CN106459192B - 具有pH依赖性抗原结合的抗TNFa抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经工程改造以显示pH敏感抗原结合的抗TNFa抗体。本发明优选地涉及抗TNFa抗体阿达木单抗(Humira®)或其生物活性变体和片段，其中通过可变区内氨基酸序列的修饰来工程改造原始的阿达木单抗抗体或其变体或片段。具体地，本发明涉及阿达木单抗或其生物活性变体或片段，其中CDR结构域通过用组氨酸残基取代一个或多个氨基酸残基来修饰。

Description

具有pH依赖性抗原结合的抗TNFa抗体
发明领域
本发明涉及经工程改造以显示pH敏感抗原结合的抗TNFa抗体。本发明优选地涉及抗TNFa 抗体阿达木单抗
Figure BDA0001196846930000011
或其生物活性变体和片段，其中通过可变区内氨基酸序列的修饰来工程改造原始的阿达木单抗抗体或其变体或片段。具体地，本发明涉及阿达木单抗或其生物活性变体或片段，其中CDR结构域通过用组氨酸残基取代一个或多个氨基酸残基来修饰。
所得修饰的抗TNFa抗体引起改善的药代动力学性质，其具有改善的抗原介导的IgG 清除率和延长的总体血清半衰期。
发明背景
据信治疗性抗体(mAb)至少为许多疾病如炎症、自身免疫或肿瘤疾病提供重要的治疗选择。在2012年，美国市场上针对肿瘤学和抗炎症疾病的各种靶标有40个FDA批准的mAb，在生物制剂市场中约占38.5％的份额。销售额约246亿美元表明治疗性抗体作为所有生物制剂的最高收入类别的作用(Aggarwal，2009，Aggarwal，2014)。
对于治疗性抗体，通过含有四类天然存在的相互作用配偶体(抗原、新生儿Fc-受体 (FcRn)、Fc-受体(FcγR)和补体系统因子)的相互作用曲线测定不同的生物学结果(Chan和Carter，2010)。已经报道了若干种策略以优化旨在额外或改善的功能和特异性的抗体(Beck等人，2010)。在抗体内，有两个结构特征可以用于工程改造。第一，介导与抗原相互作用的可变片段(Fv)，其次是参与抗体再循环或介导与免疫细胞相互作用的恒定片段(Fc)。
对于不同的抗原(例如细胞因子和生长因子)，存在多种作用机制，例如阻断可溶性配体，从而阻止与其相应受体的相互作用或阻断受体本身(Chan和Carter，2010)。已经投入了大量的努力来改善对Fv工程改造的功能，其通常通过增加对各抗原的特异性和/或结合亲和力而被估价(Beck等人，2010)。提高抗体功效的一个策略是通过亲和力成熟方法增强 Fv-抗原相互作用。本文中，使用显示技术筛选分子文库允许分离表现出优异亲和力的变体。
恒定片段(Fc)及其连接的性质可以用改变的免疫或抗体再循环的结果来调节。改变的Fc介导的免疫功能的突出实例是已经被提出以增强抗体功效和减少剂量的增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
已经探索了其它策略，包括抗体的直接和间接装备或多价抗体内特异性的调节(Carter 2011)。
Fc功能的一个重要方面对应于其在决定人免疫球蛋白1(IgG1)的长血清半衰期的抗体再循环中的关键作用。在通过流体相胞饮作用的细胞吸收后，IgG1的Fc部分以pH依赖性方式与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用，导致酸化的内体中的抗体捕获(Kuo和 Aveson，2011)。从那里，抗体被再循环回到循环中，并因此可以被保护免于细胞内分解代谢。产生具有增强的FcRn结合亲和力的不同的突变Fc-种类，并通过取代三种氨基酸来测试增加的再循环速率，其在食蟹猴研究中具有高达4倍延长的血清半衰期(Dall'Acqua等人，2006)。
虽然大多数抗体表现出高效的抗原阻断，但是存在在治疗性抗体的开发过程中没有完全解决的缺点：
Figure BDA0001196846930000021
在许多治疗性抗体中，抗体结合位点在抗体在血浆中的生存期间仅结合一个抗原分子 (Igawa等人，2010)。
Figure BDA0001196846930000022
抗体注射的剂量和频率取决于两次注射之间的抗原合成速率，因为抗原通常在体内连续产生(Igawa等人，2010)。
Figure BDA0001196846930000023
高生产成本和大量抗体的给药：
Tocilicumab治疗：8mg/kg/月，静脉注射(Maini等人，2006)，
阿达木单抗治疗：每隔一周40mg($19,272/每人/每年(Schabert等人，2013)。
Figure BDA0001196846930000024
当抗体结合可溶性靶时，可发生“抗体缓冲”效应，其中抗原的降解在与抗体结合时被阻止。游离抗原库建立自抗原-抗体复合物的可逆解离，并因此延长体内持久性 (O'Hear和Foote，2005)/Finkelman等人，1993)。
考虑到治疗性抗体的这些缺点，需要在不存在高剂量和/或频繁给药的情况下产生治疗响应的更有效的分子(Chapparo-Riggers等人，2012)。
实现这些目标的一种可能性是对新的或良好建立和批准的抗体的可变区和任选的恒定区进行特异性工程改造。一种方法是开发表现出pH敏感抗原结合的抗体。已经表明，组氨酸在抗体和其它蛋白质的结合界面中的合理或组合掺入(Sarkar等人，2002，Chaparro- Riggers等人，2012，Ito等人，1992，Igawa等人，2010，Igawa等人，2013，Murtaugh等人，2011，Gera等人，2012)可以通常用于工程改造pH依赖性结合。pH敏感结合的基础源于组氨酸对微环境中由于pH值降低而质子化的敏感性。更详细地，组氨酸需要在结合时经历pKa变化，以便在生理pH范围内质子化(Murtaugh等人，2011)。结合界面中组氨酸侧链的质子化可改变静电相互作用或可诱导导致结合亲和力的pH依赖性差异的构象变化(Gera等人，2012)。结合平衡的平衡的静电和非静电组分决定了结合的敏感性(Murtaugh等人，2011)。
将pH敏感性掺入抗原结合位点可以增加抗原结合循环的数目。本文中，pH依赖性抗体在血浆pH(pH 7.4)下以相似的高或降低的足够的亲和力与其抗原结合，并且在酸性pH(pH 6)下显示减少的结合(Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)，导致抗体从其在酸性内体内的抗原结合位点的更快和增加的解离，从而能够再循环回到血浆并降低抗原介导的清除。
在结合可溶性靶的常规抗体的FcRn介导的再循环(图1a)期间，抗体-抗原复合物通过内体运输途径再循环回到细胞外空间(Roopenian和Akilesh，2007)。相比之下，pH敏感抗体(图1b)在内体酸化期间(pH<6.5)从抗体-抗原复合物释放其抗原(Roopenian和Akilesh，2007)。结果，游离抗体再循环到循环中，而抗原进入降解途径(Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)。
因此，pH敏感结合能够使得抗体与另一抗原相互作用，并允许每个抗体分子的多个抗原分子的中和。PH-敏感性还可以增加抗体的半衰期，所述抗体针对膜相关靶并且例如在受体结合时内化和降解。本文中，当抗体在内体酸化期间释放时，pH敏感性可以导致半衰期增加。
公开了若干种不同的策略，目的是工程改造蛋白质中的pH转换。以每个单个氨基酸残基(例如在CDR区内)突变为His的组氨酸(His)扫描允许单取代变体的表征和有效突变的鉴定。通过组合这些取代产生新的变体可以导致增强的pH依赖性结合(Murtaugh等人，2011，Chaparro-Riggers等人，2012，Igawa等人，2010)。通过基于结构的建模置换组氨酸时可能有助于pH敏感性的残基的鉴定可以帮助尽可能减少在组氨酸扫描方法期间所需的努力和时间。需要晶体结构以便具备对于结合和pH转换的合理设计重要的残基的精确概念(Sarkar等人，2002)。组合组氨酸扫描文库方法需要体外筛选技术(例如噬菌体展示或酵母展示)，以从大分子文库分离pH敏感变体。Murtaugh及其同事通过使用寡核苷酸定向诱变设计了美洲驼VHH抗体文库，从而允许结合界面内的每个残基取样亲本VHH抗体的组氨酸残基和野生型残基两者。对于M13-噬菌体展示文库
Figure BDA0001196846930000031
分离的变体的筛选显示在pH7.4下的在35-91nM之间的KD和在pH 5.4下结合亲和力约104倍减少 (Murtaugh等人，2011)。
由于再循环的游离抗体能够结合另一抗原，因此与其中单个抗体可以与抗原仅结合一次的常规方法相比，pH依赖性抗原结合将使单个抗体分子能够重复结合多个抗原。
因此，通常需要制备关于其血浆和血清浓度更有效的可获得的抗体，其可以通过对治疗性抗体的不同细胞作用位点安装pH敏感性来实现。
发明内容
本发明提供了抗-TNFa抗体阿达木单抗
Figure BDA0001196846930000041
的突变形式，其中所述突变由原始非突变的抗体阿达木单抗的氨基酸残基被组氨酸残基取代的一个或多个取代构成，所述组氨酸残基在所述抗体的重链和/或轻链可变结构域的互补决定区(CDR)中。在阿达木单抗的一些CDR中的限定位置处引入组氨酸残基，使得与非突变的抗体相比，原始抗体更加pH敏感或pH依赖。有趣的是，虽然组氨酸突变的抗体经历结合亲和力的显著丧失(高达10 倍或更多的KD)，但是与其亲本非突变形式相比，本发明的突变的抗体治疗上显著更有效，导致减少抗体剂量或抗体给药间隔，和由此显著降低治疗成本的可能性。
本发明已经表明，根据本发明，通过置换阿达木单抗或其生物活性变体及其片段的 CDR中的原始氨基酸残基而成功引入组氨酸残基，就关于pH敏感性和结合亲和力的程度的期望结果而言，不遵守常规规则或心理考虑。
因此，业已发现，阿达木单抗的组氨酸突变形式是特异性治疗有效的，如果pH依赖性抗原结合导致抗原解离速率(Kdis)比pH6/pH7，其与非突变的阿达木单抗的各自Kdis速率比相比为5至20倍高，并且所述突变的阿达木单抗的结合亲和力是所述非组氨酸突变的阿达木单抗的结合亲和力的1-25％，优选1-15％，更优选2-12％。
因此，本发明提供了具有pH依赖性抗原结合的人抗TNFa抗体或其抗原结合片段，其包含人抗体阿达木单抗或其具有相同或相似生物活性的变体的轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区和/或重链可变区的至少一个CDR结构域通过用组氨酸残基置换所述 CDR结构域内的一个或多个氨基酸而突变，因此产生突变的阿达木单抗或阿达木单抗变体，引起pH依赖性抗原结合，其具有通过Bioayer Interferometrie(Octet Red)或其它相当的方法测量的抗原解离速率(Kdis)比pH 6/pH 7，其与非突变的阿达木单抗的各自Kdis速率比相比为至少5、10、15或10倍高。
在另一个实施方案中，本发明提供各自的突变阿达木单抗，其中所述突变的抗体或其抗原结合片段具有减小的抗原结合亲和力，其中优选为非突变的阿达木单抗的结合亲和力的1-15％，分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、 13％、14％或15％。
本发明提供衍生自阿达木单抗的人抗TNFa抗体，其中亲本阿达木单抗的CDR内的一个或多个原始氨基酸残基用组氨酸残基置换。有趣的是，阿达木单抗的最有效的组氨酸突变的形式包含在可变轻链内，尤其是在轻链的CDR1和CDR3结构域中的组氨酸突变。优选的组氨酸突变的阿达木单抗形式进一步或独立地包括组氨酸突变的CDR3重链。
因此本发明提供突变的阿达木单抗或其抗原结合片段，包含选自以下的CDR3重链序列：
Figure BDA0001196846930000051
或H，且X4为S或H，和其中至少X1或X2或X3或X4为H。
本发明进一步提供突变的阿达木单抗或其抗原结合片段，包含选自以下的CDR3轻 链序列：
Figure BDA0001196846930000052
其中X1为Q或H，和X2为T或H，
X 1 X2X3X4 RAPYX 5 (SEQ ID NO：41)，其中X1为Q或H，X2为R或H，X3为Y 或H，X4为N或H，和X5为T或H，其中至少X1或X2或X3或X4或X5为H。
本发明进一步提供突变的阿达木单抗或其抗原结合片段，包含选自以下的CDR1轻 链序列：
RASQGIRNHLA (SEQ ID NO：15)，
RASQGIRNHHA (SEQ ID NO：16，
RASQGIRNX1X2 A (SEQ ID NO：42)，
其中X1为Y或H，X2为L或H，其中至少X1或X2为H。
本发明进一步提供突变的阿达木单抗或其抗原结合片段，包含选自以下的CDR2轻 链序列：
AAHTLQS (SEQID NO：32)。
在本发明的一个实施方案中，所述组氨酸突变的阿达木单抗或其抗原结合片段包含如本公开内容中所述的CDR3重链序列，和如本公开内容中所述的CDR1 轻链序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述组氨酸突变的阿达木单抗或其抗原结合片段包含如本公开内容中所述的CDR3重链序列和CDR3轻链序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述组氨酸突变的阿达木单抗或其抗原结合片段包含如本公开内容中所述的CDR3重链序列、CDR2轻链序列和CDR3轻链序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述组氨酸突变的阿达木单抗或其抗原结合片段包含如本公开内容中所述的CDR3重链序列、CDR1轻链序列和CDR3轻链序列。
本发明人发现，组氨酸突变的阿达木单抗的优选形式包含以下轻链可变区之一：
(i)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000011
(ii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000012
(iii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000013
(iv)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000014
(v)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000021
(vi)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000022
(vii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000023
(viii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000024
(ix)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000025
其中X1为L或H，
(x)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000026
其中X1为Q或H，和X2为T或H
(xi)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000027
其中X1为T或H；
(xii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000031
其中X1为Q或H；
(xiii)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000032
其中X1为L或H，和X2为Q或H，和X3为T或H；
(xiv)
Figure DEST_PATH_GDA0002732609320000033
其中X1为Y或H，X2为L或H，X3为S或H，X4为Q或H，X5为R或H，X6为Y或 H，X7为N或H，X8为T或H，其中至少X1或X2或X3或X4或X5或X6或X7或X8为 H。
本发明人进一步发现，组氨酸突变的阿达木单抗的优选形式包含以下重链可变区之一：
(i)
Figure BDA0001196846930000084
(ii)
Figure BDA0001196846930000085
(iii)
Figure BDA0001196846930000086
(iv)
Figure BDA0001196846930000091
其中X1为S或H，X2为L或H，X3为S或H，X4为S或H，其中至少X1或X2或X3或X4为 H。
根据本发明优选的组氨酸突变的阿达木单抗包含如上所述的任何可变轻链和如上所述的任何一个可变重链结构域。
本发明的第一优选实施方案是组氨酸突变的阿达木单抗，其分别包含可变重链序列：
Figure BDA0001196846930000092
和
可变轻链序列：
Figure BDA0001196846930000093
本发明的第二优选实施方案是组氨酸突变的阿达木单抗，其分别包含可变重链序列：
Figure BDA0001196846930000094
和
可变轻链序列：
Figure BDA0001196846930000095
本发明的第三优选实施方案是组氨酸突变的阿达木单抗，其分别包含可变重链序列：
Figure BDA0001196846930000101
和
可变轻链序列：
Figure BDA0001196846930000102
组氨酸突变的阿达木单抗抗体或其变体或片段可以进一步包含人重链和/或轻链恒定区。
在一个实施方案中，它们包含人IgG，优选人IgG1(例如由SEQ ID NO：11指定) 或IgG2重链恒定区。
在本发明的另一个实施方案中，它们包含人κ轻链恒定区。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组氨酸突变的阿达木单抗形式包含人重链恒定区，优选IgG1，其中Fc部分在一个或多个氨基酸位置突变，所述突变通过用其它介导(增加或减少)抗体与FcRn结合的天然氨基酸残基来置换原始氨基酸残基。
本发明的组氨酸突变的阿达木单抗抗体可以通过与其它多肽或蛋白质例如细胞因子的重组融合，或通过与化学，优选细胞毒性实体的化学连接，优选通过连接分子形成抗体- 药物缀合物(ADC)缀合至其它分子。产生此类抗体融合蛋白或抗体药物缀合物的技术和方法在本领域中已经得到很好地确认。
本发明还提供了适用于治疗炎症、自身免疫或癌症疾病的药物组合物，其包含组氨酸突变的抗TNFa抗体阿达木单抗或其变体或抗原结合片段，或各自的抗体-药物缀合物或抗体细胞因子融合蛋白以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明最后提供了此类组氨酸突变的阿达木单抗或其生物有效和活性变体或片段，或ADC或其融合蛋白在制备用于治疗TNFa诱导的炎症、自身免疫或癌症疾病的药物中的治疗用途，详细说明如下。
本发明的组氨酸突变的阿达木单抗形式显示出以下有利的性质和功能：
Figure BDA0001196846930000103
阿达木单抗结合位点在TNFα结合后的长时间内不再被阻断。
Figure BDA0001196846930000104
阿达木单抗显示与靶抗原显著改善的pH敏感结合。
Figure BDA0001196846930000105
在FcRn的再循环期间，通过在酸化的内体中组氨酸突变的阿达木单抗可以更有效地释放sTNFα。
Figure BDA0001196846930000111
在结合膜结合靶(mTNFα)时，可以避免或减少引发将导致抗体消除的mTNFα-阿达木单抗复合物的受体介导的内化和溶酶体降解。
Figure BDA0001196846930000112
显示pH依赖性靶结合的TNFα结合抗体的改善的药代动力学。
Figure BDA0001196846930000113
pH敏感抗体变体通过改变抗体可变区内的氨基酸序列而衍生自亲本阿达木单抗序列。
Figure BDA0001196846930000114
将pH敏感性掺入阿达木单抗是通过用组氨酸取代重链和轻链可变区的氨基酸确立的。
Figure BDA0001196846930000115
阿达木单抗变体的pH敏感性对应于在pH6/pH7.4下与亲本阿达木单抗的比率相比动力学参数(KD，kdis)之间增加的比率。
Figure BDA0001196846930000116
在这方面，根据本发明的阿达木单抗抗体能够中和抗原多次。
Figure BDA0001196846930000117
因此，治疗效果可以延长，并且可以允许更低频率的抗体的施用和/或以更低的剂量的施用。
发明详述
肿瘤坏死因子α(TNFα)：
TNFα是在免疫应答中通过引发对例如一些细菌感染的防御应答而发挥关键作用的细胞因子。它在正常炎症的复杂网络中起作用，并且还参与淋巴组织发育(Tracey等人，2008)。
许多不同的细胞产生TNFα，包括巨噬细胞、T细胞、肥大细胞和粒细胞，仅举几例。TNFα是通用术语，其包括可溶性(sTNFα)和跨膜TNFα(mTNFα)。在通过金属蛋白酶TNF-α转换酶(TACE)蛋白水解切割跨膜TNFα(26kDa单体的同三聚体)后，细胞释放可溶性同三聚体(Wajant等人，2003)。两种形式，sTNFα或mTNFα与两种不同的受体，TNF受体1(TNFR1)和TNF受体2(TNFR2)相互作用。两种受体在其细胞表达概览和信号传导机制方面不同。因为mTNFα本身可以用作两种TNF受体的配体或受体，相互作用网络的复杂性增加(Wajant等人，2003)。
在疾病期间，TNFα的高表达触发并介导下游机制，其可以导致受影响区室内的慢性炎症和发病机理(Tracey等人，2008)。TNFα活性在自身免疫病中的共同后果是免疫细胞募集、细胞增殖、细胞死亡和免疫调节的调整。其它效应如基质降解和破骨细胞形成更具疾病特异性，并且可能与受影响组织中的不同细胞类型相关(在Tracey等人，2008，Choy&Panayi，2001；Feldmann，2002；Schottelius等人，2004中综述)。
TNFα在调节例如类风湿性关节炎、克罗恩病和斑块型银屑病中的致病事件中具有特别重要的作用，并快速诱导其它细胞因子(例如IL-1β和IL-6)(Tracey等人，2008)。在若干种炎症性自身免疫病中，通过治疗性抗-TNFα抗体阻断TNFα后的阳性临床结果证实过量TNFα暴露与疾病病理学之间的联系(Aggawal，2003；Tracey等人，2008)。
阿达木单抗：
阿达木单抗(也由其商标名
Figure BDA0001196846930000123
已知)是最初通过使用噬菌体展示开发的针对TNF α的完全人148kDa IgG1 κ单克隆抗体(Abbott Laboratories，2014)。自2002年市场推出以来，阿达木单抗产生了巨大的销售额，在2012年仅在美国市场就达到了46亿美元(Aggarwal，2014)。阿达木单抗以高亚纳摩尔亲和力结合TNFα，从而阻断TNFα与p55 和p75细胞表面受体TNFR1或TNFR2之间的相互作用(Abbott Laboratories，2014)。
由于阿达木单抗还以高亲和力结合mTNFα，因此进一步可能的作用模式包括在逆转信号传导机制和CDC或ADCC介导的细胞杀伤时的细胞凋亡或细胞因子抑制(在Tracey 等人，2008和Horiuchi等人，2010中综述)。
阿达木单抗(及其变体)的氨基酸序列及其药理学和治疗性质公开于例如WO 97/029131中。
就本发明而言重要的序列在下面详细列出：
阿达木单抗全轻链序列：
Figure BDA0001196846930000121
阿达木单抗轻链序列，可变区(VL)：
Figure BDA0001196846930000122
VL的阿达木单抗CDR1序列
RASQGIRNYLA (SEQ ID NO：3)
VL的阿达木单抗CDR2序列
AASTLQS (SEQ ID NO：4)
VL的阿达木单抗CDR3序列
QRYNRAPYT (SEQ ID NO：5)
阿达木单抗全重链序列：
Figure BDA0001196846930000131
阿达木单抗重链序列，可变区(VH)：
Figure BDA0001196846930000132
VH的阿达木单抗CDR1序列：
DYAMH (SEQ ID NO：8)
VH的阿达木单抗CDR2序列：
AITWNSGHIDYADSVEG (SEQ ID NO：9)
VH的阿达木单抗CDR3序列：
VSYLSTASSLDY (SEQ ID NO：10)
阿达木单抗人重链IgG1恒定区：
Figure BDA0001196846930000133
阿达木单抗在许多国家被批准用于一些治疗性治疗，例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩病。
因此，根据本发明的组氨酸突变的阿达木单抗形式也适用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩病，而且可用于治疗由TNFα诱导或触发的其它疾病。这可以包括自身免疫病以及癌症疾病。
抗体的选择：
根据本发明的阿达木单抗及其片段的合适的抗TNFα抗体形式的选择可以通过本领域良好建立的并已知的方法和技术来实现，例如通过经由噬菌体展示文库的组氨酸取代或通过酵母表面展示的组合组氨酸取代文库。详细内容在实施例部分提供。
术语、定义、详细内容
根据本发明，术语“抗体”或“免疫球蛋白”在最广泛的意义上使用，并且具体涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。根据其恒定区的氨基酸序列，完整抗体或全部抗体可以分为不同的类别。完整抗体有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 和IgA2。
根据本发明的抗体的优选主要类别是IgG，更详细地是IgG1和IgG2，最优选IgG1。
根据本发明的“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Fc片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。
根据本发明的“整个或完全”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。
根据本发明的抗体的“Fc”区通常包含IgG1或IgG2抗体主要类别的CH2、CH3和铰链区。所述铰链区是一组约15个氨基酸残基，其组合CH1区与CH2-CH3区。
“Fab”片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)，并且仅具有一个抗原结合位点。
“Fab'”片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。
根据本发明的“F(ab’)2”抗体是作为Fab’片段对产生的，在它们之间具有铰链半胱氨酸。
根据本发明的“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V和V结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。
根据本发明的抗体的“可变结构域”包括构架区(通常为FR1至FR4)以及被指定为“高变区”的CDR结构域(通常为CDR1、CDR2和CDR3)。
当在本文中使用时，术语“高变区”或“CDR”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变结构域中的31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3)；和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55 (H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
如果没有另外指出，根据本发明的抗体分子内的氨基酸位置根据Kabat编号。
“构架区”或“FR”残基是除如本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
根据本发明的“抗体变体”包括与亲本抗体相比具有修饰的氨基酸序列但与靶向抗原具有相同或改变的结合亲和力的抗体。抗体变体与亲本抗体的不同之处在于在抗体的可变结构域(包括CDR结构域)和/或恒定区内的特定位置处置换或缺失或添加一个或多个氨基酸残基，以便修饰抗体的某些性质，例如结合亲和力和/或受体功能，如ADCC、FcRn结合等。不经进一步修饰的本发明的组氨酸突变的抗体不被称为根据本发明的“抗体变体”。根据本发明的抗体变体与亲本抗体相比显示出80-99％的序列同源性，优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同源性，取决于待置换、缺失或添加的氨基酸残基的特定位置。阿达木单抗的抗体变体例如公开于
术语“融合蛋白”是指由一个或多个如上定义的生物分子组成的天然或合成分子，其中具有不同特异性的两个或更多个基于肽或基于蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选地通过化学或氨基酸基接头分子融合在一起。连接可以通过C-N融合或N-C融合(在5'→3'方向)，优选C- N融合实现。根据本发明的融合蛋白是本发明的抗体或抗体变体与另一蛋白或多肽，优选细胞因子融合的所述融合。
根据本发明，术语“抗体-药物缀合物(ADC)”是指由根据本发明的抗体，优选完全抗体和优选化学细胞毒剂组成的免疫缀合物。组分通过特异性接头彼此化学连接。本发明的抗体(优选在其重链恒定区内)可以在一个或多个氨基酸位置处被修饰，以便产生与接头和 /或细胞毒性有效负载药物的合适的连接。产生这种ADC的方法和技术是本领域熟知的。
根据本发明，术语“Fc受体”是指免疫球蛋白的Fc区的受体(FcR)，其将免疫系统内的体液应答与细胞活性相连。基于它们的功能，可以区分开FcR的两个一般组：主要由触发抗体效应子功能的白细胞表达的那些和主要介导跨上皮或内皮表面的免疫球蛋白转运的那些。通过靶结合抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用触发ADCC。涉及人IgG1的ADCC高度依赖于其Fc部分的糖基化概览和Fcγ受体的多态性。术语“FcRn”是指特异性新生儿Fc受体，其在酸性pH(<6.5)下结合IgG，但不在中性或更高的pH下结合IgG。受体负责延长血清中IgG抗体的半衰期。
术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的蛋白的通用术语，其作为细胞间介质作用于另一种细胞。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素，例如血管内皮生长因子(VEGF)；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGFβ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGFα和TGFβ；红细胞生成素(EPO)；干扰素如 IFNα、IFNβ和IFNγ；集落刺激因子例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素如IL-1、 IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；和TNF-α或TNF-β。
术语“生物/功能有效”或“治疗有效(量)”是指在体内或体外引起生物功能或生物功能变化的药物/分子，并且其在特定量下有效治疗在哺乳动物中，优选在人中的疾病或病症。
术语“药物治疗”是指在步骤方面实施本发明的多种方式。例如，根据本发明的药剂可以同时、按序或分别施用。此外，可以在施用之间的一个或多个时间间隔内分别施用所述药剂。本发明的治疗组合物含有生理上可耐受的载体以及作为活性成分溶解或分散于其中的如本文所述的相关药剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指组合物、载体、稀释剂和试剂，其代表能够施用于哺乳动物或在哺乳动物上施用，而不产生非期望的生理效应，例如恶心、眩晕、胃部不适等的物质。含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是众所周知的，并且不需要基于制剂进行限制。通常，将这样的组合物作为液体溶液或悬浮液制备为可注射制剂，然而，也可以制备适于在使用前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式。制剂也可以乳化。活性成分可以与药学上可接受的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合，并且其量适合用于本文所述的治疗方法。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。此外，如果需要，所述组合物可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其可以增强所述活性成分的有效性。本发明的治疗组合物可以包括在其中的组分的药学上可接受的盐。
根据本发明的组氨酸突变的阿达木单抗形式适合于治疗与批准和市售的非组氨酸突变的阿达木单抗
Figure BDA0001196846930000161
相同的病症和疾病，其是类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和慢性斑块型银屑病，其中所述药物优选通过皮下注射施用。
与市售药物一样，根据本发明的组氨酸突变的阿达木单抗可以单独使用或与支持该治疗的其它药物组合使用，例如甲氨蝶呤、DMARDS、糖皮质激素、非甾体抗炎药 (NSAID)和/或镇痛药。
Figure BDA0001196846930000171
的标准剂量方案通常为每周40mg作为单剂量。如较早指出的，组氨酸突变的阿达木单抗形式显示出比
Figure BDA0001196846930000172
明显更强的pH依赖性，因此可以以仅相当于
Figure BDA0001196846930000173
的推荐剂量的10％-90％，具体为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70 ％、80％和90％的剂量施用，取决于所使用的组氨酸突变的阿达木单抗形式的各自Kdis值。
附图简述
图1：a)常规和b)pH依赖性抗体对可溶性抗原结合之间的提议的差异(修改自：Igawa等人，2010)。
图2：可变区的阿达木单抗氨基酸序列。互补决定区用红色框突出显示。a)重链的可变区(VH)。b)轻链的可变区(VL)。
图3：七种独特VH变体与亲本VH的比对蛋白序列。在三轮筛选后，从重链文库方法中分离出独特的序列。亲本VH序列显示在顶部，并且对于每种变体突出显示与亲本VH 不同的残基。
图4A：亲本VL和在三轮筛选后从轻链文库分离的38种独特VL变体的蛋白序列比对(1-3个部分)的第一部分。亲本VL序列显示在顶部，并且对于每种变体突出显示与亲本VL不同的残基。
图4B：亲本VL和在三轮筛选后从轻链文库分离的38种独特VL变体的蛋白序列比对(1-3个部分)的第二部分。亲本VL序列显示在顶部，并且对于每种变体突出显示与亲本VL不同的残基。
图4C：亲本VL和在三轮筛选后从轻链文库分离的38种独特VL变体的蛋白序列比对(1-3个部分)的第三部分。亲本VL序列显示在顶部，并且对于每种变体突出显示与亲本VL不同的残基。
图5：阿达木单抗和具有pH依赖性结合rhTNFα的三种变体的Octet Red传感图。在pH 7.4下用范围在0.26nM-2nM之间的rhTNFα浓度进行关联，并在pH 7.4进行解离。使用Octet 8.0软件通过全局拟合测定动力学结合常数。
图6：阿达木单抗和具有pH依赖性结合的三种变体的Octet Red传感图。在pH 7.4下使用范围在0.26nM-2nM之间的rhTNFα浓度进行关联，并在pH 6下进行解离。通过使用Octet 8.0软件进行局部部分拟合来测定PSV#1、PSV#2和PSV#3的解离速率。阿达木单抗的解离速率通过使用全局拟合产生。
图7：阿达木单抗和具有pH依赖性结合的三种变体(PSV#1、PSV#2、PSV#3) 的OctetRed传感图。阿达木单抗显示rhTNFα的快速缔合并且在pH6下的解离步骤期间保持紧密结合。相比之下，pH依赖性结合变体在pH6下的解离步骤过程中在rhTNFα快速释放后在pH 7.4下显示可逆的rhTNFα结合。测量与13nM的rhTNFα的缔合200秒，和进行 400秒解离。在两个结合循环后，最后的解离步骤在pH 7.4下进行，显示rhTNFα的缓慢释放。
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实施例
实施例1：衍生自阿达木单抗的pH敏感抗TNFα抗体的选择
通过酵母表面展示从组合组氨酸取代文库中选择抗TNFα抗体片段：基于阿达木单抗的重链和轻链，通过使用预先组装的三核苷酸结构单元由Geneart，Regensburg合成两个抗体文库。在合成期间，对亲本或组氨酸残基进行取样，由此组氨酸的取样受限于重链和轻链的互补决定区(CDR)。大多数阿达木单抗文库成员携带分布在所有三个CDR上的三个组氨酸残基(图2)，但也合成携带更多或更少组氨酸取代(范围在
Figure BDA0001196846930000213
之间)的变体。理论多样性：
Figure BDA0001196846930000214
通过EBY100酵母菌株中的间隙修复克隆将该两个文库分别亚克隆到质粒载体中，所述EBY100酵母菌株允许抗体Fab片段的共价酵母表面展示(Boder和Wittrup，1997)。将相应的亲本链与重链或轻链文库配对，和通过荧光激活细胞分选术(FACS)分别筛选得到的两个文库。携带pH敏感阿达木单抗变体的细胞随后通过应用特异性染色和选择策略 (这里未解释)在三轮筛选中富集。
一旦在pH6下在30分钟内释放重组人TNFα(rhTNFα)之后，选择在pH7.4下以可逆的高亲和力(在亚纳摩尔范围内的KD)与rhTNFα结合的Fab片段。在以pH依赖性方式结合rhTNFα的变体的三轮筛选后，分离的单个克隆的序列分析揭示了携带特异性组氨酸取代模式的变体(如图3和4所示)。在重链序列数据集的CDR3区内鉴定出一个突变热点。在轻链序列数据集的CDR-L1和CDR-L3区内鉴定出两个突变热点。仅选择高丰度重链和轻链变体(在分析的序列组内出现：N>1)用于进一步加工和表征，得到表1和表2中所示的8个轻链和3个重链候选物：
表1.在三轮筛选后的38个分离的单个克隆内的三个高丰度(N>1)重链序列。
Figure BDA0001196846930000211
表2.在三轮筛选后的98个分离的单个克隆内的八个高丰度(N>1)轻链序列。
Figure BDA0001196846930000212
Figure BDA0001196846930000221
将高丰度VH/VL变体以及亲本阿达木单抗序列的可变区克隆到允许在哺乳动物细胞 (HEK293和Expi293)中表达全长IgG1κ分子的载体中。重链和轻链变体的所有可能的组合在哺乳动物细胞中共表达。本文中表达24种重链和轻链变体组合以及11种衍生自重链或轻链变体与相应亲本链的组合的IgG种类。使用固定化抗体的初始Octet Red实验评价在pH7.4下缔合rhTNFα后，在pH6或pH7.4下的差异解离行为。根据它们在pH 7.4下的高亲和力结合(pH 7.4下的缔合/解离)和在pH 6下的抗原快速释放(在pH 7.4下缔合/在pH 6 下解离)的结合特征选择十个变体。为了进一步表征，通过蛋白A纯化从粗制上清液中纯化抗体，并且最后将缓冲液更换为PBS。进一步的Octet测定显示在pH 7.4下的结合差异和在pH 6下的rhTNFα释放差异。
随后选择三个变体(根据图3-4的ID：VH#2+VL#9：PSV#1，VH#2+VL# 16：PSV#2和VH#1+VL#14：PSV#3)用于Octet Red的最终表征。
在Octet Red实验中分析几种组氨酸突变的阿达木单抗变体的结合特征。在重链和轻链以及不同的重链和轻链变体组合中的不同组氨酸突变已经显示影响在pH 7.4下的结合亲和力和在pH 6下的解离速率。
包括重链中的Leu98His和轻链中的Tyr32His、Leu33His的几种突变的组合产生PSV #3。轻链突变Gln89His、Arg90His和Asn92His产生PSV#2的轻链。突变Arg90His、Asn92His和Thr97His产生PSV#1的轻链。对于PSV#1和PSV#2两者，Ser100.bHis和Ser100.cHis的突变产生重链。
(根据kabat编号，将序列如图3和4a-c所示编号。为此目的，通过使用Clustal W并且考虑到kabat编号规则应用编号，将变体的序列与亲本序列一起比对)。
Octet Red测量的代表性传感图示于图5和6中，并且阿达木单抗、PSV#1、 PSV#2和PSV#3的计算的动力学参数的相应平均值(N＝3)显示在表3中。
表3.阿达木单抗和pH依赖性结合变体在pH 7.4和pH 6下与rhTNFα的结合动力学。阿达木单抗、PSV#1、PSV#2和PSV#3在pH 7.4下的缔合速率(kon)、解离速率 (kdis)和结合亲和力(KD)。也在pH6下测定解离速率。在25℃下进行实验，并且对于每个实验显示三次重复测定的平均值(例外：以两次重复测定在pH6下测量阿达木单抗)。对应于数据的代表性传感图示于图7中。
Figure BDA0001196846930000231
亲本阿达木单抗在pH 7.4下以高亲和力结合rhTNFα，这也在Kaymakcalan等人，2009中显示。对于三种变体，增加的kdis值导致结合亲和力降低(KD减少10-24倍)，然而，具有在三个数字范围中的皮摩尔结合亲和力的与TNFα的相互作用仍然表示非常紧密的结合(图5和表3)。
还进行Octet Red测量以评估抗体的pH敏感性。在FcRn介导的再循环的背景下改善的抗体功效需要在pH7.4下的循环中与TNFα紧密结合，和它在酸性内体中的快速释放。为了评价TNFα在酸性内体中的释放，在rhTNFα在pH 7.4下的缔合后，在pH 6下测量解离 (图6和表3)。测定在pH6和pH7.4下的解离速率比，并且所有变体在pH6下显示显著增加的解离(在pH6下增加59-160倍的kdis，与kdis比(pH6/pH7.4)为6的阿达木单抗相比(表3)。
一个另外的实验针对在pH6下解离后，PSV#1、PSV#2和PSV#3在pH7.4下可逆地结合rhTNFα的能力。为了确保在pH 6的温育不会不可逆地改变TNFα结合能力，进行结合(pH7.4)和释放(pH 6)两个循环(图7)。如图7所示，在TNFα已在pH 6释放后，PSV#1、PSV#2和PSV#3可以可逆地结合。与此相比，阿达木单抗在pH 6 的温育期间保持紧密结合。
实施例2：突变体的体内表征
在杂合转基因人FcRn小鼠(系176)以及纯合系32小鼠中研究了亲本IgG构建体及其突变体对人TNFα的PK的影响。前一系更适合于研究施用的IgG构建体之间的PK差异，而后一小鼠系提供更好的FcRn保护，导致更长的半衰期，更接近在人中所预期的结果。清除剂的这种更长的停留允许更好地评价抗体对TNFα清除的影响。
通过SC途径以预定比施用人TNFα和清除剂。研究了总清除剂和总hTNFα的血浆浓度分布。预期pH依赖性hTNFα结合导致细胞因子的清除率增加和清除剂的清除率降低。
从小鼠收集所选择的组织，以研究清除剂和靶细胞因子的分布。亲本IgG用作本研究中的参考化合物。
体外和体内数据集用于建立下列之间的相关性：
Figure BDA0001196846930000241
物理化学性质和体内药代动力学
Figure BDA0001196846930000242
FcRn亲和力和体内药代动力学和组织分布
相关性用于构建基于生理学的药代动力学(PBPK)模型，其能够表征和模拟血浆和组织药代动力学。
Figure IDA0001196846970000011
Figure IDA0001196846970000021
Figure IDA0001196846970000031
Figure IDA0001196846970000041
Figure IDA0001196846970000051
Figure IDA0001196846970000061
Figure IDA0001196846970000071
Figure IDA0001196846970000081
Figure IDA0001196846970000091
Figure IDA0001196846970000101
Figure IDA0001196846970000111
Figure IDA0001196846970000121
Figure IDA0001196846970000131
Figure IDA0001196846970000141
Figure IDA0001196846970000151
Figure IDA0001196846970000161
Figure IDA0001196846970000171
Figure IDA0001196846970000181
Figure IDA0001196846970000191
Figure IDA0001196846970000201
Figure IDA0001196846970000211
Figure IDA0001196846970000221
Figure IDA0001196846970000231
Figure IDA0001196846970000241
Figure IDA0001196846970000251
Figure IDA0001196846970000261
Figure IDA0001196846970000271
Figure IDA0001196846970000281
Figure IDA0001196846970000291

Claims (9)

1.具有pH依赖性抗原结合的人抗体或其抗原结合片段，其包含人抗体阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的具有相同或相似生物活性的变体，所述变体引起pH依赖性抗原结合，其具有通过Biolayer Interferometry测量的抗原解离速率（Kdis）比pH6/pH7，其与非突变的阿达木单抗的各自Kdis速率比相比为至少5倍高，所述抗体包含：
VL CDR1序列SEQ ID NO: 3、VL CDR2序列SEQ ID NO: 4、VL CDR3序列SEQ ID NO: 18、VH CDR1序列SEQ ID NO: 8、VH CDR2序列SEQ ID NO: 9和VH CDR3序列SEQ ID NO: 13；或者
VL CDR1序列SEQ ID NO: 3、VL CDR2序列SEQ ID NO: 4、VL CDR3序列SEQ ID NO: 17、VH CDR1序列SEQ ID NO: 8、VH CDR2序列SEQ ID NO: 9和VH CDR3序列SEQ ID NO: 13；或者
VL CDR1序列SEQ ID NO: 16、VL CDR2序列SEQ ID NO: 4、VL CDR3序列SEQ ID NO: 5、VH CDR1序列SEQ ID NO: 8、VH CDR2序列SEQ ID NO: 9和VH CDR3序列SEQ ID NO: 12。
2.权利要求1的人抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重链序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
和
可变轻链序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
3.权利要求1的人抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重链序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
和
可变轻链序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
或者
可变重链序列：
Figure 942150DEST_PATH_IMAGE003
和
可变轻链序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
4.权利要求1-3中任一项的人抗体，其包含如SEQ ID NO: 11所述的人重链IgG1恒定区。
5.权利要求4的人抗体，其中所述IgG1恒定区的Fc部分在一个或多个氨基酸位置处突变，产生具有修饰的FcRn结合的各自抗体。
6.权利要求4的人抗体，其包含人kappa恒定区。
7.抗体-药物缀合物，其包含权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其与细胞毒性化学药物直接或间接连接，或与细胞因子重组融合。
8.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的人抗体或其抗原结合片段或权利要求7的抗体-药物缀合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1-6中任一项的人抗体或其抗原结合片段或权利要求7的抗体-药物缀合物用于制备治疗类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和慢性斑块型银屑病的药物的用途。
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