de conta
[00505] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de Ca construída foi realizado pelo enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6).
[00506] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionado a culturas de E. coli que produziram fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00507] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBST contendo CaCl2 a 1,2 mM), e em seguida também lavadas duas vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,40,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00508] No segundo ciclo de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente de Ca como um índice.
[00509] Especificamente, para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno como um índice, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e duas vezes com CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00510] Para o enriquecimento com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA a 2 mM) foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
(14-2) Avaliação por ELISA de fago
[00511] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida pelo método anterior.
[00512] Depois da adição de BSA e CaCl2, o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: a placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS ou EDTA a 1 mM/TBS foi adicionado a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00513] Genes dos clones submetidos ao ELISA de fago foram amplificados usando iniciadores específicos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo. Os resultados do ELISA de fago e análise de sequência são mostrados na Tabela 20 seguinte. Tabela 20
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(14-3) Expressão e purificação de anticorpo
[00514] O gene de cada clone julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foi introduzido aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(14-4) Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente de Ca contra receptor de IL-6 humano
[00515] Para julgar a dependência de Ca da atividade de ligação de receptor de IL-6 humano de anticorpos 6RC1IgG_010 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 72 e cadeia leve: SEQ ID N°: 73), 6RC1IgG_012 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 74 e cadeia leve: SEQ ID N°: 75) e 6RC1IgG_019 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 76 e cadeia leve: SEQ ID N°: 77) obtida no Exemplo 14, estes anticorpos foram analisados quanto à sua interação com receptores de IL-6 humanos usando Biacore T100 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Tocilizumabe (cadeia pesada: SEQ ID N°: 24 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25) foi usado como um anticorpo de controle que não tem atividade de ligação dependente de Ca contra receptores de IL-6 humanos. A interação foi analisada em soluções de concentrações de íon de cálcio a 1,2 mM e 3 μM como condições de concentração com alto teor de íon de cálcio e concentração com baixo teor de íon de cálcio, respectivamente. Cada anticorpo de interesse foi capturado em Fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare BioSciences Corp.) com proteína A/G (Invitrogen Corp.) imobilizado nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento foram usados como tampões fluentes: ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4); e ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v), e CaCl2 a 3 μM (pH 7,4). Os receptores de IL- 6 humanos foram da mesma forma diluídos com cada um destes tampões. Esses ensaios foram todos realizados a 37°C.
[00516] Na análise sobre a interação de reação de antígeno- anticorpo usando o tocilizumabe de anticorpo de controle, o anticorpo 6RC1IgG_010, o anticorpo 6RC1IgG_012 e o anticorpo 6RC1IgG_019, a solução de receptor de IL-6 diluída ou um tampão fluente em branco foi injetada a uma taxa de fluxo de 5 μL/min durante 3 minutos para interagir os receptores de IL-6 com o anticorpo de tocilizumabe, o anticorpo 6RC1IgG_010, o anticorpo 6RC1IgG_012 ou o anticorpo 6RC1IgG_019 capturados no fragmento de sensor. Em seguida, glicina-HCl a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor.
[00517] A Figura 9 mostra os sensógrafos dos anticorpos analisados na concentração com alto teor de íon de cálcio por este método.
[00518] Os sensógrafos do anticorpo, tocilizumabe, do anticorpo 6RC1IgG_010, do anticorpo 6RC1IgG_012 e do anticorpo 6RC1IgG_019 sob a condição de concentração com baixo teor de íon de cálcio foram da mesma forma obtidos por um método similar. A Figura 10 mostra os sensógrafos dos anticorpos na concentração com baixo teor de íon de cálcio.
[00519] Como resultado, a capacidade de ligação do receptor de IL6 do anticorpo 6RC1IgG_010, do anticorpo 6RC1IgG_012 e do anticorpo 6RC1IgG_019 foi observada ser reduzida drasticamente pela alteração da concentração de íon de cálcio no tampão a partir de 1,2 mM a 3 μM. Exemplo 15 Obtenção de ligação de anticorpo ao receptor de IL-6 de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca de anticorpo humana usando técnica de exibição de fago
(15-1) Preparação de biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento
[00520] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana que consiste em uma pluralidade de fagos que exibem domínios de Fab que têm sequências de anticorpo humanas distintas foi construída de acordo com um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando RNA de poli-A preparado a partir de PBMC humano, RNA de poli-A humano comercialmente disponível, ou similares como um padrão.
(15-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca por método de paniculação de conta
[00521] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento construída foi realizado pelo enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6) ou pelo enriquecimento de fragmentos de anticorpo com capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um índice. O enriquecimento de fragmentos de anticorpo com capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um índice foi realizado pela eluição de fagos a partir da biblioteca de fago ligada com receptores de IL-6 na presença de íons de Ca usando EDTA que quela íons de Ca. Os antígenos usados foram receptores de IL-6 rotulados por biotina.
[00522] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00523] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Em seguida, uma solução de fago foi coletada por eluição de acordo com um método geral para o enriquecimento dos fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação do receptor de IL-6 ou por eluição das contas suspensas em EDTA a 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA a 2 mM) para o enriquecimento dos fragmentos de anticorpo com capacidade de ligação do receptor de IL-6 dependente da concentração de Ca como um índice. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00524] Nos segundo e subsequente ciclos de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago. A paniculação com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice foi repetida várias vezes.
(15-3) Avaliação por ELISA de fago
[00525] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida pelo método anterior.
[00526] Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: a placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS ou EDTA a 1 mM/TBS foi adicionado a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM (todos foram indicados pelas concentrações finais) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00527] Os genes de fragmentos de anticorpo julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foram amplificados como um padrão usando iniciadores específicos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
(15-4) Expressão e purificação de anticorpo
[00528] O gene de cada clone julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foi introduzido aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). Exemplo 16 Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente de Ca contra receptor de IL-6 humano
[00529] Para julgar a dependência de Ca da atividade de ligação de receptor de IL-6 humano de anticorpos 6RL#9-IgG1 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 78 (sequência de SEQ ID N°: 10 ligada a uma região constante derivada de IgG1) e cadeia leve: SEQ ID N°: 79) e FH4-IgG1 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 80 e cadeia leve: SEQ ID N°: 81) obtida no Exemplo 15, estes anticorpos foram cineticamente analisados quanto à sua reação de antígeno-anticorpo com receptores de IL-6 humanos usando Biacore T100 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). H54/L28-IgG1 descrita em WO2009125825 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 82 e cadeia leve: SEQ ID N°: 83) foi usada como um anticorpo de controle que não tem atividade de ligação dependente de Ca contra receptores de IL-6 humanos. A reação de antígeno-anticorpo foi cineticamente analisada em soluções de concentrações de íon de cálcio a 2 mM e 3 μM como condições de concentração com alto teor de íon de cálcio e concentração com baixo teor de íon de cálcio, respectivamente. Cada anticorpo de interesse foi capturado no Fragmento de Sensor CM4 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) com proteína A (Invitrogen Corp.) imobilizado nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento foram usados como tampões fluentes: ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v), e CaCl2 a 2 mM (pH 7,4); e ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v), e 3 μmol/L de CaCh (pH 7,4). Os receptores de IL-6 humanos foram da mesma forma diluídos com cada um destes tampões. O ensaio foi todo realizado a 37°C.
[00530] Na análise cinética sobre a reação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo H54/L28-IgG1, a solução de receptor de IL-6 diluída ou um tampão fluente em branco foi injetado a uma taxa de fluxo de 20 μL/min durante 3 minutos para interagir os receptores de IL-6 com o anticorpo H54/L28-IgG1 capturado no fragmento de sensor. Em seguida, um tampão fluente foi injetado a taxa de fluxo de 20 μL/min durante 10 minutos, e a dissociação dos receptores de IL-6 foi observada. Em seguida, glicina-HCl a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor. Uma constante de taxa associada ka (1/Ms) e uma constante de taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas como parâmetros cinéticos a partir do sensógrafo obtido no ensaio. Estes valores foram usados para calcular a constante de dissociação KD (M) do anticorpo H54/L28-IgG1 para o receptor de IL-6 humano. Cada parâmetro usando Biacore T100 Evaluation Software foi calculado (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
[00531] Na análise cinética sobre a reação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo FH4-IgG1 e o anticorpo 6RL#9-IgG1, a solução de receptor de IL-6 diluída ou um tampão fluente em branco foi injetado a uma taxa de fluxo de 5 μL/min durante 15 minutos para interagir os receptores de IL-6 com o anticorpo FH4-IgG1 ou o anticorpo 6RL#9- IgG1 capturado no fragmento de sensor. Em seguida, glicina-HCl a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor. A constante de dissociação KD (M) foi calculada usando Steady State Affinity Model a partir do sensógrafos obtidos no ensaio. Cada parâmetro usando Biacore T100 Evaluation Software foi calculado (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
[00532] A Tabela 21 mostra a constante de dissociação KD de cada anticorpo para o receptor de IL-6 determinado por este método na presença de CaCl2 a 2 mM. Tabela 21
Figure img0054
[00533] KD do anticorpo H54/L28-IgG1 sob a condição de concentração de Ca de 3 μM pode ser calculada da mesma maneira como na presença de Ca que tem uma concentração de 2 mm. O anticorpo FH4-IgG1 e o anticorpo 6RL#9-IgG1 foram dificilmente observados ao ligarem-se ao receptor de IL-6 sob a condição de concentração de Ca de 3 μM. Desse modo, KD é difícil de calcular pelo método anterior. Ao contrário, os valores de KD destes anticorpos sob a condição de concentração de Ca de 3 μM podem ser calculados de acordo com a expressão 1 seguinte (Biacore T100 Software Manual, BR-1006-48, AE 01/2007). Expressão 1 Req = C x Rmax / (KD + C) + RI
[00534] Na anterior expressão 1, cada símbolo é definido como segue: Req (RU): Níveis de ligação em estado estável Rmax (RU): Capacidade de ligação do analisado da superfície RI (RU): Contribuição de índice refrativo volumétrico na amostra C (M): Concentração de analisado KD (M): Constante de dissociação de equilíbrio
[00535] A Tabela 22 mostra os resultados de estimativa aproximada da constante de dissociação KD de cada anticorpo para o receptor de IL-6 na concentração de Ca de 3 μmol/L de acordo com a expressão 1. Na Tabela 22, Req, Rmax, RI e C representam valores supostos com base nos resultados de ensaio. Tabela 22
Figure img0055
[00536] Como resultado, o an icorpo FH4-IgG1 e o anticorpo 6RL#9-IgG1 foram preditos ter valores de KD para o receptor de IL-6, que foi aumentado por aproximadamente 60 vezes e aproximadamente 120 vezes, respectivamente (a afinidade foi reduzida por 60 vezes e 120 vezes ou mais) quando a concentração de CaCl2 no tampão foi diminuído a partir de 2 mM a 3 μM.
[00537] A Tabela 23 resume os valores de KD de três tipos de anticorpos, H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, na presença de CaCl2 a 2 mM e na presença de CaCl2 a 3 μM, e a dependência de Ca dos valores de KD. Tabela 23
Figure img0056
60 vezes ou mais Aproximadamen te 120 vezes ou mais
[00538] O an icorpo H54/L28- gG1 não foi observado diferir na ligação do receptor de IL-6 dependendo da diferença na concentração de Ca. Em comparação, a atenuação significante da ligação do receptor de IL-6 foi observada no anticorpo FH4-IgG1 e no anticorpo 6RL#9-IgG1 sob a condição de concentração com baixo teor de Ca (Tabela 23). Exemplo 17 Avaliação do anticorpo obtido quanto à sua ligação de íon de cálcio
[00539] Em seguida, a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) foi medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal) como um índice para avaliar a ligação de íon de cálcio dos anticorpos. A temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) serve como um índice para estabilidade e fica mais alta quando uma proteína é estabilizada por ligação de íon de cálcio, comparado com a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de uma proteína não ligada ao íon de cálcio (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). A alteração no valor de Tm de cada anticorpo de acordo com a alteração na concentração de íon de cálcio na solução de anticorpo foi avaliada para avaliar a atividade de ligação do anticorpo contra íons de cálcio. Os anticorpos purificados foram dialisados (EasySEP, Tomy Seiko Co., Ltd.) contra uma solução contendo Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 2 mM (pH 7,4) ou contendo Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 150 mM e CaCh a 3 μM (pH 7,4) como uma solução externa. Cada solução de anticorpo foi ajustada a aproximadamente 0,1 mg/mL de anticorpo com a solução usada na diálise e submetida como uma substância teste ao ensaio de DSC a 20°C a 115°C com a taxa de elevação de temperatura ajustada a 240°C/hr. A Tabela 24 mostra a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de cada domínio de Fab de anticorpo calculada com base na curva de desnaturação (DSC) obtida. Tabela 24
Figure img0057
[00540] Os resultados da Tabela 24 mostraram que os Valores de Tm dos domínios de Fab do anticorpo FH4-IgG1 e do anticorpo 6RL#9-IgG1 que exibem capacidade de ligação dependente de cálcio variaram, dependendo da alteração na concentração de íon de cálcio, considerando que o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo H54/L28-IgG1 que não exibe capacidade de ligação dependente de cálcio que não variou, dependendo da alteração na concentração de íon de cálcio. Tais variações nos valores de Tm dos domínios de Fab do anticorpo FH4-IgG1 e do anticorpo 6RL#9-IgG1 indicam que os domínios de Fab foram estabilizados pela ligação de íons de cálcio a estes anticorpos. Estes resultados demonstraram que o anticorpo FH4-IgG1 e o anticorpo 6RL#9-IgG1 ligam-se aos íons de cálcio, considerando que o anticorpo H54/L28-IgG1 não liga-se aos íons de cálcio. Exemplo 18 Identificação de sítio de ligação de íon de cálcio no anticorpo 6RL#9 por análise de estrutura de cristal de raios X
(18-1) Análise de estrutura de cristal de raios X
[00541] Como mostrado no Exemplo 17, o ensaio de temperatura de desnaturação térmica Tm sugeriu que o anticorpo 6RL#9 liga-se aos íons de cálcio. Entretanto, o sítio por meio do qual o anticorpo 6RL#9 liga-se aos íons de cálcio foi imprevisível. Desse modo, um resíduo responsável pela interação com íons de cálcio foi identificado na sequência do anticorpo 6RL#9 por uso do método de análise de estrutura de cristal de raios X.
(18-2) Expressão e purificação do anticorpo 6RL#9
[00542] O anticorpo 6RL#9 expresso para uso na análise de estrutura de cristal de raios X foi purificado. Especificamente, as células animais foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos para expressão em células animais preparadas para permitir a respectiva expressão da cadeia pesada (SEQ ID N°: 78) e da cadeia leve (SEQ ID N°: 79) do anticorpo 6RL#9. Os plasmídeos preparados foram transfectados por lipofecção a 800 mL de uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) suspensa em uma densidade de célula final de 1 x 106 células/mL em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). As células transfectadas com os plasmídeos foram cultivadas durante 5 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido de acordo com um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(18-3) Purificação de fragmento Fab a partir de anticorpo 6RL#9
[00543] O anticorpo 6RL#9 foi concentrado a 21 mg/mL usando uma membrana de ultrafiltração que tem um prazo de peso molecular de 10000 MWCO. O anticorpo foi diluído a 5 mg/mL com L-cisteína a 4 mM, EDTA a 5 mM, e uma solução de tamponamento de fosfato de sódio a 20 mM (pH 6,5) para preparar 2,5 mL de uma amostra de anticorpo. Depois da adição de 0,125 mg de papaína (Roche Applied Science), a amostra foi agitada, e em seguida deixada repousar a 35°C durante duas horas. A amostra desse modo deixada repousar, também foi suplementada com uma comprimido de Protease Inhibitor Cocktail Mini, livre de EDTA (Roche Applied Science) dissolvido em 10 mL de uma solução de tamponamento de MES a 25 mM (pH 6), e deixada repousar em gelo para terminar a reação de protease com papaína. Em seguida, a amostra foi adicionada a uma coluna de permuta de cátion de 1 mL de medida HiTrap SP HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) (equilibrada com uma solução de tamponamento de MES a 25 mM (pH 6)) conectado em tandem com uma a jusante coluna portadora de proteína A de 1 mL de medida HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Uma fração purificada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtida por eluição em um gradiente linear de concentração de NaCl até 300 mM nesta solução de tamponamento. Em seguida, a fração purificada obtida foi concentrada a aproximadamente 0,8 mL usando uma membrana de ultrafiltração 5000 MWCO. O concentrado foi adicionado a uma coluna de filtração em gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare BioSciences Corp.) equilibrada com uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 8) contendo NaCl a 50 mM. O fragmento Fab de anticorpo 6RL#9 purificado para cristalização foi eluído a partir da coluna usando esta solução de tamponamento. A operação de coluna foi toda realizada a uma baixa temperatura de 6 a 7,5°C.
(18-4) Cristalização de fragmento Fab de anticorpo 6RL#9 na presença de íon de cálcio
[00544] Os cristais semeados do fragmento Fab de 6RL#9 foram obtidos com antecedência sob condições geralmente ajustadas. Em seguida, o fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 purificado foi ajustado a 5 mM pela adição de CaCl2 e concentrado a 12 mg/mL usando uma membrana de ultrafiltração 5000 MWCO. Subsequentemente, a amostra desse modo concentrada foi cristalizada pelo método de difusão de vapor em gota suspensa. Uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 20 a 29% de PEG4000 foi usado como uma solução de reservatório. Os cristais de semente foram rompidos em uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 29% de PEG4000 e CaCl2 a 5 mM e diluídos 100 - 10000 vezes, e 0,2 μl de cada solução desta série de diluição foi adicionado a uma solução mista de 0,8 μl da solução de reservatório e 0,8 μl da amostra concentrada em uma cobertura de vidro para preparar gotas de cristalização. As gotas de cristalização foram deixadas repousar a 20°C durante 2 a 3 dias. Os dados de difração de raios X nos cristais semelhantes à placa finos obtidos foram determinados.
(18-5) Cristalização de fragmento Fab de anticorpo 6RL#9 na ausência de íon de cálcio
[00545] O fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 purificado foi concentrado a 15 mg/mL usando uma membrana de ultrafiltração 5000 MWCO. Subsequentemente, a amostra desse modo concentrada foi cristalizada pelo método de difusão de vapor em gota suspensa. Uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 18 a 25% de PEG4000 foi usada como uma solução de reservatório. Os cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca foram rompidos em uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 25% de PEG4000 e diluídos 100 - 10000 vezes, e 0,2 μl de cada solução desta série de diluição foi adicionado a uma solução mista de 0,8 μl da solução de reservatório e 0,8 μl da amostra concentrada em uma cobertura de vidro para preparar gotas de cristalização. As gotas de cristalização foram deixadas repousar a 20°C durante 2 a 3 dias. Os dados de difração de raios X nos cristais semelhantes à placa finos obtidos foram analisados.
(18-6) Coleção de dados de difração de raios X sobre o cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtidos na presença de íon de cálcio
[00546] Um dos monocristais (obtidos na presença de Ca) do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 imerso em uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 35% de PEG4000 e CaCl2 a 5 mM foi tirado, juntamente com a solução externa, usando alfinete de alça de náilon muito pequeno e congelado em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios X sobre o cristal congelado foram analisados usando linha de feixe BL-17A a partir de Photon Factory, Institute Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization (KEK). Durante o ensaio, o cristal congelado foi deixado em todas as vezes em uma corrente de nitrogênio de -178°C para manter seu estado congelado. Um total de 180 imagens de difração foi coletado, com o cristal girado por 1° para cada imagem, usando um detector de CCD Quantum 315r (Area Detector Systems Corporation (ADSC)) equipado com a linha de feixe. A determinação de uma constante de treliça, a indexação de manchas de difração e o processo dos dados de difração foram realizados usando um programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Wolfgang Kabsch), e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade de difração até uma resolução de 2,2 angstroms foram obtidos. Este cristal pertenceu ao grupo espacial P212121 e teve constantes de treliça a = 45,47 angstroms, b = 79,86 angstroms, c = 116,25 angstroms, α = 90°, β = 90° e y = 90°.
(18-7) Coleção de dados de difração de raios X sobre o cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na ausência de íon de cálcio
[00547] Um dos monocristais (obtido na ausência de Ca) do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 imerso em uma solução de tamponamento de HEPES a 100 mM (pH 7,5) contendo 35% de PEG4000 foi tirado, juntamente com a solução externa, usando alfinete de alça de náilon muito pequeno e congelado em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios X sobre o cristal congelado foram analisados usando linha de feixe BL-5A a partir de Photon Factory, Institute Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization (KEK). Durante o ensaio, o cristal congelado foi deixado em todas as vezes em uma corrente de nitrogênio de -178°C para manter seu estado congelado. Um total de 180 imagens de difração foi coletado, com o cristal girado por 1° para cada imagem, usando um detector de CCD Quantum 210r (Area Detector Systems Corporation (ADSC)) equipado com a linha de feixe. A determinação de uma constante de treliça, a indexação de manchas de difração, e o processo dos dados de difração foram realizados usando um programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Wolfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade de difração até uma resolução de 2,3 angstroms foram obtidos. Este cristal, que foi o mesmo tipo do cristal obtido na presença de Ca, pertenceu ao grupo espacial P212121 e teve constantes de treliça a = 45,40 angstroms, b = 79,63 angstroms, c = 116,07 angstroms, α = 90°, β = 90° e y = 90°.
(18-8) Análise estrutural de cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtida na presença de íon de cálcio
[00548] A estrutura do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtida na presença de Ca foi determinada pelo método de substituição molecular usando um programa Phaser (CCP4 Software Suite). O número de moléculas na unidade assimétrica foi presumido ser aquele do tamanho da treliça de cristal obtida e do peso molecular do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9. Com base na homologia na sequência primária, resíduos de aminoácido nas posições 112 a 220 na cadeia A e nas posições 116 a 218 na cadeia B retomada a partir da coordenada de estrutura de código PDB: 1ZA6 foram selecionados como moléculas padrão para pesquisa quanto a regiões de CL e CH1. Em seguida, resíduos de aminoácido nas posições 1 a 115 na cadeia B retomada a partir da coordenada de estrutura de código de PDB: 1ZA6 foram selecionados como uma molécula padrão para pesquisa quanto a uma região de VH. Finalmente, resíduos de aminoácido nas posições 3 a 147 na cadeia leve retomada a partir da coordenada de estrutura de código de PDB: 2A9M foram selecionados como uma molécula padrão para pesquisa quanto a uma região de VL. De acordo com esta ordem, a orientação e posição de cada molécula padrão para pesquisa na treliça de cristal foram determinados por funções de rotação e translação para obter um modelo estrutural inicial do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9. O modelo estrutural inicial foi submetido a refinamento de corpo rígido movendo cada um dos domínios de VH, VL, CH1 e CL para obter um fator de segurança cristalográfico R de 46,9% de e um valor de R Livre de 48,6% para dados de reflexão de 25-3,0 angstroms. Além disso, o modelo foi refinado por correção de modelo em um programa de repetição Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron dos coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc calculados pelo uso de refinamento de estrutura usando um programa Refmac5 (CCP4 Software Suite), um fator de estrutura experimentalmente determinado Fo, um fator de estrutura Fc calculado a partir do modelo, e uma fase. Refinamento final foi realizado usando um programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) pela incorporação de íon de Ca e moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade de elétron dos coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc. Finalmente, um fator de segurança cristalográfico R de 20,0% e um valor de R Livre de 27,9% foram obtidos para o modelo de 3440 átomos por uso de 21020 dados de reflexão com uma resolução de 25-2,2 angstroms.
(18-9) Uma análise estrutural de cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtida na ausência de íon de cálcio
[00549] A estrutura do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtida na ausência de Ca foi determinada usando a estrutura do cristal, que foi o mesmo tipo thereas, obtido na presença de Ca. Moléculas de íon Ca e água foram excluídas da coordenada de estrutura do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtida na presença de Ca, seguido por refinamento de corpo rígido movendo cada um dos domínios de VH, VL, CH1 e CL para obter um fator de segurança cristalográfico R de 30,3% e um valor de R Livre de 31,7% para dados de reflexão de 25-3,0 angstroms. Além disso, o modelo foi refinado por correção de modelo em um programa de repetição Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron dos coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc calculados pelo uso de refinamento de estrutura usando um programa Refmac5 (CCP4 Software Suite), um fator de estrutura experimentalmente determinado Fo, um fator de estrutura Fc calculado a partir do modelo, e uma fase. O refinamento final foi realizado usando um programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) pela incorporação de moléculas de água no modelo com base nos mapas de densidade de elétron dos coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc. Finalmente, um fator de segurança cristalográfico R de 20,9% e um valor de R Livre de 27,7% foram obtidos para o modelo de 3351 átomos por uso de 18357 dados de reflexão com uma resolução de 25-2,3 angstroms.
(18-10) Comparação de difração de dados de raios X entre cristais de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca e na ausência de Ca
[00550] Como resultado de comparação estrutural entre os cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca e na ausência de Ca, grande alteração foi vista na CDR3 de cadeia pesada. A Figura 11 mostra a estrutura da CDR3 de cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 determinada por análise de estrutura de cristal de raios X. Especificamente, um íon de cálcio estava presente na porção central da porção de alça de CDR3 de cadeia pesada no cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca. Foi considerado que o íon de cálcio interage com resíduos de aminoácido 95, 96 e 100a (definidos pela numeração de Kabat) na CDR3 de cadeia pesada. Isto sugeriu que, na presença de Ca, a alça de CDR3 de cadeia pesada, que é importante para ligação de antígeno, é estabilizado por ligação ao cálcio para levar uma estrutura ideal para ligação de antígeno. Nenhum dos relatos anteriores mostra que cálcio liga-se ao CDR3 de cadeia pesada de anticorpo. Esta estrutura de CDR3 cadeia pesada de anticorpo ligada com cálcio é uma nova estrutura.
[00551] Os motivos de ligação de cálcio presentes na CDR3 de cadeia pesada, que foram revelados a partir da estrutura do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9, podem da mesma forma servir como novos fatores para o projeto da biblioteca de Ca como descrito no Exemplo 11. Embora os motivos de ligação de cálcio tenham sido introduzidos à região variável de cadeia leve no Exemplo 11, outra possível biblioteca compreende, por exemplo, a CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 6RL#9 e compreende resíduos flexíveis nas outras CDRs inclusive CDRs de cadeia leve.
[00552] Exemplo 19 Obtenção de ligação de anticorpo a IL-6 de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca de anticorpo humana usando técnica de exibição de fago
(19-1) Preparação de biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento
[00553] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana que consiste em uma pluralidade de fagos que exibem domínios de Fab que têm sequências de anticorpo humanas distintas, foi construída de acordo com um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando RNA de poli-A preparado a partir de PBMC humano, RNA de poli-A humano comercialmente disponível, ou similares como um padrão.
(19-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca por método de paniculação de conta
[00554] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de exibição de fago de anticorpo humana submetida ao tratamento construída foi realizado pelo enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo tendo capacidade de ligação de antígeno (IL-6). Os antígenos usados foram IL-6 rotulado por biotina.
[00555] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziram fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00556] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBST contendo CaCl2 a 1,2 mM), e em seguida também lavadas duas vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00557] Nos segundo e subsequente ciclos de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. Os fagos coletados a partir da solução de fago tratado com tripsina foram adicionados a 10 mL de uma cepa E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago. Esta paniculação com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice foi realizada em 3 ciclos no total.
(19-3) Avaliação por ELISA de fago
[00558] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida pelo método anterior.
[00559] Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS ou EDTA a 1 mM/TBS foi adicionado a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM (todos foram indicados pelas concentrações finais) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00560] Um anticorpo 6KC4-1#85 que tem capacidade de ligação de IL-6 dependente de Ca foi obtido por ELISA de fago usando 96 clones isolados. O gene do fragmento de anticorpo julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foi amplificado como um padrão usando iniciadores específicos, e em seguida analisado quanto a sua sequência de nucleotídeo. A sequência da região variável de cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 é mostrada em SEQ ID N°: 11, e a sequência da região variável de cadeia leve da mesma é mostrada em SEQ ID N°: 84. Um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada (SEQ ID N°: 11) do anticorpo 6KC4-1#85 foi ligado por PCR a um polinucleotídeo que codifica uma sequência derivada de IgG1. O fragmento de DNA resultante foi incorporado em vetores para expressão em células animais para construir vetores que permitem a expressão de uma cadeia pesada representada por SEQ ID N°: 85. Um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia leve (SEQ ID N°: 84) do anticorpo 6KC4-1#85 foi ligado por PCR a um polinucleotídeo que codifica uma região constante de cadeia capa natural (SEQ ID N°: 26). O fragmento de DNA resultante foi incorporado em vetores para expressão em células animais. A sequência da forma modificada preparada foi confirmada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. A sequência da forma modificada preparada foi confirmada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica.
(19-4) Expressão e purificação de anticorpo
[00561] O gene do clone 6KC4-1#85 julgado como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foi introduzido aos plasmídeos para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). Exemplo 20 Avaliação de anticorpo 6KC4-1#85 quanto à sua ligação de íon de cálcio
[00562] O anticorpo 6KC4-1#85 de ligação de antígeno dependente de cálcio obtido a partir da biblioteca de anticorpo humana foi avaliado quanto à sua ligação de cálcio. Se ou não um valor de Tm medido variou sob concentrações de cálcio ionizados diferentes, foi avaliado pelo método descrito no Exemplo 6.
[00563] A Tabela 25 mostra que o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo 6KC4-1#85. Como mostrado na Tabela 25, o valor de Tm do domínio de Fab do anticorpo 6KC4-1#85 variou, dependendo da concentração de íon de cálcio, demonstrando que o anticorpo 6KC4- 1#85 liga-se ao cálcio. Tabela 25
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Exemplo 21 Identificação de sítio de ligação de íon de cálcio em anticorpo 6KC4-1#85
[00564] Como mostrado no Exemplo 20, o anticorpo 6KC4-1#85 mostrou ligar-se aos íons de cálcio, porém não teve os motivos de ligação de cálcio revelados pelo estudo na sequência hVk5-2. Desse modo para confirmar que os íons de cálcio ligam-se à cadeia pesada ou leve do anticorpo 6KC4-1#85, ou ambas, anticorpos construídos que compreendem a cadeia pesada ou leve substituída com a cadeia correspondente de um anticorpo antiglipicano 3 (sequência de cadeia pesada GC_H (SEQ ID N°: 48) e sequência de cadeia leve GC_L (SEQ ID N°: 86)) incapaz de ligar-se aos íons de cálcio foram avaliados quanto à sua ligação de íon de cálcio. A Tabela 26 mostra que os valores de Tm dos anticorpos construídos medidos de acordo com o método mostrado no Exemplo 6. Como resultado, o valor de Tm do anticorpo construído que tem a cadeia pesada do anticorpo 6KC4- 1#85 foi alterado dependendo da concentração de íon de cálcio, ao mesmo tempo que sugerindo que o anticorpo 6KC4-1#85 liga-se ao cálcio por meio de sua cadeia pesada. Tabela 26
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[00565] Para também identificar o resíduo por meio do qual a cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 liga-se aos íons de cálcio, cadeias pesadas modificadas (6_H1-11 (SEQ ID N°: 87), 6_H1-12 (SEQ ID N°: 88), 6_H1-13 (SEQ ID N°: 89), 6_H1-14 (SEQ ID N°: 90) e 6_H1-15 (SEQ ID N°: 91)) ou cadeias leves modificadas (6_L1-5 (SEQ ID N°: 92) e 6_L1-6 (SEQ ID N°: 93)) foram preparadas pela substituição de resíduos de Asp (D) presentes nas CDRs do anticorpo 6KC4-1#85 pelos resíduos de Ala (A) que não puderam participar na ligação ou quelação de íons de cálcio. Os anticorpos construídos foram purificados de acordo com o método descrito no Exemplo 19 a partir de culturas de células animais transfectadas com vetores de expressão que compreendem os genes de anticorpo construídos. A ligação de cálcio dos anticorpos construídos purificados foi analisada de acordo com o método descrito no Exemplo 6. Os resultados de ensaio são mostrados na Tabela 27. Como mostrado na Tabela 27, o anticorpo 6KC4-1#85 perdeu sua capacidade de ligação de cálcio pela substituição do resíduo 95 ou 101 (definido pela numeração de Kabat) em sua CDR3 de cadeia pesada pelo resíduo de Ala, sugerindo que estes resíduos são importantes para ligação de cálcio. Os motivos de ligação de cálcio presentes perto da base da alça de CDR3 de cadeia pesada no anticorpo 6KC4-1#85, que foram revelados a partir da propriedade de ligação de cálcio do anticorpo construído do anticorpo 6KC4-1#85 também podem servir como novos fatores para o projeto da biblioteca de Ca como descrito no Exemplo 11. Embora os motivos de ligação de cálcio tenham sido introduzidos à região variável de cadeia leve no Exemplo 11, outra possível biblioteca compreende, por exemplo, a CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 e compreende resíduos flexíveis nas outras CDRs, inclusive CDRs de cadeia leve. Tabela 27
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Exemplo 22 Obtenção da ligação de anticorpo à IgA humana de maneira dependente de Ca
(22-1) Preparação de MRA-hIgA, GC-hIgA e IgA-Fc humano biotinilado
[00566] MRA-hIgA (cadeia pesada: SEQ ID N°: 97 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25), GC-hIgA (cadeia pesada: SEQ ID N°: 98 e cadeia leve: SEQ ID N°: 99) e IgA-Fc humano biotinilado (da mesma forma chamado hIgA-Fc rotulado por biotina; hIgA_CH2-CH3-Avitag: SEQ ID N°: 100) foram preparadas como IgA humana como segue:
(22-1-1) Preparação de MRA-hIgA
[00567] IgA MRA-hIgA recombinante humana (em seguida, chamada MRA-hIgA) foi preparada como segue: hIgA expressa que compreende H(WT)-IgA1 (SEQ ID N°: 97) e L(WT) (SEQ ID N°: 25) foi purificada por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando cromatografia de permuta de íon e cromatografia de filtração em gel.
(22-1-2) Preparação de GC-hIgA
[00568] IgA GC-hIgA humana recombinante foi preparada como segue: um fragmento de gene que codifica GC-hIgA (cadeia pesada: SEQ ID N°: 98 e cadeia leve: SEQ ID N°: 99) foi incorporado em um vetor para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi cotransfectada com o vetor de plasmídeo construído e um gene que codifica EBNA1 a ser expresso usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Em seguida, as células transfectadas com estes genes foram cultivadas a 37°C durante 6 dias em uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar as proteínas de GC-hIgA no sobrenadante de cultura.
[00569] As culturas de célula contendo GC-hIgA foram filtradas por um filtro de topo de frasco de 0,22 μm para obter um sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura foi diluído com Tris-HCl a 20 mM (pH 8,0) e carregado em HiTrap Q HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com esta solução, seguido por eluição de GC-hIgA em um gradiente de concentração de NaCl. Em seguida, a remoção de associados por cromatografia de filtração em gel usando Superdex 200 e a substituição do tampão com His-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 6,0) foram realizadas para obter GC-hIgA purificada.
(22-1-3) Preparação de hIgA-Fc rotulado por biotina
[00570] Para adicionar biotina ao terminal de C da proteína de interesse (IgA-Fc humana), um fragmento de gene que codifica uma sequência específica (sequência Avitag) para biotinilação mediada por biotina ligase foi ligado a jusante de um fragmento de gene que codifica a região de IgA-Fc humana. O fragmento de gene que codifica uma proteína da IgA humana ligada à sequência Avitag (hIgA_CH2-CH3-Avitag (SEQ ID N°: 100)) foi incorporado em vetores para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi transfectada com os vetores de plasmídeo construídos usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Esta transfecção foi realizada simultaneamente com um gene que codifica EBNA1 para ser expresso e um gene que codifica biotina ligase (BirA) a ser expressa para biotinilação para rotular por biotina a proteína. As células transfectadas com estes genes de acordo com os procedimentos anteriores foram cultivadas a 37°C durante 6 dias em uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar a proteína de interesse no sobrenadante de cultura.
[00571] A culturas de célula contendo a IgA-Fc humana de interesse foram filtradas por um filtro de topo de frasco de 0,22 μm para obter um sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura foi diluído com Tris-HCl a 20 mM (pH 7,4) e carregado em HiTrap Q HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com esta solução, seguido por eluição da IgA-Fc humana de interesse em um gradiente de concentração de NaCl. O eluato de HiTrap Q HP foi diluído com Tris-HCl a 50 mM (pH 8,0) e carregado na coluna SoftLink Avidin equilibrada com esta solução, seguido por eluição com biotina a 5 mM, NaCl a 150 mM e Tris-HCl a 50 mM (pH 8,0). Em seguida, a remoção dos associados por cromatografia de filtração em gel usando Superdex 200 e a substituição do tampão com His-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 6,0) foram realizadas para obter IgA-Fc humana purificada.
(22-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca de Ca por paniculação de conta
[00572] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de anticorpo de ligação de antígeno dependente de Ca construída (biblioteca de Ca) foi realizado com capacidade de ligação de antígeno (IgA-Fc humano) como um índice.
[00573] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA ou leite desnatado e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM; ou leite desnatado a 3% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago para preparar uma solução de biblioteca de fago bloqueada. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00574] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina (IgA-Fc rotulado por biotina) foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas com BSA ou leite desnatado, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM e Tween 20 a 0,1%) e 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00575] Nos segundo e terceiro ciclos de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno dependente da concentração de íon de Ca como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada bloqueando-se da mesma maneira como no primeiro ciclo de paniculação, e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA a 2 mM) foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago.
(22-3) Avaliação de anticorpo de ligação de IgA humano usando- se Biacore
[00576] Os genes de fragmento de anticorpo extraídos a partir de fagomídeos obtidos a partir da E. coli obtida depois da conclusão do segundo ciclo de paniculação foram inseridos em vetores para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 2,63 x 105 células/mL foi inoculada a uma concentração de 190 μL/cavidade em uma placa com 96 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2).
[00577] O sobrenadante de cultura obtido pelo método anterior foi usado para analisar a capacidade de ligação de GC-hIgA usando Biacore A100. Os anticorpos no sobrenadante de cultura foram imobilizados no Fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare BioSciences Corp.) com proteína A (Invitrogen Corp.) imobilizado nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Uma solução de tamponamento que contém ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4) foi usada como um tampão fluente. GC-hIgA foi da mesma forma diluída com este tampão. O ensaio foi todo realizado a 25°C.
[00578] Os genes de anticorpos julgados como tendo capacidade de ligação de GC-hIgA como resultado da análise da capacidade de ligação de IgG Biacore foram amplificados usando iniciadores específicos dos vetores para expressão em células animais usadas na expressão dos mesmos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
(22-4) Avaliação de anticorpo de ligação de hIgA por ELISA de fago
[00579] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado por cultura de fago de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida depois do terceiro ciclo de paniculação realizado na etapa (222). Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo IgA-Fc rotulado por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com IgA- Fc contido em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS ou EDTA a 1 mM/TBS foi adicionado a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM (todos foram indicados pelas concentrações finais) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00580] Os clones julgados como tendo capacidade de ligação de IgA-Fc alterada dependendo da concentração de íon de Ca como resultado do ELISA de fago foram analisados quanto às sequências de nucleotídeo de seus genes de fragmento de anticorpo.
(22-5) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca de Ca por paniculação de fase sólida
[00581] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de anticorpo de ligação de antígeno dependente de Ca construída (biblioteca de Ca) foi realizado com capacidade de ligação de antígeno (IgA-Fc humano) como um índice.
[00582] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA ou leite desnatado e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM; ou leite desnatado a 3% e íon de cálcio a 1,2 mM) foi adicionado à solução de biblioteca de fago para preparar uma solução de biblioteca de fago bloqueada. No primeiro ciclo de paniculação, o método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00583] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina (IgA-Fc rotulado por biotina) foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas de leite desnatado-magnéticas bloqueadas, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM e Tween 20 a 0,1%) e 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00584] O segundo ciclo de paniculação usando antígenos imobilizados em uma placa foi realizado. Especificamente, foram adicionados antígenos rotulados por biotina a uma concentração de 5 pmol/cavidade a uma placa de 10 cavidades revestida com estreptavidina (StreptaWell, F. Hoffmann-La Roche Ltd.) e contatados com estes em temperatura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, a placa foi lavada três vezes com TBST (TBS contendo Tween 20 a 0,1%) para preparar uma placa imobilizada por antígeno. A biblioteca de fago bloqueada com leite desnatado contendo Ca a 1,2 mM foi adicionada a isto e desse modo contatada com os antígenos em temperatura ambiente durante 60 minutos. A placa foi lavada três vezes com CaCl2 a 1,2 mM/TBST usando uma lavadora de placa (Skan WASHER, SKARON). Em seguida, a placa foi imersa também em 2 L de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e suavemente agitada durante 60 minutos. Os fagos em cada cavidade suplementada com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA a 2 mM) foram suspensos em temperatura ambiente, seguido por coleção de uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm.
(22-6) Avaliação para anticorpo de ligação de hIgA por ELISA de fago
[00585] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado por cultura de fago de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida depois da paniculação. O ELISA de fago foi realizado pelo método descrito na etapa (22-4). Os genes de clones julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca foram analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo, em seguida inseridos em vetores para expressão em células animais, e expressos como anticorpos que foram em seguida purificados. Exemplo 23 Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente de Ca contra IgA humana
(23-1) Expressão e purificação de anticorpo de IgA anti-humana obtido
[00586] Dos anticorpos obtidos julgados como tendo capacidade de ligação de IgA humana no Exemplo 22, anticorpos GA1-IgG1 (obtidos na etapa (22-3); cadeia pesada: SEQ ID N°: 101 e cadeia leve: SEQ ID N°: 102), GA2-IgG1 (obtido na etapa (22-4); cadeia pesada: SEQ ID N°: 103 e cadeia leve: SEQ ID N°: 104), GA3-IgG1 (obtido na etapa (22-6); cadeia pesada: SEQ ID N°: 105 e cadeia leve: SEQ ID N°: 106) e GA4-IgG1 (obtido na etapa (22-3); cadeia pesada: SEQ ID N°: 107 e cadeia leve: SEQ ID N°: 108) foram expressos usando o método seguinte, e em seguida purificado: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 24112423).
(23-2) Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente de Ca contra IgA humana
[00587] Os anticorpos (GA1-IgG1, GA2-IgG1, GA3-IgG1 e GA4- IgG1) obtidos na etapa (23-1) foram avaliados quanto à sua atividade de ligação de IgA humana (constante de dissociação KD (M)) usando Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A atividade de ligação foi analisada usando Tween 20 a 0,05%, 20 mmol/l de ACES, e 150 mmol/l de NaCI contendo CaCl2 a 3 μM ou 1,2 mM (pH 7,4 e pH 5,8) ou Tween 20 a 0,05%, 20 mmol/l de ACES, e 150 mmol/l de NaCl (pH 8,0) contendo CaCl2 a 0,1 μM ou 10 mM como um tampão fluente.
[00588] Cada anticorpo foi associado com proteína recombinante A/G (Thermo Fisher Scientific K.K.) imobilizada em uma quantidade apropriada no fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) pelo método de acoplamento de amina. Uma concentração apropriada de MRA-hIgA (descrita na etapa (22-1)) foi injetada a isto como um analisado e interagida com o anticorpo no fragmento de sensor. Em seguida, 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados a isto para regenerar o fragmento de sensor. O ensaio foi realizado a 37°C. A constante de dissociação KD (M) foi calculada pela análise de ajustamento de curva e análise de valor de equilíbrio dos resultados de ensaio usando Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare BioSciences Corp.). Os resultados são mostrados na Tabela 28. Da mesma forma, os sensógrafos obtidos são mostrados na Figura 12. Como é evidentemente mostrado, GA2-IgG1, GA3-IgG1 e GA4-IgG1 fortemente ligam-se à IgA humana na concentração de Ca2+ de 1,2 mM, porém fracamente ligam-se à IgA humana na concentração de íon de Ca de 3 μM. Tabela 28
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[00589] Embora os anticorpos, cuja interação com antígenos (receptores de IL6) foi alterada dependendo da concentração de íon de Ca, tenham sido obtidos a partir da biblioteca de Ca no Exemplo 14, foi revelado que a ligação de anticorpos aos antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de Ca pode ser obtida não apenas usando os receptores de IL6, porém usando IgA humana.
[00590] Exemplo 24 Obtenção da ligação de anticorpo a glipicano 3 (GPC3) humano de maneira dependente de Ca
(24-1) Preparação de glipicano 3 humano
[00591] Glipicano 3 humano recombinante (em seguida, chamado GPC3) para uso como um antígeno foi preparado como segue: um sobrenadante de cultura foi coletado a partir de células de CHO estavelmente transfectadas com plasmídeos para expressão de uma sequência de aminoácida livre de região de transmembrana de glipicano 3 humano ligada a 6 resíduos de histidina (SEQ ID N°: 109). O sobrenadante de cultura obtido foi purificado por cromatografia de permuta de íon, em seguida purificado por afinidade com base no rótulo de His, e purificado por cromatografia de filtração em gel para obter GPC3. O GPC3 foi rotulado por biotina usando EZ-Link NHS- PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific K.K.) para preparar GPC3 rotulado por biotina.
(24-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente de Ca a partir da biblioteca por paniculação de conta
[00592] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de anticorpo de ligação de GPC3 dependente de Ca construída foi realizado com capacidade de ligação de antígeno (GPC3) como um índice.
[00593] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA ou leite desnatado e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM; ou leite desnatado a 3% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago para preparar uma solução de biblioteca de fago bloqueada. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00594] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina (GPC3 rotulado por biotina) foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas com BSA ou leite desnatado, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBST contendo CaCl2 a 1,2 mM) e 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00595] Nos segundo e subsequente ciclos de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação dependente de Ca como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada bloqueando-se da mesma maneira como no primeiro ciclo de paniculação, e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas com BSA ou leite desnatado, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Em seguida, as contas suplementadas com 0,1 mL de EDTA a 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA a 2 mM) foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 5 μL de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago.
(24-3) Avaliação para anticorpo de ligação de GPC3 por ELISA de fago
[00596] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado por cultura de fago de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de cada colônia simples da E. coli obtida depois que os segundo e terceiro ciclos de paniculação foram realizados pelo método anterior.
[00597] Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos procedimentos seguintes: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST (PBS contendo Tween 20 a 0,1%) para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar anticorpos exibidos por fago com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, e CaCl2 a 1,2 mM/TBS ou EDTA a 1 mM/TBS foi adicionado a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com TBS que tem BSA a 4% e uma concentração de cálcio ionizado de 1,2 mM (todos foram indicados pelas concentrações finais) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00598] Os genes de fragmentos de anticorpo julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago foram amplificados como um padrão usando iniciadores específicos, e em seguida analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
(24-4) Expressão e purificação da ligação de anticorpo a GPC3 humano
[00599] Os genes de quatro anticorpos julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de Ca como resultado do ELISA de fago, isto é, CSCM-01_005 (sequência de cadeia pesada: 110 e sequência de cadeia leve: 111), CSCM-01_009 (sequência de cadeia pesada: 112 e sequência de cadeia leve: 113), CSCM-01_015 (sequência de cadeia pesada: 114 e sequência de cadeia leve: 115) e CSCM-01_023 (sequência de cadeia pesada: 116 e sequência de cadeia leve: 117), e GC-IgG1 de anticorpo de GPC3 anti-humano (sequência de cadeia pesada: 118 e sequência de cadeia leve: 119) como um controle foram separadamente inseridos aos plasmídeos para expressão em células animais. Estes anticorpos foram expressos usando o método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada a uma concentração de 3 mL/cavidade em uma placa com 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 24112423). O anticorpo de GC-IgG1 foi purificado da mesma maneira como acima a partir de um sobrenadante de cultura de células de CHO que estavelmente expressam o anticorpo de GC-IgG1, e sua concentração foi calculada.
(24-5) Avaliação de anticorpo obtido quanto à sua capacidade de ligação dependente de Ca contra GPC3 humano
[00600] Os anticorpos obtidos foram submetidos ao ELISA pelos procedimentos seguintes: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante a noite com 100 μL de PBS contendo antígenos rotulados por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com tampão de ACES (ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 100 mM, e Tween 20 a 0,05% (pH 7,4)) para remover antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de tampão de ACES que contém 2% de BSA durante uma hora ou mais tempo. Depois da remoção do tampão de ACES que contém 2% de BSA, 100 μL de cada uma dentre diluições seriais de 4 vezes de IgG purificada diluída com antecedência de 10 μg/mL foram adicionados a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar durante uma hora para associar IgG com os antígenos contidos em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com tampão de ACES, e "ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4)", "ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 3 μM (pH 7,4)", "ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 1,2 mM (pH 5,8)", ou "ACES a 10 mM, NaCl a 150 mM e CaCl2 a 3 μM (pH 5,8)" foram adicionados a isto. A placa foi deixada repousar a 37°C durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com tampão de ACES, os anticorpos de IgG anti-humanos conjugados por HRP (BioSource International, Inc.) diluídos com tampão de ACES que contém 2% de BSA foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com tampão de ACES, solução simples de TMB (ZYMED Laboratories, Inc.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência a 450 nm.
[00601] Os resultados de ensaio são mostrados na Figura 13. A absorvência foi constante para GC-IgG1 indiferente da concentração de íon de cálcio, considerando que a absorvência foi significativamente mais baixa para CSCM-01_005, CSCM-01_009, CSCM-01_015 e CSCM-01_023 na concentração de íon de cálcio de 3 μM (concentração com baixo teor de íon de cálcio) do que àquela na concentração de íon de cálcio de 1,2 mM (concentração com alto teor de íon de cálcio). A partir destes resultados, CSCM-01_005, CSCM- 01_009, CSCM-01_015 e CSCM-01_023 mostraram ter a propriedade de ligação de antígeno que foi alterada dependendo da concentração de íon de cálcio, demonstrando que o anticorpo dependente de cálcio pode ser da mesma forma obtido contra glipicano 3 humano.
[00602] Exemplo 25 Obtenção da ligação de anticorpo à IgA de camundongo de maneira dependente do pH
(25-1) Preparação de GC-mIgA e IgA-Fc de camundongo biotinilado
[00603] GC-mIgA (cadeia pesada: SEQ ID N°: 120 e cadeia leve: SEQ ID N°: 121) e IgA-Fc de camundongo biotinilado (da mesma forma chamado mIgA-Fc rotulado por biotina; mIgA_CH2-CH3-Avitag: SEQ ID N°: 122) foram preparados como IgA de camundongo como segue:
(25-1-1) Preparação de GC-mIgA
[00604] GC-mIgA de IgA de camundongo recombinante foi preparado como segue: um fragmento de gene que codifica GC-mIgA (cadeia pesada: SEQ ID N°: 120 e cadeia leve: SEQ ID N°: 121) foi incorporado em um vetor para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi cotransfectada com o vetor de plasmídeo construído e um gene que codifica EBNA1 a ser expresso usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Em seguida, as células transfectadas com estes genes foram cultivadas a 37°C durante 4 dias em uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar as proteínas de GC- mIgA no sobrenadante de cultura.
[00605] As culturas de célula Contendo GC-mIgA foram filtradas por um filtro de topo de frasco de 0,22 μm para obter um sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura foi diluído com Tris-HCl a 20 mM (pH 8,0) e carregado em HiTrap Q HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com antecedência com esta solução, seguido por eluição de GC-mIgA em um gradiente de concentração de NaCl. Em seguida, os associados foram removidos por cromatografia de filtração em gel usando Superdex 200, e o Tampão contendo GC-mIgA resultante foi substituído com His-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 6,0) para obter GC-mIgA purificado.
(25-1-2) Preparação de mIgA-Fc rotulado por biotina
[00606] Para adicionar biotina ao terminal de C da proteína de interesse (IgA-Fc de camundongo), um fragmento de gene que codifica uma sequência específica (sequência Avitag) para biotinilação mediada por biotina ligase foi ligado a jusante de um fragmento de gene que codifica o camundongo região de IgA-Fc. O fragmento de gene que codifica uma proteína da IgA de camundongo ligada à sequência Avitag (mIgA_CH2-CH3-Avitag (SEQ ID N°: 122)) foi incorporado em vetores para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi transfectada com os vetores de plasmídeo construídos usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Esta transfecção foi realizada simultaneamente com um gene que codifica EBNA1 a ser expresso e um gene que codifica biotina ligase (BirA) a ser expressa para biotinilação para rotular por biotina a proteína. As células transfectadas com estes genes de acordo com os procedimentos anteriores foram cultivadas a 37°C durante 6 dias em uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar a proteína de interesse no sobrenadante de cultura.
[00607] A culturas de célula contendo o IgA-Fc de camundongo de interesse foram filtradas por um filtro de topo de frasco de 0,22 μm para obter um sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura foi diluído com Tris-HCl a 20 mM (pH 7,4) e carregado em HiTrap Q HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com antecedência com esta solução, seguido por eluição do IgA-Fc de camundongo de interesse em um gradiente de concentração de NaCl. Em seguida, o eluato de HiTrap Q HP foi diluído com Tris-HCl a 50 mM (pH 8,0) e carregado em coluna SoftLink Avidin equilibrada com antecedência com esta solução, seguido por eluição do IgA-Fc de camundongo de interesse com biotina a 5 mM, NaCl a 150 mM e Tris-HCl a 50 mM (pH 8,0). Em seguida, os associados foram removidos por cromatografia de filtração em gel usando Superdex 200, e o tampão contendo IgA-Fc de camundongo resultante foi substituído com His-HCl a 20 mM e NaCl a 150 mM (pH 6,0) para obter IgA-Fc de camundongo purificado.
(25-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente do pH a partir da biblioteca de His por paniculação de conta
[00608] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH construída (biblioteca de His 1) foi realizado com capacidade de ligação de antígeno (IgA-Fc de camundongo) como um índice.
[00609] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionado às culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, leite desnatado (concentração final: leite desnatado a 3%) foi adicionado à solução de biblioteca de fago para preparar uma solução de biblioteca de fago bloqueada. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00610] Especificamente, antígenos rotulados por biotina (mIgA-Fc rotulado por biotina) foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Os antígenos rotulados por biotina foram usados em paniculação em quantidades de 250 pmol para o primeiro círculo, 40 pmol para o segundo círculo e 10 pmol para o terceiro círculo. Depois da adição de contas de leite desnatado-magnéticas bloqueadas, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM e Tween 20 a 0,1% (pH 7,6)) e 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,6)). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago. Esta paniculação foi realizada em 3 ciclos no total.
(25-3) Avaliação de anticorpo de ligação de IgA de camundongo quanto à sua capacidade de ligação usando Biacore
[00611] Os genes de fragmento de anticorpo extraídos a partir de fagomídeos obtidos a partir da E. coli obtida depois da conclusão do terceiro ciclo de paniculação, foram inseridos em vetores para expressão em células animais. A expressão de anticorpo foi realizada pelo método seguinte: uma linhagem FreeStyle 293-F derivada de célula de rim embrionário humano (Invitrogen Corp.) foi suspensa em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 2,63 x 105 células/mL foi inoculada a uma concentração de 190 μL/cavidade em uma placa com 96 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transfectados às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2).
[00612] O sobrenadante de cultura obtido pelo método anterior foi usado para analisar a capacidade de ligação de GC-mIgA usando Biacore A100. Os anticorpos no sobrenadante de cultura foram capturados no fragmento de Sensor CM5 (GE Healthcare BioSciences Corp.) com proteína A/G (Pierce Biotechnology Inc.) imobilizada nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento foram usados como tampões fluentes: ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,4); e ACES a 20 mM, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,05% (p/v) e CaCl2 a 1,2 mM (pH 5,8). A interação de reação de antígeno-anticorpo foi analisada sob pH neutro e condições de pH ácido. GC-mIgA foi diluído da mesma forma com cada um destes tampões e injetados a uma taxa de fluxo de 10 μL/min durante 60 segundos para interagir o antígeno com os anticorpos capturados no fragmento de sensor. Em seguida, glicina- HCl a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar o fragmento de sensor. O ensaio foi todo realizado a 25°C.
[00613] Como resultado da Avaliação de ligação com Biacore, mIAP1B3-3_#024 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 123 e cadeia leve: SEQ ID N°: 124), mIAP1B3-3_#130 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 125 e cadeia leve: SEQ ID N°: 126) e mIAP1B3-3_#230 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 127 e cadeia leve: SEQ ID N°: 128) foram obtidos como anticorpos julgados como tendo capacidade de ligação dependente do pH contra GC-mIgA. A Figura 14 mostra os sensógrafos destes anticorpos em pH 7,4 e pH 5,8. A capacidade de ligação de IgA de camundongo destes anticorpos foi observada ser reduzida pela alteração do pH de tampão a partir de pH 7,4 a pH 5,8.
[00614] Os genes destes anticorpos dos vetores para expressão em células animais usadas na expressão dos mesmos foram analisados quanto às sequências de nucleotídeo.
[00615] Embora anticorpos, cuja interação com antígenos (IL-6R) foi alterada dependendo de pH, tenham sido obtidos a partir da biblioteca de His 1 no Exemplo 3, foi revelado que a ligação de anticorpos aos antígenos de uma maneira dependente do pH pode ser obtida não apenas usando IL-6R porém usando IgA de camundongo. Exemplo 26 Obtenção da ligação de anticorpo a HMGB1 humano de maneira dependente do pH
(26-1) Preparação de HMGB1 humano e HMGB1 humano biotinilado
[00616] HMGB1 humano (SEQ ID N°: 129) e humano de HMGB1- Avi biotinilado (da mesma forma chamado hHMGB1 rotulado por biotina; hHMGB1-Avitag: SEQ ID N°: 130) foram preparados como segue:
(26-1-1) Preparação de HMGB1 humano
[00617] HMGB1 hHMGB1 humano recombinante foi preparado como segue: um hHMGB1 de codificação de fragmento de gene (SEQ ID N°: 129) foi incorporado em um vetor para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi cotransfectada com o vetor de plasmídeo construído e um gene que codifica EBNA1 a ser expresso usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Em seguida, as células transfectadas com estes genes foram cultivadas a 37°C entre uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar proteínas de hHMGB1 no sobrenadante de cultura. O sobrenadante de cultura desse modo obtido foi carregado em HiTrap SP Sefarose HP (GE Healthcare BioSciences Corp.) equilibrada com antecedência com PBS, e a coluna foi lavada com PBS, seguido por eluição de proteínas adsorvidas na coluna em um gradiente de concentração linear de cloreto de sódio. Depois do equilíbrio com histidina-HCl a 20 mM (pH 5,0), a fração eluída contendo hHMGB1 diluída 3 vezes com esta solução de tamponamento foi carregada na coluna. A coluna foi lavada com esta solução de tamponamento, seguida por eluição de proteínas adsorvidas na coluna em um gradiente de concentração linear de cloreto de sódio. A fração contendo hHMGB1 foi concentrada por uma membrana de ultrafiltração, e em seguida carregada na coluna Superdex 200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada com NaCl a 300 mM e histidina a 20 mM (pH 6,0). Uma fração de hHMGB1 purificada foi obtida por separação usando a mesma solução de tamponamento.
(26-1-2) Preparação de HMGB1 humano rotulado por biotina
[00618] Para adicionar biotina ao terminal de C da proteína de interesse (HMGB1 humano), um fragmento de gene que codifica uma sequência específica (sequência Avitag) para biotinilação mediada por biotina ligase foi ligado a jusante de um fragmento de gene que codifica a região de HMGB1 humana. O fragmento de gene que codifica uma proteína do HMGB1 humano ligada à sequência Avitag (hHMGBI-Avitag (SEQ ID N°: 130)) foi incorporado em vetores para expressão em células animais. FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) foi transfectada com os vetores de plasmídeo construídos usando 293Fectin (Invitrogen Corp.). Esta transfecção foi realizada simultaneamente com um gene que codifica EBNA1 a ser expresso e um gene que codifica biotina ligase (BirA) a ser expressa para biotinilação para rotular por biotina a proteína. As células transfectadas com estes genes de acordo com os procedimentos anteriores foram cultivadas a 37°C entre uma atmosfera de CO2 a 8% para segregar a proteína de interesse no sobrenadante de cultura.
[00619] O sobrenadante de cultura desse modo obtido foi carregado em HiTrap SP Sefarose HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrado com antecedência com PBS, e a coluna foi lavada com PBS, seguido por eluição de proteínas adsorvidas na coluna em um gradiente de concentração linear de cloreto de sódio. A fração contendo HMGB1-Avi diluída duas vezes com Tris-HCl a 100 mM (pH 7,4) foi carregada na coluna SoftLink Soft Release Avidin Resin (Promega Corp.) equilibrado com TBS. A coluna foi lavada com TBS, seguido por eluição de proteínas adsorvidas na coluna usando TBS (pH 8,0) contendo biotina a 5 mM. A fração contendo HMGB1-Avi foi concentrada por uma membrana de ultrafiltração, e em seguida carregada na coluna Superdex 200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) equilibrada com NaCl a 300 mM e histidina a 20 mM (pH 6,0). Uma fração de HMGB1-Avi biotinilada purificada foi obtida por separação usando a mesma solução de tamponamento.
(26-2) Obtenção de ligação de fragmento de anticorpo ao antígeno de maneira dependente do pH a partir da biblioteca de His por paniculação de conta
[00620] O primeiro ciclo de avaliação da biblioteca de anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH construída (biblioteca de His 1) foi realizado com capacidade de ligação de antígeno (HMGB1 humano) como um índice.
[00621] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli transportando o fagomídeo construído para exibição de fago. NaCl a 2,5 M/PEG a 10% foi adicionada a culturas de E. coli que produziu fagos, e um conjunto dos fagos desse modo precipitados foi diluído com TBS para obter uma solução de biblioteca de fago. Em seguida, BSA e CaCl2 (concentração final: BSA a 4% e íon de cálcio a 1,2 mM) foram adicionados à solução de biblioteca de fago para preparar uma solução de biblioteca de fago bloqueada. O método de paniculação foi realizado com referência a um método de paniculação geral usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; e Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Streptavidin (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[00622] Especificamente, 250 pmol de antígenos rotulados por biotina (hHMGB1 rotulado por biotina) foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST (Tris a 50 mM, NaCl a 300 mM, CaCl2 a 1,2 mM e Tween 20 a 0,1% (pH 7,6)) e 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBS (Tris a 50 mM, NaCl a 300 mM e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7,6)). Depois da adição de 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina, as contas foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[00623] Nos segundo e subsequente ciclos de paniculação, os fagos foram enriquecidos com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice. Especificamente, 40 pmol de antígenos rotulados por biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada e desse modo contatados com a solução de biblioteca de fago em temperatura ambiente durante 60 minutos. Depois da adição de contas magnéticas bloqueadas por BSA, os complexos de antígeno-fago foram ligados às contas magnéticas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As contas foram lavadas várias vezes com 1 mL de CaCl2 a 1,2 mM/TBST e CaCl2 a 1,2 mM/TBS. Para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno como um índice, as contas suplementadas com 0,5 mL de 1 mg/mL de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente durante 15 minutos, imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. Para o enriquecimento com capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como um índice, 0,4 mL (ciclo 2) ou 0,1 mL (ciclo 3 ou depois) de MES a 50 mM/CaCl2 a 1,2 mM/NaCl a 150 mM (pH 5,5) foi adicionado às contas, e as contas resultantes foram suspensas em temperatura ambiente. Em seguida, as contas foram separadas usando um posto magnético para coletar uma solução de fago. A adição de 20 μL (ciclo 2) ou 5 μL (ciclo 3 ou depois) de 100 mg/mL de tripsina à solução de fago coletada clivou as proteínas pIII (proteínas pIII derivadas de fago auxiliar) de fagos de não exibição de Fab para cancelar a capacidade dos fagos de não exibição de Fab para infectar E. coli. Os fagos coletados foram adicionados a 10 mL de uma cepa E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600: 0,4-0,7). A cepa E. coli foi infectada pelos fagos através da cultura de centrifugação suave da cepa a 37°C durante uma hora. A E. coli infectada foi inoculada a uma placa de 225 mm x 225 mm. Em seguida, os fagos foram coletados a partir de culturas da E. coli inoculada para coletar uma solução de biblioteca de fago. Esta paniculação com capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de ligação dependente do pH como um índice foi realizada em 3 ciclos no total.
(26-3) Avaliação para o anticorpo de ligação a HMGB1 humano por ELISA de fago
[00624] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado por cultura de fago de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de cada colônia isolada de E. coli obtida depois do terceiro e quarto ciclos de paniculação realizados na etapa (26-2). Depois da adição de BSA e CaCl2 (concentração final: 4% de BSA e íon de cálcio a 1,2 mM), o sobrenadante de cultura contendo fago foi submetido a ELISA pelos seguintes procedimentos: placa de microtítulo StreptaWell 96 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) foi revestida durante 4 horas ou por muito mais tempo com 100 μL de PBS contendo hHMGB1 rotulado por biotina. Cada cavidade da placa foi lavada com PBST para remover os antígenos não ligados. Em seguida, a cavidade foi bloqueada com 250 μL de BSA-TBS a 4% (Tris a 50 mM, NaCl a 300 mM, CaCl2 a 2,5 mM, e 4% de BSA) durante uma hora ou por muito mais tempo. Depois da remoção de BSA-TBS a 4%, o sobrenadante de cultura preparado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi deixada repousar a 37°C durante uma hora para associar os anticorpos exibidos de fago com o HMGB1 contido em cada cavidade. Cada cavidade foi lavada com CaCl2 a 1,2 mM/TBST (pH 7,6), e CaCl2 a 1,2 mM/TBS (pH 7,6) ou CaCl2 a 1,2 mM/NaCl a 150 mM/MES a 50 mM (pH 5,5) foi adicionado a esta. A placa foi deixada repousar a 37oC durante 30 minutos para incubação. Depois de lavar com a CaCl2 a 1,2 mM/TBST (pH 7,6), anticorpos anti-M13 conjugados por HRP (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) diluídos com BSA-TBS a 4% foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada durante uma hora. Depois de lavar com CaCl2 a 1,2 mM/TBST (pH 7,6), solução isolada de TMB (Invitrogen Corp.) foi adicionada à cavidade. A reação cromogênica da solução em cada cavidade foi terminada pela adição de ácido sulfúrico. Em seguida, a cor desenvolvida foi analisada com base na absorvência em 450 nm.
[00625] Genes de fragmento de anticorpo contidos em clones julgados como tendo capacidade de ligação a HMGB1 humano alterado dependendo do pH como resultado de ELISA de fago foram analisados quanto às suas sequências de nucleotídeo.
(26-4) Expressão e purificação da ligação de ligação ao HMGB1 humano
[00626] Os genes de três anticorpos julgados como tendo capacidade de ligação de antígeno dependente do pH como resultado de ELISA de fago, isto é, HM_3_2_R_017 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 131 e cadeia leve: SEQ ID N°: 132), HM_3_2_R_054 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 133 e cadeia leve: SEQ ID N°: 134), e HM_4_1_R_001 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 135 e cadeia leve: SEQ ID N°: 136), foram inseridos separadamente aos plasmídeos para expressão em células animais. Estes anticorpos foram expressos usando o seguinte método: uma linhagem FreesStyle 293-F derivada de célula de rim embriônica humana (Invitrogen Corp.) foi suspensa em Meio de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.). A suspensão que tem uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/mL foi inoculada em uma concentração de 3 mL/cavidade a uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram transferidos às células por lipofecção. As células foram cultivadas durante 4 dias em uma incubadora de CO2 (37oC, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida em 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(26-5) Avaliação do anticorpo obtido quando a sua capacidade de ligação dependente do pH junto a HMGB1 humano
[00627] Para julgar a dependência de pH da atividade de ligação de hHMGBI dos anticorpos HM_3_2_R_017 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 131 e cadeia leve: SEQ ID N°: 132), HM_3_2_R_054 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 133 e cadeia leve: SEQ ID N°: 134), e HM_4_1_R_001 (cadeia pesada: SEQ ID N°: 135 e cadeia leve: SEQ ID N°: 136) obtidos na etapa (26-4), estes anticorpos foram analisados quanto a sua interação com hHMGB1 usando Biacore T100 (GE Healthcare BioSciences Corp.). A interação da reação de antígeno-anticorpo foi analisada em soluções de pH 7,4 e pH 5,8 como condições de pH neutro e pH ácido, respectivamente. Aproximadamente de 200 RU de cada anticorpo de interesse foi capturado sobre fragmento de Sensor CM4 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) com proteína A/G (Pierce Biotechnology Inc.) imobilizada nisto em uma quantidade apropriada pelo método de acoplamento de amina. Dois tipos de soluções de tamponamento foram usados como tampões fluentes: ASES a 20 mM, NaCl a 150 mM, 0,05% (p/v) de Tween 20, e CaCl2 a 1,2 mM (pH 7.4); e ASES a 20 mM, NaCl a 150 mM, 0,05% (p/v) de Tween 20, e CaCl2 a 1,2 mM (pH 5,8). hHMGB1 foi da mesma forma diluído com cada destes tampões. O ensaio foi todo realizado a 25°C.
[00628] Na análise na interação da reação de antígeno-anticorpo que usa o anticorpo HM_3_2_R_017, o anticorpo HM_3_2_R_054, e o anticorpo HM_4_1_R_001, a solução de hHMGB1 diluída ou um tampão fluente em branco foi injetado em uma taxa de fluxo de 10 μL/min durante 60 segundos para capturar o antígeno sobre sobre o fragmento de sensor. O anticorpo HM_3_2_R_017, o anticorpo HM_3_2_R_054, e o anticorpo HM_4_1_R_001 foram interagidos com hHMGB1. Em seguida, HCl de glicina a 10 mM (pH 1,5) foi injetado a isto a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 30 segundos para regenerar-se sobre o fragmento de sensor.
[00629] Figura 15 mostra os sensógrafos destes anticorpos analisados pelo método anterior ao pH 7,4 e pH 5,8.
[00630] A partir destes resultados, a capacidade de ligação de hHMGB1 do anticorpo HM_3_2_R_017, do anticorpo HM_3_2_R_054, e do anticorpo HM_4_1_R_001 foi observada para ser reduzida pela alteração do pH de tampão de pH 7,4 a pH 5,8, mostrando que os anticorpos de ligação dependentes do pH podem ser obtidos da mesma forma junto a HMGB1 humano. Exemplo de Referência 1 Avaliação de anticorpo de ligação dependente de Ca quanto a sua influência na retenção de plasma de antígeno usando camundongo normal
(1-1) Teste in vivo usando camundongo normal
[00631] hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel; preparado no Exemplo de Referência 4) foi administrado sozinho ou simultaneamente com cada anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano para cada camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Em seguida, o hsIL-6R e o anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano foram avaliados quanto as suas farmacocinéticas in vivo. A solução de hsIL-6R (5 μg/mL) ou uma solução misturada de hsIL-6R e o anticorpo do receptor de IL-6 anti- humano foi administrada em uma única dose de 10 mL/kg à veia do rabo. O anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano usado foi H54/L28- IgG1, 6RL#9-IgG1, ou FH4-IgG1 descrito acima.
[00632] A solução misturada teve uma concentração de hsIL-6R fixada em 5 μg/mL, porém teve uma concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano que difere-se entre os anticorpos: 0,1 mg/mL para H54/L28-IgG1 e 10 mg/mL para 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1. Neste caso, uma quantidade excessiva do anticorpo do receptor de IL- 6 anti-humano está presente em uma solução misturada para ser suficiente para a ligação ao hsIL-6R. A grande maioria dos antígenos de hsIL-6R parece, portanto, estar ligada com os anticorpos. Sangue foi coletado 15 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 12.000 rpm a 4oC durante 15 minutos para obter o plasma. O plasma separado foi armazenado em um refrigerador fixado a -20°C ou abaixo até a prática de ensaio.
(1-2) Medida da concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano no plasma de camundongo normal por ELISA
[00633] A concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti- humano no plasma de camundongo foi medida por ELISA. Primeiro, o Fragmento F(ab') de IgG (específica de cadeia y) Anti-Humana (Sigma- Aldrich Corp.) foi distribuído em Placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International) e deixado repousar durante a noite a 4oC para preparar uma placa de fase sólida de IgG ant-humana. Amostras da curva de calibre tendo uma concentração de plasma de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, ou 0,01 μg/mL e amostras de ensaio de plasma de camundongo plasma diluídas 100 vezes ou mais foram cada qual distribuídas à placa de fase sólia de IgG anti-humano, que foi em seguida incubado a 25°C durante uma hora. Em seguida, o Anticorpo de IL-6 R Anti-humano Biotinilado (R&D Systems, Inc.) foi reagido com isto a 25°C durante uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Tecnologias de Detecção Estereoespecíficas GmbH) foi reagida com isto a 25°C durante 0,5 hora. O Substrato de Microcavidade de HRP e Um componente TMB (BioFX Laboratories Inc.) foi usado como um substrato em reação cromogênica. A reação cromogênica foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N (Showa Chemical Industry Co., Ltd.). Em seguida, a absorvência da solução de cor desenvolvida foi medida em 450 nm usando uma leitora de microplaca. A concentração de anticorpo no plasma de camundongo foi calculada com referência à absorvência da curva de calibre usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices, LLC). Figura 16 mostra a alteração nas concentrações dos anticorpos de H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, e FH4-IgG1 medidos por este método no plasma dos camundongos normais depois da administração intravenosa.
(1-3) Medida da concentração de hsIL-6R no plasma por método eletroquimioluminescente
[00634] A concentração de hsIL-6R no plasma de camundongo foi medida pelo método eletroquimioluminescente. As amostras da curva de calibre de hsIL-6R ajustadas em 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, ou 31,25 pg/mL e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram reagidas durante a noite a 4oC com uma solução misturada de Anticorpo de IL-6R Anti-humano Monoclonal (R&D Systems, Inc.) rotulado com rutênio usando SULFO-TAG NHS Éster (Meso Scale Discovery), Anticorpo de IL-6 R Anti- humano Biotinilado (R&D Systems, Inc.), e uma solução de tocilizumabe (cadeia pesada: SEQ ID N°: 24 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25). A concentração de Ca livre nas amostras foi diminuída para permitir quase todos os antígenos de hsIL-6R nas amostras serem dissociados a partir de 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1, e em seguida associados com o tocilizumabe adicionado. Para este propósito, o tampão de ensaio continha EDTA a 10 mM. Em seguida, a solução de reação foi distribuída à Placa de Estreptavidina de MA400 PR (Meso Scale Discovery). Depois da outra reação a 25°C durante uma hora, cada cavidade da placa foi lavada, e o Tampão de Leitura T (x4) (Meso Scale Discovery) foi em seguida distribuído a cada cavidade. Imediatamente depois disso, a solução de reação foi analisada usando leitora SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de hsIL-6R foi calculada a partir da resposta da curva de calibre usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices, LLC). Figura 17 mostra alteração na concentração de hsIL-6R medida por este método no plasma dos camundongos normais depois da administração intravenosa.
[00635] Como resultado, hsIL-6R sozinho foi depurado do sangue rapidamente, considerando que a administração simultânea dos mesmos com o anticorpo convencional H54/L28-IgG1 não tendo ligação de hsIL-6R dependente de Ca prolongou drasticamente a depuração do hsIL-6R. Em comparação, a administração simultânea dos mesmos com o anticorpo 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1 tendo 100 vezes ou superior a ligação de hsIL-6R dependente de Ca acelerou drasticamente a depuração do hsIL-6R. Os anticorpos 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1 administrados simultaneamente com hsIL-6R reduziu a concentração de hsIL-6R de plasma depois de 1 dia por 39 vezes e 2 vezes, respectivamente, em comparação com H54/L28-IgG1 administrado simultaneamente com isto. Isto demonstrou que o anticorpo de ligação dependente de cálcio pode acelerar a depuração de antígenos do plasma. Exemplo de Referência 2 Estudo na melhoria no efeito de aceleração da depuração de antígeno do anticorpo de ligação de antígeno dependente de Ca (Preparação de anticorpo)
(2-1) Com respeito à ligação de FcRn do anticorpo de IgG
[00636] O anticorpo de IgG tem retenção de plasma longa por sua ligação a FcRn. A ligação entre IgG e FcRn é observada apenas em uma condição ácida (pH 6,0) e é dificilmente observada em uma condição neutra (pH 7,4). O anticorpo de IgG não é especificamente capturado em células, porém, reciclado sobre a superfície celular por ligação ao FcRn endossômico sob a condição ácida no endossoma e dissociado de FcRn sob a condição neutra no plasma. IgG que perdeu a ligação de FcRn sob a condição ácida pela mutação da região de Fc não é mais reciclada no plasma a partir do endossoma, resultando na retenção de plasma significativamente prejudicada do anticorpo.
[00637] Métodos previamente relacionados para melhorar a retenção de plasma do anticorpo de IgG envolvem a melhoria de sua ligação de FcRn sob a condição ácida. A substituição de aminoácido é introduzida à região Fc do anticorpo de IgG para melhorar a ligação de FcRn sob a condição ácida, desse modo realçando a eficiência da reciclagem do anticorpo de IgG a partir do endossoma no plasma. Como resultado, a retenção de plasma do anticorpo de IgG é melhorada. Foi considerado importante para a introdução da substituição de aminoácido não realçar a ligação de FcRn sob a condição neutra. Foi acreditado que a retenção de plasma de uma tal ligação de anticorpo de IgG a FcRn sob a condição neutra é bastante prejudicada porque este anticorpo de IgG pode ser reciclado sobre superfície celular por ligação ao FcRn sob a condição ácida no endossoma, porém não pode ser nem dissociado de FcRn sob a condição neutra no plasma nem reciclado no plasma.
[00638] Como descrito por, por exemplo, Dall' Acqua et al. (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), um anticorpo de IgG1 que tornou-se capaz ligar-se a FcRn de camundongo sob a condição neutra (pH 7,4) pela introdução da substituição de aminoácido segundo relatos, exibe a retenção de plasma deteriorada, quando administrada a um camundongo. Como descrito por Yeung e outro (J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan et al. (J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717), e Dall' Acqua (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), um anticorpo de IgG1 criado que tem a capacidade melhorada de ligar-se a FcRn humano sob a condição ácida (pH 6,0) como resultado da introdução da substituição de aminoácido foi da mesma forma confirmado ligar-se a FcRn humano sob a condição neutra (pH 7,4). De acordo com os relatos, o anticorpo administrado a um macaco cinomolgo não exibiu melhoria na retenção de plasma ou alteração na retenção de plasma. As técnicas de criação de anticorpo convencional de melhorar as funções do anticorpo foram focalizadas na melhoria na retenção de plasma de anticorpos realçando-se a ligação a FcRn humano sob a condição ácida sem realçar a ligação a FcRn humano sob a condição neutra (pH 7,4). Especificamente, nenhum dos relatos prévios fez menção a cerca das vantagens do anticorpo de IgG1 que tem a ligação realçada a FcRn humano sob a condição neutra (pH 7,4) pela introdução da substituição de aminoácido para a região Fc.
[00639] Os anticorpos de ligação de antígeno dependentes de Ca são muito úteis por causa de seus efeitos de acelerar a depuração de antígenos solúveis e ligação aos antígenos solúveis repetidamente por uma molécula de anticorpo. Um método de realçar a ligação de FcRn sob a condição neutra (pH 7,4) foi testado para também melhorar este efeito de aceleração de depuração de antígeno.
(2-2) Preparação de anticorpo de ligação do receptor de IL-6 humana dependente de Ca sob a condição neutra
[00640] Os aminoácidos nas regiões de Fc de FH4-IgG1 e 6RL#9- IgG1 tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de cálcio e H54/L28-IgG1 usado como um controle não tendo capacidade de ligação de antígeno dependente de cálcio foram mutados para preparar as formas modificadas tendo ligação de FcRn sob a condição neutra (pH 7,4). A mutação de aminoácido foi realizada por PCR usando um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Especificamente, FH4-N434W (cadeia pesada: SEQ ID N°: 94 e cadeia leve: SEQ ID N°: 81), 6RL#9-N434W (cadeia pesada: SEQ ID N°: 95 e cadeia leve: SEQ ID N°: 79), e H54/L28-N434W (cadeia pesada: SEQ ID N°: 96 e cadeia leve: SEQ ID N°: 83) foram preparados pela substituição de Asn no aminoácido 434 definido pela numeração EU em uma região constante de cadeia pesada de IgG1 por Trp. Vetores de expressão para células animais que têm um inserção de um polinucleotídeo que codifica cada destas variantes de substituição de aminoácido foram preparados usando Kit de Mutagênese Direcionada ao Sitio QuikChange (Stratagene Corp.) de acordo com um método descrito no manual de instrução ligado ao kit. A expressão de anticorpo e purificação e medida da concentração foram realizadas pelo método descrito no Exemplo 15. Exemplo de Referência 3 Avaliação de anticorpo de ligação dependente de Ca quanto ao seu efeito acelerador de desaparecimento usando camundongo normal
(3-1) Teste in vivo usando camundongo normal
[00641] hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel; preparado no Exemplo de Referência 4) foi administrado sozinho ou simultaneamente com cada anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano para cada camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Laboratories Japan, Inc.). Em seguida, o hsIL-6R e o anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano foram avaliados quanto as suas cinéticas in vivo. A solução de hsIL-6R (5 μg/mL) ou uma solução misturada de hsIL-6R e o anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano foi administrada a uma única dose de 10 mL/kg à veia do rabo. O anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano usado foi H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, ou FH4-N434W descritos acima.
[00642] A solução misturada teve uma concentração de hsIL-6R fixada em 5 μg/mL, porém teve uma concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano que difere-se entre os tipos de anticorpo: 0,042 mg/mL para H54/L28-N434W, 0,55 mg/mL para 6RL#9-N434W, e 1 mg/mL para FH4-N434W. Neste caso, o anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano está presente em uma quantidade excessiva suficiente para hsIL-6R. A grande maioria dos antígenos de hsIL-6R, portanto, parece estar ligada com os anticorpos. Sangue foi coletado 15 minutos, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias, e 28 dias depois da administração. O sangue coletado foi centrifugado imediatamente em 12.000 rpm a 4°C durante 15 minutos para obter o plasma. O plasma separado foi armazenado em um refrigerador fixado a -20°C ou abaixa até a prática de ensaio.
(3-2) Medida da concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti-humano no plasma de camundongo normal por ELISA
[00643] A concentração de anticorpo do receptor de IL-6 anti- humano no plasma de camundongo foi da mesma maneira medida por ELISA como no Exemplo de Referência 1. A Figura 18 mostra alteração nas concentrações dos anticorpos H54/L28-N434W, 6RL#9- N434W, e FH4-N434W medidos por este método no plasma dos camundongos normais depois da administração intravenosa.
(3-3) Medida da concentração de hsIL-6R no plasma pelo método eletroquimioluminescente
[00644] A concentração de hsIL-6R no plasma de camundongo foi medida pelo método eletroquimioluminescente. As amostras de curva de calibre de hsIL-6R ajustadas em 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, ou 31,25 pg/mL e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram reagidas durante a noite a 4°C com uma solução misturada de Anticorpo de IL-6R Anti-humano Monoclonal (R&D Systems, Inc.) rotulado com rutênio usando SULFO-TAG NHS Éster (Meso Scale Discovery) e Anticorpo de IL-6 R Anti- humano Biotinilado (R&D Systems, Inc.). Concentração de Ca livre nas amostras foi diminuída para permitir quase todos os antígenos de hsIL- 6R nas amostras serem dissociados a partir de 6RL#9-N434W ou FH4-N434W para assumir as formas livres. Para este propósito, o tampão de ensaio continha EDTA a 10 mM. Em seguida, a solução de reação foi distribuída em Placa de Estreptavidina de MA400 PR (Meso Scale Discovery). Depois da reação adicional a 25°C durante uma hora, cada cavidade da placa foi lavada, e Tampão de Leitura T (x4) (Meso Scale Discovery) foi em seguida distribuída a cada cavidade. Imediatamente depois disso, a solução de reação foi analisada usando a leitora SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de hsIL-6R foi calculada a partir da resposta da curva de calibre usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices, LLC). A Figura 19 mostra a alteração na concentração de hsIL-6R medida por este método no plasma dos camundongos normais depois da administração intravenosa.
[00645] Como resultado, a administração simultânea de hsIL-6R com o anticorpo H54/L28-N434W tendo atividade de ligação de FcRn ao pH 7.4, porém, nenhuma atividade de ligação dependente de Ca junto a hsIL-6R prolongou drasticamente a depuração do hsIL-6R, comparada com a administração do hsIL-6R sozinho. Em comparação, a administração simultânea dos mesmos com o anticorpo 6RL#9- N434W ou o anticorpo FH4-N434W tendo 100 vezes ou superior de ligação de hsIL-6R dependente de Ca e da mesma forma a ligação de FcRn ao pH 7,4 acelerou o desaparecimento do hsIL-6R, em comparação apenas com a administração do hsIL-6R. O anticorpo 6RL#9-N434W e o anticorpo FH4-N434W simultaneamente administrados com hsIL-6R reduziram a concentração de hsIL-6R de plasma por 3 vezes e 8 vezes em um dia depois da administração, respectivamente, em comparação com o hsIL-6R administrado sozinho. Estes resultados demonstraram que o anticorpo de ligação de antígeno dependente de cálcio fornecido com atividade de ligação de FcRn em pH 7,4 pode também acelerar o desaparecimento de antígenos do plasma.
[00646] O anticorpo 6RL#9-IgG1 ou o anticorpo FH4-IgG1 tendo 100 vezes ou superior a atividade de ligação de hsIL-6R dependente de Ca foi confirmado ter o efeito de aumentar o desaparecimento de hsIL-6R, em comparação com o anticorpo H54/L28-IgG1 que não tem nenhuma ligação de hsIL-6R dependente de Ca. O anticorpo 6RL#9- N434W ou o anticorpo FH4-N434W que têm 100 vezes ou superior a atividade de ligação de hsIL-6R dependente de Ca e da mesma forma a ligação de FcRn ao pH 7,4 foi confirmada acelerar o desaparecimento de hsIL-6R, em comparação apenas com o hsIL-6R administrado. Estes dados sugerem que, como com o anticorpo de ligação de antígeno dependente do pH, o anticorpo de ligação de antígeno dependente de Ca é dissociado do antígeno no endossoma.
Exemplo de Referência 4 Preparação de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R)
[00647] Um antígeno recombinante do receptor de IL-6 humano foi preparado como segue: uma linhagem de célula de CHO estavelmente expressando um recepror de IL-6 humano solúvel (em seguida, referido como hsIL-6R) composto de uma sequência de aminoácido N- terminal a partir das posições 1 a 357 como relacionado por Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968) foi construído por um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. A linhagem de expressão foi cultivada para expressar hsIL-6R. hsIL-6R foi purificado a partir do sobrenadante de cultura obtido por cromatografia de coluna Blue Sepharose 6 FF e cromatografia de coluna de filtração de gel. Uma fração eluída como um pico principal na etapa final foi usada como um produto purificado final. Exemplo de Referência 5 Análise de RMN de anticorpo que compreende sequência de hVk1 humana que tem motivo de ligação de íon de cálcio para sua atividade de ligação de íon de cálcio
(5-1) Expressão e purificação de de anticorpo
[00648] Um anticorpo que compreende LfVk1_Ca e um anticorpo que compreende LfVk1 foi expressa para uso em ensaio de RMN e purificado. Especificamente, as células animais foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos para expressão em células animais preparadas para permitir expressão respectiva da cadeia pesada (SEQ ID N°: 24) e da cadeia leve (SEQ ID N°: 43) do anticorpo que compreende LfVk1_Ca (da mesma forma referido como um anticorpo LfVk1_Ca). Da mesma forma, as células animais foram transitoriamente transfectados com plasmídeos para expressão em células animais preparadas para permitir a expressão respectiva da cadeia pesada (SEQ ID N°: 24) e da cadeia leve (SEQ ID N°: 44) do anticorpo que compreende LfVk1 (da mesma forma referido como um anticorpo LfVk1). Os aminoácidos de rotulagem foram adicionados a 100 mL de uma suspensão de célula de uma linhagem FreesStyle 293-F derivada de célula de rim embriônica humana (Invitrogen Corp.) suspensa em uma densidade de célula final de 1 x 106 células/mL em Meio de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.). Especificamente, para o rótulo de Asp/Glu/Gln/Asn, ácido L-aspártico-13C4,15N (10 mg), ácido L-glutâmico-13C5,15N (2,5 mg), L-glutamina-13C5,15N2 (60 mg), L- asparagina-13C4,15N2-H2O (2,5 mg), e β-cloro-L-alanina (6 mg) foram suspensos em 10 mL de água, e a solução resultante foi filtrada por um filtro de 0,22 μm, e em seguida adicionada a isto. Para o rótulo de Leu, L-leucina-15N (30 mg) e β- cloro-L-alanina (6 mg) foram suspensos em 10 mL de água, e a solução resultante foi filtrada por um filtro de 0,22 μm, e em seguida adicionada a isto. Os plasmídeos preparados foram transferidos às células por lipofecção. As células transfectadas com os plasmídeos foram cultivadas durante 5 dias em uma incubadora de CO2 (37oC, 8% de CO2, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido de acordo com um método geralmente conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose(TM) Fast Flow (Amersham Biosciences, Inc.). A absorvência da solução de anticorpo purificada foi medida em 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir do valor de medida obtido por uso de um coeficiente de extinção calculado por PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(5-2) Preparação de fragmento Fab
[00649] Cada anticorpo foi concentrado em 8,2 a 11,8 mg/mL usando uma membrana de ultrafiltração tendo um corte de peso molecular de 30.000 MWCO. O anticorpo foi diluído em 8 mg/mL com 1 mM de L-cisteína, 2 mM de EDTA, e ácido acético a 50 mM/solução tris de tamponamento a 125 mM (pH 6,8) para preparar uma amostra de anticorpo. Depois de adição de papaína (Roche Applied Science) em 1/240 da quantidade de cada anticorpo, a amostra foi agitada, e em seguida deixada repousar a 37oC durante uma hora. A amostra desse modo deixada repousar foi adicionada a uma HP ativada por HiTrap NHS de 1 mL de medida conjugada por peptídeo de Gly-Gly- Tyr-Arg (Sigma-Aldrich Corp.) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) (equilibrado com ácido acético a 50 mM/solução tris de tamponamento a 125 mM (pH 6.8)) conectada em tandem com uma coluna portadora de proteína A de 1 mL de medida a jusante HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A papaína ativada foi removida pelo peptídeo de Gly-Gly-Tyr-Arg a montante, enquanto os fragmentos Fc e anticorpos indigestos foram removidos pela coluna portadora de proteína A a jusante para obter uma fração purificada do fragmento Fab. Um inibidor de cisteína protease E64 de 10 μM (Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionado à fração de Fab para prevenir a ativação da papaína inativa contida na fração de Fab. A operação de coluna foi toda realizada em temperatura ambiente de 20 a 25°C.
(5-3) Preparação de amostras de RMN de fragmentos Fab de anticorpo LfVkl Ca e LfVkl
[00650] Cada solução de anticorpo foi concentrada a 0,5 mL por centrifugação usando um ultrafiltro de MWCO 5000 Vivaspin (Sartorius). Em seguida, a Xícara de Diafiltração foi colocada no ultrafiltro, e a solução de tampão foi substituída com uma solução de tampão para RMN: d-BisTris a 5 mM, NaCl a 20 mM, 0,001% (p/v) de NaN3, e 5% (v/v) de 2H2O (pH 7,0) (ajustado por pH usando NaOH ou HCl) (5 mL da solução de tampão foram adicionados à Xícara de Diafiltração, os teores dos quais foram concentrados em 0,5 mL por centrifugação; esta operação foi repetida três vezes). A solução resultante foi concentrada finalmente em 0,25 mL. Finalmente, o ultrafiltro foi lavado completamente com a solução de tamponamento de RMN. As lavagens foram combinadas com o concentrado para preparar 420 μL de uma solução de anticorpo LfVk1_Ca e 270 μL de uma solução de anticorpo LfVk1. Neste estágio, o pH de cada solução foi novamente confirmado e ajustado, se necessário, para pH 7,0 com NaOH ou HCl. A absorvência foi medida em 280 nm usando um medidor UV Nanodrop (Thermo Fisher Scientific K.K.). Cada fragmento Fab foi quantificado com o coeficiente de extinção molar em 280 nm fixado em 70000 M-1-cm-1 e consequentemente determinado ser 0,12 mM para o anticorpo LfVk1_Ca rotulado por Leu e o anticorpo LfVk1 rotulado por Leu e 0,24 mM para o anticorpo LfVk1_Ca rotulado por Asp/Glu/Asn/Gln e o anticorpo LfVk1 rotulado por Asp/Glu/Asn/Gln. Destas amostras, cada anticorpo LfVk1_Ca foi carregado em um tubo de amostra de RMN (Shigemi Co., Ltd.) de 5 mM em diâmetro, enquanto cada anticorpo LfVk1 foi carregado em um tubo de microamostra simétrico por soluções aquosas (Shigemi Co., Ltd.) de 5 mM em diâmetro usando uma pipeta Pasteur. Na experiência de titulação de Ca2+ do anticorpo LfVk1_Ca, soluções de CaCl2 foram consecutivamente adicionadas à solução de anticorpo em 1, 2, 5, 10, e 20 equivalentes molares de Ca2+ ao anticorpo. As soluções de CaCl2 usadas na adição foram preparadas como soluções de 10, 20, 50, e 100 mM de CaCl2 dissolvidas em um tampão de RMN. As quantidades necessárias das soluções de CaCl2 foram diretamente adicionadas em volumes na faixa de 3 a 10 μL às soluções de anticorpo carregadas nos tubos de amostra de RMN usando uma microsseringa de ordem especial (Ito Corp.) com uma porção da seringa estendida a partir do já feito. Os tubos de amostra foram agitados usando misturador de vórtice, e em seguida centrifugadas em uma centrífuga manual (Shimadzu Corp.).
(5-3) Análise de RMN para observar os sinais de grupo amida dos fragmentos Fab de anticorpo LfVkl Ca e LfVkl Ca
[00651] A análisede RMN foi realizada usando um espectroscópio de RMN DRX750 (Bruker Biospin K.K.) equipado com TCI CryoProbe. A temperatura foi fixada em 307 K (fluxo de gás: 535 L/h). 1H-15N HSQC foi usado no ensaio de RMN para observar os sinais de grupo amida. 1H-15N FHSQC que envolve o desacoplamento de 13C simultâneo de a-carbono e carbonil carbono no período de evolução de 15N, e série de pulsos de 3-9-19 para o cancelamento de sinais de água solventes foi usado no método de ensaio. Para o controle disto, o programa de pulso incluído como padrão pelo fabricante (Bruker Biospin K.K.) foi usado. As condições de ensaio de RMN foram como segue: largura de espectro: 12019 Hz (f2) e 1976 Hz (f1), e o número de pontos de dados: 2048 (f2) e 128 (f1). Topspin 3.0 (Bruker Biospin K.K.) foi usado para o processamento de dados. As condições de processamento de dados foram como segue: igualmente para f2 e f1, os dados foram multiplicados com uma função da janela de sino de seno trocado (QSINE) e carregado em zero para duplicar o número de pontos de dados, seguido por transformação Fourier. Os desvios químicos dos sinais foram calculados usando o software de análise de RMN Sparky (UCSF).
(5-4) Atribuição do sinal de RMN de grupo amida de cadeia principal
[00652] 80% de sinais de RMN foram atribuídos até agora aos grupos amida de cadeia principal no fragmento Fab de tocilizumabe (cadeia pesada: SEQ ID N°: 24 e cadeia leve: SEQ ID N°: 25) (dados não publicados). A sequência de aminoácido do fragmento Fab do anticorpo LfVk1_Ca é igual àquela do fragmento Fab de tocilizumabe com exceção de uma porção de CDR1 de cadeia leve, CDR2, e CDR3 e resíduos de aminoácido de cadeia leve 73 e 83. Como os sinais de RMN das mesmas partes nas sequências de aminoácido destes anticorpos têm desvios químicos idênticos ou similares, a informação de atribuição a cerca de tocilizumabe pode ser migrada ao anticorpo LfVk1_Ca. A atribuição de resíduos de cadeia leve 11, (33), (46), (47), (54), (78), 125, 135, 136, 154, 175, 179, 181, e 201 e resíduos de cadeia pesada 18, 46, 64, 71, 81, 83, 114, 144, 147, 165, 176, 181, 184, e 195 puderam ser migrados à amostra rotulada por Leu. Os números sem parênteses representam números de resíduo aos quais a atribuição pôde ser migrada por causa de seus desvios químicos idênticos àqueles de tocilizumabe. Os números em parênteses representam números de resíduo aos quais a atribuição pôde ser migrada por causa de seus desvios químicos similares àqueles de tocilizumabe e a ausência dos outros sinais que têm desvios químicos similares. Para a amostra rotulada por Asp/Glu/Asn/Gln, quatro sinais foram observados recentemente em LfVk1_Ca pela comparação espectral entre o anticorpo LfVk1_Ca e o anticorpo LfVk1. Estes sinais foram classificados bem sucedidamente como sinais derivados de qualquer 4 de 5 resíduos introduzidos como motivos de ligação de Ca2+, isto é, Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, e Glu50, na cadeia leve que diferem-se na sequência entre os anticorpos, entre os resíduis de Asp, Glu, Asn, e Gln.
(5-5) Identificação do sítio de ligação de Ca2+ em anticorpo LfVkl Ca
[00653] Sinais que têm alteração no desvio químico foram extraídos pela comparação espectral de 1H-15N HSQC entre o fragmento Fab de anticorpo LfVk1_Ca não suplementado com Ca2+ e o fragmento Fab suplementar com 20 equivalentes molares de Ca2+. Os resultados a cerca das amostras rotulada por Leus demonstraram que Leu33 de cadeia leve está envolvida na ligação, considerando que os outros resíduos de Leu não estão envolvidos na ligação. Os resultados a cerca das amostras rotuladas por Asp/Glu/Asn/Gln demonstraram que quaisquer 4 dos 5 resíduos (Asp30, Asp31, Asp32, Asp92, e Glu50 de cadeia leve) estão envolvidos na ligação, considerando que os outros resíduos de Asp, Glu, Asn, e Gln com exceção de 1 resíduo não estão envolvidos na ligação. A partir destes resultados, os aminoácidos em pelo menos CDR1 de cadeia leve na sequência de aminoácido introduzida como os motivos de ligação de Ca2+ bem como em uma ou ambas CDR2 e CDR3 de cadeia leve foram identificados para participarem na ligação de Ca2+. Isto foi consistente com os resultados confirmados no Exemplo 15 exibindo que o importante para ligação de íon de cálcio é que 4 dos 30, 31, 32, 50, e 92 resíduos (definidos pelo numeração de Kabat) são aminoácidos da sequência de hVk5-2.
(5-6) Cálculo da constante de dissociação de Ca2+ na experiência de titulação
[00654] Espectros de 1H-15N HSQC foram usados, os quais foram obtidos quando a concentração de Ca2+ foi de 0, 1, 2, 5, 10, ou 20 equivalentes molares ao fragmento Fab de anticorpo LfVk1_Ca. Um desvio química de 1H ou 15N no sinal de Leu33 de cadeia leve identificada como um sítio de ligação foi plotado na ordenada, enquanto os equivalentes molares acima de Ca2+ foram plotados na abscissa. Os dados foram ajustados em uma função representada pela seguinte expressão 2 usando o software de criação de gráfico Gnuplot: Expressão 2 f(x) = s x [1 - 0,5 / a x {(a x x + a + Kd) - ((a x x + a + Kd)2 - 4 x x x a2)0’5} + t x [0,5 / a x {(a x x + a + Kd) - ((a x x + a + Kd)2 - 4 x x x a2)0’5}
[00655] Na função representada pela expressão 2, s e t representam um desvio químico [ppm] na ausência de Ca2+ ligado e um desvio químico putativo [ppm] na presença de Ca2+ ligado por saturação, respectivamente; a representa a concentração [M] do fragmento Fab de anticorpo; Kd representa uma constante de dissociação; e x representa o equivalente molar de Ca2+ adicionado ao fragmento Fab de anticorpo. Para o ajustamento, s, t, e Kd foram usados como parâmetros de ajustamento. Como resultado, Kd = 7,1 x 10-5 [M] foi estimada a partir do desvio químico de 1H, e Kd = 5,9 x 10-5 [M] foi estimada a partir do desvio químico de 15N.

Claims (18)

1. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que consiste em uma pluralidade de anticorpos que se diferem na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada um dos anticorpos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve e ainda compreende um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno do anticorpo dependendo das condições da concentração de íon, em que a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio, e o resíduo de aminoácido está localizado na posição 30, 31, ou 32 na CDR1, posição 50 na CDR2 ou posição 92 na CDR3, definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve.
2. Biblioteca de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de estrutura de cadeia leve no anticorpo compreende uma sequência de estrutura de linhagem germinativa.
3. Biblioteca de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
4. Biblioteca de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido forma um motivo de ligação de cálcio.
5. Biblioteca de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que onde o motivo de ligação de cálcio é um motivo de ligação de cálcio selecionado a partir de um domínio de caderina, um EF hand, um domínio de C2, um domínio de Gla, uma lectina tipo C, domínio A, uma anexina, um domínio tipo 3 de trombospondina, um domínio tipo EGF, um domínio de Vk5, um domínio representado por SEQ ID NO: 10, e um domínio representado por SEQ ID NO: 11.
6. Biblioteca de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido é um aminoácido que tem um efeito de quelação de metal.
7. Biblioteca de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o aminoácido que tem um efeito de quelação de metal é serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico.
8. Biblioteca de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a pluralidade de anticorpos são scFvs.
9. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que consiste em uma pluralidade de polipeptídeos de fusão cada qual compreendendo anticorpos que se diferem na sequência mutuamente, em que um domínio de ligação de antígeno em cada um dos anticorpos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve e ainda compreende um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno do anticorpo dependendo das condições da concentração de íon, em que a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio, e o resíduo de aminoácido está localizado nas posições 30, 31 ou 32 na CDR1, posição 50 na CDR2 ou posição 92 na CDR3 definidas pela numeração de Kabat na região variável de cadeia leve.
10. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que cada um dos polipeptídeos de fusão é um produto de fusão do anticorpo e uma porção de uma proteína do envoltório viral.
11. Biblioteca de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína do envoltório viral é selecionada a partir do grupo que consiste em proteína pIII, proteína do envoltório principal pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pv1, e variantes das mesmas.
12. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a região de estrutura de cadeia leve no anticorpo compreende uma sequência de estrutura de linhagem germinativa.
13. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácido de uma sequência não tratada.
14. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido forma um motivo de ligação de cálcio.
15. Biblioteca de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que onde o motivo de ligação de cálcio é um motivo de ligação de cálcio selecionado a partir de um domínio de caderina, um EF hand, um domínio de C2, um domínio de Gla, uma lectina tipo C, domínio A, uma anexina, um domínio tipo 3 de trombospondina, um domínio tipo EGF, um domínio de Vk5, um domínio representado por SEQ ID NO: 10, e um domínio representado por SEQ ID NO: 11.
16. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido é um aminoácido que tem um efeito de quelação de metal.
17. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o aminoácido que tem um efeito de quelação de metal é serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico.
18. Biblioteca de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a pluralidade dos anticorpos são scFvs.
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