ES2926376T3 - Anticuerpos anti-TNFa con unión al antígeno dependiente del pH - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos anti-TNFa que se modifican para exhibir una unión a antígeno sensible al pH. La invención se dirige preferentemente al anticuerpo anti-TNFa adalimumab (Humira®) o variantes biológicamente activas y fragmentos del mismo, donde el anticuerpo original de adalimumab o variante o fragmento del mismo se modifica mediante modificaciones de la secuencia de aminoácidos dentro de las regiones variables. Específicamente, la invención se relaciona con adalimumab o variantes biológicamente activas o fragmentos del mismo, en donde los dominios CDR se modifican reemplazando uno o más residuos de aminoácidos por residuos de histidina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-TNFa con unión al antígeno dependiente del pH

Estado de la técnica

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-TNFa diseñados para mostrar una unión al antígeno sensible al pH. La invención está dirigida a las variantes biológicamente activas del anticuerpo anti-TNFa adalimumab (Humira®) y a sus fragmentos, en los que el anticuerpo original adalimumab o la variante o fragmento del mismo están diseñados mediante modificaciones de la secuencia de aminoácidos dentro de las regiones variables. En concreto, la invención se refiere a variantes biológicamente activas de adalimumab o fragmentos del mismo, en las que los dominios CDR se modifican sustituyendo residuos de aminoácidos por residuos de histidina. Los anticuerpos anti-TNFa modificados resultantes provocan unas propiedades farmacocinéticas mejoradas con un aclaramiento de la IgG mediado por el antígeno y una vida media sérica global ampliada.

Antecedentes de la invención

Se cree que los anticuerpos terapéuticos (mAbs) ofrecen, al menos, importantes opciones de tratamiento para muchas enfermedades como los trastornos inflamatorios, autoinmunes u oncológicos. En 2012 había 40 mAbs aprobados por la FDA en el mercado estadounidense contra diversas dianas en oncología y trastornos antiinflamatorios, con una cuota de ~ 38,5 % dentro del mercado de productos biológicos. Las ventas de ~24 600 millones de dólares ponen de manifiesto el papel de los anticuerpos terapéuticos como la categoría con mayores ingresos de todos los productos biológicos (Aggarwal, 2009, Aggarwal, 2014).

En el caso de los anticuerpos terapéuticos, los diferentes resultados biológicos vienen determinados por los perfiles de interacción con cuatro clases de socios de interacción naturales: el antígeno, el receptor Fc neonatal (FcRn), los receptores Fc (FcyRs) y los factores del sistema del complemento (Chan y Cárter, 2010). Se ha informado de varias estrategias para optimizar los anticuerpos que buscan funciones y especificidades adicionales o mejoradas. (Beck et al, 2010). Dentro de los anticuerpos hay dos características estructurales que pueden ser objeto de ingeniería. En primer lugar, el fragmento variable (Fv) que media la interacción con el antígeno, y en segundo lugar el fragmento constante (Fc) que participa en el reciclaje del anticuerpo o media las interacciones con las células inmunitarias.

Para diferentes antígenos (por ejemplo, citocinas y factores de crecimiento) existen múltiples mecanismos de acción, por ejemplo, el bloqueo de los ligandos solubles, lo que impide la interacción con su correspondiente receptor, o el bloqueo del propio receptor. (Chan y Carter, 2010). Se han invertido muchos esfuerzos en la mejora de las funciones hacia la ingeniería de Fv, que a menudo se valora aumentando la especificidad y/o la afinidad de unión a los antígenos respectivos (Beck et al, 2010). Una estrategia para elevar la eficacia de los anticuerpos es mejorar la interacción Fv - antígeno mediante enfoques de maduración por afinidad. En este caso, el uso de tecnologías de visualización para el cribado de bibliotecas de moléculas permite aislar las variantes que presentan una afinidad superior.

El fragmento constante (Fc) y sus propiedades vinculadas pueden modularse con resultados alterados para la inmunidad o el reciclaje de anticuerpos. Ejemplos destacados de funciones inmunitarias mediadas por Fc alteradas son el aumento de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), que se han abordado para mejorar la eficacia de los anticuerpos y reducir las dosis.

Se han explorado otras estrategias, como el armado directo e indirecto de anticuerpos o la modulación de las especificidades dentro de los anticuerpos multivalentes (Carter 2011).

Un aspecto importante de la función Fc corresponde a su papel crítico en el reciclaje de anticuerpos que determina la larga vida media sérica de la inmunoglobulina 1 humana (IgG1). Tras la absorción celular por pinocitosis en fase líquida, la porción Fc de una IgG1 interactúa de forma dependiente del pH con el receptor Fc neonatal (FcRn), lo que conduce a la captura del anticuerpo en el endosoma acidificado (Kuo y Aveson, 2011). Desde allí, los anticuerpos se reciclan de nuevo a la circulación y, por tanto, pueden protegerse del catabolismo intracelular. Se generaron diferentes especies Fc mutacionales con una mayor afinidad de unión al FcRn y se probaron para aumentar las tasas de reciclaje con una semivida sérica hasta 4 veces mayor en estudios con cynomolgus mediante la sustitución de tres aminoácidos (Dall'Acqua et al, 2006).

Aunque la mayoría de los anticuerpos demuestran una gran eficacia en el bloqueo de antígenos, existen inconvenientes que no se abordan del todo en el proceso de desarrollo de los anticuerpos terapéuticos:

> En muchos anticuerpos terapéuticos los sitios de unión al antígeno se unen a una sola molécula de antígeno durante la vida del anticuerpo en el plasma (Igawa et al, 2010).

> La dosificación y la frecuencia de las inyecciones de anticuerpos depende de la tasa de síntesis de antígenos entre dos inyecciones, ya que los antígenos suelen producirse continuamente in vivo (Igawa et al, 2010).

> Altos costes de producción y administración de grandes cantidades de anticuerpos:

Terapia con tocilicumab: 8 mg/kg/mes por i.v. (Maini et al, 2006),

Terapia con adalimumab: 40 mg cada dos semanas (19 272 USD / por persona / al año (Schabert et al.

2013).

> Cuando los anticuerpos se unen a objetivos solubles, pueden producirse efectos de "amortiguación de anticuerpos" en los que se impide la degradación del antígeno mientras está unido al anticuerpo. Se establece una reserva de antígeno libre a partir de la disociación reversible del complejo antígenoanticuerpo y, por tanto, se prolonga la persistencia in vivo (O'Hear y Foote, 2005) / Finkelman et al, 1993).

Teniendo en cuenta estos inconvenientes de los anticuerpos terapéuticos, se necesitan moléculas más eficaces que produzcan respuestas terapéuticas sin necesidad de una dosis elevada y/o una administración frecuente (Chapparo-Riggers et al, 2012).

Una posibilidad para lograr estos objetivos es la ingeniería específica de la región variable y, opcionalmente, de la región constante de un anticuerpo nuevo o bien establecido y aprobado. Un enfoque consiste en desarrollar anticuerpos que presenten una unión al antígeno sensible al pH. Se ha demostrado que la incorporación racional o combinatoria de histidinas en las interfaces de unión de los anticuerpos y otras proteínas (Sarkar et al., 2002, Chaparro-Riggers et al., 2012, Ito et al., 1992, Igawa et al., 2010, Igawa et al., 2013, Murtaugh et al., 2011, Gera et al., 2012) puede utilizarse habitualmente para diseñar una unión dependiente del pH. La base de la unión dependiente del pH surge de la sensibilidad de la histidina a ser protonada como resultado de la disminución de los valores de pH en el microambiente. Más en detalle, las histidinas necesitan sufrir un cambio de pKa al unirse para protonarse en un rango de pH fisiológico (Murtaugh et al., 2011). La protonación de las cadenas laterales de la histidina en las interfaces de unión puede alterar las interacciones electrostáticas o puede inducir cambios conformacionales que conduzcan a diferencias dependientes del pH en la afinidad de unión (Gera et al., 2012). Los componentes electrostáticos y no electrostáticos equilibrados del equilibrio de unión determinan la sensibiliad de la unión (Murtaugh et al., 2011).

La incorporación de la sensibilidad al pH en el sitio de unión al antígeno puede aumentar el número de ciclos de unión al antígeno. Aquí los anticuerpos dependientes del pH se unen con una afinidad suficiente y similar, alta o reducida, a sus antígenos a pH plasmático (pH 7,4) y muestran una unión disminuida a pH ácido (pH 6) (Chaparro-Riggers et al., 2012, Igawa et al, 2010), lo que da lugar a una disociación más rápida y mayor del anticuerpo de su sitio de unión al antígeno dentro del endosoma ácido, permitiendo así el reciclaje de vuelta al plasma y reduciendo el aclaramiento mediado por el antígeno.

Durante el reciclaje mediado por el FcRn (Fig.1 a) de los anticuerpos convencionales que se unen a dianas solubles, el complejo anticuerpo-antígeno se recicla de nuevo al espacio extracelular a través de la vía de tráfico endosomal (Roopenian y Akilesh, 2007). En cambio, los anticuerpos sensibles al pH (Fig. 1b) liberan su antígeno del complejo anticuerpo-antígeno durante la acidificación endosomal (pH <6,5) (Roopenian y Akilesh, 2007). Como resultado, el anticuerpo libre se recicla a la circulación, mientras que el antígeno entra en la vía de degradación (Chaparro-Riggers et al., 2012, Igawa et al, 2010).

Por tanto, la unión sensible al pH permite que el anticuerpo interactúe con otro antígeno y permite la neutralización de múltiples moléculas de antígeno por molécula de anticuerpo. La sensibilidad al pH también puede aumentar la vida media de los anticuerpos que se dirigen a dianas asociadas a la membrana y se internalizan y degradan, por ejemplo, al unirse a un receptor. Aquí la sensibilidad al pH puede conducir a un aumento de la vida media, cuando el anticuerpo se libera durante la acidificación endosomal.

Se han publicado varias estrategias diferentes que tienen como objetivo la ingeniería de los interruptores de pH en las proteínas. La exploración de la histidina (His), mediante la cual cada residuo de aminoácido (por ejemplo, dentro de las regiones CDR) se muta a His, permite la caracterización de variantes de sustitución única y la identificación de mutaciones eficaces. La creación de nuevas variantes mediante la combinación de estas sustituciones puede dar lugar a una mayor unión dependiente del pH (Murtaugh et al., 2011, Chaparro-Riggers et al., 2012, Igawa et al, 2010). La identificación de los residuos que pueden contribuir a la sensibilidad al pH tras la sustitución con histidinas mediante el modelado basado en la estructura puede ayudar a minimizar el esfuerzo y el tiempo necesarios durante el enfoque de exploración de las histidinas. Se necesitan estructuras de cristal para tener una idea precisa de los residuos que son críticos para la unión y el diseño racional de los interruptores de pH (Sarkar et al., 2002). Los enfoques combinatorios de bibliotecas de exploración de histidinas requieren tecnologías de cribado in vitro (por ejemplo, exposición en fango o exposición en levadura) para aislar las variantes sensibles al pH a partir de una gran biblioteca de moléculas. Murtaugh y sus colegas diseñaron una biblioteca de anticuerpos VHH de llama utilizando la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, permitiendo así que cada residuo dentro de la interfaz de unión muestre tanto los residuos de histidina como los residuos de tipo salvaje del anticuerpo VHH parental. Hacia el cribado de una biblioteca de visualización de fagos M13 (diversidad ^{~ 10}12^{) las variantes aisladas mostraron KDs entre 35-91 nM a pH 7,4 y una disminución de ~10}4 ^{veces en la} afinidad de unión a pH 5,4 (Murtaugh et al. 2011).

La solicitud de patente europea EP 2 275 443 A1 publicada se refiere a los métodos para mejorar la farmacocinética de las moléculas de unión a antígeno y a los métodos para aumentar el número de veces de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno. El documento divulga moléculas de unión a antígeno, como los anticuerpos, con unión a antígeno dependiente del pH, en las que al menos un aminoácido de dicha molécula de unión a antígeno se ha mutado a histidina

La solicitud de patente internacional publicada W O 2012/065072 A2 divulga formulaciones acuosas líquidas que comprenden el anticuerpo anti-TNFa adalimumab.

La publicación Igawa et al., "Engineered Monoclonal Antibody with Novel Antigen-Sweeping Activity In Vivo", PLoS ONE (2013), vol. 8, n. ° 5, página e63236 divulga un tipo de anticuerpo de ingeniería, denominado "anticuerpo barredor", que muestra tanto una unión al antígeno dependiente del pH como una mayor unión al receptor Fc neonatal de la superficie celular (FcRn) a pH neutro. El documento informa de que este tipo de anticuerpo mostró una eliminación selectiva del antígeno del plasma.

La publicación Devanaboyina et al., "The effect of pH dependence of antibody-antigen interactions on subcellular trafficking dynamics", mAbs (2013), vol. 5, n. ° 6, páginas 851-859, describe experimentos para estudiar cómo la dependencia del pH de las interacciones anticuerpo-antígeno afecta al tráfico intracelular de los antígenos. El documento menciona el problema de que los anticuerpos pueden prolongar la persistencia del antígeno diana mediante un efecto amortiguador y describe el uso de "anticuerpos de barrido".

Dado que el anticuerpo libre reciclado es capaz de unirse a otro antígeno, la unión al antígeno dependiente del pH permitiría que una sola molécula de anticuerpo se uniera repetidamente a múltiples antígenos, en contraste con el enfoque convencional en el que un solo anticuerpo puede unirse al antígeno solo una vez.

Por lo tanto, es una necesidad generalizada disponer de anticuerpos que sean más eficaces con respecto a su concentración plasmática y sérica, lo que se puede conseguir instalando la sensibilidad del pH con respecto a los diferentes sitios de acción celular del anticuerpo terapéutico.

Resumen de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otro aspecto, configuración o realización que se exponga aquí y que no entre en el ámbito de las reivindicaciones es solo a título informativo.

La invención proporciona formas mutadas del anticuerpo anti-TNFa adalimumab (Humira®), en las que la mutación consiste en la sustitución de residuos de aminoácidos del anticuerpo original no mutado adalimumab por residuos de histidina en las regiones determinantes complementarias (c Dr ) de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. La introducción de residuos de histidina en posición definida en algunas de las CDR del adalimumab hace que el anticuerpo original sea mucho más sensible o dependiente del pH en comparación con el anticuerpo no mutado. Curiosamente, aunque el anticuerpo mutado por histidina sufre una pérdida significativa de afinidad de unión (hasta un factor 10 y más de K^d), el anticuerpo mutado de la invención es terapéuticamente mucho más eficaz en comparación con su versión parental no mutada, lo que da lugar a la posibilidad de reducir la dosis de anticuerpo o los intervalos de dosificación del mismo y, por tanto, los costes del tratamiento de forma significativa.

La invención ha demostrado que la introducción con éxito de los residuos de histidina según la invención mediante la sustitución de los residuos de aminoácidos originales en las CDR del adalimumab o de sus variantes y fragmentos biológicamente activos, no obedece a reglas rutinarias ni a consideraciones mentales en vista de los resultados deseados en cuanto al grado de sensibilidad al pH y la afinidad de unión.

Así, se descubrió que las versiones del adalimumab mutadas por histidina son específicamente eficaces desde el punto de vista terapéutico, si la unión del antígeno dependiente del pH da lugar a una relación de la tasa de ^{disociación del antígeno (K}dis^{) pH 6 / pH 7 que es de 5 a 20 veces mayor en comparación con la respectiva relación de la tasa K}dis ^{del adalimumab no mutado y la afinidad de unión del adalimumab mutado es del 1 al 25} %, preferiblemente del 1 al 15 %, más preferiblemente del 2 al 12 % de la afinidad de unión del adalimumab no mutado por histidina.

Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo humano anti-TNFa o un fragmento de unión a antígeno del mismo con unión a antígeno dependiente del pH que comprende una variante de las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo humano adalimumab con una actividad biológica igual o similar, en la que al menos uno de los dominios CDR de las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada está mutado por la sustitución de uno o más aminoácidos dentro de dichos dominios CDR por un residuo de histidina, generando así un adalimumab mutado o una variante de adalimumab que provoca una unión al antígeno dependiente del pH ^{con una relación de tasa de disociación del antígeno (K}dis^{) pH 6 / pH 7 medida por interferometría de Bioayer} (Octet Red), u otros métodos comparables, que es al menos 5, 10, 15 o 10 veces mayor en comparación con la ^{respectiva relación de tasa K}dis ^{del adalimumab no mutado.}

También se da a conocer un adalimumab mutado respectivo, en el que el anticuerpo mutado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una afinidad de unión a antígeno reducida, que es preferentemente del 1 al 15 %, respectivamente del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 % 14 % o 15 % de la afinidad de unión del adalimumab no mutado.

La invención proporciona anticuerpos humanos anti-TNFa derivados del adalimumab, en los que los residuos de aminoácidos originales dentro de las CDR del adalimumab parental fueron sustituidos por residuos de histidina. Curiosamente, las versiones más eficaces de adalimumab con mutaciones por histidina comprenden mutaciones por histidina dentro de la cadena ligera variable, especialmente en los dominios CDR1 y CDR3 de la cadena ligera. Las versiones preferidas de adalimumab con mutaciones por histidina incluyen además o independientemente una cadena pesada CDR3 con mutaciones por histidina.

Se divulga aquí un adalimumab mutado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia de cadena pesada CDR3 seleccionada del grupo que consiste en:

Además, en el presente documento, se divulga un adalimumab mutado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia de cadena ligera CDR3 seleccionada del grupo que consiste en:

HHYHRAPYT (N. ° ID DE SEQ: 17) QHYHRAPYH (N. ° ID DE SEQ: 18 QRHNRAPYT (N. ° ID DE SEQ: 38) X₁ HYHRAPYX₂ (N. ° ID DE SEQ : 19) , ^{donde X 1 es Q o H, y X2 es T o H,} X₁ X₂X₃X₄RAPYX₅ (N. ° ID DE SEQ: 4 1 ) , ^{donde X 1 es Q o H, X2 es R o H, X3 es Y} o H, X4 es N o H, y X5 es T o H, donde al menos X 1 o X2 o X3 o X 4 o X5 es H.

Además, en el presente documento, se divulga un adalimumab mutado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia de cadena ligera CDR1 seleccionada del grupo que consiste en:

RASQGIRNHLA (N. ° ID DE SEQ: 1 5 ) , RASQGIRNHHA (N. ° ID DE SEQ: 16 , RASQGIRNX¹ X²A (N. ° ID DE SEQ: 4 2 ) , ^{donde X 1 es Y o H, X 2 es L o H, donde al menos} X 1 o X 2 es H.

Además, en el presente documento, se divulga el adalimumab mutado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia de cadena ligera CDR2 seleccionada del grupo que consiste en:

AAHTLQS (N. ° ID DE SEQ: 32)

También se divulga cuna realización en la que el adalimumab mutado por histidina o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena pesada CDR3 como se ha especificado anteriormente y en las reivindicaciones, y una secuencia de cadena ligera CDR1 como se ha especificado anteriormente y en las reivindicaciones.

También se divulga aquí una realización en la que el adalimumab mutado por histidina o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena pesada CDR3, y una secuencia de cadena ligera CDR3 como se especifica arriba y en las reivindicaciones.

También se divulga aquí una realización en la que el adalimumab mutado por histidina o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena pesada CDR3, una secuencia de cadena ligera CDR2 y una secuencia de cadena ligera CDR3 como se especifica más arriba y en las reivindicaciones.

También se divulga aquí una realización en la que el adalimumab mutado por histidina o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de cadena pesada CDR3, una secuencia de cadena ligera CDR1 y una secuencia de cadena ligera CDR3 como se especifica arriba y en las reivindicaciones.

También se divulgan aquí versiones de adalimumab con mutación por histidina que comprenden una de las siguientes regiones variables de la cadena ligera:

(i)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 28) (¡Ü

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 29 ) . mDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQH YHRAPYHFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 30 ) . (M

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQH YHRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 33 ) . ÍY)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR YNHAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 34) (vi)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 35) Ívii)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR HNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 36) (viii)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHLAWYQQKP GKAPKLLIYA AHTLQSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 37) (ix)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHXiAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 20 ) ^{, donde Xi es L o} H,

ÍX)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYY CXi H YHRAPYX² FGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 21) , ^{donde X} i ^{es Q o H y X 2 es T o H} M )

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDVATYYCHH YHRAPYXiFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 22 ) ^{, donde Xi es T o H;} M i)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCXi H YHRAPYHFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 23 ) ^{, donde Xi es Q o H;}

M ii)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHXiAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCX² H YHRAPYX³ FGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 24 ) ^{, donde X} i ^{es L o H, y X2 es Q o H y X 3 es T o H;}

(xiv)

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NX¹ X²AWYQQKP GKAPKLLIYA AX³ TLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCX⁴X⁵ X6X7RAPYX8FGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 43 ^{), donde X 1 es Y o H, X 2 es L o H, X3 es S o H, X4 es Q o H, X5 es R o H, X}6 ^{es Y o H, X7 es N o H, X}8 ^{es T o H, donde al menos X 1 o X2 o X3 o X4 o X5 o X}6 ^{o X7 o X}8 ^{es H.}

También se divulgan aquí versiones de adalimumab con mutación por histidina que comprenden una de las siguientes regiones variables de la cadena pesada:

(i)

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 25 ) ; (i)

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 26) ; (Ni)

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVH YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 39 ) , (iv)

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVXi YX² STAX³X⁴LDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 44 ) , donde X 1 es S o H, X2 es L o H, X3 es S o H, X4 es S o H, donde al menos X 1 o X 2 o X3 o X 4 es H.

Se divulga en el presente documento el adalimumab mutado por histidina que comprende cualquiera de las cadenas ligeras variables como se especificó anteriormente y cualquiera de los dominios de cadena pesada variable como se especificó anteriormente.

Una primera realización de la invención es un adalimumab mutado por histidina respectivamente que comprende la secuencia variable de la cadena pesada:

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YHSTASSLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 25) ^y la secuencia variable de la cadena ligera: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NHHAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 27) .

Una segunda realización de la invención es un adalimumab mutado por histidina respectivamente que comprende la secuencia variable de la cadena pesada:

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKV S YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 26) ^y la secuencia variable de la cadena ligera:

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCHH YHRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 2 ) .

Una tercera realización de la invención es un adalimumab mutado por histidina respectivamente que comprende la secuencia variable de la cadena pesada:

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKV S YLSTAHHLDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 26) ^y la secuencia variable de la cadena ligera: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQH YHRAPYHFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 29) .

Los anticuerpos de adalimumab con mutación por histidina o sus variantes o fragmentos pueden comprender además regiones constantes humanas pesadas y/o ligeras.

En una realización comprenden una región constante de la cadena pesada de IgG humana, preferiblemente una región constante de la cadena pesada de IgG1 (como la especificada por la N° ID DE SEQ : 11) o de IgG2 humana.

En otra realización de la invención comprenden la región constante de la cadena ligera kappa humana.

En otra realización de la invención, las versiones de adalimumab mutadas por histidina de la invención comprenden una región constante de cadena pesada humana, preferentemente IgG1, en la que la porción Fc está mutada en una o más posiciones de aminoácidos mediante la sustitución de los residuos de aminoácidos originales por otros residuos de aminoácidos naturales que median (aumentan o disminuyen) la unión del anticuerpo al FcRn.

Los anticuerpos de adalimumab con mutación por histidina de la invención pueden conjugarse con otras moléculas mediante la fusión recombinante con otros polipéptidos o proteínas, como la citocina, o mediante la unión química con entidades químicas, preferentemente citotóxicas, preferiblemente a través de moléculas enlazadoras para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). Las técnicas y los métodos para producir tales proteínas de fusión de anticuerpos o conjugados anticuerpo-fármaco están bien establecidos en la técnica.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas adecuadas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o cancerosas que comprenden una variante de un anticuerpo anti-TNFa con mutación por histidina, adalimumab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención, o un conjugado respectivo de anticuerpo-fármaco o una proteína de fusión de citocina de anticuerpo, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona finalmente el uso terapéutico de dicho adalimumab con mutación por histidina o de una variante o fragmento biológicamente efectivo y activo del mismo, o de ADCs o proteínas de fusión del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o cancerosas inducidas por el TNFa, como se especifica en detalle a continuación.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).

Las versiones de adalimumab con mutación por histidina de las invenciones presentan las siguientes propiedades y funciones ventajosas:

> Los sitios de unión del adalimumab ya no se bloquean durante un largo período de tiempo al unirse al TNFa.

> El adalimumab muestra una unión sensible al pH significativamente mejorada con el antígeno diana.

> El sTNFa puede ser liberado de forma mucho más eficiente por el adalimumab mutado por histidina en el endosoma acidificado durante el reciclaje vía FcRn.

> Al unirse a la diana unido a la membrana (mTNFa) puede evitarse o reducirse el inicio de la intemalización mediada por el receptor y la degradación lisosomal del complejo mTNFa-adalimumab que conduciría a la eliminación del anticuerpo.

> Mejora de la farmacocinética del anticuerpo de unión al TNFa que presenta una unión a la diana dependiente del pH

> Las variantes de anticuerpos sensibles al pH se derivan de la secuencia parental del adalimumab mediante la alteración de las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo.

> La incorporación de la sensibilidad al pH en el adalimumab se establece mediante sustituciones de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera por histidinas

> La sensibilidad al pH de las variantes de adalimumab corresponde a un aumento de las relaciones entre los parámetros cinéticos (KD, kdis) a pH 6 / pH 7,4 en comparación con las relaciones del adalimumab parental.

> A este respecto, los anticuerpos de adalimumab según la invención están capacitados para neutralizar el antígeno varias veces

> Por lo tanto, el efecto terapéutico puede ser prolongado y puede permitir administraciones menos frecuentes del anticuerpo y/o administraciones a dosis más bajas.

Detalles de la invención

Factor de necrosis tumoral a (TNFa):

El TNFa es una citocina que desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias al iniciar las respuestas de defensa, por ejemplo, ante algunas infecciones bacterianas. Actúa en una compleja red en la inflamación normal y también participa en el desarrollo del tejido linfoide (Tracey et al., 2008).

Muchas células diferentes producen TNFa, incluidos los macrófagos, las células T, los mastocitos y los granulocitos, por nombrar algunos. TNFa es un término general que incluye el TNFa soluble (sTNFa) y el TNFa transmembrana (mTNFa). Los homotrímeros solubles son liberados por las células tras la escisión proteolítica del TNFa transmembrana (homotrímeros de monómeros de 26 kDa) por la enzima convertidora del TNF-alfa (TACE), que es una metaloproteasa (Wajant et al., 2003). Ambas formas, el sTNFa o el mTNFa interactúan con dos receptores distintos, el receptor 1 del TNF (TNFR1) y el receptor 2 del TNF (TNFR2). Ambos receptores difieren en sus perfiles de expresión celular y en sus mecanismos de señalización. La complejidad de la red de interacción aumenta ya que el propio mTNFa puede actuar como ligando o receptor de ambos receptores del TNF (Wajant et al., 2003).

Durante la enfermedad, la alta expresión de TNFa desencadena y media los mecanismos descendentes que pueden conducir a la inflamación crónica y a la patogénesis dentro de los compartimentos afectados (Tracey et al., 2008). Las consecuencias comunes de las actividades del TNFa en las enfermedades autoinmunes son la modulación del reclutamiento de células inmunitarias, la proliferación celular, la muerte celular y la regulación inmunitaria. Otros efectos, como la degradación de la matriz y la osteoclastogénesis, son más específicos de la enfermedad y pueden estar relacionados con diferentes tipos de células en los tejidos afectados (revisado en Tracey et al., 2008, Choy y Panayi, 2001; Feldmann, 2002; Schottelius et al., 2004).

El TNFa desempeña un papel especialmente importante en la regulación de los acontecimientos patógenos en, por ejemplo, la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn y la psoriasis en placas, e induce rápidamente otras citocinas (por ejemplo, la IL-1p y la IL-6) (Tracey et al., 2008). En varias enfermedades inflamatorias autoinmunes, el resultado clínico positivo tras el bloqueo del TNFa mediante anticuerpos terapéuticos anti-TNFa ha corroborado el vínculo entre la exposición excesiva al TNFa y las patologías de la enfermedad (Aggawal, 2003; Tracey et al., 2008).

Adalimumab:

El adalimumab (también conocido por su nombre comercial HUMIRA® ) es un anticuerpo monoclonal IgGlK de 148 kDa totalmente humano contra el TNFa que se desarrolló originalmente utilizando la visualización de fagos (Abbott Laboratories, 2014). Desde su lanzamiento al mercado en 2002, el adalimumab generó enormes ventas que alcanzaron los 4.600 millones de dólares solo en el mercado estadounidense en 2012 (Aggarwal, 2014). El adalimumab se une al TNFa con una alta afinidad subnanomolar y, por tanto, bloquea la interacción entre el TNFa y los receptores de superficie celular p55 y p75 TNFR1 o TNFR2 (Abbott Laboratories, 2014).

Como el adalimumab se une también al mTNFa con alta afinidad, otros posibles modos de acción incluyen la apoptosis o la supresión de citocinas mediante mecanismos de señalización inversa y la muerte celular mediada por la CDC o la ADCC (revisado en Tracey et al., 2008 y Horiuchi et al, 2010).

Las secuencias de aminoácidos del adalimumab (y sus variantes) y sus propiedades farmacológicas y terapéuticas se divulgan, por ejemplo, en el documento W O 97/029131.

Las secuencias que son importantes a la vista de la presente invención se enumeran a continuación en detalle: Secuencia completa de la cadena ligera del adalimumab:

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (N. ° ID DE SEQ: 1) Secuencia de la cadena ligera del adalimumab, región variable (VL):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 2)

Secuencia CDR1 de adalimumab de VL

RASQGIRNYLA (N. ° ID DE SEQ: 3)

Secuencia CDR2 de adalimumab de VL

AASTLQS (N. ° ID DE SEQ: 4)

Secuencia CDR3 de adalimumab de VL

QRYNRAPYT (N. ° ID DE SEQ: 5)

Secuencia completa de la cadena pesada del adalimumab:

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (N. ° ID DE SEQ: 6) Secuencia de la cadena pesada del adalimumab, región variable (VH):

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVS YLSTASSLDY WGQGTLVTVS S

(N. ° ID DE SEQ: 7)

Secuencia CDR1 de adalimumab de VH:

DYAMH (N. ° ID DE SEQ: 8)

Secuencia CDR2 de adalimumab de VH:

AITWNSGHIDYADSVEG (N. ° ID DE SEQ: 9)

Secuencia CDR3 de adalimumab de VH:

VSYLSTASSLDY (N. ° ID DE SEQ: 10)

Adalimumab cadena pesada humana IgG1 región constante:

ASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (N. ° ID DE SEQ: 11)

El adalimumab está aprobado en muchos países para un par de tratamientos terapéuticos, como la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante y la enfermedad de Crohn.

Por lo tanto, las versiones de adalimumab con mutación por histidina según la invención también son aplicables en el tratamiento de la artritis reumatoide, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante y la enfermedad de Crohn, pero también en el tratamiento de otras enfermedades inducidas o desencadenadas por el TNFa. Esto puede incluir trastornos autoinmunes así como enfermedades cancerosas.

Selección de anticuerpos:

La selección de versiones adecuadas de anticuerpos anti-TNFa de adalimumab y sus fragmentos según la presente divulgación puede lograrse mediante métodos y técnicas bien establecidos y conocidos en la técnica, como por ejemplo, mediante la sustitución de histidinas a través de bibliotecas de visualización de páginas o de bibliotecas combinatorias de sustitución de histidinas por visualización de superficies de levadura. Los detalles se proporcionan en la sección de ejemplos.

Términos, Definiciones, Detalles

El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se utiliza según la invención en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, los biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y los fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de sus regiones constantes, los anticuerpos intactos o enteros pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse además en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.

La clase principal preferida para los anticuerpos según la invención es la IgG, en concreto la IgG1 y la IgG2, más preferentemente la IgG1.

Los "fragmentos de anticuerpos" según la invención comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión al antígeno o la región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fc, diabodies, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple; anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo "entero o completo" según la invención es un anticuerpo que comprende una región variable de unión al antígeno, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3.

Una región "Fc" de un anticuerpo según la invención comprende, por regla general, una región CH2, CH3 y la región bisagra de una clase principal de anticuerpos IgG1 o IgG2. La región bisagra es un grupo de unos 15 residuos de aminoácidos que combina la región CH1 con la región CH2-CH3.

Un fragmento "Fab" también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada y tiene un solo sitio de unión al antígeno.

Un fragmento "Fab' " se diferencia de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el carboxiterminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo uno o más residuos de cisteína de la región bisagra del anticuerpo.

Un anticuerpo "F(ab')2" según esta invención se produce como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "scFv" según la invención comprenden los dominios V, y V, del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

El "dominio variable" de un anticuerpo según la invención comprende las regiones marco (normalmente FR1 a FR4) así como los dominios CDR (normalmente CDR1, CDR2 y CDR3) que se designan como "regiones hipervariables".

El término "región hipervariable" o "CDR" cuando se utiliza aquí se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente los residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1 ), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Si no se indica lo contrario, las posiciones de aminoácidos dentro de las moléculas de anticuerpos según esta invención están numeradas según Kabat.

"Residuos de la región marco" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, tal como se definen en el presente documento.

Las "variantes de anticuerpos" según la invención incluyen anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos modificada en comparación con el anticuerpo parental, pero que tienen una afinidad de unión igual o modificada con el antígeno diana. Las variantes de anticuerpos difieren del anticuerpo parental por la sustitución o supresión o adición de uno o más residuos de aminoácidos en posiciones específicas dentro de los dominios variables, incluidos los dominios CDR, y o las regiones constantes del anticuerpo, con el fin de modificar ciertas propiedades del anticuerpo, como la afinidad de unión y/o las funciones del receptor, como la ADCC, la unión al FcRn y otras. Los anticuerpos mutados con histidina de esta invención sin más modificaciones no se designan como "variantes de anticuerpos" según esta invención. Las variantes de anticuerpos según la invención presentan una homología de secuencia del 80 al 99 % en comparación con el anticuerpo parental, preferiblemente del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 %, dependiendo de la ubicación específica del residuo de aminoácido que se sustituya, elimine o añada. Las variantes de anticuerpos de adalimumab se divulgan, por ejemplo, en

El término "proteína de fusión" se refiere a una molécula natural o sintética formada por una o más moléculas biológicas como las definidas anteriormente, en la que dos o más moléculas basadas en péptidos o proteínas (incluidas las glicoproteínas) que tienen diferente especificidad se fusionan entre sí, opcionalmente, mediante moléculas de enlace químicas o basadas en aminoácidos. La unión puede lograrse por fusión C-N o N-C (en la dirección 5' ^ 3'), preferentemente por fusión C-N. Una proteína de fusión según la invención es dicha fusión de un anticuerpo o variante de anticuerpo de esta invención fusionado a otra proteína o polipéptido, preferentemente una citocina.

El término "conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)" se refiere según la invención a un inmunoconjugado compuesto por un anticuerpo, preferentemente completo, según la invención, y un agente citotóxico preferentemente químico. Los componentes están unidos químicamente entre sí por enlazadores específicos. El anticuerpo de la invención (preferentemente dentro de su región constante de la cadena pesada) puede modificarse en una o más posiciones de aminoácidos para crear un enlace adecuado con el enlazador y/o el fármaco citotóxico de carga útil. El método y las técnicas para generar tales ADCs son bien conocidos en el estado de la técnica.

El término "receptor Fc" se refiere, según la invención, a los receptores para la región Fc de las inmunoglobulinas (FcR) que vinculan las respuestas humorales con las actividades celulares dentro del sistema inmunitario.

Basándose en su función, pueden distinguirse dos grupos generales de FcR: los expresados predominantemente por los leucocitos que desencadenan las funciones efectoras de los anticuerpos y los que median principalmente el transporte de las inmunoglobulinas a través de las superficies epiteliales o endoteliales. La ADCC se desencadena mediante la interacción de anticuerpos unidos a la diana (pertenecientes a las clases IgG o IgA o IgE) con determinados receptores Fc (FcR). La ADCC en la que participa la IgG1 humana depende en gran medida del perfil de glicosilación de su porción Fc y del polimorfismo de los receptores Fcy. El término "FcRn" se refiere al receptor Fc específico de los neonatos, que se une a la IgG a un pH ácido (<6,5) pero no a un pH neutro o superior. El receptor es responsable de la prolongación de la vida media de los anticuerpos IgG en el suero.

El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso, como el NGFI3; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGF), como el TGFa y el TGFI3; la eritropoyetina (EPO); los interferones como el IFNa, el IFNI3 y el IFNy; los factores estimulantes de colonias como el M-CSF, el GM-CSF y el G-CSF; las interleucinas como la IL-1, la IL-1a, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11 y la IL-12; y el TNF-a o TNF-13.

El término "biológicamente/funcionalmente eficaz" o "terapéuticamente eficaz (cantidad)" se refiere a un fármaco/molécula que provoca una función biológica o un cambio de una función biológica in vivo o in vitro, y que es eficaz en una cantidad específica para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero, preferentemente en un ser humano.

El término "tratamiento farmacéutico" se refiere a una variedad de modalidades para practicar la invención en cuanto a los pasos. Por ejemplo, los agentes según la invención pueden administrarse simultáneamente, secuencialmente o por separado. Además, los agentes pueden administrarse por separado en uno o varios intervalos de tiempo entre administraciones. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con el agente correspondiente, tal como se describe en el presente documento, disuelto o disperso en él como ingrediente activo.

Tal como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las composiciones, portadores, diluyentes y reactivos que representan materiales capaces de ser administrados a un mamífero o sobre él sin que se produzcan efectos fisiológicos indeseables como náuseas, mareos, molestias gástricas y similares. La preparación de una composición farmacológica que contenga ingredientes activos disueltos o dispersos en ella se conoce bien en la técnica y no tiene por qué estar limitada en función de la formulación. Típicamente, tales composiciones se preparan como una preparación inyectable, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución, o suspensiones, en líquido antes de su uso. La preparación también puede ser emulsionada. El principio activo puede mezclarse con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo y en cantidades adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos aquí descritos. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y sus combinaciones. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH y similares, que pueden aumentar la eficacia del principio activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes de la misma.

Las versiones de adalimumab con mutación por histidina según la invención son adecuadas para el tratamiento de los mismos trastornos y enfermedades que el adalimumab sin mutación por histidina (HUMIRA®) aprobado y comercializado, que son la artritis reumatoide, la artritis idiopática juvenil, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la psoriasis crónica en placas, en las que el fármaco se administra preferentemente por inyección subcutánea.

Al igual que el fármaco comercializado, el adalimumab con mutación por histidina según la invención puede utilizarse solo o en combinación con otros fármacos que apoyen la terapia, como el metotrexato, los DMARDS, los glucocorticoides, los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y/o los analgésicos.

El régimen de dosis estándar de HUMIRA® suele ser de 40 mg cada semana como dosis única. Las versiones de adalimumab con mutación por histidina presentan, como ya se ha señalado, una dependencia del pH significativamente mayor que la de HUMIRA® , por lo que pueden administrarse en dosis que corresponden solo al 10 - 90 %, en concreto al 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % y 90 %, de la dosis recomendada ^{de HUMIRA®, en función de los respectivos valores K}dis ^{de las versiones de adalimumab con mutación por} histidina utilizadas.

Descripción breve de las figuras:

Figura 1: Diferencias propuestas entre a) el anticuerpo convencional y b) el dependiente del pH en la unión del antígeno soluble (modificado de: Igawa et al., 2010).

Figura 2: Secuencias de aminoácidos del adalimumab de las regiones variables. Las regiones determinantes complementarias están resaltadas con recuadros rojos. a) Región variable de la cadena pesada (VH). b) Región variable de la cadena ligera (VL).

Figura 3: Alineación de las secuencias proteicas de siete variantes únicas de la VH con la VH parental. Las seuencias únicas se aislaron a partir del enfoque de la biblioteca de cadenas pesadas después de tres rondas de cribado. La secuencia de la VH parental se muestra en la parte superior y los residuos que varían de la VH parental se destacan para cada variante.

Figura 4A: Primera parte de la alineación de la secuencia de la proteína (1-3 partes) de la VL parental y 38 vaiantes únicas de la VL que se aislaron de la biblioteca de cadenas ligeras después de tres rondas de cribado. La secuencia de la VL parental se muestra en la parte superior y los residuos que varían de la VL parental se destacan para cada variante.

Figura 4B: Segunda parte de la alineación de la secuencia de la proteína (1-3 partes) de la VL parental y 38 variantes únicas de la VL que se aislaron de la biblioteca de cadenas ligeras después de tres rondas de cribado. La secuencia de la VL parental se muestra en la parte superior y los residuos que varían de la VL parental se destacan para cada variante.

Figura 4C: Tercera parte de la alineación de la secuencia de la proteína (1-3 partes) de la VL parental y de las 38 variantes únicas de la VL que se aislaron de la biblioteca de cadenas ligeras después de tres rondas de cribado. La secuencia de la VL parental se muestra en la parte superior y los residuos que varían de la VL parental se destacan para cada variante.

Figura 5: Sensorgramas Octet Red del adalimumab y de tres variantes con unión dependiente del pH al rhTNFa. La asociación se realizó con concentraciones de rhTNFa que oscilaban entre 0,26 nM - 2 nM a pH 7,4 y la disociación se realizó a pH 7,4. Las constantes cinéticas de unión se determinaron mediante un ajuste global utilizando el software Octet 8.0.

Figura 6: Sensorgramas Octet Red de adalimumab y de tres variantes con unión dependiente del pH. La asociación se realizó con concentraciones de rhTNFa que oscilaban entre 0,26 nM - 2 nM a pH 7,4 y la disociación se llevó a cabo a pH 6. Se determinaron las tasas de desactivación para PSV#1, PSV#2 y PSV#3 mediante un ajuste parcial local utilizando el software Octet 8.0. Las tasas de desactivación para el adalimumab se generaron mediante un ajuste global.

Figura 7: Sensorgramas Octet Red del adalimumab y de tres variantes con unión dependiente del pH (PSV#1, PSV#2, PSV#3). El adalimumab muestra una asociación rápida del rhTNFa y mantiene una unión estrecha durante el paso de disociación a pH 6. Por el contrario, las variantes con unión dependiente del pH muestran una unión reversible del rhTNFa a pH 7,4 tras una liberación rápida del rhTNFa durante el paso de disociación a pH 6. La asociación a 13 nM de rhTNFa se midió durante 200 s y la disociación se llevó a cabo durante 400 s. Tras dos ciclos de unión, el último paso de disociación se realizó a pH 7,4, mostrando una liberación lenta de rhTNFa.

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23. Schottelius, A. J. G., Moldawer, L. L., Dinarello, C. A., Asadullah, K., Sterry,

W., & Edwards, C. K. Biology of tumor necrosis factor-alphaimplications for psoriasis. Exp Dermatol 13 (2004) 193-222.

24. Tracey D, Klareskog L, Sasso EH, Salfeld JG, Tak PP. Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther. 2 (2008) 244-79.

25. Wajant H, Pfizenmaier K, Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ. 1 (2003) 45-65. Ejemplos

Ejemplo 1: Selección de anticuerpos anti-TNFa sensibles al pH derivados del adalimumab

Selección de fragmentos de anticuerpos anti-TNFa a partir de bibliotecas combinatorias de sustitución de histidina por visualización en superficie de levadura: Basándose en las cadenas pesada y ligera del adalimumab, Geneart, Regensburg, sintetizó dos bibliotecas de anticuerpos utilizando bloques de construcción de trinucelótidos preensamblados. Durante la síntesis se muestrearon residuos parentales o de histidina, por lo que el muestreo de histidinas se restringió a las regiones determinantes complementarias (CDR) de las cadenas pesada y ligera. La mayoría de los miembros de la biblioteca de adalimumab llevaban tres residuos de histidina repartidos por las tres CDR (Fig. 2), pero también se sintetizaron variantes que llevaban más o menos sustituciones de histidina (entre 0 y ~20). Diversidades teóricas: Biblioteca de cadena pesada ~10'000 variantes, biblioteca de cadena ligera ~3000 variantes.

Ambas bibliotecas se subclonaron por separado en vectores de plásmidos mediante clonación de reparación de huecos en la cepa de levadura EBY100 que permite la visualización covalente en la superficie de la levadura de los fragmentos Fab de los anticuerpos (Boder y Wittrup, 1997). Las cadenas parentales correspondientes se emparejaron con las bibliotecas de cadenas pesadas o ligeras y las dos bibliotecas resultantes se examinaron por separado mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células portadoras de variantes de adalimumab sensibles al pH se enriquecieron posteriormente en tres rondas de cribado aplicando una estrategia de tinción y selección específica (no explicada aquí).

Se seleccionaron los fragmentos Fab que realizan una unión reversible de alta afinidad (KD dentro de rangos subnanomolares) al TNFa humano recombinante (rhTNFa) a pH 7,4, una vez que el rhTNFa se ha liberado en 30 minutos a pH 6. Después de tres rondas de cribado para las variantes que se unen al rhTNFa de manera dependiente del pH, el análisis de la secuencia de los clones individuales aislados reveló variantes que portaban patrones específicos de sustitución de histidina (mostrados en las Figuras 3 y 4). Se identificó un punto caliente mutacional dentro de la región CDR3 del conjunto de datos de la secuencia de la cadena pesada. Se identificaron dos puntos calientes mutacionales dentro de las regiones CDR-L1 y CDR-L3 del conjunto de datos de la secuencia de la cadena ligera. Solo se seleccionaron las variantes abundantes de las cadenas pesadas y ligeras (ocurrencia dentro del conjunto de secuencias analizadas: N>1) para su posterior procesamiento y caracterización, lo que dio como resultado ocho candidatos de cadena ligera y tres de cadena pesada que se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2:

Tabla 1. Tres secuencias abundantes (N>1) de la cadena pesada dentro de 38 clones individuales aislados después de tres rondas de cribado.

Tabla 2. Ocho secuencias de cadenas ligeras abundantes (N>1) dentro de 98 clones individuales aislados después de tres rondas de cribado.

Las regiones variables de las abundantes variantes VH/VL, así como las secuencias parentales de adalimumab, se clonaron en vectores que permiten la expresión de moléculas IgGlK de longitud completa en células de mamífero (HEK293 y Expi293). Todas las combinaciones posibles de variantes de cadena pesada y ligera se coexpresaron en células de mamífero. Se expresaron 24 combinaciones de variantes de cadenas pesadas y ligeras, así como 11 especies de IgG derivadas de combinaciones de las variantes de cadenas pesadas o ligeras con las correspondientes cadenas parentales. Los experimentos iniciales de Octet Red con anticuerpos inmovilizados evaluaron el comportamiento de disociación diferencial a pH 6 o pH 7,4 después de asociar rhTNFa a pH 7,4. Se seleccionaron diez variantes en función de sus perfiles de unión respecto a la alta afinidad de unión a pH 7,4 (asociación / disociación a pH 7,4) y la rápida liberación del antígeno a pH 6 (asociación a pH 7,4 / disociación a pH 6). Para una mayor caracterización se purificaron los anticuerpos mediante la purificación de la proteína A a partir de los sobrenadantes crudos y, finalmente, se cambió el tampón a PBS. Otros ensayos de octetos revelaron diferencias en la unión a pH 7,4 y diferencias en la liberación de rhTNFa a pH 6.

Posteriormente, se seleccionaron tres variantes (identificaciones según las figuras 3-4: VH#2 VL#9: PSV#1, VH#2 VL#16: PSV#2 y VH#1+ VL#14: PSV#3) se seleccionaron para la caracterización final en Octet Red.

Se analizaron las características de unión de varias variantes de adalimumab con mutaciones por histidina en los experimentos de Octet Red. Se demostró que diferentes mutaciones de histidina en las cadenas pesadas y ligeras, así como diferentes combinaciones de variantes de cadenas pesadas y ligeras, afectan a las afinidades de unión a pH 7,4 y a las tasas de disociación a pH 6.

Una combinación de varias mutaciones, incluyendo Leu98His en la cadena pesada y Tyr32His, Leu33His en la cadena ligera, generó la PSV#3. Las mutaciones de la cadena ligera Gln89His, Arg90His y Asn92His generaron la cadena ligera de la PSV#2. Las mutaciones Arg90His, Asn92His y Thr97His generaron la cadena ligera del PSV#1. Para ambos, PSV#1 y PSV#2, las mutaciones Ser100.bHis y Ser100.cHis generaron la cadena pesada.

(Las secuencias se numeraron como se muestra en las figuras 3 y 4a-c según la numeración kabat. Para ello, las secuencias de las variantes se alinearon junto con la secuencia parental mediante Clustal W y la numeración se aplicó teniendo en cuenta las reglas de numeración de kabat).

En las figuras 5 y 6 se muestran sensorgramas representativos de las mediciones de Octet Red y en la tabla 4 se muestran los valores medios correspondientes (N=3) de los parámetros cinéticos calculados para adalimumab, PSV#1, PSV#2 y PSV#3.

Tabla 3. Cinética de unión del adalimumab y de las variantes de unión dependientes del pH al rhTNFa a pH 7,4 y pH 6. Velocidad de asociación (kon), velocidad de disociación (kdis) y afinidad de unión (KD) del adalimumab, PSV#1, PSV#2 y PSV#3 a pH 7,4. Las tasas de disociación se determinaron también a pH 6. Los experimentos se realizaron a 25°C y para cada experimento se muestran los valores medios de triplicados (excepción: el adalimumab se midió a pH 6 por duplicado). En las figuras 7 y 8 se muestran los sensorgramas representativos que corresponden a los datos.

pH 7.4 pH 6

Anticuerpo KD (M) kon (M-1s-1) kdis (s-1) kdis (s-1) relación relación kdis kdis (pH 6)

vs.

pH 6 / adalimumab pH 7.4

Adalimumab 0,46E-11 1,32E+06 0,55E-05 4,81E-05 9 1

PSV#1 4,63E-11 0,67E+06 3,26E-05 754E-05 231 157

PSV#2 7,73E-11 1,14E+06 9,35E-05 7340E-05 785 1527

PSV#3 11,2E-11 1,93E+06 21,8E-05 11000E-05 505 2293

El adalimumab parental se une con alta afinidad al rhTNFa a pH 7,4, lo que también se demostró en Kaymakcalan et al., 2009. En el caso de las tres variantes, el aumento de los valores de kdis da lugar a una disminución de la afinidad de unión (10-24 veces menos de KD); sin embargo, la interacción con el TNFa con afinidades de unión picomolares en el rango de los tres dígitos sigue representando una unión muy estrecha (Figura 5 y tabla 3).

También se realizaron mediciones de Octet Red para evaluar las sensibilidades al pH de los anticuerpos. La mejora de la eficacia de los anticuerpos en el contexto del reciclaje mediado por el FcRn requiere una unión estrecha al TNFa en la circulación a pH 7,4 y su rápida liberación en el endosoma ácido. Para evaluar la liberación del TNFa dentro del endosoma ácido, se midió la disociación a pH 6 tras la asociación del rhTNFa a pH 7,4 (Figura 6 y tabla 3). Se determinaron las relaciones de las tasas de disociación a pH 6 y pH 7,4 y todas las variantes mostraron un aumento considerable de la disociación a pH 6 (kdis 59-160 veces mayor a pH 6, en contraste con el adalimumab con una relación kdis (pH6/pH7,4) de 6 (tabla 3).

Un experimento adicional abordó la capacidad de la PSV#1, la PSV#2 y la PSV#3 para unirse de forma reversible al rhTNFa a pH 7,4, después de la disociación a pH 6. Para garantizar que la incubación a pH 6 no cambia de forma irreversible la capacidad de unión del TNFa, se realizaron dos ciclos de unión (pH 7,4) y liberación (pH 6) (Figura 7). Como se muestra en el Figura 8, la PSV#1, la PSV#2 y la PSV#3 pueden unirse de forma reversible tras la liberación del TNFa a pH 6. En cambio, el adalimumab mantiene una unión estrecha durante la incubación a pH 6.

Ejemplo 2: Caracterización in vivo de los mutantes

Se investigó el efecto del constructo IgG parental y de sus mutantes sobre la PK del TNFa humano en ratones FcRn humanos transgénicos heterocigotos, línea 176, así como en ratones homocigotos línea 32. La primera línea era más adecuada para investigar las diferencias de PK entre las construcciones de IgG administradas, mientras que la última línea de ratones proporcionaba una mejor protección del FcRn, lo que daba lugar a vidas medias más largas, más cercanas a lo esperado en humanos. Esta residencia más larga del scavenger permitió evaluar mejor el impacto del anticuerpo en el aclaramiento del TNFa.

El TNFa humano y el scavenger se administraron por vía SC en proporciones predefinidas. Se investigaron los perfiles de concentración plasmática del scavenger total y del hTNFa total. Se esperaba que la unión del hTNFa dependiente del pH diera lugar a un mayor aclaramiento de la citocina y a un menor aclaramiento del scavenger.

Se recogieron tejidos seleccionados de los ratones para investigar la distribución del carroñero y de la citocina diana. Las IgG parentales se utilizaron como compuesto de referencia en este estudio.

Los conjuntos de datos in vitro e in vivo se utilizaron para establecer correlaciones entre:

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo con unión a antígeno dependiente del pH que comprende una variante de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo humano adalimumab con una actividad biológica igual o similar, dicho anticuerpo comprende la 5 secuencia variable de cadena pesada:

EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA

ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKV S

Y^H STASSLDY WGQGTLVTVS S N. ° ID DE SEQ: 2 5 ) ^y la secuencia variable de la cadena ligera: 10 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR N^{H H} AWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQR YNRAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 2 7 ) ,

o

la secuencia variable de la cadena pesada: 15 EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKV S YLSTA^{H H} LDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 2 6 ) ^y la secuencia variable de la cadena ligera: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA

20 ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYC^HH Y^H RAPYTFGQ GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 2 8 ) ,

o

la secuencia variable de la cadena pesada: EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFD DYAMHWVRQA PGKGLEWVSA

25 ITWNSGHIDY ADSVEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKV S YLSTA^{H H} LDY WGQGTLVTVS S (N. ° ID DE SEQ: 2 6 ) ^y la secuencia variable de la cadena ligera: DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIR NYLAWYQQKP GKAPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDVATYYCQ^H Y^H RAPY^H FGQ

30 GTKVEIK (N. ° ID DE SEQ: 2 9 ) .

2. El anticuerpo humano de la reivindicación 1 que comprende la región constante de la cadena pesada IgG1 humana especificada por la N. ° ID DE SEQ: 11.

3. El anticuerpo humano de la reivindicación 2, en el que la porción Fc de dicha región constante de la 35 IgG1 está mutada en una o más posiciones de aminoácidos, lo que da lugar a un anticuerpo respectivo con unión FcRn modificada.

4. El anticuerpo humano completo de la reivindicación 2 o 3, que comprende la región constante kappa humana.

5. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de 40 cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 unido directa o indirectamente a un fármaco químico citotóxico o fusionado recombinantemente con una citocina.

6. Una composición farmacéutica adecuada para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o cancerosas que comprende un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, o un conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 5 junto con un 45 portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Un anticuerpo humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, o un conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes o cancerosas inducidas por el TNFa.