BR112016030202B1 - Anticorpo monoclonal isolado do interferon alfa e ômega, seu uso,composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produção do anticorpo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO DO INTERFERON ALFA E ÔMEGA, SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DO ANTICORPO. A presente invenção refere-se a anticorpos que neutralizam amplamente o interferon-(alfa) e o interferon-(ômega) polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou fragmentos, e a métodos para preparação e uso dos supracitados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos que neutralizam amplamente os polinucleotídeos do interferon-α e do interferon-w, que codificam os anticorpos ou fragmentos dos mesmos, e a métodos de preparo e uso dos supracitados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] os interferons (IFNs) do tipo I (IFN-I) são uma família de citocinas que sinalizam através de um receptor heterodimérico expresso ubiquamente IFNAR (heterodímero de IFNAR1 e IFNAR2) resultando em efeitos antivirais, antiproliferativos e imunomodulatórios. em humanos, o IFN do tipo I é composto de pelo menos 12 subtipos de proteínas ifna e 1 subtipo cada, para o IFN-β, IFN-ε, IFN-K e IFN-w. o IFN-I ocorre em resposta tanto a ligantes microbianos quanto estéreis. mediante a ligação do receptor, o IFN-I inicia uma cascata de sinalização através da ativação de JAK1 e TYK2, levando à fosforilação de vários membros da família STAT, incluindo STATs 1 a 6. a ativação do STAT1 e STAT2 leva à formação de um complexo com o fator 9 regulador de ifn (IRF9) e esse complexo, também conhecido como fator do gene estimulado por interferon IFN 3 (ISGF3) se liga aos elementos responsivos estimulados por IFN (ISREs) no núcleo, resultando na transcrição de vários genes estimulados por interferon (ISGs) incluindo IRF7 e CXCL10 (IP - 10) (gonzalez-navajas et al., nature reviews. immunology 12, 125 (Feb, 2012). o IFN-I também modula a função celular através de outras vias, incluindo o homólogo do oncogene CT10 do vírus sarcoma v-crk do tipo (aviário) (CRKL), proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK), fosfoinositida 3-quinase (PI3K), e através do acentuador da cadeia leve kappa do fator nuclear de cé-an official journal of the American Association for Cancer Research 17, 2619 (May 1, 2011)).

[0003] Várias doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune ou doenças autoimunes, como lúpus, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou lúpus eritematoso cutâneo (LEC), diabetes tipo I, pso- ríase, síndrome de Sjogren, esclerose sistêmica, artrite reumatoide, trombocitopenia imune (ITP), síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), miosite, imunodeficiência comum variável (IDCV) e doença autoimune da tireoide que são associadas ao menos em uma subpopulação de pacientes à superexpressão dos transcritos de gene induzidos por IFN, comumente chamados de assinatura de IFN, presentes no sangue integral e/ou tecido, ou com IFN-I elevado.

[0004] LES é uma doença inflamatória crônica autoimune ou mediada pelo sistema imunológico na qual a produção de autoanticorpos patogênicos e complexos imunes resulta em dano tecidual em vários sistemas de órgãos. A doença exibe uma ampla faixa de sintomas com apresentação clínica heterogênea e pode incluir manifestações sistêmicas, cutâneas, renais, músculo-esqueléticas, neurológicas e hematológicas. LES varia muito em gravidade e é crônico, recorrente ou reincidente com surtos de de atividade, em ciclo com períodos de melhora ou remissão que podem durar semanas, meses ou anos. IFN-α é elevado em pacientes com LES e acredita-se que promove uma perda de tolerância para o indivíduo. Foi observado que o IFN-α contribui para a ativação sustentada de células dendríticas e, portanto, para a apresentação do antígeno e supressão da função de Treg, o que contribui para LES. IFN-α também induz a expressão de BLyS, um alvo para o produto terapêutico para LES comercializado, BENLYSTA™. Vários polimorfismos associados à produção de ou resposta ao IFN-I foram identificados e representam mais da metade dos polimorfismos confirmados associados ao LES (Ghodke-Puranik & Niewold, Interna- tional Journal of Clinical Rheumatology 8, doi:10.2217/ijr.13.58 (2013)). Anticorpos que neutralizam vários subtipos de IFN-α (anticorpos pan- IFNα) estão sendo avaliados em testes clínicos para LES (Consulte, por exemplo, publicação de patente internacional n° WO02/066649, publicação de patente internacional n° WO05/059106, publicação de patente internacional n° WO06/086586, publicação de patente internacional N° WO09/135861).

[0005] IFN-w constitui aproximadamente 15% da atividade total de IFN-I em preparações de IFN de leucócitos humanos produzidos após infecção viral (Adolf, Virology 175, 410 (Apr, 1990). Tem sido relatado que a expressão do gene do IFN-w é elevada em pacientes com LES (Han et al., Genes and immunity 4, 177 (Apr, 2003); Yao et al., Hum Genomics Proteomics 2009, (2009)), e a capacidade do IFN-w induzir a diferenciação DC foi relatada (Walker and Tough, European journal of immunology 36, 1827 (Jul, 2006)). Os anticorpos anti-IFN-α atualmente em testes clínicos (sifalimumabe (MEDI-545), rontalizumabe e AGS-009) não neutralizam IFN-w. Dados de testes clínicos com esses anticorpos indicam a redução parcial da assinatura de IFN do tipo I em pacientes tratados com anticorpos anti-IFNα (Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009), e dados de estudo de Fase 2 com rontalizumabe (anticorpo pan-anti-IFN-α) indicaram melhoras nos sinais e sintomas de LES, taxas de ativação e carga esteroidal na semana 24 em um grupo definido por biomarcador pré-especificado de indivíduos com Métrica de Assinatura do Interferon (ISM) de lúpus de moderado baixo a gravemente ativo. Nenhuma eficácia foi observada em pacientes tendo níveis mais altos de expressão gênica induzida por IFN pré-definida como ISM-alta (Kalu- nian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).

[0006] Além de anticorpos anti-IFN, anticorpos anti-IFNAR1 estão sendo investigados para o tratamento do lúpus (Wang et al., 2013; Cli- nical Pharmacology & Therapeutics, prévia do artigo aceita em 14 de fevereiro de 2013; doi: 10.1038/clpt.2013.35). É provável que o bloqueio de IFNAR1 anule a sinalização de IFN induzida por todos os IFNs do tipo I, incluindo IFN-β. O IFN-β pode desempenhar um papel de importância mais crítica na defesa antiviral, já que a deleção específica do gene que codifica o IFN-β acarreta em susceptibilidade substancial a uma série de vírus quando comparado a camundongos expostos da mesma forma tendo IFN-β funcional (Lazear et al., J Virol 85:7186-7194, 2011; Deonarain et al., J Virol 74(7): 3404-340, 2000; Deonarain et al., Circulation 110: 3540-3543, 2004; Gerlach, et al., J Virol 80: 3438-3444, 2006). Portanto, anticorpos anti-IFNAR1 podem aumentar o risco de efeitos colaterais.

[0007] O padrão atual de tratamento para LES inclui corticosteroi- des, drogas antimaláricas, imunossupressores ou moduladores de células B. Esses produtos terapêuticos podem exibir toxicidade e outros efeitos colaterais graves, e podem não ser adequados para o tratamento de todos os pacientes com lúpus. Dessa forma, existe uma necessidade de tratamentos terapêuticos adicionais para o lúpus e outras doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune ou autoimunes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0008] A Figura 1A mostra os níveis de IFN-w e IFN-α (pg/ml) no plasma de pacientes chineses com LES. As barras horizontais na figura indicam o valor de ELISA médio de amostras em replicata e as barras verticais indicam o desvio-padrão (DP).

[0009] A Figura 1B mostra os níveis séricos de IFN-w e IFN-α (pg/ml) de pacientes brancos com LES. O círculo sólido escuro indica os maiores níveis de IFN-α e o círculo pontilhado indica os maiores níveis de IFN-w no plasma de vários doadores. As barras horizontais na figura indicam o valor de ELISA médio das amostras em replicatas e as barras verticais indicam o DP.

[0010] A Figura 1C mostra que o soro do paciente ativa as vias de sinalização do interferon a jusante medidas usando-se ensaio do gene-repórter ISRE. O doador que apresenta a maior quantidade de proteína IFN-α (círculo sólido escuro) e IFN-w (círculo pontilhado) também demonstrou os níveis mais elevados de indução de ISRE no ensaio de gene-repórter. Os resultados são leituras obtidas de um único poço para cada amostra de soro.

[0011] A Figura 2 mostra a inibição do IFN induzido pelo complexo imune de LES com o aumento da concentração (0,4 - 100 μg/ml) do anticorpo anti-IFN-α sozinho ou em 100 μg/ml em combinação com o anticorpo anti-IFN-w (20 μg/ml). Os complexos imunes de LES (CI LES) foram preparados a partir de dois doadores diferentes (Doador LES 232 ou 293). O bloqueio combinado de IFN-α e IFN-w resultou em supressão aumentada da atividade de IFN induzida por LES IC, conforme medido usando-se o ensaio ISRE. Meio condicionado HV IC = meio condicionado de CMSPs estimuladas com complexos imunes de doadores saudáveis.

[0012] A Figura 3 mostra a indução da secreção de IP-10 de CMSPs de 6 indivíduos saudáveis estimuladas com IFN-αA ou IFN-w, conforme indicado.

[0013] A Figura 4A mostra a secreção do IFN-Y por células T CD4+ na presença de células dendríticas (DCs) diferenciadas na presença de IFN-w, IFN-α, IFN-w e anticorpo anti-IFN-w ou anticorpo IFN- α e anti-IFN-α, ou o isotipo controle (iso), conforme indicado. DCs diferenciadas na presença de IFN-w ou IFN-α induziram a ativação de células T CD4+ até um mesmo grau, enquanto que DCs diferenciadas na presença de anticorpos neutralizantes anti-IFN-w ou anti-IFN-α não induziram a diferenciação de células T CD4+. As DCs diferenciadas foram cultivadas com células T CD4+ purificadas na razão de DC: células T CD4+ de 1:20. O IFN-Y secretado foi medido no dia 6. Os dados são representativos de 2 estudos. As barras de erro indicam DP de triplicatas Luminex. CONC: concentração.

[0014] A Figura 4B mostra a secreção do IL-17 por células T CD4+ na presença de células dendríticas (DCs) diferenciadas na presença de IFN-w, IFN-α, IFN-w e anticorpo anti-IFN-w, ou IFN-α e anticorpo anti-IFN-α ou o isotipo controle (iso), conforme indicado. As DCs diferenciadas na presença de IFN-w ou IFN-α induziram a ativação de células T CD4+ T até um mesmo grau, enquanto que DCs diferenciadas na presença de anticorpos neutralizantes anti-IFN-w ou anti-IFN-α não induziram a diferenciação de células T CD4+. As DCs diferenciadas foram cultivadas com células T CD4+ purificadas na razão de células DC: células T CD4+ de 1:20. IL-17 secretado foi medido no dia 6. Os dados são representativos de 2 estudos. As barras de erro indicam DP de triplicatas Luminex. CONC: concentração.

[0015] A Figura 5A mostra que IFN-w induz a ativação de células B independente de células T no mesmo grau que IFN -α. A ativação de células B foi avaliada pela expressão na superfície de CD86 usando anticorpos anti-CD86 marcados com fluorescência. A ativação de células B independente de células T foi induzida por CpG (ODN2006) e/ou anticorpos anti-receptor de célula B (aBCR) conforme indicado na figura. IFN-w ou IFN-α (IFN-αB2) foram usados na concentração indicada. A fluorescência mediana foi medida. As células B foram obtidas de um doador. Os resultados foram expressos como valores médios de amostras duplicadas ± DP.

[0016] A Figura 5B mostra que o IFN-w induz a secreção de IL-6 pelas células B ativadas de forma não dependente de células T no mesmo grau que IFN-α. A ativação de células B independente de células T foi induzida por CpG (ODN- 2006) e/ou anticorpos anti-BCR (aBCR) como indicado na figura. IFN-w ou IFN-α (IFN-α2B) foi usado na concentração indicada. A concentração de IL-6 é indicada em pg/ml. As células B foram obtidas de um doador. Os resultados foram expressos como valores médios de amostras duplicadas ± DP.

[0017] A Figura 6 mostra que IFN-w induz a secreção de BLyS de CMSPs humanas no mesmo grau que IFN-α (IFN-αB2). A concentração de IFN-w ou IFN-α usada para estimular as CMSPs é indicada no eixo X. A concentração de BLys é mostrada em pg/ml. Os resultados são expressos como valores médios de amostras duplicadas ± DP.

[0018] A Figura 7A mostra a estrutura molecular global do complexo IFN-w/Fab IFWM371 (apenas o Fv do anticorpo é mostrado). A área contida no quadrado é ampliada na Figura 7B. A alça AB do IFN-w (AB), a hélice E (E) e a hélice D (D) do IFN-w estão indicadas. Pequenos círculos representam moléculas de água. VL e VH ou IFWM371 são indicadas.

[0019] A Figura 7B mostra uma ampliação de uma área contida em um quadrado da Figura 7A, demonstrando uma rede de ligação de hidrogênio mediada por moléculas de água (complexo de água (WC) 1, 2, e 3) na interface IFN-w/Fab IFWM371.

[0020] A Figura 8A mostra o epítopo no complexo IFN-w/Fab IFWM371. A numeração de resíduos IFN-w de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0021] A Figura 8B mostra o parátopo no complexo IFN-w/Fab IFWM371. Os resíduos Y32, Y92, T94 e L96 são resíduos na VL, e os resíduos W33, I50, D57, T58, R59, H99, P100, G101, L102, N103, W104, A105 e D107 são resíduos na VH em contato com IFN-w. VL: SEQ ID NO: 29; VH: SEQ ID NO: 28. T94 e A105 não são mostrados na figura.

[0022] A Figura 8C mostra um mapa de interação bidimensional entre IFN-w e Fab IFWM371. Os resíduos no quadrado são resíduos do parátopo de VL, e os resíduos no círculo são resíduos do parátopo VH. Os resíduos destacados em cinza são os resíduos do epítopo de IFN-w. A numeração dos resíduos da VL, VH e IFN-w é de acordo com as SEQ ID NOs: 29, 28 e 1, respectivamente. Interações de Van der Walls (VDW) e hidrofóbicas são mostradas em linhas sólidas, ligações eletrostáticas e ligações de H em linhas tracejadas, setas indicam as interações com a cadeia principal com setas apontando para os átomos da cadeia principal. A maior parte das interações são formados pelos três resíduos do epítopo de IFN-w F27, L30 e R33.

[0023] A Figura 9 mostra um alinhamento de IFN-w com vários subtipos de IFN-α. As setas indicam os resíduos do epítopo aos quais IFWM371 se liga. F27, L30 e R33 são conservados entre IFNs tipo I, exceto no IFN-αD ao qual IFWM371 não se liga. A numeração dos resíduos é de acordo com a SEQ ID NO: do IFN-w humano: 1 (IFNw-01 na figura). IFNα-01/D/1: SEQ ID NO: 18; IFNα-02/A: SEQ ID NO: 5; IFNα-04/a/b: SEQ ID NO: 15; IFNα-07/J: SEQ ID NO: 13; IFNα-10/C: SEQ ID NO: 7; IFNα-17/I: SEQ ID NO: 12; IFNα-21/F: SEQ ID NO: 9; IFNα-14/H: SEQ ID NO: 11; IFNα-16/WA: SEQ ID NO: 16; IFNα-08/B2: SEQ ID NO: 6; IFNα-05/G: SEQ ID NO: 10; IFNα-06/K: SEQ ID NO: 14.

[0024] A Figura 10 mostra os valores de IC50 para anticorpos selecionados para vários IFNs tipo I em um ensaio de ISRE.

[0025] A Figura 11A mostra a neutralização da liberação pelo leucócito de IP10 induzida por IFN em sangue integral humano com anticorpos anti-IFN-α/w. IFN de leucócitos (Lk) foi usado para induzir a secreção de IP-10 em sangue integral de doadores saudáveis de 2 indivíduos. O sangue integral foi incubado com interferon de leucócitos (LK) com ou sem anticorpos anti-IFN-α/w IFWM3522 ou IFWM3525 em várias concentrações (10 μg/ml a 10 pg/ml), como indicado na figura. A barra representa a média e as barras DP de erro de poços em duplicata. Os dados são resultados representativos de 2 experimentos independentes usando-se sangue integral de 2 doadores humanos diferentes.

[0026] A Figura 11B mostra a neutralização da liberação de IP-10 induzida por IFN de leucócitos em sangue integral humano com anticorpos anti-IFN-α/w. IFN de leucócitos (Lk) foi usado para induzir a secreção de IP-10 em sangue integral de doadores saudáveis de 2 indivíduos. O sangue integral foi incubado com interferon de leucócitos (Lk) com ou sem anticorpo anti-IFN-α/w IFWM3399 ou o isotipo controle em várias concentrações (10 μg/ml-10 pg/ml) como indicado na figu-ra. A barra representa a média e as barras de erro DP médio de poços em duplicata. Os dados são resultados representativos de 2 experimentos independentes usando-se sangue integral de 2 doadores humanos diferentes.

[0027] A Figura 12A mostra a neutralização da liberação de IP-10 induzida pelo complexo imune de LES em sangue integral humano com anticorpos anti-IFN-α/w. O sangue integral foi incubado com preparações de interferon induzido pelo complexo imune de LES com ou sem os anticorpos anti-IFN-α/w IFWM3522 ou IFWM3525 em várias concentrações (10 μg/ml-10 pg/ml), como indicado na figura, e o IP-10 foi analisado do plasma usando-se um kit de ELISA. A barra representa a média e as barras de erro DP médio de poços em duplicata. Os dados são resultados representativos de 4 experimentos independentes usando-se sangue integral de 2 doadores humanos diferentes.

[0028] A Figura 12B mostra a neutralização da liberação de IP-10 induzida pelo complexo imune de LES em sangue integral humano com anticorpos anti-IFN-α/w. O sangue integral foi incubado com preparações de interferon induzido pelo complexo imune de LES com ou sem o anticorpo anti-IFN-α/w IFWM3399 ou o isotipo controle em várias concentrações (10 μg/ml-10 pg/ml), como indicado na figura, e o IP-10 foi analisado do plasma usando um kit de ELISA. A barra representa a média e as barras de erro DP médio de poços em duplicata. Os dados são resultados representativos de 4 experimentos independentes usando-se sangue integral de 2 doadores humanos diferentes.

[0029] A Figura 13A mostra a normalização da expressão gênica de MX1 no sangue de paciente com LES após exposição in vitro do sangue ao anticorpo para IFN-α/w IFWM2423 ou ao isotipo controle durante 24 horas em várias concentrações (μg/ml), conforme indicado na figura. A barra representa a média e as barras de erro DP de poços em triplicata. A expressão gênica de MX1 foi normalizada para actina- β.

[0030] A Figura 13B mostra a normalização da expressão gênica de MX1 no sangue de paciente com LES após exposição in vitro do sangue ao anticorpo para IFN-α/w IFWM3522 e IFWM2525 ou ao isotipo controle durante 24 horas em várias concentrações (μg/ml), conforme indicado na figura. A barra representa a média e as barras de erro DP de poços em triplicata. A expressão gênica de MX1 foi normalizada para actina- β.

[0031] A Figura 14A mostra as interações da ligação de hidrogênio (H) entre o resíduo R33 do epítopo com VH de M371 bem como moléculas de água na interface do anticorpo/antígeno na estrutura do IFN-w/M341.

[0032] A Figura 14B mostra as interações de ligação H modificadas entre o resíduo R33 do epítopo com VH de M3421 bem como moléculas de água na estrutura de IFN-w/M3421.

[0033] A Figura 14C mostra a sequência (mutação L96I) e as alterações estruturais na maturação de M371. Na estrutura M371, F108 de VH é melhor descrito como tendo duas conformações alternativas. Na estrutura M3421, elas são convertidas em uma configuração, sugerindo um empacotamento mais forte entre VH e VL. Além disso, há uma articulação de rotâmero da cadeia lateral do W47 da VH.

[0034] A Figura 14D mostra as alterações na sequência e estruturais com a maturação de M371. A c de VL foi mutada em um F mais hidrofóbica (Y32F) e removendo as duas ligações de H entre Y32 em M371 e IFN-w. A50 de VL também foi mutada em F (A50F). O resíduo não entra em contato direto com o antígeno, mas se empilha contra W104 da VH que entra em contato com o antígeno. Duas outras alterações (S31G e S30D) não estão envolvidos na ligação de antígeno ou no impacto direto nos resíduos de ligação, como A50F. Essas alterações nos resíduos provavelmente influenciam a hidrofobicidade local e otimizam a interação do solvente.

[0035] A Figura 15 mostra um mapa bidimensional entre IFN-w e Fab IFWM3421. Os resíduos no quadrado são resíduos do parátopo de VL, e os resíduos no círculo são resíduos do parátopo VH. Os resíduos destacados em cinza são os resíduos do epítopo de IFN-w. A numeração dos resíduos da VL, VH e IFN-w são de acordo com as SEQ ID NOs: 28, 71 e 1, respectivamente. As interações Van der Waals (VDW) e hidrofóbicas são mostradas em linhas sólidas, e as ligações eletrostáticas e de H são mostradas em linhas tracejadas, as setas indicam as interações com a cadeia principal com as setas apontando para os átomos da cadeia principal. Mais interações são formadas por três resíduos do epítopo de IFN-w F27, L30 e R33.

[0036] A Figura 16 mostra um mapa de interação bidimensional entre IFN-w e Fab de IFWM3525. Os resíduos no quadrado são resíduos do parátopo de VL, e os resíduos no círculo são resíduos do pa- rátopo VH. Os resíduos destacados em cinza são os resíduos do epí- topo de IFN-w. A numeração dos resíduos da VL, VH e IFN-w são de acordo com as SEQ ID NOs: 28, 71 e 1, respectivamente. As interações Van der Waals (VDW) e hidrofóbicas são mostradas em linhas sólidas, e as ligações eletrostáticas e de H são mostradas em linhas tracejadas, as setas indicam as interações com a cadeia principal com as setas apontando para os átomos da cadeia principal. Mais interações são formadas por três resíduos do epítopo de IFN-w F27, L30 e R33.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0037] Uma modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal isolado que se liga e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e ao menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α).

[0038] Uma outra modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal isolado que se liga e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e ao menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN- α), sendo que o anticorpo neutraliza a atividade biológica do IFN-w humano com um IC50 de pelo menos cerca 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 ou menos ou cerca de 1x10-11 M ou menos.

[0039] Em outras modalidades, o anticorpo da invenção neutraliza a atividade de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de IFN-α humano com um IC50 de pelo menos cerca de 2x10-10 M ou menos, cerca de 1,5 x 10-10 M ou menos ou cerca de 1x10-10 M ou menos.

[0040] Em outras modalidades, o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) das SEQ ID NOs: 109, 114 e 121, respectivamente, e as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) das SEQ ID NOs: 118, 119 e 120.

[0041] Em outras modalidades, o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 159, 119 e 160, respectivamente.

[0042] Em outras modalidades, o anticorpo neutraliza ao menos dez subtipos de IFN-α humano selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1,IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a.

[0043] Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao IFN-w da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos de aminoácido F27, L30 e R33.

[0044] Em outras modalidades, o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 161, 119 e 162, respectivamente.

[0045] Em outras modalidades, o anticorpo neutraliza pelo menos subtipos de IFN-α humano IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-α4a.

[0046] Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica com a SEQ ID NO: 28 e a uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0047] Em outras modalidades, o anticorpo compreende certas sequências da LCDR e da HCDR, conforme descrito aqui.

[0048] Em outras modalidades, o anticorpo compreende certas sequências da VH e da VL, conforme descrito aqui.

[0049] Outra modalidade da invenção é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo isolado da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0050] Uma outra modalidade da invenção é um polinucleotídeo que codifica a VH e/ou a VL do anticorpo da invenção.

[0051] Outra modalidade da invenção é um vetor compreendendo o polinucleotídeo da invenção.

[0052] Outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo da invenção.

[0053] Uma outra modalidade da invenção é um método para pro dução do anticorpo da invenção, que compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção em condições em que o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira.

[0054] Uma outra modalidade da invenção é um método para tratamento de uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo isolado da invenção a um paciente que tenha necessidade do mesmo durante um tempo suficiente para tratar ou evitar a doença.

[0055] Em algumas modalidades, a doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou doença autoimunes é lúpus, psoríase, trombo- citopenia imune (ITP), síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, miosite, imunodeficiência comum variável (IDCV), doenças autoimunes da tireoide, diabetes tipo I, artrite reumatoide, rejeição a transplante ou doença do enxerto contra hospedeiro (DECH).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0056] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, patentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.

[0057] Deve-se entender que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de apenas descrever modalidades particulares e não pretende ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence.

[0058] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos aqui materiais e métodos exempli- ficadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usada.

[0059] O termo "ligação específica" ou "que se liga especificamente" ou "liga-se", como usado aqui, refere-se ao anticorpo que se liga a um antígeno ou a um epítopo dentro do antígeno com maior afinidade que a outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo se liga a um antígeno ou ao epítopo dentro do antígeno com uma constante de dissociação (KD) de 1x10-8 M ou menos, por exemplo, 1x10-9 M ou menos, 1x10-10 M ou menos, 1x10-11 M ou menos, ou 1x10-12 M ou menos, tipicamente com uma KD que é pelo menos dez vezes menor que sua KD de ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). A constante de dissociação pode ser medida com o uso de procedimentos-padrão. Anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo dentro do antígeno podem, no entanto, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno de outras espécies (homólogas), como humanos ou macacos, por exemplo Macaca fascicularis (cinomolgo) ou Pan troglodytes (chimpanzé). Os anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo dentro do antígeno podem ligar-se ainda a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos diferentes, como pelo menos um subtipo interferon alfa (IFN-α) e interferon ômega (IFN-w); ou seja, os anticorpos reagem de forma cruzada com os sub- tipos de IFN-α e IFN-w.

[0060] O termo "neutralização" ou "neutraliza" ou "anticorpo neu- tralizante" ou "anticorpo antagonista", como usado aqui, refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inibe parcial ou completamente, a atividade biológica do interferon ômega humano (IFN-w) e/ou ao menos um subtipo do interferon alfa humano (IFN-α) recombinante. Os anticorpos neutralizantes podem ser identificados usando-se ensaios para a atividade biológica de IFN-α e/ou IFN-w, como aqui descrito. Os anticorpos neutralizantes de IFN-α e/ou IFN-w podem inibir a atividade biológica medida de IFN-α e IFN-w em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0061] O termo "interferon-α" (IFN-α), como usado aqui, refere-se a todos os subtipos nativos de interferons alfa humanos. IFN-α nativo consiste em ao menos 12 subtipos de proteínas intimamente relacionadas codificadas por genes distintos com um elevado grau de homo- logia estrutural (Weissmann and Weber, Prog Nucl Acid Res Mol Biol., 33: 251, 1986; Roberts et al., J Interferon Cytokine Res. 18: 805-816, 1998). A nomenclatura para interferons humanos é encontrada em: http://www_genenames_org/genefamilies/_IFN. A Tabela 4 mostra as sequências dos subtipos de IFN-α usados na presente invenção, em adição a outros IFNs do Tipo I.

[0062] O termo IFN-w, como usado aqui, refere-se ao IFN-w humano tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e número de acesso UniProt P05000. O IFN-w humano inclui também a variante da SEQ ID NO: 2 tendo uma substituição de treonina por ácido glutâmico na posição 80 (T80).

[0063] O termo "interferon tipo I" ou "IFN-I" refere-se a todos os subtipos nativos de interferon-α humano e um subtipo de interferon-β, interferon-ε, interferon-w e interferon-K que se ligam a um receptor de interferon comum IFNAR.

[0064] Como usado aqui, o termo "IFNAR" refere-se ao receptor de interferon bem conhecido que é um heterodímero de IFNAR1 e IFNAR2. Sequências de proteínas de IFNAR1 e IFNAR2 são mostradas nas SEQ ID NOs: 26 e 27, respectivamente. O domínio extracelu- lar maduro de IFNAR1 abrange os resíduos 28-436 da SEQ ID NO: 26 e o domínio extracelular maduro de IFNAR2 abrange os resíduos 27243 da SEQ ID NO: 27.

[0065] O termo "anticorpos" é usado aqui em um amplo sentido e inclui moléculas de imunoglobulina incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais de murinos, humanos, humanizados e quiméricos, fragmentos de anticorpos, anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos formados a partir de ao menos dois anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos, anticorpos diméricos, tetraméricos ou multiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno de especificidade necessária.

[0066] As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de ami- noácidos do domínio constante da cadeia pesada. IgA e IgG são ainda sub-classificadas como os isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, kappa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0067] O termo "fragmentos de anticorpo" refere-se a uma porção de uma molécula de imunoglobulina que retém o sítio de ligação do antígeno da cadeia pesada e/ou cadeia leve, como regiões determinantes de complementaridade de uma cadeia pesada (HCDR) 1, 2 e 3, regiões determinantes de complementaridade de uma cadeia leve (LCDR) 1, 2 e 3, uma região variável da cadeia pesada (VH) ou uma região variável da cadeia leve (VL). Os fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos bem conhecidos Fab, F(ab’)2, Fd e Fv, assim como anticorpos de domínio (dAb) consistindo em um domínio VH. Os domínios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domínios VH/VL se emparelham de forma intramolecular ou intermolecular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos se- parados de anticorpo de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno monovalente, como a cadeia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO1998/44001, publicação de patente internacional n° WO1988/01649; publicação de patente internacional n° WO1994/13804 ; publicação de patente internacional n° WO1992/01047.

[0068] Uma região variável do anticorpo consiste em uma região de "estrutura principal" interrompida por três "sítios de ligação ao antí- geno". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos: (i) As regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três na VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), baseiam-se na variabilidade da sequência (Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiões hipervariáveis", "HVR", ou "HV", três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3), referem-se às regiões dos domínios variáveis de anticorpos que têm es-trutura hipervariável, conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). Outros termos incluem "IMGT- CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55 a 77, 2003) e "Uso de Resíduo Determinante de Especificidade" (SDRU) (Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004). O banco de dados da International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas de sítios de ligação ao antígeno. A correspondência entre as delineações de CDRs, HVs e IMGT é descrita em Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55 a 77, 2003.

[0069] "Anticorpo monoclonal", como aqui usado, refere-se a uma população homogênea de anticorpos de composição molecular única. O anticorpo monoclonal pode ser multi-específico ou não específico.

[0070] "Resíduos de Chothia", como usado na presente invenção, são os resíduos de anticorpo VL e VH numerados de acordo com Al- Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927 a 948, 1997).

[0071] "Estrutura principal" ou "sequências da estrutura principal" são as sequências remanescentes de uma região variável diferente daquelas definidas para serem o sítio de ligação ao antígeno. Como o sítio de ligação ao antígeno pode ser definido por vários termos, conforme descrito acima, a sequência de aminoácidos exata de um estrutura principal depende de como o sítio de ligação ao antígeno foi definido.

[0072] "Anticorpos humanizados" refere-se a anticorpos em que os sítios de ligação ao antígeno são derivados de espécies não humanas, e as estruturas principais de região variável são derivados das sequências da imunoglobulina humana. Anticorpos humanizados podem incluir substituições nas regiões da estrutura principal de modo que o estrutura principal pode não ser uma cópia exata das sequências da imunoglobulina humana expressa ou do gene da linhagem germinativa.

[0073] Anticorpos "adaptados aos seres humanos" ou anticorpos "adaptados à estrutura principal humana (HFA)" referem-se a anticorpos adaptados de acordo com os métodos descrito na publicação de patente US n° US2009/0118127. Anticorpos humanos ad aptados são humanizados selecionando os quadros de aceitador humano baseados nas semelhanças máximas de CDR e FR, compatibilidades de comprimento e similaridades de sequência de ciclos de CDR1 e de CDR2 e uma porção de ciclos de cadeia leve de CDR3.

[0074] O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo tendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve nas quais tanto a estrutura quanto as regiões de sítio de ligação ao antígeno são derivadas das sequências de origem humana. Se o anticorpo tiver uma região constante, a região constante também é derivada dessas sequências de origem humana.

[0075] O anticorpo humano compreende regiões variáveis da ca- deia pesada ou leve que são "derivadas de" sequências de origem humana se as regiões variáveis do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana ou da imunoglobulina com rearranjo. Esses sistemas exemplificado- res são bibliotecas de genes de imunoglobulina humana, expostas em fago, e animais transgênicos não humanos, como camundongos, carregando loci de imunoglobulina humana, conforme aqui descrito. O "anticorpo humano" pode conter diferenças de aminoácidos em comparação às sequências da imunoglobulina da linhagem germinativa humana ou com rearranjo devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de substituições. Tipicamente, "anticorpo humano" são pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticos à sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos codificada por uma linhagem germinativa humana ou gene da imunoglobulina rearranjado. Em alguns casos, "anticorpo humano" pode conter sequências estruturais de consenso derivadas de análises de sequência estrutural humana, por exemplo, Knappik et al (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86), ou HCDR3 sintético incorporado em bibliotecas de genes de imunoglobu- lina humana expostas em fago, por exemplo, conforme descrito em Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96, 2010 e publicação de patente internacional n° WO2009/085462.

[0076] Os anticorpos humanizados isolados são sintéticos. Anticorpos humanos, mesmo que derivados de sequências de imunoglo- bulina humana, podem ser gerados usando sistemas, como expressão em fago, incorporando CDRs sintéticos e/ou estruturas sintéticas, ou podem ser submetidos à mutagênese in vitro para melhorar as propriedades do anticorpo, resultando em anticorpos que não existem naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

[0077] Os anticorpos humanos podem incluir substituições no estrutura principal ou no sítio de ligação ao antígeno de modo que eles podem não ser cópias exatas das sequências da imunoglobulina humana expressa ou do gene da linhagem germinativa. Entretanto, os anticorpos nos quais os sítios de ligação ao antígeno são derivados de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anticorpo humano".

[0078] O termo "recombinante", como usado aqui, inclui anticorpos e outras proteínas, como vários subtipos de IFN-α ou IFN-w que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes.

[0079] O termo "epítopo", como usado aqui, significa uma porção de um antígeno à qual um anticorpo se liga especificamente. Os epíto- pos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa (como polar, não polar ou hidrofóbica) de porções como aminoácidos ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Um epítopo pode ser composto por ami- noácidos contíguos ou não contíguos que formam uma unidade espacial conformacional. Para um epítopo não contíguo, os aminoácidos de porções diferentes da sequência linear do antígeno aproximam-se estreitamente no espaço tridimensional através do enovelamento da molécula de proteína.

[0080] "Biespecífico", como usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a dois antígenos distintos ou a dois epítopos distintos dentro de um antígeno. O anticorpo biespecífico pode ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados ou pode se ligar a um epítopo que é compartilhado entre dois ou mais antígenos diferentes, como pelo menos um subtipo de IFN-α e IFN-w.

[0081] O termo "em combinação com", como usado aqui, significa que os fármacos ou agentes terapêuticos descritos podem ser administrados a uma espécie animal, como a humana, juntos em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.

[0082] Os termos "atividade biológica de IFN-α " e "atividade biológica de IFN-w ", como usado aqui, refere-se a qualquer atividade que ocorre como resultado da ligação de IFN-α e IFN-w, respectivamente, ao seu receptor IFNAR. Uma atividade biológica de IFN-α e IFN-w é a capacidade de IFN-α e IFN-w induzirem a expressão da fosfatase alcalina embrionária (SEAP) secretada sob o promotor induzível de interferon, como ISG54, em células HEK293, expressando estavelmente o transdutor de sinal e o ativador de transcrição 2 (STAT2), o fator regulador de interferon 9 (IRF9) e SEAP, usando métodos convencionais. Outra atividade biológica de IFN-α e IFN-w é a indução da produção de quimiocina IP-10 (CXCL10) por células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) ou de sangue integral, como descrito aqui.

[0083] O termo "vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser duplicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido entre tais sistemas. Polinucleotídeos vetores contêm tipicamente elementos, como as origens de replicação, sinais de poliadenilação ou marcadores de seleção, que funcionam para facilitar a duplicação ou manutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico. Exemplos desses sistemas biológicos podem incluir uma célula, vírus, animal, planta, e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotídeo que compreende um vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido das mesmas.

[0084] O termo "vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utilizado em um sistema biológico ou em um sistema biológico reconstituído para direcionar a tradução de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeos presente no vetor de expressão.

[0085] O termo "polinucleotídeo" significa uma molécula que compreende uma cadeia de nucleotídeos ligados covalentemente por uma cadeia principal de açúcar-fosfato ou outra ligação química covalente equivalente. DNAs e RNAs de cadeia dupla e cadeia simples são exemplos típicos de polinucleotídeos.

[0086] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" significa uma molécula que compreende pelo menos dois resíduos de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica para formar um polipeptídeo. Pequenos po- lipeptídeos com menos de 50 aminoácidos podem ser chamados de "peptídeos".

[0087] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras convencionais são usados na presente invenção conforme mostrado na Tabela 1.

Composições de matéria

[0088] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais que se ligam e neutralizam a atividade do interferon ômega humano (IFN- w) e subtipos múltiplos de interferon alfa humano (IFN-α) (anticorpos anti-IFN-α/w). A invenção tem por base, pelo menos em parte, na apreciação da função do INF-w na patogênese do lúpus com efeitos imunomodulatórios similares aos do IFN-α sozinho. Foi observado que o IFN-w está presente e ativo no soro de pacientes com lúpus e concluiu-se que o IFN-w induziu a liberação de citocina e perfis de expressão gênica similares, a diferenciação da célula dendrítica e ativação de células B independente de células T quando comparado com o IFN-α; fornecendo a base para a justificativa da neutralização de ambos IFN-α e IFN-w para maximizar o efeito terapêutico. A invenção também se baseia, pelo menos em parte, na identificação de um epí- topo neutralizante mínimo compartilhado por IFN-w e por múltiplos subtipos de IFN-α aos quais os anticorpos IFN-α/w da invenção se ligam. Os anticorpos para IFN-α/w da invenção podem neutralizar IFN-α e múltiplos subtipos de IFN-w com alta eficácia, e, portanto, podem ser mais potentes na neutralização de preparações relevantes de LES do IFN tipo I e assinaturas de IFN que anticorpos que neutralizam múltiplos subtipos de IFN-α, mas não de IFN-w. Portanto, os anticorpos da invenção podem ser mais eficazes no tratamento de doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune ou doenças autoimunes, incluindo lúpus. Como os anticorpos para IFN-α/w da invenção não neutralizam IFN-β, eles podem ter perfis de segurança e FC mais favoráveis quando comparados com as terapias anti-IFNAR, que supostamente bloqueiam todos os IFNs tipo I.

[0089] Uma modalidade da invenção descrita aqui, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo é um anticorpo monoclonal isolado que se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α).

[0090] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza a atividade de IFN-w humano com um IC50 de pelo menos cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10- 11 M, quando a atividade do IFN-w humano é a expressão da fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) induzida por IFN-w humano, sob o promotor induzível por interferon ISG54 em células HEK293 expressando de maneira estável o transdutor de sinal e o ativador d transcrição 2 (STAT2), o fator regulador de interferon 9 (IRF9) e SEAP ("ensaio ISRE" conforme aqui descrito).

[0091] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e ao menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez e onze subtipos do interferon alfa humano (IFN-α) selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN- αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN- αWA e IFN-α4a.

[0092] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo,o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αH2 e IFN-αK.

[0093] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αG, IFN- αH2 e IFN-αK.

[0094] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αF, IFN-αG, IFN- αH2 e IFN-αK.

[0095] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αF, IFN- αG, IFN-αH2 e IFN-αK.

[0096] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αF, IFN- αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-αK.

[0097] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αG, IFN-αH2 e IFN-αK.

[0098] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αF, IFN-αG, IFN-αH2 e IFN-αK.

[0099] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αG, IFN-αH2 e IFN-αK.

[0100] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG e IFN-α4a.

[0101] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI e IFN-αK.

[0102] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-αK.

[0103] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-αK.

[0104] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK e IFN-α4a.

[0105] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αWA e IFN-α4a.

[0106] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a.

[0107] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w e IFN-αA, IFN-αB, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a.

[0108] Os anticorpos da invenção aqui descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem se ligar e neutralizar pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de IFN-α além de neutralizar IFN-w. Os subtipos de IFN-α e IFN-w podem ser produzidos por meio de expressão recombinante usando métodos convencionais. Sequências sinal exemplificadoras que podem ser usadas para direcionamento da secreção são mostradas na SEQ ID NOs: 21-25.

[0109] Os anticorpos da invenção aqui descritos e, em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem ser testados quanto à sua capacidade de neutralizar IFN-α e IFN-w em um ensaio de gene repórter usando linhagens de células que expressam genes sob um promotor responsivo a interferon, e estimular as células com vários subtipos de IFN-α e/ou IFN-w. Por exemplo, células HEK-Blue™ IFN-α/β (InvivoGen, San Diego, CA) modificadas para expressar uma via de sinalização de IFN tipo I totalmen-te ativa (que expressam estavelmente STAT2 e IRF9) e transfectadas com um gene repórter SEAP sob o controle do promotor ISG54 induzí- vel por IFNα/β podem ser usadas como aqui descrito. O sinal de fosfa- tase alcalina pode ser detectado e um IC50 pode ser calculado para a inibição com o uso de métodos bem conhecidos.

[0110] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção neutralizam a atividade biológica do IFN-w humano com um valor de IC50 de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10- 11 M ou menos, quando a atividade biológica do IFN-w humano é inibição da fosfatase alcalina embrionárias secretada (SEAP) sob o promo- tor induzível por interferon ISG54 em células HEK293 expressando de maneira estável o transdutor de sinal e o ativador de transcrição 2 (STAT2), o fator regulador de interferon 9 (IRF9) e SEAP, usando o "ensaio de gene-repórter ISRE", conforme descrito no Exemplo 1.

[0111] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção neutralizam a atividade biológica do IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos, quando o IC50 é medido no "ensaio de gene-repórter IS- RE" aqui descrito.

[0112] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção neutralizam a atividade biológica do IFN-w humano com um valor de IC50 entre cerca de 1x10-10 M a cerca de 6x10-12 M, quando o IC50 é medido no "ensaio de gene-repórter IS- RE" aqui descrito. Os versados na técnica entenderão que o desvio do ensaio de gene-repórter ISRE pode, tipicamente, estar aproximadamente dentro de pIC50 de cerca de 0,28 (log (M)). Portanto, o termo "cerca de" reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico de um IC50 de 1x10-9 M está entre cerca de 0,53x10-9 a 1,9x10-9.

[0113] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção neutralizam a atividade biológica de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de IFN-α humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 2x10- 10 M ou menos, cerca de 1,5 x 10-10 M ou menos, ou cerca de 1x10-10 M ou menos.

[0114] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo neutraliza a atividade do IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos, e pelo menos 6 subtipos de IFN-α humano com um valor de IC50 de cerca de 2x10-10 M ou menos, cerca de 1,5 x 10-10 M ou menos, ou cerca de 1x10-10 M ou menos, quando o valor de IC50 é medido com o uso do "ensaio de gene-repórter ISRE" aqui descrito.

[0115] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza a atividade do IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos, e pelo menos 10 subtipos de IFN-α humano com um valor de IC50 de cerca de 2x10-10 M ou menos, cerca de 1,5 x 10-10 M ou menos, ou cerca de 1x10-10 M ou menos, quando o valor de IC50 é medido com o uso do "ensaio de gene-repórter ISRE" aqui descrito.

[0116] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza a atividade de IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos, e pelo menos 6 subtipos de IFN-α humano com um valor de IC50 de cerca de 1x10-10 M ou menos, quando o valor de IC50 é medido com o uso do "ensaio de gene-repórter ISRE" aqui descrito.

[0117] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza a atividade do IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos, e pelo menos 10 subtipos de IFN-α humano com um valor de IC50 de cerca de 1x10-10 M ou menos, quando o valor de IC50 é medido com o uso do "ensaio de gene-repórter ISRE" aqui descrito.

[0118] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção inibem a liberação de IP-10 induzida por interferon em sangue integral induzido por 250 U/ml de interferon, em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/ml de anticorpo do que na ausência do anticorpo.

[0119] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção inibem a liberação de IP-10 induzida por complexo imune do lúpus eritematoso sistêmico (LES) no sangue integral, em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/ml de anticorpo do que na ausência do anticorpo.

[0120] Os anticorpos da invenção aqui descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem ser testados por sua capacidade de neutralização através da avaliação da sua capacidade de inibir a liberação de citocina induzida por IFN, como a liberação de IP-10 de células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) induzidas por IFN ou sangue integral. Por exemplo, as PBMC são isoladas de sangue inteiro heparinizado de voluntários saudáveis usando protocolos padrão, tratadas com um complexo pré-formado de IFN e o anticorpo a ser testado, e a liberação de IP-10 é medida usando métodos convencionais, tais como o kit Milliplex de citocina/quimiocina (Millipore, Premixed 39 plex). Os anticorpos da invenção podem inibir a liberação de IP-10 em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, quando comparada à liberação de IP-10 induzida por IFN na ausência do anticorpo.

[0121] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos da invenção se ligam a um IFN-w humano com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, ou cerca de 5x10-12 M ou menos.

[0122] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção se liga a IFN-w e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos do interferon alfa humano (IFN-α) selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN- αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN- αWA e IFN-α4a com uma KD de cerca de 5x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, ou cerca de 5x10-12 M ou menos.

[0123] A afinidade de um anticorpo por IFN-w ou por vários subti- pos de IFN-α pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. Tais métodos podem usar a instrumentação ProteOn XPR36, Biacore 3000 ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica. A afinidade medida de um anticorpo específico/ IFN-w ou anticorpo/ subtipos de IFN-α pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação (por exemplo, KD, Klig, Kdesl) são, de preferência, realizadas sob condições padronizadas e um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito. O versado na técnica vai entender que o erro interno das medições de afinidade, por exemplo, usando Biacore 3000 ou ProteOn (medido como desvio padrão, DP) pode tipicamente estar dentro de 5-33% para as medições dentro dos limites de detecção típicos. Portanto, o termo "cerca de" reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico para uma KD de 1x0-9 M é de até ±0,33x10-9 M.

[0124] Os anticorpos que se ligam ao IFN-w humano e subtipos de IFN-α com um perfil de afinidade e neutralização desejados podem ser selecionados de bibliotecas de variantes ou fragmentos por imunoad- sorção com IFN-w e subtipos de IFN-α humano e opcionalmente por maturação adicional da afinidade do anticorpo. Em uma campanha de imunoadsorção exemplificadora, as bibliotecas de fago podem ser se-lecionadas sequencialmente ou usando-se uma mistura de subtipos de IFN-w de chimpanzé e IFN-α humano IFN-α2, IFN-α1, IFN-αH2, IFN- αG e IFN-αF. Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser gerados através da imunização de camundongos com os subtipos de IFN-wde chimpanzé e de cinomolgos, IFN-α humano IFN-αD, IFN-αJ1, IFN-αC, IFN-αB2, IFN-αH2, IFN-αA, IFN-α4a, IFN-αG, IFN-αF, IFN- αWA e IFN-αI, e a triagem de hibridomas para ligação ao IFN-w e vários subtipos de IFN-α e, subsequentemente, a capacidade de neutralização dos anticorpos usando os métodos aqui descritos.

[0125] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades enumeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende as sequências de amino- ácidos da região determinantes de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) das SEQ ID NOs: 109, 114 e 121, respectivamente, e as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) das SEQ ID NOs: 118, 119 e 120.

[0126] Exemplos de tais anticorpos são anticorpos IFWM3308, IFWM3307, IFWM3410, IFWM3322, IFWM3385, IFWM3416, IFWM3310, IFWM3400, IFWM3321, IFWM3522, IFWM3524, IFWM3320, IFWM3304, IFWM3520, IFWM3399, IFWM3314, IFWM3331, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 e IFWM3421. Esses anticorpos neutralizam o IFN-w humano e pelo menos três subtipos de IFN-α com um valor de IC50 de cerca de 1x10-10 M ou menos, e compreendem as sequências de aminoácidos de consenso da LCDR1 (SEQ ID NO: 118), LCDR2 (SEQ ID NO: 119), LCDR3 (SEQ ID NO: 120), HCDR2 (SEQ ID NO: 114) e HCDR3 (SEQ ID NO: 121) uma sequência de aminoácido constante HCDR1 (SEQ ID NO: 109). Anticorpos com substituições pelo menos na posição do resíduo 103 de VH das SEQ ID NOs: 28, 31, 157 ou 158, posições de resíduo de VL 30, 31, 32, 50, 91-94 ou 96 das SEQ ID NOs: 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 71, 73, 75 ou 135, e posições de resíduos de VL 30, 31, 32, 50, 51, 92-95 ou 97 das SEQ ID NOs: 57, 61, 62, 68 e 150 resultaram em anticorpos tendo potência maior quando comparados aos anticorpos parentais IFWM371. SEQ ID NO: 118 QSIX1X2X3X4; em que X1 é G, D, A, R, E, S ou N; X2 é D, G, N, S, R, E ou K; X3 é F, A, N, T, S ou V; X4 é Y, N ou deletado. SEQ ID NO: 119 X5AS; em que X5 é F, W ou G. SEQ ID NO: 120 QQX6X7X8X9PX10T; em que X6 é A, G, S ou W; X7 é L, Y, H, W, F ou I; X8 é D ou S; X9 é F, T, L, N ou W; e X10 é L, F ou I. SEQ ID NO: 114 IX11X12SDSDT; em que X11 é D ou A; e X12 é P ou A. SEQ ID NO: 121 ARHPGLX13WAPDFDY; em que X13 é A ou N. SEQ ID NO: 109 GYSFTSYW

[0127] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 159, 119 e 160, respectivamente.

[0128] Exemplos de tais anticorpos são anticorpos IFWM3400, IFWM3321, IFWM3522, IFWM3524, IFWM3320, IFWM3304, IFWM3520, IFWM3399, IFWM3314, IFWM3331, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 e IFWM3421. Esses anticorpos neutralizam o IFN-w humano e pelo menos seis subtipos de IFN-α com um valor de IC50 de cerca de 1x10-10 M ou menos, e compreende uma sequência de aminoácidos de consenso de LCDR1 (SEQ ID NO: 159), LCDR2 (SEQ ID NO: 119), LCDR3 (SEQ ID NO: 160), HCDR2 (SEQ ID NO: 114) e HCDR3 (SEQ ID NO: 121) e uma sequência de aminoácido constante HCDR1 (SEQ ID NO: 109). SEQ ID NO: 159 QSIX14X15X16X17; em que X14 é G, D, A, E, S ou N; X15 é D, G, N, S ou R; X16 é F, A, N, S ou V; e X17 é Y, N ou deletado. SEQ ID NO: 160 QQX18X19X20X21PX22T; em que X18 é A, G ou S; X19 é Y, H, W ou F; X20 é D ou S; X21 é F, T, L ou W; e X22 é L, F ou I.

[0129] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 161, 119 e 162, respectivamente.

[0130] Exemplos desses anticorpos são anticorpos IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 e IFWM3421. Esses anticorpos neutralizam o IFN-w humano e pelo menos dez subtipos de IFN-α com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 2x10-10 M ou menos, cerca de 1,5x10-10 M ou menos, ou cerca de 1x10-10 M ou menos, e compreendem sequências de consenso de LCDR1 (SEQ ID NO: 161), LCDR2 (SEQ ID NO: 119), LCDR3 (SEQ ID NO: 162), HCDR2 (SEQ ID NO: 114) e HCDR3 (SEQ ID NO: 121) e uma constante de HCDR1 (SEQ ID NO: 109). SEQ ID NO: 161 QSIX23X24X25X26; em que X23 é A ou D; X24 é N ou G; X25 é F, N ou S; e X26 é Y, N ou deletado. SEQ ID NO: 162 QQX27X28X29X30PX31T; em que X27 é G ou S; X28 é Y; X29 é D; X30 é F, T ou L; e X31 é L, F ou I.

[0131] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção neutraliza IFN-w humano e ao menos dez subtipos de IFN-α humano selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a.

[0132] Em algumas modalidades da invenção aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo neutraliza o IFN-w e ao menos os subtipos IFN-α humanos IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-α4a.

[0133] Em algumas modalidades da invenção aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas e alistadas abaixo, o anticorpo não se liga ou neutraliza IFN-αD ou IFN-α1.

[0134] Em algumas modalidades da invenção aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo não se liga nem neutraliza IFN-β.

[0135] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a sequência de aminoácidos da HCDR1 da SEQ ID NO: 109; a sequência de aminoácidos da HCDR2 das SEQ ID NOs: 111, 112 ou 113; a sequência de aminoácidos da HCDR3 das SEQ ID NOs: 115 ou 116; a sequência de aminoácidos da LCDR1 das SEQ ID NOs: 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91; a sequência de aminoácidos da LCDR2 das SEQ ID NOs: 93, 94 ou 95; e a sequência de aminoácidos da LCDR3 das SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107.

[0136] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: a) 109, 113, 116, 77, 93 e 104, respectivamente; b) 109, 113, 116, 85, 93 e 96, respectivamente; c) 109, 113, 115, 79, 95 e 107, respectivamente; d) 109, 113, 116, 76, 93 e 103, respectivamente; e) 109, 113, 115, 85, 93 e 96, respectivamente; f) 109, 113, 115, 89, 95 e 100, respectivamente; g) 109, 113, 116, 86, 93 e 105, respectivamente; h) 109, 113, 115, 76, 93 e 103, respectivamente; i) 109, 113, 116, 80, 93 e 97, respectivamente; j) 109, 113, 116, 84, 93 e 97, respectivamente; k) 109, 113, 116, 90, 93 e 97, respectivamente; l) 109, 113, 116, 88, 93 e 102, respectivamente; m) 109, 113, 116, 87, 93 e 105, respectivamente; n) 109, 113, 116, 91, 93 e 106, respectivamente; o) 109, 113, 115, 80, 93 e 97, respectivamente; p) 109, 113, 116, 83, 93 e 101, respectivamente; q) 109, 113, 116, 82, 94 e 98, respectivamente; r) 109, 113, 115, 78, 95 e 100, respectivamente; s) 109, 111, 116, 81, 93 e 106, respectivamente; t) 109, 113, 116, 82, 94 e 99, respectivamente; u) 109, 113, 115, 81, 93 e 106, respectivamente; v) 109, 112, 116, 81, 93 e 106, respectivamente; ou w) 109, 113, 116, 81, 93 e 106, respectivamente.

[0137] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 77, 93 e 104, respectivamente.

[0138] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 85, 93 e 96, respectivamente.

[0139] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 79, 95 e 107, respectivamente.

[0140] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 76, 93 e 103, respectivamente.

[0141] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 85, 93 e 96, respectivamente.

[0142] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 89, 95 e 100, respectivamente.

[0143] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 86, 93 e 105, respectivamente.

[0144] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 76, 93 e 103, respectivamente.

[0145] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 80, 93 e 97, respectivamente.

[0146] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 84, 93 e 97, respectivamente.

[0147] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 90, 93 e 97, respectivamente.

[0148] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 88, 93 e 102, respectivamente.

[0149] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 87, 93 e 105, respectivamente.

[0150] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 91, 93 e 106, respectivamente.

[0151] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 80, 93 e 97, respectivamente.

[0152] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 83, 93 e 101, respectivamente.

[0153] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 82, 94 e 98, respectivamente.

[0154] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 78, 95 e 100, respectivamente.

[0155] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 111, 116, 81, 93 e 106, respectivamente.

[0156] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 82, 94 e 99, respectivamente.

[0157] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 115, 81, 93 e 106, respectivamente.

[0158] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 112, 116, 81, 93 e 106, respectivamente.

[0159] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da presente invenção compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 113, 116, 81, 93 e 106, respectivamente.

[0160] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH e a VL, sendo que a VH compreende a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 28, 31, 157 ou 158.

[0161] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH e a VL, sendo que a VL compreende a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 ou 150.

[0162] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH das SEQ ID NOs: 28, 31, 157 ou 158, e a VL das SEQ ID NOs: 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 ou 150.

[0163] Em algumas modalidades da invenção aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH e a VL das SEQ ID NOs: 28 e 40, 28 e 39, 31 e 62, 28 e 54, 31 e 39, 31 e 68, 28 e 42, 31 e 54, 28 e 53, 28 e 73, 28 e 75, 28 e 52, 28 e 35, 28 e 135, 31 e 53, 28 e 46, 28 e 61, 31 e 57, 157 e 71, 28 e 150, 31 e 71, 158 e 71, ou 28 e 71.

[0164] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH e a VL, sendo que a VH compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 28, 30, 31, 157 ou 158.

[0165] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da VH das SEQ ID NOs: 28, 30, 31, 157 ou 158, e as sequências de aminoácidos da LCDR1, LCDR2, e LCDR3 da VL das SEQ ID NOs: 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 ou 153, sendo que as CDRs são definidas de acordo com Kabat, Chothia e/ou IMGT.

[0166] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH e a VL, sendo que a VL compreende a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 ou 153.

[0167] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo compreende a VH e a VL, sendo que a VH compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 28, 30, 31, 157 ou 158, e a VL compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 ou 153.

[0168] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 29.

[0169] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 32.

[0170] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 33.

[0171] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 34.

[0172] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 35.

[0173] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 36.

[0174] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 37.

[0175] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 38.

[0176] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 39.

[0177] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 40.

[0178] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 41.

[0179] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 42.

[0180] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 43.

[0181] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 44.

[0182] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 45.

[0183] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 46.

[0184] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 47.

[0185] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 48.

[0186] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 49.

[0187] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 50.

[0188] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 51.

[0189] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 52.

[0190] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 53.

[0191] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 54.

[0192] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 55.

[0193] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 56.

[0194] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 57.

[0195] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 58.

[0196] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 59.

[0197] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 60.

[0198] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0199] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 62.

[0200] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0201] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 64.

[0202] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0203] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 66.

[0204] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0205] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 68.

[0206] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 69.

[0207] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 32.

[0208] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 33.

[0209] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 34.

[0210] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 35.

[0211] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 36.

[0212] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 37.

[0213] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 38.

[0214] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 39.

[0215] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 40.

[0216] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 41.

[0217] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 42.

[0218] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 43.

[0219] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 44.

[0220] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 45.

[0221] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 46.

[0222] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 47.

[0223] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 48.

[0224] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 49.

[0225] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 50.

[0226] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 51.

[0227] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 52.

[0228] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 53.

[0229] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 54.

[0230] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 56.

[0231] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 57.

[0232] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 58.

[0233] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 59.

[0234] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 60.

[0235] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0236] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 62.

[0237] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0238] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 64.

[0239] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0240] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 66.

[0241] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0242] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 68.

[0243] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 69.

[0244] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 32.

[0245] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 33.

[0246] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 34.

[0247] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 35.

[0248] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 36.

[0249] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 37.

[0250] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 38.

[0251] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 39.

[0252] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 40.

[0253] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 41.

[0254] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 42.

[0255] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 43.

[0256] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 44.

[0257] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 45.

[0258] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 46.

[0259] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 47.

[0260] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 48.

[0261] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 49.

[0262] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 50.

[0263] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 51.

[0264] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 52.

[0265] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 53.

[0266] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 54.

[0267] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 56.

[0268] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 57.

[0269] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 58.

[0270] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 59.

[0271] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 60.

[0272] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 61.

[0273] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 62.

[0274] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 63.

[0275] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 65.

[0276] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 66.

[0277] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 67.

[0278] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 68.

[0279] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 69.

[0280] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 70.

[0281] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 70.

[0282] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 30 e a VL da SEQ ID NO: 70.

[0283] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0284] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 31 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0285] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 123.

[0286] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 124.

[0287] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 125.

[0288] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 126.

[0289] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 127.

[0290] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 128.

[0291] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 129.

[0292] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 130.

[0293] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 131.

[0294] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 132.

[0295] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 133.

[0296] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 134.

[0297] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 135.

[0298] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 136.

[0299] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 137.

[0300] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 138.

[0301] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 139.

[0302] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 140.

[0303] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 141.

[0304] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 73.

[0305] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 142.

[0306] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 143.

[0307] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 74.

[0308] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 75.

[0309] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 144.

[0310] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 145.

[0311] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 146.

[0312] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 147.

[0313] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 148.

[0314] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 149.

[0315] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 150.

[0316] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 151.

[0317] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 152.

[0318] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 153.

[0319] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 157 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0320] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compreende a VH da SEQ ID NO: 158 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0321] As variantes dos anticorpos anti-IFN-w/a da invenção que compreendem sequências de aminoácido da VH ou VL mostradas na Tabela 9, Tabela 13, Tabela 15, Tabela 17, Tabela 19 e Tabela 21 es- tão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, as variantes podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou substituições de amino- ácidos na VH e/ou na VL que não afetam de modo adverso as propriedades do anticorpo. Em algumas modalidades, a identidade da sequência pode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma sequência de aminoácidos da VL ou VH da invenção. O percentual de identidade pode ser determinado, por exemplo, pelo alinhamento de pares de sequências com o uso das configurações-padrão do módulo AlignX do Vector NTI v.9.0.0 (Invitro- gen, Carslbad, CA, EUA). Modificações exemplificadoras são, por exemplo, substituições de aminoácido conservativas no sítio de liga-ção ao antígeno ou na estrutura sem alterar adversamente as propriedades do anticorpo. As substituições conservativas podem também ser feitas para melhorar as propriedades do anticorpo, por exemplo, a estabilidade ou afinidade. As substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados podem ser divididos em quatro famílias: (1) ácidos (aspartato, glutamato), (2) básicos (lisina, arginina, histidina), (3) não polares (ala- nina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, tripto- fano), e (4) polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano, e tirosina são, algumas vezes, classificados juntamente como aminoácidos aromáticos. Alternativamente, o repertório de aminoácidos pode ser agrupado como (1) acídicos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, argi- nina histidina), (3) alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), com serina e treonina sendo opcionalmente agrupadas separadamente como alifáticos-hidroxilados; (4) aromáticos (feni- lalanina, tirosina, triptofano), (5) amida (asparagina, glutamina), e (6) contendo enxofre (cisteína e metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a edição, WH Freeman and Co., 1981). Além disso, qualquer resíduo nativo no polipeptídeo também pode ser substituído por alanina, conforme foi previamente descrito para mutagênese de varredura da ala- nina (MacLennan et al (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55 a 67; Sasaki et al (1998) Adv. Biophys. 35:1-24). As substituições de amino- ácido desejadas podem ser determinadas pelos especialistas na técnica no momento em que tais substituições forem desejadas. As variantes de anticorpo resultantes podem ser avaliadas quanto as suas características usando-se os ensaios aqui descritos.

[0322] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 28 e a uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 71.

[0323] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 28 e a uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0324] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 28 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 71.

[0325] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 28 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0326] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 97% idêntica a SEQ ID NO: 28 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 97% idêntica a SEQ ID NO: 71.

[0327] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 97% idêntica a SEQ ID NO: 28 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) pelo menos 97% idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0328] As substituições de aminoácido podem ser feitas, por exemplo, por mutagênese por PCR (patente US n° 4.68 3.195). Alternativamente, as bibliotecas de variantes podem ser geradas com o uso de métodos conhecidos, por exemplo, com o uso de códons randômi- cos (NNK) ou não randômicos, por exemplo, códons DVK, que codificam 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) e triagem nas bibliotecas de variantes com as propriedades dese-jadas.

[0329] Embora as modalidades ilustradas nos Exemplos compreendam pares de regiões variáveis, um de uma cadeia pesada e um de uma cadeia leve, um versado na técnica reconhecerá que modalidades alternativas podem compreender regiões variáveis únicas de cadeia pesada ou leve. A região variável única pode ser usada para triagem de domínios variáveis capazes de formar um fragmento de ligação ao antígeno específico de dois domínios capaz de, por exemplo, se ligar ao IFN-w humano ou vários subtipos de IFN-α humano. A triagem pode ser realizada por métodos de triagem por expressão de fago (phage display) com o uso, por exemplo, de abordagem combinatória dupla hierárquica apresentada na publicação de patente internacional n° WO92/01047. Nessa abordagem, uma colônia individ ual que contém um clone de cadeia H ou de cadeia L é usada para infectar uma biblioteca de clones completa que codifica a outra cadeia (L ou H), e o domínio de ligação ao antígeno específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de expressão em fago, conforme descrito. Portanto, as cadeias polipeptídicas VH e VL individuais são úteis na identificação de anticorpos adicionais que se ligam especificamente a IFN-w ou a vários subtipos de IFN-α diferentes, com o uso dos métodos revelados na publicação de patente internacional. n° WO92/01047.

[0330] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos com o uso de uma variedade de tecnologias para gerar anticorpos. Por exemplo, o método do hibridoma de Kohler e Milstein, Nature 256:495, 1975, pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais. No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro, como um hamster, rato ou macaco, é imunizado com o IFN-w humano e/ou vários subtipos de IFN-α humano ou fragmentos dessas proteínas, seguido de fusão de células de baço dos animais imunizados com célu- las de mieloma usando métodos convencionais para formar células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas de 59 a 103 (Academic Press, 1986)). As colônias produzidas a partir de células de hibridoma únicas imortalizadas são selecionadas quanto à produção de anticorpos com propriedades desejáveis, como especificidade de ligação, reatividade cruzada ou falta da mesma, e afinidade pelo antígeno.

[0331] Vários animais hospedeiros podem ser usados para produzir anticorpos IFN-α/w da invenção. Por exemplo, camundongos Balb/c podem ser usados para gerar anticorpos anti-IFN-α/w humano de camundongo. Os anticorpos produzidos em camundongos Balb/c e outros animais não humanos podem ser humanizados usando-se várias tecnologias para gerar sequências similares às humanas. Técnicas de humanização exemplificadoras, incluindo a seleção de estruturas do aceptor humano, são conhecidas pelos versados na técnica e incluem enxerto de CDR (patente US n° 5.225.539), enxerto d e SDR (patente US n° 6.818.749), "Resurfacing" (Padlan, Mol Immunol 28:489-499, 1991), "Resurfacing" de resíduos determinantes de especificidade (publicação de patente US n° 20100261620), adaptação humana (ou adaptação da estrutura humana) (publicação de patente US n° US20 09/0118127), super-humanização (patente US n° 7.709.226) e seleção direcionada (Osborn et al (2005) Methods 36:61-68, 2005; patente US n° 5.565.332).

[0332] Os anticorpos humanizados podem ser adicionalmente otimizados para melhorar sua seletividade ou afinidade por um antígeno desejado através da incorporação dos resíduos de suporte à estrutura alterada para preservar a afinidade da ligação (retromutações) por técnicas, como aquelas reveladas na publicação de patente internacional n° WO90/007861 e publicação de patente interna cional n° WO92/22653.

[0333] Camundongos transgênicos carreando loci da imunoglobulina (Ig) humana no seu genoma podem ser usados para gerar anticorpos humanos contra uma proteína-alvo e são descritos, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO90/04036, patente US n° 6150584, publicação de patente internacional n° WO9 9/45962, publicação de patente internacional n° WO02/066630, publicação de patente internacional n° WO02/43478, Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9; Green et al (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jakobovits (1998) Exp. Med. 188:483-95; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Bruggemann et al (1991) Eur. J. Immunol. 21:1323- 1326; Fishwild et al (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez et al (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang et al (1999) Cancer Res. 59:1236-1243; Brüggemann and Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458; publicação de patente internacional N° WO02/043478). Os loci de imunoglobulina e ndógena nesses camundongos podem ser interrompidos ou deletados, e ao menos um locus de imunoglobulina humana completo ou parcial pode ser inserido no genoma de camundongo usando recombinação homóloga ou não homóloga, usando transcromossomos ou usando minigenes. Empresas, como Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http:// www ky- mab_ com), Trianni (http://_www.trianni_com) e Ablexis (http:// www ablexis_com) podem ser encarregadas de fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando a tecnologia descrita acima.

[0334] Os anticorpos humanos podem ser selecionados de uma biblioteca de exposição de fago, em que o fago é modificado para expressar imunoglobulinas humanas ou porções das mesmas, como Fabs, anticorpos de cadeia única (scFv) ou regiões variáveis de anticorpo não pareadas ou pareadas (Knappik et al (2000) J. Mol. Biol.296:57-86; Krebs et al (2001) J. Immunol. Meth. 254:67-84; Vaughan et al (1996) Nature Biotechnology 14:309-314; Sheets et al (1998) PITAS (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, (1991) J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al (1991) J. Mol. Biol. 222:581). Os anticorpos da invenção podem ser isolados, por exemplo, da biblioteca de exposição de fago expressando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo, como proteínas de fusão, com a proteína do envoltório do bac- teriofago pIX, conforme descrito em Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:38596 e publicação de patente internacional N° WO09/08 5462). As bibliotecas de anticorpos podem ser selecionadas pela ligação ao IFN-w e IFNα humanos, e os clones positivos obtidos podem ser adicionalmente caracterizados, os Fabs são isolados dos lisados do clone, e expressos como IgGs de comprimento total. Tais métodos de exposição de fago para isolar anticorpos humanos são descritos em, por exemplo: patentes US n°s 5.223.409; 5.403.484; e 5.571. 698 concedidas a Ladner et al.; patentes US n°s 5.427.908 e 5.580.717 concedidas a et al.; patentes US n°s 5.969.108 e 6.172.197 concedidas a McCafferty et al.; e patentes US n°s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.73 1; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 concedidas a Griffiths et al.

[0335] A preparação de antígenos imunogênicos e a produção de anticorpos monoclonais pode ser executada com o uso de qualquer técnica adequada, como a produção de proteína recombinante. Os an- tígenos imunogênicos podem ser administrados a um animal sob a forma de proteína purificada, ou misturas de proteína que incluem células completas ou extratos de tecido ou célula, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal a partir de ácidos nucleicos que codificam o dito antígeno ou uma parte do mesmo.

[0336] Em um exemplo de método, as bibliotecas de exposição de fago podem ser selecionadas contra IFN-α2 humano biotinilado ou IFN-αG humano biotinilado. Após três ciclos de imunoadsorção, um ensaio ELISA de fago policlonal usando IFN-α2, IFN-αG e IFN-w como antígenos, pode ser realizado para detectar o enriquecimento específico de cada experimento de imunoadsorção. Os fagos que demonstraram enriquecimento para ligantes de IFN-α2, IFN-αG e IFN-w podem ser coletados, e adicionalmente triados em um ensaio ELISA padrão para ligação aos subtipos de IFN-α em formato Fab. Os clones Fab identificados podem ser clonados em anticorpos de comprimento total e caracterizados adicionalmente quanto sua afinidade e a capacidade de neutralização de IFN-w humano e vários subtipos de de IFN-α usando ProteOn e o ensaio de gene-repórter ISRE, conforme aqui descritos.

[0337] Os anticorpos da invenção podem ser humanos ou humanizados.

[0338] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos contra o IFN-α/w da invenção compreendem uma estrutura de VH derivada do gene da linhagem germinativa humana IGHV5-51 (SEQ ID NO: 155).

[0339] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, os anticorpos contra IFN-α/w da invenção compreendem uma estrutura do gene da linhagem germinativa IGKV1D-39 (SEQ ID NO: 156).

[0340] Os anticorpos da invenção aqui descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem ser do tipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Os anticorpos da invenção podem ser do tipo IIgG1, IgG2, IgG3, IgG4.

[0341] As propriedades de atuador imunológico dos anticorpos da invenção podem ser acentuadas ou silenciadas através de modificações Fc por técnicas conhecidas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as funções efetoras de Fc como a ligação de C1q, cito- toxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação descendente de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas por meio da modificação dos resíduos no Fc responsável por essas atividades. As propriedades farmacocinéticas dos anticorpos da invenção podem ser acentuadas pela mutação dos resíduos no domínio Fc que estendem a meia-vida do anticorpo (Strohl (2009) Curr Opin Bio- technol 20:685-91). As modificações exemplificadoras do Fc são IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E (Dall’Acqua et al (2006) J. Biol. Chem. 281:23514-24; ou V234A/G237A/P238S, V234A/ G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 em IgG2 ou V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S em IgG2 (publicação de patente internacional No. WO11/066501), ou as descritas na patente US n° 6.737.056 (numeração do resíduo de acordo com a numeração da UE).

[0342] Adicionalmente, os anticorpos da invenção aqui descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem ser modificados após a tradução por processos, como glicosilação, isomerização, deglicosilação ou modificação covalente de ocorrência não natural, como a adição de porções de po- lietileno glicol (peguilação) e lipidação. Tais modificações podem ocorrer in vivo ou in vitro. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser conjugados ao polietileno glicol (PEGuilados) para otimizar seus perfis farmacocinéticos. A conjugação pode ser realizada por técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Foi demonstrado que a conjugação de anticorpos terapêuticos com PEG melhora a farmacodinâmi- ca, enquanto não interfere com a função (Knigh et al (2004) Platelets 15:409-18; Leong et al (2001) Cytokine 16:106-19; Yang et al (2003) Protein Eng. 16:761-70).

[0343] Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos da invenção modificados para otimizar a estabilidade, a seletividade, a reatividade cruzada, a afinidade, a imunogenicidade ou outras propriedades biológicas ou biofísicas desejadas são contidos no escopo da invenção. A estabilidade de um anticorpo é influenciada por inúmeros fatores, incluindo (1) o empacotamento do núcleo dos domínios individuais que afetam sua estabilidade intrínseca, (2) as interações de interface prote- ína/proteína que têm impacto no pareamento de HC e LC, (3) a disposição de resíduos polares e carregados, (4) a rede de ligação H a resíduos polares e carregados; e (5) a distribuição na superfície dos resíduos polares e carregados dentre outras forças intra e intermolecula- res (Worn et al (2001) J. Mol. Biol. 305:989-1010). Resíduos com o potencial para desestabilizar estruturas podem ser identificados com base na estrutura cristalina do anticorpo ou através de modelagem molecular em determinados casos, e o efeito dos resíduos sobre a estabilidade do anticorpo pode ser testado através da geração e da avaliação de variantes que abrigam mutações nos resíduos identificados. Uma das maneiras de aumentar a estabilidade do anticorpo é elevar o ponto médio de transição térmica (Tm) conforme medido através de calorimetria de varredura diferencial (CVD). De modo geral, a Tm da proteína está correlacionada com sua estabilidade e inversamente cor-relacionada com sua suscetibilidade ao enovelamento e desnaturação em solução e aos processos de degradação que dependem da tendência da proteína a se desenovelar (Remmele et al (2000) Biopharm 13:36-46,). Inúmeros estudos revelaram a correlação entre a classificação da estabilidade física das formulações medida como estabilidade térmica por calorimetria de varredura diferencial (CVD) e a estabilidade física medida por outros métodos (Gupta et al (2003) AAPS PharmSci 5E8; Zhang et al (2004) J. Pharm. Sci. 93:3076-89; Maa et al (1996) Int. J. Pharm. 140:155-68; Bedu-Addo et al (2004) Pharm.Res. 21:1353-61; Remmele et al (1997) Pharm. Res. 15:200-8). Os estudos de formulação sugerem que uma Tm do Fab implica na estabilidade física de longo prazo de um mAb correspondente. As diferenças em aminoácidos tanto na estrutura como no dentre as CDRs poderiam ter efeitos significativos sobre a estabilidade térmica do domínio Fab (Yasui et al (1994) FEBS Lett. 353:143-6).

[0344] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compete com a ligação ao IFN-w humano com um anticorpo isolado que compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 71.

[0345] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção compete com a ligação ao IFN-w humano com um anticorpo isolado que compreende a VH da SEQ ID NO: 28 e a VL da SEQ ID NO: 150.

[0346] A competição entre a ligação específica ao IFN-w humano com anticorpos da invenção que compreendem certas sequências da VH e VL pode ser testada in vitro usando métodos conhecidos. Por exemplo, a ligação do anticorpo marcado pelo método MSD SulfoTag™ com NHS-éster ao IFN-w humano na presença de um anticorpo não marcado pode ser avaliada por ELISA, ou análises Biacore, ou a citometria de fluxo podem ser usadas para demonstrar a competição com os anticorpos da presente invenção.

[0347] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção se liga e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN -w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α), sendo que o anticorpo se liga ao IFN-w da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos F27, L30 e R33.

[0348] Os resíduos F27, L30 e R33 de IFN-w definem um epítopo mínimo necessário para ampla atividade neutralizante dos anticorpos contra IFN-α/w da invenção. A estrutura cristalina de vários complexos anticorpo/IFN-α ou anticorpo/IFN-w revelou os três resíduos que proporcionam contribuições predominantes para a ligação do anticorpo. O resíduo F27 é conservado em todos os IFN-αs humanos exceto IFN- αD (α1), ao qual os anticorpos da invenção não se ligam. Tanto L30 quanto R33 são conservados em todos os IFN-αs humanos, bem como no IFN-w humano. A confirmação adicional da contribuição do F27 para o epítopo é evidente a partir dos estudos de ligação com vários subtipos de IFN-α de cinomolgos: os anticorpos da invenção não se ligam ao IFN-α13 de cinomolgos, o qual, como o IFN-αD humano, tem uma serina na posição 27 (S27).

[0349] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção se liga ao IFN-w humano da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos S25, P26, F27, L28, L30, K31, R33, R34 e D35.

[0350] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α), sendo que o anticorpo se liga ao IFN-w humano da SEQ ID NO: 1 em um ou mais resíduos, incluindo F27.

[0351] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, o anticorpo da invenção é um anticorpo biespecífico que se liga a e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α) e se liga a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL ou IFN-Y.

[0352] Dada a presença de IFN-w elevado em pacientes com LES e a demonstração de que IFN-w pode induzir a secreção de BLyS em CMSPs in vitro, o bloqueio combinado de IFN-α/w em pacientes com LES pode ser mais eficaz na redução dos níveis de BLyS em comparação com abordagens específicas anti IFN-α. A extensão da assinatura IFN e da atividade do IFN em pacientes com LES parece se correlacionar a níveis de BLyS solúvel.

[0353] Os anticorpos IFN-α/w da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, pode ser manipulada em que os anticorpos biespecíficos são também abrangidos dentro do escopo da invenção. As regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser manipuladas com o uso dos métodos publicados para formar anticorpos biespecíficos de cadeia única, como estruturas como os designs TandAb® (publicação de patente internacional n° WO99/57150; publicação de patente US n° US2011/0206672) ou scFVs biespecíficos como estruturas, como as reveladas na patente US n° US5869620; publicação de patente internacional n° WO95/15388, publicação de patente inter nacional n° WO97/14719, ou publicação de patente internacional n° WO11/036460.

[0354] As regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser manipuladas para formar anticorpos biespecíficos de comprimento total, onde cada braço do anticorpo se liga a um antígeno ou epítopo distinto. Esses anticorpos biespecíficos são tipicamente produzidos através da modulação das interações CH3 entre as duas cadeias pesadas dos anticorpos para formar anticorpos biespecíficos com o uso de tecnologias, como descrito na patentes US n° 7.6 95.936; publicação de patente internacional n° WO04/111233; public ação de patente US n° 2010/0015133; publicação de patente US n° 200 7/0287170; publicação de patente internacional n° WO2008/119353; pu blicação de patente US n° 2009/0182127; publicação de patente US n° 2010/0286374; publicação de patente US n° 2011/0123532; publicaçã o de patente internacional n° WO2011/131746; publicação de patente internacional n° WO2011/143545; ou publicação de patente US n° 2012/ 0149876.

[0355] Por exemplo, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser gerados in vitro em um ambiente livre de células através da introdução de mutações assimétricas nas regiões de CH3 de dois anticorpos homodiméricos mono-específicos e da formação do anticorpo heterodimérico biespecífico de dois anticorpos homodiméricos mono- específicos parentais em condições redutoras para permitir a isomeri- zação da ligação de dissulfeto de acordo com os métodos descritos na publicação de patente internacional n° WO2011/13174 6. Nos métodos, o primeiro anticorpo mono-específico bivalente (por exemplo, anticorpo anti-IFN-α/w da invenção) e o segundo anticorpo mono-específico bivalente (por exemplo, anticorpo anti-BLyS, anti-CD40L, anti- IL-6, anti- CD27, anti-BDCA2, anti- IL-12, anti-IL-23, anti-IFN-αD, anti-IL-17, anti- CD20, anti-IL-10, anti-CD22, anti-IL-21, anti-ICOS, anti- ICOSL ou anti- IFN-Y) são manipulados para terem certas substituições no domínio CH3 que promove estabilidade do heterodímero; os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região da dobradiça sofram isomerização da ligação de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As condições de incubação param ser idealmente restauradas para não redutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioe- ritritol (DTE), glutationa, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína e beta-mercaptoetanol, de preferência, um agente redutor selecionado do grupo que consiste em: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris(2- carboxietil)fosfina. Por exemplo, a incubação durante pelo menos 90 min, a uma temperatura de pelo menos 20°C na presen ça de 25 mM de 2-MEA ou na presença de pelo menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.

[0356] Mutações CH3 exemplificadoras que podem ser usadas em uma primeira cadeia pesada e em uma segunda cadeia pesada do anticorpo biespecífico são K409R e/ou F405L.

[0357] Estruturas biespecíficas adicionais às quais as regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser incorporadas são, por exemplo, as Imunoglobulinas de Domínio Variável Duplo (publicação de patente internacional n° WO2009/134776), ou estr uturas que incluem vários domínios de dimerização para conectar os dois braços do anticorpo com especificidades diferentes, como os domínios do zíper da leucina ou de dimerização do colágeno (publicação de patente internacional n° WO2012/022811, patente US n° 5.932.4 48; patente US n° 6.833.441). DVDs são anticorpos de comprimento total que compreendem a cadeia pesada tendo uma estrutura VH1-ligante-VH2-CH e a cadeia leve tendo a estrutura VL1-ligante-VL2-CL; o ligante sendo opcional.

[0358] A VH e a VL se ligando a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL ou IFN-Y a serem incorporados a anticorpos anti-IFN-α/w bies- pecíficos podem ser geradas de novo com o uso de métodos descritos na presente invenção, ou podem ser manipuladas a partir de anticorpos mono-específicos existentes. Um anticorpo anti-BLyS exemplifica- dor que pode ser usado para gerar os anticorpos biespecífico da invenção é BENLYSTA®. Anticorpos CD40L exemplificadores que podem ser usados são aqueles descritos na patente US n° 5.474.771, na patente US n° 5.747.037, publicação de pedido inter nacional n° WO01/68860, publicação de patente internacional n°W O06/033702, ou publicação de patente internacional n° WO08/118356. Anticorpos anti- IL-6 exemplificadores que podem ser usados são aqueles descritos no pedido de patente internacional n° WO06/119115, pub licação de patente internacional n° WO10/056948, publicação de p atente internacional n° WO10/088444, ou publicação de patente inter nacional n° WO07/076927. Anticorpos anti-CD27 exemplificadores que podem ser usados são aqueles descritos no pedido de patente internacional n° WO13/138586, publicação de patente internacional n° WO11/130434, ou publicação de patente internacional n° WO12/004367. Anticorpos IL-12 e IL-23 exemplificadores que podem ser usados são STELARA®. Anticorpos IL-23 exemplificadores que podem ser usados são aqueles descritos na publicação de patente internacional n° WO07/0059 55, publicação de patente internacional n° WO07/027714, publicação de patente in-ternacional n° WO08/103432, publicação de patente i nternacional n° WO07/106769, publicação de patente internacional n° WO07/147019, ou publicação de patente internacional n° WO08/1346 59. Anticorpos IL-17 exemplificadores que podem ser usados são os descritos, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO06/013107, publicação de patente internacional n° WO06/054059, publicação de patente internacional n° WO07/070750, publicação de patente internacional n° WO08/134659, publicação de patente intern acional n° WO07/149032, publicação de patente internacional n° WO08/021156, publicação de patente internacional n° WO08/047134, publicação de patente internacional n° WO09/130459, publicação de patente internacional n° WO10/025400, publicação de patente intern acional n° WO11/053763 e publicação de patente internacional n° WO12/095662.

[0359] Uma outra modalidade da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, é um anticorpo que se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α), tendo certas sequências de VH e VL, em que a VH do anticorpo é codificada por um primeiro polinucleotídeo e a VL do anticorpo é codificada por um segundo polinucleotídeo sintético. O polinucleotídeo pode ser um ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) e pode ser de otimizado para o códon para expressão em hospedeiro adequado. A otimização de códon é uma tecnologia bem conhecida.

[0360] Em algumas modalidades aqui descritas, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas e listadas abaixo, os polinucleotídeos que codificam a VH ou VL do anticorpo da invenção compreendem as SEQ ID NOs: 72, 92, 108, 110, 117 ou 122.

[0361] Uma outra modalidade da invenção é um polinucleotídeo isolado que codifica quaisquer das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo e/ou as regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo da invenção. Certos polinucleotídeos exemplificadores são revelados aqui, entretanto, outros polinucleotídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão, codificam os anticorpos da invenção, também estão dentro do escopo da invenção. Os polinucleotídeos exemplificadores são, por exemplo, polinucleotídeos tendo as sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 72, 92, 108, 110, 117 ou 122. As sequências de polinucleotídeos que codificam uma VH ou uma VL ou um fragmento das mesmas do anticorpo da invenção podem ser funcionalmente ligadas a um ou mais elementos reguladores, como um promotor ou acentuador (enhancer), que permitem a expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira desejada. O polinucleotídeo pode ser um cDNA.

[0362] Uma outra modalidade da invenção é um vetor compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Esses vetores podem ser vetores plasmidiais, vetores virais, vetores para expressão em baculovírus, vetores com base em transposon ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução do polinucleotídeo sintético da invenção em um dado organismo ou fundo genético por quaisquer meios. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos da invenção, opcionalmente ligadas a regiões constantes, são inseridos em vetores de expressão. As cadeias pesadas e/ou leves podem ser clonadas no mesmo vetor de expressão ou em vetores de expressão diferentes. Os seg-mentos de DNA que codificam as cadeias de imunoglobulina são fun-cionalmente ligados às sequências de controle no(s) vetor(es) de expressão que garante(m) a expressão de polipeptídeos de imunoglobu- lina. Essas sequências de controle incluem sequências de sinalização, promotores (por exemplo, promotores associados naturalmente ou he- terólogos), elementos de acentuador e sequência de terminação da transcrição e são escolhidas por serem compatíveis com a células hospedeira escolhida para expressar o anticorpo. Depois que o vetor for incorporado no hospedeiro adequado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de alto nível das proteínas codificadas pelos polinucleotídeos incorporados.

[0363] Os vetores de expressão adequados são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros ou como epissomas ou como uma parte integrada do DNA cromossômico hospedeiro. Comumente, os vetores de expressão contêm marcadores de seleção, como resistência à ampicilina, resistência à higromicina, resistência à tetraciclina, resistência à canamicina ou resistência à neomicina para permitir a detecção dessas células transformadas com as sequências de DNA desejadas.

[0364] Elementos do promotor e acentuador adequados são conhecidos na técnica. Para a expressão em uma célula bacteriana, promotores exemplificadores incluem lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P e trc. Para expressão em uma célula eucariote, promotores exemplifi- cadores incluem elementos do promotor e acentuador do gene da imunoglobulina de cadeia leve e/ou pesada; promotor inicial imediato de citomegalovírus; promotor da timidina quinase do vírus da herpes simples; promotores SV40 iniciais e tardios; promotor presente em longas repetições terminais de um retrovírus; promotor da metalotione- ína-I do camundongo e vários promotores específicos para tecido conhecidos na arte. Para expressão em uma célula de levedura, um promotor exemplificador é um promotor constitutivo, como um promotor ADH1, um promotor PGK1, um promotor ENO, um promotor PYK1 e similares; ou um promotor regulável, como um promotor GAL1, um promotor GAL10, um promotor ADH2, um promotor PH05, um promotor CUP1, um promotor GAL7, um promotor MET25, um promotor MET3, um promotor CYC1, um promotor HIS3, um promotor ADH1, um promotor PGK, um promotor GAPDH, um promotor ADC1, um promotor TRP1, um promotor URA3, um promotor LEU2, um promotor ENO, um promotor TP1 e AOX1 (por exemplo, para uso em Pichia). A seleção do vetor e promotor adequados está dentro do nível do versado na técnica.

[0365] Grandes números de vetores e promotores adequados são conhecidos dos versados na técnica; muitos estão comercialmente disponíveis para gerar construtos recombinantes em questão. Os vetores a seguir são fornecidos a título de exemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Eucaraiotes: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL (Pharmacia).

[0366] Uma outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores da invenção. O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão re- combinante foi introduzido. Entende-se que o termo célula hospedeira refere-se não apenas à célula do específica em questão, mas à progê- nie desta célula, e também a uma linhagem celular estável gerada da célula do específica em questão. Uma vez que certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser idêntica à célula progenitora, mas ainda assim ser incluída no escopo do termo "células hospedeira" para uso na presente invenção. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetais ou células de arquea.

[0367] Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, e outras Enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas, são exemplos de células hospedeiras procarióticas. Outros micróbios, como leveduras, também são úteis para a expressão. Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) e Pichia são exemplos de células hospedeiras de levedura adequadas. Células eucarióti- cas exemplificadoras podem ser de origem mamífera, de inseto, aves ou outras origens animais. As células eucarióticas de mamíferos incluem linhagens celulares imortalizadas, como linhagens celulares de hi- bridoma ou mieloma, como linhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA, CRL- 1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC n° 85110503), FO (ATC C CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL-1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas derivadas de células de ovário do hamster chinês (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD, EUA), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ou DG44.

[0368] Uma outra modalidade da invenção é um método de produ- ção de um anticorpo da invenção, que compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção em condições nas quais o anticorpo é expresso, e a recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira. Os métodos de produção de anticorpos e de purificação dos mesmos são bem conhecidos na técnica. Depois de sintetizados (ou quimicamente ou por recombinação), os anticorpos inteiros, seus dímeros, cadeias individuais leves e/ou pesadas, ou outros fragmentos de anticorpo, como VH e/ou VL, podem ser purificados de acordo com procedimentos convencionais, incluindo precipitação por sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), eletroforese em gel e similares (consulte, em geral, Scopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)). Um anticorpo em questão pode ser substancialmente puro, por exem-plo, com ao menos cerca de 80% a 85% de pureza, com ao menos cerca de 85% a 90% de pureza, com ao menos cerca de 90% a 95% de pureza, ou com ao menos cerca de 98% a 99%, ou mais, de pureza, por exemplo, isento de contaminantes, como resíduos celulares, macromo- léculas, etc. que não sejam o anticorpo em questão.

[0369] Uma outra modalidade da invenção é um método para produção de anticorpo que se liga a, e neutraliza a atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez ou onze interferons alfa humanos (IFN-α) que compreende:incorporar do primeiro polinucleotídeo que codifica a VH do anticorpo e o segundo polinucleotídeo que codifica a VL do anticorpo em um vetor de expressão;transformar uma célula hospedeira com o vetor de expressão;cultivar a célula hospedeira em um meio de cultura sob condições em que a VL e VH do anticorpo são expressas e formam o anticorpo; e recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira ou meio de cultura.

[0370] Os polinucleotídeos codificando certas sequências de VH ou VL da invenção são incorporados nos vetores usando métodos- padrão de biologia molecular. A transformação na célula hospedeira, cultura, expressão e purificação do anticorpo são feitos usando métodos bem conhecidos.

Métodos de tratamento

[0371] Os anticorpos IFN-α/w da invenção podem ser utilizados para tratar doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune ou doenças autoimunes como lúpus, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou lúpus eritematoso cutâneo (LEC), ou outras doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune, como psoríase, trombocitopenia imune (ITP), síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, miosite, imunodeficiência comum variável (IDCV), doença autoimune da tireoide, diabetes tipo I, artrite reumatoi- de, rejeição a transplante ou doença de enxerto-contra-hospedeiro (GVHD). Essas doenças podem ser associadas com a produção aumentada de IFN-α e/ou IFN-w assinatura de IFN do tipo 1.

[0372] Uma modalidade da invenção é um método de tratamento de uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune, que compreende administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um anticorpo isolado que se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze sub- tipos de interferon alfa humano (IFN-α) a um paciente em necessidade do mesmo durante um período de tempo suficiente para tratar a doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou a doença autoimune.

[0373] Uma outra modalidade da invenção é um método para tratar lúpus, que compreende administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um anticorpo isolado que se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α) a um paciente em necessidade do mesmo durante um período de tempo suficiente para tratar lúpus.

[0374] Em algumas modalidades, lúpus é lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou lúpus eritematoso cutâneo (LEC).

[0375] Em algumas modalidades, o paciente tem nefrite lúpica.

[0376] Em algumas modalidades, a doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou doenças autoimunes é psoríase, trombocitope- nia imune (ITP), síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, miosite, imunodeficiência comum variável (IDCV), doenças autoimunes da tireoide, diabetes tipo I, artrite reumatoide, rejeição a transplante ou doença do enxerto contra hospedeiro (DECH).

[0377] Uma outra modalidade da invenção é um método para tratar uma infecção viral crônica, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo isolado que se liga a, e neutraliza uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α) a um paciente em necessidade do mesmo durante um período de tempo suficiente para tratar a infecção viral crônicas.

[0378] IFN-I é bem conhecido por ter uma função protetora na infecção viral aguda. Demonstrou-se recentemente que IFN-I tem uma função imunossupressora em infecções virais crônicas através de um mecanismo mediado ao menos parcialmente por IL-10 e o ligante da morte celular programada 1 (PDL1) (Teijaro et al., Science 340, 207211, (2013); Wilson et al., Science 340, 202-207, 2013). O bloqueio combinado de múltiplos subtipos de IFN-α e IFN-w pode oferecer efeitos benéficos a pacientes com infecções virais crônicas, incluindo HIV e hepatite C, mediante a retro-modulação de um ambiente imunossu-pressor que contribui para a persistência viral.

[0379] Em algumas modalidades, a infecção viral crônica é HIV ou hepatite C.

[0380] "Tratamento" ou "tratar" refere-se ao tratamento terapêutico. Pacientes que podem ser tratados também incluem aqueles propensos ou suscetíveis ao distúrbio, daqueles em que o distúrbio deve ser evitado. Indivíduos com necessidade de tratamento incluem aqueles já com um distúrbio ou um sintoma do distúrbio. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem o alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizada (ou seja, não piora), atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhora ou paliativo do estado de doença, e remissão (seja parcial ou total), de- tectável ou indetectável. "Tratamento" pode também significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada de um in-divíduo não recebendo tratamento.

[0381] Anticorpos exemplificadores que podem ser usados nos métodos da invenção compreendem as regiões VH, VL, HCDR e/ou LCDR, conforme mostrado nas Tabelas 9, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, e os anticorpos IFWM3308, IFWM3307, IFWM3410, IFWM3322, IFWM3321, IFWM3520, IFWM3385, IFWM3522, IFWM3399, IFWM3416, IFWM3524, IFWM3314, IFWM3310, IFWM3320, IFWM3331, IFWM3400, IFWM3304, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 e IFWM3421.

[0382] Outros anticorpos exemplificadores que podem ser usados nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, são anticorpos que se ligam a, e neutralizam uma atividade biológica de um interferon ômega humano (IFN-w) e pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α), sendo que o anticorpo se liga ao IFN-w da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos F27, L30 e R33.

[0383] Outros anticorpos exemplificadores que podem ser usados nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, são anticorpos que se ligam ao IFN-w humano da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos S25, P26, F27, L28, L30, K31, R33, R34 e D35.

[0384] Os métodos da invenção podem ser usados para tratar um paciente animal pertencente a qualquer classificação. Exemplos de tais animais incluem mamíferos como humanos, roedores, cães, gatos e animais da fazenda.

[0385] Os anticorpos da invenção podem ser úteis na preparação de um medicamento para este tratamento, sendo que o medicamento é preparado para administração nas dosagens aqui definidas. LES é uma doença autoimune crônica que afeta múltiplos órgãos com fatores genéticos e ambientais contribuindo para seu desenvolvimento.

[0386] LES é caracterizada pela produção de autoanticorpos patogênicos e deposição no tecido dos complexos imunes, resultando em dano ao tecido em órgãos múltiplos. Combinações de complicações cutâneas, músculo-esqueléticas, hematológicas, neurológicas e renais são observadas em pacientes, com períodos de surtos e remissões. Nefrite lúpica é definida como um caso de LES com um diagnóstico de nefrite, proteinúria, hematúria e/ou insuficiência renal. Em pacientes com nefrite lúpica, o envolvimento renal é caracterizado por proteinúria (>0,5 g/24 horas), e/ou eritrócitos, ou cilindros hemáticos em amostras de urina.

[0387] Sem se ater à qualquer teoria particular, é sugerido que o LES desencadeie esses complexos imunes, invoque respostas de IFN do tipo I, incluindo a superprodução de IFN-α e IFN-w, mas não de IFN-β. Portanto, os anticorpos IFN-α/w da invenção podem proporcionar um tratamento mais eficaz de lúpus e outras doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune, inibindo amplamente o IFN-w e múltiplos subtipos de IFN-α, enquanto poupam a função de IFN-β, o qual pode desempenhar um papel de importância crítica na defesa antiviral, e no qual a molécula pode não ter relevância biológica no lúpus. Por exemplo, anticorpos anti-IFN-β deixaram de neutralizar a atividade sé- rica do paciente tanto de pacientes com LES como com AGS, uma doença também associada à atividade elevada do IFN-I e assinatura de IFN (Hooks et al., Arthritis and Rheumatism 25:396-400, 1982; Hua et al., Arthritis and Rheumatism 54: 1906 (Jun, 2006); Rice et al., Lancet Neurology doi:10.1016/S1474-4422(13)70258-8 (2013)).

[0388] Outros tipos de lúpus, além do LES, incluem lúpus eritema- toso cutâneo (LEC) e lúpus pediátrico.

[0389] Os sintomas associados ao lúpus incluem dor e rigidez nas juntas, artrite não erosiva, dores musculares, dor, fraqueza, febre, malestar, úlceras nos tecidos bucais, manifestações cutânea (por exemplo, erupção cutânea em forma de borboleta pelo nariz e bochechas; manchas dermatológicas induzidas pela luz solar), perda de peso ou ganho de peso anormal, anemia, baixa contagem de plaquetas e/ou linfócitos, manifestações neuropsiquiátricas ou neurológicas (por exemplo, dificuldade de pensar, problemas de memória, confusão, depressão, dor de cabeça, convulsões, acidente vascular cerebral), problemas nos rins (por exemplo, nefrite, por exemplo, glomerulonefrite), sensibilidade ao sol ou à luz, perda de cabelo, dedos roxos ou pálidos do estresse ou frio, lesões vasculares ou outras manifestações vasculares, ou sintomas cardio-pulmonares, como pericardite ou pleurite. Níveis elevados de interleucinas, IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, IL-5 e IL-16; TNF-α ou interferons do tipo 1, bem como a superexpres- são de genes induzíveis por IFN, são documentados em pacientes com lúpus. Os pacientes podem ter níveis elevados de autoanticorpos contra componentes nucleares e celulares, como DNA de fita dupla (dsDNA), ribonucleoproteína (RNP), SS-a/Ro, SS-b/La, fosfolipídeos, histonas ou cardiolipina. Os pacientes podem ter deposição do complexo imune em pelo menos um tecido.

[0390] LES pode ser diagnosticado ou classificado, por exemplo, usando-se as recomendações do American College of Rheumatology (Escola Americana de Reumatologia, ACR), ou os critérios do SLICC (Systemic Lúpus International Collaborating Clinics Criteria) para a classificação de lúpus eritematoso sistêmico. Por exemplo, os critérios do SLICC de 2012 exigem que os pacientes demonstrem pelo menos 4 dos 11 critérios, com pelo menos um critério clínico e um imunológi- co, ou nefrite lúpica verificada por biópsia na presença de anticorpos anti-DNA (ADA) ou anticorpos anti-ácido nucleico (ANA). Os critérios clínicos são lúpus cutâneo agudo, lúpus eritematoso cutâneo crônico, úlceras orais ou nasais, alopécia não-cicatrizada, artrite, serosite, sintomas renais, sintomas neurológicos, anemia hemolítica, leucopenia ou trombocitopenia (<100.000/mm3). Os critérios imunológicos incluem ANA, ADA, anticorpos anti-fosfolipídeo, teste de baixo complemento (C3, C4 e CH50) ou teste de Coombs direto, que não contam na presença de anemia hemolítica (Petre et al., Arthritis and Rheumatism Aug 2012). Doença ativa pode ser definida por um critério "A" do grupo de atividade do lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG) ou por dois critérios BILAG "B"; índice de atividade da doença LES (SLEDAI); ou índice de respondedor do lúpus eritematoso sistêmico (LES) descrito em Furie et al., Arthritis Rheum. 61(9): 1143-51 (2009).

[0391] A gravidade e a atividade da doença LES podem ser definidos por uma pontuação BILAG por um clínico especialista em LES. O índice BILAG 2004 é usado para determinar a pontuação BILAG (ver Yee, et al. Arthritis & Rheumatism 54:3300-3305, 2006; Isenberg et al., Rheumatology 44:902-906; 2005). O índice BILAG 2004 avalia 97 sinais e sintomas clínicos, e parâmetros de laboratório em nove domínios dos sistemas de órgãos: constitucional, mucocutâneo, neuropsiquiátrico, músculo-esquelético, cardiorrespiratório, gastrointestinal, oftálmico, renal e hematológico. Os 97 sintomas são classificados com relação à gravi-dade no mês anterior (4 semanas) e com relação a qualquer alteração do exame anterior (novo, melhorando, estável, piorando, ausente). Uma única pontuação alfabética (de A a E) para cada um dos nove domínios é então derivada dos resultados do exame resulta em cada categoria de órgão. A Tabela 2 mostra as categorias BILAG.

[0392] LEC é classificado adicionalmente em agudo (LECA), su-bagudo (LECS), crônico (LECC) ou intermitente (LECI), dependendo do grupo de características clínicas e duração das lesões cutâneas, anormalidades laboratoriais, alterações histológicas na biópsia da pele. A classificação e manifestações clínicas das várias formas de LEC são analisadas em Kuhn and Landmann, J Autiommunity 48-49:14-19, 2014.

[0393] Foi relatada correlação positiva entre uma assinatura do gene IFN tipo I com características clínicas orológicas de lúpus (Kara- georgas et al., J Biomed Biotechnol 273907, 2011 Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615, 2003, Bennett et al., J Exp Med 197:711-723, 2003, Dall'era et al. Ann Rheum Dis 64: 1692-1697, 2005, Niewold et al. Genes Immun 8: 492-502,2007).). A preponderância de autoanticorpos em conjunto com uma depuração deficiente de leva a um ciclo de realimentação da produção de IFN onde a internali- zação dependente de receptor de Fc dos complexos imunes em células dendríticas plasmocitoides (pDC) leva a um aumento das quantidades de IFN e, assim, ao estabelecimento da assinatura de IFN. Em testes clínicos, anticorpos anti-IFNα em pacientes com LES demonstraram uma redução parcial da assinatura do IFN do tipo I na maioria dos pacientes exibindo a assinatura de IFN e ligeira eficácia na análise exploratória (Petri et al., Arthritis and rheumatism 65, 1011 (Apr, 2013); Merrill J et al., Annals of the rheumatic diseases 70, 314 (2011); Kennedy et al., 10° Congresso Internacional de LES, Buenos Aires, Argentina Apresentação Oral 5, 022, (20 de abril de 2013)).

[0394] O padrão de tratamento no gerenciamento do lúpus é baseado nos padrões atuais da prática médica aceitos, documentos de orientação desenvolvidos por sociedades de reumatologia (por exemplo, American College of Rheumatology, European League Against Rheumatism) e os critérios dos médicos do tratamento. Os pacientes com lúpus continuam a ter a atividade da doença muito depois do di- agnóstico ser feito, mesmo com gerenciamento adequado, geralmente, envolvendo danos a novos sistemas de órgão ou a um sistema de órgão específico. Existem três padrões de atividade da doença no lúpus: o agudo (ou remissiva, recorrência da atividade da doença), doença cronicamente ativa e quiescência prolongada. Esses padrões da doença são caracterizados por meio de avaliações clínicas sistemáticas, testes de laboratório de rotina, medições padronizadas da atividade da doença e integração dessas avaliações com as próprias percepções do paciente do seu estado de saúde e qualidade de vida. Com a persistência ou agravamento dos sinais e sintomas do surto do paciente, o médico pode entender que uma alteração na medicação e/ou nas dosagens é necessária. Os medicamentos usados para controlar o lúpus incluem, mas não se limitam aos seguintes: (1) AINES, incluindo AINES de venda livre, por exemplo, naproxeno (Aleve) e ibuprofeno (Advil, Motrin, outros), e AINES mais fortes disponíveis por prescrição; (2) medicamentos antimaláricos, por exemplo, hidroxicloroquina (Pla- quenil); (3) corticosteroides, por exemplo, prednisona, e outros tipos de corticosteroides, e (4) imunossupressores, por exemplo, ciclofosfamida (Cytoxan), azatioprina (Imuran, Azasan), micofenolato (CellCept), le- flunomida (Arava) e metotrexato (Trexall).

[0395] Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto à sua eficácia in vitro em células relevantes da doença usando preparações de IFN relevantes da doença. Esses ensaios in vitro podem ser, por exemplo, a avaliação da inibição da produção de IFN induzida pelo complexos imunes de LES no sangue integral, ou a avaliação da capacidade dos anticorpos de reduzirem a assinatura de IFN no sangue integral, conforme descrito aqui. Modelos animais do lúpus também podem ser usados, como os camundongos NZB/NZW F1 que apresentem uma doença dependente de tempo e que afeta fêmeas, com várias características do lúpus humano, incluindo glomerulonefrite. Entre- tanto, como os camundongos não produzem IFN-w, seu uso como modelo para avaliar a eficácia dos anticorpos da invenção é mais limitado.

[0396] Em algumas modalidades, o paciente exibe uma assinatura do interferon tipo I. "Interferon tipo I" ou "assinatura de interferon", como aqui usado, refere-se à regulação positiva de um subconjunto de genes que são induzidos pelo IFN-I. Vários tipos de assinaturas de IFN tipo I são conhecidas, na faixa de 3 a 27 genes. Essas assinaturas podem ser utilizadas, por exemplo, como marcadores farmacodinâmicos para avaliar o envolvimento alvo dos inibidores do IFN tipo I para o tratamento de LES com a finalidade de estratificação do paciente com LES.

[0397] Uma assinatura de interferon tipo 1 exemplificadora é mostrada na Tabela 3, e consiste em 21 genes com regulação positiva, como descrito em Yao et al., Arthritis and rheumatism 60, 1785 (Jun, 2009). Outros exemplos de assinaturas de interferon tipo I são descritos em Tcherepanova, I., et al., Annals of the rheumatic diseases 71(Suppl3) (2012) and Richardson, B. et al. Development of A Quantitative PCR Method to Determine Interferon Signature Metric Status in SLE Patients: Distribution and Clinical & Serological Associations in Two Lúpus Clinical Trials. ACR/ARHP 2012 Annual Meeting Resumo 620 (2012).

[0398] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IFN-α/w é um anticorpo biespecífico.

[0399] Em alguns métodos, o anticorpo anti-IFN-α/w biespecífico neutraliza BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL- 17 ou CD20.

Administração/Composições farmacêuticas

[0400] A invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção aqui descrito, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para o uso terapêutico, o anticorpo anti-IFN-α/w da invenção pode ser preparado como composições farmacêuticas que contêm uma quantidade eficaz do anticorpo anti-IFN-α/w como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" refere-se a um diluen- te, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual o composto ativo é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farma- ceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração das moléculas ou anticorpos da invenção aqui descrita nesta formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos de cerca de 0,5%, usualmente até pelo menos cerca de 1%, até tanto quanto 15 ou 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem necessária, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administração selecionado. Veículos adequados e formulações adequadas, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 21a Edição, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, EUA, Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" páginas 691 a 1092, consulte especialmente as páginas 958 a 989.

[0401] O modo de administração do anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de ca- da uma das modalidades numeradas listadas abaixo, pode ser qualquer via adequada, como administração parenteral, por exemplo, in- tradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, pulmonar, transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, retal) ou outros meios entendidos pelo versado na técnica, também conhecidos na técnica.

[0402] O anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, pode ser administrado a um paciente através de qualquer via adequada, por exemplo, parentalmente por infusão intravenosa (i.v.) ou injeção de bolus, intramuscularmente ou sub- cutaneamente ou intraperitonealmente. Infusão i.v. pode ser realizada, por exemplo, 15, 30, 60, 90, 120, 180 ou 240 minutos, ou a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 horas.

[0403] A dose dada a um paciente que tem uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune, como lúpus, é suficiente para aliviar ou pelo menos interromper parcialmente a doença sendo tratada ("quantidade terapeuticamente eficaz") e pode ser algumas vezes de 0,005 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 20 mg/kg ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg ou cerca de 1 mg a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 4 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 16 mg/kg ou cerca de 24 mg/kg ou, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg, mas pode ainda ser maior, por exemplo cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg.

[0404] Uma dose de unidade fixa pode também ser administrada, por exemplo, 50, 100, 200, 500 ou 1000 mg, ou a dose pode ser com base na área superficial do paciente, por exemplo, 500, 400, 300, 250, 200 ou 100 mg/m2. Geralmente, entre 1 e 8 doses, (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) podem ser administradas para tratar a doença infla- matória mediada pelo sistema imune, mas 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais doses podem ser dadas.

[0405] A administração do anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas e listadas abaixo, pode ser repetida após um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, ou mais. Cursos de tratamento repetidos também são possíveis, assim como a administração crônica. A administração repetida pode ser na dose igual ou em uma dose diferente. Por exemplo, o anticorpo anti-IFN-/w nos métodos da invenção pode ser administrado a 0,1 mg/kg, a 1 mg/kg, a 5 mg/kg, 8 mg/kg ou a 16 mg/kg em intervalos semanais durante 8 semanas, seguido de administração a 8 mg/kg ou a 16 mg/kg a cada duas semanas durante 16 semanas adicionais, seguido de administração a 8 mg/kg ou a 16 mg/kg a cada quatro semanas, por infusão intravenosa.

[0406] Os anticorpos anti-IFN-α/w podem ser administrados nos métodos da invenção e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, por terapia de manutenção, como por exemplo, uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.

[0407] Por exemplo, os anticorpos anti-IFN-α/w nos métodos da invenção e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, podem ser fornecidos em uma dosagem diária em uma quantidade de cerca de 0,1 a 100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em ao menos dentre o dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente, ao menos uma dentre a semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 após o início do tratamento, ou qualquer combinação dos mesmos, com o uso de doses únicas ou divididas a cada 24, 12, 8, 6, 4, ou 2 horas, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0408] O anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, também pode ser administrado profilaticamente de modo a reduzir o risco de desenvolver doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune, como lúpus, retardar o início da doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou da doença au- toimune, e/ou reduzir o risco de recorrência quando a doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou a doença autoimune, como lúpus, está em remissão.

[0409] Dessa forma, uma composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular pode ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e entre cerca de 1 ng a cerca 100 mg/kg, por exemplo, de cerca de 50 ng a cerca de 30 mg/kg ou, com mais preferência, de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg/kg, de anticorpos anti-IFN- α/w da invenção.

[0410] Por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção aqui descritos, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, para infusão intravenosa pode ser composta para conter cerca de 200 ml de solução de Ringer esterilizada, e de cerca de 8 mg a cerca de 2400 mg, de cerca de 400 mg a cerca de 1600 mg, ou de cerca de 400 mg a cerca de 800 mg do anticorpo anti-INF-α/w para administração a um paciente de 80 kg. Os métodos para produzir as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, "Remington's Phar- maceutical Science", 15a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.

[0411] A "quantidade terapeuticamente eficaz" dos anticorpos para IFNα/w da presente invenção eficazes no tratamento de uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune pode ser determinada por técnicas convencionais de pesquisa. Além disso, ensaios in vitro podem ser empregados para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem. Opcionalmente, a dosagem de anticorpos para IFNα/w da invenção que pode ser eficaz no tratamento de doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune ou doenças autoimunes, como lúpus, incluindo LES, pode ser determinada por meio da administração dos anticorpos para IFNα/w a modelos animais relevantes bem conhecidos na técnica. A seleção de uma dosagem eficaz específica pode ser determinada (por exemplo, através de testes clínicos) por versados na técnica, com base na consideração de vários fatores. Tais fatores incluem a doença a ser tratada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do paciente, o estado imune do paciente e outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. A dosagem que precisa ser empregada na formulação também irá depender da via de administração e da severidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta à dosagem, derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro. Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto a sua eficácia e dosagem eficaz com o uso de qualquer um dos modelos aqui descritos.

[0412] O anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, pode ser liofilizado para armazenamento e reconstituído em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica mostrou-se eficaz com preparações de proteínas convencionais e as técnicas de reconstituição e de liofilização bem conhecidas na técnica podem ser utilizadas.

[0413] O anticorpo anti-IFN-α/w nos métodos da invenção aqui descrita, e em algumas modalidades de cada uma das modalidades numeradas listadas abaixo, pode ser administrado em combinação com um segundo agente terapêutico simultaneamente, sequencialmente ou separadamente.

[0414] O segundo agente terapêutico pode ser um corticosteroide, um medicamento antimalárico, um imunossupressor, um medicamento citotóxico ou um modulador de célula B.

[0415] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é prednisona, prednisolona, metilprednisolona, deflazacorte, hidroxiclo- roquina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, micofenolato de mo- fetila (MMF), micofenolato sódico, ciclosporina, leflunomida, tacrolimus, rituximabe™ ou belimumabe™.

Modalidades adicionais da invenção

[0416] Abaixo são numeradas certas modalidades adicionais da invenção de acordo com as divulgações em outras partes do presente documento. As características das modalidades da invenção definidas acima, referem-se também a invenção divulgada aqui a cada uma destas modalidades adicionais enumeradas. 1) Um anticorpo monoclonal isolado, que se liga a, e neutraliza a atividade de um interferon ômega humano (IFN-w) e ao menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de interferon alfa humano (IFN-α). 2) O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, sendo que a atividade do IFN-w humano e dos subtipos de IFNα humano é a expressão da fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) induzida por IFN-w humano ou subtipo do IFN-α humano sob o promotor indu- zível por interferon ISG54 em células HEK293, que expressam de maneira estável o transdutor de sinal e ativador de transcrição 2 (STAT2), fator regulador de interferon 9 (IRF9) e SEAP. 3) O anticorpo, de acordo com as modalidades 1 ou 2, sendo que o anticorpo neutraliza a atividade biológica do IFN-w humano com um IC50 de pelo menos cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10- 11 M ou menos. 4) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, sendo que o anticorpo neutraliza a atividade biológica do IFN-w humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos. 5) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, sendo que o anticorpo neutraliza a atividade do IFN-w humano com um valor de IC50 de entre cerca de 1x10-10 M e cerca de 6x10-12 M. 6) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, sendo que o anticorpo neutraliza a atividade de pelo menos três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze subtipos de IFN- α humano com um valor de IC50 de pelo menos cerca de 1x10-10 M ou menos. 7) O anticorpo, de acordo com a modalidade 6, sendo que os subtipos do IFN-α são selecionados do grupo que consiste em IFN- αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN- αK, IFN-αWA e IFN-α4a. 8) O anticorpo, de acordo com a modalidade 7, sendo que o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da região de-terminante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) das SEQ ID NOs: 109, 114 e 121, respectivamente, e as sequências de aminoácidos da região determi- nante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) das SEQ ID NOs: 118, 119 e 120. 9) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, sendo que o anticorpo neutraliza ao menos seis subtipos de IFN-α selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN-αB2, IFN- αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a. 10) O anticorpo, de acordo com a modalidade 9, sendo que o anticorpo compreende as sequências de aminoácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 159, 119 e 160, respectivamente. 11) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 5, sendo que o anticorpo neutraliza ao menos dez subtipos de IFN-α selecionados do grupo que consiste em IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA e IFN-α4a. 12) O anticorpo, de acordo com a modalidade 11, sendo que o anticorpo se liga ao IFN-w humano da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos de aminoácido F27, L30 e R33. 13) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1-5, sendo que o anticorpo compreende as sequências de ami- noácidos da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 109, 114, 121, 161, 119 e 162, respectivamente. 14) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 11-13, sendo que o anticorpo neutraliza ao menos os subtipos de IFN-α humano IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 e IFN-α4a. 15) O anticorpo, de acordo com a reivindicação 14, sendo que o anticorpo neutraliza adicionalmente IFN-αI, IFN-αK ou IFN-αWA. 16) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali- dades 1-15, sendo que o anticorpo a) inibe a liberação de IP-10 induzida por interferon no leu-cócito no sangue integral induzida por 250 U/ml de interferon em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/ml de anticorpo ou b) inibe a liberação de IP-10 induzida pelo complexo imune do lúpus eritematoso sistêmico (LES) no sangue integral em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/ml de anticorpo. 17) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1-16, sendo que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 28, e sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) com ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID NO: 150. 18) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1-17, que compreende a) a sequência de aminoácidos de HCDR1 da SEQ ID NO: 109; b) as sequências de aminoácidos de HCDR2 das SEQ ID NOs: 111, 112 ou 113; c) as sequências de aminoácidos de HCDR3 das SEQ ID NOs: 115 ou 116; d) as sequências de aminoácidos de LCDR1 das SEQ ID NOs: 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91; e) as sequências de aminoácidos de LCDR2 das SEQ ID NOs: 93, 94 ou 95; e f) as sequências de aminoácidos de LCDR3 das SEQ ID NOs: 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107. 19) O anticorpo, de acordo com a modalidade 18, que com-preende as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: a) 109, 113, 116, 77, 93 e 104, respectivamente; b) 109, 113, 116, 85, 93 e 96, respectivamente; c) 109, 113, 115, 79, 95 e 107, respectivamente; d) 109, 113, 116, 76, 93 e 103, respectivamente; e) 109, 113, 115, 85, 93 e 96, respectivamente; f) 109, 113, 115, 89, 95 e 100, respectivamente; g) 109, 113, 116, 86, 93 e 105, respectivamente; h) 109, 113, 115, 76, 93 e 103, respectivamente; i) 109, 113, 116, 80, 93 e 97, respectivamente; j) 109, 113, 116, 84, 93 e 97, respectivamente; k) 109, 113, 116, 90, 93 e 97, respectivamente; l) 109, 113, 116, 88, 93 e 102, respectivamente; m) 109, 113, 116, 87, 93 e 105, respectivamente; n) 109, 113, 116, 91, 93 e 106, respectivamente; o) 109, 113, 115, 80, 93 e 97, respectivamente; p) 109, 113, 116, 83, 93 e 101, respectivamente; q) 109, 113, 116, 82, 94 e 98, respectivamente; r) 109, 113, 115, 78, 95 e 100, respectivamente; s) 109, 111, 116, 81, 93 e 106, respectivamente; t) 109, 113, 116, 82, 94 e 99, respectivamente; u) 109, 113, 115, 81, 93 e 106, respectivamente; v) 109, 112, 116, 81, 93 e 106, respectivamente; ou w) 109, 113, 116, 81, 93 e 106, respectivamente. 20) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 19, sendo que o anticorpo é humanizado ou humano. 21) O anticorpo, de acordo com a modalidade 20, sendo que a estrutura da região variável da cadeia pesada do anticorpo humano é derivada do gene da linhagem germinativa humana IGHV5-51 (SEQ ID NO: 155). 22) O anticorpo, de acordo com a modalidade 21, sendo que a estrutura da região variável da cadeia leve do anticorpo humano é derivada do gene da linhagem germinativa humana IGKV1D-39 (SEQ ID NO: 156). 23) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 22, sendo que o anticorpo é do subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. 24) O anticorpo, de acordo com a modalidade 23, sendo que o anticorpo tem pelo menos uma substituição em uma região Fc. 25) O anticorpo, de acordo com a modalidade 24, sendo que a substituição compreende uma substituição M252Y/S254T/ T256E, V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/ A330S/P331S ou P238S/ L234A/L235A, sendo que a numeração do resíduo é de acordo com a numeração EU. 26) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 26, que compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região variável da cadeia leve (VL), sendo que a a) VH compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 28, 31, 157 ou 158. 27) O anticorpo, de acordo com a modalidade 26, sendo que a VL compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 ou 150. 28) O anticorpo, de acordo com a modalidade 27, que com-preende a VH e a VL das SEQ ID NOs: a) 28 e 40, respectivamente; b) 28 e 39, respectivamente; c) 31 e 62, respectivamente; d) 28 e 54, respectivamente; e) 31 e 39, respectivamente; f) 31 e 68, respectivamente; g) 28 e 42, respectivamente; h) 31 e 54, respectivamente; i) 28 e 53, respectivamente; j) 28 e 73, respectivamente; k) 28 e 75, respectivamente; l) 28 e 52, respectivamente; m) 28 e 35, respectivamente; n) 28 e 135, respectivamente; o) 31 e 53, respectivamente; p) 28 e 46, respectivamente; q) 28 e 61, respectivamente; r) 31 e 57, respectivamente; s) 157 e 71, respectivamente; t) 28 e 150, respectivamente; u) 31 e 71, respectivamente; v) 158 e 71, respectivamente; ou w) 28 e 71, respectivamente. 29) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 28, sendo que o anticorpo é biespecífico. 30) O anticorpo, de acordo com a modalidade 29, sendo que o anticorpo se liga a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL- 23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL ou IFN-y. 31) Uma composição farmacêutica compreendendo o anti-corpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 30, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 32) Um polinucleotídeo que codifica a VH ou VL do anticorpo ou a VH e VL do anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 28. 33) Um vetor que compreende o polinucleotídeo da modali-dade 32. 34) Uma célula hospedeira que compreende o vetor da mo-dalidade 33. 35) Um método de produção do anticorpo da modalidade 19, que compreende cultivar a célula hospedeira da modalidade 33, em condições em que o anticorpo é expresso, e recuperar o anticorpo produzido pela célula hospedeira. 36) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 30, para uso no tratamento de uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune. 37) O anticorpo, de acordo com a modalidade 36, para o uso de a) doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou doença autoimune, sendo que a doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou a doença autoimune é opcionalmente lúpus, psoríase, trombocitopenia imune (ITP), síndrome de Aicardi-Goutieres (AGS), esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, miosite, imunodeficiência comum variável (IDCV), doença autoimune da tireoide, diabetes tipo I, artrite reumatoide, rejeição a transplante ou doença do enxerto contra hospedeiro (DECH). b) infecção viral crônica, sendo que a infecção viral crônica é opcionalmente infecção por HIV ou por hepatite C. 38) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 30, para uso no tratamento do lúpus. 39) O anticorpo, de acordo com a modalidade 38 para uso em lúpus, sendo que o lúpus é lúpus eritematoso sistêmico (LES) ou lúpus eritematoso cutâneo (LEC). 40) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 30, para uso no tratamento de uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune ou uma doença autoimune, ou lúpus, sendo que o paciente a ser tratado tem a) nefrite lúpica; ou b) exibe uma assinatura de interferon do tipo I. 41) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 30, para uso de acordo com as modalidades 37-40 em combinação com um segundo agente terapêutico. 42) O anticorpo de acordo com a modalidade 41, sendo que o segundo agente terapêutico é a) um anticorpo que se liga a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL ou IFN-Y; b) um corticosteroide, um medicamento antimalárico, um imunossupressor, um fármaco citotóxico ou um modulador de células B; ou c) prednisona, prednisolona, metilprednisolona, deflazacor- te, hidroxicloroquina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, micofe- nolato de mofetila (MMF), micofenolato sódico, ciclosporina, leflunomi- da, tacrolimus, rituximabe™ ou belimumabe™. 43) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali-dades 1 a 30, sendo que o anticorpo não neutraliza IFN-αD, IFN-α1 e/ou IFN-β.

[0417] A presente invenção será agora descrita com relação aos seguintes exemplos específicos não limitadores.

Materiais e métodos Ensaio de gene-repórter ISRE ("ensaio do gene-repórter ISRE")

[0418] Células HEK-Blue™ IFNα/β (Invivogen, San Diego, CA, EUA) modificadas para expressar uma via de sinalização de IFN tipo I totalmente ativa (que expressa estavelmente STAT2 e IRF9) e trans- fectadas com um gene-repórter SEAP sob o controle do promotor ISG54 induzível por IFN-α/β foram usadas. As células foram cultivadas em frascos T150 revestidos com colágeno tipo I em meio Eagle modi ficado por Dulbecco com 10% de soro fetal bovino, 100 μg/ml de blas- ticidina e 30 μg/ml de zeocina a 37°C, 5% de CO 2. As células foram coletadas e semeadas em placas de 384 poços em 50 μl por poço a 50.000 células por ml. As células plaqueadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. As amostras de interferon testadas foram preparadas e diluídas em meio consumido isento de soro HEK ISRE e 50 μl de amostra de IFN foram adicionados a cada poço. As células plaqueadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO 2 por 20 horas. A fosfa- tase alcalina foi detectada a partir de 20 μl de sobrenadantes celulares com 60 μl/poço de QUANTI-Blue™ ressuspenso em água filtrada após incubação por 20 min à temperatura ambiente. A densidade ótica foi lida em um leitor de placas Biotek Synergy a 650 nm.

[0419] Alguns ensaios de gene repórter ISRE foram feitos em placas de 96 poços, da seguinte forma: Células HEK-Blue™ IFN-α/β (In- vivoGen, San Diego, CA, EUA) foram plaqueadas a 50.000 células por poço em 100 μl de meio isento de seleção (DMEM + Glutamax/ 10% FBS, Gibco) e deixada em incubação de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, os estímulos de IFN do tipo I foram preparados (ou seja, interferon recombinante, IFN leucocitário, preparações de IFN induzidas por IC, soro, etc) com ou sem inibidores de IFN do tipo I em uma placa de transferência de fundo em U de 96 poços (BD Falcon) e preaquecidos a 37°C por 10 minutos. A placa de célu las foi removida da incubadora e o meio foi removido e substituído por 100 μl de tratamentos apropriados preparados em placa de transferência de 96 poços com fundo em U. As células foram novamente incubadas a 37°C por 24 horas. No dia seguinte, 40 μl de sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços de fundo plano (BD Falcon) contendo 160 μl de substrato QUANTI-Blue™ SEAP (Invivogen). A placa foi deixada desenvolver por cerca de 15 minutos, tempo no qual foi lida usando um espectrômetro a uma absorvância de 650 nm.

Exemplo 1. IFN-w solúvel está presente e ativo no sangue de pacientes com LES

[0420] O plasma de duas coortes de LES independentes de Nanjing, China e o soro coletado de uma coorte caucasiana nos EUA foram analisadas quanto a IFN-w e IFN-α solúveis usando-se um ensaio ELISA multiplex, usando um kit ELISA multiplex de interferon humano VeriPlex (PBL Assay Science, n° de catálogo 51500-1 ) de acordo com as instruções do fabricante. O ELISA multiplex detecta muitos, mas não todos os subtipos de IFN-α e pode não refletir com precisão as diferenças quantitativas entre níveis de IFN-α versus IFN-w.

[0421] IFN-w, além de IFN-α, foi considerado como estando elevado em certos pacientes na coorte de Nanjing, China (Figura 1A) e na coorte caucasiana (Figura 1B) de cada coorte. A Figura 1a mostra resultados apenas daqueles pacientes que apresentaram IFN-α ou IFN-w elevados. Amostras séricas do grupo da população branca foram adicionalmente triadas quanto à atividade de IFN-I usando-se um ensaio de gene-repórter ISRE. Doadores exibindo o maior nível de proteína IFN detectável por ELISA também demonstraram o maior nível de indução do ensaio do gene-repórter ISRE (Figura 1C).

Exemplo 2. Bloqueio combinado de IFN-w e IFN-α resulta em inibição maior do IFN induzido pelo complexo imune de LES que o bloqueio de IFN-α sozinho

[0422] O efeito da inibição de IFN-α sozinho ou ambos IFN-w e IFN-α para reduzir o IFN induzido pelo complexo imune de LES, um estímulo melhor representando o meio do IFN tipo 1 presente em LES, foi avaliado. O IFN induzido pelo complexo imune de LES foi preparado por meio da estimulação de CMSPs humanas com complexos imunes preparados a partir de dois doadores de LES individuais, e esse meio condicionado foi utilizado em um ensaio de gene-repórter induzí- vel por IFN do tipo I (ensaio de gene-repórter ISRE) na presença de inibidores de IFN e controles.

Preparação do complexo imune

[0423] Plasma do doador de LES 232 e 293 (pré-triados quanto à atividade de IFN) e plasma de um controle saudável (Astarte Biologics) foram usados para purificação de IgG usando-se colunas de proteína A/G (Thermo Scientific, n° de catálogo 89958), de a cordo com as instruções do fabricante. O soro de uma preparação de doador saudável agrupada (Life Technologies, n° de catálogo 3400510 0) foi usado para purificação de IgG de controle saudável. Para criar lisados para formação de complexos imunes, células HEK293T (ATCC, n° de catálogo CRL-3216) foram concentradas a 5 X 107 células/ml em DPBS 1X (Life Technologies, n° de catálogo 14190-250). Para criar os lisados, conge- lamento-descongelamento foi realizado durante 4 ciclos de 10 minutos, o congelamento a -80°C e descongelamento a 37°C, co m exceção de um congelamento inicial de 30 min. Após o 4° congel amento-descon- gelamento, os restos celulares foram removidos por centrifugação a 400 x g durante 5 minutos. As preparações de IgG purificadas e os li- sados celulares foram então quantificados usando um ensaio de proteína BCA (Pierce, n° de catálogo 23225), de acordo com as instruções do fabricante. Para preparações de meio condicionado estimuladas por complexo imune, CMSPs de sangue heparinizado com sódio de doadores saudáveis foram isoladas com o uso de tubos de preparação celular (BD Vacutainer, n° de catálogo 362753), ressuspensas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, n° de catálogo 1 1875-085) + 10% de SFB (Life Technologies, n° de catálogo 16140-063 ) a 2x106 célu- las/ml e inoculadas em placas de 6 poços em um volume de 2 ml/poço. IgG purificada de soro LES e saudável foi pré-misturada com os lisados celulares em concentrações equivalentes de 500 μg/ml cada e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos e, então, adicionada às CMSPs a um volume de 2 ml por poço, e incubadas por 24 horas a 37°C. As placas foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 mi-nutos e o meio condicionado estimulado pelo complexo imune de CMSPs foi coletado, dividido em alíquotas e armazenado a -80°C para uso futuro.

Ensaio de atividade

[0424] Células Hek-Blue IFN α/β (Invivogen) foram plaqueadas em uma placa de fundo plano de 96 poços a 50.000 células por poço em 200 μl de DMEM (Life Technologies) + 10% soro bovino fetal (Life Technologies) e incubadas durante 5 horas a 37°C pa ra permitir que as células aderissem à placa. Após 5 horas, as células Hek-Blue foram removidas da incubadora e os sobrenadantes foram substituídos por uma diluição de 1:6 de meio condicionado com CMSPs do doador 232 ou por uma diluição de 1:81 de meio condicionado do doador 293 (usando meio de cultura de células Hek-Blue como diluente) com ou sem os seguintes tratamentos: mAb antagonista anti-IFN-α amplo (M24, IgG1 humana), a 0,4, 2, 10, 50 100 e μg/ml juntamente com concentrações fixas de 20 μg/ml de isotipo controle (R&D Systems, IgG1 de murino), 100 μg/ml de anti-IFN-α combinado com 20 μg/ml de mAb antagonista anti-IFN-w (eBioscience, clone OMG5, IgG1 de muri- no), ou 100 μg/ml de isotipo controle de IgG1 humana (Southern Biotech) combinado com 20 μg/ml de isotipo controle de IgG1 de murina. As células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, 40 μl do sobrenadante celular de cada um dos poços foram removidos e adicionados a 160 μl de substrato de fosfatase alcalina Quanti-Blue (Invivogen) em uma placa de fundo plano de 96 separada. Os sobrenadantes foram deixados reagir com o substrato durante 10 minutos e, então, a placa foi lida em um espectrofotômetro em comprimento de onda 650 nm. As densidades ópticas foram representadas no gráfico prisma GraphPad.

[0425] O bloqueio do adicional do IFN-w na presença de antago- nista de IFN-α resultou em supressão aumentada da atividade de IFN-I relevante para LES do que bloqueio da atividade de IFN-α sozinho (Figura 2). Conforme esperado, o meio condicionado de CMSPs estimulado com complexos imunes de doadores saudáveis (meio condicionado com HV IC) não apresentou atividade detectável de ISRE indicando o potencial interferogênico dos complexos imunes do paciente com LES.

Exemplo 3. Efeitos imunomodulatórios de IFN-w são similares aos do IFN-α

[0426] A capacidade do IFN-w de induzir a secreção de quimio- quina, a assinatura do gene de IFN, a ativação e maturação de células dendríticas e a maturação de células B foram avaliadas em comparação ao IFN-α. Nesses estudos, IFN-αA e IFN-α2, duas das moléculas de IFN-α mais amplamente usadas, foram usados principalmente como controles do subtipo de IFN-α representativo. Em alguns ensaios, IFN-αB2 foi usado.

Indução da secreção de quimioquina e assinatura do gene IFN

[0427] CMSPs isoladas de 6 doadores humanos saudáveis individuais foram estimuladas com IFN-αA (IFN-α2) ou IFN-w, e os sobre- nadantes e os péletes foram coletados para análise, 3, 6 e 24 horas pós-tratamento. Um painel de 25 citoquinas foi medido dos sobrena- dantes usando imunoensaio Luminex: IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, TNFα, IFN-α, IFN- Y, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, Eotaxin, RANTES, e MCP-1. Ambos IFN-w e IFN-α2 aumentaram o nível detectável de IP-10, MCP- 1, IL-1RA, IL-6, MIP-1αe MIP-1β. A Figura 3 mostra a indução de IP-10 por IFN-w e IFN-α2. A secreção de IL-8 foi reduzida em ambos os tratamentos nesses experimentos. Os níveis de IL-2R, IL-12 e RANTES não foram alterados pelo tratamento com IFN-α ou IFN-w (com a exceção de um único doador, que teve um aumento apenas na RAN- TES). Todos os outros analitos no painel de citocina não se alteraram em relação ao tratamento com IFN-α ou IFN-w ou ficaram abaixo do limite de detecção.

[0428] Os péletes coletados foram processados para RNA e avaliados usando-se uma assinatura de painel de IFN de 21 genes para avaliar possíveis similaridades e/ou diferenças na expressão induzida de IFN-w e IFN-α CMSPs humanos tratados com IFN-w exibiram respostas da expressão gênica qualitativa e cinética quase que indistinguíveis em comparação com as células tratadas com IFN-αA. 92,5% dos genes modulados por tratamento com IFN-αA versus controle não tratado também foram modulados por tratamento com IFN-w em 3 h. Nos intervalos de tempo de 6 e 24 h pós-tratamento, 97,83% e 99,25% dos genes modulados por tratamento com IFN-α também foram modulados por IFN-w, respectivamente (dados não mostrados).

[0429] Em resumo, IFN-α e IFN-w induziram a liberação de citoci- na qualitativa indistinguível e os perfis de expressão gênica entre prepa-rações de CMSPs obtidas a partir de 6 doadores humanos saudáveis, sugerindo que eles podem conferir efeitos imunomodulatórios similares.

IFN-w induz a diferenciação de células dendríticas que é inibida por anticorpos de bloqueio de IFN-w

[0430] A capacidade do IFN-w e do IFN-α de induzirem a diferenciação de monócitos em DC e a funcionalidade foram avaliadas.

[0431] Os monócitos purificados foram diferenciados em DC na presença de GM-CSF apenas ou com IFN-α ou IFN-w na presença ou ausência de 50 μg/ml de anti-IFN-α ou anti-IFN-w durante 3 dias com o uso de métodos convencionais. As células foram colhidas e analisadas para expressão de marcador de superfície por FACS de 8 cores. Ambos o IFN-α e o IFN-w induziram a expressão do marcador de superfície de DC característico CD83 e CD80, CD86, CD40, CD11c, e reduziram a expressão do marcador de monócitos CD14. A adição de anti-IFN-α ou anti- IFN-w na concentração de 50 μg/ml no início da cul- tura inibiu parcialmente a diferenciação das DC enquanto o anticorpo do isotipo não teve efeito (dados não mostrados).

[0432] A reação de linfócitos misturados (MLR) foi usada para demonstrar a funcionalidade das DCs diferenciadas. As DCS diferenciadas foram colhidas, lavadas, ressuspensas em meio fresco e cultivadas com razões células T CD4+ purificadas em razões celulares de DC:células T CD4+ de 1:10, 1:20 e 1:100. No dia 6 os sobrenadantes foram coletados e as citoquinas secretadas foram analisadas usando um ensaio de microesferas multiplex para 26 citoquinas/citoquinas. As DCs se diferenciaram na presença de células CD4+ ativadas por IFN-α ou IFN-w, conforme mostrado pela secreção de citoquinas específicas para células T IFN-Y e IL-17. As DCs diferenciadas na presença do anticorpo anti-IFN-α ou do anticorpo anti-IFN-w não induziu a ativação da célula T CD4+. A Figura 4A mostra a falta de secreção de IFN-Y induzida pelas células CD4+ ativadas por DCs diferenciadas na presença de anticorpos anti-IFN-α ou anti-IFN-w. A Figura 4b mostra a falta de secreção induzida por IL-17 de células CD4+ ativadas por DCs diferenciadas na presença de anticorpos anti-IFN-α ou anti-IFN-w. IFN- α e IFN-w também induziram a secreção de IL-4, IL-5, IL-12p40 e IL- 13 (dados não mostrados). Todas as condições de cultivo incluíam GM-CSF. Os dados são representativos de 2 estudos. As barras de erro indicam DP de triplicatas Luminex. No experimento mostrado na figura, os dados ilustrados, uma razão celular de DC para T CD4 de 1:20 foi usada.

IFN-w induz ativação de células B independente de células T

[0433] As células B desempenham um papel importante na pato- gênese do lúpus através da produção de autoanticorpos patogênicos e citoquinas, e pela apresentação de antígenos às células T. A ativação e a maturação funcional de células B podem ocorrer de uma forma dependente de célula T (TD) ou independente de célula T (TI). Em res- postas de células B TI, as células B são liberadas do controle de tole-rância dependente de T, à medida que ligantes TLR ou citoquinas de-rivadas de células dendríticas são capazes de substituir a célula T au-xiliar. Em LES, onde acredita-se que os ligantes de TLR (por exemplo, DNA de fita dupla) e as citoquinas derivadas de DC (por exemplo, IFNs do tipo 1) contribuem para a patogênese da doença, a ativação de células B TI representa um possível mecanismo relevante. Além da produção de autoanticorpos, acredita-se que células B autorreativas desempenhem um papel importante na patogenicidade apresentando autoantígenos para as células T e secretando citoquinas pró- inflamatórias. Foi relatado que IFN-α melhora a produção de IL-6 pró- inflamatória por células B humanas ativadas com anticorpos contra o receptor de célula B (BCR) e CpG (imitando o antígeno específico e sinais TLR, respectivamente) na ausência de fatores derivados de células T. Além disso, foi demonstrado que a cocultura com DCs plas- macitoides melhora a ativação de células B, como determinado por níveis de expressão de CD86 que dependiam de fatores solúveis. A capacidade do IFN-w de aumentar a expressão de CD86 e a produção de citoquina pró-inflamatória por células B humanas foi investigada com o uso de um sistema de cultura de independente de células T. Células B de sangue periférico foram cultivadas com CpG (ODN- 2006), anti-BCR e CpG e anti-BCR, e concentrações variadas de IFN- α2 (Alfa 2b) ou IFN-w conforme indicado (concentrações de IFN em U/ml). A expressão de CD86 (níveis médios de fluorescência) foi de-terminada por citometria de fluxo depois de 3 dias, e os sobrenadantes foram analisados por imunoensaio Luminex de 26-plex, incluindo IL-6. Os resultados foram expressos como valores médios de amostras em duplicatas ± DP.

[0434] A regulação positiva induzida por IFN-w- dependente de dose da expressão de CD86 mediante o estímulo de anti-BCR/CpG foi observada em ambas as amostras de doadores testadas, enquanto que a cocultura de linfócitos B sem estímulo mostrou apenas um efeito fraco. INF-w induziu a expressão de CD86 a um grau similar ao do IFN-α2B. A Figura 5A mostra a expressão de CD86 induzida por IFN- w de células B de um doador. O IFN-w também induziu de forma dependente da dose a produção de IL-6 mediante o estímulo de CpG e anti-BCR/CpG a um grau similar do IFN-α2B em ambas amostras de doadores testadas. A Figura 5B mostra a secreção de IL-6 induzida por IFN-w de células B de um doador.

IFN-w induz a secreção de BLyS

[0435] BLyS (BAFF) é um fator de sobrevivência das células B e um alvo clinicamente validado em LES humano. O tratamento com IFN-α demonstrou induzir a expressão do gene BLyS in vivo, conforme determinada por análise de microarranjo e qPCR de CMSPs isoladas de pacientes após 24 h da dosagem. A capacidade do IFN-w induzir a secreção de BLyS foi, portanto, avaliada.

[0436] CMSPs foram isoladas de dois doadores saudáveis normais diferentes. As concentrações equivalentes de IFN-w e IFN-α foram usadas para estimular as células durante 72 horas, e, então, os sobrenadantes foram coletados e os BLyS solúveis foram analisados por ELISA. Os resultados foram expressos como valores médios de amostras em duplicata ± DP.

[0437] IFN-w e IFN-α foram competentes de modo similar na indução da secreção de BLyS em CMSPs humanas in vitro. Os resultados de um doador são mostrados na Figura 6.

Exemplo 4 Geração de antígenos de IFN do Tipo I humano usados para imunização, adsorção de fago, caracterização de anticorpos e estudos de cristalografia

[0438] 20 IFN-alfa do tipo I humano recombinantes individuais mostrados na Tabela 4 foram clonados e expressos em células HEK 293 usando métodos convencionais com o uso de sequências sinali-zadoras, como as SEQ ID NOs: 21-25. As proteínas são humanas exceto onde especificado em contrário. Para otimizar o nível de expressão e solubilidade, um mutante de aminoácido único na posição 80 do IFN-w, IFN-w T80E foi gerado e expresso em células HEK 293. A variante T80E de IFNw (SEQ ID NO: 2) teve atividade comparável à proteína selvagem. IFN-αD e IFN-α1 diferem em um aminoácido na posição 114 (valina vs alanina). Alfa A e Alfa 2 diferem em um aminoácido na posição 23, um (lisina em Alfa A vs. arginina em Alfa 2). Alfa 4 tem duas formas, 4a e 4b, que diferem em dois aminoácidos na posição 51 (alanina em Alfa 4a e treonina em Alfa 4b) e 114 (glutamato em Alfa 4a vs valina em Alfa 4b). Essas variações estão localizadas fora da região de ligação do receptor e não afetam a atividade. Foi demonstrado que os anticorpos neutralizam esses pares de variantes (αD/α1, αA/α2 e α4a/α4b) igualmente bem e em alguns experimentos subsequentes apenas um antígeno de cada par foi usado. Exemplo 5. Geração de anticorpos que se ligam a IFN-α e IFN-w Fabs que se ligam a IFN-α e IFN-w foram selecionados de novo dentre bibliotecas de expressão de fago pIX, conforme descrito em Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; publicação de patente internacional n° WO2009/085462; publicação de patente US N° US2010/0021477). Resumindo, as bibliotecas foram geradas diversificando as estruturas principais humanas onde os genes VH da linhagem germinativa IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 foram recombinados com o minigene IGHJ-4 humano através da alça H3, e os genes VL kappa da linhagem germinativa humana O12 (IGKV1- 39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) e B3 (IGKV4-1*01) foram recombinados com o minigene IGKJ-1 para montar os domínios completos VH e VL. As posições nas regiões variáveis da cadeia pesada e leve ao redor das alças H1, H2, L1, L2 e L3 correspondendo às posições identificadas como frequentemente em contato com antíge- nos da proteína e peptídeo foram escolhidas para diversificação. A diversidade de sequências nas posições selecionadas foi limitada a resíduos ocorrendo em cada posição das famílias de genes da linhagem germinativa IGHV ou IGLV dos respectivos genes IGHV ou IGLV. A diversidade da alça H3 foi gerada usando alças sintéticas de tamanho pequeno a médio com o comprimento de 7 a 14 aminoácidos. A distribuição do aminoácido na H3 foi projetada para imitar a variação observada de aminoácidos em anticorpos humanos. O design da biblioteca está detalhado em Shi et al., J Mol Biol 397:385 a 396, 2010. As estruturas principais usadas para gerar as bibliotecas foram denominadas de acordo com sua origem gênica da linhagem germinativa da VH e VL humana. As três bibliotecas de cadeia pesada foram combinadas com as quatro cadeias leves da linhagem germinativa ou bibliotecas de cadeia leve da linhagem germinativa para gerar 12 combinações únicas de VH:VL para experimentos de triagem para IFN-α e IFN-w.

[0439] As bibliotecas foram selecionadas para IFN-α2 humano bio- tinilado ou IFN-αG humano biotinilado. Após três ciclos de seleção, um ensaio ELISA de fago policlonal usando IFN-α2, IFN-αG humanos e IFN-w de cinomolgos como antígenos foi realizado para detectar o enriquecimento específico de experimentos de seleção individuais. O fa- go coletado desses experimentos de seleção que demonstraram enriquecimento para aglutinantes IFN-α2, IFN-αG e IFN-w foram triados adicionalmente com um ensaio ELISA de Fab monoclonal em que proteínas expressadas de clones de Fab individuais foram usados como aglutinantes. Os clones de Fab com sinal de ligação a 20 nM de antí- geno biotinilado de três vezes mais alto que o controle negativo foram selecionados para uma triagem secundária do Fab. Os Fabs selecionados foram clonados em fundo IgG1/K e caracterizados adicionalmente com o uso de ProteOn e ensaio do gene-repórter ISRE. A partir desses ensaios, mAb IFWM371 foi selecionado para manipulação adicional e maturação da afinidade.

[0440] A Tabela 5 mostra os valores de afinidade (KD) e de IC50 para IFWM371, conforme medidos usando-se o ProteOn e o ensaio do gene-repórter ISRE para vários IFNs tipo I, assim como IFN-β. Com exceção de IFN-α1 (IFN-αD), IFWM371 se ligou a todas as proteínas IFN-alfa humanas testadas na faixa de 179 pM a 10 nM. Os anticorpos não se ligaram a IFN-α1 (IFN-αD). O anticorpo também se ligou a IFN- w humano, de chimpanzé e de macacos cinomolgos, mas não se ligou a IFN-β. IFWM371 demonstrou atividade neutralizante para todas as moléculas de IFN-α testadas, com exceção de IFN-α1 (αD), que o an-ticorpo não neutralizou. IFWM371 contém VH IFWH591 (SEQ ID NO: 28) e VL PH9L4 (linhagem germinativa O12) (SEQ ID NO: 29.ND: não realizado NN: não neutralizante

Exemplo 6. Estrutura cristalina de IFWM371 em complexo com IFN-w T80E

[0441] Para revelar o epítopo e o parátopo, a base estrutural para sua ampla especificidade de ligação aos subtipos de IFN-α e IFN-w, e para fornecer suporte para manipulação para melhorar a afinidade e especificidade, foi realizado o estudo de cristalografia de IFN-w T80E humano em complexo com o Fab de IFWM371.

[0442] O Fab de IFWM371 marcado com His (isotipo IgG1/kappa) foi clonado e expresso em células HEK293 e purificado usando croma- tografia de afinidade, troca iônica e exclusão de tamanho. O Fab foi recebido em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM. A variante de IFN-w T80E humano (doravante simplesmente IFN-w) com uma cauda 6xHis-C-terminal foi expressa em células HEK293. A proteína foi recebida em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM.

[0443] O complexo foi preparado mediante a mistura de IFN-w com FAb de IFWM371 em uma razão molar entre 1,2:1,0 (IFN-w em excesso), incubado a 4°C de um dia para outro, e pu rificado em coluna Superdex 200 equilibrada com 20 mM de HEPES pH 7,5, NaCl 0,25 mM, e então, concentrada para 9,96 mg/ml, com o uso de um corte Amicon-Ultra 10 kDa. Cristais adequados para a difração X foram obtidos a partir de 20% de PEG 3 K, 0,2 M de fosfato de amônio dibásico com MMS (Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R. & Gilliland, G. L. (2010), promovendo a cristalização de complexos anticor- po-antígeno na triagem da matriz de microsementes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 927-33.).

[0444] Para coleta de dados de raios X, um cristal do complexo IFN-w/Fab de IFWM371 foi mergulhado por alguns segundos em um licor-mãe sintético (20% PEG 3350, 0,2 M (NH4)2HPO4, pH 7,9) suplementado com glicerol 20% e congelado rapidamente na corrente de nitrogênio a 100 K. Os dados de difração de raios X foram coletados usando um gerador de raios X de microfoco Rigaku MicroMax™- 007HF equipado com elementos óticos confocais Osmic™ VariMax™, detector Saturn 944 CCD e um sistema de criocongelamento X-stream™ 2000 (Rigaku, TX, EUA). As intensidades de difração foram detectadas ao longo de uma rotação de cristal de 205° em image ns de um quarto de grau. Os dados de raios X foram processados com o programa XDS. As estatísticas dos dados de raios X são fornecidas na Tabela 6.

[0445] A estrutura do complexo IFN-w/Fab de IFM371 foi resolvida por substituição molecular (MR) com Phaser. Os modelos de pesquisa para MR foram a estrutura cristalina do Fab15 ((PDB ID 3NA9; Luo, J., Obmolova, G., Huang, A., Strake, B., Teplyakov, A., Malia, T., Mu- zammil, S., Zhao, Y., Gilliland, G. L. & Feng, Y. (2010). Coevolution of antibody stability and Vkappa CDR-L3 canonical structure. J Mol Biol 402, 708-19) e IFN-α4A. Entretanto, uma solução de MR não foi obtida para IFN-w devido a graves colisões intermoleculares. A inspeção do mapa de densidade eletrônica em fase com Fab de IFWM371 sozinho mostrou que a densidade eletrônica de mais da metade da molécula de IFN-w está faltando. Entretanto, a parte restante da molécula de IFN-w foi prontamente ajustada na densidade. As estruturas foram, então, refinadas com PHENIX e os ajustes do modelo foram realizados utilizando COOT. *Os valores do envoltório de alta resolução estão em parêntesis

[0446] A estrutura molecular global do complexo de IFN-w/Fab de IFWM371 é mostrada na Figura 7A. Havia um complexo na unidade assimétrica. O modelo molecular da molécula de IFN-w incluiu os resí-duos 23 a 39 e 119 a 153, que correspondem ao segmento helicoidal AB e hélices D e E. A numeração dos resíduos é de acordo com a sequência de aminoácidos de IFN-w mostrada na SEQ ID NO: 1. As hélices A, B e C e as alças de conexão estavam desordenados. O modelo molecular do Fab continha resíduos de 1 a 212 para a cadeia leve (SEQ ID NO: 29) e de 1 a 222 para cadeia pesada (SEQ ID NO: 28). A cauda 6xHis C-terminal, a ligação dissulfeto inter-cadeia e os resíduos da cadeia pesada de 137 a 141 estavam desordenados. Além disso, havia um número de moléculas de água na interface do anticor- po/antígeno que formou redes extensas de ligação H (Figura 7B).

[0447] As partes observadas da molécula IFN-w foram quase que idênticas às partes correspondentes de um modelo de comprimento total de um IFN-w publicado (PDB id 3se4, Cα rmsd de 0,54 Â para 40 resíduos) e muito similar à do IFN-α2 com um Cα rmsd médio de 0,42 Â (seis moléculas de IFN-α2, código pdb 1rh2) para cerca de 40 átomos Cα. O modelo para o IFN-w no IFN-w/Fab de IFWM371 contém apenas partes das hélices C e D, bem como alça (alça AB) de conexão. As outras partes estavam ausentes na densidade eletrônica. As análises de empacotamento de cristal mostraram que não houve espaço suficiente para as hélices ausentes. A análise detalhada dos dados de difração indicou que isso não foi um artefato devido a anormalidades, como pareamento ou atribuição de grupo de espaço incorreta. Portanto, é mais provável que a proteína IFN-w tenha sido clivada durante o processo de cristalização.

[0448] Fab de IFWM371 reconheceu um epítopo conformacional que é composto de resíduos da alça AB (entre S25 e D35) e os resíduos M146 e K150 da hélice E (Figura 8A). O parátopo é composto de resíduos de cinco CDRs, exceto da LCDR2. Os resíduos do parátopo formam uma série de bolsos nos quais as cadeias laterais dos resíduos F27, L30 e R33 da hélice curta AB do IFN-w se acoplam. A Figura 8B mostra os resíduos de parátopo na VL e VH de IFWM371. As interações entre anticorpo e antígeno parecem ser principalmente interações de van der Waals (vdw) e empacotamento hidrofóbico, bem como ligações de H entre o anticorpo e o antígeno. A Figura 8C mostra um mapa de interação 2D entre as interações IFN-w e IFWM371.Na figura, os resíduos do epítopo de IFN-w são destacados em cinza, os resíduos do parátopo da VL estão dentro de um quadrado, e os resíduos do parátopo de VH estão circulados. A figura demonstra que a maior parte das interações antígeno/anticorpo são formadas pelos três resíduos do epítopo F27, L30 e R33 da hélice AB do IFN-w. Dessa forma, esta região do IFN-w constitui a parte principal do epítopo. Uma outra característica desse complexo é que parece que as moléculas de água desempenham um papel significativo na mediação do reconhecimento do antígeno. Três agrupamentos de água (WCs) estivam presentes na interface. WC1 contribuiu para as interações de ligação de H entre HCDR3 e R34, F36 e E147 do IFN-w. O WC2 mediou o parea- mento de VH/VL e a ligação de H entre Fv e os principais resíduos do epítopo L30, R33 e seus vizinhos. As moléculas de água do WC3 estavam na periferia da interface, provavelmente menos importantes para as interações.

[0449] IFWM371 se liga fortemente a vários subtipos de IFN-α e IFN-w, exceto IFN-αD ou IFN-α1. IFWM371 não se liga a IFN-β. O alinhamento de sequências de IFNs é mostrado na Figura 9. Os resíduos do epítopo de IFWM371 são amplamente conservados dentre os subtipos, sugerindo que a ampla especificidade do IFNM371 é um resultado da conservação do epítopo. IFN-αD ou IFN-α1, no entanto, aos quais IFWM371 não se liga, contêm S27 em vez de F27, levando a uma perda da maior parte de contatos hidrofóbicos da cadeia lateral F27. Como F27 é acoplado em um bolso profundo formado por resíduos de HCDR2, HCDR3 e LCDR3, a perda dos contatos da cadeia lateral, provavelmente explica a baixa ou nenhuma ligação das proteínas IFN-αD e IFN-α1. Isto também sugere que F27 é um dos principais resíduos de ligação. P26 é um resíduo que é muito menos conservado. Um resíduo de His ou Leu ocupa essa posição em vários subtipos de IFN-α. Por causa das diferenças de tamanho e formato, esse resí- duo pode influenciar significativamente as interações locais entre FWM371 e IFN-α com essas mutações.

Exemplo 7. Varredura de alanina de IFWM371

[0450] A varredura de alanina dos resíduos da CDR da cadeia pesada e leve de IFWM371 foi conduzida para guiar esforços subsequentes de maturação-afinidade. Todos os resíduos nas CDRs de cadeia pesada e leve foram substituídos por alanina com exceção de alguns resíduos de baixa exposição ao solvente ou resíduos não expostos ao solvente. Quando os resíduos nativos nas CDRs eram alanina, eles foram substituídos por Tirosina e/ou Serina e/ou Ácido aspártico. Uma posição com possíveis imputabilidades de desenvolvimento (W104 em IFWH591, SEQ ID NO 28) foi substituída por Alanina, Tiro- sina, Serina e Ácido aspártico. Os mAbs mutados foram transitoriamente expressos em células HEK 293, e os sobrenadantes celulares foram testados quanto à atividade de ligação em um painel de IFNs por ELISA. Dois mutantes de VH, IFWH591 R59A (SEQ ID NO: 30) e IFWH591 N103A (SEQ ID NO: 31), apresentaram uma ligação significativamente aprimorada em comparação ao mAb parental.

Exemplo 8. Maturação- da afinidade de IFWM371 Design da biblioteca

[0451] Duas bibliotecas distintas de VL (PH9L4L2 e PH9L4L3) foram projetadas e usadas para maturação-afinidade da cadeia leve de IFWM371 PH9L4 (O12) (SEQ ID NO: 29). As posições escolhidas para diversificação da biblioteca PH9L4L2 se basearam nas posições de resíduos frequentemente encontrados em complexos de antiproteína e antipeptídeo. Os resíduos usados para diversificar cada posição foram codificados dentro da família do gene da linhagem germinativa dos genes IGKV (Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96). A complexidade da biblioteca foi limitada para não exceder 107 membros da biblioteca de forma que a diversidade pudesse ser totalmente avaliada durante a maturação por afinidade (a complexidade real da biblioteca: 3,57). A Tabela 7 mostra o esquema de diversificação do design da biblioteca para a LCDR1 posições 30, 31 e 32, LCDR2 posição 50 e LCDR3 posição 91, 92, 93, 94 e 96 da VL PH9L4 (O12) na biblioteca. A numeração do resíduo está de acordo com Kabat.

[0452] As posições do resíduo a serem diversificadas na segunda biblioteca de maturação da afinidade de cadeia leve, PH9L4L3, foram escolhidas com base em análise de estruturas entre complexos de an-ticorpo-proteína, e a diversidade em cada posição foi projetada com base na análise das estruturas de proteína do anticorpo, bem como no uso de aminoácido nos genes de linhagem germinativa para cada posição (G. Raghunathan et al, Antigen-binding site anatomy and somatic mutations in antibodies that recognize different types of antigens. J. Mol Recognit. 25:103-113 (2012). A diversidade para LCDR3, foi estendida além do repertório natural para assegurar que cada posição tenha aminoácidos de diferentes propriedades bioquímicas (isto é, po- lar/não polar, positivamente/negativamente carregados). Adicionalmente, a frequência relativa de cada amino ácido por posição foi vari- ada, o que foi possível com o uso da tecnologia de síntese Sloning. A Tabela 8 mostra a composição da biblioteca de PH9L4L3. A numeração do resíduo está de acordo com Kabat.

Adsorção e caracterização

[0453] As bibliotecas de maturação por afinidade foram geradas pela combinação de bibliotecas de cadeia leve PH9L4L2 ou PH9L4L3 com a cadeia pesada parental IFWH591 (SEQ ID NO: 28). As bibliotecas foram então usadas para selecionar anticorpos de alta afinidade. Os experimentos de seleção de maturação da afinidade resultaram em aprimoramentos tendenciosos de ligação a apenas IFN-w ou apenas a alguns subtipos IFN-α, mas não a ambos. A fim de gerar anticorpos de neutralização amplamente neutralizantes com IC50 aprimorado para a maioria dos subtipos de IFN-α e IFN-w, um subconjunto de subtipos de IFN-α que foram mais diversificados entre si (IFN-α2, IFN-α4a, IFN-αF e IFN-αG) foram alternativamente selecionados com macaco cinomol- gos ou com IFN-w humano entre cada ciclo de seleção. Um total de três ciclos de seleção foram executados para cada experimento de se- leção.

[0454] As proteínas Fab dos clones individuais foram expressas em E. coli TG-1 e os lisados celulares bacterianos foram usados em ELISAS de Fab para determinar suas afinidades com IFN-α4a, IFN-αF e IFN-w em comparação com IFWM371. Como Fab de IFWM371 se ligou fracamente a esses antígenos, o Fab de IFWF477, que tem maior afinidade pelos antígenos, foi usado como substituto para o Fab para comparação. 42 clones foram identificados que exibiram atividade de ligação várias vezes mais alta que o Fab substituto em ELISA. Algumas variantes continham uma inserção de aminoácido na LCDR1, que não era parte do design original da biblioteca, mas foi introduzida durante a síntese da biblioteca. De modo geral, a maturação por afinidade de VL resultou em um aprimoramento significativo na ligação em comparação com o Fab substituto. Os melhores clones das duas bibliotecas mostraram atividade de ligação mais de 23 vezes mais alta ao IFN-w humano que o Fab substituto de IFWF477, respectivamente.

[0455] Para uma caracterização funcional e biofísica, um total de 42 cadeias leves derivadas das bibliotecas foram pareadas com a cadeia pesada parental IFWH591 (SEQ ID NO: 28), bem como duas variantes de VH com atividade de ligação aprimorada, IFWH624 (IFWH591 R59A, SEQ ID NO: 30) e IFWH629 (IFWH591 N103A, SEQ ID NO: 31), identificadas a partir do experimento de varredura de alanina descrito no Exemplo 7. Um total de 126 mAbs convertidos (42 cadeias leves pareadas com três cadeias pesadas) foram então expressas adicionalmente caracterizadas. A Tabela 9 mostra os anticorpos parentais e maturados quanto à afinidade e suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve.

[0456] Afinidades de 126 mAbs geradas com um painel de IFN-w humano e subtipos de IFN-α humano foram medidos por ProteOn. Os mAbs foram transitoriamente transfectados em triplicata juntamente com controles em células HEK 293 em placas de 48 poços e sobrena- dantes celulares foram usadas nesse experimento. Para aumentar a capacidade de processamento do ensaio, uma concentração do antí- geno individual foi usada. A Tabela 10 mostra os valores de KD para IFWM371 parental e seleciona os anticorpos maturados para afinida-de. A maioria dos mAbs mostrou aprimoramento significativo de afinidade de ligação em todos os antígenos testados. Alguns deles mostraram um aprimoramento de mais de 100 vezes em relação ao mAb parental.

[0457] Os anticorpos selecionados do painel de 126 foram caracterizados em um ensaio de ISRE por sua habilidade de inibir uma variedade de subtipos de IFN-α e IFN-w, e suas características de solubilidade e biofísicas foram avaliadas. Os valores de IC50 do ensaio de IS- RE são mostrados na Tabela 11 e na Tabela 12 para os anticorpos selecionados. Os valores de IC50 foram de dois dígitos de pM ou me- nos em vários anticorpos para 11 subtipos recombinantes de IFN-α e para IFN-w. Isso representa um aprimoramento de mais de cem vezes em relação ao mAb parental, IFWM371, cujo IC50 contra seus antíge- nos ficou na faixa de um dígito para dois dígitos de nM. Como o anticorpo parental, os anticorpos maturados para afinidade não neutralizam IFN-αD ou IFN-β. O anticorpo maturado para afinidade mais potente mAb IFWM3423 apresentou um IC50 picomolar de quase um dígito em todos os subtipos de interferon aos quais se ligou.

Exemplo 9. Modificação de anticorpos para minimizar o risco de modi-ficação pós-traducional

[0458] Com base na atividade neutralizante, solubilidade e propriedades biofísicas, quatro mAbs derivados de maturação por afinidade IFWM371, IFWM3331 (IFWB3066), IFWM3399 (IFWB3134), IFWM3421 (IFWB3156) e IFWM3423 (IFWB3158) foram analisados adicionalmente. As cadeias pesadas desses mAbs consistem em IFWH591 (SEQ ID NO: 28) ou IFWH629 (SEQ ID NO: 31), e as cadeias leves consistem em IFWL984 (SEQ ID NO: 71) ou IFWL1048 (SEQ ID NO: 53) ou IFWL1073 (SEQ ID NO: 61).

[0459] Ambas as cadeias de VH contêm vários possíveis motivos de modificação pós-traducional (PTM) nas suas CDRs, incluindo um motivo de sequência de hidrólise catalisada por ácido (D52-P53), um motivo de isomerização (D55-S56) na HCDR2 e possíveis sítios de oxidação em HCDR1 (W33) e CDR-H3 (W104).

[0460] A VL de IFWL984 (SEQ ID NO: 71) e IFWL1048 (SEQ ID NO: 53) contêm um motivo de isomerização (D30-G31) na LCDR1, enquanto a VL de IFW1073 (SEQ ID NO: 61) contém possíveis sítios de oxidação em LCDR3 (W92 e W94) e um possível sítio de desami- nação na LCDR1 (N31-S32).

[0461] Para reduzir os riscos de PTM nas CDRs da cadeia pesada, D52 na HCDR2 foi retromutado para o resíduo da linhagem germi- nativa tirosina (D52Y). P53 foi mutado para alanina. W104 na HCDR3 (VH_W104) foi substituído por alanina, tirosina, serina ou ácido aspár- tico. As cadeias pesadas mutadas foram co-expressas com três cadeias leves diferentes e testadas no ensaio de ISRE. Desses experimentos, os anticorpos de cadeia pesada IFWH615 (SEQ ID NO: 157) e IFWH617 (SEQ ID NO: 158) foram adicionalmente caracterizados.

[0462] Para reduzir os riscos de PTM na VL IFWL984 (SEQ ID NO: 71) e IFWL1048 (SEQ ID NO: 53), uma série de mutações para remover possíveis motivos de PTM foram projetados com orientação das informa-ções estruturais obtidas da estrutura complexa IFWM371/IFN-W descrita no Exemplo 6. Além disso, para melhorar a solubilidade de IFWM3421 (IFWB3156) e IFWM3423 (IFWB3158) contento a cadeia leve comum IFWL984, uma série de mutações nos vários resíduos hidrofóbicos nas suas CDRs foram feitas para reduzir a hidrofobicidade total da superfície das cadeias leves do anticorpo. As variantes de IFWL984 foram expres-sas em células HEK293 com a cadeia pesada parental IFWH591 e o anticorpo expresso em sobrenadantes celulares foi triado no ensaio de gene-repórter para inibição de IFN-w de IFN de leucócitos usando os métodos descritos no Exemplo 11. Os anticorpos resultantes IFWB3196 (D30E F32Y), IFWB3201 (D30S, G31S) e IFWB3202 (D30S, G31S, F32Y) retiveram boa atividade neutralizante. A Tabela 13 mostra as sequências da VL dos anticorpos gerados com a região variável de cadeia pesada do IFWH591 parental (SEQ ID NO: 28) e uma variante da cadeia leve IFWL984. O IFWM3421 parental tem a VH do IFWH591 e o IFWM3423 parental tem a VH de IFWH629. A Tabela 14 mostra os valores IC50 para a neutralização do IFN-w e IFN de leucócitos dos anticorpos gerados selecionados.

[0463] De modo similar, as 26 variantes de IFWL1048 foram construídas para reduzir os riscos de PTM. As cadeias leves geradas foram coexpressas com uma cadeia pesada IFWH591 em células HEK293E e o sobrenadante contendo o anticorpo foi testado com ensaio de IS- RE. A Tabela 15 mostra as sequências da VH e VL dos anticorpos gerados, e a Tabela 16 mostra os valores de IC50 dos anticorpos para IFN-w e IFN de leucócitos. Os anticorpos resultantes com cadeias variantes IFWL1048 onde a o motivo DG (D30-G31) na LCDR1 foi eliminado, incluindo IFWB3210 (D30S), IFWB3211 (D30E) e IFWB3223 (D30S, G31S), mostraram atividade de neutralização similar a do mAbs parental, IFWB3056 (VL: IFWL1048, VH: IFWH591) e IFWB3134 (VL: IFWL1048; VH: IFWH629). Entretanto, os anticorpos resultantes com cadeias IFWL1048 variantes com o motivo DG eliminado e substituições feitas para reduzir a hidrofobicidade, incluindo IFWB3219 (D30E, A32Y), IFWB3227 (D30S, G31S, F94L) e IFWB3230 (D30S, G31S, A32Y, F94L) demonstraram uma menor atividade que os mAbs parentais.

[0464] Possíveis motivos PTM na VL IFWL1073 de IFWB3066 incluíram possíveis sítios de oxidação em LCDR3 (W92 e W94). A LCDR3 de IFWL1073 (QQGWDWPLT; SEQ ID NO: 98) foi substituída por uma sequência de consenso da LCDR3 identificada presente na LCDR3 de anticorpos maturados para afinidade (QQSYDFPLT; SEQ ID NO: 154). Além disso, vários mutantes foram projetados para abordar um possível sítio de desamidação (N31-S32) na LCDR1. 14 variantes gerados de IFWL1073 foram pareados com IFWH591 e expressos em transfecção transitória em HEK293E em 48 poços. Os sobre- nadantes celulares foram testados diretamente no ensaio de ISRE quanto as suas atividades de neutralização contra o IFN-w humano recombinante e IFNs expressos em leucócitos induzidos por vírus. Os mAbs com mutações W93Y e/ou W95F mostraram alguns aprimoramentos na atividade de neutralização. Os mutantes para remover o motivo NS por substituição ou encurtamento da CDR-L1 mostraram redução ou perda de atividade de neutralização. A Tabela 17 mostra as sequências da VH e VL dos anticorpos gerados, e a Tabela 18 mostra os valores de IC50 para IFN-w e IFN de leucócitos.

[0465] Variantes da VL selecionados derivados dos esforços de modificação para minimizar o risco de PTM foram pareados com IFWH591 ou IFWH629 e tiveram a escala aumentada para expressão e purificação. A Tabela 19 mostra o pareamento da VL/VH dos anticorpos. A Tabela 20 mostra os valores de IC50 dos anticorpos resultantes selecionados para vários subtipos de IFN-α e IFN-w recombinantes.

Exemplo 10. Ampla capacidade de neutralização dos anticorpos anti- IFN-α/^

[0466] Vários dos anticorpos gerados neutralizaram IFN-w e múltiplos subtipos de IFN-α com um IC50 de 100 pM ou menos, medidos usando-se um ensaio de ISRE descrito acima. As sequências da região variável desses anticorpos são mostradas na Tabela 21. A Tabela 22 mostra as sequências da LCDR1, a Tabela 23, a LCDR2, a Tabela 24, a LCDR3, a Tabela 25, a HCDR1, a Tabela 26, a HCDR2 e a Tabela 27, a HCDR3 dos anticorpos. A Figura 10 mostra os valores de IC50 para cada IFN do Tipo 1 no ensaio de ISRE.

Exemplo 11. Anticorpos anti-IFN-α/^ neutralizam IFN de leucócitos

[0467] A capacidade dos anticorpos neutralizarem o IFN de leucócitos foi avaliada pela capacidade dos anticorpos inibirem a liberação de IP-10 induzida por IFN de sangue integral.

[0468] Os anticorpos selecionados da campanha de maturação da afinidade ou após a minimização do risco de PTM foram caracterizados adicionalmente quanto sua capacidade de inibir IFN do tipo 1 endógeno. Todos os anticorpos caracterizados foram do tipo IgG1/K. Os anticorpos IFWM3522, IFWM3525, IFWM3399 e IFWM3423 foram usados nos testes.

Ensaio de liberação de IP-10:

[0469] 240 μl de sangue integral (Biological Specialty Corporation) foram adicionados a poços individuais de placas fundo em U de 96 po- ços contendo 30 μl de anticorpo (anti IFN-α/w ou isotipo controle), com ou sem ou IFN ou meio condicionado contendo IFN diluído em meio de cultura celular (RPMI1640 com 10% HI FBS e 1% penicilina/estrepto- micina). Para estimulação, o IFN de leucócito humano (Sigma-Aldrich) foi utilizado a 250 U/ml (volume final) e o meio condicionado tratado com o complexo imune de LES a 10 microlitros por poço. IFN e as misturas de anticorpos foram pré-incubadas à temperatura ambiente durante 20-30 min antes da adição de sangue integral. As placas foram incubadas durante 20-22 minutos a 37°C. No dia segu inte, as placas foram centrifugadas a 400xg durante 5 minutos à temperatura ambiente e o plasma foi removido e congelado a -20°C. As amostras em duplicata de cada tratamento foram analisadas usando um kit ELISA CXCL10/IP-10 obtido junto à Qiagen. Após o descongelamento, o plasma coletado foi diluído 2,5 vezes usando um tampão de diluição de amostra e usado no ensaio. O protocolo do fabricante foi seguido com ligeiras modificações na diluição de padrões da seguinte forma. Duas diluições seriais duplas do antígeno padrão foram preparadas em uma concentração de partida de 4000 pg/ml e concentração final de 31,25 pg/ml. As placas foram lidas a uma absorbância de 450 nm dentro de 30 minutos após a interrupção da reação. A análise foi realizada usando Doftmax Pro.

Resultados

[0470] Os anticorpos selecionados foram caracterizados por sua capacidade de neutralizar preparações de IFN-I endógeno em tipos de células relevantes. A estimulação de IFN-I do sangue integral induz a liberação de IP-10 (CXCL10) in vitro e in vivo (Arico, E. et al. Concomitant detection of IFNalpha signature and activated monocyte/dendritic cell precursors in the peripheral blood of IFNalpha-treated subjects at early times after repeated local cytokine treatments. J Transl Med 9, 67, doi:10.1186/1479-5876-9-67 (2011).; Mohty, A. M. et al. Induction of IP-10/CXCL10 secretion as an immunomodulatory effect of low-dose adjuvant interferon-alpha during treatment of melanoma. Immunobiology 215, 113-123, doi:10.1016/j.imbio.2009.03.008 (2010)). IP-10 é elevada em LES, e, em vários estudos observou-se que está correlacionada à atividade da doença e manifestações clínicas da doença (Bauer, J. W. et al. Interferon-regulated chemokines as biomarkers of systemic lúpus erythematosus disease activity: a validation study. Arthritis and rheumatism 60, 3098-3107, doi:10.1002/art.24803 (2009).; Kong, K. O. et al. Enhanced expression of interferon-inducible protein- 10 correlates with disease activity and clinical manifestations in systemic lúpus erythematosus. Clinical and experimental immunology 156, 134-140, doi:10.1111/j.1365-2249.2009.03880.x (2009).; Rose, T. et al. IFNalpha and its response proteins, IP-10 and SIGLEC-1, are biomarkers of disease activity in systemic lúpus erythematosus. Annals of the rheumatic diseases 72, 1639-1645, doi:10.1136/annrheumdis- 2012-201586 (2013).

[0471] A capacidade de mAbs anti IFN-α/w inibir a liberação de IP- 10 no sangue integral induzida por IFN de leucócitos foi examinada in vitro. O IFN-I é rapidamente produzido em resposta a agentes infecciosos, como vírus, para ajudar a controlar a infecção. O IFN de leucócito humano é uma mistura natural de IFNs produzidos por leucócitos após infecção viral e é composta, em grande parte, dos subtipos de IFN-α e IFN-w. Acredita-se que IFN-w constitui aproximadamente 15% da atividade total do IFN-I nessas preparações. É importante observar que acredita-se que as infecções potencialmente contribuem para indução e a exacerbação do LES. Neste estudo, o IFN de leucócitos humanos foi adicionado a amostras de sangue integral de 2 doadores humanos saudáveis na presença de inibidores ou controles e o plasma foi avaliado quanto à liberação de IP-10 24 h após a exposição a IFN. mAbs anti IFN-α/w: IFWM3522 e IFWM3525 (Figura 11A), e IFWM3399 (Fi- gura 11B) neutralizaram de modo dose-dependente a liberação de IP- 10 induzida por IFN de leucócitos em ambos os doadores testados.

Exemplo 12. Anticorpos anti-IFN-α/w neutralizam os complexos imunes LES

[0472] Uma característica do LES é a presença de autoanticorpos, como anticorpo anti-DNA de fita dupla (anti-dsDNA) que tipicamente precede o desenvolvimento de doença clinicamente definida. Acredita- se que os autoanticorpos ligados aos ligantes de ácido nucleico são indutores endógenos do IFN do tipo I em pacientes com LES. A preponderância de autoanticorpos em conjunto com uma depuração deficiente dos autoantígenos leva a um ciclo de realimentação da produção de IFN onde a internalização dependente do receptor de Fc dos complexos imunes em células dendríticas plasmocitoides (pDC) leva a um aumento das quantidades de IFN circulantes e, então, ao estabelecimento da assinatura do gene IFN.

[0473] Foi testada adicionalmente a capacidade dos anticorpos anti IFN-α/w de neutralizar mais preparações de IFN endógeno relevantes da doença.

[0474] Os complexos imunes foram preparados essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Esses complexos imunes derivados de pacientes com LES foram então adicionados a CMSPs de doadores saudáveis e meio condicionado contendo IFN coletado de culturas celulares (IC92 e IC163). Em seguida, o meio condicionado foi adicionado ao sangue integral de doadores saudáveis de 4 doadores saudáveis na presença de inibidores ou do controle para determinar o impacto da neutralização do IFN-α/w sobre a liberação de IP-10 induzida por IFN. IFWM3522, IFWM3525 e IFWM3399, todos neutralizaram a liberação de IP-10 dose-dependente usando ambas as preparações de IFN induzidas pelo complexo imune em todas as amostras de sangue integral de doadores testadas. A Figura 12A mostra a neutralização da liberação de IP-10 estimulada por IFN induzida pelo complexo imune de LES em sangue integral humano pelos anticorpos IFWM3522 e IFWM2525 de um doador (doador 92 de LES). A Figura 12B mostra os resultados do anticorpo IFWM3399 e do isotipo controle.

Exemplo 13. Anticorpos anti-IFN-α/w neutralizam o plasma de LES

[0475] mAbs anti IFN-α/w demonstraram neutralização dose- dependente das preparações de IFN-I endógeno produzidas a partir de células primárias humanas após exposição a ambos ligantes estéreis (complexo imune; Exemplo 12) e ligantes microbianos (IFN de leucócitos; Exemplo 11). A potência do mAbs de IFN-α/w de neutralizar IFN tipo I foi adicionalmente avaliada pela capacidade dos anticorpos para neutralizar a atividade de IFN-I de soros e plasma de pacientes com LES. Essa abordagem, assim, avalia a capacidade dos anticorpos de neutralizarem o meio de circulação de IFN-I real do paciente, que pode conter um espectro de IFN que pode ser difícil de recapitular in vitro.

Ensaio ISRE usando soro LES:

[0476] Células HEK Blue (α/β) (InvivoGen) foram plaqueadas a 50.000 células por poço em um volume total de 200 μl DMEM + 10% FBS e incubadas durante a noite a 37°C. No dia segu inte, o plasma (3 doadores) ou soro (13 doadores) pré-selecionado agrupado com base na obtenção de uma OD maior que ou igual a 1,0 após 30 minutos de incubação nesse ensaio foi descongelado e misturado, a uma razão de 1:1 com DMEM (v/v) + 10% FBS. Os sobrenadantes foram removidos das células Hek-Blue previamente plaqueadas e substituídos por 100 μl de plasma de LES ou mistura de soro/meio e deixada incubar de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, 40 μl do meio condicionado foram removidos e adicionados a 160 μl de substrato Quanti-Blue (In- vivoGen) em uma nova placa e deixados incubar durante 30 minutos. As placas foram lidas usando-se um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 650 nanômetros, e os valores de IC50 foram calcu- lados usando-se GraphPad Prism.

Resultados

[0477] O soro LES de uma coorte de pacientes chineses (coorte LES 1) e o plasma LES de uma coorte principalmente de afro-americanos (coorte LES 2) foram pré-selecionadas quanto a IFN-I usando o ensaio ISRE. As amostras de soro ou plasma do doador de LES tendo uma OD de ~1,0 ou mais foram determinadas como tendo uma janela suficiente de atividade de IFN-I de modo que a inibição com anticorpos antagonistas pode ser facilmente medida. Essas amostras de doador foram então agrupadas para criar um estoque de soro ou plasma para gerar volume de amostra suficiente para permitir a repetição dos experimentos e as titulações de anticorpo. As amostras de pacientes com LES de diversos coortes raciais/grupos étnicos foram utilizadas para capturar melhor a possível diversidade em respostas qualitativa e quantitativa a IFN-I em pacientes com LES. Os doadores afro- americanos e asiáticos são considerados como tendo maior atividade de IFN-I que os doadores caucasianos. Os mAbs anti-IFN-FN-α/w testados neutralizaram de maneira dose-dependente a atividade de IFN-I em amostras agrupadas de soro e plasma de pacientes com LES. Os valores de IC50 de dois experimentos independentes são mostradas usando-se amostras agrupadas de duas coortes LES na Tabela 28.

Exemplo 14. Anticorpos anti-IFN-α/^ neutralizam a assinatura de gene de IFN

[0478] O IFN tipo I induz um espectro de genes que também são superexpressos em alguns pacientes com LES quando comparados a controles saudáveis. As amostras de plasma de pacientes com LES que exibem essa assinatura de gene de IFN são capazes de induzir a superexpressão de um conjunto similar de genes quando adicionadas a CMSPs ou linhagens celulares de doadores saudáveis, e essa atividade é predominantemente neutralizada por anticorpos que alvejam IFN-α (Hua et al., Arthritis and rheumatism 54, 1906-1916, doi: 10.1002/art.21890 (2006)).

[0479] Um teste foi desenvolvido para determinar o efeito dos anticorpos sobre a normalização da assinatura de IFN-I presente no sangue integral heparinizado de pacientes com LES. A expressão do gene induzível por IFN-I MX1 (resistência a mixovírus 1) foi usada como um marcador para atividade de IFN-I.

Materiais

[0480] 2-4 h após a coleta de sangue com LES ou saudável em tubos com heparina sódica, 240 μl foram plaqueados em placas de fundo em U de 96 poços contendo anticorpos anti- IFN-α/w ou o isoti- po controle IgG1. Os anticorpos diluídos em PBS foram adicionados a 30 μl por poço a 240 μl de sangue. Após 24 h de incubação a 37°C, 745 μl de reagente de estabilização PAXgene (QIAGEN) foram adicionados a uma placa de 96 poços profundos e as amostras de sangue foram transferidos e misturados completamente por pipetagem. As placas foram vedadas e congeladas a -80°C até proce ssamento adicional. Após o descongelamento, as amostras foram transferidas para tubos Safe-Lock de 2 ml (Eppendorf) e centrifugadas a 5000xg durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram aspirados e os péletes da amostra foram ressuspensos em 432 μl de água livre de RNase/DNase por vortexação. As amostras foram adicionalmente centrifugadas a 5000xg e os péletes ressuspensos em 350 μl de tampão BR1. 300 μl de tampão BR2 foram, então, adicionados seguidos de 40 μl de proteinase K, e as amostras foram incubadas a 55°C e agitadas a 8 00 rpm durante 10 minutos. O protocolo do fabricante foi seguido pelo restante de purificação (QIAGEN, n° de catálogo 762164). 120 ng de RNA total de cada amostra foram convertidos em cDNA utilizando-se o kit de síntese de cDNA iScript (BIO-RAD) e os pares iniciador/sonda do MX1 humano e beta actina (ACTB) (n° de catálogo Hs00895608 m1 e Hs01060665 g1, respectivamente) foram usados para o qPCR. Os dados foram coletados em um sistema de PCR em tempo real Viia7 e analisados em GraphPad Prism representando a alteração na expressão de MX1 em relação a ACTB (dCT).

Resultados

[0481] A capacidade dos anticorpos IFN-α/w de diminuírem a assinatura do IFN-I no sangue do paciente foi avaliada com o uso da expressão do gene MX1 como um marcador da atividade de IFN-I.

[0482] A expressão gênica de MX1 foi aumentada em aproximadamente 7 vezes no sangue de um paciente com LES quando comparada a um controle saudável. Os anticorpos anti-IFN-α/w testados reduziram de forma dose-dependente a expressão de MX1 no sangue de pacientes com LES após 24 horas de incubação, e na concentração mais alta de anticorpos da expressão de MX1 foi normalizada próxima aos níveis observados no controle saudável. A Figura 13 mostra o efeito do tratamento com anticorpo sobre a expressão de MX1 em um doador com LES normalizado para a expressão de beta actina e é representativo de vários doadores que têm expressão de linha de base elevada de MX1 quando comparada a controles saudáveis.

Exemplo 15. Os anticorpos anti-IFN-α/w neutralizam IFNs Tipo I de macacos cinomolgos

[0483] A capacidade de anticorpos anti-IFN-α/w neutralizar vários IFNs Tipos I de macacos cinomolgos foi avaliada usando o ensaio de gene-repórter de ISRE.

[0484] IFN-α2 de cinomolgos (PBL Assay Sciences), IFN-α4 (Sino Biological), IFN-α8 (Sino Biological) e IFN-α13 (Sino Biological) foram usados nos testes. Os valores de IC50 foram determinados usando os valores de EC75 previamente determinados para cada IFN. (0,078 ng/ml para IFN-α2, 2,68 ng/ml para IFN-α4, 0,66 ng/ml para IFN-α8 e 18,4 para IFN-α13). O IC50 dos mAbs anti-IFN-a/w selecionados é mostrado na Tabela 29). Os dados da Tabela 20 representam uma média de dois experimentos independentes. Os mAbs de IFN-α/w IFWM3525 e IFWM3522 IFN exibiram propriedades similares de neutralização cruzada entre os antígenos humanos e ortólogos de cinomo- lgos disponíveis para teste. A falta de neutralização do IFN-α13 de ci- nomolgos era esperada, uma vez que essa molécula, como o IFN-αD humano, tem uma serina na posição 27 (S27).

Exemplo 16. Estrutura cristalina de IFWM3421 em complexo com IFN- w T80E

[0485] A cristalização, a coleta de dados de raios X e a determina-ção da estrutura foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 6, exceto pelas seguintes variações:

[0486] O complexo foi preparado mediante a mistura de IFN-w:Fab a uma razão de 1,05:1,00 (excesso de IFN-w), incubado a 4°C de um dia para o outro, e foi, então, concentrado a 8,37 mg/ml sem purificação em 20 mM de Tris, pH 7,4, 50 mM de NaCl. Os cristais para a coleta de dados de raios X foram obtidos de HEPES pH 7,5, 0,2 M de Li2SO4, 18% PEG 3350 com semeadura em MMS.

[0487] Para a coleta de dados de raios X do complexo IFNw/ Fab3186, um cristal foi mergulhado em licor-mãe sintético (HEPES 0,1 M, pH 7,5, PEG 3350 20%, LiCl 0,2 M com 20% de glicerol) e foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido. Os dados de raios X foram coletados em APS (Argonne National Lab). ELN ATeplyak-2013-0014. Os dados de difração foram processados com XDS. As estatísticas de refinamento da estrutura são dadas na Tabela 30. *Os valores do envoltório de alta resolução estão em parêntesis

[0488] A estrutura cristalina de IFNw/Fab3421 foi determinada em 1,9 Â (Tabela 30). O modelo IFN-w continha os resíduos de 23-39 e 118-153. A maior parte da molécula de IFN-w não apresentou nenhuma densidade de elétrons, e não havia espaço para eles no cristal, sugerindo que a clivagem de IFN-w também ocorreu.

[0489] A estrutura geral do complexo IFN-w/Fab3421 foi muito similar à do IFNw/FabM371. As estruturas da cadeia principal dos componentes individuais (VH, VL e IFNw) são quase idênticas (Cα rmsd 0,17, 0,23 e 0,36 Â, respectivamente).

[0490] Existem, entretanto, várias diferenças estruturais significativas. Primeiro, quando as duas estruturas foram sobrepostas na VL, a VH foi girada em 4 graus e o antígeno foi girado em 11 graus, levando a um grande desvio da molécula de IFN-w em relação à VL. Segundo, a ligação de H e as estruturas de água (WC2 em particular) foram diferentes entre as duas estruturas (Figuras 14A e 14B). R33 de IFN-w faz 6 ligações de H incluindo uma ponte de sal com D107 de HCDR3 no complexo parental M371 (Figura 14A). Na forma madura, a densidade eletrônica da cadeia lateral para ambos R33 do IFN-w e D107 da VH é menos bem definida (não mostrada), e eles parecem estar separados, reduzindo, assim, o número e força das interações entre as cargas (Figura 14B). Uma molécula de água que envolve H99 da VH em M371 está agora ausente (Figuras 14A, 14B). Terceiro, F108 da HCDR3 não está envolvido na ligação de antígenos, mas faz parte da interface VL/VH. Ele adota duas conformações alternativas na estrutura parental (Figura 14C). A rotação relativa dos domínios VL/VH juntamente com a mutação L96I na VL a reduziu a um único rotâmero. Assim, parece que parte das mutações da maturação levam a um melhor pareamento da Fv. Quarto, duas posições foram mutadas para F (A50F e Y32F) durante a maturação. Y32 forma duas ligações de H com a cadeia principal de IFN-w. Mas elas também foram perdidas como um resultado de uma mutação em F (Figura 14D). A mutação A50F não gera qualquer contato novo com o antígeno. Em vez disso, seu anel de fenila se empilha com a W104 de VH, que, por sua vez, se empilha com o antígeno (Figura 14D). Na LCDR3, duas mutações hi- drofóbicas adicionais (T94L e L96I) parecem formar um melhor bolso hidrofóbico no L30 e F27 do antígeno. Duas mutações adicionais de carga negativa (S39D e S93D) não formam quaisquer interações, exceto com solvente. Em geral, a aprimoração na afinidade é o resultado do processo de maturação que reduz as interações polares, mas favo- rece/ reforça o empacotamento hidrofóbico com o antígeno, e também melhora o pareamento VL/VH.

[0491] Resíduos do epítopo e parátopo. A Figura 15 mostra a interação bidimensional do mAb entre IFN-w e IFWM3421. Os resíduos do epítopo são idênticos àqueles na estrutura M371. Os resíduos do pará- topo também são quase idênticos (Figura 15). Entretanto, conforme descrito acima, o processo de maturação resultou em uma série de diferenças estruturais e de interação, que provavelmente explicam a melhoria na afinidade de ligação.

Exemplo 17. Estrutura cristalina de IFWM3525 1 em complexo com IFN-w T80E

[0492] A cristalização, a coleta de dados de raios X e a determinação da estrutura foram realizadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 6.

[0493] O complexo foi preparado mediante a mistura de IFN-w com Fab de IFWM3525 em uma razão molar de 1,05:1,0 (excesso de IFN-w, 1,92: 1,12 mg), incubado a 4°C de um dia para out ro e purificado em coluna Superdex 200 equilibrada com 20 mm de Hepes pH 7,5, NaCl 0,25 M, glicerol 10% e, então, concentrada a 9,79 mg/ml. Os cristais adequados para a difração de raios X foram obtidos de 18% de PEG 3K, 0,2 M de citrato de sódio por semeadura em MMS com sementes dos cristaisde IFN-w/Fab3186.

[0494] Para coleta de dados de raios X, um cristal do complexo IFNw/IFWM3525 foi mergulhado durante alguns segundos em um licor-mãe sintético (20% PEG 3350, 0,2 M de citrato de sódio, 25% de glicerol), e congelado rapidamente em nitrogênio líquido. Os dados de raios X foram coletados em APS (Argonne National Lab). Os dados de difração foram processados com XDS10.

[0495] A estrutura do complexo IFN-w/ IFWM3525 foi resolvida por substituição molecular (MR) com Phaser. Os modelos de pesquisa para MR foram a estrutura cristalina do IFN-w /FabM371. As estruturas foram, então, refinadas com PHENIX e os ajustes do modelo foram realizados utilizando COOT. Todos os outros cálculos cristalográficos foram realizados com a suíte de programas CCP4. Todos os gráficos moleculares foram gerados com Pymol. As estatísticas de refinamento da estrutura são dadas na Tabela 31.*Os valores do envoltório de alta resolução estão em parêntesis

[0496] A estrutura geral do complexo IFN-W/IFWM35258 foi muito similar à do IFN-w/FabM371. Os modelos moleculares das moléculas de IFN-w incluíram os resíduos 23 a 39 e 119 a 153, que correspondem ao segmento helicoidal AB e às hélices D e E. As hélices A, B e C e as alças de conexão estão desordenadas. Essas partes que faltam do IFN-w são provavelmente devido à proteólise limitada, como observada nas estruturas do complexo M371 e M3421. O modelo molecular de Fab contém os resíduos 1 a 213 para a cadeia leve e de 1 a 222 para a cadeia pesada. A cauda 6xHis C-terminal, a ligação dissulfeto inter-cadeia e os resíduos da cadeia pesada de 137 a 141 estão desordenados. Nenhuma molécula de água no solvente foi incluída devido à baixa resolução de difração.

[0497] A Figura 16 mostra um mapa de interação bidimensional entre IFN-w e Fab de IFWM3525. Os resíduos do epítopo F27, L30 e R33 da hélice AB são responsáveis pela maioria das interações Ab/Ag. Dessa forma, essa região do IFN-w parece constituir a parte principal do epítopo. Em comparação com o M371 parental, o epítopo contém dois outros resíduos da hélice E do IFN-w que formam interações com a HCDR3 de IFWM3525.

[0498] IFWM3525 tem uma ampla especificidade de ligação para IFN-w e a maioria dos subtipos de IFN-α. Ele não se liga ao IFN-β e ao IFNα-D/1. O alinhamento de sequência dos IFNs (Figura 9) indica que os resíduos do epítopo IFWM3525 são amplamente conservados entre os subtipos IFN-w e IFN-α. Além disso, a comparação dos resíduos do epítopo no IFN-α (PDB código 2RH2, que foi recriado e refinado usando-se os dados depositados já que apenas o traço Cα estava disponível em PDB) e IFN-w indica que resíduos do epítopo têm uma estrutura da cadeia principal muito similar às estruturas da cadeia lateral. Portanto, as conservações da sequência e da estrutura (ou a conservação do epítopo) são provavelmente responsáveis pela ampla ligação de IFNα/w por IFWM3525.

Claims (19)

1. Anticorpo isolado que se liga e neutraliza uma atividade biológica de uma proteína interferon ômega humano (IFN-w) e uma proteína interferon alfa humano (IFN-α), caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade da cadeia pesada (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) e 3 (HCDR3) das SEQ ID NOs: 109, 113 e 116, respectivamente, e as sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade da cadeia leve (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) e 3 (LCDR3) das SEQ ID NOs: 82, 94 e 99, respectivamente.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a atividade biológica do IFN-w humano e do IFN-α humano é a expressão induzida pelo IFN-w humano ou pelos subtipos de IFN-α humano da fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) sob o promotor induzível por interferon ISG54 em células HEK293, que expressam de maneira estável o transdutor de sinal e o ativador da transcrição 2 (STAT2), o fator regulador do interferon 9 (IRF9) e a SEAP.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que o anticorpo se liga ao IFN-w humano da SEQ ID NO: 1 pelo menos nos resíduos de aminoácido F27, L30 e R33.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a) inibe a liberação de IP-10 induzida por interferon pelo leucócito no sangue total induzida por 250 U/mL de interferon em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/mL de anticorpo, do que na ausência do anticorpo; ou b) inibe a liberação de IP-10 induzida pelo complexo imune do lúpus eritematoso sistêmico (SLE) no sangue total em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/mL de anticorpo, do que na ausência do anticorpo.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humanizado ou humano.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a estrutura da região variável da cadeia pesada do anticorpo humano é derivada do gene da linhagem germinativa humana IGHV5-51 (SEQ ID NO: 155).

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura da região variável da cadeia leve do anticorpo humano é derivada do gene da linhagem germinativa humana IGKV1D-39 (SEQ ID NO: 156).

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem ao menos uma substituição em uma região Fc.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a substituição compreende uma substituição M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S ou P238S/L234A/L235A, em que a numeração do resíduo é de acordo com a numeração EU.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Anticorpo isolado que se liga e neutraliza uma atividade biológica de uma proteína interferon ômega humano (IFN-w) e uma proteína interferon alfa humano (IFN-α), caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 28, e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 150.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é biespecífico.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo neutralizasse liga BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL ou IFN-Y.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: a) inibe a liberação de IP-10 induzida por interferon pelo leucócito no sangue total induzida por 250 U/mL de interferon em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/mL de anticorpo, do que na ausência do anticorpo; ou b) inibe a liberação de IP-10 induzida pelo complexo imune do lúpus eritematoso sistêmico (SLE) no sangue total em cerca de 50% ou mais, na presença de 10 μg/mL de anticorpo, do que na ausência do anticorpo.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem ao menos uma substituição em uma região Fc.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a substituição compreende uma substituição M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S ou P238S/L234A/L235A, em que a numeração do resíduo é de acordo com a numeração EU.