JP7313410B2 - イオン濃度依存性結合分子ライブラリ - Google Patents

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Description

関連する出願
本出願は、日本特許出願2011-218006（2011年9月30日出願）および2012-123479（2012
年5月30日出願）に基づく優先権を主張しており、これらの内容は本明細書に参照として
取り込まれる。
発明の分野
本発明は、イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の
ライブラリおよびその製造方法、そのような抗原結合分子の選択方法および製造方法、な
らびにそのような抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。
抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている
。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されて
いる（非特許文献1、非特許文献2）。一方、第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として
様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、薬物動態、安定性を向上
させる、あるいは、免疫原性リスクを低減させる技術等が報告されている（非特許文献3
）。抗体医薬は一般に投与量が非常に高いため、皮下投与製剤の作製が困難であること、
製造コストが高いこと等が課題として考えられる。抗体医薬の投与量を低減させる方法と
して、抗体の薬物動態を向上する方法と、抗体と抗原の親和性（アフィニティー）を向上
する方法が考えられる。
抗体の薬物動態を向上させる方法として、定常領域の人工的なアミノ酸置換が報告され
ている（非特許文献4、5）。抗原結合能、抗原中和能を増強させる技術として、アフィニ
ティー成熟化技術（非特許文献6）が報告されており、可変領域のCDR領域などのアミノ酸
に変異を導入することで抗原への結合活性を増強することが可能である。抗原結合能の増
強によりin vitroの生物活性を向上させる、あるいは投与量を低減することが可能であ
り、さらにin vivoでの薬効を向上させることも可能である（非特許文献7）。
一方、抗体1分子あたりが中和できる抗原量はアフィニティーに依存し、アフィニティ
ーを強くすることで少ない抗体量で抗原を中和することが可能であり、様々な方法で抗体
のアフィニティーを強くすることが可能である（非特許文献6）。さらに抗原に共有結合
的に結合し、アフィニティーを無限大にすることができれば1分子の抗体で1分子の抗原（
2価の場合は2抗原）を中和することが可能である。しかし、これまでの方法では1分子の
抗体で1分子の抗原（2価の場合は2抗原）の化学量論的な中和反応が限界であり、抗原量
以下の抗体量で抗原を完全に中和することは不可能であった。つまり、アフィニティーを
強くする効果には限界が存在していた（非特許文献9）。中和抗体の場合、その中和効果
を一定期間持続させるためには、その期間に生体内で産生される抗原量以上の抗体量が投
与される必要があり、上述の抗体の薬物動態向上、あるいは、アフィニティー成熟化技術
だけでは、必要抗体投与量の低減には限界が存在していた。そのため、抗原量以下の抗体
量で抗原の中和効果を目的期間持続するためには、1つの抗体で複数の抗原を中和する必
要がある。
これを達成する新しい方法として、最近、抗原に対してpH依存的に結合する抗体が報告
された（特許文献1）。この文献は、抗原結合分子にヒスチジンを導入することにより、p
H中性領域とpH酸性領域で性質が変化するpH依存的抗原結合抗体を開示している。抗原に
対して血漿中の中性条件下においては強く結合し、エンドソーム内の酸性条件下において
抗原から解離するpH依存的抗原結合抗体は、エンドソーム内で抗原から解離することが可
能である。pH依存的抗原結合抗体は、抗原を解離した後に抗体がFcRnによって血漿中にリ
サイクルされると再び抗原に結合することが可能であるため、1つの抗体で複数の抗原に
繰り返し結合することが可能となる。
また、抗原の血漿中滞留性は、FcRnに結合してリサイクルされる抗体と比較して非常に
短い。血漿中滞留性が長い抗体がこのような血漿中滞留性が短い抗原に結合すると、抗体
抗原複合体の血漿中滞留性は抗体と同様に長くなる。そのため、抗原は抗体と結合するこ
とにより、むしろ血漿中滞留性が長くなり、血漿中抗原濃度は上昇する。このような場合
、抗体の抗原に対するアフィニティーを向上させても抗原の血漿中からの消失を促進する
ことはできない。上述のpH依存的抗原結合抗体は、通常の抗体と比較して抗原の血漿中か
らの消失を促進する方法としても有効であることが報告されている（特許文献1）。
このようにpH依存的抗原結合抗体は1つの抗体で複数の抗原に結合し、通常の抗体と比
較して抗原の血漿中からの消失を促進することができるため、通常の抗体では成し得なか
った作用を有する。既存の抗体配列を置換することによって抗原に対するpH依存的な結合
活性を付与することができる。一方、こうした抗体を新たに取得するためには、免疫動物
から抗体を取得する方法またはヒト抗体ライブラリから抗体を取得する方法において下記
のような制限が考えられる。
非ヒト動物を免疫する方法では、pH依存的結合抗体を得られる可能性はあるものの、多
種類の抗原に対するpH依存的抗原結合抗体を短期間に得ること、あるいは特定のエピトー
プに特異的に結合する抗体を選択的に得ること、が困難な場合がある。また、ヒト抗体ラ
イブラリの中からpH依存的な抗原に対する結合能を指標に抗体を濃縮することが可能であ
る。しかし、一般的に（Kabatデータベースに登録された）ヒト抗体の抗体可変領域部分
におけるヒスチジン残基の出現頻度は、重鎖CDR1では5.9%、重鎖CDR2では1.4％、重鎖CDR
3では1.6％、軽鎖CDR1では1.5％、軽鎖CDR2では0.5%、軽鎖CDR3では2.2%と高くないこと
が知られており、ヒト抗体ライブラリ中にpH依存的抗原結合能を持ち得る配列は非常に少
ないと考えられる。よって、抗原との結合部位におけるヒスチジン出現頻度を高めたpH依
存的な抗原に対する結合能を持ち得る配列を多く含む抗体ライブラリの提供が望まれてい
る。
一方、抗原の血漿中からの消失を促進する等の効果は、pH以外の血漿中と早期エンドソ
ーム内の環境間において異なる要素に対する抗原に対する結合能の依存性を付与すること
ができれば達成できると考えられる。
なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
WO2009125825
Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078. Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008, Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29. Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life, J Immunol. (2006) 176 (1), 346-356. Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640. Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (2005) 102 (24), 8466-8471. Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract, J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665. Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol, (2005) 16 (6), 631-6. Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-13.
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、イオン濃度の条件
によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残
基が抗原結合ドメインに含まれている互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主とし
てなるライブラリ、前記抗原結合分子をコードする複数のポリヌクレオチド分子を含む組
成物、前記ポリヌクレオチド分子を含む複数のベクターを含む組成物、前記抗原結合分子
の選択方法、前記ポリヌクレオチド分子の単離方法、前記抗原結合分子の製造方法、前記
抗原結合分子を含む医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、生体内の環境要素の相違によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性
を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに含まれている互いに配
列の異なる複数の抗原結合分子を含むライブラリについて鋭意研究を行った。その結果、
本発明者らは、血漿中と早期エンドソーム内におけるイオン濃度、特にカルシウムイオン
濃度の差異やpHに着目し、カルシウム依存的またはpH依存的な抗原に対する結合活性を有
する抗原結合分子を用いることで、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みの促進、
血漿中の抗原濃度の減少をもたらす抗原結合分子から主としてなるライブラリが作製可能
であることを見出した。
すなわち本発明は、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を
変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに含まれている互いに配列
の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリ、前記抗原結合分子をコードす
る複数のポリヌクレオチド分子を含む組成物、前記ポリヌクレオチド分子を含む複数のベ
クターを含む組成物、前記抗原結合分子の選択方法、前記ポリヌクレオチド分子の単離方
法、前記抗原結合分子の製造方法、前記抗原結合分子を含む医薬組成物等に関する。より
具体的には、以下に関する。
〔１〕互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリであって、前
記抗原結合分子中の抗原結合ドメインは、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結
合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基を含むことを特徴とするラ
イブラリ、
〔２〕イオン濃度が、カルシウムイオン濃度である〔１〕に記載のライブラリ、
〔３〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の重鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔
２〕に記載のライブラリ、
〔４〕重鎖の抗原結合ドメインが重鎖可変領域である〔３〕に記載のライブラリ、
〔５〕前記アミノ酸残基が重鎖可変領域のCDR3に含まれている〔４〕に記載のライブラリ
、
〔６〕前記アミノ酸残基が重鎖CDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位
および/または101位に含まれている〔２〕から〔５〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔７〕前記アミノ酸残基以外のアミノ酸配列がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔２〕
から〔６〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔８〕前記抗原結合分子の軽鎖可変領域がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔３〕から
〔７〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔９〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の軽鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔
２〕に記載のライブラリ、
〔１０〕軽鎖の抗原結合ドメインが軽鎖可変領域である〔９〕に記載のライブラリ、
〔１１〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR1に含まれている〔１０〕に記載のライブ
ラリ、
〔１２〕前記アミノ酸残基がCDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位および/また
は32位に含まれている〔１１〕に記載のライブラリ、
〔１３〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR2に含まれている〔１０〕から〔１２〕の
いずれかに記載のライブラリ、
〔１４〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれて
いる〔１３〕に記載のライブラリ、
〔１５〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3である〔１０〕から〔１４〕のいずれかに記載の
ライブラリ、
〔１６〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれて
いる〔１５〕に記載のライブラリ、
〔１７〕前記抗原結合分子の軽鎖のフレームワークが生殖細胞系列のフレームワーク配列
を含む〔２〕または〔９〕から〔１６〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔１８〕前記抗原結合分子の重鎖可変領域がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む請求項〔
２〕または〔９〕から〔１７〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔１９〕前記アミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフを形成する〔１〕から〔１８〕の
いずれかに記載のライブラリ、
〔２０〕カルシウム結合モチーフが、カドヘリンドメイン、EFハンド、C2ドメイン、Gla
ドメイン、C型レクチン、ドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよび
EGF様ドメイン、Vk5の部分、配列番号１０、配列番号１１のいずれかのカルシウム結合モ
チーフである〔１９〕に記載のライブラリ、
〔２１〕前記アミノ酸残基が、金属キレート作用を有するアミノ酸である〔２〕から〔２
０〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔２２〕金属キレート作用を有するアミノ酸が、セリン、スレオニン、アスパラギン、グ
ルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかひとつ以上のアミノ酸である〔
２１〕に記載のライブラリ、
〔２３〕イオン濃度の条件がpHである〔１〕に記載のライブラリ、
〔２４〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の重鎖の抗原結合ドメインに含まれている
〔２３〕に記載のライブラリ、
〔２５〕重鎖の抗原結合ドメインが重鎖可変領域である〔２４〕に記載のライブラリ、
〔２６〕前記アミノ酸残基が重鎖可変領域のKabatナンバリングで表される27位、31位、3
2位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96
位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位または107位の
いずれか一つ以上に含まれている〔２５〕に記載のライブラリ、
〔２７〕重鎖可変領域のKabatナンバリングで表される27位、31位、32位、33位、35位、5
0位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99
位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位または107位のいずれかのアミノ酸
残基以外のアミノ酸配列がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔２６〕に記載のライブラ
リ、
〔２８〕前記抗原結合分子の軽鎖可変領域が生殖細胞系列の配列を含む〔２３〕から〔２
７〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔２９〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の軽鎖の抗原結合ドメインに含まれている
〔２３〕に記載のライブラリ、
〔３０〕軽鎖の抗原結合ドメインが軽鎖可変領域である〔２９〕に記載のライブラリ、
〔３１〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のKabatナンバリングで表される24位、27位、2
8位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90
位、91位、92位、93位、94位または95a位のいずれか一つ以上に含まれている〔３０〕に
記載のライブラリ、
〔３２〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR1に含まれている〔３０〕または〔３１〕
に記載のライブラリ、
〔３３〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR1のKabatナンバリングで表される24位、27位、28
位、30位、31位、32位または34位のいずれか一つ以上に含まれている〔３２〕に記載のラ
イブラリ、
〔３４〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2に含まれている〔３０〕から〔３３〕のいずれか
に記載のライブラリ、
〔３５〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2のKabatナンバリングで表される50位、51位、52
位、53位、54位、55位または56位のいずれか一つ以上に含まれている〔３４〕に記載のラ
イブラリ、
〔３６〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれている〔３０〕から〔３５〕のいずれか
に記載のライブラリ、
〔３７〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される89位、90位、91
位、92位、93、94位または95a位のいずれか一つ以上に含まれている〔３６〕に記載のラ
イブラリ、
〔３８〕軽鎖のフレームワークが生殖細胞系列のフレームワーク配列を含む〔２９〕から
〔３７〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔３９〕重鎖可変領域がナイーブ配列である〔２９〕から〔３８〕のいずれかに記載のラ
イブラリ、
〔４０〕前記アミノ酸残基が、側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸である〔２３〕から〔
３９〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔４１〕前記アミノ酸残基が、グルタミン酸である〔２３〕から〔４０〕のいずれかに記
載のライブラリ、
〔４２〕前記アミノ酸残基が、側鎖のpKaが5.5-7.0であるアミノ酸である〔２３〕から〔
３９〕に記載のライブラリ、
〔４３〕前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである〔２３〕から〔４０〕または〔４２〕の
いずれかに記載のライブラリ、
〔４４〕〔１〕から〔４３〕のいずれかに記載の抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプ
チドから主としてなるライブラリであって、前記融合ポリペプチドは抗原結合分子の重鎖
可変領域とウイルスコートタンパク質の少なくとも一部とが融合したものであることを特
徴とするライブラリ、
〔４５〕前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質pIII、主コートタンパク質pVIII、p
VII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1およびその変異体からなる群から選択される、〔４４〕に
記載されるライブラリ、
〔４６〕〔１〕から〔４３〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求
項〔４４〕または〔４５〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを各々コー
ドする複数のポリヌクレオチド分子を含む組成物、
〔４７〕〔４６〕に記載される複数のポリヌクレオチド分子を作用可能なように連結され
ている状態で各々含む複数のベクターを含む組成物、
〔４８〕ベクターが複製可能な発現ベクターである、〔４７〕に記載の組成物、
〔４９〕複製可能な発現ベクターが、lac Zプロモーター系、アルカリフォスファターゼ
pho Aプロモーター（Ap）、バクテリオファージλPLプロモーター（温度感受性プロモー
ター）、tacプロモーター、トリプトファンプロモーター、pBADプロモーターおよびバク
テリオファージT7プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域が発現ベクタ
ーにおいて前記ポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている〔４８〕に記載の組
成物、
〔５０〕複製可能な発現ベクターが、M13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体、ま
たはラムダ型ファージもしくはその誘導体である、〔４８〕または〔４９〕に記載の組成
物、
〔５１〕〔４７〕から〔５０〕のいずれかに記載されるベクターを各々含む複数のウイル
スを含む組成物、
〔５２〕〔１〕から〔４３〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求
項〔４４〕または〔４５〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドが各々その
表面に提示されている複数のウイルスを含む組成物、
〔５３〕〔１〕から〔４３〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求
項〔４４〕または〔４５〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを含むライ
ブラリであって、1 x 106ないし1 x 1014の互いに異なる可変領域配列を有するライ
ブラリ、
〔５４〕1 x 108以上の互いに異なる可変領域配列を有する〔５３〕に記載のライブラ
リ、
〔５５〕互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリの作製方法
であって、前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、イオン濃度の条件によって抗原に
対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基を含むよう設
計された複数の抗原結合分子中を製造することを含む方法、
〔５６〕前記抗原結合分子が〔２〕から〔４３〕のいずれかに記載の抗原結合分子である
〔５５〕に記載の作製方法、
〔５７〕前記抗原結合分子の重鎖可変領域がウイルスコートタンパク質の少なくとも一部
と融合している、〔５５〕または〔５６〕の作製方法、
〔５８〕前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質pIII、主コートタンパク質pVIII、p
VII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1およびその変異体からなる群から選択される、〔５５〕か
ら〔５７〕のいずれかに記載の作製方法、
〔５９〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を選択
する方法であって、
a）〔１〕から〔４３〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔４４〕または〔４５〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチド
から主としてなるライブラリを作製するステップ、
b）前記ライブラリをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステ
ップ、
c）イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の集団を前
記ライブラリから分画するステップ、
d）c）において分画された集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変
化する抗原結合分子を単離するステップ、
とを含む方法、
〔６０〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子をコー
ドするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
a）〔１〕から〔４３〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔４４〕または〔４５〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチド
を各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々
含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または
融合ポリペプチドを発現するステップ、
c）前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d）イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e）d）において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結
合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
とを含む方法、
〔６１〕追加的に前記c）からd）のステップを少なくとも1回反復する〔６０〕に記載の
方法、
〔６２〕イオン濃度がカルシウムイオン濃度である〔５９〕から〔６１〕のいずれかに記
載の方法、
〔６３〕低カルシウム濃度の条件での抗原に対する結合活性が高カルシウム濃度の条件で
の結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔６２〕に記載の方法、
〔６４〕低カルシウム濃度の条件が0.1μMから30μMである〔６３〕に記載の方法、
〔６５〕高カルシウム濃度の条件が100μMから10 mMである〔６３〕または〔６４〕に記
載の方法、
〔６６〕イオン濃度の条件がpHである〔５９〕から〔６１〕のいずれかに記載の方法、
〔６７〕pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下
する抗原結合分子を選択する〔６６〕に記載の方法、
〔６８〕pH酸性域条件がpH4.0から6.5である〔６６〕に記載の方法、
〔６９〕pH中性域条件がpH6.7から10.0である〔６７〕または〔６８〕に記載の方法、
〔７０〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造
方法であって、
a）〔１〕から〔４３〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔４４〕または〔４５〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチド
を各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々
含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または
融合ポリペプチドを発現するステップ、
c）前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d）イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e）d）において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結
合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
g）単離されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿入されたベ
クターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
h）g）で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
とを含む製造方法、
〔７１〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造
方法であって、
a）〔１〕から〔４３〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔４４〕または〔４５〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチド
を各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々
含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または
融合ポリペプチドを発現するステップ、
c）前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d）イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e）d）において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結
合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
g）単離されたポリヌクレオチドをインフレームで抗体定常領域をコードするポリヌクレ
オチドと連結するステップ、
h）g）において連結されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿
入されたベクターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
i）h）で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
とを含む製造方法、
〔７２〕追加的に前記c）からd）のステップを少なくとも1回反復する〔７０〕または〔
７１〕に記載の製造方法、
〔７３〕イオン濃度がカルシウムイオン濃度である〔７０〕から〔７２〕のいずれかに記
載の製造方法、
〔７４〕低カルシウム濃度の条件での抗原に対する結合活性が高カルシウム濃度の条件で
の結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔７３〕に記載の製造方法、
〔７５〕低カルシウム濃度の条件が0.1μMから30μMである〔７４〕に記載の製造方法、
〔７６〕高カルシウム濃度の条件が100μMから10 mMである〔７４〕または〔７５〕に記
載の製造方法、
〔７７〕イオン濃度の条件がpHの条件である〔７０〕から〔７２〕のいずれかに記載の製
造方法、
〔７８〕pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下
する抗原結合分子を選択する〔７７〕に記載の製造方法、
〔７９〕pH酸性域条件がpH4.0から6.5である〔７８〕に記載の製造方法、
〔８０〕pH中性域条件がpH6.7から10.0である〔７８〕または〔７９〕に記載の製造方法
、
〔８１〕〔７０〕から〔８０〕のいずれかに記載の製造方法によって製造された抗原結合
分子、
〔８２〕〔８１〕に記載の抗原結合分子またはその改変体を含む医薬組成物を提供するも
のである。
pH依存的に抗原に結合する抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された132クローンの配列情報のアミノ酸の分布（Libraryと表示される）と設計されたアミノ酸分布（Designと表示される）との関係を示すグラフである。横軸はKabatナンバリングで表されるアミノ酸の部位が表される。縦軸はアミノ酸の分布の比率が表される。 抗IL-6R抗体（トシリズマブ）、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体および6RpH#03抗体のpH7.4におけるセンサーグラムを表す。横軸は時間、縦軸はRU値を示す。 抗IL-6R抗体（トシリズマブ）、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体および6RpH#03抗体のpH6.0におけるセンサーグラムを表す。横軸は時間、縦軸はRU値を示す。 pH依存的結合抗体の血漿中（pH7.4）とエンドソーム内（pH6.0）の抗原への相互作用の様式を示す図である。 カルシウム依存的結合抗体の血漿中（Ca2+ 2mM）とエンドソーム内（Ca2 + 3μM）の抗原への相互作用の様式を示す図である。 pHおよびカルシウム依存的結合抗体の血漿中（Ca2+ 2mM）とエンドソーム内（Ca2+ 3μM）の抗原への相互作用の様式を示す図である。 ヒトVk5-2配列を含む抗体と、ヒトVk5-2配列中の糖鎖付加配列が改変されたh Vk5-2＿L65配列を含む抗体のイオン交換クロマトグラムである。実線はヒトVk5-2配列を含む抗体（重鎖：CIM＿H、配列番号：４および軽鎖：hVk5-2、配列番号：１に配列番号：２６が融合されたもの）のクロマトグラム、破線はhVk5-2＿L65配列をもつ抗体（重鎖：CIM＿H（配列番号：４）、軽鎖：hVk5-2＿L65（配列番号：５））のクロマトグラムを表す。 LfVk1＿Ca配列を含む抗体（重鎖：GC＿H、配列番号：４８および軽鎖：LfVk1＿Ca、配列番号：４３）と、LfVk1＿Ca配列中のAsp（D）残基がAla（A）残基に改変された配列を含む抗体の5℃保存後（実線）または50℃保存後（点線）のイオン交換クロマトグラムである。それぞれ5℃保存後のイオン交換クロマトグラムのもっとも高いピークをメインピークとして、メインピークでy軸ノーマライズした図である。 LfVk1＿Ca配列を含む抗体（重鎖：GC＿H、配列番号：４８および軽鎖：LfVk1＿Ca、配列番号：４３）と、LfVk1＿Ca配列中の30位（Kabatナンバリング）のAsp（D）残基がSer（S）残基に改変されたLfVk1＿Ca6配列（重鎖：GC＿H、配列番号：４８および軽鎖：LfVk1＿Ca6、配列番号：４９）を含む抗体の5℃保存後（実線）または50℃保存後（点線）のイオン交換クロマトグラムである。それぞれ5℃保存後のイオン交換クロマトグラムのもっとも高いピークをメインピークとして、メインピークでy軸ノーマライズした図である。 Ca依存的に抗原に結合する抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された290クローンの配列情報のアミノ酸の分布（Libraryと表示される）と設計されたアミノ酸分布（Designと表示される）との関係を示すグラフである。横軸はKabatナンバリングで表されるアミノ酸の部位が表される。縦軸はアミノ酸の分布の比率が表される。 高カルシウムイオン濃度の条件（1.2 mM）下における抗IL-6R抗体（トシリズマブ）、6RC1IgG＿010抗体、6RC1IgG＿012抗体および6RC1IgG＿019抗体のセンサーグラムを表す。横軸は時間、縦軸はRU値を示す。 低カルシウムイオン濃度の条件（3μM）下における抗IL-6R抗体（トシリズマブ）、6RC1IgG＿010抗体、6RC1IgG＿012抗体および6RC1IgG＿019抗体のセンサーグラムを表す。横軸は時間、縦軸はRU値を示す。 X線結晶構造解析で決定された6RL#9抗体のFabフラグメントの重鎖CDR3の構造を表す。(i)はカルシウムイオンが存在する結晶化条件で得られた結晶構造の重鎖CDR３、(ii)はカルシウムイオンが存在しない結晶化条件で得られた結晶構造の重鎖CDR3を示す図である。 Biacoreを用いた抗ヒトIgA抗体のCa2+1.2 mM およびCa2+ 3μM におけるヒトIgAへの相互作用を示すセンサーグラムを示す図である。 ELISA法を用いた抗ヒトグリピカン3抗体のCa2+1.2 mM およびCa2+ 3μM における組み換えヒトグリピカン3への相互作用を示す図である。 Biacoreを用いた抗マウスIgA抗体のpH7.4 およびpH5.8 におけるマウスIgAへの相互作用を示すセンサーグラムを示す図である。実線はpH7.4、破線はpH5.8の条件を表す。 Biacoreを用いた抗ヒトHMGB1抗体のpH7.4 およびpH5.8 におけるヒトHMGB1への相互作用を示すセンサーグラムを示す図である。実線はpH7.4、破線はpH5.8の条件を表す。 H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体、および、6RL#9-IgG1抗体のノーマルマウスの血漿中の抗体濃度の推移を示す図である。 H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体、および、6RL#9-IgG1抗体が投与されたノーマルマウスの血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター（hsIL-6R）の濃度推移を示す図である。 H54/L28-N434W抗体、FH4-N434W抗体、および、6RL#9-N434W抗体のノーマルマウスの血漿中の抗体濃度の推移を示す図である。 H54/L28-N434W抗体、FH4-N434W抗体、および、6RL#9-N434W抗体が投与されたノーマルマウスの血漿中の可溶型ヒトIL-6レセプター（hsIL-6R）の濃度推移を示す図である。
本発明の開示によって、イオン濃度等の条件によって抗原に対する結合活性が変化する
互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。また
、本発明の開示によって、金属イオン濃度および/または水素イオン濃度の条件によって
抗原に対する結合活性が変化する互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてな
るライブラリの新規で体系的な製造方法が提供される。そのようなライブラリは、例えば
、金属イオン濃度および/または水素イオン濃度の条件に応じた望ましい活性、例えば結
合親和性およびアビディティーのある合成の抗原結合分子のクローンを選択および/また
はスクリーニングするために役立つ、組合せライブラリとして使用され得る。
これらのライブラリは、多種多様な対象抗原のいずれかと相互作用することのできる抗
原結合分子のポリペプチドの配列を同定するために有用である。例えば、ファージディス
プレイとして発現する本発明の多様化された抗原結合分子のポリペプチドを含んでいるラ
イブラリは、目的とする抗原結合分子の選択および/またはスクリーニングに特に有用で
あり、またそのための高スループットの、効率的で自動化可能な系が本発明によって提供
される。本発明の方法にしたがえば、対象抗原に対して条件依存的に結合する抗原結合分
子を提供し得る。さらに本発明によって当該抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成
物が提供される。
定義
アミノ酸
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、P
he/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/
I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方
で表記されている。
EUナンバリングおよびKabatナンバリング
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置
はKabatにしたがって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Inter
est（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）。本
明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ
酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じた
EUナンバリングにしたがって表される。
アミノ酸の改変
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（
Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap ext
ension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸
に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu. R
ev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコド
ン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合された
tRNAが含まれる無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適
に用いられる。また、アミノ酸の改変を表す表現として、特定の位置を表す数字の前後に
改変前と改変後のアミノ酸の1文字コードを用いた表現が適宜使用され得る。例えば、抗
体定常領域に含まれるFc領域にアミノ酸の置換を加える際に用いられるP238Dという改変
は、EUナンバリングで表される238位のProのAspへの置換を表す。すなわち、数字はEUナ
ンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の一文字コー
ドは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードは置換後のアミノ
酸を表す。
および/または
本明細書において、「および/または」の用語の意義は、「および」と「または」が適
宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「33位、55位、および/ま
たは96位のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含
まれる；
(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f)
55位および96位、(g) 33位および55位および96位。
抗原結合分子
本明細書において、用語「抗原結合分子」は抗原結合ドメインを含む分子を表す最も広
義な意味として使用されており、具体的には、それらが抗原に対する結合活性を示す限り
、様々な分子型が含まれる。例えば、抗原結合ドメインがFcRn結合ドメインと結合した分
子の例として、抗体が挙げられる。抗体には、単一のモノクローナル抗体（アゴニストお
よびアンタゴニスト抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が含まれ得る。
また抗体の断片として使用される場合としては、抗原結合ドメインおよび抗原結合断片（
例えば、Fab、F(ab’)2、scFvおよびFv）が好適に挙げられ得る。既存の安定なα/βバレ
ルタンパク質構造等の立体構造がスキャフォールド（scaffold；土台）として用いられ、
その一部分の構造のみが抗原結合ドメインの構築のためにライブラリ化されたスキャフォ
ールド分子も、本発明の抗原結合分子に含まれ得る。
本明細書において、「抗原結合ドメイン」は目的とする抗原に結合するかぎりどのよう
な構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、例えば、抗体の重鎖
および軽鎖の可変領域、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミ
ノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール（WO2004044011、WO2005040229）、細胞膜に
発現する糖タンパク質であるフィブロネクチン（fibronectin）中のタンパク質に結合す
るドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin（WO2002032925）、ProteinAの58アミノ
酸からなる3つのヘリックスの束（bundle）を構成するIgG結合ドメインをスキャフォール
ドとするAffibody（WO1995001937）、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリッ
クスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復（
ankyrin repeat：AR）の分子表面に露出する領域であるDARPins（Designed Ankyrin R
epeat proteins）（WO2002020565）、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン（neutrophil
gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等のリポカリン分子において高度に保存
された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのルー
プ領域であるAnticalin等（WO2003029462）、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲
得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体（variab
le lymphocyte receptor（VLR））のロイシン残基に富んだリピート（leucine-rich-re
peat（LRR））モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート
構造のくぼんだ領域（WO2008016854）が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの
好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる
。
本明細書において、「抗体」とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成
により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天
然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝
子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例
としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適
に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、Ig
D、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明の抗体には、これ
らのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒ
トIgG3、ヒトIgG4定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequence
s of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に
記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列と
しては、EUナンバリングで表される356-358位のアミノ酸配列がDELであってもEEMであっ
てもよい。ヒトIgK(Kappa)定常領域とヒトIgL7 (Lambda)定常領域としては、遺伝子多型
による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest
, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれで
あっても良い。所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である
。
抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され
得る。モノクローナル抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製さ
れ得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの
、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞
によって産生されるもの等が含まれる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって作製され
得る。すなわち、感作抗原によって通常の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。
得られる免疫細胞が通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合される。次に、通常の
スクリーニング法によって、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることに
よって当該感作抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。
該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、
細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ
歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使
用される。
公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方
法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に注射によって投与されることにより
免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で
適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイ
ント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日
毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子
量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホール
リンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫するこ
とが望ましい場合もある。
また、所望のポリペプチドに対する抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用
し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコ
ードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免
疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与
えられる免疫方法である。タンパク質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比
べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。
－抗原が膜タンパク質の場合、その構造を維持して免疫刺激が与えられ得る。
－免疫抗原を精製する必要が無い。
前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエ
ローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい
。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す
。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略す
る）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテ
リン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選
択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞の
サルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖
するようになる。
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略
する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミ
ジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナ
ログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができ
る。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオ
キシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融
合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
このようなミエローマ細胞として、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979
）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and I
mmunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-51
9）、MPC-11（Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685),
269-270）、FO（J.Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J
. Exp. Med.（1978）148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131
-133）等が好適に使用され得る。
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Methods Enzym
ol.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行わ
れる。
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融
合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、セン
ダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルス
ルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細
胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液とし
ては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その
他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS
）等の血清補液が好適に添加され得る。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、
予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から6
0％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細
胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され
、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくな
い細胞融合剤等が除去され得る。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒ
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択
され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（
通常、係る十分な時間は数日から数週間である）上記HAT培養液を用いた培養が継続され
得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングおよび単一クローニングが実施される。
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する
選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやT
Kの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを
含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細
胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選
択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分
な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週
間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法に
よって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニング
が実施され得る。
所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づく
スクリーニング方法によって好適に実施され得る。このようなモノクローナル抗体は、た
とえば、FACS（fluorescence activated cell sorting）によってスクリーニングされ
得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が発する蛍
光を測定することによって細胞表面への抗体の結合を測定することを可能にするシステム
である。
あるいは固定化した抗原に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評価され得
る。たとえば、ELISAプレートのウエルに抗原が固定化される。ハイブリドーマの培養上
清をウエル内の抗原に接触させ、抗原に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体
がマウス由来の場合、抗原に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検
出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する
所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。こ
のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中
で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得
る。
当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナ
ル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与し
て増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度
の抗体を得るのに好適なものである。
当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコー
ドされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組
み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する
。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例
えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 7
67-775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
たとえば、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、当該抗体の可変領域（V領
域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNA
が抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利
用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス）等
を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルス
ケアバイオサイエンス）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市
販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得
られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは
、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社
）等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA
増幅キット（Clontech）およびPCRを用いた5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-
2932）が適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述
する適切な制限酵素サイトが導入され得る。
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される
。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に
、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組
換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例
えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマー
を使った5’-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出された
RNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’-RACE cDNAライブラリが得られる。5’-RACE cDN
Aライブラリの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットが適宜用いられ
る。
得られた5’-RACE cDNAライブラリを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅さ
れる。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインさ
れ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列で
ある。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピ
ングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておく
ことが望ましい。
具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重
鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能
なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側の
プライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用
される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリ作製キットに付属する
プライマーが利用される。
こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組合せからなるイムノグロブリ
ンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、抗原に対する結合活性を指標と
して、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえば抗原に対する抗体の取得を目的と
するとき、抗体の抗原への結合は、特異的であることがさらに好ましい。抗原に結合する
抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体を抗原に
接触させる工程、
（２）抗原と抗体との結合を検出する工程、および
（３）抗原に結合する抗体を選択する工程。
抗体と抗原との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFACSやELIS
Aなどの手法によって、抗体と抗原との結合が検出され得る。
目的とする抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入し
た制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は
、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更
に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制
限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗体のV領域をコードするcDNAを適当
な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、
抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフ
レームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と
可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種キメラ抗体に
加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領
域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現
ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコー
ドするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制
限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がイン
フレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
所望の抗体を製造するために、抗体遺伝子が制御配列と作用可能に連結されて発現ベク
ターに組み込まれる。抗体を発現するための制御配列とは、例えば、エンハンサーやプロ
モーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列
がアミノ末端に付加され得る。例えばシグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATA
TGVHS（配列番号：１３）を有するペプチドが使用されるが、これ以外にも適したシグナ
ル配列が付加される。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断
され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで
、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、所望の抗体
をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。
抗体遺伝子の発現のために、抗体の重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは
、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターによっ
て、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）されることによって、重鎖と軽鎖を
備えた抗体分子が発現され得る。あるいは重鎖および軽鎖をコードするDNAが単一の発現
ベクターに組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る（WO19994011523を参
照のこと）。
単離された抗体遺伝子を適当な宿主に導入することによって抗体を作製するための宿主
細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発
明の抗原結合分子を単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主細胞として使用される場
合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞
としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO（Chinese hamster ovary cell line）、COS（Monkey kid
ney cell line）、ミエローマ（Sp2/O、NS0等）、BHK （baby hamster kidney cel
l line）、HEK293（human embryonic kidney cell line with sheared adenovir
us (Ad)5 DNA）、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transfor
med with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)、Hela、Vero、
など（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table
5.9.1)）
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニ
コティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
－酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミ
セス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
－糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspe
rgillus）属
また、原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用
いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞が適宜利用され得る。これらの細
胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質
転換された細胞をin vitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望
の抗体が取得され得る。
組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物も利用され得
る。すなわち所望の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体を得ること
ができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺
伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁
中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用され得る。抗体
遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当該注入された胚
が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（また
はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質と
して取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁
量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る（Bio/
Technology (1994), 12 (7), 699-702）。
本明細書において記載される抗原結合分子がヒトに投与される場合、当該分子における
抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為
的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。遺伝子組
換え型抗体には、例えば、ヒト化（Humanized）抗体等が含まれる。これらの改変抗体は
、公知の方法を用いて適宜製造される。
本明細書において記載される抗原結合分子における抗原結合ドメインを作製するために
用いられる抗体の可変領域は、通常、４つのフレームワーク領域（FR）にはさまれた３つ
の相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成されている
。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は
多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間で
も、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の
結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動
物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗
体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップ・伸長（Overl
ap Extension） PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のF
Rを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付
加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRの
ヒトFRへの移植においては、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機
能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに
隣接しているFRのアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するの
が好ましい。
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。
それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDR
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列
は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳
型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
最終的に3つのCDRと4つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニー
ルし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上
記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するよ
うに発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。
当該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、当該組換え細胞を培養
し、当該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、当該ヒト化抗体が当該
培養細胞の培養物中に産生される（EP239400、WO1996002576）。
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、
評価することによって、CDRを介して連結されたときに当該CDRが良好な抗原結合部位を形
成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適
切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば
、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入
することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の
変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配
列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法
で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Satoら（
Cancer Res (1993) 53, 851-856）。
また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（WO1993
012227、WO1992003918、WO1994002602、WO1994025585、WO1996034096、WO1996033735参照
）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
さらに、ヒト抗体ライブラリを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知
られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレ
イ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択
され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体
のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後
、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発
現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上
記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、当該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現さ
せることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（WO19920010
47、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、WO1993019172、WO1995001438、WO1995
015388参照）。
本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し
且つ相補的である領域をいう。抗原結合ドメインの例として抗体の抗原結合ドメインを有
しているドメインを挙げることができる。抗体の抗原結合ドメインの例として、CDRや可
変領域が挙げられ得る。抗体の抗原結合ドメインがCDRである場合、抗体に含まれる6つの
CDR全てが含まれ得るし、1つ若しくは2つ以上のCDRも含まれ得る。抗体の結合領域として
CDRが含まれる場合、抗原に対する結合活性を有する限り、含まれるCDRにはアミノ酸の欠
失、置換、付加及び/又は挿入などが行われ得るし、又、CDRの一部分も使用され得る。抗
原の分子量が大きい場合、抗体は抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定
部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインよ
り提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可
変領域（VH）とを含む。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chai
nFv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain
Fv2）」、「Fab」、「ダイアボディ」、「線状抗体」または「F(ab')2」等が好適に挙
げられる。
本明細書で使われるように、「抗体可変領域」とは、相補性決定領域（CDR；すなわち
、CDR1、CDR2およびCDR3）ならびにフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列を含む、抗
体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。VHは重鎖の可変領域（Heavy chain variable
region）をいう。VLは軽鎖の可変領域（Light chain variable region）をいう。本発
明で使用されている方法によると、CDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにした
がって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National
Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）。本明細書におい
て、抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、Kabatのアミノ酸位置に準じ
たKabatナンバリングで表される。
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域（CDR；すなわち、CDR1、CDR2およ
びCDR3）」とは、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変領域のアミノ酸残基
をいう。各可変領域は、一般的にCDR1、CDR2およびCDR3と表される3つのCDR領域を含む。
各相補性決定領域は、Kabatが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残
基（すなわち、軽鎖可変領域の残基約24～34（CDR1）、50～56（CDR2）、および89～97（
CDR3）ならびに重鎖可変領域の31～35（CDR1）、50～65（CDR2）および95～102（CDR3）
；Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public
Health Service、National Institute of Health、Bethesda、MD.（1991））、およ
び/または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変領域の残基約26～32（CDR1
）、50～52（CDR2）および91～96（CDR3）ならびに重鎖可変領域の26～32（CDR1），53～
55（CDR2）および96～101（CDR3）；ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol. (1987) 196, 9
01-917）を含み得る。ある場合には、相補性決定領域はKabatの記載によって定義されて
いるCDR領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
用語「Fab」断片は、軽鎖の可変および定常領域と重鎖の可変領域および第1の定常領域
（CH1）を含む。F(ab’)2抗体断片は一対のFab断片を含み、通常これらはその間にあるヒ
ンジ領域中のシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される
。抗体断片の他の化学的結合も本発明が属する技術分野で公知である。
用語「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は抗体のVHおよびVL領域を含み、これらの領域
は単一のポリペプチド鎖を形成する。通常、FvポリペプチドはVHおよびVL領域の間にポリ
ペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはscFvが抗原結合にとって望ましい構造を
形成することを可能にする。scFvの総説は、例えば、Pluckthun, The Pharmacology o
f Monoclonal Antibodies (1994) Vol.113, 269-315 (Rosenburg and Moore編、
Springer-Verlag, New York)等に記載されている。
用語「ダイアボディ（diabody）」とは、抗原結合部位を2つ備える小さな抗体断片をい
い、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（VHおよびVL）内に軽鎖可変領域（VL）に連結さ
れた重鎖可変領域（VH）が含まれる。同じ鎖の上の2つの領域の間で対合させるにはあま
りに短いリンカーを用いて、この領域を他の鎖の相補性領域と強制的に対合させ、2つの
抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば欧州特許第404097号、WO1993011161
等の特許文献やHolligerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993) 90, 6444-6448）等の非
特許文献において詳細に記載されている。
用語「線状抗体」はZapata et al., Protein Eng. (1995) 8 (10), 1057-1062
に記載されている抗体をいう。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に
一対の抗原結合ドメインを形成する、一対のタンデムFdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）を
含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
抗原
本明細書において「抗原」は抗原結合ドメインが結合するエピトープを含む限りその構
造は特定の構造に限定されない。別の意味では、抗原は無機物でもあり得るし有機物でも
あり得る。抗原としては下記のような分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-
PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビ
ンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2
、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、AD
AM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALC
AM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ－V/ベータ-1アンタゴ
ニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、
ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-
H、B-リンパ球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax
、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B
MP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 オステオゲニン（Osteogenin）、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BM
P-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-I
B（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来
神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3（C3）、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125
、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原（CEA）、癌関連抗原、カテプシンA、カテ
プシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、
カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL
1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、C
CL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、C
CL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7
、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、
CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、
CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、C
D44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B
7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD16
4、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、C
MV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1
、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、C
XCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3
、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体
制御因子（Decay accelerating factor）、des（1-3）-IGF-I（脳IGF-1）、Dhh、ジゴ
キシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EG
F、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eN
OS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、
ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タ
ンパク質（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、
FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカ
イン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、G
CP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6
（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDF-1
5（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ
3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、g
p72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HC
MV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血
成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（Er
bB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV） gB糖タンパク質、HSV gD糖タ
ンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 12
0 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサ
イトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICA
M-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R
、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、
IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、イン
ターフェロン（INF）-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリ
ンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリン
アルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンア
ルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5（アルファV）、インテグリンアルファ5/ベー
タ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、
インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カ
リクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリ
クレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、
KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潜在的TG
F-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス－Y抗原、ルイス－Y関連
抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチ
ン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容
体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、MET
ALLOPROTEASES、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、M
K、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP
-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン（Muc1）、MUC18、ミ
ュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM
、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因
子（NGF）、NGFR、NGF－ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG
、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、P
BSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI
2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、プロ
インスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原（PSMA
）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラ
キシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（RSV）F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、
RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIG
IRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE
、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質－72）、TARC、TCA-3、T細胞受容体（例えば、T
細胞受容体アルファ/ベータ）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様
アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Spe
cific、TGF-ベータRI（ALK-5）、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF
-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck
-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TN
F-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（T
RAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、
TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、T
NFRSF11A（RANK ODF R、TRANCER）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK
R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA
、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR A
ITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120
a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（
LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50
）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27
）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（Dc
TRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD
、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2リガンド、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RA
NKリガンド ODF、OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド）、TN
FSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（L
IGHT HVEMリガンド、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンド AITRリガ
ンド、TL6）、TNFSF1A（TNF-a コネクチン（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF
-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40リガンド gp34、TXGP1）
、TNFSF5（CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fasリガンド A
po-1リガンド、APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンド CD70）、TNFSF8（CD30リガンド
CD153）、TNFSF9（4-1BBリガンド CD137リガンド）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL
R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、
TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、
uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEF
GR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-
1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B
／13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、
WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP
、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/I
L-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL, PCSK9, prekallikrein , RON, TMEM16F、SOD1, C
hromogranin A, Chromogranin B、tau, VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R
、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、
C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C
5a, C5b, C6, C7, C8, C9,factor B, factor D, factor H, properdin、scle
rostin、fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 組織因子, factor V, fa
ctor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor I
X, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XI
I, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPC
R, トロンボモデュリン、TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2、GPC3
、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P、Acetylcholine recep
tor、AdipoR1、AdipoR2、ADP ribosyl cyclase-1、alpha-4/beta-7 integrin、alpha-
5/beta-1 integrin、alph

a-v/beta-6 integrin、alphavbeta1 integrin、Angiopoietin ligand-2、Angptl2、An
thrax、Cadherin、Carbonic anhydrase-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51
、CD70、CD72、Claudin 18、Clostridium difficile toxin、CS1、Delta-like prote
in ligand 4、DHICA oxidase、Dickkopf-1 ligand、Dipeptidyl peptidase IV、EP
OR、F protein of RSV、Factor Ia、FasL、Folate receptor alpha、Glucagon re
ceptor、Glucagon-like peptide 1 receptor、Glutamate carboxypeptidase II、GM
CSFR、Hepatitis C virus E2 glycoprotein、Hepcidin、IL-17 receptor、IL-22 r
eceptor、IL-23 receptor、IL-3 receptor、Kit tyrosine kinase、Leucine Rich
Alpha-2-Glycoprotein 1 (LRG1)、Lysosphingolipid receptor、Membrane glycoprot
ein OX2、Mesothelin、MET、MICA、MUC-16、Myelin associated glycoprotein、Neuro
pilin-1、Neuropilin-2、Nogo receptor、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B
、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3 、PLXNC1 、PLXND1 、Programmed cell death ligan
d 1、Proprotein convertase PC9、P-selectin glycoprotein ligand-1、RAGE、Ret
iculon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SE
MA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SE
MA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga like toxin II、Sphingosine-1-phosphate receptor-
1、ST2、Staphylococcal lipoteichoic acid、Tenascin、TG2、Thymic stromal lymp
hoprotein receptor、TNF superfamily receptor 12A、Transmembrane glycoprotei
n NMB、TREM-1、TREM-2、Trophoblast glycoprotein、TSH receptor、TTR、Tubulin、
ULBP2ならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。そのほか、前記
受容体のうち生体の体液中で細胞に係留されずに可溶型で存在する分子も例示され得る。
抗原中に存在する抗原決定基を意味するエピトープは、本明細書において開示される抗
原結合分子中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。よって、例えば、
エピトープは、その構造によって定義され得る。また、当該エピトープを認識する抗原結
合分子中の抗原に対する結合活性によっても当該エピトープが定義され得る。抗原がペプ
チド又はポリペプチドである場合には、エピトープを構成するアミノ酸残基によってエピ
トープを特定することも可能である。また、エピトープが糖鎖である場合には、特定の糖
鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。
直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープであ
る。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも3つ、および最も普通には少なくとも5
つ、例えば約8ないし約10個、6ないし20個のアミノ酸が固有の配列において含まれる。
立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の
一次配列が、認識されるエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミ
ノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを規定する抗体により認識されないエピトープ）
である。立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増大した数のアミノ酸を包含
するかもしれない。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパ
ク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成
する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸および/またはポリペプチド
主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構
造を決定する方法には、例えばX線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的な
スピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば
、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第66
巻、Morris（編）を参照。
遺伝子組換え手法
用語「コドンセット」とは、所望のアミノ酸をコードするために用いられる、一組の異
なるヌクレオチドトリプレット配列をいう。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセット
によって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であっ
て所望のアミノ酸群をコードする配列を含む。こうした一組のオリゴヌクレオチドは、例
えば固相法によって合成され得る。標準的なコドン指定形式はIUBコードのそれであり、
このコードは当技術分野で公知である。コドンセットは、一般的に3つの大文字、例えばN
NK、NNS、DVK、DVDなどで表される。
IUBコード
G グアニン
A アデニン
T チミン
C シトシン
R（AまたはG）
Y（CまたはT）
M（AまたはC）
K（GまたはT）
S（CまたはG）
W（AまたはT）
H（AまたはCまたはT）
B（CまたはGまたはT）
V（AまたはCまたはG）
D（AまたはGまたはT）
N（AまたはCまたはGまたはT）
例えば、コドンセットDVKでは、DはヌクレオチドAまたはGまたはTであり、VはAまたはG
またはCであり、KはGまたはTである。このコドンセットは18個の異なるコドンを表し、ア
ミノ酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、GlyおよびCysがコー
ドされ得る。
特定の位置に「縮重」ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの設計方法は本発明の
属する技術分野で公知である。（例えば、Garrard and Henner, Gene (1993) 128,
103-109等）。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセ
ットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどか
ら入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例え
ば、Life Technologies, Rockville, MD）。したがって、特定のコドンセットを有す
る合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドが
含まれる。また、本発明の非限定な態様として、例えばクローニングに役立つ制限酵素部
位も含まれ得る。
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は本明細書では同義で使われ、そのような呼
称には細胞または細胞系のすべての子孫が含まれ得る。このように、例えば、「形質転換
体」および「形質転換細胞」のような用語には、継代数に関係なくそれらに由来する一次
対象細胞および培養物が含まれる。また、故意または偶発的な突然変異によって、すべて
の子孫においてDNAの内容が正確に同一であるというわけではないこともまた理解される
。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、実質的に同じ機能または生物学的
活性を有する変異体の子孫も含まれ得る。異なった呼称を意図する記載である場合は、当
該記載の前後関係からそのような意図は明白となるであろう。
コード配列の発現に言及する場合の用語「制御配列」とは、特定の宿主生物で作用可能
に連結したコード配列の発現のために必要なDNA塩基配列をいう。例えば原核生物に好適
な制御配列には、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位
、およびおそらくはまだよく理解されていない他の配列が含まれる。真核細胞ではコード
配列の発現のために、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用
することが公知である。
核酸に関して「作用可能に連結した」は、その核酸が他の核酸配列と機能的な関係にあ
ることを意味する。例えば、プレシーケンス（presequence）または分泌リーダーのDNAは
、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、その
ポリペプチドのDNAと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、
それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。また
は、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配
列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したDNA配列が連続しており
、分泌リーダーの場合は連続して読取り枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサ
ーは連続する必要はない。連結は適切な制限部位でライゲーションによって達成される。
このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが
、従来の慣行に従って使用される。また前記のOverlap Extension PCRの手法によって
も連結された核酸が作製され得る。
「ライゲーション」は、2つの核酸断片の間でリン酸ジエステル結合を形成する方法で
ある。2つの断片のライゲーションのために、断片の末端は互いに適合していなければな
らない。場合によっては、この末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直ちに適合性を有す
る。しかし、ライゲーションに適合させるために、まずエンドヌクレアーゼ消化の後に一
般的に形成される付着末端は平滑末端に変えられる必要がある。平滑末端にするためには
、DNAが適切な緩衝液中で15℃にて少なくとも15分間、4つのデオキシリボヌクレオチド三
リン酸の存在下でDNAポリメラーゼＩまたはT4DNAポリメラーゼのクレノー断片の約10単位
で処理される。次にDNAがフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカ
精製によって精製される。連結すべきDNA断片が溶液に等モル量加えられる。この溶液に
は、ATP、リガーゼ緩衝に加え、T4DNAリガーゼのようなリガーゼがDNA0.5 μgにつき約1
0単位含まれる。DNAをベクターに連結する場合は、ベクターは適当な制限エンドヌクレア
ーゼによる消化作用によってまず線状にされる。線状にされた断片を次に細菌のアルカリ
ホスファターゼまたは仔ウシ腸管のホスファターゼで処理することによって、ライゲーシ
ョンのステップの間の当該断片のセルフライゲーションが予防される。
用語「コートタンパク質」はタンパク質のうち、少なくともその一部がウイルス粒子の
表面に存在するものをいう。機能上の観点からは、コートタンパク質は宿主細胞でのウイ
ルスの構築過程でウイルス粒子と結合する任意のタンパク質であり、ウイルスが他の宿主
細胞に感染するまでそれと結合したままである。コートタンパク質は、主要なコートタン
パク質であり得るし、マイナーなコートタンパク質でもあり得る。マイナーなコートタン
パク質は、通常ウイルスの外殻に存在するコートタンパク質であり、好ましくは1ビリオ
ンにつき少なくとも約5個、より好ましくは少なくとも約7個、より好ましくは少なくとも
約10個かそれ以上のタンパク質のコピーが存在する。主要なコートタンパク質は、1ビリ
オンにつき数十、数百または数千のコピーが存在し得る。主要なコートタンパク質の例と
しては、繊維状ファージのp8タンパク質が挙げられる。
特定の検定における、ある化学的な無機体、有機体、生物等の物体の「検出限界」とは
、その検定でバックグラウンドレベルより高く検出されるその物体の最小限の濃度をいう
。例えば、ファージELISAでは、特定の抗原結合断片を提示している特定のファージの「
検出限界」とは、その抗原結合断片を提示していない対照ファージによって生じたものよ
りも多くのELISAシグナルを特定のファージが生産するファージ濃度をいう。
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ
の粒子表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手
法である。ファージディスプレイの有用さは、ランダム化タンパク質変異体の大きなライ
ブラリから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速に、効率的に選別できることにある
。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリの提示は、何百万ものポリペプチド
を特異的結合特性に関してスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディ
スプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIとの融合を通して小さな
ランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた（WellsおよびLow
man（Curr.Opin.Struct.Biol. (1992) 3, 355-362）とその中の引用文献）。一価のフ
ァージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリが遺伝子IIIまたはそ
の一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の1個または0個のコピーを提示するよ
うに野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で、低レベルで発現される。アビディティー効
果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づ
いておりファージミドベクターが使われるが、このベクターはDNA操作を単純化する（Low
manおよびWells、Methods：A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3,
205-216）。
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばCo1E1およびバクテリオファージの遺伝
子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドはいかなる公知のバ
クテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムダ型バクテリオファージ
も適宜使用され得る。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これら
のベクターにクローニングされたDNA断片は、プラスミドとして増殖することができる。
これらのベクターが導入された細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子
を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミ
ドDNAの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性
または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドが
ファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子
と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファージミドを含む
。
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファー
ジの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形
成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファ
ージ、例えばM13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体、またはラムダ型ファージ、
例えばラムダ、21、phi80、phi81、82、424、434、その他もしくはその誘導体である。
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（例えば、固相手法、例えばEP266032に記載さ
れている手法を利用したリン酸トリエステル、亜リン酸塩、またはホスホラミダイト化学
、またはFroeshlerら（Nucl.Acids.Res. (1986) 14, 5399-5407）に記載されているデ
オキシヌクレオチドH-ホスホン酸塩中間体を通した方法）によって化学的に合成される短
い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。他の方法には、以下に記載
のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、および固体担体上のオリゴヌク
レオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Engelsら（Agnew.Chem.Int.Ed.Engl
. (1989) 28, 716-734）に記載されている。遺伝子のすべての核酸配列が公知ならば
、またはコード鎖と相補的な核酸の配列が利用できるならばこれらの方法が使われる。あ
るいは、対象アミノ酸配列が公知ならば、各アミノ酸残基の公知で好ましいコード残基を
使って可能な核酸配列が適宜推測され得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミド
ゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿法によって精製することができる。
用語「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」とは、共有結合で互いに結合され
た2つの部分を持つポリペプチドをいい、各部分は異なる特性を有するポリペプチドであ
る。この特性は、例えばin vitroまたはin vivo活性などの生物学的性質であり得る。
また、この特性は、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触
媒などでもあり得る。この2つの部分は、単一のペプチド結合によって直接、または1つま
たは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを介して結合され得る。通常、こ
の2つの部分とリンカーは同じ読取り枠中に存在する。好ましくは、ポリペプチドの2つの
部分は異種または異なるポリペプチドから得られる。
用語「異種DNA」とは、宿主細胞に導入される任意のDNAをいう。DNAは、ゲノムDNA、cD
NA、合成DNAおよびこれらの融合または組合せを含む様々な起源に由来し得る。DNAは、宿
主または受容細胞と同じ細胞または細胞型からのDNA、あるいは異なる細胞型、例えば哺
乳類または植物からのDNAを含み得る。DNAは任意選択にマーカーまたは選択遺伝子、例え
ば抗生物質耐性遺伝子、耐熱性遺伝子、その他を含み得る。
本明細書で使われるように、用語「非常に多様な位置」とは、公知のかつ/または天然
抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつ
かの異なるアミノ酸を持つ軽鎖および重鎖可変領域上のアミノ酸の位置をいう。非常に多
様な位置は一般的にCDR領域に存在する。一態様では、公知のかつ/または天然抗体の非常
に多様な位置を決定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological
Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) （1987年および1991
年）が提供するデータが有効である。また、インターネット上の複数のデータベース（ht
tp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html）では収集
された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置が提供されており、これらの配列とそ
の配置の情報は本発明における非常に多様な位置の決定に有用である。本発明によると、
アミノ酸がある位置で好ましくは約2から約20、好ましくは約3から約19、好ましくは約4
から約18、好ましくは5から17、好ましくは6から16、好ましくは7から15、好ましくは8か
ら14、好ましくは9から13、好ましくは10から12個の可能な異なるアミノ酸残基の多様性
を有する場合は、その位置は非常に多様といえる。いくつかの実施形態では、あるアミノ
酸位置は、好ましくは少なくとも約2、好ましくは少なくとも約4、好ましくは少なくとも
約6、好ましくは少なくとも約8、好ましくは約10、好ましくは約12の可能な異なるアミノ
酸残基の多様性を有し得る。本明細書においては、こうしたアミノ酸残基はフレキシブル
残基とも呼ばれる。用語「非ランダムコドンセット」とは、本明細書で記載されているア
ミノ酸選択のための基準を部分的に、好ましくは完全に満たす選択されたアミノ酸をコー
ドするコドンセットをいう。また、本明細書で使われるように、用語「ランダムコドンセ
ット」とは、20個のアミノ酸（Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe
/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I
、Val/V）のうち任意のアミノ酸をコードするコドンが組み合わされたコドンセットをい
う。
ライブラリ
ある一態様によれば、本発明は、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子
の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに含まれてい
る互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリを提供する。イオ
ン濃度の例としては金属イオン濃度や水素イオン濃度が好適に挙げられる。
本明細書において「ライブラリ」とは複数の抗原結合分子または抗原結合分子を含む複
数の融合ポリペプチド、もしくはこれらの配列をコードする核酸、ポリヌクレオチドをい
う。ライブラリ中に含まれる複数の抗原結合分子または抗原結合分子を含む複数の融合ポ
リペプチドの配列は単一の配列ではなく、互いに配列の異なる抗原結合分子または抗原結
合分子を含む融合ポリペプチドである。
本明細書において「金属イオン」とは、水素を除くアルカリ金属および銅族等の第I族
、アルカリ土類金属および亜鉛族等の第II族、ホウ素を除く第III族、炭素とケイ素を除
く第IV族、鉄族および白金族等の第VIII族、V、VIおよびVII族の各A亜族に属する元素と
、アンチモン、ビスマス、ポロニウム等の金属元素のイオンをいう。金属原子は原子価電
子を放出して陽イオンになる性質を有しており、これをイオン化傾向という。イオン化傾
向の大きい金属は、化学的に活性に富むとされる。
本発明で好適な金属イオンの例としてカルシウムイオンが挙げられる。カルシウムイオ
ンは多くの生命現象の調節に関与しており、骨格筋、平滑筋および心筋等の筋肉の収縮、
白血球の運動および貪食等の活性化、血小板の変形および分泌等の活性化、リンパ球の活
性化、ヒスタミンの分泌等の肥満細胞の活性化、カテコールアミンα受容体やアセチルコ
リン受容体を介する細胞の応答、エキソサイトーシス、ニューロン終末からの伝達物質の
放出、ニューロンの軸策流等にカルシウムイオンが関与している。細胞内のカルシウムイ
オン受容体として、複数個のカルシウムイオン結合部位を有し、分子進化上共通の起源か
ら由来したと考えられるトロポニンC、カルモジュリン、パルブアルブミン、ミオシン軽
鎖等が知られており、その結合モチーフも数多く知られている。例えば、カドヘリンドメ
イン、カルモジュリンに含まれるEFハンド、Protein kinase Cに含まれるC2ドメイン、
血液凝固タンパク質FactorIXに含まれるGlaドメイン、アシアログライコプロテインレセ
プターやマンノース結合レセプターに含まれるC型レクチン、LDL受容体に含まれるAドメ
イン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメインがよく知られて
いる。
本発明においては、金属イオンがカルシウムイオンの場合には、カルシウムイオン濃度
の条件として低カルシウムイオン濃度の条件と高カルシウムイオン濃度の条件が挙げられ
る。カルシウムイオン濃度の条件によって結合活性が変化するとは、低カルシウムイオン
濃度と高カルシウムイオン濃度の条件の違いによって抗原に対する抗原結合分子の結合活
性が変化することをいう。例えば、低カルシウムイオン濃度の条件下における抗原に対す
る抗原結合分子の結合活性よりも高カルシウムイオン濃度の条件下における抗原に対する
抗原結合分子の結合活性の方が高い場合が挙げられる。また、高カルシウムイオン濃度の
条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりも低カルシウムイオン濃度の条
件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い場合もまた挙げられる。
本明細書において、高カルシウムイオン濃度とはとくに一義的な数値に限定されるわけ
ではないが、好適には100μMから10 mMの間から選択される濃度であり得る。また、別の
態様では、200μMから5 mMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は500μMから2.5 mMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では200μMか
ら2 mMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに400μMから1.5 mMの間から選択さ
れる濃度でもあり得る。特に生体内の血漿中（血中）でのカルシウムイオン濃度に近い50
0μMから2.5 mMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
本明細書において、低カルシウムイオン濃度とはとくに一義的な数値に限定されるわけ
ではないが、好適には0.1μMから30μMの間から選択される濃度であり得る。また、別の
態様では、0.2μMから20μMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は0.5μMから10μMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では1μMから5μ
Mの間から選択される濃度でもあり得る。さらに2μMから4μMの間から選択される濃度で
もあり得る。特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μMか
ら5μMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
本発明において、抗原結合分子の低カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する
結合活性が高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性より低いとは、
抗原結合分子の0.1 μMから30μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に
対する結合活性が、100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原
に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子の0.5μMから10μ
Mの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、200μMから5
mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意
味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度における抗
原結合活性が、生体内の血漿中のカルシウムイオン濃度における抗原結合活性より弱いこ
とを意味し、具体的には、抗原結合分子の1μMから5μMの間から選択されるカルシウムイ
オン濃度での抗原に対する結合活性が、500μMから2.5 mMの間から選択されるカルシウ
ムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
金属イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化しているか
否かは公知の測定方法を使用することによって決定され得る。例えば、低カルシウムイオ
ン濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりも高カルシウムイオン
濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高く変化することを確
認するためには、低カルシウムイオン濃度および高カルシウムイオン濃度の条件下におけ
る抗原に対する抗原結合分子の結合活性が比較される。
さらに本発明において、「抗原結合分子の低カルシウムイオン濃度条件下における抗原
に対する結合活性が高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性より低
い」という表現は、抗原結合分子の高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する
結合活性が低カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性よりも高いと表
現することもできる。なお本発明においては、「低カルシウムイオン濃度条件下における
抗原結合活性が高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性より低い」
を「低カルシウムイオン濃度条件下における抗原結合能が高カルシウムイオン濃度条件下
における抗原に対する結合能よりも弱い」と記載する場合もあり、また、「低カルシウム
イオン濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に
対する結合活性より低下させる」を「低カルシウムイオン濃度条件下における抗原結合能
を高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合能よりも弱くする」と記載す
る場合もある。
抗原への結合活性を測定する際のカルシウムイオン濃度以外の条件は、当業者が適宜選
択することが可能であり、特に限定されない。例えば、HEPESバッファー、37℃の条件に
おいて測定することが可能である。例えば、Biacore（GE Healthcare）などを用いて測
定することが可能である。抗原結合分子と抗原との結合活性の測定は、抗原が可溶型抗原
である場合は、抗原結合分子を固定化したチップへ、抗原をアナライトとして流すことで
可溶型抗原への結合活性を評価することが可能であり、抗原が膜型抗原である場合は、抗
原を固定化したチップへ、抗原結合分子をアナライトとして流すことで膜型抗原への結合
活性を評価することが可能である。
本発明の抗原結合分子において、低カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する
結合活性が高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性よりも弱い限り
、低カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性と高カルシウムイオン濃
度条件下における抗原に対する結合活性の比は特に限定されないが、好ましくは抗原に対
する低カルシウムイオン濃度条件下におけるKD（Dissociation constant：解離定数）と
高カルシウムイオン濃度条件下におけるKDの比であるKD (Ca 3μM)/KD (Ca 2 mM)の
値が２以上であり、さらに好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 2 mM)の値が10以上であ
り、さらに好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 2 mM)の値が40以上である。KD (Ca 3
μM)/KD (Ca 2 mM)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限
り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。また、KD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 m
M)の値でも特定され得る。すなわち、KD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が２以上で
あり、さらに好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が10以上であり、さらに
好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が40以上である。KD (Ca 3μM)/KD
(Ca 1.2 mM)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、4
00、1000、10000等、いかなる値でもよい。
抗原に対する結合活性の値として、抗原が可溶型抗原の場合はKD（解離定数）を用いる
ことが可能であるが、抗原が膜型抗原の場合は見かけのKD（Apparent dissociation co
nstant：見かけの解離定数）を用いることが可能である。KD（解離定数）、および、見か
けのKD（見かけの解離定数）は、当業者公知の方法で測定することが可能であり、例えば
Biacore（GE healthcare）、スキャッチャードプロット、フローサイトメーター等を用
いることが可能である。
また、本発明の抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原に対する結合活性
と高カルシウム濃度条件下における抗原に対する結合活性の比を示す他の指標として、例
えば、解離速度定数であるkd（Dissociation rate constant：解離速度定数）もまた好
適に用いられ得る。結合活性の比を示す指標としてKD（解離定数）の代わりにkd（解離速
度定数）を用いる場合、抗原に対する低カルシウム濃度条件下におけるkd（解離速度定数
）と高カルシウム濃度条件下におけるkd（解離速度定数）の比であるkd（低カルシウム濃
度条件下）/kd（高カルシウム濃度条件下における）の値は、好ましくは2以上であり、さ
らに好ましくは5以上であり、さらに好ましくは10以上であり、より好ましくは30以上で
ある。kd（低カルシウム濃度条件下）/kd（高カルシウム濃度条件下における）の値の上
限は特に限定されず、当業者の技術常識において作製可能な限り、50、100、200等、いか
なる値でもよい。
抗原結合活性の値として、抗原が可溶型抗原の場合はkd（解離速度定数）を用いること
が可能であり、抗原が膜型抗原の場合は見かけのkd（Apparent dissociation rate co
nstant：見かけの解離速度定数）を用いることが可能である。kd（解離速度定数）、およ
び、見かけのkd（見かけの解離速度定数）は、当業者公知の方法で測定することが可能で
あり、例えばBiacore（GE healthcare）、フローサイトメーター等を用いることが可能
である。なお本発明において、異なるカルシウムイオン濃度における抗原結合分子の抗原
に対する結合活性を測定する際は、カルシウム濃度以外の条件は同一とすることが好まし
い。
本発明で、プロトンすなわち水素原子の原子核の濃度の条件は、水素指数（pH）の条件
とも同義に取り扱われる。水溶液中の水素イオンの活動量をaH+で表すと、pHは-log10aH+
と定義される。水溶液中のイオン強度が（例えば10-3より）低ければ、aH+は水素イオン
強度にほぼ等しい。例えば25℃、1気圧における水のイオン積はKw=aH+aOH=10-14であるた
め、純水ではaH+=aOH=10-7である。この場合のpH=7が中性であり、pHが7より小さい水溶
液は酸性、pHが7より大きい水溶液はアルカリ性である。
本発明においては、水素イオン濃度の条件としてpHの条件が用いられる場合には、pHの
条件としてpH酸性域の条件とpH中性域の条件が挙げられる。pHの条件によって結合活性が
変化するとは、pH酸性域とpH中性域の条件の違いによって抗原に対する抗原結合分子の結
合活性が変化することをいう。例えば、pH酸性域の条件下における抗原に対する抗原結合
分子の結合活性よりもpH中性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の
方が高い場合が挙げられる。また、pH中性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子
の結合活性よりもpH酸性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が
高い場合もまた挙げられる。
本明細書において、pH中性域とはとくに一義的な数値に限定されるわけではないが、好
適にはpH6.7からpH10.0の間から選択され得る。また、別の態様では、pH6.7からpH9.5の
間から選択され得る。また、異なる態様ではpH7.0からpH9.0の間から選択され得るし、ほ
かの態様ではpH7.0からpH8.0の間から選択され得る。特に生体内の血漿中（血中）でのpH
に近いpH7.4が好適に挙げられる。
本明細書において、pH酸性域とはとくに一義的な数値に限定されるわけではないが、好
適にはpH4.0からpH6.5の間から選択され得る。また、別の態様では、pH4.5からpH6.5の間
から選択され得る。また、異なる態様ではpH5.0からpH6.5の間から選択され得るし、ほか
の態様ではpH5.5からpH6.5の間から選択され得る。特に生体内の早期エンドソーム内での
pHに近いpH5.8が好適に挙げられる。
本発明において、抗原結合分子のpH酸性域条件下における抗原に対する結合活性がpH中
性域条件下における抗原に対する結合活性より低いとは、抗原結合分子のpH4.0からpH6.5
の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH10.0の間から選択され
るpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子のpH
4.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH9.5の間か
ら選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味し、より好ましくは、抗原
結合分子のpH5.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0か
らpH9.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。また
、好ましくは抗原結合分子のpH5.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合
活性が、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを
意味する。特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原結合活性が、
生体内の血漿中のpHにおける抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合
分子のpH5.8での抗原に対する結合活性が、pH7.4での抗原に対する結合活性より弱いこと
を意味する。
pHの条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化しているか否かは、例え
ば前記の異なるpHの条件下での結合活性の測定方法に準じて実施される。例えば、pH酸性
域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりもpH中性域の条件下におけ
る抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高く変化することを確認するためには、pH
酸性域およびpH中性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性が比較され
る。
さらに本発明において、「抗原結合分子のpH酸性域の条件下における抗原に対する結合
活性がpH中性域の条件下における抗原に対する結合活性より低い」という表現は、抗原結
合分子のpH中性域の条件下における抗原に対する結合活性がpH酸性域の条件下における抗
原に対する結合活性よりも高いと表現することもできる。なお本発明においては、「pH酸
性域の条件下における抗原結合活性がpH中性域の条件下における抗原に対する結合活性よ
り低い」を「pH酸性域の条件下における抗原結合能がpH中性域の条件下における抗原に対
する結合能よりも弱い」と記載する場合もあり、また、「pH酸性域の条件下における抗原
結合活性をpH中性域の条件下における抗原に対する結合活性より低下させる」を「pH酸性
域の条件下における抗原結合能をpH中性域の条件下における抗原に対する結合能よりも弱
くする」と記載する場合もある。
前記のようにイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化さ
せるアミノ酸残基の例として、例えば、金属イオンがカルシウムイオンである場合には、
カルシウム結合モチーフを形成するアミノ酸であれば、その種類は問わない。カルシウム
結合モチーフは、当業者に周知であり、詳細に記載されている（例えばSpringerら（Cell
(2000) 102, 275-277）、KawasakiおよびKretsinger（Protein Prof. (1995) 2, 3
05-490）、Moncriefら（J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562）、Chauvauxら（Bioch
em. J. (1990) 265, 261-265）、BairochおよびCox（FEBS Lett. (1990) 269, 4
54-456）、Davis（New Biol. (1990) 2, 410-419）、Schaeferら（Genomics (1995)
25, 638～643）、Economouら（EMBO J. (1990) 9, 349-354）、Wurzburgら（Stru
cture. (2006) 14, 6, 1049-1058））。すなわち、ASGPR, CD23、MBR、DC-SIGN等の
C型レクチン等の任意の公知のカルシウム結合モチーフが、本発明の抗原結合分子に含ま
れ得る。上記のほか、このようなカルシウム結合モチーフの好適な例として、後述される
ように、Vk5-2等の生殖細胞系列の配列を有する抗体の軽鎖可変領域に存在するVk5の部分
に含まれるカルシウム結合モチーフも挙げられ得る。
また、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変
化させるアミノ酸残基の例として、金属キレート作用を有するアミノ酸も好適に用いられ
る得る。金属キレート作用を有するアミノ酸の例として、例えばセリン（Ser（S））、ス
レオニン（Thr（T））、アスパラギン（Asn（N））、グルタミン（Gln（Q））、アスパラ
ギン酸（Asp（D））およびグルタミン酸（Glu（E））等が好適に挙げられる。
前記のアミノ酸残基が含まれる抗原結合ドメインの位置は特定の位置に限定されず、カ
ルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる限
り、抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域または軽鎖可変領域中のいずれの位置でも
あり得る。すなわち、本発明の一態様では、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に
対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が重鎖の抗原結合ドメインに含
まれている互いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
また、別の態様では、当該アミノ酸残基が重鎖のCDR3に含まれている互いに配列の異なる
抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。そのほかの態様では、当該アミ
ノ酸残基が重鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位および/または
101位に含まれている互いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提
供される。
また、本発明の一態様では、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結
合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が軽鎖の抗原結合ドメインに含まれている互
いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。また、別の態
様では、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR1に含まれている互いに配列の異なる抗原結合分子
から主としてなるライブラリが提供される。そのほかの態様では、当該アミノ酸残基が軽
鎖のCDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位および/または32位に含まれている互
いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
また、別の態様では、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR2に含まれている互いに配列の異な
る抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。そのほかの態様では、当該ア
ミノ酸残基が軽鎖のCDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれている互いに配列
の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
さらに別の態様では、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれている互いに配列の異な
る抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。そのほかの態様では、当該ア
ミノ酸残基が軽鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれている互いに配列
の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
また、当該アミノ酸残基が、前記に記載された軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3から選択さ
れる2つまたは3つのCDRに含まれている互いに配列の異なる抗原結合分子から主としてな
るライブラリもまた本発明の異なる態様として提供される。さらに、当該アミノ酸残基が
軽鎖のKabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位および/または92位のいずれ
かひとつ以上に含まれている互いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラ
リもまた提供される。
特に好適な実施形態では、抗原結合分子の軽鎖および/または重鎖可変領域のフレーム
ワーク配列は、ヒトの生殖細胞系フレームワーク配列を有していることが望ましい。した
がって、本発明の一態様においてフレームワーク配列が完全にヒトの配列であるならば、
ヒトに投与（例えば疾病の治療）された場合、本発明の抗原結合分子は免疫原性反応を殆
どあるいは全く引き起こさないと考えられる。上記の意味から、本発明の「生殖細胞系列
の配列を含む」とは、本発明のフレームワーク配列の一部が、いずれかのヒトの生殖細胞
系フレームワーク配列の一部と同一であることを意味する。例えば、本発明の抗原結合分
子の重鎖FR2の配列が複数の異なるヒトの生殖細胞系フレームワーク配列の重鎖FR2配列が
組み合わされた配列である場合も、本発明の「生殖細胞系列の配列を含む」抗原結合分子
である。
フレームワークの例としては、例えばV-Base（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）等
のウェブサイトに含まれている、現在知られている完全にヒト型のフレームワーク領域の
配列が好適に挙げられる。 これらのフレームワーク領域の配列が本発明の抗原結合分子
に含まれる生殖細胞系列の配列として適宜使用され得る。生殖細胞系列の配列はその類似
性にもとづいて分類され得る（Tomlinsonら（J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798
）WilliamsおよびWinter（Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461）およびCoxら
（Nat. Genetics (1994) 7, 162-168））。 7つのサブグループに分類されるVκ１
０のサブグループに分類されるVλ、7つのサブグループに分類されるVHから好適な生殖細
胞系列の配列が適宜選択され得る。
完全にヒト型のVH配列は、下記のみに限定されるものではないが、例えばVH1サブグル
ープ（例えば、VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-6
9）、VH2サブグループ（例えば、VH2-5、VH2-26、VH2-70）、VH3サブグループ（VH3-7、V
H3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH
3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH
3-74）、VH4サブグループ（VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61）
、VH5サブグループ（VH5-51）、VH6サブグループ（VH6-1）、VH7サブグループ（VH7-4、V
H7-81）のVH配列等が好適に挙げられる。これらは公知文献（Matsudaら（J. Exp. Med.
(1998) 188, 1973-1975））等にも記載されており、当業者はこれらの配列情報をも
とに本発明の抗原結合分子を適宜設計することが可能である。これら以外の完全にヒト型
のフレームワークまたはフレームワークの準領域も好適に使用され得る。
完全にヒト型のVK配列は、下記のみに限定されるものではないが、例えばVk1サブグル
ープに分類されるA20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22
、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、Vk2サブグループに分類されるA1、A2、A3、A5
、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、Vk3サブグループに分類されるA11、A27、L2、L6、
L10、L16、L20、L25、Vk4サブグループに分類されるB3、Vk5サブグループに分類されるB2
（本明細書においてはVk5-2とも指称される））、VK6サブグループに分類されるA10、A14
、A26等（Kawasakiら（Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028）、Schableおよび
Zachau（Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022）およびBrensing-Kup
persら（Gene (1997) 191, 173-181））が好適に挙げられる。
完全にヒト型のVL配列は、下記のみに限定されるものではないが、例えばVL1サブグル
ープに分類されるV1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、
V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、VL2サブグループに分類されるV2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V
2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、VL3サブグループに分類されるV3-2、V3-3、
V3-4、VL4サブグループに分類されるV4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、VL5サブグループに
分類されるV5-1、V5-2、V5-4、V5-6等（Kawasakiら（Genome Res. (1997) 7, 250-26
1））が好適に挙げられる。
通常これらのフレームワーク配列は一またはそれ以上のアミノ酸残基の相違により互い
に異なっている。これらのフレームワーク配列は本発明の「イオン濃度の条件によって抗
原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」と共に
使用され得る。本発明の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活
性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」と共に使用される完全にヒト型のフレー
ムワークの例としては、これだけに限定されるわけではないが、ほかにもKOL、NEWM、REI
、EU、TUR、TEI、LAY、POM等が挙げられる（例えば、Kabatら (1991)およびWuら（J. E
xp. Med. (1970) 132, 211-250））。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、生殖細胞系の配列の使用がほとんど
の個人において有害な免疫反応を排除すると期待されている一つの理由は、以下の通りで
あると考えられている。通常の免疫反応中に生じる親和性成熟ステップの結果、免疫グロ
ブリンの可変領域に体細胞の突然変異が頻繁に生じる。これらの突然変異は主にその配列
が超可変的であるCDRの周辺に生じるが、フレームワーク領域の残基にも影響を及ぼす。
これらのフレームワークの突然変異は生殖細胞系の遺伝子には存在せず、また患者の免疫
原性になる可能性は少なくないとも考えられる。一方、通常のヒトの集団は生殖細胞系の
遺伝子によって発現されるフレームワーク配列の大多数にさらされており、免疫寛容の結
果、これらの生殖細胞系のフレームワークは患者において免疫原性が低いあるいは非免疫
原性であると予想される。免疫寛容の可能性を最大にするため、可変領域をコード化する
遺伝子が普通に存在する機能的な生殖細胞系遺伝子の集合から選択され得る。
本発明の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させ
る少なくとも一つのアミノ酸残基」が前記のフレームワーク配列に含まれる抗原結合分子
を作製するために部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得
る。
例えば、「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させ
る少なくとも一つのアミノ酸残基」が予め含まれているフレームワーク配列として選択さ
れた軽鎖可変領域と、ランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域
とを組み合わせることによって本発明の複数の互いに配列の異なる抗原結合分子を含むラ
イブラリが作製され得る。このような非限定的な例として、イオン濃度がカルシウムイオ
ン濃度である場合には、例えば、配列番号：１（Vk5-2）に記載された軽鎖可変領域配列
とランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせたラ
イブラリが好適に挙げられる。上記のVk5-2等の生殖細胞系列の配列を有する抗体の軽鎖
可変領域に存在するVk5のドメインを含む軽鎖可変領域配列の好適な例として、配列番号
：１（Vk5-2）に記載された軽鎖可変領域配列のほかに、後述される配列番号：２で表さ
れるVk5-2バリアント１または配列番号：３で表されるVk5-2バリアント２等も適宜使用さ
れる。これらの分子に含まれる「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の
結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」を含むVk5-2の部分が、本発明の
カルシウム結合モチーフを含むドメインとして使用され得る。本発明の非限定の一態様で
は、カルシウム結合モチーフを形成する少なくとも一つのアミノ酸が本発明の「イオン濃
度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのア
ミノ酸残基」として使用され得る。
また、前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化
させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が予め含まれているフレームワーク配列として選
択された軽鎖可変領域の配列に、当該アミノ酸残基以外の残基として多様なアミノ酸が含
まれるように設計することも可能である。本発明においてそのような残基は、フレキシブ
ル残基と指称される。本発明の抗原結合分子の抗原に対する結合活性が、イオン濃度の条
件によって変化する限り、当該フレキシブル残基の数および位置は特定の態様に限定され
ることはない。すなわち、重鎖および/または軽鎖のCDR配列および/またはFR配列に一つ
またはそれ以上のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオ
ン濃度である場合には、配列番号：１（Vk5-2）に記載された軽鎖可変領域配列に導入さ
れるフレキシブル残基の非限定的な例として、表13、表14、表17または表18に記載された
アミノ酸残基が挙げられる。
また、前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化
させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域とランダム化可変領域
配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせることによっても、本発明
の複数の互いに配列の異なる抗原結合分子を含むライブラリが作製され得る。このような
非限定的な例として、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である場合には、例えば、配列
番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号：８（Vk3）、配列番号：９（Vk4）等
の生殖細胞系列の特定の残基が「カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原
結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」に置換された軽鎖可変
領域配列とランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合
わせたライブラリが好適に挙げられる。当該アミノ酸残基の非限定な例として軽鎖のCDR1
に含まれるアミノ酸残基が例示される。ほかにも、当該アミノ酸残基の非限定な例として
軽鎖のCDR2に含まれるアミノ酸残基が例示される。また、当該アミノ酸残基の非限定な別
の例として軽鎖のCDR3に含まれるアミノ酸残基もまた例示される。
前記のように、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR1に含まれるアミノ酸残基の非限定な例と
して、軽鎖可変領域のCDR1中のKabatナンバリングで表される30位、31位、および/または
32位のアミノ酸残基が挙げられる。また、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR2に含まれるアミ
ノ酸残基の非限定な例として、軽鎖可変領域のCDR2中のKabatナンバリングで表される50
位のアミノ酸残基が挙げられる。さらに、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれアミノ
酸残基の非限定な例として、軽鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される92位
のアミノ酸残基が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフ
を形成し、および/または、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合
分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらの
アミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。また、複数個のカルシウムイオン結合部
位を有し、分子進化上共通の起源から由来したと考えられるトロポニンC、カルモジュリ
ン、パルブアルブミン、ミオシン軽鎖等が知られており、その結合モチーフが含まれるよ
うに軽鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3を設計することも可能である。例えば、上記の目
的でカドヘリンドメイン、カルモジュリンに含まれるEFハンド、Protein kinase Cに含
まれるC2ドメイン、血液凝固タンパク質FactorIXに含まれるGlaドメイン、アシアログラ
イコプロテインレセプターやマンノース結合レセプターに含まれるC型レクチン、LDL受容
体に含まれるAドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメ
インが適宜使用され得る。
前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる
少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域とランダム化可変領域配列ラ
イブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせる場合でも、前記と同様に、フレ
キシブル残基が当該軽鎖可変領域の配列に含まれるように設計することも可能である。本
発明の抗原結合分子の抗原に対する結合活性が、イオン濃度の条件によって変化する限り
、当該フレキシブル残基の数および位置は特定の態様に限定されることはない。すなわち
、重鎖および/または軽鎖のCDR配列および/またはFR配列に一つまたはそれ以上のフレキ
シブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である場合には、
軽鎖可変領域配列に導入されるフレキシブル残基の非限定的な例として、表13、表14、表
17または表18に記載されたアミノ酸残基が挙げられる。
組み合わされる重鎖可変領域の例として、ランダム化可変領域ライブラリが好適に挙げ
られる。ランダム化可変領域ライブラリの作製方法は公知の方法が適宜組み合わされる。
本発明の非限定な一態様では、特定の抗原で免疫された動物、感染症患者やワクチン接種
して血中抗体価が上昇したヒト、癌患者、自己免疫疾患のリンパ球由来の抗体遺伝子をも
とに構築された免疫ライブラリが、ランダム化可変領域ライブラリとして好適に使用され
得る。
また、本発明の非限定な一態様では、ゲノムDNA におけるV 遺伝子や再構築され機能
的なV遺伝子のCDR配列が、適当な長さのコドンセットをコードする配列を含む合成オリゴ
ヌクレオチドセットで置換された合成ライブラリもまた、ランダム化可変領域ライブラリ
として好適に使用され得る。この場合、重鎖のCDR3の遺伝子配列の多様性が観察されるこ
とから、CDR3の配列のみを置換することもまた可能である。抗原結合分子の可変領域にお
いてアミノ酸の多様性を生み出す基準は、抗原結合分子の表面に露出した位置のアミノ酸
残基に多様性を持たせることである。表面に露出した位置とは、抗原結合分子の構造、構
造アンサンブル、および/またはモデル化された構造にもとづいて、表面露出が可能、か
つ/または抗原との接触が可能と判断される位置のことをいうが、一般的にはそのCDRであ
る。好ましくは、表面に露出した位置は、InsightIIプログラム（Accelrys）のようなコ
ンピュータプログラムを用いて、抗原結合分子の3次元モデルからの座標を使って決定さ
れる。表面に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、LeeおよびRic
hards（J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400）、Connolly（J.Appl.Cryst. (1983) 16,
548-558））を使用して決定され得る。表面に露出した位置の決定は、タンパク質モデ
リングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行われ得る
。このような目的のために利用できるソフトウェアとして、SYBYL生体高分子モジュール
ソフトウェア（Tripos Associates）が好適に挙げられる。一般的に、また好ましくは、
アルゴリズムがユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使わ
れるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。さらに、パ
ーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した表面に露出した領域およびエリアの決
定法が、Pacios（Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386およびJ.Mol.Model. (1995
) 1, 46-53）に記載されている。
さらに、本発明の非限定な一態様では、健常人のリンパ球由来の抗体遺伝子から構築さ
れ、そのレパートリーにバイアスを含まない抗体配列であるナイーブ配列からなるナイー
ブライブラリもまた、ランダム化可変領域ライブラリとして特に好適に使用され得る（Ge
jimaら（Human Antibodies (2002) 11,121-129）およびCardosoら（Scand. J. Immu
nol. (2000) 51, 337-344））。本発明で記載されるナイーブ配列を含むアミノ酸配列
とは、このようなナイーブライブラリから取得されるアミノ酸配列をいう。
本発明の一つの態様では、「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結
合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が予め含まれているフレームワーク
配列として選択された重鎖可変領域と、ランダム化可変領域配列ライブラリとして作製さ
れた軽鎖可変領域とを組み合わせることによって本発明の複数の互いに配列の異なる抗原
結合分子を含むライブラリが作製され得る。このような非限定的な例として、イオン濃度
がカルシウムイオン濃度である場合には、例えば、配列番号：１０（6RL#9H-IgG1）また
は配列番号：１１（6KC4-1#85H-IgG1）に記載された重鎖可変領域配列とランダム化可変
領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域とを組み合わせたライブラリが好適に
挙げられる。また、ランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域の
代わりに、生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域の中から適宜選択することによって
作製され得る。例えば、配列番号：１０（6RL#9H-IgG1）または配列番号：１１（6KC4-1#
85H-IgG1）に記載された重鎖可変領域配列と生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域と
を組み合わせたライブラリが好適に挙げられる。
また、前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化
させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が予め含まれているフレームワーク配列として選
択された重鎖可変領域の配列に、フレキシブル残基が含まれるように設計することも可能
である。本発明の抗原結合分子の抗原に対する結合活性が、イオン濃度の条件によって変
化する限り、当該フレキシブル残基の数および位置は特定の態様に限定されることはない
。すなわち、重鎖および/または軽鎖のCDR配列および/またはFR配列に一つまたはそれ以
上のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である
場合には、配列番号：１０（6RL#9H-IgG1）に記載された重鎖可変領域配列に導入される
フレキシブル残基の非限定的な例として、重鎖CDR1およびCDR2の全てのアミノ酸残基のほ
か重鎖CDR3の95位、96位および/または100a位以外のCDR3のアミノ酸残基が挙げられる。
または配列番号：１１（6KC4-1#85H-IgG1）に記載された重鎖可変領域配列に導入される
フレキシブル残基の非限定的な例として、重鎖CDR1およびCDR2の全てのアミノ酸残基のほ
か重鎖CDR3の95位および/または101位以外のCDR3のアミノ酸残基もまた挙げられる。
また、前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化
させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された重鎖可変領域とランダム化可変領域
配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域または生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可
変領域とを組み合わせることによっても、本発明の複数の互いに配列の異なる抗原結合分
子を含むライブラリが作製され得る。このような非限定的な例として、イオン濃度がカル
シウムイオン濃度である場合には、例えば、重鎖可変領域の特定の残基が「カルシウムイ
オン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一
つのアミノ酸残基」に置換された重鎖可変領域配列とランダム化可変領域配列ライブラリ
として作製された軽鎖可変領域または生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域とを組み
合わせたライブラリが好適に挙げられる。当該アミノ酸残基の非限定な例として重鎖のCD
R1に含まれるアミノ酸残基が例示される。ほかにも、当該アミノ酸残基の非限定な例とし
て重鎖のCDR2に含まれるアミノ酸残基が例示される。また、当該アミノ酸残基の非限定な
別の例として重鎖のCDR3に含まれるアミノ酸残基もまた例示される。当該アミノ酸残基が
重鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基の非限定な例として、重鎖可変領域のCDR3中のKabatナ
ンバリングで表される95位、96位、100a位および/または101位のアミノ酸が挙げられる。
また、これらのアミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフを形成し、および/または、カ
ルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化する限り
、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わさ
れて含まれ得る。
前記の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる
少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された重鎖可変領域とランダム化可変領域配列ラ
イブラリとして作製された軽鎖可変領域または生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域
とを組み合わせる場合でも、前記と同様に、フレキシブル残基が当該重鎖可変領域の配列
に含まれるように設計することも可能である。本発明の抗原結合分子の抗原に対する結合
活性が、イオン濃度の条件によって変化する限り、当該フレキシブル残基の数および位置
は特定の態様に限定されることはない。すなわち、重鎖のCDR配列および/またはFR配列に
一つまたはそれ以上のフレキシブル残基が含まれ得る。また、「イオン濃度の条件によっ
て抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基」以外の重鎖可変領域
のCDR1、CDR2および/またはCDR3のアミノ酸配列としてランダム化可変領域ライブラリも
好適に使用され得る。軽鎖可変領域として生殖細胞系列の配列が用いられる場合には、例
えば、配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号：８（Vk3）、配列番号：
９（Vk4）等の生殖細胞系列の配列が非限定な例として挙げられ得る。
前記の、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を
変化させるアミノ酸残基としては、カルシウム結合モチーフを形成する限り、いずれのア
ミノ酸残基も好適に使用され得るが、そのようなアミノ酸残基としては具体的に電子供与
性を有するアミノ酸が挙げられる。こうした電子供与性を有するアミノ酸としては、セリ
ン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸が好適
に例示される。
本発明の一つの態様として、「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分
子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域と
ランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせること
によっても、本発明の複数の互いに配列の異なる抗原結合分子を含むライブラリが作製さ
れ得る。
当該アミノ酸残基の非限定な例として軽鎖のCDR1に含まれるアミノ酸残基が例示される
。ほかにも、当該アミノ酸残基の非限定な例として軽鎖のCDR2に含まれるアミノ酸残基が
例示される。また、当該アミノ酸残基の非限定な別の例として軽鎖のCDR3に含まれるアミ
ノ酸残基もまた例示される。
前記のように、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR1に含まれるアミノ酸残基の非限定な例と
して、軽鎖可変領域のCDR1中のKabatナンバリングで表される24位、27位、28位、30位、3
1位、32位および/または34位のアミノ酸残基が挙げられる。また、当該アミノ酸残基が軽
鎖のCDR2に含まれるアミノ酸残基の非限定な例として、軽鎖可変領域のCDR2中のKabatナ
ンバリングで表される50位、51位、52位、53位、54位、55位および/または56位のアミノ
酸残基が挙げられる。さらに、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基の非
限定な例として、軽鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される89位、90位、91
位、92位、93位、94および/または95a位のアミノ酸残基が挙げられる。また、これらのア
ミノ酸残基が、水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変
化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上
組み合わされて含まれ得る。
前記の「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化さ
せる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域とランダム化可変領域配
列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせる場合でも、前記と同様に、
フレキシブル残基が当該軽鎖可変領域の配列に含まれるように設計することも可能である
。本発明の抗原結合分子の抗原に対する結合活性が、水素イオン濃度の条件によって変化
する限り、当該フレキシブル残基の数および位置は特定の態様に限定されることはない。
すなわち、重鎖および/または軽鎖のCDR配列および/またはFR配列に一つまたはそれ以上
のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、軽鎖可変領域配列に導入されるフレキシブル
残基の非限定的な例として、表4または表5に記載されたアミノ酸残基が挙げられる。また
、水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミ
ノ酸残基やフレキシブル残基以外の軽鎖可変領域のアミノ酸配列としては、非限定な例と
してVk1（配列番号：６）、Vk2（配列番号：７）、Vk3（配列番号：８）、Vk4（配列番号
：９）等の生殖細胞系列の配列が好適に使用され得る。
組み合わされる重鎖可変領域の例として、ランダム化可変領域ライブラリが好適に挙げ
られる。ランダム化可変領域ライブラリの作製方法は公知の方法が適宜組み合わされる。
本発明の非限定な一態様では、特定の抗原で免疫された動物、感染症患者やワクチン接種
して血中抗体価が上昇したヒト、癌患者、自己免疫疾患のリンパ球由来の抗体遺伝子をも
とに構築された免疫ライブラリが、ランダム化可変領域ライブラリとして好適に使用され
得る。
また、本発明の非限定な一態様では、前記と同様に、ゲノムDNA におけるV 遺伝子や
再構築され機能的なV遺伝子のCDR配列が、適当な長さのコドンセットをコードする配列を
含む合成オリゴヌクレオチドセットで置換された合成ライブラリもまた、ランダム化可変
領域ライブラリとして好適に使用され得る。
さらに、本発明の非限定な一態様では、健常人のリンパ球由来の抗体遺伝子から構築さ
れ、そのレパートリーにバイアスを含まない抗体配列であるナイーブ配列からなるナイー
ブライブラリもまた、ランダム化可変領域ライブラリとして特に好適に使用され得る（Ge
jimaら（Human Antibodies (2002) 11,121-129）およびCardosoら（Scand. J. Immu
nol. (2000) 51, 337-344））。
本発明の別の態様として、「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子
の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された重鎖可変領域とラ
ンダム化可変領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域または生殖細胞系列の配
列を有する軽鎖可変領域とを組み合わせることによっても、本発明の複数の互いに配列の
異なる抗原結合分子を含むライブラリが作製され得る。このような非限定的な例として、
例えば、重鎖可変領域の特定の残基が「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原
結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」に置換された重鎖可変
領域配列とランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域または生殖
細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域とを組み合わせたライブラリが好適に挙げられる。
当該アミノ酸残基の非限定な例として重鎖のCDR1に含まれるアミノ酸残基が例示される。
ほかにも、当該アミノ酸残基の非限定な例として重鎖のCDR2に含まれるアミノ酸残基が例
示される。また、当該アミノ酸残基の非限定な別の例として重鎖のCDR3に含まれるアミノ
酸残基もまた例示される。
当該アミノ酸残基が重鎖のCDR1に含まれアミノ酸残基の非限定な例として、重鎖可変領
域のCDR1中のKabatナンバリングで表される27位、31位、32位、33位および/または35位の
アミノ酸が挙げられる。重鎖のCDR2に含まれアミノ酸残基の非限定な例として、重鎖可変
領域のCDR2中のKabatナンバリングで表される50位、52位、53位、55位、57位、58位、59
位、61位および/または62位のアミノ酸が挙げられる。重鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基
の非限定な例として、重鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される95位、96位
、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位および/または10
7位のアミノ酸が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、水素イオン濃度の条件に
よって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単
独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。
前記の「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化さ
せる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された重鎖可変領域とランダム化可変領域配
列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域または生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変
領域とを組み合わせる場合でも、前記と同様に、フレキシブル残基が当該重鎖可変領域の
配列に含まれるように設計することも可能である。本発明の抗原結合分子の抗原に対する
結合活性が、水素イオン濃度の条件によって変化する限り、当該フレキシブル残基の数お
よび位置は特定の態様に限定されることはない。すなわち、重鎖のCDR配列および/または
FR配列に一つまたはそれ以上のフレキシブル残基が含まれ得る。また、「水素イオン濃度
の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基」以外の
重鎖可変領域のCDR1、CDR2および/またはCDR3のアミノ酸配列としてランダム化可変領域
ライブラリも好適に使用され得る。また、軽鎖可変領域として生殖細胞系列の配列が用い
られる場合には、例えば、配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号：８（
Vk3）、配列番号：９（Vk4）等の生殖細胞系列の配列が非限定な例として挙げられ得る。
前記の、水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化さ
せるアミノ酸残基としては、いずれのアミノ酸残基も好適に使用され得るが、そのような
アミノ酸残基としては、具体的に側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸が挙げられる。こう
した電子供与性を有するアミノ酸としては、ヒスチジンまたはグルタミン酸等の天然のア
ミノ酸のほか、ヒスチジンアナログ（US20090035836）もしくはm-NO2-Tyr（pKa 7.45）
、3,5-Br2-Tyr（pKa 7.21）または3,5-I2-Tyr（pKa 7.38）等の非天然のアミノ酸（Bio
org.Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768が好適に例示される。また、当該アミ
ノ酸残基の特に好適な例としては、側鎖のpKaが5.5-7.0であるアミノ酸が挙げられる。こ
うした電子供与性を有するアミノ酸としては、ヒスチジンが好適に例示される。
抗原結合ドメインのアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR
等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するア
ミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys
. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2
003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバー
コドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれ
る無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる
。
組み合わされる軽鎖可変領域の例として、ランダム化可変領域ライブラリが好適に挙げ
られる。ランダム化可変領域ライブラリの作製方法は公知の方法が適宜組み合わされる。
本発明の非限定な一態様では、特定の抗原で免疫された動物、感染症患者やワクチン接種
して血中抗体価が上昇したヒト、癌患者、自己免疫疾患のリンパ球由来の抗体遺伝子をも
とに構築された免疫ライブラリが、ランダム化可変領域ライブラリとして好適に使用され
得る。
また、本発明の非限定な一態様では、ゲノムDNA におけるV 遺伝子や再構築され機能
的なV遺伝子のCDR配列が、適当な長さのコドンセットをコードする配列を含む合成オリゴ
ヌクレオチドセットで置換された合成ライブラリもまた、ランダム化可変領域ライブラリ
として好適に使用され得る。この場合、重鎖のCDR3の遺伝子配列の多様性が観察されるこ
とから、CDR3の配列のみを置換することもまた可能である。抗原結合分子の可変領域にお
いてアミノ酸の多様性を生み出す基準は、抗原結合分子の表面に露出した位置のアミノ酸
残基に多様性を持たせることである。表面に露出した位置とは、抗原結合分子の構造、構
造アンサンブル、および/またはモデル化された構造にもとづいて、表面に露出が可能、
かつ/または抗原との接触が可能と判断される位置のことをいうが、一般的にはそのCDRで
ある。好ましくは、表面に露出した位置は、InsightIIプログラム（Accelrys）のような
コンピュータプログラムを用いて、抗原結合分子の3次元モデルからの座標を使って決定
される。表面に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、LeeおよびR
ichards（J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400）、Connolly（J. Appl. Cryst. (
1983) 16, 548-558））を使用して決定され得る。表面に露出した位置の決定は、タン
パク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って
行われ得る。このような目的のために利用できるソフトウェアとして、SYBYL生体高分子
モジュールソフトウェア（Tripos Associates）が好適に挙げられる。一般的に、また好
ましくは、アルゴリズムがユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算に
おいて使われるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。
さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した表面に露出した領域および
エリアの決定法が、Pacios（Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386およびJ. Mol
. Model. (1995) 1,46-53）に記載されている。
さらに、本発明の非限定な一態様では、健常人のリンパ球由来の抗体遺伝子から構築さ
れ、そのレパートリーにバイアスを含まない抗体配列であるナイーブ配列からなるナイー
ブライブラリもまた、ランダム化可変領域ライブラリとして特に好適に使用され得る（Ge
jimaら（Human Antibodies (2002) 11,121-129）およびCardosoら（Scand. J. Immu
nol. (2000) 51, 337-344））。
イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸
残基以外のアミノ酸としては、本発明の抗原結合分子が抗原に結合する限り任意のアミノ
酸が使用され得るが、好適な例としてJ. D. Marksら（J. Mol. Biol. (1991) 222,
581-597）等の公知の抗体ファージディスプレイライブラリ技術が適宜適用され得る。
すなわち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる
アミノ酸残基以外のアミノ酸配列として、上記の抗体ファージライブラリで採用される。
本発明の、互いに配列の異なる複数の抗原結合分子という記載における「互いに配列の
異なる」との用語は、ライブラリ中の個々の抗原結合分子の配列が相互に異なることを意
味する。すなわち、ライブラリ中における互いに異なる配列の数は、ライブラリ中の配列
の異なる独立クローンの数が反映され、「ライブラリサイズ」と指称される場合もある。
通常のファージディスプレイライブラリでは106から1012であり、リボゾームディスプレ
イ法等の公知の技術を適用することによってライブラリサイズを1014まで拡大することが
可能である。しかしながら、ファージライブラリのパンニング選択時に使用されるファー
ジ粒子の実際の数は、通常、ライブラリサイズよりも10ないし10,000倍大きい。この過剰
倍数は、「ライブラリ当量数」とも呼ばれるが、同じアミノ酸配列を有する個々のクロー
ンが10ないし10,000存在し得ることを表す。よって本発明における「互いに配列の異なる
」との用語はライブラリ当量数が除外されたライブラリ中の個々の抗原結合分子の配列が
相互に異なること、より具体的には互いに配列の異なる抗原結合分子が106から1014分子
、好ましくは107から1012分子、さらに好ましくは108から1011特に好ましくは108から101
0存在することを意味する。
また、本発明の、複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリという記載における
「複数の」との用語は、例えば本発明の抗原結合分子、融合ポリペプチド、ポリヌクレオ
チド分子、ベクターまたはウイルスは、通常、その物質の2つ以上の種類の集合を指す。
例えば、ある2つ以上の物質が特定の形質に関して互いに異なるならば、その物質には2種
類以上が存在することを表す。例としては、アミノ酸配列中の特定のアミノ酸位置で観察
される変異体アミノ酸が挙げられ得る。例えば、フレキシブル残基以外、または表面に露
出した非常に多様なアミノ酸位置の特定の変異体アミノ酸以外は実質的に同じ、好ましく
は同一の配列である本発明の2つ以上の抗原結合分子がある場合、本発明の抗原結合分子
は複数個存在する。他の実施例では、フレキシブル残基をコードする塩基以外、または表
面に露出した非常に多様なアミノ酸位置の特定の変異体アミノ酸をコードする塩基以外は
実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の2つ以上のポリヌクレオチド分子が
あるならば、本発明のポリヌクレオチド分子は複数個存在する。
さらに、本発明の、複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリという記載におけ
る「から主としてなる」との用語は、ライブラリ中の配列の異なる独立クローンの数のう
ち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が異なっている抗原
結合分子の数が反映される。具体的には、そのような結合活性を示す抗原結合分子がライ
ブラリ中に少なくとも104分子存在することが好ましい。また、より好ましくは、本発明
はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくとも105分子存在するライブラリを提
供する。さらに好ましくは、本発明はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくと
も106分子存在するライブラリを提供する。特に好ましくは、本発明はそのような結合活
性を示す抗原結合分子が少なくとも107分子存在するライブラリを提供する。また、好ま
しくは、本発明はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくとも108分子存在する
ライブラリを提供する。別の表現では、ライブラリ中の配列の異なる独立クローンの数の
うち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が異なっている抗
原結合分子の割合としても好適に表現され得る。具体的には、本発明は、そのような結合
活性を示す抗原結合分子がライブラリ中の配列の異なる独立クローンの数の0.1％から80
％、好ましくは0.5％から60％、より好ましくは1％から40％、さらに好ましくは2％から2
0％、特に好ましくは4％から10％含まれるライブラリを提供する。融合ポリペプチド、ポ
リヌクレオチド分子またはベクターの場合も、上記と同様、分子の数や分子全体における
割合で表現され得る。また、ウイルスの場合も、上記と同様、ウイルス個体の数や個体全
体における割合で表現され得る。
抗原結合分子を含む融合ポリペプチド
本発明における一つの実施形態では、本発明の抗原結合分子と異種ポリペプチドとの融
合分子が作製され得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドはウイルスコートタンパク
質、例えばpIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびその変異体からなる群か
ら選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合され得る。
ある実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ScFv、Fab断片、F(ab)2またはF(ab’)2
であり得るため、別の一つの実施形態では、これらの抗原結合分子と異種ポリペプチドと
の融合分子であって互いに配列の異なる複数の融合分子から主としてなるライブラリが提
供される。具体的には、これらの抗原結合分子とウイルスコートタンパク質、例えばpIII
、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびその変異体からなる群から選択されるウ
イルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合された融合タンパク質であって互いに配
列の異なる複数の融合分子から主としてなるライブラリが提供される。本発明の抗原結合
分子はさらに二量体化ドメインを含み得る。ある実施形態では、前記二量体化ドメインは
抗体の重鎖または軽鎖の可変領域とウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との間に
存在し得る。この二量体化ドメインには、二量体化配列の少なくとも1つ、および/または
1つまたは複数のシステイン残基を含む配列が含まれ得る。この二量体化ドメインは、好
ましくは重鎖可変領域または定常領域のC末端と連結され得る。二量体化ドメインは、前
記抗体可変領域がウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質成分として作製さ
れている（二量体化ドメインの後ろにアンバー終止コドンを有さない）かどうかによって
、または、前記抗体可変領域が主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに作製されて
いる（例えば、二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有する）かどうかによって
、様々な構造をとることが可能である。前記抗体可変領域が主にウイルスのコートタンパ
ク質成分との融合タンパク質として作製されるときは、1つまたは複数のジスルフィド結
合および/または単一の二量体化配列によって二価提示がもたらされる。本発明の抗原結
合分子が、主にウイルスのコートタンパク質成分と融合されずに作製される抗体可変領域
である（例えば、アンバー終止コドンを有する）場合、システイン残基と二量体化配列の
両方を含んでいる二量体化ドメインを持つことが好ましい。ある実施形態では、F(ab)2の
重鎖は、ヒンジ領域を含まない二量体化ドメインによって二量体化される。この二量体化
ドメインには、例えば公知であるGCN4配列：GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG（配
列番号：１２）等のロイシンジッパー配列が含まれ得る。
抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド
抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを作製するために用いられるオリゴヌクレ
オチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成され得る。例えば、コドン
セットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを含み、所
望のアミノ酸群をコードする配列を含む一組のオリゴヌクレオチドが固相法によって合成
され得る。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、
一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコド
ンセットによるものである。ある位置での選択された「縮重」ヌクレオチドを有するオリ
ゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを
有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems
）を使って合成され得るし、またはその市販品が入手され得る（例えば、Life Technolo
gies）。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸鋳型へのハ
イブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部
位を含み得る。
ライブラリは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを用いることによって生成さ
れ得る。各オリゴヌクレオチドセットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコド
ンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを有する。上
流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、PCR産
物の「ライブラリ」を作製するために使用され得る。PCR産物は確立された分子生物学的
手法を使って、他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパ
ク質構成成分および二量体化ドメインをコードする核酸配列と融合され得るため、こうし
たオリゴヌクレオチドセットは「核酸カセット」と呼ばれることもある。
PCRプライマー配列は、抗原結合分子の表面に露出し非常に多様なフレキシブル残基の
ために設計されたコドンセットの１つまたは複数を含む。前記のように、コドンセットは
所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレ
ット配列である。また、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダ
イズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位が含まれ得る。DNA鋳
型はバクテリオファージM13ベクターに由来するベクター、またはViera他（Meth.Enzymol
. (1987) 153, 3）に記載されている一本鎖ファージの複製起点を含むベクターによっ
て生成される。このように、突然変異させるべきDNAは、一本鎖鋳型を生成するためにこ
れらのベクターの1つに挿入される。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等の教科書に記載さ
れている。
また、本発明の非限定な一実施態様で記載される、選択されたアミノ酸を抗原結合分子
に導入する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている
。例えば、Kunkelら（Methods Enzymol. (1987) 154, 367-382）によるキュンケル方
法を使用し、少なくとも１つの抗原結合分子の表面に露出しかつ/または「イオン濃度の
条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ
酸残基」や非常に多様なフレキシブル残基を導入することによってライブラリが作製され
得る。例えば、本発明の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活
性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域とランダム化
可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域との組合せによって、本発明の複
数の互いに配列の異なる抗原結合分子を含むライブラリが作製される場合に、こうした方
法が適宜採用され得るであろう。このような非限定的な例として、金属イオンがカルシウ
ムイオンである場合に、例えば、配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号
：８（Vk3）、配列番号：９（Vk4）等の生殖細胞系列の特定の残基が「カルシウムイオン
濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つの
アミノ酸残基」に置換された軽鎖可変領域配列が作製されることが挙げられているが、こ
うした軽鎖可変領域の作製に、こうした方法が採用され得る。
この場合、核酸カセットを作製するための鋳型として可変領域の核酸鋳型（テンプレー
ト）配列が使用されるPCR反応のプライマーとしてオリゴヌクレオチドセットが使用され
得る。可変領域のテンプレート配列は、対象核酸配列（すなわち、置換の対象となるアミ
ノ酸をコードしている核酸配列）を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のいかなる部分
も好適に用いられる。前記の例でいえば、配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、
配列番号：８（Vk3）、配列番号：９（Vk4）等の生殖細胞系列の可変領域が、テンプレー
ト配列として使用され得る。可変領域のテンプレート配列は、少なくとも可変領域の一部
を含み、また少なくとも1つのCDRを含む。場合によっては、可変領域のテンプレート配列
は複数のCDRを含む。可変領域のテンプレート配列の上流部および下流部は、上流域のオ
リゴヌクレオチドセットおよび下流域のオリゴヌクレオチドセットの構成メンバーによる
ハイブリダイゼーションの対象とされ得る。上流のプライマーセットの第1のオリゴヌク
レオチドは第1の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第2
のオリゴヌクレオチドは第2の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレ
オチドプライマーは１つまたは複数のコドンセットを含み、可変領域のテンプレート配列
の一部にハイブリダイズするように設計され得る。これらのオリゴヌクレオチドの使用に
よって、PCR後に2つ以上のコドンセットがPCR産物（すなわち核酸カセット）に導入され
得る。抗体可変領域をコードする核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、アミノ酸置換の対象となるCDR残基をコードする部分が含まれ得る。
また、本発明の非限定な一実施態様で記載される、選択されたアミノ酸を抗原結合分子
に導入する方法として本明細書で記載されているように、Overlap Extension PCR法も
適宜採用され得る（WO1993003151）。少なくとも１つの抗原結合分子の表面に露出しかつ
/または「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる
少なくとも一つのアミノ酸残基」または非常に多様なフレキシブル残基を導入することに
よってライブラリが作製され得る。Overlap Extension PCR法に使用される上流域およ
び下流域のオリゴヌクレオチドセットには「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原
結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」または非常に多様なフ
レキシブル残基とともに、可変領域のテンプレート配列にハイブリダイズするために十分
な長さのフレームワークの配列が含まれ得る。
例えば、本発明の非限定な一実施態様として記載される、「イオン濃度の条件によって
抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導
入された軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために、当該アミノ
酸残基のコドンセットおよび付加的にフレキシブル残基のコドンセットをコードするオリ
ゴヌクレオチドセットが作製される。当該オリゴヌクレオチドセットには可変領域のテン
プレート配列にハイブリダイズするために十分な長さのフレームワークの配列がその上流
または下流にインフレームで連結される。
例えば、軽鎖可変領域のCDR2およびCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブ
ル残基を導入する場合、オリゴヌクレオチドセットの5’末端にCDR2に隣接する十分な長
さのFR2のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結され、3’末端にCDR2に隣
接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結されたプライマーが作
製される。さらにオリゴヌクレオチドセットと相補的なオリゴヌクレオチドセットの5’
末端にCDR3に隣接する十分な長さのFR4のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド
が連結され、3’末端にCDR3に隣接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチ
ドが連結された相補プライマーもまた作製される。当該プライマーのFR3のアミノ酸をコ
ードするオリゴヌクレオチドと当該相補プライマーのFR3のアミノ酸をコードするオリゴ
ヌクレオチドとが互いにハイブリダイズすることが可能な程度の長さのオーバーラップす
る配列を含んでいる場合、テンプレート配列が存在しない条件下でのPCR反応によって、C
DR2およびCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブル残基が導入された軽鎖可
変領域が作製され得る。そのようなオーバーラップする配列を含んでいない場合は、例え
ば、配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号：８（Vk3）、配列番号：９
（Vk4）等の生殖細胞系列の可変領域を、テンプレート配列としたPCR反応によって、同様
にCDR2およびCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブル残基が導入された軽鎖
可変領域が作製され得る。
例えば、軽鎖可変領域のCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブル残基を導
入し、CDR1およびCDR2がランダム化された可変領域を含むライブラリを作製する場合、オ
リゴヌクレオチドセットと相補的なオリゴヌクレオチドセットの5’末端にCDR3に隣接す
る十分な長さのFR4のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結され、3’末端
にCDR3に隣接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結されたプラ
イマーと、FR1をコードするヌクレオチド配列を有するプライマーを用いたナイーブ配列
等のランダム化された可変領域を含むライブラリをテンプレート配列とするPCRによって
、同様にCDR2に当該アミノ酸残基および付加的なフレキシブル残基が導入され、CDR1およ
びCDR2がランダム化された軽鎖可変領域をコードするのポリヌクレオチドのライブラリが
作製され得る。上記の軽鎖に「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結
合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」および/またはフレキシブル残基が
導入されたポリヌクレオチドライブラリの作製方法は、重鎖に当該アミノ酸残基および付
加的なフレキシブル残基が導入されたポリヌクレオチドライブラリを作製するためにも適
宜採用される。
また、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むように上流域および下流域のオリゴ
ヌクレオチドセットが合成され得る。これらの制限部位は、さらなる抗体配列を有してい
る発現ベクターへの核酸カセット（すなわちPCR反応生成物）の挿入を容易にする。好ま
しくは、制限部位は外来の核酸配列を導入することなく、または元のCDRまたはフレーム
ワーク核酸配列を取り除くことなく核酸カセットのクローニングを容易にするように設計
されている。
作製された本発明の抗原結合分子を構成する軽鎖または重鎖の配列の一部またはすべて
の発現のために、核酸カセットが適切なベクターにクローニングされ得る。本発明で詳述
される方法によると、核酸カセットはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融
合した軽鎖または重鎖配列の一部またはすべて（すなわち、融合タンパク質を形成）の生
産を可能とするベクターにクローニングされる。後述されるように、こうしたベクターは
、前記の融合タンパク質が粒子または細胞の表面で提示されるように設計された発現ベク
ターであり得る。こうした目的のために数種類のベクターが入手され、それらは本発明の
実施に用いられるが、ファージミドベクターが本明細書での使用には好ましいベクターで
ある。当業者に公知であるように、ファージミドベクターには、通常、プロモーター、シ
グナル配列等の制御配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位および他の必要な構成成分を
含む様々な構成成分が含まれ得る。
特定の変異体アミノ酸の組合せが発現される非限定な実施形態では、核酸カセットには
、重鎖または軽鎖の可変領域のすべてまたは一部がコードされ得る。例えば、本発明の非
限定な一態様である、「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性
を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」および/またはフレキシブル残基が重鎖のC
DR3に含まれるように設計する場合、重鎖CDR3の配列多様性を有する核酸カセットが作製
された後に、ナイーブ配列等のランダム化された可変領域をコードする核酸カセットに連
結され得る。ライブラリの場合のようにこれらの変異体アミノ酸または変異体アミノ酸の
組合せを含んでいる抗原結合分子の作製のために、核酸カセットは、さらなる抗体配列、
例えば軽鎖および重鎖可変領域の可変または定常領域のすべてまたは一部を含んでいる発
現ベクターに挿入され得る。これらのさらなる抗原結合分子の配列は他の核酸配列、例え
ばウイルスコートタンパク質構成成分をコードしている配列と融合され、その結果、融合
タンパク質の生産が可能となる。
ベクター
本発明の非限定な一態様では、遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製
可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまた
は一部と融合し、1つの抗原結合分子の可変領域、または1つの抗原結合分子の可変領域と
1つの定常領域を含む融合タンパク質をコードする。前記のように、多様な配列で生成さ
れた互いに配列の異なる複数の抗原結合分子の可変領域を含む複数の異なる融合タンパク
質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリも
含まれる。ベクターは様々な構成成分を含むことが可能で、好ましくは異なるベクターの
間で抗原結合分子の可変領域が移動できるように、かつ/または異なるフォーマットで融
合タンパク質が提示されるように構築される。
ベクターの例として、ファージベクターが好適に挙げられる。ファージベクターは、フ
ァージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは
好ましくは、M13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体が含まれる繊維状バクテリオ
ファージ、またはラムダ、21、phi80、phi81、82、424、434、その他、もしくはその誘導
体が含まれるラムダ型ファージが好適な例として挙げられ得る。
ウイルスコートタンパク質の例には、感染性タンパク質PIII、主コートタンパク質PVII
I、pVII、pIX、Soc（T4）、Hoc（T4）、gpD（バクテリオファージλ）、マイナーバクテ
リオファージコートタンパク質6（pVI）（繊維状ファージ（J. Immunol. Methods. (1
999) 231 (1-2), 39-51）、M13バクテリオファージ主コートタンパク質変異体（P8）
（Protein Sci. (2000) 9 (4), 647-654））が含まれる。融合タンパク質はファー
ジの表面で提示されるが、適切なファージ系にはM13KO7ヘルパーファージ、M13R408、M13
-VCSおよびPhi X 174、pJuFoファージ系（J. Virol. (2001) 75 (15), 7107-7113
）、ハイパーファージ（Nat. Biotechnol. (2001) 19 (1), 75-78）、KM13（Fold
Des. (1998) 3 (5), 321-328）が含まれる。好ましいヘルパーファージはM13KO7であ
り、好ましいコートタンパク質はM13ファージ遺伝子IIIコートタンパク質である。好まし
い宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。例えばfth1ベクター（Nucl
eic Acids Res. (2001) 29 (10) e50）等のベクターは、融合タンパク質の発現に
有用であり得る。
発現ベクターは、抗原結合分子の重鎖可変領域または軽鎖可変領域もしくはその断片を
コードしているDNAと融合した分泌シグナル配列も含み得る。この配列は典型的には融合
タンパク質をコードしている遺伝子の隣接する5’側に位置し、したがって融合タンパク
質のアミノ末端で転写される。しかし、ある場合には、シグナル配列は分泌されるべきタ
ンパク質をコードしている遺伝子の5’以外の位置にあることが証明された。この配列は
、それが細菌細胞の内膜を横切って結合するタンパク質を対象とする。シグナル配列をコ
ードしているDNAは、シグナル配列を持つタンパク質をコードしている遺伝子のいずれか
から、制限エンドヌクレアーゼ断片として得られる。原核生物の適当なシグナル配列は、
例えば、LamBまたはOmpF（Wongら（Gene (1983), 68 (2), 193-203）、MalE、PhoAを
コードしている遺伝子および他の遺伝子も使用され得る。本発明の実施のための好ましい
原核生物シグナル配列は、Changら（Gene (1987) 55 (2-3), 189-196）に記載されて
いる大腸菌耐熱性エンテロトキシンII（STII）シグナル配列、pelBおよびmalEである。
ベクターには、一般的に、融合タンパク質の発現を促進する制御配列としてプロモータ
ーが含まれる。原核生物ベクターで一般的に使われるプロモーターには、lac Zプロモー
ター系、アルカリホスファターゼpho Aプロモーター（Ap）、バクテリオファージλPLプ
ロモーター（温度感受性プロモーター）、tacプロモーター（lacリプレッサーによって制
御されるハイブリッドtrp-lacプロモーター）、トリプトファンプロモーター、pBADプロ
モーターおよびバクテリオファージT7プロモーターが含まれる。プロモーターの総説に関
しては、前記のSambrook他の教示書に記載されている。これらが最も一般的に使用される
プロモーターであるが、他の適切な微生物プロモーターも同様に使用され得る。
ベクターには、また、他の核酸配列、例えば、gDタグ、c-Mycエピトープ、ポリ－ヒス
チジンタグ、蛍光タンパク質（例えば、GFP）またはファージまたは細胞の表面で発現す
る融合タンパク質の検出または精製に役立つβ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードし
ている配列が含まれ得る。例えば、gDタグをコードしている核酸配列によって、融合タン
パク質を発現する細胞またはウイルスの正または負の選択が可能となる。いくつかの実施
形態では、gDタグは好ましくはウイルスコートタンパク質の構成成分に融合していない抗
原結合分子の可変領域と融合する。例えば、ポリヒスチジン標識をコードしている核酸配
列は、免疫組織化学手法を使って特異的抗原と結合する抗原結合分子の可変領域を含む融
合タンパク質を同定するために有益である。抗原結合の検出に役立つタグは、ウイルスコ
ートタンパク質構成成分に融合していない抗原結合分子の可変領域、またはウイルスコー
トタンパク質構成成分に融合した抗原結合分子の可変領域に融合され得る。
本発明を実践するのに用いられるベクターの他の有用構成成分として、表現型選択遺伝
子が好適に挙げられる。典型的表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタ
ンパク質をコードしている遺伝子である。そのような例として、アンピシリン耐性遺伝子
（ampr）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tetr）等が好適に使用され得る。
ベクターには、独特の制限部位および抑制性終止コドンを含んでいる核酸配列も含まれ
得る。独特の制限部位は異なるベクターおよび発現系の間で抗原結合分子の可変領域を移
動させるために有用である。特に細胞培養による完全長の抗原結合分子または抗原結合断
片の生産に有用である。抑制性終止コドンは融合タンパク質の発現レベルを調節するのに
有用であり、可溶型の抗原結合分子の断片の精製を容易にする。例えば、アンバー終止コ
ドンはファージディスプレイを可能にするsupE宿主ではGlnに翻訳され得るが、非supE宿
主ではそれはファージコートタンパク質と融合していない可溶型の抗原結合分子の断片を
産生する終止コドンと解釈される。これらの合成配列は、ベクター内の1つまたは複数の
抗原結合分子の可変領域と融合され得る。
目的とする抗原結合分子の配列をコードする核酸がベクターから容易に取り出されて他
のベクターに入れられるようにするベクターが好適に使用され得る。例えば、本発明の抗
原結合分子またはその可変領域をコードしている核酸配列の取り出しを容易にするために
、適当な制限部位がベクターに組み込まれ得る。制限配列は、通常、効率的な切出しおよ
び新しいベクターへのライゲーションを容易にするために、ベクター内でユニークなもの
が選択される。抗原結合分子またはその可変領域は、その後外来の融合された配列、例え
ばウイルスコートタンパク質または他の配列タグを含まない構造を有する分子としてベク
ターから発現され得る。
抗原結合分子の可変領域または定常領域をコードしている核酸（遺伝子1）とウイルス
のコートタンパク質構成成分（遺伝子2）との間に、終結または終止コドンをコードして
いるDNAが挿入され得る。そのような終結コドンにはUAG（アンバー）、UAA（オーカー）
およびUGA（オペル）が含まれる。（Davisら（Microbiology (1980) , 237, 245-247
, 374 Harper & Row, New York））。野生型宿主細胞で発現する終結または終止コ
ドンは、遺伝子2タンパク質が結合しない遺伝子1タンパク質産物の合成をもたらす。しか
し、抑制宿主細胞での増殖によって検出可能な量の融合タンパク質が合成される。そのよ
うな抑制宿主細胞は公知であり、大腸菌抑制遺伝子株（Bullockら（BioTechniques (198
7) 5, 376-379））等が記載されている。そのような終結コドンが、融合ポリペプチド
をコードするmRNAに挿入され得る。
抑制性コドンは、抗原結合分子の可変または定常領域をコードする第1の遺伝子とファ
ージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第2の遺伝子との間に挿入され得る
。あるいは、抑制性終結コドンは、抗原結合分子の可変領域の最後のアミノ酸トリプレッ
トまたはファージコートタンパク質の最初のアミノ酸を置換することによって融合部位に
隣接して挿入され得る。抑制性終結コドンは、二量体化ドメインのC末端またはその後に
挿入され得る。抑制性コドンを含んでいるプラスミドがサプレッサー宿主細胞中で複製し
た場合、検出可能な量のポリペプチドおよびコートタンパク質を含んでいる融合ポリペプ
チドが生産される。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞中で複製した場合、挿入された
抑制性トリプレットUAG、UAAまたはUGAにおける翻訳の終結のために、実質的にファージ
コートタンパク質と融合せずに抗原結合分子の可変領域が合成される。よって、非サプレ
ッサー細胞中で発現した抗原結合分子の可変領域は、宿主メンブランに固定する融合ファ
ージコートタンパク質を含まないために、合成された後に宿主細胞から分泌される。
抗原結合分子の軽鎖および/または重鎖の可変領域または定常領域は、ウイルス粒子ま
たは細胞の表面での1つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用を可能にするペプチド
配列にさらに融合され得る。これらのペプチド配列は、本明細書では「二量体化ドメイン
」と指称される。二量体化ドメインは、少なくとも１つまたは複数の二量体化配列、また
はシステイン残基を含んでいる配列を少なくとも1つ、あるいはこの両方ともに含むこと
ができる。適当な二量体化配列には、疎水残基が一定の間隔をあけて存在し、各タンパク
質の疎水残基の相互作用による二量体の形成を可能にする両親媒性のαヘリックスを有す
るタンパク質のそれらが含まれる。そのようなタンパク質およびタンパク質部分には、例
えばロイシンジッパー領域が含まれる。二量体化ドメインは、また、1つまたは複数のシ
ステイン残基を含むことができる（例えば、二量体化ドメイン内に抗体ヒンジ配列を含む
ことにより提供される）。システイン残基は、1つまたは複数のジスルフィド結合の形成
による二量体化を可能にする。終止コドンが二量体化ドメインの後方に存在する一実施形
態では、二量体化ドメインは少なくとも1つのシステイン残基を含む。二量体化ドメイン
は、好ましくは抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質構成成分との間
に位置する。
場合によっては、ベクターは、例えばコートタンパク質に融合した重鎖および軽鎖の可
変領域を含んでいる単鎖形態の単一の抗原結合分子のファージポリペプチドをコードする
。これらのケースでは、ベクターは、ある種のプロモーターの制御下で1つの転写産物を
発現する「一シストロン性」と考えられる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間にリン
カーペプチドを有し、VLおよびVHドメインをコードしている一シストロン性配列の発現を
促進するためにアルカリホスファターゼ（AP）またはTacプロモーターを利用するベクタ
ーが例示される。このようなシストロン配列は、5’末端で大腸菌のmalEまたは耐熱性エ
ンテロトキシンII（STII）シグナル配列に連結され、3’末端で（例えば、pIIIタンパク
質等の）ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結される。いくつかの実施形
態では、ベクターは第2の可変領域配列とウイルスコートタンパク質配列との間のその3’
末端に、（例えばロイシンジッパー等の）二量体化ドメインをコードしている配列番号：
１２で示されるような配列をさらに含むことができる。
その他の場合、重鎖および軽鎖の可変領域は別々のポリペプチドとして発現され、この
ようなベクターは「二シストロン性」であり、別々の転写産物の発現を可能にする。これ
らのベクターでは、適切なプロモーター、例えばtacまたはPhoAプロモーターは二シスト
ロン性mRNAの発現を促すために利用され得る。例えば、軽鎖可変領域および定常領域をコ
ードしている第1のシストロンが、5’末端で大腸菌のmalE、pelBまたは耐熱性エンテロト
キシンII（STII）シグナル配列に連結され、3’末端でgDタグをコードしている核酸配列
に連結される。例えば、重鎖可変領域および定常領域CH1をコードしている第2のシストロ
ンは、5’末端で大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII（STII）シグナル配列に
連結され、3’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結されている。
二シストロン性mRNAを生成し、F(ab’)2-pIIIを提示するベクターでは、例えば、適切
なプロモーター、例えばtacまたはPhoA（AP）プロモーターは、5’末端で大腸菌malEまた
は耐熱性エンテロトキシンII（STII）シグナル配列と作用可能に連結され、3’末端でgD
タグをコードしている核酸配列と連結された軽鎖可変領域および定常領域をコードしてい
る第1のシストロンの発現を促進する。第2のシストロンは、例えば5’末端で大腸菌のmal
Eまたは耐熱性エンテロトキシンII（STII）シグナル配列と作用可能に連結された重鎖可
変領域および定常領域をコードし、3’末端にはIgGヒンジ配列およびロイシンジッパー配
列、さらにその後方に少なくとも一部のウイルスコートタンパク質を含む二量体化ドメイ
ンを含む。
融合ポリペプチドの提示
抗原結合分子の可変領域の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファージミド粒
子の表面で様々な態様で提示され得る。これらの態様には、単鎖Fv断片（scFv）、F(ab)
断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。多価の形態は、好ましくはScFv、Fab
またはF(ab’)の二量体であり、これらは本明細書では(ScFv)2、F(ab)2およびF(ab’)2と
それぞれ指称される。多価の形態の提示が好まれる理由の一つは、多価の形態の提示によ
って、通常低親和性クローンの同定が可能となる点、または、選択過程で稀なクローンの
より効率的な選択を可能にする複数の抗原結合部位を有する点であると考えられる。
バクテリオファージの表面で抗体断片を含んでいる融合ポリペプチドを提示する方法は
当技術分野で公知であり、例えばWO1992001047および本明細書で記載されている。他にも
WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236および1993019172では関連した方法が記載さ
れており、当業者はこれらの方法を適宜使用することが可能である。他の公知文献（H.R.
Hoogenboom & G.Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388、WO1993006213お
よびWO1993011236）では、ファージ表面で提示された様々な抗原に対する、人工的に再配
置された可変領域遺伝子レパートリーによる抗体の同定が示されている。
scFvの態様での提示のためにベクターが構築される場合、抗原結合分子の軽鎖可変領域
および重鎖可変領域をコードしている核酸配列がこのベクターに含まれる。一般的には、
抗原結合分子の重鎖可変領域をコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成
分に融合する。抗原結合分子の軽鎖可変領域をコードしている核酸配列は、ペプチドリン
カーをコードしている核酸配列によって抗原結合分子の重鎖可変領域に連結される。ペプ
チドリンカーは、一般的に約5から15個のアミノ酸を含む。任意に、例えば精製または検
出に役立つ標識をコードしている他の配列が、抗原結合分子の軽鎖可変領域もしくは抗原
結合分子の重鎖可変領域のいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融
合され得る。
F(ab)の態様での提示のためにベクターが構築される場合、抗原結合分子の可変領域お
よび抗原結合分子の定常領域をコードする核酸配列がこのベクターに含まれる。軽鎖可変
領域をコードする核酸は、軽鎖定常領域をコードする核酸配列に融合される。抗原結合分
子の重鎖可変領域をコードする核酸配列は、重鎖定常CH1領域をコードする核酸配列に融
合される。一般的には、重鎖可変領域および定常領域をコードしている核酸配列は、ウイ
ルスコートタンパク質のすべてまたは一部をコードしている核酸配列に融合される。重鎖
可変領域および定常領域は好ましくはウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融
合体として発現され、軽鎖可変領域および定常領域は、重鎖ウイルスコート融合タンパク
質とは別々に発現される。重鎖および軽鎖は互いと結合するが、その結合は共有結合でも
非共有結合でもあり得る。任意に、例えば精製または検出に役立つポリペプチド標識をコ
ードしている他の配列が、抗原結合分子の軽鎖定常領域もしくは抗原結合分子の重鎖定常
領域のいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融合され得る。
宿主細胞へのベクターの導入
前記のように構築されたベクターは、増幅および/または発現のために宿主細胞に導入
される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む公知の
形質転換法によって、宿主細胞に導入され得る。ベクターがウイルスのような感染性の粒
子である場合、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドが挿入されている複製可能な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクシ
ョンおよび公知の手法によるファージ粒子の生産によって、融合タンパク質がファージ粒
子の表面に提示される。
複製可能な発現ベクターは、様々な方法を使用して宿主細胞に導入され得る。非限定な
一実施態様では、ベクターはWO2000106717に記載されているようにエレクトロポレーショ
ン法を使って細胞に導入され得る。細胞は標準の培養液中で任意に約6ないし48時間（ま
たは600 nmにおけるODが0.6ないし0.8になるまで）、37℃で培養し、次に培養液を遠心
分離することによって（例えばデカンテーションにより）培養上清が取り出される。精製
の初期段階では、好ましくは緩衝液（例えば1.0 mMのHEPES（pH7.4））中に細胞ペレッ
トが再懸濁される。次に再度の遠心分離によって懸濁液から上清が取り出される。得られ
た細胞ペレットは例えば5-20%V/Vに希釈されたグリセリンに再懸濁される。再度遠心分離
によって懸濁液から上清を取り除くことによって細胞ペレットが得られる。当該細胞ペレ
ットを水または希釈されたグリセリンの中に再懸濁することによって得られる菌体濃度の
測定値をもとづいて、最終的な菌体濃度が水または希釈されたグリセリンを用いて所望の
濃度に調製される。
例えば、好ましい受容細胞として、エレクトロポレーション応答能のある大腸菌株SS32
0（Sidhuら（Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363））が挙げられる。大腸菌株SS
320は、稔性エピソーム（F’プラスミド）またはXL1-BLUEをMC1061細胞に移転するのに十
分な条件の下で、MC1061細胞をXL1-BLUE細胞と交接させて調製された。ATCC（10801 Uni
versity Boulevard, Manassas, Virginia）に寄託された大腸菌株SS320に対して寄託
番号98795が与えられている。この菌株でのファージ複製を可能にするいかなるF’エピソ
ームでも、本発明で用いられ得る。適切ななエピソームはATCCに寄託されている株から入
手可能であるし、または市販品も入手可能である（TG1, CJ236、CSH18、DHF’、ER2738
、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等）。
エレクトロポレーションでより高いDNA濃度（約10倍）を使用すると、形質転換率が向
上し、宿主細胞に形質転換されるDNAの量が増加する。高い菌体濃度の使用も効率を高め
る（約10倍）。移転されたDNA量の増加により、より大きな多様性を有し、配列の異なる
独立クローンの数が大きなライブラリが作製され得る。形質転換細胞は、通常、抗生物質
を含む培地上の増殖の可否によって選択される。
条件によって結合活性が変化する抗原結合分子の選択方法および当該分子をコードするポ
リヌクレオチドの単離方法
抗原に対して所望の結合活性を示す抗原結合分子を同定するためのファージディスプレ
イの使用方法は、様々な改変が加えられた方法も含め、当技術分野で確立されている。非
限定の一態様では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結し
た転写調節要素を含むように構築された複製可能なベクターのライブラリが、適切な宿主
細胞に形質転換される。形質転換された細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ
粒子表面で提示するファージ粒子が形成される。その後、選択の過程で抗原に結合しない
粒子と比較して結合する粒子の集団を増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が抗
原と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択、分画
を伴う「結合分子を選択する」ステップが実施される。異なるまたは同じ反応条件で同じ
集団をさらに1回スクリーニングするために、分画された集団を、例えば新鮮なXL1-Blue
細胞等の宿主細胞に感染させることによって当該集団が増幅される。つぎに、得られた抗
原結合分子の増幅された集団と、イオン濃度の異なる条件下において抗原に接触させるス
テップが実施され、所望の条件で抗原に結合する抗原結合分子がスクリーニングされる。
また、イオン濃度の異なる条件下において抗原に接触させるステップを前記の選択方法の
最初のステップとして実施することも可能であるし、「結合分子を選択する」ステップと
イオン濃度の異なる条件下で結合活性が変化している結合分子を選択するステップの組合
せは適宜変更され得る。また、前記の選択および分画のステップは何回でも実施され得る
。これらのイオン濃度の異なる条件下において抗原に結合する抗原結合分子は、生体に投
与されたときに病因となる抗原を生体から速やかに除去する能力を有する治療薬として有
用である。
本発明の、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させ
るアミノ酸および/またはフレキシブル残基を含んでいる可変領域またはその一部の融合
ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子または細胞の表面に発現される。次にイオ
ン濃度の異なる条件下における、融合ポリペプチドの集団中の構成メンバーの抗原に結合
する能力について選択および/または分画がされ得る。融合ポリペプチドに対する選択、
分画およびスクリーニングの方法は、protein Lまたはファージ上で提示される抗原結合
分子もしくはその断片と結合する標識抗体のような抗原結合分子の可変領域と親和性を有
する一般的なタンパク質上での選択、分画およびスクリーニングの方法も含まれる。こう
した方法は正しくフォールドされた抗原結合分子（を含む融合ポリペプチド）の断片を提
示するライブラリサイズまたはライブラリ当量数を豊富にするために使用され得る。
前記の選択、分画およびスクリーニングのために2つの主な方策が使用され得る。第1の
方策は固体担体方法またはプレートスクリーニングまたは固定化抗原スクリーニングであ
り、第2の方策は、溶液結合方法である。
「固体担体方法」では、抗原は当技術分野で公知の適切な固体または半固体マトリック
ス、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々
なアクリルコポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキルゲル、ポリアクリルおよびポリ
メタクリルコポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などに結合され得る。マトリ
ックスに対する抗原の結合は、Methods in Enzymology (1976) 44に記載されている
方法、または当技術分野で公知の他の手段によって達成され得る。
マトリックスへの抗原の結合の後、ファージ粒子集団の少なくとも1サブセットと固定
化抗原との結合に適した条件下で、固定化された抗原と融合ポリペプチドを発現している
ライブラリとを接触させる。通常、pH、イオン強度、温度等を含む条件は、生理学的条件
を模倣する条件が選択される。前記の固定化抗原と結合する粒子（「結合体」）は、水洗
により対象と結合しない粒子から分離される。洗浄条件は、高親和性の結合体以外のすべ
てが取り除かれるように調節され得る。結合体は様々な方法によって固定化された対象か
ら解離させることができる。これらの方法には例えば過剰な抗原等の野生型リガンドを用
いる競合的解離、pHおよび/またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野で公知の方法
が含まれる。結合体は、一般的に0.1 MのHClなどの酸またはリガンドのような、適当な
溶出材料によってアフィニティーマトリックスから溶出され得る。リガンドの濃度を上昇
させて溶出することによって、提示されたより親和性の高い結合分子を溶出させることも
可能である。
単離された結合体であるウイルス粒子（および、例えばウイルス粒子がファージミド粒
子である場合は必要に応じてヘルパーファージ）を細胞に感染させることによって、結合
体が適切な宿主細胞で再増幅され得る。こうして得られた宿主細胞は所望の融合ポリペプ
チドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養される。次にファージ粒子を採取し、抗
原の結合体が相当の割合を占めるまで選択工程が1回または複数回繰り返される。選択ま
たはスクリーニングは何回も行われ得る。選択またはスクリーニング方法の1つとして、p
rotein Lまたは提示されるポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体、例
えばgDタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような一般の親和性タンパク
質と結合する結合体を単離することも含まれ得る。
本発明の1つの態様として、「溶液結合方法」と呼ばれる溶相スクリーニング法が適宜
使用され得る。ランダムなライブラリから、あるいは所望の結合クローンまたはクローン
群の結合活性を改善することを目的としたライブラリから改善された結合体を見つけるた
めに溶液結合方法が使用され得る。複数のポリペプチド、例えばファージまたはファージ
ミド粒子（ライブラリー）上で提示されるポリペプチドと、タグ分子で標識されたまたは
タグ分子と融合された抗原との接触が、この方法には含まれる。タグはビオチンまたは他
の特異的結合体が利用可能である。第1の溶液結合相で濃度を段階的に低くした標識され
たまたは融合された抗原を用いて、溶相のストリンジェンシーが変化され得る。さらにス
トリンジェンシーを高めるために、第1の溶相での最初のタグ分子で標識されたまたは標
識タグ分子と融合された抗原との結合の後に、追加的にタグ分子で標識されていないまた
は標識タグ分子と融合されていない高濃度の抗原を有する第2の溶相と接触させることも
適宜実施され得る。その場合には、通常、標識対象の100から1000倍の量のタグ分子で標
識されていないまたは標識タグ分子と融合されていない抗原が第2相で使われる。第1の溶
相のインキュベーション時間は、平衡に達するまで2、3分から1、2時間またはそれ以上の
範囲である。結合速度の速い結合体はこの第1相における結合時間が短い性質を有する傾
向があるため、結合時間を短くする接触の条件が採用されうる。第2相のインキュベーシ
ョンの時間および温度は、ストリンジェンシーを高めるために変化させ得る。こうしたイ
ンキュベーションの条件の変化によって、対象から離れる速度（解離速度）が遅い結合体
に対する選択の偏りが生じる。ファージ/ファージミド粒子上で提示された複数のポリペ
プチドと抗原とを接触させた後に、タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合され
た抗原と結合したファージまたはファージミド粒子が、結合しないファージまたはファー
ジミド粒子から分離される。タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された抗原
との結合が可能になるような範囲で短い時間（例えば2～5分間）、ファージまたはファー
ジミド粒子と抗原とを接触させることによって、溶相からファージまたはファージミド粒
子と抗原との混合物が単離される。タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合され
た抗原の初期濃度の範囲は、約0.1 nMから約1000 nMまでである。当該混合物から溶出
された粒子は、次のスクリーニングのために増殖させることができる。各回のスクリーニ
ングにおいて、タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された低濃度の抗原を用
いてスクリーニングを複数回繰り返すのが好ましい。後述する実施例に記載されるように
、標識タグ分子としてビオチンが使用される場合には、ストレプトアビジンがコートされ
た磁気ビーズ等が溶液結合方法において適宜使用され得る。
固体担体方法と溶液結合方法の組合せは、所望の特性を有している結合体を単離するた
めに適宜単独でまたは組み合わせて実施され得る。抗原に対して2回、3回もしくは4回選
択およびスクリーニングを繰り返した後、所望の性質/特性を有する特異的結合体を同定
するために選択された集団から個々のクローンのスクリーニングが通常実行される。好ま
しくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリに対する高スループットスクリーニン
グを可能にする自動化システムによって実行され得る。
結合体が抗原に対する結合により同定された後、当該結合体から核酸が抽出され得る。
抽出されたDNAは次に大腸菌宿主細胞を形質転換するのに直接用いられる。あるいは、そ
のコード配列が、例えばPCRによって適切なプライマーを使って増幅されたのちに、典型
的シークエンシング方法によってその配列が決定され得る。次にそのコードする抗原結合
分子の発現のために、結合体の可変領域をコードするDNAが、制限酵素を用いて消化され
たベクターに挿入され得る。
本発明の、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化した
抗原結合分子またはその融合ポリペプチドを発現するファージ粒子を選択し、スクリーニ
ングするために、固定化された抗原と抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現してい
るファージ粒子を含むライブラリとを接触させる条件を変化させることによって、抗原に
対する結合活性をが変化するファージ粒子の集団が分画される。
例えば、金属イオンの好適な例としてカルシウムイオンが着目される場合には、カルシ
ウムイオン濃度の条件として低カルシウムイオン濃度の条件と高カルシウムイオン濃度の
条件が挙げられる。カルシウムイオン濃度の条件によって結合活性が変化するとは、低カ
ルシウムイオン濃度と高カルシウムイオン濃度の条件の違いによって抗原に対する抗原結
合分子の結合活性が変化することをいう。例えば、低カルシウムイオン濃度の条件下にお
ける抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりも高カルシウムイオン濃度の条件下におけ
る抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い場合が挙げられる。また、高カルシウ
ムイオン濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりも低カルシウム
イオン濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い場合もまた
挙げられる。
本明細書において、高カルシウムイオン濃度とはとくに一義的な数値に限定されるわけ
ではないが、好適には100μMから10 mMの間から選択される濃度であり得る。また、別の
態様では、200μMから5 mMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は500μMから2.5 mMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では200 μM
から2mMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに400μMから1.5 mMの間から選択さ
れる濃度でもあり得る。特に生体内の血漿中（血中）でのカルシウムイオン濃度に近い50
0μMから2.5 mMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
本明細書において、低カルシウムイオン濃度とはとくに一義的な数値に限定されるわけ
ではないが、好適には0.1μMから30μMの間から選択される濃度であり得る。また、別の
態様では、0.2μMから20μMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は0.5μMから10μMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では1μMから5μ
Mの間から選択される濃度でもあり得る。さらに2μMから4μMの間から選択される濃度で
もあり得る。特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μMか
ら5μMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
本発明において、抗原結合分子の低カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する
結合活性が高カルシウムイオン濃度条件下における抗原に対する結合活性より低いとは、
抗原結合分子の0.1μMから30μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対
する結合活性が、100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に
対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子の0.5μMから10μM
の間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、200μMから5 m
Mの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意
味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度における抗
原結合活性が、生体内の血漿中のカルシウムイオン濃度における抗原結合活性より弱いこ
とを意味し、具体的には、抗原結合分子の1μMから5μMの間から選択されるカルシウムイ
オン濃度での抗原に対する結合活性が、500μMから2.5 mMの間から選択されるカルシウ
ムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
例えば、低カルシウムイオン濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活
性よりも高カルシウムイオン濃度の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性
の方が高い抗原結合分子またはその融合ポリペプチドを発現するファージ粒子を選択し、
スクリーニングするために、最初に高カルシウム濃度の条件下で固定化された抗原に結合
するファージ粒子の集団が分画された後に、その分画された集団と抗原とを低カルシウム
濃度の条件下で固定化された抗原と抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現している
ファージ粒子を含むライブラリとを接触させる。低カルシウム濃度の条件下で固定化され
た抗原に結合しないファージ粒子が上清またはその後の洗浄液に分画される。高カルシウ
ム濃度および低カルシウム濃度の条件は、上記に記載された範囲内で適宜採用され得る。
非限定な一態様では、0.1 μMから30μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での
抗原に対する結合と100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原
に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。また、別の非限定の態様では0.5
μMから10μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合と、200μM
から5 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合の活性の相違
にもとづいて分画され得る。さらに別の非限定の態様では、生体内の早期エンドソーム内
のカルシウムイオン濃度における抗原に対する結合と、生体内の血漿中のカルシウムイオ
ン濃度における抗原に対する結合の活性の相違、具体的には、1μMから5μMの間から選択
されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合と、500μMから2.5 mMの間から選択
されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得
る。
例えば、イオン濃度の好適な例として水素イオン濃度が着目される場合には、水素イオ
ン濃度の条件としてpH酸性域の条件とpH中性域の条件が挙げられる。pHの条件によって結
合活性が変化するとは、pH酸性域とpH中性域の違いによって抗原に対する抗原結合分子の
結合活性が変化することをいう。例えば、pH酸性域における抗原に対する抗原結合分子の
結合活性よりもpH中性域における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い場合が
挙げられる。また、pH中性域における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりもpH酸性
域における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い場合もまた挙げられる。
本明細書において、pH中性域とはとくに一義的な数値に限定されるわけではないが、好
適にはpH6.7からpH10.0の間から選択され得る。また、別の態様では、pH6.7からpH9.5の
間から選択され得る。また、異なる態様ではpH7.0からpH9.0の間から選択され得るし、ほ
かの態様ではpH7.0からpH8.0の間から選択され得る。特に生体内の血漿中（血中）でのpH
に近いpH7.4が好適に挙げられる。
本明細書において、pH酸性域とはとくに一義的な数値に限定されるわけではないが、好
適にはpH4.0からpH6.5の間から選択され得る。また、別の態様では、pH4.5からpH6.5の間
から選択され得る。また、異なる態様ではpH5.0からpH6.5の間から選択され得るし、ほか
の態様ではpH5.5からpH6.5の間から選択され得る。特に生体内の早期エンドソーム内での
イオン化カルシウム濃度に近いpH5.8が好適に挙げられる。
本発明において、抗原結合分子のpH酸性域条件下における抗原に対する結合活性がpH中
性域条件下における抗原に対する結合活性より低いとは、抗原結合分子のpH4.0からpH6.5
の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH10.0の間から選択され
るpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子のpH
4.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH9.5の間か
ら選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味し、より好ましくは、抗原
結合分子のpH5.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0か
らpH9.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。また
、好ましくは抗原結合分子のpH5.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合
活性が、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを
意味する。好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原結合活性が、生体
内の血漿中のpHにおける抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子
のpH5.8での抗原に対する結合活性が、pH7.4での抗原に対する結合活性より弱いことを意
味する。
pHの条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化しているか否かは、例え
ば前記の異なるpHの条件下での結合活性の測定方法に準じて実施される。例えば、pH酸性
域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりもpH中性域の条件下におけ
る抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高く変化することを確認するためには、pH
酸性域およびpH中性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性が比較され
る。
例えば、pH酸性域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性よりもpH中性
域の条件下における抗原に対する抗原結合分子の結合活性の方が高い抗原結合分子または
その融合ポリペプチドを発現するファージ粒子を選択し、スクリーニングするために、最
初にpH中性域の条件下で固定化された抗原に結合するファージ粒子の集団が分画された後
に、その分画された集団と抗原とをpH酸性域の条件下で固定化された抗原と抗原結合分子
または融合ポリペプチドを発現しているファージ粒子を含むライブラリとを接触させる。
pH酸性域の条件下で固定化された抗原に結合しないファージ粒子が上清またはその後の洗
浄液に分画される。pH中性域およびpH酸性域の条件は、上記に記載された範囲内で適宜採
用され得る。非限定な一態様では、pH4.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対す
る結合とpH6.7からpH10.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合の活性の相違にも
とづいて分画され得る。また、別の非限定の態様ではpH4.5からpH6.5の間から選択される
pHでの抗原に対する結合と、pH6.7からpH9.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合
の活性の相違にもとづいて分画され得る。さらに、別の非限定の態様ではpH5.0からpH6.5
の間から選択されるpHでの抗原に対する結合と、pH7.0からpH9.0の間から選択されるpHで
の抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。そのほか、pH5.5からpH6.5
の間から選択されるpHでの抗原に対する結合と、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHで
の抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。さらに別の非限定の態様で
は、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原に対する結合と、生体内の血漿中のpH
における抗原に対する結合の活性の相違、具体的には、pH5.8での抗原に対する結合と、p
H7.4での抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。
条件によって結合活性が変化する抗原結合分子の製造方法
本発明の非限定の一態様では、前記のように選択された条件によって結合活性が変化す
る抗原結合分子分子をコードするポリヌクレオチドが単離された後に、当該ポリヌクレオ
チドが適切な発現ベクターに挿入される。すなわち、目的とする抗原結合分子の可変領域
をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入された制限酵素サイトを認識
する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗原結合分子の遺伝子
を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの
消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入
が好ましい。上記のように消化された抗原結合分子の可変領域をコードするcDNAを適当な
発現ベクターに挿入することによって、本発明の抗原結合分子の発現ベクターが取得され
得る。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記可変領域をコード
する遺伝子とがインフレームで融合され得る。
所望の抗原結合分子を製造するために、抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドが
制御配列に作用可能に連結された態様で発現ベクターに組み込まれる。制御配列とは、例
えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗原結合分子が細胞外に分泌
されるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に連結され得る。例えばシグナル配列と
して、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：１３）を有するペプチドが使用さ
れるが、これ以外にも適したシグナル配列が連結され得る。発現されたポリペプチドは上
記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチド
として細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質
転換されることによって、所望の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを発現する
組換え細胞が取得され得る。
抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドの発現のために、抗原結合分子の重鎖およ
び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。重
鎖と軽鎖が組み込まれたベクターによって、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfe
ct）されることによって、重鎖と軽鎖を備えた抗原結合分子が発現され得る。あるいは重
鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドが単一の発現ベクターに組み込まれることに
よって宿主細胞が形質転換され得る（WO19994011523を参照のこと）。
単離された抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主に導入することに
よって抗原結合分子を作製するための宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知
である。これらの発現系は、いずれも本発明の抗原結合分子を単離するのに応用され得る
。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が
適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO（Chinese hamster ovary cell line）、COS（Monkey kid
ney cell line）、ミエローマ（Sp2/O、NS0等）、BHK （baby hamster kidney cel
l line）、HEK293（human embryonic kidney cell line with sheared adenovir
us (Ad)5 DNA）、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transfor
med with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)、Hela、Vero、
など（Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table
5.9.1)）
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニ
コティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
－酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミ
セス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
－糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspe
rgillus ）属
また、原核細胞を利用した抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドの発現系も公知
である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞
が適宜利用され得る。これらの細胞中に、目的とする抗原結合分子をコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質転換された細胞をin
vitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望の抗原結合分子が取得
され得る。
組換え抗原結合分子の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物も利
用され得る。すなわち所望の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドが導入された動
物から、当該抗原結合分子を得ることができる。例えば、抗原結合分子をコードするポリ
ヌクレオチドは、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にイン
フレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁中に分泌されるタ
ンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどが利用され得る。抗原結合分子をコード
するポリヌクレオチドが挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当
該注入された胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニ
ックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗原結合分子が乳汁タンパク
質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生され
る所望の抗原結合分子を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニック
ヤギに対して投与され得る（Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702）。
本明細書において記載される抗原結合分子がヒトに投与される場合、当該分子における
抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為
的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。遺伝子組
換え型抗体には、例えば、ヒト化（Humanized）された抗体等が含まれる。これらの改変
抗原結合分子は、公知の方法を用いて適宜製造される。
本明細書において記載される抗原結合分子における抗原結合ドメインを作製するために
用いられる抗原結合分子の可変領域は、通常、4つのフレームワーク領域（FR）にはさま
れた3つの相補性決定領域（complementarity-determining region ; CDR）で構成され
ている。CDRは、実質的に、抗原結合分子の結合特異性を決定している領域である。CDRの
アミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有
する抗原結合分子の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移
植によって、ある抗原結合分子の結合特異性を、他の抗原結合分子の移植することができ
る。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動
物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗
体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公
知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライ
マーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは
４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植において
は、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利で
あるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ
酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。
それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDR
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列
は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳
型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
最終的に3つのCDRと4つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニー
ルし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上
記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するよ
うに発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。
該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、
該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の
培養物中に産生される（EP 239400、WO1996002576）。
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、
評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成
するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切
な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、
マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入す
ることができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変
異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列
の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で
測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Satoら（Ca
ncer Res, (1993) 53, 851-856））。
本発明の非限定な一態様において、前記のように選択された条件によって結合活性が変
化する抗原結合分子分子をコードするポリヌクレオチドが単離された後に、当該ポリヌク
レオチドの改変体が適切な発現ベクターに挿入される。このような改変体の一つとして、
ランダム化可変領域ライブラリとして、合成ライブラリや非ヒト動物を起源として作製さ
れた免疫ライブラリを用いることによってスクリーニングされた本発明の抗原結合分子を
コードするポリヌクレオチド配列がヒト化された改変体が好適に挙げられる。ヒト化され
た抗原結合分子の改変体の作製方法は、前記のヒト化抗体の作製方法と同様の方法が採用
され得る。
また、改変体のその他の態様として、ランダム化可変領域ライブラリとして合成ライブ
ラリやナイーブライブラリを用いることによってスクリーニングされた本発明の抗原結合
分子の抗原に対する結合親和性の増強（アフィニティ成熟化）をもたらすような改変が、
単離されたポリヌクレオチド配列に施された改変体が好適に挙げられる。そのような改変
体はCDRの変異誘導（Yangら（J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403））、鎖シャッ
フリング（Marksら（Bio/Technology (1992) 10, 779-783））、E.coliの変異誘発株
の使用（Lowら（J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368））、DNAシャッフリング（Pa
ttenら（Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733））、ファージディスプレイ
（Thompsonら（J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88））および有性PCR（sexual PCR
）（Clameriら（Nature (1998) 391, 288-291））を含む種々のアフィニティー成熟化
の公知の手順によって取得され得る。
前記のように、本発明の製造方法によって作製される抗原結合分子として、FcRn（特に
ヒトFcRn）結合ドメインを含む抗原結合分子が挙げられるが、FcRn（特にヒトFcRn）結合
ドメインとして様々な改変体が使用され得る。このようなFcRn（特にヒトFcRn）結合ドメ
インの改変体をコードするポリヌクレオチドと、前記のように選択された条件によって結
合活性が変化する抗原結合分子分子をコードするポリヌクレオチドとがインフレームで連
結された重鎖を有する抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドも、本発明の改変体の
一態様として好適に挙げられる。
本発明の非限定な一態様では、FcRn（特にヒトFcRn）結合ドメインとして、例えば、配
列番号：１４で表されるIgG1（N末端にAla が付加されたAAC82527.1）、配列番号：１５
で表されるIgG2（N末端にAlaが 付加されたAAB59393.1）、配列番号：１６で表されるIg
G3（CAA27268.1）、配列番号：１７で表されるIgG4（N末端にAlaが付加されたAAB59394.1
）等の抗体の定常領域が好適に挙げられる。IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い（血漿
中からの消失が遅い）のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが
機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分
子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合す
る。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進み、そこで分解されるが、FcR
nへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離するこ
とで再び血漿中に戻る。
抗原に対して血漿中の高カルシウム濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム
内の低カルシウム濃度の条件下において抗原から解離する本発明の「カルシウムイオン濃
度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子」はエンドソーム内で抗
原から解離することが可能である。抗原に対して血漿中の高カルシウム濃度の条件下にお
いては強く結合し、エンドソーム内の低カルシウム濃度の条件下において抗原から解離す
る本発明の「カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原
結合分子」は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると再び抗原に
結合することが可能である。すなわち、1分子の当該抗原結合分子が複数の抗原に繰り返
し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原がエンドソーム内で解
離することで血漿中にリサイクルされないため、抗原結合分子による抗原の細胞内への取
り込みを促進し、抗原結合分子の投与により抗原の消失を促進し、血漿中の抗原濃度を低
下させることが可能となる。
また、抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内
の酸性条件下において抗原から解離する本発明の「pHの条件によって抗原に対する結合活
性が変化する抗原結合分子」はエンドソーム内で抗原から解離することが可能である。抗
原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の酸性条件
下において抗原から解離する本発明の「pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化す
る抗原結合分子」は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると再び
抗原に結合することが可能である。すなわち、1分子の当該抗原結合分子が複数の抗原に
繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原がエンドソーム
内で解離することで血漿中にリサイクルされないため、抗原結合分子による抗原の細胞内
への取り込みを促進し、抗原結合分子の投与により抗原の消失を促進し、血漿中の抗原濃
度を低下させることが可能となる。
抗原に対して血漿中の高カルシウム濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム
内の低カルシウム濃度の条件下において抗原から解離する本発明の「カルシウムイオン濃
度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子」に、血漿中の高カルシ
ウム濃度の条件下におけるFcRnに対する結合を付与することによって、当該抗原結合分子
と抗原との複合体の細胞内への取り込みが促進される。すなわち、当該抗原結合分子の投
与によって血漿中からの抗原の消失が促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可
能となる。
また、抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内
のpH酸性条件下において抗原から解離する本発明の「pHの条件によって抗原に対する結合
活性が変化する抗原結合分子」に、血漿中のpH中性域の条件下におけるFcRnに対する結合
を付与することによって、当該抗原結合分子と抗原との複合体の細胞内への取り込みが促
進される。すなわち、当該抗原結合分子の投与によって血漿中からの抗原の消失が促進さ
れ、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
通常のFc領域を含む抗体は血漿中のpH中性域の条件下においてFcRnに対する結合活性を
有しないため、通常の抗体および抗体－抗原複合体は、非特異的なエンドサイトーシスに
よって細胞に取り込まれ、エンドソーム内のpH酸性域の条件下でFcRnに結合することで細
胞表面に輸送される。FcRnは抗体をエンドソーム内から細胞表面に輸送するため、FcRnの
一部は細胞表面にも存在していると考えられるが、細胞表面のpH中性域の条件下では抗体
はFcRnから解離するため、抗体は血漿中にリサイクルされる。
前記の、FcRn結合ドメインであるFc領域を含む抗体の生体内での動態を考慮すると、抗
原に対して血漿中の高カルシウム濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の
低カルシウム濃度の条件下において抗原から解離する本発明の「カルシウムイオン濃度の
条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子」は、血漿中で抗原に結合し
、エンドソーム内において結合している抗原を解離するため、抗原の消失速度は非特異的
なエンドサイトーシスによる細胞への取り込み速度と等しくなると考えられる。抗原結合
分子の抗原に対する結合のカルシウムイオン濃度依存性が不十分な場合は、エンドソーム
内において解離しない抗原が血漿中にリサイクルされてしまうが、抗原結合分子の抗原に
対する結合のカルシウムイオン濃度依存性が十分な場合は、抗原の消失速度は非特異的な
エンドサイトーシスによる細胞への取り込みが律速となる。
また、抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内
のpH酸性条件下において抗原から解離する本発明の「pHの条件によって抗原に対する結合
活性が変化する抗原結合分子」は、血漿中で抗原に結合し、エンドソーム内において結合
している抗原を解離するため、抗原の消失速度は非特異的なエンドサイトーシスによる細
胞への取り込み速度と等しくなると考えられる。抗原結合分子の抗原に対する結合のpH依
存性が不十分な場合は、エンドソーム内において解離しない抗原が血漿中にリサイクルさ
れてしまうが、抗原結合分子の抗原に対する結合のpH依存性が十分な場合は、抗原の消失
速度は非特異的なエンドサイトーシスによる細胞への取り込みが律速となる。
よって、FcRn結合ドメインを含む抗原結合分子にpH中性域におけるFcRnへの結合能を付
与することによって、細胞表面に存在するFcRnに結合した当該抗原結合分子が、FcRn依存
的に細胞に取り込まれる。FcRnを介した細胞への取込み速度は、非特異的なエンドサイト
ーシスによる細胞への取込み速度よりも早いため、pH中性域におけるFcRnへの結合能を付
与することによって、抗原の血漿中からの消失速度をさらに速めることが可能である。す
なわち、pH中性域においてFcRnに対する結合能を有する抗原結合分子は、通常の（血漿中
のpH中性域の条件下においてFcRnに対する結合活性を有しない）Fc領域を含む抗原結合分
子よりも速やかに抗原を細胞内に送り込み、エンドソーム内で抗原を解離し、再び細胞表
面ないしは血漿中にリサイクルされ、そこで再び抗原に結合し、またFcRnを介して細胞内
に取り込まれる。pH中性域においてFcRnに対する結合能を高くすることで、このサイクル
の回転速度を速くすることが可能となるため、血漿中から抗原を消失させる速度が速くな
る。さらに、抗原結合分子のpH酸性域における抗原結合活性をpH中性域における抗原結合
活性より低下させることによって、更にその効率を高めることが可能である。また1分子
の抗原結合分子によるこの回転数が多くなることによって、1分子の抗原結合分子によっ
て結合できる抗原の数も多くなると考えられる。
本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとFcRn（特にヒトFcRn）結合ドメインから
なり、FcRn結合ドメインは抗原に対する結合に影響を与えることはないため、また、上述
のメカニズムから考えても、抗原の種類に依存することがなく、抗原結合分子の低カルシ
ウムイオン濃度の条件下における抗原結合活性（結合能）を高カルシウムイオン濃度の条
件下における抗原結合活性より低下させ、および/または、血漿中でのpH中性域におけるF
cRnへの結合活性を増大させることにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込を
促進させ、抗原の消失速度を速くすることが可能であると考えられる。
また、本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとFcRn結合ドメインからなり、FcRn
結合ドメインは抗原に対する結合に影響を与えることはないため、また、上述のメカニズ
ムから考えても、抗原の種類に依存することがなく、抗原結合分子のpH酸性域の条件下に
おける抗原結合活性（結合能）をpH中性域の条件下における抗原結合活性より低下させ、
および/または、血漿中でのpH中性域におけるFcRnへの結合活性を増大させることにより
、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込を促進させ、抗原の消失速度を速くすること
が可能であると考えられる。
抗体定常領域等のFcRn結合ドメインのFcRnに対する結合活性は、前記結合活性の項で述
べられているように、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、pH以外の条
件については当業者が適宜決定することが可能である。抗原結合分子の抗原結合活性とヒ
トFcRn結合活性は、KD（Dissociation constant：解離定数）、見かけのKD（Apparent
dissociation constant：見かけの解離定数）、解離速度であるkd（Dissociation rate
：解離速度）、又は見かけのkd（Apparent dissociation：見かけの解離速度）等として
評価され得る。これらは当業者公知の方法で測定され得る。例えばBiacore（GE healthc
are）、スキャッチャードプロット、フローサイトメーター等を使用され得る。
抗体定常領域等のFcRn結合ドメインのヒトFcRnに対する結合活性を測定する際のpH以外
の条件は当業者が適宜選択することが可能であり、特に限定されない。例えば、WO200912
5825に記載されているようにMESバッファー、37℃の条件において測定され得る。また、
抗体定常領域等のFcRn結合ドメインのヒトFcRnに対する結合活性の測定は当業者公知の方
法により行うことが可能であり、例えば、Biacore（GE Healthcare）などを用いて測定
され得る。抗体定常領域等のFcRn結合ドメインとヒトFcRnの結合活性の測定は、FcRn結合
ドメインまたはFcRn結合ドメインを含む本発明の抗原結合分子あるいはヒトFcRnを固定化
したチップへ、それぞれヒトFcRnあるいはFcRn結合ドメインまたはFcRn結合ドメインを含
む本発明の抗原結合分子をアナライトとして流すことによって評価され得る。
抗体定常領域等のFcRn結合ドメインまたはFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とFcRn
との結合活性を有する条件としてのpH中性域とは、通常pH6.7～pH10.0を意味する。pH中
性域とは、好ましくはpH7.0～pH8.0の任意のpH値によって示される範囲であり、好ましく
はpH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、および8.0から選択され、特
に好ましくはインビボの血漿中（血中）のpHに近いpH7.4である。pH7.4でのヒトFcRn結合
ドメインとヒトFcRnとの結合アフィニティーが低いためにその結合アフィニティーを評価
することが難しい場合には、pH7.4の代わりにpH7.0を用いることができる。本発明におい
て、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とFcRnとの結
合活性を有する条件としてのpH酸性域とは、通常pH4.0～pH6.5を意味する。好ましくはpH
5.5～pH6.5を意味し、特に好ましくは、インビボの早期エンドソーム内のpHに近いpH5.8
～pH6.0を意味する。測定条件に使用される温度として、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒ
トFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合アフィニティーは、10℃～50
℃の任意の温度で評価してもよい。好ましくは、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結
合ドメインを含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために、15
℃～40℃の温度が使用される。より好ましくは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、および35℃のいずれか1つのような20℃から35℃までの任意の
温度も同様に、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子と
ヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために使用される。25℃という温度は本発明
の態様の非限定な一例である。
The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671によれば、天然型ヒトIgG1
のヒトFcRn結合活性はpH酸性域（pH6.0）でKD 1.7μMであるが、pH中性域では活性をほ
とんど検出できていない。よって、好ましい態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn
結合活性がKD 20μMまたはそれより強く、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性が天然型
ヒトIgGと同等かそれより強い抗原結合分子を含む、pH酸性域およびpH中性域においてヒ
トFcRn結合活性を有する本発明の抗原結合分子がスクリーニングされ得る。より好ましい
態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 2.0μMまたはそれより強く、
pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 40μMまたはそれより強い抗原結合分子がスク
リーニングされ得る。さらにより好ましい態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn結
合活性がKD 0.5μMまたはそれより強く、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 15μ
Mまたはそれより強い抗原結合分子がスクリーニングされ得る。上記のKD値は、The Jour
nal of Immunology (2009) 182: 7663-7671に記載された方法（抗原結合分子をチッ
プに固定し、アナライトとしてヒトFcRnを流す）によって決定される。
本発明においては、pH酸性域およびpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有するFcRn結
合ドメインが好ましい。当該ドメインは、あらかじめpH酸性域およびpH中性域においてヒ
トFcRn結合活性を有しているFcRn結合ドメインであればそのまま用いられ得る。当該ドメ
インがpH酸性域および/またはpH中性域においてヒトFcRn結合活性がない若しくは弱い場
合には、抗原結合分子中のアミノ酸を改変することによって所望のヒトFcRnに対する結合
活性を有するFcRn結合ドメインが取得され得るが、ヒトFcRn結合ドメイン中のアミノ酸を
改変することによってpH酸性域および/またはpH中性域における所望のヒトFcRnに対する
結合活性を有するFcRn結合ドメインも好適に取得され得る。また、あらかじめpH酸性域お
よび/またはpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているFcRn結合ドメイン中のアミ
ノ酸の改変によって、所望のヒトFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインも取得
され得る。そのような所望の結合活性をもたらすヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸改変は
、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域および/またはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性
を比較することによって見出され得る。公知の手法を用いて当業者は適宜アミノ酸の改変
を実施することができる。
本発明において、FcRn結合ドメインの「アミノ酸の改変」または「アミノ酸改変」とは
、出発FcRn結合ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列に改変することを含む。
出発FcRn結合ドメインの修飾改変体がpH酸性域および/または中性域においてヒトFcRnに
結合することができる限り（ゆえに、出発FcRn結合ドメインはpH酸性域および/または中
性域の条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性を必ずしも必要とするわけではない）い
ずれのFcRn結合ドメインも出発ドメインとして使用され得る。出発FcRn結合ドメインの例
としては、IgG抗体の定常領域、すなわち配列番号：１４から１７のいずれかで表される
天然型の定常領域が好適に挙げられる。また、既に改変が加えられたFcRn結合ドメインを
出発FcRn結合ドメインとしてさらなる改変が加えられた改変FcRn結合ドメインも本発明の
改変FcRn結合ドメインとして好適に使用され得る。出発FcRn結合ドメインとは、ポリペプ
チドそのもの、出発FcRn結合ドメインを含む組成物、または出発FcRn結合ドメインをコー
ドするアミノ酸配列を意味し得る。出発FcRn結合ドメインには、抗体の項で概説された組
換えによって産生された公知のIgG抗体のFcRn結合ドメインが含まれ得る。出発FcRn結合
ドメインの起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る
。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチ
ネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類
から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、出発FcRn結合ドメインはま
た、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され
得る。好ましくは、出発Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに
限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を出
発Fc領域として適宜用いることができることを意味する。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3
、ヒトIgG4 Fc領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of
proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に記載さ
れているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては
、EUナンバリング３５６－３５８番目のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい
。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブク
ラスのFcRn結合ドメインを、好ましくは出発FcRn結合ドメインとして用いることができる
ことを意味する。天然に存在するIgGのバリアントまたは操作された型の例は、公知の文
献（Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol.
(2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-20
2、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、およびWO2006105338）に記載されるが
それらに限定されない。
FcRn（特にヒトFcRn）結合ドメインを含む抗原結合分子にpH中性域におけるFcRn（特に
ヒトFcRn）への結合能を付与するために、FcRnとの結合に関与するFcRn結合ドメイン中の
アミノ酸に適宜変異が加えられる。FcRn結合ドメインとして抗体IgG分子の定常領域が用
いられる場合には、例えば、EUナンバリングで表される221位～225位、227位、228位、23
0位、232位、233～241位、243～252位、254～260位、262～272位、274位、276位、278～2
89位、291～312位、315～320位、324位、325位、327～339位、341位、343位、345位、360
位、362位、370位、375～378位、380位、382位、385～387位、389位、396位、414位、416
位、423位、424位、426～438位、440位および442位の位置のアミノ酸が天然型IgGの定常
領域の相当するアミノ酸とは異なる改変された定常領域が挙げられる。より具体的には、
例えばEUナンバリングで表される256位のアミノ酸がPro、280位のアミノ酸がLys、339位
のアミノ酸がThr、385位のアミノ酸がHis、428位のアミノ酸がLeu、および/または434位
のアミノ酸がTrp、Tyr、Phe、AlaもしくはHisのいずれかである定常領域の改変体が挙げ
られる。これらの改変体を使用することで、IgG型免疫グロブリンのFc領域のpH中性域に
おけるヒトFcRnに対する結合活性を強くすることが可能である。
また、pH酸性域におけるヒトFcRnに対する結合を天然型IgGの定常領域と比較して強く
することができる改変体も適宜使用され得る。これらの改変体のうち、pH中性域において
もヒトFcRnに対する結合を強くすることが出来る改変体が適宜選択され、本発明に使用す
ることが可能である。そのような例として、定常領域におけるEUナンバリングで表される
アミノ酸が天然型IgGの定常領域の相当するアミノ酸とは異なる改変された定常領域が挙
げられる。そのようなアミノ酸の改変例として表1に挙げられるアミノ酸を含む定常領域
の改変体が好適に使用され得る。
特に好ましいアミノ酸の改変として、例えばEUナンバリング237位、238位、239位、248
位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位
、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、3
17位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387
位、389位、424位、428位、433位、434位および436位で表されるアミノ酸を天然型IgGの
定常領域の相当するアミノ酸と異なるアミノ酸へ置換する改変が挙げられる。これらのア
ミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に改変することによって
、FcRn結合ドメインのpH中性域におけるヒトFcRnに対する結合活性を高めることができる
。
特に好ましい改変としては、例えば、天然型IgGの定常領域のEUナンバリングで表され
る；
237位のアミノ酸がMet、
238位のアミノ酸がAla、
239位のアミノ酸がLys、
248位のアミノ酸がIle、
250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がThr、
255位のアミノ酸がGlu、
256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がHis、
265位のアミノ酸がAla、
270位のアミノ酸がPhe、
286位のアミノ酸がAlaまたはGluのいずれか、
289位のアミノ酸がHis、
297位のアミノ酸がAla、
298位のアミノ酸がGly、
303位のアミノ酸がAla、
305位のアミノ酸がAla、
307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg
、Ser、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArgのいずれか、
311位のアミノ酸がAla、His、またはIleのいずれか、
312位のアミノ酸がAlaまたはHisのいずれか、
314位のアミノ酸がLysまたはArgのいずれか、
315位のアミノ酸がAlaまたはHisのいずれか、
317位のアミノ酸がAla、
325位のアミノ酸がGly、
332位のアミノ酸がVal、
334位のアミノ酸がLeu、
360位のアミノ酸がHis、
376位のアミノ酸がAla、
380位のアミノ酸がAla、
382位のアミノ酸がAla、
384位のアミノ酸がAla、
385位のアミノ酸がAspまたはHisのいずれか、
386位のアミノ酸がPro、
387位のアミノ酸がGlu、
389位のアミノ酸がAlaまたはSerのいずれか、
424位のアミノ酸がAla、
428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr
、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
433位のアミノ酸がLys、
434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrのいずれか、および
436位のアミノ酸がHis
である改変が好適に挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、1箇
所のみのアミノ酸を改変してもよいし、2箇所以上のアミノ酸を改変してもよい。2箇所以
上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えば表2に記載されるような組合せが挙げられ
る。
改変の例としては一以上の変異、例えば、出発Fc領域のアミノ酸とは異なるアミノ酸残
基に置換された変異、あるいは出発Fc領域のアミノ酸に対して一以上のアミノ酸残基の挿
入または出発Fc領域のアミノ酸から一以上のアミノ酸の欠失等が含まれる。好ましくは、
改変後のFc領域のアミノ酸配列には、天然に生じないFc領域の少なくとも部分を含むアミ
ノ酸配列を含む。そのような変種は必然的に出発Fc領域と100％未満の配列同一性または
類似性を有する。好ましい実施形態において、変種は出発Fc領域のアミノ酸配列と約75％
～100％未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは約80％～100％未満、よ
り好ましくは約85％～100％未満の、より好ましくは約90％～100％未満、最も好ましくは
約95％～100％未満の同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。本発明の非限定の一
態様において、出発Fc領域および本発明の改変されたFc領域の間には少なくとも１つのア
ミノ酸の差がある。出発Fc領域と改変Fc領域のアミノ酸の違いは、特に前述のEUナンバリ
ングで特定されるアミノ酸残基の位置の特定されたアミノ酸の違いによっても好適に特定
可能である。
Fc領域のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の
方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改
変方法として、複数の公知の方法も採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. St
ruct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11
), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補
的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系
システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる。
前記のようなアミノ酸の変異が加えられたFcRn結合ドメインの改変体をコードするポリ
ヌクレオチドと、前記のように選択された条件によって結合活性が変化する抗原結合分子
分子をコードするポリヌクレオチドとがインフレームで連結された重鎖を有する抗原結合
分子をコードするポリヌクレオチドも、本発明の改変体の一態様として作製される。
本発明によって、FcRn結合ドメインをコードするポリヌクレオチドとインフレームで連
結された本発明のウイルスから単離されたポリヌクレオチドが作用可能に連結されたベク
ターが導入された細胞の培養液から抗原結合分子を回収することを含む抗原結合分子の製
造方法が提供される。また、ベクター中に予め作用可能に連結されたFcRn結合ドメインを
コードするポリヌクレオチドとインフレームで連結された本発明のウイルスから単離され
たポリヌクレオチドが作用可能に連結されたベクターが導入された細胞の培養液から抗原
結合分子を回収することを含む抗原結合分子の製造方法もまた提供される。
医薬組成物
本発明は特定の理論により拘束されるものではないが、例えば、pH酸性域における抗原
に対する結合活性がpH中性域の条件における抗原に対する結合活性よりも低いように、イ
オン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインおよび付加的
にpH中性域の条件下でヒトFcRnに対する結合活性を有する抗体定常領域等のFcRn結合ドメ
インを含む抗原結合分子が生体に投与されたときに生体中の細胞への取込みが促進される
ことによって、1分子の抗原結合分子が結合可能な抗原の数が増加する理由、および、血
漿中抗原濃度の消失が促進される理由はたとえば以下のように説明することが可能である
。
例えば、抗原結合分子が膜抗原に結合する抗体が生体内に投与された場合、当該抗体は
抗原に結合した後、抗原に結合したまま抗原と一緒にインターナライゼーションによって
細胞内のエンドソームに取り込まれる。その後、抗原に結合したままライソソームへ移行
した抗体は、抗原とともにライソソームによって分解される。インターナライゼーション
を介した血漿中からの消失は抗原依存的な消失と呼ばれており、多くの抗体分子で報告さ
れている（Drug Discov Today (2006) 11(1-2), 81-88）。1分子のIgG抗体が2価で
抗原に結合した場合、1分子の抗体が2分子の抗原に結合した状態でインターナライズされ
、そのままライソソームで分解される。従って、通常の抗体の場合、1分子のIgG抗体が3
分子以上の抗原に結合することは出来ない。例えば、中和活性を有する1分子のIgG抗体の
場合、3分子以上の抗原を中和することはできない。
IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い（消失が遅い）のは、IgG分子のサルベージ受容体
として知られているヒトFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエン
ドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム
内に発現しているヒトFcRnに結合する。ヒトFcRnに結合できなかったIgG分子はその後移
行するライソソーム内で分解される。一方、ヒトFcRnに結合したIgG分子は細胞表面へ移
行する。血漿中の中性条件下においてIgG分子はヒトFcRnから解離するため、当該IgG分子
は再び血漿中にリサイクルされる。
また抗原結合分子が可溶型抗原に結合する抗体の場合、生体内に投与された抗体は抗原
に結合し、その後、抗体は抗原に結合したまま細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込ま
れた抗体の多くはエンドソーム内でFcRnに結合した後に細胞表面に移行する。血漿中の中
性条件下において抗体はヒトFcRnから解離するため、細胞外に放出される。しかし、pH等
のイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化しない通常の抗原結合ドメイン
を含む抗体は抗原と結合したまま細胞外に放出される為、再度、抗原に結合することはで
きない。従って、膜抗原に結合する抗体と同様、pH等のイオン濃度の条件によって抗原に
対する結合活性が変化しない通常の1分子のIgG抗体は3分子以上の抗原に結合することは
できない。
抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内のpH酸
性域の条件下において抗原から解離するpH依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対
してpH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する抗体）や抗原に対して血漿
中の高カルシウムイオン濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシ
ウムイオン濃度の条件下において抗原から解離するカルシウムイオン濃度依存的に抗原に
対して結合する抗体（抗原に対して高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシ
ウムイオン濃度の条件下で解離する抗体）はエンドソーム内で抗原から解離することが可
能である。pH依存的に抗原に対して結合する抗体やカルシウムイオン濃度依存的に抗原に
対して結合する抗体は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると、
再び抗原に結合することが可能である。そのため一分子の抗体が複数の抗原分子に繰り返
し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原はエンドソーム内で抗
体から解離することによって血漿中にリサイクルされずライソソーム内で分解される。こ
うした抗原結合分子を生体に投与することによって、抗原の細胞内への取込みが促進され
、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内のpH酸
性域の条件下において抗原から解離するpH依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対
してpH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する抗体）や抗原に対して血漿
中の高カルシウムイオン濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシ
ウムイオン濃度の条件下において抗原から解離するカルシウムイオン濃度依存的に抗原に
対して結合する抗体（抗原に対して高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシ
ウムイオン濃度の条件下で解離する抗体）に、pH中性域の条件下（pH7.4）におけるヒトF
cRnに対する結合能を付与することで、抗原結合分子が結合する抗原の細胞内への取込み
がさらに促進される。すなわち、こうした抗原結合分子の生体への投与によって抗原の消
失が促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。pH依存的な抗原に対す
る結合能、またはカルシウムイオン濃度依存的な抗原に対する結合能を有しない通常の抗
体およびその抗体－抗原複合体は、非特異的なエンドサイトーシスによって細胞に取り込
まれ、エンドソーム内の酸性条件下でFcRnに結合することで細胞表面に輸送され、細胞表
面の中性条件下でFcRnから解離することによって血漿中にリサイクルされる。そのため、
十分にpH依存的に抗原に対して結合する（pH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下
で解離する）、または十分にカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する（高カ
ルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシウムイオン濃度の条件下で解離する）抗
体が血漿中で抗原に結合し、エンドソーム内において結合している抗原を解離する場合、
抗原の消失速度は非特異的なエンドサイトーシスによる抗体およびその抗体－抗原複合体
の細胞への取込み速度と等しくなると考えられる。抗体と抗原間の結合のpH依存性または
カルシウムイオン濃度依存性が不十分な場合は、エンドソーム内において抗体から解離し
ない抗原も抗体とともに血漿中にリサイクルされてしまうが、pH依存性が十分な場合は、
抗原の消失速度は非特異的なエンドサイトーシスによる細胞への取込み速度が律速となる
。また、FcRnは抗体をエンドソーム内から細胞表面に輸送するため、FcRnの一部は細胞表
面にも存在していると考えられる。
通常、抗原結合分子の一態様であるIgG型免疫グロブリンはpH中性域におけるFcRnに対
する結合活性をほとんど有しない。本発明者らは、pH中性域においてFcRnに対する結合活
性を有するIgG型免疫グロブリンは、細胞表面に存在するFcRnに結合することが可能であ
り、細胞表面に存在するFcRnに結合することによって当該IgG型免疫グロブリンがFcRn依
存的に細胞に取り込まれると考えた。FcRnを介した細胞への取り込み速度は、非特異的な
エンドサイトーシスによる細胞への取り込み速度よりも早い。そのため、pH中性域におい
てFcRnに対する結合能を付与することによって、抗原結合分子による抗原の消失速度をさ
らに速めることが可能であると考えられる。すなわち、pH中性域においてFcRnに対する結
合能を有する抗原結合分子は、通常の（天然型ヒト）IgG型免疫グロブリンよりも速やか
に抗原を細胞内に送り込み、エンドソーム内で抗原を解離し、再び細胞表面ないしは血漿
中にリサイクルされ、そこで再び抗原に結合し、またFcRnを介して細胞内に取り込まれる
。pH中性域においてFcRnに対する結合能を高くすることによって、このサイクルの回転速
度を速くすることが可能となるため、血漿中から抗原を消失させる速度が速くなる。更に
抗原結合分子のpH酸性域における抗原に対する結合活性をpH中性域における抗原に対する
結合活性より低下させることによって、更に血漿中から抗原を消失させる速度を高めるこ
とが可能である。またこのサイクルの回転速度を早くする結果生じるそのサイクルの数の
増大によって、1分子の抗原結合分子が結合可能な抗原の分子数も多くなると考えられる
。本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとFcRn結合ドメインからなり、FcRn結合ド
メインは抗原に対する結合に影響を与えることはないため、また、上述のメカニズムから
考えても、抗原の種類に依存することがなく、抗原結合分子のpH酸性域または低カルシウ
ムイオン濃度の条件等のイオン濃度の条件における抗原に対する結合活性（結合能）をpH
中性域または高カルシウムイオン濃度の条件等のイオン濃度の条件における抗原に対する
結合活性（結合能）より低下させ、および/または、血漿中でのpHにおけるFcRnへの結合
活性を増大させることによって、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させ
、抗原の消失速度を速くすることが可能であると考えられる。よって本発明の抗原結合分
子は、抗原がもたらす副作用の低減、抗体の投与量の上昇、抗体の生体内の動態の改善、
といった点で従来の治療用抗体よりも優れた効果を発揮すると考えられる。
すなわち、本発明は、本発明の抗原結合分子、本発明のスクリーニング方法により単離
された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む医薬
組成物に関する。本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結
合分子はその投与により通常の抗原結合分子と比較して血漿中の抗原濃度を低下させる作
用が高いことから医薬組成物として有用である。本発明の医薬組成物には医薬的に許容さ
れる担体が含まれ得る。
本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断
のための薬剤をいう。
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法を用いて製剤化され得る。例えば、水もし
くはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経
口的に使用され得る。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌
水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒ
クル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単
位用量形態で混和することによって製剤化され得る。これら製剤における有効成分量は、
指示された範囲の適当な容量が得られるように設定される。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施にし
たがって処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他
の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を
含む等張液が挙げられる。適切な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリ
アルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性
剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）が併用され得る。
油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/
またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び
酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベン
ジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常
、適切なアンプルに充填される。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、
経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物が投与される。例えば、静脈内注射、
筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。抗原結合分子を含有する医薬
組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲
に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量が設定され得
るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は
、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し
適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例え
ば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者に
よく知られた修飾である）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾され
た場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み
入れられる。
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表され
る態様は、「本質的に・・・からなる（essentially consisting of）」との表現によ
り表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting of）」との表現により表され
る態様を包含する。
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるも
のではない。
［実施例１］pH依存的結合抗体ライブラリの設計
（１－１）pH依存的結合抗体の取得方法
WO2009125825は抗原結合分子にヒスチジンを導入することにより、pH中性領域とpH酸性
領域で性質が変化するpH依存的抗原結合抗体を開示している。開示されたpH依存的結合抗
体は、所望の抗原結合分子のアミノ酸配列の一部をヒスチジンに置換する改変によって取
得されている。改変する対象の抗原結合分子を予め得ることなく、pH依存的結合抗体をよ
り効率的に取得するために、ヒスチジンを可変領域（より好ましくは抗原結合に関与する
可能性がある位置）に導入した抗原結合分子の集団（Hisライブラリと呼ぶ）から所望の
抗原に結合する抗原結合分子を取得する方法が考えられる。Hisライブラリから得られる
抗原結合分子は通常の抗体ライブラリよりもヒスチジンが高頻度に出現するため、所望の
性質を有する抗原結合分子が効率的に取得できると考えられる。
（１－２）pH依存的に抗原に結合する結合抗体が効率よく取得できるように、ヒスチジン
残基が可変領域に導入された抗体分子の集団（Hisライブラリ）の設計
まず、Hisライブラリでヒスチジンを導入する位置が選択された。WO2009125825ではIL-
6レセプター抗体、IL-6抗体およびIL-31レセプター抗体の配列中のアミノ酸残基をヒスチ
ジンに置換することでpH依存的抗原結合抗体を作製したことが開示されている。さらに、
抗原結合分子のアミノ酸配列をヒスチジンに置換することによって、pH依存的抗原結合能
を有する、抗卵白リゾチウム抗体（FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88）および抗
ヘプシジン抗体（WO2009139822）が作製されている。IL-6レセプター抗体、IL-6抗体、IL
-31レセプター抗体、卵白リゾチウム抗体およびヘプシジン抗体でヒスチジンを導入した
位置が表3に示される。表3に示す位置は、抗原と抗体との結合を制御できる位置の候補と
して挙げられ得る。さらに表3で示された位置以外でも、抗原と接触する可能性が高い位
置も、ヒスチジンを導入する位置として適切であると考えられた。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域から構成されるHisライブラリのうち、重鎖可変領域はヒ
ト抗体配列が使用され、軽鎖可変領域にヒスチジンが導入された。Hisライブラリでヒス
チジンを導入する位置として、上記で挙げられた位置と、抗原結合に関与する可能性があ
る位置、すなわち軽鎖の30位、32位、50位、53位、91位、92位および93位（Kabatナンバ
リング、Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological In
terest. NIH）が選択された。またヒスチジンを導入する軽鎖可変領域のテンプレート配
列として、Vk1配列が選択された。テンプレート配列に複数のアミノ酸を出現させてライ
ブラリを構成する抗原結合分子の多様性が拡げられた。複数のアミノ酸を出現させる位置
は、抗原と相互作用する可能性が高い可変領域の表面に露出する位置が選択された。具体
的には、軽鎖の30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位および96
位（Kabatナンバリング、Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Im
munological Interest. NIH）が、こうしたフレキシブル残基として選択された。
次に出現させるアミノ酸残基の種類とその出現率が設定された。Kabatデータベース（K
ABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest',
vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION）に登録されているhVk1とhVk3の配列中のフレキシ
ブル残基におけるアミノ酸の出現頻度が解析された。解析結果を元に、各位置で出現頻度
が高いアミノ酸からHisライブラリで出現させるアミノ酸の種類が選択された。この際、
アミノ酸の性質が偏らないように解析結果では出現頻度が少ないと判定されたアミノ酸も
選択された。また、選択されたアミノ酸の出現頻度は、Kabatデータベースの解析結果を
参考にして設定された。
以上のように設定されたアミノ酸および出現頻度を考慮することによって、Hisライブ
ラリとして、ヒスチジンが各CDRで1つ必ず入るように固定されているHisライブラリ1とHi
sライブラリ1よりも配列の多様性が重視されたHisライブラリ2が設計された。Hisライブ
ラリ1およびHisライブラリ2の詳細なデザインは表4および表5に示されている（各表中の
位置はKabatナンバリングを表す）。また、表4および5で記載されるアミノ酸の出現頻度
は、Kabatナンバリングで表される92位がAsn（N）の場合は94位はSer（S）を除外するこ
とができる。
［実施例2］pH依存的に抗原に結合する抗体を取得するためのヒト抗体ファージディスプ
レイライブラリ（Hisライブラリ1）の作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として
PCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。実施例1に記載のHisラ
イブラリ１として設計された抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリが、PCR法を用いて増
幅された。このように作製された抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領
域の遺伝子ライブラリとの組合せがファージミドベクターへ挿入され、ヒト抗体配列から
なるFabドメインを提示するヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。構
築方法として、（Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100）が参考とされた。上記
ライブラリの構築に際しては、ファージミドのFabとファージpIIIタンパク質をつなぐリ
ンカー部分、および、ヘルパーファージpIIIタンパク遺伝子のN2ドメインとCTドメインの
間にトリプシン切断配列が挿入されたファージディスプレイライブラリの配列が使用され
た。抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された抗体遺伝子部分の配列が確
認され、132クローンの配列情報が得られた。設計されたアミノ酸分布と、確認された配
列中のアミノ酸の分布が、図1に示されている。設計されたアミノ酸分布に対応する多様
な配列を含むライブラリが構築された。
［実施例3］pH依存的にIL-6Rに結合する抗体の取得
（３－１）ビーズパンニングによるライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗体断片
の取得
構築されたHisライブラリ1からの最初の選抜は、抗原（IL-6R）への結合能をもつ抗体
断片のみの濃縮によって実施された。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行
われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加すること
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。ファージライブラリ液にBSAおよびCaCl2を添加することによって終濃度4%
BSA、1.2mMカルシウムイオンとなるよう調製された。パンニング方法として、一般的な
方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（J. Immu
nol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (
1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomic
s (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-M
ag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabea
ds M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原を加え
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室
温にて15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2、0.1%
Tween20を含むTBS）にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（pH7.6）にて
さらに2回洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは室温で15
分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収さ
れた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸
菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによっ
て、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレ
ートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによっ
て、ファージライブラリ液が調製された。
2回目以降のパンニングでは、抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標にファージの
濃縮が行われた。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識
抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSA
でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと
室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSに
て複数回洗浄された。その後抗原結合能を指標として濃縮する場合は、1mg/mLのトリプシ
ン0.5mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビ
ーズが分離され、ファージ溶液が回収された。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場合
は、0.1mLの50mM MES/1.2mM CaCl2/150mM NaCl（pH5.5）が加えられたビーズは室温で
懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、回収されたファージ溶液
に、100mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIII
タンパク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しないフ
ァージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージが、対数増殖期（OD600
が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大
腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌
は225 mmx 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からフ
ァージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。抗原結合能もしくは
pH依存的結合能を指標とするパンニングが2回繰り返された。
（３－２）ファージELISAによる評価
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
終濃度4%BSAおよびカルシウムイオン濃度1.2 mMとなるようBSAおよびCaCl2が加えられ
たファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイク
ロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされ
た。当該プレートの各ウエルをPBST（0.1%Tween20を含むPBS）にて洗浄することによって
抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングされた
。4% BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37
℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に
結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS（pH7
.6）もしくは1.2 mM CaCl2/TBS（pH5.5）が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静
置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に4% BSAおよびイオ
ン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham
Pharmacia Biotech）が各ウエルに添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。
1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の
溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色
が測定された。
抗原結合能を指標に濃縮した場合、パンニングを2回実施したものについてファージELI
SAを実施したところ、抗原特異的にELISA陽性となったものは96クローン中1７クローンで
あったため、パンニングを3回実施したものが解析された。一方、pH依存的抗原結合能を
指標に濃縮した場合、パンニングを2回実施したものについてファージELISAを実施したと
ころ、ELISA陽性となったものは94クローン中70クローンであったため、パンニングを2回
実施したものが解析された。
上記のファージELISAを実施したクローンに対し、特異的なプライマーを用いて増幅さ
れた遺伝子の塩基配列が解析された。
ファージELISAおよび配列解析の結果が以下の表6に示されている。
同様の方法により、ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリから、pH依存的
抗原結合能をもつ抗体取得が行われた。抗原結合能を指標に濃縮した場合、88クローン評
価中13種類のpH依存的結合抗体が取得された。またpH依存的抗原結合能を指標に濃縮した
場合、83クローン評価中27種類のpH依存的結合抗体が取得された。
以上の結果より、ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリと比較し、Hisラ
イブラリ１のほうが得られるpH依存的抗原結合能をもつクローンのバリエーションが多い
ことが確認された。
（３－３）抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。
ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expression
Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレー
トの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培
養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光
度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Prot
ein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（３－４）取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対するpH依存的結合能の評価
（３－３）で取得された抗体6RpH#01（重鎖配列番号：１８、軽鎖配列番号：１９）、
および、6RpH#02（重鎖配列番号：２０）、軽鎖配列番号：２１）、および、6RpH#03（重
鎖配列番号：２２）、軽鎖配列番号：２３）のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がpH
依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの相互作用
がBiacore T100（GE Healthcare）を用いて解析された。ヒトIL-6レセプターに対するp
H依存性の結合活性を有しない対照抗体として、トシリズマブ（重鎖配列番号：２４）、
軽鎖配列番号：２５）が用いられた。中性域pHおよび酸性域pHの条件として、それぞれpH
7.4およびpH6.0の溶液中で抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法
でprotein A/G（Invitrogen）が適当量固定化されたSensor chip CM5（GE Healthcar
e）上に、目的の抗体がそれぞれ300RU程度キャプチャーされた。ランニングバッファーに
は20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2（pH7.4）ま
たは20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM CaCl2（pH6.0）の2
種類の緩衝液が用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用
された。測定は全て37℃で実施された。
対照抗体であるトシリズマブ抗体、6RpH#01抗体および6RpH#02抗体および6RpH#03抗体
を用いた抗原抗体反応の相互作用の解析に際して、IL-6レセプターの希釈液とブランクで
あるランニングバッファーを流速5μL/minで3分間インジェクトすることによって、セン
サーチップ上にキャプチャーさせたトシリズマブ抗体、6RpH#01抗体および6RpH#02抗体お
よび6RpH#03抗体にIL-6レセプターを相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl（pH
1.5）を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生さ
れた。
前記の方法により測定されたpH7.4におけるセンサーグラムが、図２に示されている。
また同様の方法で取得されたpH6.0の条件下でのセンサーグラムが、図３に示されている
。
前記の結果から、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体および6RpH#03抗体は、バッファー中のpH
をpH7.4からpH6.0にすることで、IL6レセプターに対する結合能が大幅に低減することが
観察された。
［実施例4］pH依存的に抗原に結合する抗体を取得するためのヒト抗体ファージディスプ
レイライブラリ（Hisライブラリ2）の作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として
PCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。実施例１に記載される
ように、pH依存的抗原結合能をもつ抗体の出現頻度を向上させるため、抗体可変領域の軽
鎖部分のうち、抗原接触部位となる可能性の高い部位のヒスチジン残基の出現頻度を高め
た抗体可変領域軽鎖部分が設計される。また、フレキシブル残基のうちヒスチジンが導入
された残基以外のアミノ酸残基として、天然ヒト抗体でのアミノ酸出現頻度の情報から特
定される出現頻度の高いアミノ酸が均等に分布させた抗体軽鎖可変領域のライブラリが設
計される。上記のように設計された抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリが、合成される
。ライブラリの合成は商業的な受託会社等に委託して作製することも可能である。このよ
うに作製された抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブ
ラリとの組合せがファージミドベクターへ挿入され、公知の方法（Methods Mol Biol.
(2002) 178, 87-100）に準じて、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示するヒト
抗体ファージディスプレイライブラリが構築される。実施例2に記載された方法に準じて
、抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された抗体遺伝子部分の配列が確認
される。
［実施例5］pH依存的にIL-6Rに結合する抗体の取得
（５－１）ビーズパンニングによるライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗体断片
の取得
構築されたHisライブラリ2からの最初の選抜は、抗原（IL-6レセプター）への結合能を
もつ抗体断片のみの濃縮によって実施される。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行
われる。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加すること
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られる。次に、ファージライブラリ液にブロッキング剤としてBSAもしくはスキム
ミルクが添加される。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化し
た抗原を用いたパンニング方法が参照される（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (
1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. P
rog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。磁
気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-co
ated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用
いられる。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原を加え
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させる。ブロッ
キング剤でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気
ビーズと室温にて15分間結合させる。ビーズは1 mLのTBSTにて3回洗浄された後、1 mL
のTBSにてさらに2回洗浄される。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビ
ーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファー
ジ溶液が回収される。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となっ
た10 mLの大腸菌株ER2738に添加される。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を
行うことによって、ファージを大腸菌に感染させる。感染させた大腸菌は、225 mm x
225 mmのプレートへ播種される。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによって、ファージライブラリ液が調製される。
2回目以降のパンニングでは、抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標にファージの
濃縮が行われる。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識
抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させる。BSA
もしくはスキムミルクでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの
複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させる。ビーズは1 mLのTBSTとTBSにて洗浄され
る。その後、抗原結合能を指標として濃縮する場合は1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えら
れたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、
ファージ溶液が回収される。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場合は0.1 mLの50 m
M MES/1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl（pH5.5）が加えられたビーズは室温で懸濁された
後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収される。回収さ
れたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示し
ないファージのpIIIタンパク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、
Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせる。回収されたファージが、
対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加される。37℃で1
時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させる
。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種される。次に、播種された
大腸菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された
。抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標とするパンニングが複数回繰り返される。
（５－２）ファージELISAによる評価
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収される。
BSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供さ
れた。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む10
0μLのPBSにて一晩コートされる。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによ
って抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングさ
れる。4%BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを3
7℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に
結合させる。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS（pH7
.6）もしくは1.2 mM CaCl2/TBS（pH5.5）が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静
置しインキュベートされる。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に4% BSAおよびイオ
ン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham
Pharmacia Biotech）が各ウエルに添加されたプレートを１時間インキュベートさせる。
1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の
溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色
が測定される。
上記のファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断される抗体
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われ
る。
（５－３）抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入される。抗体の発現は以下の方法を用いて行われる。
ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expression
Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレー
トの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれる。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入される。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培
養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製される。分光光
度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定される。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出される（Prot
ein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（５－４）取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対するpH依存的結合能の評価
実施例５で取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がpH依存的であるか
どうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの相互作用解析がBiacore
T100（GE Healthcare）を用いて行われる。ヒトIL-6レセプターに対するpH依存性の結
合活性を有しない対照抗体として、トリシズマブ（重鎖配列番号：２４、軽鎖配列番号：
２５）が用いられる。中性域pHおよび酸性域pHの条件として、それぞれｐH7.4およびpH6.
0の溶液中で抗原抗体反応の相互作用解析が行われる。アミンカップリング法でprotein
A/G（Invitrogen）が適当量固定化されたSensor chip CM5（GE Healthcare）上に、目
的の抗体がキャプチャーされる。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaC
l、0.05%(w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2（pH7.4）または20 mM ACES、150 mM NaCl
、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM CaCl2（pH6.0）の2種類の緩衝液が用いられる。ヒトI
L-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用される。測定は全て37℃で実施さ
れる。
対照抗体であるトシリズマブ抗体、実施例５で取得される抗体を用いた抗原抗体反応の
相互作用解析に際して、IL-6レセプターの希釈液とブランクであるランニングバッファー
をインジェクトすることによって、センサーチップ上にキャプチャーさせ抗体にIL-6レセ
プターを相互作用させる。その後、10 mM Glycine-HCl（pH1.5）を流速30μL/minで30
秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生される。pH6.0の条件下での
センサーグラムも、同様の方法で取得する。
［実施例6］カルシウムイオンに結合するヒト生殖細胞系列配列の探索
（６－１）カルシウム依存的に抗原に結合する抗体
カルシウム依存的に抗原に結合する抗体（カルシウム依存的抗原結合抗体）はカルシウ
ムの濃度によって抗原との相互作用が変化する抗体である。カルシウム依存的抗原結合抗
体は、カルシウムイオンを介して抗原に結合すると考えられるため、抗原側のエピトープ
を形成するアミノ酸は、カルシウムイオンをキレートすることが可能な負電荷のアミノ酸
あるいは水素結合アクセプターとなりうるアミノ酸である（図４Ｂ）。こうしたエピトー
プを形成するアミノ酸の性質から、図４Ａに示されるヒスチジンを導入することにより作
製されるpH依存的に抗原に結合する結合分子以外のエピトープをターゲットすることが可
能となる。さらに、図４Ｃに示されるように、カルシウム依存的およびpH依存的に抗原に
結合する性質を併せ持つ抗原結合分子を用いることで、幅広い性質を有する多様なエピト
ープを個々にターゲットすることが可能な抗原結合分子を作製することが可能となると考
えられる。そこで、カルシウムが結合するモチーフを含む分子の集合（Caライブラリ）を
構築し、この分子の集団から抗原結合分子を取得すれば、カルシウム依存的抗原結合抗体
が効率的に得られると考えられる。
（６－２）ヒト生殖細胞系列配列の取得
カルシウムが結合するモチーフを含む分子の集合の例として、当該分子が抗体である例
が考えられる。言い換えればカルシウムが結合するモチーフを含む抗体ライブラリがCaラ
イブラリである場合が考えられる。
ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体でカルシウムイオンが結合するものはこれまで報告さ
れていない。そこで、ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか
否かを判定するため、Human Fetal Spreen Poly RNA（Clontech）から調製されたcDN
Aを鋳型としてヒト生殖細胞系列配列を含む抗体の生殖細胞系列の配列がクローニングさ
れた。クローニングされたDNA断片は動物細胞発現ベクターに挿入された。得られた発現
ベクターの塩基配列が、当業者公知の方法で決定され、アミノ酸配列の配列番号が表7に
示されている。配列番号：６（Vk1）、配列番号：７（Vk2）、配列番号：８（Vk3）、配
列番号：９（Vk4）ならびに配列番号：１（Vk5）をコードするポリヌクレオチドが、PCR
法によって天然型Kappa鎖の定常領域（配列番号：２６）をコードするポリヌクレオチド
と連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。また、配列番号：２
７（Vk1）、配列番号：２８（Vk2）、配列番号：２９（Vk3）ならびに配列番号：３０（V
k4）をコードする重鎖可変領域ポリヌクレオチドが、PCR法によって配列番号：１４のC末
端の２アミノ酸が欠失したIgG1をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、
動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で
確認された。なお、ヒトのVk1はhVk1、ヒトのVk2はhVk2、ヒトのVk3はhVk3、ヒトのVk4は
hVk4と記載することがある。
（６－３）抗体の発現と精製
取得された5種類のヒト生殖細胞系列配列を含むDNA断片が挿入された動物細胞発現ベク
ターが動物細胞へ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細
胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expression Medium培地（
Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエル
へ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ
導入される。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培養が行われた。
rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知
の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精
製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数
を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science
(1995) 4, 2411-2423）。
（６－４）ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体のカルシウムイオン結合活性の評価
精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。抗体へのカルシウムイオン
の結合の評価の指標として、示差走査型熱量測定（DSC）による熱変性中間温度（Tm値）
が測定された（MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal）。熱変性中間温度（Tm値）は
安定性の指標であり、カルシウムイオンの結合によってタンパク質が安定化すると、熱変
性中間温度（Tm値）はカルシウムイオンが結合していない場合に比べて高くなる（J. Bi
ol.Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149）。抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変
化に応じた抗体のTm値の変化を評価することによって、抗体へのカルシウムイオンの結合
活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2
（pH7.4）または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, 3μM CaCl2（pH7.4）の溶液を外
液とする透析（EasySEP、TOMY）処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0
.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速
度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabド
メインの熱変性中間温度（Tm値）が表8に示されている。
その結果、hVk1、hVk2、hVk3、hVk4配列を含む抗体のFabドメインのTm値は、当該Fabド
メインを含む溶液中のカルシウムイオンの濃度によらず変動しなかった。一方で、hVk5配
列を含む抗体のFabドメインのTm値は、当該Fabドメインを含む抗体溶液中のカルシウムイ
オンの濃度によって変動したことから、hVk5配列がカルシウムイオンと結合することが示
された。
（６－５）hVk5-2配列のカルシウム結合評価
実施例６の（６－２）においてVk5-2（配列番号：１に配列番号：２６が融合されたも
の）のほかにVk5-2に分類されるVk5-2バリアント１（配列番号：２）およびVk5-2バリア
ント２（配列番号：３）が得られた。これらのバリアントについてもカルシウム結合評価
が行われた。Vk5-2、Vk5-2バリアント１およびVk5-2バリアント２のDNA断片がそれぞれ動
物細胞用発現ベクターに組み込まれた。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の
方法で決定された。Vk5-2、Vk5-2バリアント１およびVk5-2バリアント２のDNA断片がそれ
ぞれ組み込まれた動物細胞用発現ベクターは、重鎖としてCIM＿H（配列番号：４）が発現
するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例6の（６－３）で記載した方法
で共に動物細胞中に導入され、抗体が精製された。精製された抗体のカルシウムイオン結
合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl
2（pH7.5）または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl（pH7.5）の溶液（表9ではカルシウ
ムイオン濃度0mMと表記）を外液とする透析（EasySEP、TOMY）処理に供された。透析に用
いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃か
ら115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづ
いて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度（Tm値）が表9に示されている。
その結果、Vk5-2、Vk5-2バリアント１およびVk5-2バリアント２の配列を含む抗体のFab
ドメインのTm値は、当該Fabドメインを含む抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度によっ
て変動したことから、Vk5-2に分類される配列を持つ抗体はカルシウムイオンと結合する
ことが示された。
［実施例7］ヒトVk5（hVk5）配列の評価
（７－１）hVk5配列
Kabatデータベース中には、hVk5配列としてhVk5-2配列のみが登録されている。以下で
は、hVk5とhVk5-2は同義で扱われる。WO2010136598では、hVk5-2配列の生殖細胞系列配列
中の存在比は0.4%と記載されている。他の報告でもhVk5-2配列の生殖細胞系列配列中の存
在比は0～0.06％と述べられている（J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86、Proc. Na
tl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221）。上記のように、hVk5-2配列は、
生殖細胞系列配列中で出現頻度が低い配列であるため、ヒト生殖細胞系列配列で構成され
る抗体ライブラリやヒト抗体を発現するマウスへの免疫によって取得されたB細胞から、
カルシウムと結合する抗体を取得することは非効率であると考えられた。そこで、ヒトhV
k5-2配列を含むCaライブラリを設計する可能性が考えられるが、報告されている合成抗体
ライブラリ（WO2010105256やWO2010136598）ではhVk5配列は含まれていなかった。さらに
、hVk5-2配列の物性は報告されておらず、その実現の可能性は未知であった。
（７－２）糖鎖非付加型hVk5-2配列の構築、発現および精製
hVk5-2配列は20位（Kabatナンバリング）のアミノ酸にN型糖鎖が付加する配列を有する
。タンパク質に付加する糖鎖にはヘテロジェニティーが存在するため、物質の均一性の観
点から糖鎖は付加されないほうが望ましい。そこで、20位（Kabatナンバリング）のAsn（
N）残基がThr（T）残基に置換された改変体hVk5-2＿L65（配列番号：５）が作製された。
アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用い
る当業者公知の方法で行われた。改変体hVk5-2＿L65をコードするDNAが動物発現用ベクタ
ーに組み込まれた。作製された改変体hVk5-2＿L65のDNAが組み込まれた動物発現用ベクタ
ーは、重鎖としてCIM＿H（配列番号：４）が発現するように組み込まれた動物発現用のベ
クターと、実施例6で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞
中で発現したhVk5-2＿L65 およびCIM＿Hを含む抗体が、実施例6で記載した方法で精製さ
れた。
（７－３）糖鎖非付加型hVk5-2配列を含む抗体の物性評価
取得された改変配列hVk5-2＿L65を含む抗体が、改変に供されたもとのhVk5-2配列を含
む抗体よりも、そのヘテロジェニティーが減少しているか否かが、イオン交換クロマトグ
ラフィーを用いて分析された。イオン交換クロマトグラフィーの方法は表10に示されてい
る。分析の結果、図5に示されるように糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2＿L65は、元のhV
k5-2配列よりもヘテロジェニティーが減少していることが示された。
次に、ヘテロジェニティーが減少したhVk5-2＿L65配列を含む抗体がカルシウムイオン
と結合するか否かが、実施例6に記載された方法を用いて評価された。その結果、表11に
示されるように、糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2＿L65を含む抗体のFabドメインのTm値
も、抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度の変化によって変動した。すなわち、糖鎖付加
部位が改変されたhVk5-2＿L65を含む抗体のFabドメインにカルシウムイオンが結合するこ
とが示された。
［実施例8］hVk5-2配列のCDR配列を含む抗体分子に対するカルシウムイオンの結合活性の
評価
（８－１）hVk5-2配列のCDR配列を含む改変抗体の作製、発現および精製
hVk5-2＿L65配列はヒトVk5-2配列のフレームワークに存在する糖鎖付加部位のアミノ酸
が改変された配列である。実施例7で糖鎖付加部位を改変してもカルシウムイオンが結合
することが示されたが、フレームワーク配列は生殖細胞系列の配列であることが免疫原性
の観点から一般的には望ましい。そこで、抗体のフレームワーク配列を、当該抗体に対す
るカルシウムイオンの結合活性を維持しながら、糖鎖が付加されない生殖細胞系列配列の
フレームワーク配列に置換することが可能であるか否かが検討された。
化学合成されたhVk5-2配列のフレームワーク配列がhVk1、hVk2、hVk3および hVk4配列
に改変された配列（それぞれCaVk1（配列番号：３１）、CaVk2（配列番号：３２）、CaVk
3（配列番号：３３）、CaVk4（配列番号：３４）をコードするポリヌクレオチドが、PCR
法によって天然型Kappa鎖の定常領域（配列番号：２６）をコードするポリヌクレオチド
と連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の
配列は当業者公知の方法で確認された。上記のように作製された各プラスミドは、CIM＿H
（配列番号：４）をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドと共に実施例
6で記載された方法で動物細胞に導入された。上記のように導入された動物細胞の培養液
から、発現した所望の抗体分子が精製された。
（８－２）hVk5-2配列のCDR配列を含む改変抗体のカルシウムイオン結合活性の評価
hVk5-2配列以外の生殖細胞系列配列（hVk1、hVk2、hVk3、hVk4）のフレームワーク配列
およびhVK5-2配列のCDR配列を含む改変抗体に、カルシウムイオンが結合するか否かが実
施例6に記載された方法によって評価された。評価された結果が表12に示される。各改変
抗体のFabドメインのTm値は、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化によって変動す
ることが示された。よって、hVk5-2配列のフレームワーク配列以外のフレームワーク配列
を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。
さらに、hVk5-2配列以外の生殖細胞系列配列（hVk1、hVk2、hVk3、hVk4）のフレームワ
ーク配列およびhVK5-2配列のCDR配列を含むように改変された各抗体のFabドメインの熱安
定性の指標である熱変性温度（Tm値）は、改変に供されたもとのhVk5-2配列を含む抗体の
FabドメインのTm値よりも増加することが明らかになった。この結果から、hVk1、hVk2、h
Vk3、hVk4のフレームワーク配列およびhVk5-2配列のCDR配列を含む抗体はカルシウムイオ
ンと結合する性質を有する上に、熱安定性の観点でも優れた分子であることが見出された
。
［実施例9］ヒト生殖細胞系列hVk5-2配列に存在するカルシウムイオン結合部位の同定
（９－１）hVk5-2配列のCDR配列中の変異部位の設計
実施例8に記載されているように、hVk5-2配列のCDR部分が他の生殖細胞系列のフレーム
ワーク配列に導入された軽鎖を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。
この結果からhVk5-2に存在するカルシウムイオン結合部位はCDRの中に存在することが示
唆された。カルシウムイオンと結合する、すなわち、カルシウムイオンをキレートするア
ミノ酸として、負電荷のアミノ酸もしくは水素結合のアクセプターとなりうるアミノ酸が
挙げられる。そこで、hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAsp（D）残基またはGlu（E）残
基がAla（A）残基に置換された変異hVk5-2配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合する
か否かが評価された。
（９－２）hVk5-2配列のAla置換体の作製ならびに抗体の発現および精製
hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAspおよび/ またはGlu残基がAla残基に改変された
軽鎖を含む抗体分子が作製された。実施例7で記載されるように、糖鎖が付加されない改
変体hVk5-2＿L65はカルシウムイオン結合を維持していたことから、カルシウムイオン結
合性という観点ではhVk5-2配列と同等と考えられる。本実施例ではhVk5-2＿L65をテンプ
レート配列としてアミノ酸置換が行われた。作製された改変体は表13に示されている。ア
ミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）、PCRまた
はIn fusion Advantage PCR cloning kit（TAKARA）等の当業者公知の方法によって
行われ、アミノ酸が置換された改変軽鎖の発現ベクターが構築された。
得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。作製された改変軽
鎖の発現ベクターを重鎖CIM＿H（配列番号：４）の発現ベクターと共に、ヒト胎児腎癌細
胞由来HEK293H株（Invitrogen）、またはFreeStyle293細胞（Invitrogen）に一過性に導
入することによって、抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProtein A Sepharo
seTM Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体が精製された。精
製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が、分光光度計を用いて測定された。PACE法によ
り算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された
（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（９－３）hVk5-2配列のAla置換体を含む抗体のカルシウムイオン結合活性評価
得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例6に記載された方法に
よって判定された。その結果が表14に示されている。hVk5-2配列のCDR配列中に存在するA
spまたはGlu残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla残基に置
換することによって、抗体溶液のカルシウムイオン濃度の変化によってそのFabドメイン
のTm値が変動しない抗体が存在した。Ala置換によってTm値が変動しない置換部位（32位
および92位（Kabatナンバリング））はカルシウムイオンと抗体の結合に特に重要である
ことが示された。
［実施例10］カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列を含む抗体の評価
（１０－１）カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列の作製ならびに抗体の発現
および精製
実施例9で記載されたAla置換体のカルシウムの結合活性の結果から、hVk5-2配列のCDR
配列の中でAspやGlu残基がカルシウム結合に重要であることが示された。そこで、30位、
31位、32位、50位および92位（Kabatナンバリング）の残基のみを他の生殖細胞系列の可
変領域配列に導入してもカルシウムイオンと結合できるか否かが評価された。具体的には
、ヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位（Kabatナン
バリング）の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位および92位（Kabatナンバリン
グ）の残基に置換された改変体LfVk1＿Ca（配列番号：４３）が作製された。すなわち、h
Vk5-2配列中のこれらの5残基のみが導入されたhVk1配列を含む抗体がカルシウムと結合で
きるか否かが判定された。改変体の作製は実施例9と同様に行われた。得られた軽鎖改変
体LfVk1＿Caおよび軽鎖hVk1配列を含むLfVk1（配列番号：４４）を、重鎖CIM＿H（配列番
号：４）と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例9と同様の方法で実施された
。
（１０－２）カルシウムイオン結合モチーフを有するヒトhVk1配列を含む抗体のカルシウ
ムイオン結合活性の評価
上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例6に記載
された方法で判定された。その結果を表15に示す。hVk1配列を有するLfVk1を含む抗体のF
abドメインのTm値は抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によっては変動しない一方で、
LfVk1＿Caを含む抗体配列の、Tm値は、抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1℃
以上変化したことから、LfVk1＿Caを含む抗体がカルシウムと結合することが示された。
上記の結果から、カルシウムイオンの結合には、hVk5-2のCDR配列がすべて必要ではなく
、LfVk1＿Ca配列を構築する際に導入された残基のみでも十分であることが示された。
（１０－３）分解抑制型LfVk1＿Ca配列の構築、発現および精製
実施例10の（１０－１）でヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50
位および92位（Kabatナンバリング）の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位およ
び92位（Kabatナンバリング）の残基に置換された改変体LfVk1＿Ca（配列番号：４３）が
作製され、カルシウムイオンが結合することが示された。そこで、LfVk1＿Ca配列を含むC
aライブラリを設計する可能性が考えられるが、LfVk1＿Ca配列の物性は報告されておらず
、その実現可能性は未知であった。LfVk1＿Ca配列は、30位、31位および32位（Kabatナン
バリング）にAspが存在し、酸性条件下で分解することが報告されているAsp-Asp配列がCD
R1配列中に存在する（J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1), 23-30）。保存安
定性の観点から、酸性条件での分解は避けることが望ましい。そこで、分解する可能性が
あるAsp（D）残基がAla（A）残基に置換された改変体LfVk1＿Ca1（配列番号：４５）、Lf
Vk1＿Ca2（配列番号：４６）およびLfVk1＿Ca3（配列番号：４７）が作製された。アミノ
酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いる当業
者公知の方法で行われた。改変体をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた
。作製された改変体のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてGC＿H（配列
番号：４８）が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例6で記載し
た方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現した抗体が、実施例
6で記載した方法で精製された。
（１０－４）分解抑制型LfVk1＿Ca配列を含む抗体の安定性評価
実施例10の（１０－３）で取得された抗体が、改変に供されたもとのLfVk1＿Ca配列を
含む抗体よりも、pH6.0溶液中での分解が抑制されているか否かが熱加速後の各抗体のヘ
テロジェニティーの比較によって評価された。各抗体が20 mM Histidine-HCl、150 mM
NaCl、pH6.0の溶液に一晩4℃の条件で透析された。透析された抗体は0.5mg/mLに調製さ
れ、5℃または50℃で3日間保存された。保存後の各抗体を実施例7に記載された方法でイ
オン交換クロマトグラフィーが行われた。分析の結果、図6に示されるように分解部位が
改変されたLfVk1＿Ca1は、元のLfVk1＿Ca配列よりもヘテロジェニティーが少なく、熱加
速による分解が著しく抑制されていることが示された。すなわち、LfVk1＿Ca配列中の30
位に存在するAsp（D）残基が分解することが示され、アミノ酸改変によって回避できるこ
とが示された。
（１０－５）軽鎖30位Asp残基分解抑制型LVk1＿Ca配列の作製ならびに抗体の発現および
精製
実施例10の（１０－４）で記載されたAla置換体の分解抑制の結果から、LfVk1＿Ca配列
のCDR配列の中で30位（Kabatナンバリング）のAsp（D）残基が酸性条件で分解し、30位（
Kabatナンバリング）を他のアミノ酸（（１０－４）では、Ala（A）残基に置換された）
に置換することで分解が抑制できることが示された。そこで、30位（Kabatナンバリング
）の残基をカルシウムイオンがキレートできる残基の代表であるSer（S）残基に置換した
配列（LfVk1＿Ca6とよぶ。配列番号：４９）としても、分解が抑制されるか否かが評価さ
れた。改変体の作製は実施例10と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1＿Ca6および
軽鎖LfVk1＿Ca配列を、重鎖GC＿H（配列番号：４８）と共に発現させた。抗体の発現およ
び精製は実施例10と同様の方法で実施された。
（１０－５）軽鎖30位Asp残基分解抑制型LVk1＿Ca配列の評価
上記のように得られた精製抗体の酸性条件下における保存安定性が実施例10の（１０－
４）に記載された方法で判定された。その結果、図7に示すように、LfVk1＿Ca6配列を含
む抗体は、元のLfVk1＿Ca配列を含む抗体よりも分解が抑制されていることが示された。
さらに、LfVk1＿Ca配列を含む抗体およびLfVk1＿Ca6配列を含む抗体がカルシウムイオ
ンと結合するか否かが実施例6に記載された方法で判定された。その結果を表16に示す。L
fVk1＿Ca配列を含む抗体および分解抑制型であるLfVk1＿Ca6配列を含む抗体のFabドメイ
ンのTm値は、それぞれ抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1℃以上変化した。
［実施例11］Ca濃度依存的に抗原に結合する結合抗体が効率よく取得できるように、カル
シウムイオン結合モチーフが可変領域に導入された抗体分子の集団（Caライブラリ）の設
計
カルシウム結合モチーフとして、例えばhVk5-2配列やそのCDR配列、さらに残基が絞ら
れた30位、31位、32位、50位、92位（Kabatナンバリング）が好適に挙げられる。他にも
、カルシウムと結合するタンパク質が有するEFハンドモチーフ（カルモジュリンなど）や
Cタイプレクチン（ASGPRなど）もカルシウム結合モチーフに該当する。
Caライブラリは重鎖可変領域と軽鎖可変領域から構成される。重鎖可変領域はヒト抗体
配列が使用され、軽鎖可変領域にカルシウム結合モチーフが導入された。カルシウム結合
モチーフが導入される軽鎖可変領域のテンプレート配列として、hVk1配列が選択された。
hVk1配列にカルシウム結合モチーフのうちの一つであるhVk5-2のCDR配列が導入されたLfV
k1＿Ca配列を含む抗体は実施例10で示したように、カルシウムイオンと結合することが示
された。テンプレート配列に複数のアミノ酸を出現させてライブラリを構成する抗原結合
分子の多様性が拡げられた。複数のアミノ酸を出現させる位置は、抗原と相互作用する可
能性が高い可変領域の表面に露出する位置が選択された。具体的には、30位、31位、32位
、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位および96位（Kabatナンバリング）が、こ
うしたフレキシブル残基として選択された。
次に出現させるアミノ酸残基の種類とその出現率が設定された。Kabatデータベース（K
ABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest',
vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION）に登録されているhVk1とhVk3の配列中のフレキシ
ブル残基におけるアミノ酸の出現頻度が解析された。解析結果を元に、各位置で出現頻度
が高いアミノ酸からCaライブラリで出現させるアミノ酸の種類が選択された。この際、ア
ミノ酸の性質が偏らないように解析結果では出現頻度が少ないと判定されたアミノ酸も選
択された。また、選択されたアミノ酸の出現頻度は、Kabatデータベースの解析結果を参
考にして設定された。
以上のように設定されたアミノ酸および出現頻度を考慮することによって、Caライブラ
リとして、カルシウム結合モチーフを含み、当該モチーフ以外の各残基で複数のアミノ酸
を含むような配列の多様性が重視されたCaライブラリが設計された。表17および18にCaラ
イブラリの詳細なデザインが示されている（各表中の位置はKabatナンバリングを表す）
。また、表17および18で記載されるアミノ酸の出現頻度は、Kabatナンバリングで表され
る92位がAsn（N）の場合、94位はSer（S）ではなくLeu（L）とすることができる。
［実施例12］Caライブラリの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として
PCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。抗体軽鎖可変領域部分
については、実施例11に記載されるように、カルシウム結合モチーフを維持しカルシウム
濃度依存的に抗原に対して結合可能な抗体の出現頻度を高めた抗体可変領域軽鎖部分が設
計された。また、フレキシブル残基のうちカルシウム結合モチーフが導入された残基以外
のアミノ酸残基として、天然ヒト抗体でのアミノ酸出現頻度の情報（（KABAT, E.A. ET
AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991
, NIH PUBLICATION）が参考にされ、天然ヒト抗体の配列中で出現頻度の高いアミノ酸
を均等に分布させた抗体軽鎖可変領域のライブラリが設計された。このように作製された
抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリとの組合せ
がファージミドベクターへ挿入され、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示するヒト
抗体ファージディスプレイライブラリ（Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100）
が構築された。
実施例2に記載された方法に準じて、抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単
離された抗体遺伝子部分についての配列が確認された。得られた290種類のクローンの配
列のアミノ酸分布と、設計したアミノ酸分布が、図8に示されている。
［実施例13］Caライブラリに含まれる分子のカルシウムイオン結合活性の評価
（１３－１）Caライブラリに含まれる分子のカルシウムイオン結合活性
実施例7に示されているように、カルシウムイオンと結合することが示されたhVk5-2配
列は生殖細胞系列配列中で出現頻度が低い配列であるため、ヒト生殖細胞系列配列で構成
される抗体ライブラリやヒト抗体を発現するマウスへの免疫によって取得されたB細胞か
ら、カルシウムと結合する抗体を取得することは非効率であると考えられた。そこで、実
施例12でCaライブラリが構築された。構築されたCaライブラリにカルシウム結合を示すク
ローンが存在するか評価された。
（１３－２）抗体の発現と精製
Caライブラリに含まれるクローンが、動物細胞発現用プラスミドへ導入される。抗体の
発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrog
en）がFreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 1
06細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製された
プラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（3
7度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Fl
ow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養
上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光
度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定
値から抗体濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
（１３－３）取得された抗体へのカルシウムイオン結合評価
上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例６に記載
された方法で判定された。その結果を表19に示す。Caライブラリに含まれる複数の抗体の
FabドメインのTmはカルシウムイオン濃度によって変動し、カルシウムイオンと結合する
分子が含まれることが示された。
［実施例14］Ca依存的にIL-6レセプターに結合する抗体の取得
（１４－１）ビーズパンニングによるライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体断
片の取得
構築されたCaライブラリからの最初の選抜は、抗原（IL-6レセプター）への結合能をも
つ抗体断片のみの濃縮によって実施された。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行
われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加すること
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液にBSA、およびCaCl2を添加することによって
終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンとなるよう調製された。パンニング方法として、
一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（
J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001)
247 (1-2),191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Pro
teomics (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（
Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（D
ynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原を加え
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室
温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2を含むTB
ST）にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM CaCl2を含むTBS）に
てさらに2回洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは室温で
15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収
された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大
腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによ
って、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプ
レートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによ
って、ファージライブラリ液が調製された。
2回目のパンニングでは、抗原結合能もしくはCa依存的結合能を指標にファージの濃縮
が行われた。
具体的には、抗原結合能を指標に濃縮を行った際には、調製したファージライブラリ液
に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分
間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージ
との複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TB
STにて3回、1.2 mM CaCl2/TBSにて2回洗浄された。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5
mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズ
が分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリ
プシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質（ヘルパ
ーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対
する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）とな
った10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養
を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x
225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによってファージライブラリ液が回収された。
Ca依存的結合能を指標に濃縮を行った際には、調製したファージライブラリ液に40 pm
olのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と
接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合
体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2
mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM EDTA/TBS（2 mMのEDTAを含
むTBS）が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズ
が分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリ
プシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質（ヘルパ
ーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対
する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）とな
った10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養
を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x
225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによってファージライブラリ液が回収された。
（１４－２）ファージELISAによる評価
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
BSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供さ
れた。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む10
0μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによ
って抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングさ
れた。4% BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレート
を37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗
原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS
もしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベー
トされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、イオン化カルシウム濃度1.2 mMと
したTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）が各ウ
エルに添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗
浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添
加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
上記のファージELISAを実施したクローンに対し、特異的なプライマーを用いて増幅さ
れた遺伝子の塩基配列解析が行われた。ファージELISA、配列解析の結果を以下の表20に
示した。
（１４－３）抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。
ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expression
Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレー
トの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法に
よって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培養
が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用い
て当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度
計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出さ
れた吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Protei
n Science (1995)4, 2411-2423）。
（１４－４）取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対するCa依存的結合能の評価
実施例１４で取得された抗体6RC1IgG＿010（重鎖配列番号：７２、軽鎖配列番号：７３
）、および、6RC1IgG＿012（重鎖配列番号：７４、軽鎖配列番号：７５）、および、6RC1
IgG＿019（重鎖配列番号：７６、軽鎖配列番号：７７）のヒトIL-6レセプターに対する結
合活性がCa依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターと
の相互作用解析がBiacore T100（GE Healthcare）を用いて行われた。ヒトIL-6レセプ
ターに対するCa依存性の結合活性を有しない対照抗体として、トリシズマブ（重鎖配列番
号：２４、軽鎖配列番号：２５）が用いられた。高カルシウムイオン濃度および低カルシ
ウムイオン濃度の条件として、それぞれ1.2 mMおよび3μMのカルシウムイオン濃度の溶
液中で相互作用解析が行われた。アミンカップリング法でprotein A/G（Invitrogen）が
適当量固定化されたSensor chip CM5（GE Healthcare）上に、目的の抗体がキャプチ
ャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) T
ween20、1.2 mMCaCl2（pH7.4）または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tw
een20、3μM CaCl2（pH7.4）の2種類の緩衝液が用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈
にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は全て37℃で実施された。
対照抗体であるトシリズマブ抗体、6RC1IgG＿010抗体および6RC1IgG＿012抗体および6R
C1IgG＿019抗体を用いた抗原抗体反応の相互作用解析に際して、IL-6レセプターの希釈液
とブランクであるランニングバッファーを流速5μL/minで3分間インジェクトすることに
よって、センサーチップ上にキャプチャーさせたトシリズマブ抗体、6RC1IgG＿010抗体お
よび6RC1IgG＿012抗体および6RC1IgG＿019抗体にIL-6レセプターを相互作用させた。その
後、10 mM Glycine-HCl（pH1.5）を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによ
って、センサーチップが再生された。
この方法により測定された高カルシウムイオン濃度におけるセンサーグラムが、図9に
示されている。
低カルシウムイオン濃度の条件下でのトシリズマブ抗体、6RC1IgG＿010抗体および6RC1
IgG＿012抗体および6RC1IgG＿019抗体についてのセンサーグラムも、同様の方法で取得し
た。低カルシウムイオン濃度におけるセンサーグラムが、図10に示されている。
上記の結果から、6RC1IgG＿010抗体および6RC1IgG＿012抗体および6RC1IgG＿019抗体は
、バッファー中のカルシウムイオン濃度を1.2mMから3μMにすることで、IL6レセプターに
対する結合能が大幅に低減することが観察された。
［実施例15］ファージディスプレイ技術を用いたヒト抗体ライブラリからのCa依存的にIL
-6レセプターに結合する抗体の取得
（１５－１）ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として
当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複
数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
（１５－２）ビーズパンニングによるライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体断
片の取得
構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリからの最初の選抜は、抗
原（IL-6レセプター）への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮、または、Ca濃度依存的な抗
原（IL-6レセプター）への結合能を指標とした抗体断片の濃縮によって実施された。Ca濃
度依存的な抗原（IL-6レセプター）への結合能を指標として抗体断片の濃縮は、Caイオン
をキレートするEDTAを用いてCaイオン存在下でIL-6レセプターと結合させたファージライ
ブラリからファージを溶出することによって実施された。抗原としてビオチン標識された
IL-6レセプターが用いられた。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行
われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加すること
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4％BSAおよび1.2mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が添加された。パンニング方法として、一般的な方法
である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（J. Immunol.
Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2)
, 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (
2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag
SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabeads
M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原を加え
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室
温にて15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM CaCl2を含むT
BS）にて1回洗浄された。その後、IL-6レセプターへの結合能をもつ抗体断片を濃縮する
場合には、一般的な方法による溶出によって、Ca濃度依存的なIL-6レセプターへの結合能
を指標として抗体断片を濃縮する場合には、2 mM EDTA/TBS（2mMEDTAを含むTBS）に懸
濁されたビーズからの溶出によって、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶
液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株TG1に添加された。37℃
で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染さ
せた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種
された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調
製された。
2回目以降のパンニングでは、Ca依存的結合能を指標にファージの濃縮が行われた。具
体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることに
よって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされ
た磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合さ
せた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その
後0.1mLの2 mM EDTA/TBSが加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタン
ドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、
対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株TG1に添加された。37℃で1時間
緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感
染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸
菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。Ca
依存的結合能を指標とするパンニングが複数回繰り返された。
（１５－３）ファージELISAによる評価
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
終濃度4％BSAおよび1.2 mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加え
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マ
イクロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コート
された。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当
該ウエルが1時間以上250μLの4％BSA-TBSにてブロッキングされた。4％BSA-TBSが除かれ
た各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置すること
によって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に結合させた。1.2 mM C
aCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加
えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBS
Tにて洗浄された後に、終濃度4％のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTB
Sによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）が各ウエルに
添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、T
MB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加によ
り停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
上記のファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断される抗体
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われ
た。
（１５－４）抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。
ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expression
Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレー
トの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培
養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光
度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Prot
ein Science (1995) 4, 2411-2423）。
［実施例16］取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対するCa依存的結合能の評価
実施例15で取得された抗体6RL#9-IgG1（重鎖（配列番号：７８、配列番号：１０にIgG1
由来定常領域が連結された配列）、軽鎖配列番号：７９）、および、FH4-IgG1（重鎖配列
番号：８０、軽鎖配列番号：８１）のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がCa依存的で
あるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの抗原抗体反応の速
度論的解析がBiacore T100（GE Healthcare）を用いて行われた。ヒトIL-6レセプター
に対するCa依存性の結合活性を有しない対照抗体として、WO2009125825に記載されている
H54/L28-IgG1（重鎖配列番号：８２、軽鎖配列番号：８３）が用いられた。高カルシウム
イオン濃度および低カルシウムイオン濃度の条件として、それぞれ2 mMおよび3μMのカ
ルシウムイオン濃度の溶液中で抗原抗体反応の速度論的解析が行われた。アミンカップリ
ング法でprotein A（Invitrogen）が適当量固定化されたSensor chip CM4（GE Healt
hcare）上に、目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには10 mM ACE
S、150 mMNaCl、0.05% (w/v) Tween20、2 mM CaCl2（pH7.4）または10 mM ACES、
150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、3μmol/L CaCl2（pH7.4）の2種類の緩衝液が
用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は
全て37℃で実施された。
H54/L28-IgG1抗体を用いた抗原抗体反応の速度論的解析に際して、IL-6レセプターの希
釈液とブランクであるランニングバッファーを流速20μL/minで3分間インジェクトするこ
とによって、センサーチップ上にキャプチャーさせたH54/L28-IgG1抗体にIL-6レセプター
を相互作用させた。その後、流速20μL/minで10分間ランニングバッファーを流しIL-6レ
セプターの解離が観察された後、10 mM Glycine-HCl（pH1.5）を流速30μL/minで30秒
間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定で得られたセンサ
ーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka（1/Ms）、および解
離速度定数 kd（1/s）が算出された。これらの値を用いてH54/L28-IgG1抗体のヒトIL-6
レセプターに対する解離定数KD（M）が算出された。各パラメーターの算出にはBiacore
T100 Evaluation Software（GE Healthcare）が用いられた。
FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体を用いた抗原抗体反応の速度論的解析に際しては、
IL-6レセプターの希釈液とブランクであるランニングバッファーを流速5μL/minで15分間
インジェクトすることによって、センサーチップ上にキャプチャーさせたFH4-IgG1抗体ま
たは6RL#9-IgG1抗体にIL-6レセプターを相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl
（pH1.5）を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再
生された。測定で得られたセンサーグラムからsteady state affinity modelを使って
解離定数KD（M）が算出された。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation
Software（GE Healthcare）が用いられた。
この方法により決定された2 mM CaCl2存在下における各抗体とIL-6レセプターとの解
離定数KDが表21に示されている。
Ca濃度が3μMの条件下でのH54/L28-IgG1抗体のKDは、2 mM Ca濃度存在下と同様の方
法で算出することが可能である。Ca濃度が3μMの条件下では、FH4-IgG1抗体および6RL#9-
IgG1抗体は、IL-6レセプターに対する結合はほとんど観察されなかったため、上記の方法
によるKDの算出は困難である。しかし、下記の式１（Biacore T100 Software Handboo
k, BR-1006-48, AE 01/2007）を用いることによって、Ca濃度が3μMの条件下でのこれ
らの抗体のKDを予測することが可能である。
［式１］
Req=C x Rmax/（KD+C）+RI
上記式１中の各項目の意味は下記；
Req（RU）: 定常状態結合レベル（Steady state binding levels）
Rmax（RU）:アナライトの表面結合能（Analyte binding capacity of the surface
）
RI（RU）: 試料中の容積屈折率寄与（Bulk refractive index contribution in th
e sample）
C（M）: アナライト濃度（Analyte concentration）
KD（M）: 平衡解離定数（Equilibrium dissociation constant）
で表される。
上記の式１を用いた、Ca濃度が3μmol/Lの場合の各抗体とIL-6レセプターとの解離定数
KDの予測される概算結果が表22に示されている。表22 中の、Req、Rmax、RI、Cは測定結
果を基に仮定された値である。
上記の結果から、FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体は、バッファー中のCaCl2の濃度
を2 mMから3μMに減少することで、IL-6レセプターに対するKDがそれぞれ約60倍、約120
倍上昇（60倍、120倍以上アフィニティーが低減）すると予測された。
表23にH54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1の3種類の抗体の2 mM CaCl2存在下およ
び3μM CaCl2存在下におけるKD値、および、KD値のCa依存性についてまとめた。
Ca濃度の違いによるH54/L28-IgG1抗体のIL-6レセプターに対する結合の違いは観察され
なかった。その一方、低濃度のCa条件下ではFH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体のIL-6レ
セプターに対する結合の著しい減弱が観察された（表23）。
［実施例17］取得された抗体へのカルシウムイオン結合評価
次に、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価の指標として、示差走査型熱量測定（DS
C）による熱変性中間温度（Tm値）が測定された（MicroCal VP-Capillary DSC、MicroC
al）。熱変性中間温度（Tm値）は安定性の指標であり、カルシウムイオンの結合によって
タンパク質が安定化すると、熱変性中間温度（Tm値）はカルシウムイオンが結合していな
い場合に比べて高くなる（J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149）。抗体
溶液中のカルシウムイオン濃度の変化に応じた抗体のTm値の変化を評価することによって
、抗体へのカルシウムイオンの結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-H
Cl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2（pH7.4）または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,
3μM CaCl2（pH7.4）の溶液を外液とする透析（EasySEP、TOMY）処理に供された。透析
に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20
℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にも
とづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度（Tm値）が表24に示されてい
る。
表24の結果から、カルシウム依存的結合能を示すFH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体の
FabのTm値はカルシウムイオンの濃度の変化により変動し、カルシウム依存的結合能を示
さないH54/L28-IgG1抗体のFabのTm値はカルシウムイオンの濃度の変化により変動しない
ことが示された。FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体のFabのTm値の変動は、これらの抗
体にカルシウムイオンが結合し、Fab部分が安定化したことを示している。上記の結果よ
り、FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体にはカルシウムイオンが結合し、一方でH54/L28-
IgG1抗体にはカルシウムイオンが結合していないことが示された。
［実施例18］6RL#9抗体のカルシウムイオン結合部位のX線結晶構造解析による同定
（１８－１）X線結晶構造解析
実施例17に示されたように、6RL#9抗体はカルシウムイオンと結合することが熱変性温
度Tm値の測定から示唆された。しかし、6RL#9抗体のどの部位がカルシウムイオンと結合
しているか予想できなかったため、X線結晶構造解析の手法を用いることによって、カル
シウムイオンが相互作用する6RL#9抗体の配列中の残基が特定された。
（１８－２）6RL#9抗体の発現および精製
X線結晶構造解析に用いるために発現させた6RL#9抗体が精製された。具体的には、6RL#
9抗体の重鎖（配列番号：７８）と軽鎖（配列番号：７９）をそれぞれ発現させることが
出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細
胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地（Invitr
ogen）へ懸濁された800 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）に
、リポフェクション法により調製されたプラスミドが導入された。プラスミドが導入され
た細胞はCO2インキュベーター（37℃、8%CO2、90 rpm）中で5日間培養された。rProtein
A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いた当業者公知の方法に
したがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて
精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係
数を用いて測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-242
3）。
（１８－３）6RL#9抗体からのFabフラグメントの精製
分子量分画サイズ10000MWCOの限外ろ過膜 を用いて6RL#9抗体が21 mg/mLまで濃縮さ
れた。L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）を用
いて5 mg/mLによって希釈された2.5 mLの当該抗体の試料が調製された。0.125 mgのPa
pain（RocheApplied Science）を加えて攪拌された当該試料が35℃にて2時間静置された
。静置後、プロテアーゼインヒビターカクテルミニ、EDTAフリー（Roche Applied Scie
nce）1錠を溶かした10 mLの25 mM MES 緩衝液（pH6）をさらに当該試料に加え、氷中
に静置することによって、Papainによるプロテアーゼ反応が停止された。次に、当該試料
が、下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSelect Sure（GE Healthcare
）がタンデムにつながれた25 mM MES 緩衝液pH6で平衡化された1 mLサイズの陽イオ
ン交換カラムHiTrap SP HP（GE Healthcare）に添加された。同緩衝液中NaCl濃度を30
0 mMまで直線的に上げて溶出をおこなうことで6RL#9抗体のFabフラグメントの精製画分
が得られた。次に、得られた精製画分が5000MWCOの限外ろ過膜 により0.8 mL程度まで
濃縮された。50 mM NaCl を含む100 mM HEPES緩衝液（pH 8）で平衡化されたゲル
ろ過カラムSuperdex 200 10/300 GL（GE Healthcare）に濃縮液が添加された。結晶
化用の精製6RL#9抗体のFabフラグメントが同緩衝液を用いてカラムから溶出された。なお
、上記のすべてのカラム操作は6から7.5℃の低温下にて実施された。
（１８－４）6RL#9抗体の FabフラグメントのCa存在下での結晶化
予め一般的な条件設定で6RL#9 Fabフラグメントの種結晶が得られた。つぎに5 mM
となるようにCaCl2が加えられた精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過
膜を用いて12 mg/mLに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、
前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として20-29%のPEG4
000を含む100 mM HEPES緩衝液（pH7.5）が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザ
ーバー溶液および0.8μlの前記濃縮試料の混合液に対して、29% PEG4000および5 mM C
aCl2を含む100 mM HEPES緩衝液（pH7.5）中で破砕された前記種結晶が100-10000倍に希
釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該
結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線
回折データが測定された。
（１８－５）6RL#9抗体の FabフラグメントのCa非存在下での結晶化
精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜 を用いて15 mg/mlに濃縮
された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料
の結晶化が実施された。リザーバー溶液として18-25%のPEG4000を含む100 mM HEPES緩
衝液（pH7.5）が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザーバー溶液および0.8μlの
前記濃縮試料の混合液に対して、25% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液（pH7.5）中
で破砕されたCa存在下で得られた6RL#9抗体のFabフラグメントの結晶が100-10000倍に希
釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該
結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線
回折データが測定された。
（１８－６）6RL#9抗体の FabフラグメントのCa存在下での結晶のX線回折データの測定
35% PEG4000および5 mM CaCl2を含む100mM HEPES緩衝液（pH7.5）の溶液に浸され
た6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンルー
プ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結
された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームライン
BL-17Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-17
8℃の窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付
けられたCCDディテクタQuantum315r（ADSC）を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトー
タル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折
データの処理がプログラムXia2（CCP4 Software Suite）、XDS Package（Walfgang K
absch）ならびにScala（CCP4 Software Suite）によって行われた。最終的に分解能2.2
Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数ａ＝45.
47Å、ｂ＝79.86Å、ｃ＝116.25Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°であった。
（１８－７）6RL#9抗体の FabフラグメントのCa非存在下での結晶のX線回折データの測
定
35% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液（pH7.5）の溶液に浸された6RL#9抗体のFab
フラグメントのCa非存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを
用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネ
ルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL-5Aを用いて
、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流
中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDデ
ィテクタQuantum210r（ADSC）を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回
折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理が
プログラムXia2（CCP4 Software Suite）、XDS Package（Walfgang Kabsch）ならび
にScala（CCP4 Software Suite）によって行われた。最終的に分解能2.3Åまでの回折
強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数ａ＝45.40Å、ｂ＝79
.63Å、ｃ＝116.07Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°であり、Ca存在下の結晶と同型で
あった。
（１８－８）6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造解析
プログラムPhaser（CCP4 Software Suite）を用いた分子置換法によって、6RL#9抗体
のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造が決定された。得られた結晶格子の大きさ
と6RL#9抗体のFabフラグメントの分子量から、非対称単位中の分子数が一個であると予想
された。一次配列上の相同性をもとにPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたA鎖1
12-220番およびB鎖116-218番のアミノ酸残基部分が、CLおよびCH1領域の探索用モデル分
子とされた。次にPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたB鎖1-115番のアミノ酸残
基部分が、VH領域の探索用モデル分子とされた。最後にPDB code 2A9Mの構造座標から
取り出された軽鎖3-147番のアミノ酸残基が、VL領域の探索用モデル分子とされた。この
順番にしたがい各探索用モデル分子の結晶格子内での向きと位置を回転関数および並進関
数から決定することによって、6RL#9抗体のFabフラグメントの初期構造モデルが得られた
。当該初期構造モデルに対してVH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化をおこ
なうことにより、25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は46.9%、Free
R値は48.6%となった。さらにプログラムRefmac5（CCP4 Software Suite）を用いた構造
精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相
を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正
を繰り返しプログラムCoot（Paul Emsley）上でおこなうことによってモデルの精密化が
おこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとにCaイオンおよ
び水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5（CCP4 Software Suite
）を用いて精密化がおこなわれた。分解能25-2.2Åの21020個の反射データを用いること
によって、最終的に3440原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.0%、Free R
値は27.9%となった。
（１８－９）6RL#9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶のX線回折データの測定
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶の構造は、同型であるCa存在下結晶
の構造を使って決定された。6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造座標
から水分子とCaイオン分子がのぞかれ、VH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密
化がおこなわれた。25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は30.3%、Free
R値は31.7%となった。さらにプログラムRefmac5（CCP4 Software Suite）を用いた構造
精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相
を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正
を繰り返しプログラムCoot（Paul Emsley）上でおこなうことによってモデルの精密化が
おこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデ
ルに組み込むことによって、プログラムRefmac5（CCP4 Software Suite）を用いて精密
化がおこなわれた。分解能25-2.3Åの18357個の反射データを用いることによって、最終
的に3351原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.9%、Free R値は27.7%となっ
た。
（１８－１０）6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在または非存在下での結晶のX線回析
データの比較
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶およびCa非存在下での結晶の構造を比
較すると、重鎖CDR3に大きな変化がみられた。X線結晶構造解析で決定された6RL#9抗体の
Fabフラグメントの重鎖CDR3の構造が図11で示されている。具体的には、Ca存在下での6RL
#9抗体のFabフラグメントの結晶では、重鎖CDR3ループ部分の中心部分にカルシウムイオ
ンが存在していた。カルシウムイオンは、重鎖CDR3の95位、96位および100a位（Kabatナ
ンバリング）と相互作用していると考えられた。Ca存在下では、抗原との結合に重要であ
る重鎖CDR3ループがカルシウムと結合することによって安定化し、抗原との結合に最適な
構造となっていることが考えられた。抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合する例は今まで
に報告されておらず、抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合した構造は新規な構造である。
6RL#9抗体のFabフラグメントの構造から明らかになった重鎖CDR3に存在するカルシウム
結合モチーフも、実施例11で記載されるようなCaライブラリのデザインの新たな要素とな
りうる。すなわち、実施例11では軽鎖可変領域にカルシウム結合モチーフが導入されたが
、たとえば6RL#9抗体の重鎖CDR3を含み、軽鎖を含むそれ以外のCDRにフレキシブル残基を
含むライブラリが考えられる。
［実施例19］ファージディスプレイ技術を用いたヒト抗体ライブラリからのCa依存的にIL
-6に結合する抗体の取得
（１９－１）ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として
当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複
数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
（１９－２）ビーズパンニングによるライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体断
片の取得
構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリからの最初の選抜は、抗
原（IL-6）への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施された。抗原としてビオチ
ン標識されたIL-6が用いられた。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行
われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加すること
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4％BSAおよび1.2mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が添加された。パンニング方法として、一般的な方法
である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（J. Immunol.
Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2)
, 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (
2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag
SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabeads
M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原を加え
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室
温にて15分間結合させた。ビーズは1.2 mM CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2を含むTBST）
にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM CaCl2を含むTBS）にてさ
らに2回洗浄された。その後、0.5 mLの1 mg/mLのトリプシンが加えられたビーズは室温
で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回
収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの
大腸菌株TG1に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによっ
て、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレ
ートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによっ
て、ファージライブラリ液が調製された。
2回目以降のパンニングでは、Ca依存的結合能を指標にファージの濃縮が行われた。具
体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることに
よって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされ
た磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合さ
せた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その
後0.1mLの2 mM EDTA/TBSが加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタン
ドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に10
0 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタン
パク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しないファー
ジの大腸菌に対する感染能を失わせた。トリプシン処理されたファージ溶液から回収され
たファージが、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株TG1に添加され
た。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌
に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に
、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液
が回収された。Ca依存的結合能を指標とするパンニングが3回繰り返された。
（１９－３）ファージELISAによる評価
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
終濃度4％BSAおよび1.2 mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加え
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マ
イクロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コート
された。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当
該ウエルが1時間以上250μLの4％BSA-TBSにてブロッキングされた。4％BSA-TBSが除かれ
た各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置すること
によって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に結合させた。1.2 mM C
aCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加
えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBS
Tにて洗浄された後に、終濃度4％のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTB
Sによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmacia Biotech）が各ウエルに
添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、T
MB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加によ
り停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
単離された96クローンを用いてファージELISA を行うことによって、IL-6に対するCa
依存的な結合能を有する6KC4-1#85抗体が得られた。上記のファージELISAの結果、Ca依存
的な抗原に対する結合能があると判断される抗体断片を鋳型として特異的なプライマーに
よって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われた。6KC4-1#85抗体の重鎖可変領域の配
列は配列番号：１１に、および、軽鎖可変領域の配列は配列番号：８４に記載されている
。6KC4-1#85抗体の重鎖可変領域（配列番号：１１）をコードするポリヌクレオチドが、P
CR法によってIgG1由来配列をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物
細胞発現用ベクターに組み込まれ、配列番号：８５で表される重鎖を発現するベクターが
構築された。6KC4-1#85抗体の軽鎖可変領域（配列番号：８４）をコードするポリヌクレ
オチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域（配列番号：２６）をコードするポリ
ヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製さ
れた改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。作製された改変体の配列は当業者公
知の方法で確認された。
（１９－４）抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローン6KC
4-1#85が、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行
われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293 Expr
ession Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエ
ルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクシ
ョン法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4
日間培養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences
）を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。
分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法によ
り算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された
（Protein Science (1995) 4, 2411-2423）。
［実施例20］6KC4-1#85抗体のカルシウムイオン結合評価
ヒト抗体ライブラリから取得されたカルシウム依存的抗原結合抗体6KC4-1#85抗体がカ
ルシウムと結合するか評価された。イオン化カルシウム濃度が異なる条件で、測定される
Tm値が変動するか否かが実施例６に記載された方法で評価された。
6KC4-1#85抗体のFabドメインのTm値が表25に示されている。表25に示されているように
、6KC4-1#85抗体のFabドメインのTm値はカルシウムイオンの濃度によって変動しているこ
とから、6KC4-1#85抗体がカルシウムと結合することが明らかになった。
［実施例21］6KC4-1#85抗体のカルシウムイオン結合部位の同定
実施例20で示されるように、6KC4-1#85抗体はカルシウムイオンと結合することが示さ
れたが、6KC4-1#85はhVk5-2配列の検討から明らかになったカルシウム結合モチーフを持
たない。そこで、カルシウムイオンが6KC4-1#85抗体の重鎖に結合するのか、軽鎖に結合
するのかまたは両者に結合するのかを確認するために、カルシウムイオンと結合しない抗
グリピカン3抗体（重鎖配列GC＿H（配列番号：４８）、軽鎖配列GC＿L（配列番号：８６
））の重鎖と軽鎖とそれぞれ交換した改変抗体に対するカルシウムイオンの結合が評価さ
れた。実施例6に示される方法に準じて測定された改変抗体のTm値が表26に示されている
。その結果、6KC4-1#85抗体の重鎖をもつ改変抗体のTm値がカルシウムイオンの濃度によ
って変化するため、6KC4-1#85抗体の重鎖でカルシウムと結合していると考えられた。
そこで、さらに6KC4-1#85抗体の重鎖のどの残基とカルシウムイオンが結合しているか
同定するために、6KC4-1#85抗体のCDRに存在するAsp（D）残基をカルシウムイオンの結合
もしくはキレートに関与できないAla（A）残基に置換した改変重鎖（6＿H1-11（配列番号
：８７）、6＿H1-12（配列番号：８８）、6＿H1-13（配列番号：８９）、6＿H1-14（配列
番号：９０）、6＿H1-15（配列番号：９１））、または改変軽鎖（6＿L1-5（配列番号：
９２）および6＿L1-6（配列番号：９３））が作製された。改変抗体遺伝子を含む発現ベ
クターが導入された動物細胞の培養液から、改変抗体が実施例19に記載された方法にした
がって精製された。精製された改変抗体のカルシウム結合が、実施例6に記載された方法
にしたがって測定された。測定された結果が表27に示されている。表27に示されているよ
うに、6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3の95位または101位（Kabatナンバリング）をAla残基に置
換することによって6KC4-1#85抗体のカルシウム結合能が失われることから、この残基が
カルシウムとの結合に重要であると考えられる。6KC4-1#85抗体の改変抗体のカルシウム
結合性から明らかになった6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3のループ付け根付近に存在するカル
シウム結合モチーフも、実施例11で記載されるようなCaライブラリのデザインの新たな要
素となりうる。すなわち、実施例11では軽鎖可変領域にカルシウム結合モチーフが導入さ
れたが、たとえば6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3を含み、軽鎖を含むそれ以外のCDRにフレキシ
ブル残基を含むライブラリが考えられる。
［実施例２２］Ca依存的にヒトIgAに結合する抗体の取得
（２２－１）MRA-hIgA、GC-hIgAおよびビオチンを付加したヒトIgA-Fcの調製
ヒトIgAとして、MRA-hIgA（重鎖配列番号９７、軽鎖配列番号２５）GC-hIgA（重鎖配列
番号９８、軽鎖配列番号９９）およびビオチンを付加したヒトIgA-Fc（ビオチン標識hIgA
-Fcともいう、hIgA＿CH2-CH3-Avitag：配列番号１００）が以下のように調製された。
（２２－１－１）MRA-hIgAの調製
ヒトIgAの組換え体であるMRA-hIgA（以下MRA-hIgA）は以下のように調製された。発現
させたH(WT)-IgA1（配列番号：９７）とL(WT)（配列番号：２５）とを含むhIgAが、当業
者公知の方法によってイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィー
を用いて精製された。
（２２－１－２）GC-hIgAの調製
ヒトIgAの組換え体であるGC-hIgAは、以下のように調製された。GC-hIgA（重鎖配列番
号：９８、軽鎖配列番号：９９）をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベクターに
組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fec
tin (Invitrogen)を用いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、遺伝子
導入された細胞を37℃、CO2 8%で6日間培養して、GC-hIgAタンパク質を培養上清中に分
泌させた。
GC-hIgAを含む細胞培養液を、0.22μmボトルトップフィルターでろ過し培養上清が得ら
れた。20 mM Tris-HCl, pH8.0で平衡化されたHiTrap Q HP (GE healthcare)に同
溶液で希釈された培養上清を負荷し、NaClの濃度勾配によりGC-hIgAが溶出された。その
後、Superdex200によるゲルろ過クロマトグラフィーにて会合体の除去と20 mM His-HCl
, 150 mM NaCl, pH6.0への置換を行い、精製GC-hIgAが得られた。
（２２－１－３）ビオチン標識hIgA-Fcの調製
ビオチンを目的タンパク質（ヒトIgA-Fc）のC末端に付加するために、ヒトIgA-Fc領域
をコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異
的な配列（Avitag配列）をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトIgAとAvitag配列が
連結されたタンパク質（hIgA＿CH2-CH3-Avitag（配列番号：１００））をコードする遺伝
子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが、Fr
eeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入された。こ
のときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ（BirA）を発現する遺伝子を同時
に導入し、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺伝子が
導入された細胞を、37℃、CO2 8%で6日間培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌
させた。
目的のヒトIgA-Fcを含む細胞培養液を、0.22μmボトルトップフィルターでろ過し培養
上清が得られた。20 mM Tris-HCl, pH7.4で平衡化されたHiTrap Q HP (GE health
care)に同溶液で希釈された培養上清を負荷し、NaClの濃度勾配により目的のヒトIgA-Fc
が溶出された。50 mM Tris-HCl, pH8.0で希釈されたHiTrap Q HP溶出液を、同溶液
で平衡化したSoftLink Avidin columnに負荷し、5 mM Biotin, 150 mM NaCl, 50
mM Tris-HCl, pH8.0で溶出させた。その後、Superdex200によるゲルろ過クロマトグ
ラフィーにて会合体の除去と20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0への置換を行い
、精製ヒトIgA-Fcが得られた。
（２２－２）ビーズパンニングによるCaライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体
断片の取得
構築されたCa依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ（Caライブラリ）からの最初の選
抜は、抗原（ヒトIgA-Fc）への結合能を指標として実施された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージが産生
された。ファージが産生された大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加して沈殿さ
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまたは3%SkimMilk
、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が添加され、ブ
ロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、一般的な
方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（J. Immu
nol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (
1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomic
s (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-M
ag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabea
ds M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原（ビオ
チン標識IgA-Fc）を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗
原と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原
とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM
CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20、を含むTBS）と1 mLの1.2 mM CaCl2/
TBS（1.2 mM CaCl2を含むTBS）にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが
加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離
され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4
-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌
の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、
225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からフ
ァージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
２回目、３回目のパンニングでは、Caイオン濃度依存的抗原結合能を指標にファージの
濃縮が行われた。具体的には、1回目のパンニングと同様にブロッキングを行い調製した
ファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージラ
イブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加え
られ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 m
Lの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM
EDTA/TBS（2 mMのEDTAを含むTBS）が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に
磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファー
ジ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファ
ージのpIIIタンパク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提
示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数
増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間
緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感
染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸
菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。
（２２－３）BiacoreによるヒトIgA結合抗体のスクリーニング
2回目のパンニング終了後に得られた大腸菌から取得されたファージミドから抽出され
た抗体断片遺伝子が動物細胞発現用ベクターへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を用
いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 293
Expression Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、2.63x105細胞/mLの細胞密度で96
ウエルプレートの各ウエルへ190uLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェ
クション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37度、8%CO2）中で4日間
培養が行われた。
上記方法により得られた培養上清を用い、BiacoreA100を用いてGC-hIgAへの結合能が解
析された。アミンカップリング法でproteinA(invitrogen)が適当量固定化されたsensor
chip CM5(GE Healthcare)に対し培養上清中の抗体を固定化させた。ランニングバッフ
ァーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2（pH7.
4）の緩衝液が用いられた。GC-hIgAの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定
は全て25℃で実施された。
上記のIgG Biacoreでの結合能解析の結果、GC-hIgAに対する結合能があると判断され
た抗体について、発現に用いた動物細胞発現用ベクターから、特異的なプライマーを用い
て増幅された抗体遺伝子の塩基配列が解析された。
（２２－４）Phage ELISAによるhIgA結合抗体のスクリーニング
（２２－２）で実施された3回目のパンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニー
から、常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に習いファージの培養を
行い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4％BSAおよび1.2 mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手
順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がビオチン
標識IgA-Fcを含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTに
て洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4％BSA-TBS
にてブロッキングされた。4％BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えら
れた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウ
エルに存在するIgA-Fcに結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1
.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静
置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4％のBSA
および1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体
（Amersham Pharmacia Biotech）が各ウエルに添加されたプレートを１時間インキュベ
ートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された
各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によ
って当該発色が測定された。
上記のファージELISAの結果、Caイオン濃度によりIgA-Fcへの結合能が変化すると判断
されたクローンに対し、抗体断片遺伝子の塩基配列解析が行われた。
（２２－５）固層パンニング法によるCaライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体
断片の取得
構築されたCa依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ（Caライブラリ）からの最初の選
抜は、抗原（ヒトIgA-Fc）への結合能を指標として実施された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージが産生
された。ファージが産生された大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することに
よって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液
が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまた
は3%SkimMilk、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が
添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法とし
て、1回目のパンニングでは一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパ
ンニング方法が参照された（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J.
Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18
(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、
NeutrAvidin coated beads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはSt
reptavidin coated beads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原（ビオ
チン標識IgA-Fc）を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗
原と接触させた。SkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージ
との複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TB
ST（1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20を含むTBS）と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM
CaCl2を含むTBS）にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビ
ーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファー
ジ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となっ
た10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を
行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x
225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによって、ファージライブラリ液が調製された。
2回目のパンニングでは、プレート上に固層化された抗原を用いてパンニングが行われ
た。具体的には、ストレプトアビジンがコーティングされた10ウエルのプレート(Strepta
well, Roche)に各ウエルあたり 5pmolのビオチン標識抗原が加えられ、室温で60分間抗
原と接触させた後、TBST（0.1% Tween20を含むTBS）にて3回洗浄された抗原固相化プレ
ートが作製された。ここに、1.2mM Caを含むSkimMilkでブロッキングされたファージラ
イブラリを加え、室温で60分間抗原と接触させた。プレートは1.2 mM CaCl2/TBSTにて
、プレートウォッシャー(Skan WASHER, SKARON)により3回洗浄された。その後、さらに
2Lの1.2 mM CaCl2/TBST に浸漬され、60分間緩やかに振とうされた。0.1 mLの2 mM
EDTA/TBS（2 mMのEDTAを含むTBS）が加えられたウエルは室温で懸濁された後、ファー
ジ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加える
ことによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質（ヘルパーファージ由来のpII
Iタンパク質）が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた
。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株
ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、
ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ
播種された。
（２２－６）Phage ELISAによるhIgA結合抗体のスクリーニング
上記パンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法（Methods Mol. B
iol. (2002) 178, 133-145）に習いファージの培養を行い、ファージ含有培養上清が
回収された。（２２－４）に記載の方法で、PhageELISAを実施し、Ca依存的抗原結合能が
あると判断されたクローンに対し塩基配列解析が行われ、動物細胞発現用ベクターに挿入
され、抗体として発現、精製された。
[実施例２３] 取得された抗体のヒトIgAに対するCa依存的結合能の評価
（２３－１）取得された抗ヒトIgA抗体の発現および精製
実施例２２においてヒトIgAに対する結合能があると判断された抗体として取得された
抗体のうち、GA1-IgG1（（２２－３）で取得された、重鎖配列番号１０１、軽鎖配列番号
１０２）,GA2-IgG1（（２２－４）で取得された、重鎖配列番号１０３、軽鎖配列番号１
０４）、GA3-IgG1（（２２－６）で取得された、重鎖配列番号１０５、軽鎖配列番号１０
６）、GA4-IgG1（（２２－３）で取得された、重鎖配列番号１０７、軽鎖配列番号１０８
）を以下の方法を用いて発現して、当該抗体の精製が行われた。FreeStyle 293 Expres
sion Medium培地（Invitrogen）に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（
Invitrogen）が1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLず
つ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された
。CO2インキュベーター（37度、8%CO2、90 rpm）中で4日間培養が行われた。rProtein
A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方法を用
いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗
体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いるこ
とによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science (1995) 4,
2411-2423）。
（２３－２）取得された抗体のヒトIgAに対するCa依存的結合能の評価
Biacore T200（GE Healthcare）を用いて、（２３－１）で取得された抗体（GA1-IgG
1, GA2-IgG1, GA3-IgG1およびGA4-IgG1）のヒトIgAに対する結合活性（解離定数KD (M
)）が評価された。ランニングバッファーとして3μMもしくは1.2 mM CaCl2を含有する0
.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl（pH7.4およびpH5.8）、0.1μM
もしくは10 mM CaCl2を含有する0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l
NaCl、pH8.0を用いて当該結合活性が測定された。
Sensor chip CM5(GE Healthcare)上にアミノカップリング法で適切な量が固定化さ
れた組換え型プロテインA/G（Thermo Scientific）に、抗体を結合させた。アナライト
として適切な濃度のMRA-hIgA（（２２－１）に記載）をインジェクトし、センサーチップ
上の抗体と相互作用させた。その後、10 mmol/L Glycine-HCl, pH1.5をインジェクト
し、センサーチップが再生された。測定は37℃で行われた。Biacore T200 Evaluation
Software（GE Healthcare）を用いた、測定結果のカーブフィッティングによる解析お
よび平衡値解析により、解離定数KD (M)が算出された。その結果を表２８に示した。ま
た、得られたセンサーグラムを図１２に示した。GA2-IgG1、GA3-IgG1、GA4-IgG1はCa2+濃
度が1.2 mMにおいてはヒトIgAに強く結合するが、Caイオン濃度が3μMにおいてはヒトIg
Aに弱く結合することが明らかに示された。
実施例１４ではCaライブラリからIL6レセプターに対してCaイオン濃度依存的に抗原（I
L6レセプター）との相互作用が変化する抗体が取得されたが、Caイオン濃度依存的に抗原
に結合する抗体は、IL6レセプターだけでなくヒトIgAでも取得できることが明らかになっ
た。
［実施例２４］Ca依存的にヒトグリピカン３(GPC3)に結合する抗体の取得
（２４－１）ヒトグリピカン３の調製
抗原として用いる組換えヒトグリピカン3（以下GPC3）が以下のように調製された。ヒ
トグリピカン3の膜貫通領域を含まないアミノ酸配列に6残基のヒスチジンが連結した配列
（配列番号：１０９）を発現するプラスミドが定常的に導入されているCHO細胞の培養上
清が回収された。得られた培養上清を、イオン交換クロマトグラフィー精製後、Hisタグ
を用いたアフィニティー精製およびゲルろ過クロマトグラフィー精製を行って、GPC3が得
られた。EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo SCIENTIFIC)を用いて当該GPC3に対してビ
オチンが標識されたビオチン標識GPC3が調製された。
（２４－２）ビーズパンニングによるライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体断
片の取得
構築されたCa依存的にGPC3に結合する抗体ライブラリからの最初の選抜は、抗原（GPC3
）への結合能を指標に実施された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージが産生
された。ファージが産生された大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加することに
よって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液
が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまた
は3%SkimMilk、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が
添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法とし
て、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照され
た（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2
001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cel
l Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated b
eads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated be
ads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原（ビオ
チン標識GPC3）を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原
と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原と
ファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM
CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2を含むTBST）と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM CaCl
2を含むTBS）にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは
室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液
が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10
mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うこ
とによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 m
mのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収するこ
とによって、ファージライブラリ液が調製された。
2回目以降のパンニングでは、Ca依存的結合能を指標にファージの濃縮が行われた。具
体的には、1回目のパンニングと同様にブロッキングを行い調製したファージライブラリ
液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60
分間抗原と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ
、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1
.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM ED
TA/TBS（2 mMのEDTAを含むTBS）が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気
スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶
液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのp
IIIタンパク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しない
ファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期（
OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに
上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた
大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養
液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。
（２４－３）Phage ELISAによるGPC3結合抗体のスクリーニング
上記の方法で実施された２回目および３回目のパンニング後に得られた大腸菌のシング
ルコロニーから、常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に習いファー
ジの培養を行い、ファージ含有培養上清が回収された。
終濃度4％BSAおよび1.2 mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加え
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マ
イクロタイタープレート（Roche）がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コート
された。当該プレートの各ウエルをPBST（0.1% Tween20を含むPBS）にて洗浄することに
よって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4％BSA-TBSにてブロッキング
された。4％BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレート
を37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗
原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS
もしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベー
トされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4％のBSAおよび1.2 mMのイ
オン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharm
acia Biotech）が各ウエルに添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。1.2
mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液（ZYMED）が添加された各ウエル中の溶液の
発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定
された。
上記のファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断される抗体
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列が解析された
。
（２４－４）ヒトGPC3に結合する抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断された４抗体、CSC
M-01＿005（重鎖配列：１１０、軽鎖配列：１１１）、CSCM-01＿009（重鎖配列：１１２
、軽鎖配列：１１３）、CSCM-01＿015（重鎖配列：１１４、軽鎖配列：１１５）、および
CSCM-01＿023（重鎖配列：１１６、軽鎖配列：１１７）ならびにコントロールとして抗ヒ
トGPC3抗体であるGC-IgG1（重鎖配列：１１８、軽鎖配列：１１９）がそれぞれ動物細胞
発現用プラスミドへ挿入された。抗体を以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293
Expression Medium培地（Invitrogen）に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 2
93-F株（Invitrogen）が1.33 x 106個 /mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ
3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導
入された。CO2インキュベーター（37℃、8%CO2, 90 rpm）で4日間培養が行われた。rPr
otein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方
法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製さ
れた抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用
いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science 1995
; 4 : 2411-2423）。なお、GC-IgG1抗体については、GC-IgG1抗体を定常的に発現す
るCHO細胞培養上清から同様の方法で抗体を精製し、濃度が算出された 。
（２４－５）取得された抗体のヒトGPC3に対するCa依存的結合能評価
取得された抗体が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープ
レート（Roche）がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。該当プレ
ートの各ウエルをACES buffer（10 mM ACES, 150 mM NaCl, 100 mM CaCl2,0.05
% Tween20, pH7.4）にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが2%BSA
を含むACES Buffer 250μLにて1時間以上ブロッキングされた。2%BSAを含むACES Buff
erが除かれた各ウエルに、あらかじめ10μg/mLから4倍ずつ希釈を行った精製IgG各100μL
が加えられた当該プレートを一時間静置することによって、IgGを各ウエルに存在する抗
原に結合させた。ACES Bufferにて洗浄された各ウエルに、「10 mM ACES,150 mM Na
Cl, 1.2 mM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH
7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH5.8」もしくは「10 mM
ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH5.8」が加えられ、当該プレートは37℃で30
分間静置しインキュベートされた。ACES Bufferにて洗浄された後に、2%BSAを含むACES
Bufferによって希釈されたHRP結合抗ヒトIgG抗体（BIOSOURCE）が各ウエルに添加され
たプレートを1時間インキュベートさせた。ACES Bufferにて洗浄後、TMB single溶液（
ZYMED）が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、4
50 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
測定された結果を図１３に示した。GC-IgG1ではカルシウムイオンの濃度に依らず吸光
度が同じであるのに対して、CSCM-01＿005、CSCM-01＿009、CSCM-01＿015およびCSCM-01
＿023は1.2 mMカルシウムイオン濃度（高カルシウムイオン濃度）における吸光度と比較
して、3μMカルシウムイオン濃度（低カルシウムイオン濃度）における吸光度は、顕著に
低い結果となった。この結果から、CSCM-01＿005、CSCM-01＿009、CSCM-01＿015およびCS
CM-01＿023はカルシウムイオンの濃度によって抗原との結合が変化する性質を有すること
が示され、ヒトグリピカン3に対してもカルシウム依存的抗体が取得できることが示され
た。
［実施例２５］pH依存的にマウスIgAに結合する抗体の取得
（２５－１）GC-mIgAおよびビオチンを付加したマウスIgA-Fcの調製
マウスIgAとして、GC-mIgA（重鎖配列番号１２０、軽鎖配列番号１２１）およびビオチ
ンを付加したマウスIgA-Fc（ビオチン標識mIgA-Fcともいう、mIgA＿CH2-CH3-Avitag：配
列番号１２２）が以下のように調製された。
（２５－１－１）GC-mIgAの調製
マウスIgAの組換え体であるGC-mIgAは、以下のように調製された。GC-mIgA（重鎖配列
番号：１２０、軽鎖配列番号：１２１）をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベク
ターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に
293Fectin (Invitrogen)を用いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、
遺伝子導入された細胞を37℃、CO2 8%で4日間培養して、GC-mIgAタンパク質を培養上清
中に分泌させた。
GC-mIgAを含む細胞培養液を、0.22μmボトルトップフィルターでろ過し培養上清が得ら
れた。20 mM Tris-HCl, pH8.0で平衡化された後に同溶液で希釈された培養上清が負荷
されたHiTrap Q HP (GE healthcare)から、NaClの濃度勾配によりGC-mIgAが溶出され
た。その後、Superdex200を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体が除去さ
れたGC-mIgAを含むバッファーを20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0へ置換して、
精製GC-mIgAが得られた。
（２５－１－２）ビオチン標識mIgA-Fcの調製
ビオチンを目的タンパク質（マウスIgA-Fc）のC末端に付加するために、マウスIgA-Fc
領域をコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される
特異的な配列（Avitag配列）をコードする遺伝子断片が連結された。マウスIgAとAvitag
配列が連結されたタンパク質（mIgA＿CH2-CH3-Avitag（配列番号：１２２））をコードす
る遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクター
が、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入され
た。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ（BirA）を発現する遺伝子
を同時に導入し、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺
伝子が導入された細胞を、37℃、CO2 8%で6日間培養し、目的のタンパク質を培養上清中
に分泌させた。
目的のマウスIgA-Fcを含む細胞培養液を、0.22μmボトルトップフィルターでろ過し培
養上清が得られた。20 mM Tris-HCl, pH7.4で平衡化された後に同溶液で希釈された培
養上清が負荷されたHiTrap Q HP (GE healthcare)から、NaClの濃度勾配により目的
のマウスIgA-Fcを溶出させた。次に、50 mM Tris-HCl, pH8.0で平衡化された後に、同
溶液で希釈された前記HiTrap Q HP溶出液が負荷されたSoftLink Avidin columnから
、5 mM Biotin, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH8.0で目的のマウスIgA-Fcを
溶出させた。その後、Superdex200を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体
が除去されたマウスIgA-Fcを含むバッファーを20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.
0へ置換して、精製マウスIgA-Fcが得られた。
（２５－２）ビーズパンニングによるHisライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗
体断片の取得
構築されたpH依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ（Hisライブラリ１）からの最初
の選抜は、抗原（マウスIgA-Fc）への結合能を指標として実施された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージが産生
された。ファージが産生された大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加して沈殿さ
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度3%SkimMilk、となるようSkim Milkが添加され、ブ
ロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、一般的な
方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された（J. Immu
nol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (
1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomic
s (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads（Sera-M
ag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavidin coated beads（Dynabea
ds M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液にビオチン標識抗原（ビオチン標識mIgA
-Fc）を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触さ
せた。1回目のパニングでは250pmol、2回目のパニングでは40 pmol、3回目のパニングで
は10pmolのビオチン標識抗原が用いられた。Skim Milkでブロッキングされた磁気ビーズ
が加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビー
ズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBST（1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20を含むTBS, pH7.6）
と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS（1.2 mM CaCl2を含むTBS, pH7.6）にて洗浄された。そ
の後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即
座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたフ
ァージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加さ
れた。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸
菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。
次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブ
ラリ液が調製された。パンニングは、合計3回繰り返された。
（２５－３）BiacoreによるマウスIgA結合抗体の結合能評価
3回目のパンニング終了後に得られた大腸菌から取得されたファージミドから抽出され
た抗体断片遺伝子が、動物細胞発現用ベクターへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を
用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）がFreeStyle 2
93 Expression Medium培地（Invitrogen）に懸濁され、2.63x105細胞/mLの細胞密度で9
6ウエルプレートの各ウエルへ190μLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフ
ェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター（37℃、8%CO2）中で4日
間培養が行われた。
上記方法により得られた培養上清を用い、BiacoreA100を用いてGC-mIgAへの結合能が解
析された。アミンカップリング法で適切な量のproteinA/G(PIERCE)が固定化されたsensor
chip CM5(GE Healthcare)に対し培養上清中の抗体をキャプチャーさせた。ランニン
グバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaC
l2（pH7.4）および20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM Ca
Cl2（pH5.8）の2種の緩衝液が用いられ、中性域pHおよび酸性域pHの条件中での抗原抗体
反応の相互作用が解析された。GC-mIgAの希釈にもそれぞれのバッファーが使用され、流
速10μL/minで60秒間インジェクトすることによって、センサーチップ上にキャプチャー
された抗体と相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl（pH1.5）を流速30μL/min
で30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃
で実施された。
上記のBiacoreでの結合評価の結果、GC-mIgAに対してpH依存的結合能を持つと判断され
た抗体として、mIAP1B3-3＿#024（重鎖配列番号：１２３、軽鎖配列番号：１２４）、mIA
P1B3-3＿#130（重鎖配列番号：１２５、軽鎖配列番号：１２６）、mIAP1B3-3＿#230（重
鎖配列番号：１２７、軽鎖配列番号：１２８）が得られた。これらの抗体のpH7.4およびp
H5.8におけるセンサーグラムを図１４に示した。バッファー中のpHをpH7.4からpH5.8にす
ることで、マウスIgAに対する結合能が低減することが観察された。
これらの抗体について、発現に用いた動物細胞発現用ベクターから抗体遺伝子の塩基配
列が解析された。
実施例３ではHisライブラリ１からIL-6Rに対してpH依存的に抗原（IL-6R）との相互作
用が変化する抗体が取得されたが、pH依存的に抗原に結合する抗体は、IL-6Rだけでなく
マウスIgAでも取得できることが明らかになった。
［実施例２６］pH依存的にヒトHMGB1に結合する抗体の取得
（２６－１）ヒトHMGB1およびビオチンを付加したヒトHMGB1の調製
ヒトHMGB1（配列番号：１２９）、およびビオチンを付加したヒトHMGB1-Avi（ビオチン
標識hHMGB1ともいう、hHMGB1-Avitag：配列番号１３０）が以下のように調製された。
（２６－１－１）ヒトHMGB1の調製
ヒトHMGB1の組換え体であるhHMGB1は、以下のように調製された。hHMGB1（配列番号：
１２９）をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築され
たプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用
いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、遺伝子導入された細胞を37℃
、CO2 8%で培養して、hHMGB1タンパク質を培養上清中に分泌させた。PBSで平衡化された
後に、得られた培養上清が負荷されたHiTrap SP Sepharose HP（GE Healthcare社）
をPBSで洗浄後、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によってカラムに吸着した蛋白質を溶
出させた。20 mM Histidine-HCl, pH5.0で平衡化された後に、同緩衝液で3倍に希釈さ
れた前記のhHMGB1を含む溶出画分が負荷された。同緩衝液で洗浄されたカラムから、カラ
ムに吸着した蛋白質を塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によって溶出させた。限外ろ過膜
で濃縮されたhHMGB1を含む画分が、300 mM NaCl, 20 mMヒスチジン, pH6.0で平衡化
されたSuperdex200カラム（GE Healthcare社）に負荷された。同緩衝液で分離すること
でhHMGB1精製画分が得られた。
（２６－１－２）ビオチン標識ヒトHMGB1の調製
ビオチンを目的タンパク質（ヒトHMGB1）のC末端に付加するために、ヒトHMGB1領域を
コードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的
な配列（Avitag配列）をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトHMGB1とAvitag配列が
連結されたタンパク質（hHMGB1-Avitag（配列番号：１３０））をコードする遺伝子断片
が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが、FreeStyl
e293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入された。このときE
BNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ（BirA）を発現する遺伝子を同時に導入し
、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺伝子が導入され
た細胞を、37℃、CO2 8%で培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。
PBSで平衡化された後に、前記で得られた培養上清が負荷されたHiTrap SP Sepharose
HP（GE Healthcare社）をPBSで洗浄後、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によってカ
ラムに吸着した蛋白質を溶出させた。TBSで平衡化されたSoftLink Soft Release Avid
in Resinカラム（Promega社）に100 mM Tris-HCl, pH7.4で2倍に希釈されたHMGB1-Av
iを含む画分が負荷された。TBSで洗浄されたカラムから、カラムに吸着した蛋白質を5 m
M Biotinを含むTBS（pH8.0）で溶出させた。限外ろ過膜で濃縮されたHMGB1-Aviを含む画
分が、300 mM NaCl, 20 mMヒスチジン, pH6.0で平衡化されたSuperdex200カラム（G
E Healthcare社）に負荷された。同緩衝液で分離することでBiotin化されたHMGB1-Avi精
製画分が得られた。
（２６－２）ビーズパンニングによるHisライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗
体断片の取得
構築されたpH依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ（Hisライブラリ１）からの最初
の選抜は、抗原（ヒトHMGB1）への結合能を指標として実施された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージが産生
された。ファージが産生された大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10%PEGを添加して沈殿さ
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSA、
およびCaCl2が添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パン
ニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング
方法が参照された（J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol.
Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212
-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9）。磁気ビーズとして、NeutrAvi
din coated beads（Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）もしくはStreptavid
in coated beads（Dynabeads M-280 Streptavidin）が用いられた。
具体的には、調製されたファージライブラリ液に250 pmolのビオチン標識抗原（ビオ
チン標識hHMGB1）を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗
原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの
複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST（
50mM Tris, 300mM NaCl, 1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20, pH7.6）と1 mLの1.2
mM CaCl2/TBS（50mM Tris, 300mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH7.6）にて洗浄された
。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後
、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収され
たファージ溶液が、対数増殖期（OD600が0.4-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添
加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを
大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種され
た。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージラ
イブラリ液が調製された。
2回目以降のパンニングでは、抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標にファージの
濃縮が行われた。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識
抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSA
でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと
室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSに
て複数回洗浄された。その後抗原結合能を指標として濃縮する場合は、1mg/mLのトリプシ
ン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いて
ビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場
合は、Round2では0.4 mL, Round3以降では0.1 mLの50 mM MES/1.2 mM CaCl2/150
mM NaCl（pH5.5）が加えられ、ビーズは室温で懸濁された後、磁気スタンドを用いて
ビーズが分離された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシンをRound2では
20μL、Round3以降では5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタン
パク質（ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質）が切断され、Fabを提示しないファー
ジの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージが、対数増殖期（OD600が0.4
-0.7）となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌
の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は22
5 mmx 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファー
ジを回収することによってファージライブラリ液が回収された。抗原結合能もしくはpH依
存的結合能を指標とするパンニングは3回繰り返された。
（２６－３）Phage ELISAによるヒトHMGB1結合抗体のスクリーニング
（２６－２）で実施された3回目、4回目のパンニング後に得られた大腸菌のシングルコ
ロニーから、常法（Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145）に習いファージの
培養を行い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4％BSAおよび1.2 mMカルシウ
ムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以
下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート（Roche）がビ
オチン標識hHMGB1を含む100μLのPBSにて4時間以上コートされた。当該プレートの各ウエ
ルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4
％BSA-TBS(50mM Tris, 300mM NaCl, 2.5mM CaCl2, 4%BSA）にてブロッキングされ
た。4％BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37
℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在するHMGB1に
結合させた。1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)にて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/T
BS(pH7.6)もしくは1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl/50 mM MES(pH5.5)が加えられ、当該
プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)にて
洗浄された後に、4％BSA-TBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体（Amersham Pharmaci
a Biotech）が各ウエルに添加されたプレートを１時間インキュベートさせた。1.2 mM
CaCl2/TBST(pH7.6)にて洗浄後、TMB single溶液（invitrogen）が添加された各ウエル
中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該
発色が測定された。
上記のファージELISAの結果、pHによりヒトHMGB1への結合能が変化すると判断されたク
ローンに含まれる体断片遺伝子の塩基配列が解析された。
（２６－４）ヒトHMGB1に結合する抗体の発現と精製
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断された３抗体、HM
＿3＿2＿R＿017(重鎖配列番号：１３１、軽鎖配列番号：１３２）、HM＿3＿2＿R＿054（
重鎖配列番号：１３３、軽鎖配列番号：１３４）、およびHM＿4＿1＿R＿001（重鎖配列番
号：１３５、軽鎖配列番号：１３６）がそれぞれ動物細胞発現用プラスミドへ挿入された
。抗体を以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地（In
vitrogen）に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen）が1.33
x 106個 /mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製さ
れたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベータ
ー（37℃、8%CO2, 90 rpm）で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast
Flow（Amersham Biosciences）を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた
培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの
吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた
測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
（２６－５）取得された抗体のヒトHMGB1に対するpH依存的結合能の評価
（２６－４）で取得された抗体HM＿3＿2＿R＿017（重鎖配列番号：１３１、軽鎖配列番
号：１３２）、HM＿3＿2＿R＿054（重鎖配列番号：１３３、軽鎖配列番号：１３４）、お
よびHM＿4＿1＿R＿001（重鎖配列番号：１３５、軽鎖配列番号：１３６）のhHMGB1に対す
る結合活性がpH依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とhHMGB1との相互作
用がBiacore T100（GE Healthcare）を用いて解析された。中性域pHおよび酸性域pHの
条件として、それぞれpH7.4およびpH5.8の溶液中で抗原抗体反応の相互作用が解析された
。アミンカップリング法でprotein A/G（PIERCE）が適当量固定化されたSensor chip
CM4（GE Healthcare）上に、目的の抗体がそれぞれ200RU程度キャプチャーされた。ラン
ニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM
CaCl2（pH7.4）または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM
CaCl2（pH5.8）の2種類の緩衝液が用いられた。hHMGB1の希釈にもそれぞれのバッファ
ーが使用された。測定は全て25℃で実施された。
HM＿3＿2＿R＿017抗体およびHM＿3＿2＿R＿054抗体およびHM＿4＿1＿R＿001抗体を用い
た抗原抗体反応の相互作用の解析に際して、hHMGB1の希釈液とブランクであるランニング
バッファーを流速10μL/minで60秒間インジェクトすることによって、センサーチップ上
にキャプチャーさせた。HM＿3＿2＿R＿017抗体およびHM＿3＿2＿R＿054抗体およびHM＿4
＿1＿R＿001抗体にhHMGB1を相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl（pH1.5）を
流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。
前記の方法により測定されたpH7.4, pH5.8におけるセンサーグラムが、図１５に示さ
れている。
前記の結果から、HM＿3＿2＿R＿017抗体、HM＿3＿2＿R＿054抗体およびHM＿4＿1＿R＿0
01抗体は、バッファー中のpHをpH7.4からpH5.8にすることで、hHMGB1に対する結合能が低
減することが観察され、ヒトHMGB1に対してもpH依存的結合抗体が取得できることが示さ
れた。
［参考実施例１］ノーマルマウスを用いたCa依存性結合抗体の抗原の血漿中滞留性への影
響の評価
（１－１）ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス（C57BL/6J mouse、Charles River Japan）にhsIL-6R（可溶型ヒトI
L-6レセプター：参考実施例４にて作製）を単独投与もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レ
セプター抗体を同時投与した後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体の体内動態が
評価された。hsIL-6R溶液（5μg/mL）、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レセプター抗体
の混合溶液が尾静脈に10 mL/kgで単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター抗体としては
、前記のH54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1が使用された。
混合溶液中のhsIL-6R濃度は全て5μg/mLであるが、抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度は抗
体毎に異なり、H54/L28-IgG1は0.1 mg/mL、6RL#9-IgG1およびFH4-IgG1は10 mg/mL、こ
のとき、hsIL-6Rに対して抗ヒトIL-6レセプター抗体は十分量過剰に存在することから、h
sIL-6Rは大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後15分、7時間、1日、2日、4日
、7日、14日、21日、28日の時点で採血が行われた。採取された血液を直ちに4℃、12,000
rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離された血漿は、測定を
実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫で保存された。
（１－２）ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度の測定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度はELISA法にて測定された。まずAnti-Hu
man IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody（SIGMA）をNunc-Imm
uno Plate, MaxiSoup（Nalge nunc International）に分注し、4℃で１晩静置するこ
とによってAnti-Human IgG固相化プレートが作成された。血漿中濃度として0.64、0.32
、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mLの検量線試料および100倍以上希釈されたマウス
血漿測定試料のそれぞれが分注されたAnti-Human IgG固相化プレートが25℃で1時間イン
キュベーションされた。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody（R&D）を
25℃で1時間反応させた後にStreptavidin-PolyHRP80（Stereospecific Detection Tech
nologies）を25℃で0.5時間反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substr
ate（BioFX Laboratories）を基質として用いて発色反応が行われた。1N-Sulfuric aci
d（Showa Chemical）によって発色反応が停止された後、マイクロプレートリーダーを用
いて発色液の450 nmにおける吸光度が測定された。解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Mol
ecular Devices）を用いて、マウス血漿中濃度が検量線の吸光度を基準として算出され
た。この方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-IgG1、6RL#9-
IgG1、FH4-IgG1の血漿中の抗体濃度の推移が図１６に示されている。
（１－３）電気化学発光法による血漿中のhsIL-6R濃度の測定
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定された。2000、1000、500、250
、125、62.5、31.25 pg/mLに調整されたhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈されたマ
ウス血漿測定試料と、SULFO-TAG NHS Ester（Meso Scale Discovery）でルテニウム
化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody（R&D）およびBiotinylated Anti-hum
an IL-6 R Antibody （R&D）およびトシリズマブ（重鎖配列番号：２４、軽鎖配列番
号：２５）溶液との混合液を4℃で1晩反応させた。サンプル中のFree Ca濃度を低下させ
、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-IgG1もしくはFH4-IgG1から解離し、添加した
トシリズマブと結合した状態とするために、その際のAssay bufferには10 mM EDTAが
含まれていた。その後、当該反応液がMA400 PR Streptavidin Plate（Meso Scale D
iscovery）に分注された。さらに25℃で1時間反応させたプレートの各ウエルが洗浄され
た後、各ウエルにRead Buffer T（×4）（Meso Scale Discovery）が分注された。た
だちに反応液はSECTOR PR 400 reader（Meso Scale Discovery）を用いて測定され
た。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular
Devices）を用いて算出された。前記の方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウス
における血漿中のhsIL-6Rの濃度推移が図１７に示されている。
その結果、hsIL-6R単独では非常に早い消失を示したのに対して、hsIL-6RとCa依存的な
結合が無い通常の抗体であるH54/L28-IgG1を同時に投与した場合は、hsIL-6Rの消失を大
幅に遅くした。それに対して、hsIL-6Rと100倍以上のCa依存的な結合を有する6RL#9-IgG1
あるいはFH4-IgG1を同時に投与した場合は、hsIL-6Rの消失が大幅に加速された。H54/L28
-IgG1を同時に投与した場合と比較して、6RL#9-IgG1およびFH4-IgG1を同時に投与した場
合は、一日後の血漿中のhsIL-6R濃度はそれぞれ39倍および2倍低減された。これよりカル
シウム依存的結合抗体が血漿中からの抗原の消失を加速可能であることが確認された。
［参考実施例２］Ca依存的抗原結合抗体の抗原消失加速効果の向上検討（抗体作製）
（２－１）IgG抗体のFcRnへの結合に関して
IgG抗体はFcRnに結合することで長い血漿中滞留性を有する。IgGとFcRnの結合は酸性条
件下（pH6.0）においてのみ認められ、中性条件下（pH7.4）においてその結合はほとんど
認められない。IgG抗体は非特異的に細胞に取り込まれるが、エンドソーム内の酸性条件
下においてエンドソーム内のFcRnに結合することによって細胞表面上に戻り、血漿中の中
性条件下においてFcRnから解離する。IgGのFc領域に変異を導入し、酸性条件下におけるF
cRnへの結合を失わせると、エンドソーム内から血漿中にリサイクルされなくなるため、
抗体の血漿中滞留性は著しく損なわれる。
IgG抗体の血漿中滞留性を改善させる方法として、酸性条件下におけるFcRnへの結合を
向上させる方法が報告されている。IgG抗体のFc領域にアミノ酸置換を導入し、酸性条件
下のFcRnへの結合を向上させることによって、エンドソーム内から血漿中へのIgG抗体の
リサイクル効率が上昇する。その結果、IgG抗体の血漿中の滞留性が改善する。アミノ酸
の置換を導入する際に重要と考えられているのは、中性条件下におけるFcRnへの結合を高
めないことであった。中性条件下においてFcRnに結合するIgG抗体は、エンドソーム内の
酸性条件下においてFcRnに結合することによって細胞表面上に戻ることはできても、中性
条件下の血漿中においてIgG抗体がFcRnから解離せず血漿中にリサイクルされないために
、逆にIgG抗体の血漿中滞留性は損なわれると考えられていた。
例えば、Dall’ Acquaら（J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180）に記載さ
れているように、マウスに投与された、アミノ酸置換を導入することによって中性条件下
（pH7.4）においてマウスFcRnに対する結合が認められるようになったIgG1抗体の血漿中
滞留性が悪化することが報告されている。また、Yeungら（J. Immunol. (2009) 182
(12), 7663-7671）、Datta-Mannanら（J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-17
17）、Dall’ Acquaら（J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180）に記載されて
いるように、アミノ酸置換を導入することによって酸性条件下（pH6.0）におけるヒトFcR
nの結合が向上するIgG1抗体改変体は、同時に中性条件下（pH7.4）におけるヒトFcRnに対
する結合が認められるようになる。カニクイザルに投与された当該抗体の血漿中滞留性は
改善されず、血漿中滞留性に変化が認められなかったことが報告されている。そのため、
抗体の機能を向上させる抗体工学技術においては、中性条件下（pH7.4）におけるヒトFcR
nに対する結合を増加させることなく酸性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増加させる
ことで抗体の血漿中滞留性を改善させることに注力されていた。すなわち、そのFc領域に
アミノ酸置換を導入することによって中性条件下（pH7.4）におけるヒトFcRnに対する結
合が増加したIgG1抗体の利点はこれまで報告されていない。
Ca依存的に抗原に結合する抗体は、可溶型の抗原の消失を加速させ、ひとつの抗体分子
が複数回繰り返し可溶型の抗原に結合する効果を有することから、極めて有用である。こ
の抗原消失加速効果をさらに向上させる方法として、中性条件下（pH7.4）におけるFcRn
に対する結合を増強する方法が検証された。
（２－２）中性条件下におけるFcRnに対する結合活性を有するCa依存的ヒトIL-6レセプタ
ー結合抗体の調製
カルシウム依存的抗原結合能を有するFH4-IgG1、6RL#9-IgG1、および対照として用いら
れたカルシウム依存的抗原結合能を有しないH54/L28-IgG1のFc領域にアミノ酸変異を導入
することによって、中性条件下（pH7.4）におけるFcRnに対する結合を有する改変体が作
製された。アミノ酸の変異の導入はPCRを用いた当業者公知の方法を用いて行われた。具
体的には、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングで表される434位のアミノ酸で
あるAsnがTrpに置換されたFH4-N434W（重鎖配列番号：９４、軽鎖配列番号：８１）と6RL
#9-N434W（重鎖配列番号：９５、軽鎖配列番号：７９）とH54/L28-N434W（重鎖配列番号
：９６、軽鎖配列番号：８３）が作製された。QuikChange Site-Directed Mutagenesis
Kit（Stratagene）を用いて、添付説明書記載の方法を用いてそのアミノ酸が置換され
た変異体をコードするポリヌクレオチドが挿入された動物細胞発現ベクターが作製された
。抗体の発現、精製、濃度測定は実施例15に記載された方法に準じて実施された。
［参考実施例３］ノーマルマウスを用いたCa依存性結合抗体の消失加速効果の評価
（３－１）ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス（C57BL/6J mouse、Charles River Japan）にhsIL-6R（可溶型ヒトI
L-6レセプター：参考実施例４にて作製）が単独で投与された、もしくはhsIL-6Rおよび抗
ヒトIL-6レセプター抗体が同時投与された後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体
の体内動態が評価された。hsIL-6R溶液（5μg/mL）、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レ
セプター抗体の混合溶液が尾静脈に10 mL/kgで単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター
抗体として、上述のH54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434Wが使用された。
混合溶液中のhsIL-6R濃度は全て5μg/mLであるが、抗ヒトIL-6レセプター抗体の濃度は
抗体毎に異なり、H54/L28-N434Wは0.042 mg/mL、6RL#9-N434Wは0.55 mg/mL、FH4-N434W
は1 mg/mLに調製された。このとき、hsIL-6Rに対して抗ヒトIL-6レセプター抗体は十分
量過剰に存在するため、hsIL-6Rの大部分は抗体に結合していると考えられた。投与後15
分、7時間、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日の時点で採血が行われた。採取され
た血液を直ちに4℃、12,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。
分離された血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫で保存された。
（３－２）ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体の濃度の測
定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度は参考実施例１と同様のELISA法によっ
て測定された。この方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-N4
34W、6RL#9-N434W、FH4-N434W抗体の血漿中の抗体濃度の推移が図１８に示されている。
（３－３）電気化学発光法による血漿中hsIL-6R濃度測定
マウスの血漿中hsIL-6R濃度が電気化学発光法にて測定された。2000、1000、500、250
、125、62.5、31.25 pg/mLに調製されたhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈されたマ
ウス血漿測定試料と、SULFO-TAG NHS Ester（Meso Scale Discovery）でルテニウム
化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody（R&D）およびBiotinylated Anti-hum
an IL-6 R Antibody （R&D）との混合液を4℃で1晩反応させた。サンプル中のFree
Ca濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-N434WもしくはFH4-N434Wか
ら解離し、free体として存在する状態とするために、その際のAssay bufferには10 mM
EDTAが含まれていた。その後、当該反応液がMA400 PR Streptavidin Plate（Meso
Scale Discovery）に分注された。さらに25℃で1時間反応させたプレートの各ウエルが
洗浄された後、各ウエルにRead Buffer T（×4）（Meso Scale Discovery）が分注さ
れた。ただちに反応液はSECTOR PR 400 reader（Meso Scale Discovery）を用いて
測定された。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Mol
ecular Devices）を用いて算出された。前記の方法で測定された静脈内投与後のノーマ
ルマウスにおける血漿中のhsIL-6Rの濃度推移を図１９に示されている。
その結果、pH7.4におけるFcRnに対する結合活性を有する一方でhsIL-6Rに対するCa依存
的な結合活性を有しないH54/L28-N434W抗体が同時に投与された場合は、hsIL-6Rが単独で
投与された場合と比較して、hsIL-6Rの消失が大幅に遅延した。それに対して、hsIL-6Rに
対して100倍以上のCa依存的な結合を有し、pH7.4におけるFcRnに対する結合を有する6RL#
9-N434W抗体またはFH4-N434W抗体が同時に投与された場合は、hsIL-6Rが単独で投与され
た場合よりもhsIL-6Rの消失が加速された。hsIL-6Rが単独で投与された場合と比較して、
6RL#9-N434W抗体またはFH4-N434W抗体が同時に投与された場合は、投与後一日での血漿中
のhsIL-6R濃度がそれぞれ3倍および8倍低減した。この結果、カルシウム依存的に抗原に
対して結合する抗体に対して、pH7.4におけるFcRnに対する結合活性を付与することによ
って、血漿中からの抗原の消失がさらに加速し得ることが確認された。
hsIL-6Rに対するCa依存的な結合を有しないH54/L28-IgG1抗体と比較して、hsIL-6Rに対
して100倍以上のCa依存的な結合活性を有する6RL#9-IgG1抗体またはFH4-IgG1抗体は、hsI
L-6Rの消失を増大させる効果が確認された。hsIL-6Rに対して100倍以上のCa依存的な結合
を有し、pH7.4におけるFcRnに対する結合を有する6RL#9-N434W抗体またはFH4-N434W抗体
は、hsIL-6Rの消失をhsIL-6R単独の投与よりも加速することが確認された。これらのデー
タは、pH依存的に抗原に結合する抗体と同様、Ca依存的に抗原に結合する抗体がエンドソ
ーム内で抗原を解離することを示唆している。
［参考実施例４］可溶型ヒトIL-6レセプター（hsIL-6R）の調製
抗原であるヒトIL-6レセプターの組換えヒトIL-6レセプターは以下のように調製された
。Mullberg ら（J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968）で報告されているN末端側1
番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター（以下、hsIL-6R）の
CHO定常発現株が当業者公知の方法で構築された。当該発現株を培養することによって、h
sIL-6Rが発現した。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラ
フィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによってhsIL-6Rが精製された。最終工程に
おいてメインピークとして溶出された画分が最終精製品として用いられた。
［参考実施例５］NMRによるカルシウムイオン結合モチーフを有するヒトhVk1配列を含む
抗体のカルシウムイオン結合活性の評価
（５－１）抗体の発現と精製
NMR測定に用いるために発現させたLfVk1＿Caを含む抗体とLfVk1を含む抗体が精製され
た。具体的には、LfVk1＿Caを含む抗体（LfVk1＿Ca抗体とも呼ぶ）は重鎖（配列番号：２
４）と軽鎖（配列番号：４３）をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物
発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。また、LfVk1を含む抗体（LfVk1抗体
とも呼ぶ）は重鎖（配列番号：２４）と軽鎖（配列番号：４４）をそれぞれ発現させるこ
とが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最
終細胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地（In
vitrogen）へ懸濁された100 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株（Invitrogen
）の細胞懸濁液に、標識アミノ酸が加えられた。具体的には、Asp/Glu/Gln/Asn標識体に
ついてはL-Aspartic acid-13C4,15N（10 mg）、L-Glutamic acid-13C5,15N（2.5 mg
）、L-Glutamine-13C5,15N2（60 mg）、L-Asparagine-13C4,15N2・H2O（2.5 mg）、β-
chloro-L-alanine（6 mg）を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した
液を加えた。Leu標識体については、L-Leucine-15N（30 mg）、β-chloro-L-alanine（6
mg）を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した液を加えた。リポフ
ェクション法により調製されたプラスミドが細胞に導入された。プラスミドが導入された
細胞はCO2インキュベーター（37℃、8%CO2、90 rpm）中で5日間培養された。rProtein
A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いた当業者公知の方法にし
たがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精
製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数
を用いて測定値から抗体濃度が算出された（Protein Science (1995) 4, 2411-2423
）。
（５－２）Fabフラグメントの調製
分子量分画サイズ30,000MWCOの限外ろ過膜 を用いて、各種抗体が8.2-11.8 mg/mLま
で濃縮された。L-Cystein 1 mM、EDTA 2 mM、50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液（pH
6.8）を用いて8 mg/mLに希釈された当該抗体の試料が調製された。各抗体に対して1/2
40量のPapain（Roche Applied Science）を加えて攪拌された当該試料が37℃にて1時間
静置された。静置後、それぞれ下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSele
ct Sure（GE Healthcare）がタンデムにつながれた50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液（
pH 6.8）で平衡化されたGly-Gly-Tyr-Arg（Sigma）ペプチドを結合した1 mLサイズのHi
Trap NHS-activated HP（GE Healthcare）に添加された。上流のGly-Gly-Tyr-Argペプ
チドによって活性化Papainを除去するとともに、下流のProteinA担体カラムでFcフラグメ
ントおよび未消化抗体を除去することでFabフラグメントの精製画分が得られた。Fab画分
に含まれる不活性Papainが活性化するのを防ぐために、Fab画分にはシステインプロテア
ーゼ阻害剤E64（Sigma）を10μM添加した。なお、上記のすべてのカラム操作は20から25
℃の室温下にて実施された。
（５－３）LfVk1＿Ca抗体およびLfVk1抗体の FabフラグメントのNMR試料調製
抗体溶液をMWCO 5000の限外濾過器Vivaspin（Sartorius）を用いて0.5 mLまで遠心に
より濃縮した。次に上記限外濾過器にダイアフィルトレーションカップを設置して、NMR
用緩衝液：5 mM d-BisTris, 20 mM NaCl, 0.001 % (w/v) NaN3, 5 % (v/v)
2H2O, pH 7.0（NaOH、HClを用いてpHを調製した）へ緩衝液置換（ダイアフィルトレ
ーションカップに上記緩衝液を5 mL足して0.5 mLまで遠心濃縮することを3回繰り返し
た）を行い、最後に0.25 mLまで濃縮した。最後に、NMR緩衝液で限外濾過器を洗いこみ
、濃縮液とあわせて抗体溶液をLfVk1＿Ca抗体については420μL、LfVk1抗体については27
0μLとした。この段階で再度、pHを確認し、必要に応じてNaOH、HClによりpH 7.0に調整
した。UV測定器Nanodrop（Thermo Fisher Scientific）を用いて280 nmにおける吸光
度を測定し、280 nmにおけるモル吸光係数を70000 M-1・cm-1としてFabフラグメントを
定量した。Leu標識LfVk1＿Ca抗体、Leu標識LfVk1抗体は0.12 mM、Asp、Glu、Asn、Gln標
識LfVk1＿Ca抗体、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1抗体は0.24 mMとなった。これらの試料
の内、LfVk1＿Ca抗体については、直径5 mmのNMR試料管（shigemi）に、LfVk1抗体につ
いては直径5 mmの水溶液用対称形ミクロ試料管（shigemi）にパスツールピペットを用い
て充填した。LfVk1＿Ca抗体のCa2+滴定実験においては、抗体溶液に、抗体に対して、Ca2
+が1、2、5、10、20モル等量となるよう、CaCl2溶液を順次、添加した。添加に用いたCaC
l2溶液にはNMRバッファーに溶解した10、20、50、100 mM CaCl2溶液を準備した。シリ
ンジ部分を既製品から延長した特注マイクロシリンジ（ITO）により、添加容量が3-10μL
の範囲となるように、CaCl2溶液の必要量を直接、NMR試料管に充填された抗体溶液に添加
し、試料管をボルテックスミキサーにより攪拌後、手動遠心器（Shimadzu）により遠心分
離した。
（５－３）LfVk1＿Ca抗体およびLfVk1＿Ca抗体の Fabフラグメントのアミド基シグナル
を観測するためのNMR測定
NMR測定には、TCI CryoProbeを設置したNMR分光器DRX750（Bruker Biospin）を用い
た。設定温度を307K（GasFlow 535 L/h）とした。アミド基シグナルを観測するためのN
MR測定には1H-15N HSQCを用いた。測定法としては、15N展開期にα炭素とカルボニル炭
素の同時13Cデカップリング、および溶媒水シグナル消去のための3-9-19パルストレイン
を伴う1H-15N FHSQCを用い、それを制御するパルスプログラムには、メーカー（Bruker
Biospin）により標準として準備されているものを用いた。NMRの測定条件は以下の通り
とした。スペクトル幅:12019Hz (f2), 1976 Hz (f1)、データポイント数: 2048 (f
2), 128 (f1)。データ処理にはTopspin 3.0（Bruker Biospin）を用いた。データ処
理条件は以下の通りとした。f2、f1共に、ウィンドウ関数としてshifted Sine (QSINE)
を乗じ、2倍のデータポイント数となるようにゼロフィリングを行った後に、フーリエ
変換を行った。シグナルの化学シフトはNMR解析ソフトウェアSparky（UCSF）を用いて算
出した。
（５－４）主鎖アミド基のNMRシグナルの帰属
これまでにトシリズマブ（重鎖配列番号：２４、軽鎖配列番号：２５）のFabフラグメ
ントの主鎖アミド基のNMRシグナルの内、80%が帰属された（データ未公開）。LfVk1＿Ca
抗体のFabフラグメントのアミノ酸配列は、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の一部、および軽鎖73
、83番のアミノ酸残基およびを除き、トシリズマブとFabフラグメントのアミノ酸配列と
同じである。両抗体でアミノ酸配列が同じ部分については、そのNMRシグナルが同一の化
学シフトを有する、あるいはそれらが近いため、トシリズマブの帰属情報を移行すること
が可能であった。Leu標識試料については、軽鎖11、(33)、(46)、(47)、(54)、(78)、125
、135、136、154、175、179、181、201、重鎖18、46、64、71、81、83、114、144、147、
165、176、181、184、195が帰属を移行することが可能であった。上記、括弧が付いてい
ない番号はトシリズマブと同一の化学シフトであるため、帰属が移行できた残基番号、括
弧が付いた番号は、トシリズマブと近い化学シフトを有しており、それ以外に近い化学シ
フトを有するシグナルがないため、帰属が可能であった残基番号であった。一方、Asp、G
lu、Asn、Gln標識試料については、LfVk1＿Ca抗体とLfVk1抗体のスペクトルを比較し、4
個のシグナルがLfVk1＿Caで新たに観測されていた。これは、この両抗体間でAsp、Glu、A
sn、Gln残基の内、Ca2+結合モチーフとして導入した配列の異なる軽鎖Asp30、31、32、92
、Glu50の5残基の内のいずれか4残基由来であると分類できた。
（５－５）Ca 2+ のLfVk1＿Ca抗体上の結合部位の同定
LfVk1＿Ca抗体のFabフラグメントのCa2+未添加状態と、20モル等量添加の1H-15N HSQC
スペクトルを比較して、化学シフトが変化しているシグナルを抽出した。その結果、Leu
標識試料からは、軽鎖Leu33が結合に関与しており、それ以外のLeu残基は結合に関与して
いないことが分かった。また、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料からは、軽鎖Asp30、31、32
、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基が結合に関与し、それ以外のAsp、Glu、Asn、Gl
n残基の内の1残基を除くすべてが結合に関与していないことが明らかとなった。以上のこ
とから、Ca2+結合モチーフとして導入されたアミノ酸配列の内、少なくとも軽鎖CDR1、こ
れに加えて軽鎖CDR2、CDR3の両方もしくはいずれかのアミノ酸がCa2+結合に関与している
と同定された。このことは実施例１５において確認された30位、31位、32位、50位および
92位（Kabatナンバリング）のうち４つがhVk5-2配列のアミノ酸であることがカルシウム
イオンの結合に重要であった結果と一致している。
（５－６）滴定実験におけるCa 2+ 解離定数の算出
Ca2+濃度がLfVk1＿Ca抗体のFabフラグメントに対して、0、1、2、5、10、20モル等量の
時の1H-15N HSQCスペクトルを利用した。結合部位として同定された軽鎖Leu33のシグナ
ルの1Hまたは15N化学シフトを縦軸に、上記Ca2+のモル等量を横軸にプロットし、グラフ
作成ソフトウェアGnuplotを用いて以下の式２で示される関数のフィッティングを行った
。
〔式２〕
f(x)=s×[1-0.5/a×{(a×x+a+Kd)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}+t×[0.5/a×{(a×x+a+K
d)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}
式２で表される関数において、s、tはそれぞれCa2+非結合時の化学シフト[ppm]、Ca2+
飽和結合時の推定化学シフト[ppm]、aは抗体 Fabフラグメント濃度[M]、Kdは解離定数、
xは抗体 Fabフラグメントに対して添加したCa2+のモル等量を示している。フィッティン
グの際には、s, t, Kdをフィッティングパラメータとした。その結果、1H化学シフトか
らはKd=7.1×10-5[M]、15N化学シフトからは、Kd=5.9×10-5[M]として見積もられた。

Claims (12)

  1. pHの条件によって所望の抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を選択する方法であって、
    a）互いに配列の異なる複数の抗原結合分子を含んでなるライブラリであって、
    前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、
    pHによって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が、前記重鎖可変領域の相補鎖決定領域（CDR）1、CDR2、CDR3および前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のいずれか一つ以上のCDRに含まれ、
    前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである、
    ライブラリを作製するステップ、
    b）前記ライブラリをpHの異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステップ、
    c）pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の集団を前記ライブラリから分画するステップ、
    d）c）において分画された集団からpHの条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を単離するステップ、
    とを含む方法。
  2. pHの条件によって所望の抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
    a）互いに配列の異なる複数の抗原結合分子をコードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含んでなるライブラリであって、
    前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、
    pHによって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が、前記重鎖可変領域の相補鎖決定領域（CDR）1、CDR2、CDR3および前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のいずれか一つ以上のCDRに含まれ、
    前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである、
    ライブラリを作製するステップ、
    b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
    c）前記複数のウイルスをpHの異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステップ、
    d）pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ライブラリから分画するステップ、
    e）d）において分画されたウイルスの集団からpHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
    f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
    とを含む方法。
  3. 追加的に前記c）からd）のステップを少なくとも1回反復する請求項１または２に記載の方法。
  4. pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. pH酸性域条件がpH4.0から6.5のいずれかである請求項４に記載の方法。
  6. pH中性域条件がpH6.7から10.0のいずれかである請求項４または５に記載の方法。
  7. pHの条件によって所望の抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造方法であって、
    a）互いに配列の異なる複数の抗原結合分子をコードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含んでなるライブラリであって、
    前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、
    pHによって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が、前記重鎖可変領域の相補鎖決定領域（CDR）1、CDR2、CDR3および前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のいずれか一つ以上のCDRに含まれ、
    前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである、
    ライブラリを作製するステップ、
    b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
    c）前記複数のウイルスをpHの異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステップ、
    d）pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ライブラリから分画するステップ、
    e）d）において分画されたウイルスの集団からpHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
    f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
    g）単離されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿入されたベクターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
    h）g）で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
    とを含む製造方法。
  8. pHの条件によって所望の抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造方法であって、
    a）互いに配列の異なる複数の抗原結合分子をコードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含んでなるライブラリであって、
    前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、
    pHによって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基が、前記重鎖可変領域の相補鎖決定領域（CDR）1、CDR2、CDR3および前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のいずれか一つ以上のCDRに含まれ、
    前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである、
    ライブラリを作製するステップ、
    b）前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
    c）前記複数のウイルスをpHの異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステップ、
    d）pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ライブラリから分画するステップ、
    e）d）において分画されたウイルスの集団からpHの条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
    f）単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
    g）単離されたポリヌクレオチドをインフレームで抗体定常領域をコードするポリヌクレオチドと連結するステップ、
    h）g）において連結されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿入されたベクターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
    i）h）で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
    とを含む製造方法。
  9. 追加的に前記c）からd）のステップを少なくとも1回反復する請求項７または８に記載の製造方法。
  10. pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する請求項７から９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. pH酸性域条件がpH4.0から6.5のいずれかである請求項１０に記載の製造方法。
  12. pH中性域条件がpH6.7から10.0のいずれかである請求項１０または１１に記載の製造方法。

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