TW201329299A - 離子濃度依存性結合分子庫 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示主要由隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基係包含於抗原結合結構域(domain)中之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫。又，亦揭示包含編碼抗原結合分子之複數個聚核苷酸分子之組成物、包含含有前述聚核苷酸分子之複數個載體的組成物、前述抗原結合分子之選擇方法、前述聚核苷酸分子之單離方法、前述抗原結合分子之製造方法、包含前述抗原結合分子之醫藥組成物。

Description

離子濃度依存性結合分子庫 相關之申請案
本申請案係以日本專利申請案2011-218006(2011年9月30日申請)及2012-123479(2012年5月30日申請)作為優先權而主張，該等內容係作為參考而採入本說明書中。
發明之領域
本發明係關於隨著離子濃度之條件不同，對抗原之結合活性會變化的抗原結合分子庫及其製造方法、如此抗原結合分子之選擇方法及製造方法、以及含有如此抗原結合分子之醫藥組成物。
抗體在血漿中之安定性高，副作用亦少，因而作為醫藥品而受到注目。其中尤以IgG型之抗體醫藥有多數上市，現在亦有大量的抗體醫藥正被開發(非專利文獻1、非專利文獻2)。另一方面，作為可應用於第2世代之抗體醫藥的技術，係開發有各種的技術，而被報導使效用(effector)功能、抗原結合能力、藥物動力學、安定性提高；或免疫原性風險降低之技術等(非專利文獻3)。抗體醫藥一般而言投與量非常之高，因此被認為其課題為皮下投與製劑製造困難、且製造成本高等。作為使抗體醫藥之投與量降低之方法，可考慮使抗體之藥物動力學提高的方 法、及使抗體與抗原之親和性(affinity)提高之方法。
作為使抗體之藥物動力學提高的方法，被報導有恆定區域之人工胺基酸取代(非專利文獻4、5)。作為使抗原結合能力、抗原中和能力增強之技術，被報導有親和性成熟化技術(非專利文獻6)，藉由於可變區域之CDR區域等的胺基酸導入變異，可使對抗原之結合活性增強。藉由抗原結合能力之增強，可使in vitro之生物活性提高、或使投與量降低，進一步地亦可提高in vivo之藥效(非專利文獻7)。
另一方面，抗體每1分子可中和之抗原量係依存於親和性，藉由使親和性變強，能夠以少的抗體量來中和抗原，可用各種方法來使抗體之親和性變強(非專利文獻6)。進一步地，若能與抗原共價地鍵結，使親和性無限大，則能夠以1分子抗體來中和1分子之抗原(2價的情況為2個抗原)。但是，至今為止的方法中，以1分子之抗體對1分子之抗原(2價的情況為2個抗原)進行化學計量上的中和反應已為極限，以抗原量以下之抗體量將抗原完全中和則為不可能。換言之，使親和性變強之效果係存在著極限(非專利文獻9)。中和抗體時，為了使其中和效果持續一定期間，必須投與在該期間於生體內產生之抗原量以上的抗體量，僅靠上述之抗體藥物動力學提高、或親和性成熟化技術，對必要抗體投與量之降低而言尚存在極限。因此，為了將以抗原量以下之抗體量中和抗原之效果持續一目標之期間，必須以一抗體中和複數個抗原。
作為達成其之新方法，最近報導有依pH依存性地對抗原結合的抗體(專利文獻1)。此文獻揭示了藉由對抗原結合分子導入組胺酸，在pH中性區域與pH酸性區域其性質會變化之pH依存性地對抗原結合的抗體。在血漿中之中性條件下對抗原強力地結合，在內體(endosome)內之酸性條件下由抗原解離之pH依存性地對抗原結合的抗體，在內體內可由抗原解離。pH依存性地對抗原結合的抗體，在使抗原解離後，抗體藉由FcRn被回收到血漿中後可再度與抗原結合，因此能夠以一抗體對複數個抗原重複地結合。
又，抗原之在血漿中滯留性，相較於與FcRn結合而被回收的抗體係非常短。在血漿中滯留性長之抗體與如此之血漿中滯留性短的抗原結合時，抗體抗原複合體在血漿中滯留性會與抗體同樣地變長。因此，抗原藉由與抗體結合，血漿中滯留性傾向於變長，血漿中抗原濃度會上昇。如此情況時，即使抗體對抗原之親和性提高，亦無法促進抗原由血漿中消失。上述之pH依存性地對抗原結合的抗體，相較於通常之抗體，有被報導作為促進抗原由血漿中消失之方法亦為有效(專利文獻1)。
如此pH依存性地對抗原結合的抗體因以一抗體對複數個抗原結合，相較於通常之抗體，能夠促進抗原由血漿中之消失，因此具有通常的抗體所無法達成之作用。藉由取代既存之抗體序列，可賦予對抗原之pH依存性的結合活性。另一方面，為了新取得如此的抗體，在由免疫動物 取得抗體之方法或由人類抗體庫取得抗體之方法中，被認為有如下述之限制。
對非人類動物誘發免疫之方法中，雖有可能可以得到pH依存性的結合抗體，但也可能有難以在短期間得到對多種抗原之pH依存性地對抗原結合的抗體、或選擇性地得到對特定的抗原決定部位特異地結合的抗體。又，可由人類抗體庫中以pH依存性地對抗原之結合能力作為指標來濃縮抗體。但是，一般而言(登錄於Kabat資料庫之)人類抗體之抗體可變區域部分中的組胺酸殘基出現頻率，已知在重鏈CDR1為5.9%、重鏈CDR2為1.4%、重鏈CDR3為1.6%、輕鏈CDR1為1.5%、輕鏈CDR2為0.5%、輕鏈CDR3為2.2%，並不高，於人類抗體庫中可具有pH依存性的抗原結合能力之序列被認為非常少。因而，期望提供大量含有與抗原之結合部位中組胺酸出現頻率經提高之可具有pH依存性的對抗原之結合能力之序列的抗體庫。
另一方面，可認為只要可在pH以外之血漿中與早期內體內之環境間賦予對於抗原的結合能力之對於不同要素之依存性，即可達成促進抗原由血漿中之消失等效果。
再者，本發明之先前技術文獻如以下所示。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2009125825
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol.(2005)23, 1073-1078
[非專利文獻2]Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008, Eur J Pharm Biopharm. (2005)59(3), 389-396.
[非專利文獻3]Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells.(2005) 20(1), 17-29
[非專利文獻4]Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life, J Immunol.(2006) 176(1), 346-356
[非專利文獻5]Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol.(1997) 15(7), 637-640
[非專利文獻6]Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.(2005) 102(24), 8466-8471
[非專利文獻7]Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract, J. Mol. Biol.(2007) 368, 652-665
[非專利文獻8]Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol, (2005) 16(6), 631-6
[非專利文獻9]Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334(4), 1004-13.
本發明係鑑於如此之狀況而為者，其目的在提供主要由隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基係包含於抗原結合結構域(domain)中之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫、包含編碼前述抗原結合分子之複數個聚核苷酸分子的組成物、包含含有前述聚核苷酸分子之複數個載體之組成物、前述抗原結合分子之選擇方法、前述聚核苷酸分子之單離方法、前述抗原結合分子之製造方法、包含前述抗原結合分子之醫藥組成物。
本發明者等人，對於包含隨著生體內環境要素之相異，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基係包含於抗原結合結構域中之彼此序列互異之複數個抗原結合分子的分子庫進行努力研究。結果，本發明者等人，著眼於血漿中與早期內體內中之離子濃度、特別是鈣離子濃度的差異或pH，發現了藉由使用具有鈣依存性或pH依存性對抗原之結合活性的抗原結合分子，可製造主要由促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入、帶來血漿中之抗原濃度減少的抗原結合分子所構成之分子庫。
亦即本發明係關於主要由隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基係包含於抗原結合結構域中之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫、包含編碼前述抗原結合分子之複數個聚核苷酸分子的組成物、包含含有前述聚核苷酸分子之複數個載體之組成物、前述抗原結合分子之選擇方法、前述聚核苷酸分子之單離方法、前述抗原結合分子之製造方法、包含前述抗原結合分子之醫藥組成物等。更具體而言係關於以下者。
本發明提供：[1]一種分子庫，其係主要由彼此序列互異的複數個抗原結合分子所構成之分子庫，其特徵在於，前述抗原結合 分子中之抗原結合結構域，係包含隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基、[2]如[1]記載之分子庫，其中離子濃度為鈣離子濃度、[3]如[2]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之重鏈的抗原結合結構域中、[4]如[3]記載之分子庫，其中重鏈之抗原結合結構域為重鏈可變區域、[5]如[4]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈可變區域之CDR3中、[6]如[2]至[5]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈CDR3之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位中、[7]如[2]至[6]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基以外之胺基酸序列係包含天然(naive)序列之胺基酸序列、[8]如[3]至[7]中任一項記載之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈可變區域係包含天然序列之胺基酸序列、[9]如[2]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之輕鏈之抗原結合結構域中、[10]如[9]記載之分子庫，其中輕鏈之抗原結合結構域為輕鏈可變區域、[11]如[10]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包 含於輕鏈可變區域之CDR1中、[12]如[11]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於CDR1之以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位中、[13]如[10]至[12]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之CDR2中、[14]如[13]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2之以Kabat編號表示之50位中、[15]如[10]至[14]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基為輕鏈之CDR3、[16]如[15]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3之以Kabat編號表示之92位中、[17]如[2]或[9]至[16]中任一項記載之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈的框架(framework)係包含生殖細胞系列之框架序列、[18]如[2]或[9]至[17]中任一項記載之分子庫，其中前述抗原結合分子之重鏈可變區域係包含天然序列之胺基酸序列、[19]如[1]至[18]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係形成鈣結合模式結構(motif)、[20]如[19]記載之分子庫，其中鈣結合模式結構為鈣黏素結構域、EF hand、C2結構域、Gla結構域、C型凝集素、結構域、annexin、thrombospondin 3型結構域及類EGF結構域、Vk5之部分、序列編號10、序列編號11之 任一者之鈣結合模式結構、[21]如[2]至[20]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基為具有金屬鉗合作用之胺基酸、[22]如[21]記載之分子庫，其中具有金屬鉗合作用之胺基酸，係絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺、天門冬胺酸或麩胺酸之任一者以上之胺基酸、[23]如[1]記載之分子庫，其中離子濃度之條件為pH、[24]如[23]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之重鏈的抗原結合結構域中、[25]如[24]記載之分子庫，其中重鏈之抗原結合結構域為重鏈可變區域、[26]如[25]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈可變區域之以Kabat編號表示之27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位或107位之任一者以上中、[27]如[26]記載之分子庫，其中重鏈可變區域之以Kabat編號表示之27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位或107位之 任一者的胺基酸殘基以外之胺基酸序列係包含天然序列之胺基酸序列、[28]如[23]至[27]中任一項記載之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈可變區域係包含生殖細胞系列之序列、[29]如[23]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之輕鏈的抗原結合結構域中、[30]如[29]記載之分子庫，其中輕鏈之抗原結合結構域為輕鏈可變區域、[31]如[30]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之以Kabat編號表示之24位、27位、28位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位或95a位之任一者以上中、[32]如[30]或[31]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之CDR1中、[33]如[32]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1之以Kabat編號表示之24位、27位、28位、30位、31位、32位或34位之任一者以上中、[34]如[30]至[33]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2中、[35]如[34]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2之以Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位或56位之任一者以上中、 [36]如[30]至[35]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3中、[37]如[36]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3之以Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93、94位或95a位之任一者以上中、[38]如[29]至[37]中任一項記載之分子庫，其中輕鏈之框架係包含生殖細胞系列之框架序列、[39]如[29]至[38]中任一項記載之分子庫，其中重鏈可變區域為天然序列、[40]如[23]至[39]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸、[41]如[23]至[40]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基為麩胺酸、[42]如[23]至[39]記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基係側鏈之pKa為5.5-7.0之胺基酸、[43]如[23]至[40]或[42]中任一項記載之分子庫，其中前述胺基酸殘基為組胺酸、[44]一種分子庫，其係主要由包含如[1]至[43]中任一項記載之抗原結合分子之複數個融合多肽所構成之分子庫，其特徵在於，前述融合多肽係抗原結合分子之重鏈可變區域與病毒外殼蛋白質之至少一部分經融合者、[45]如[44]記載之分子庫，其中前述病毒外殼蛋白質係選自由蛋白質pIII、主外殼蛋白質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1及其變異體所構成群組、 [46]一種組成物，其係包含各自編碼如[1]至[43]記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如請求項[44]或[45]記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸分子、[47]一種組成物，其係包含：以連結為能夠作用的狀態各自包含如[46]記載之複數個聚核苷酸分子之複數個載體、[48]如[47]記載之組成物，其中載體為可複製之表現載體、[49]如[48]記載之組成物，其中可複製之表現載體係使選自由lac Z啟動子系、鹼性磷酸酯酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λPL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子、色胺酸啟動子、pBAD啟動子及噬菌體T7啟動子所構成群組之啟動子區域在表現載體中與前述聚核苷酸連結為能夠作用、[50]如[48]或[49]記載之組成物，其中可複製之表現載體為M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物；或者λ型噬菌體或其衍生物、[51]一種組成物，其係包含：各自包含如[47]至[50]中任一項記載之載體的複數個病毒、[52]一種組成物，其係包含：：各自於其表面展現如[1]至[43]記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個病毒、[53]一種分子庫，其係包含如[1]至[43]記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互 異的融合多肽之分子庫，且其係具有1 x 106至1 x 1014個之彼此相異之可變區域序列、[54]如[53]記載之分子庫，其係具有1 x 108以上個之彼此相異之可變區域序列、[55]一種分子庫之製造方法，其係主要由彼此序列互異的複數個抗原結合分子所構成之分子庫之製造方法，且其係包含製造以前述抗原結合分子中之抗原結合結構域係包含隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基的方式所設計之複數個抗原結合分子、[56]如[55]記載之製造方法，其中前述抗原結合分子為如[2]至[43]中任一項記載之抗原結合分子、[57]如[55]或[56]之製造方法，其中前述抗原結合分子之重鏈可變區域係與病毒外殼蛋白質之至少一部分融合、[58]如[55]至[57]中任一項記載之製造方法，其中前述病毒外殼蛋白質係選自由蛋白質pIII、主外殼蛋白質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1及其變異體所構成群組、[59]一種選擇抗原結合分子之方法，其係選擇隨著離子濃度之條件不同，對抗原之結合活性會變化之抗原結合分子之方法，且其係包含a)製造主要由如[1]至[43]中任一項記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互異的 融合多肽所構成之分子庫之步驟、b)將前述分子庫在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、c)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子的集團之步驟、d)由於c)所區分的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之步驟、[60]一種單離聚核苷酸之方法，其係單離編碼隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子的聚核苷酸之方法，且其係包含、a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠作用之狀態各自包含各自編碼如申[1]至[43]中任一項記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、 f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟、[61]如[60]記載之方法，其中追加地重複由前述c)至d)的步驟至少1次、[62]如[59]至[61]中任一項記載之方法，其中離子濃度為鈣離子濃度、[63]如[62]記載之方法，其係選擇在低鈣濃度之條件下對抗原的結合活性比在高鈣濃度之條件下的結合活性更低之抗原結合分子、[64]如[63]記載之方法，其中低鈣濃度之條件為0.1μM至30μM、[65]如[63]或[64]記載之方法，其中高鈣濃度之條件為100μM至10 mM、[66]如[59]至[61]中任一項記載之方法，其中離子濃度之條件為pH、[67]如[66]記載之方法，其係選擇在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性更低之抗原結合分子、[68]如[66]記載之方法，其中pH酸性區域條件為pH4.0至6.5、[69]如[67]或[68]記載之方法，其中pH中性區域條件為pH6.7至10.0、[70]一種抗原結合分子之製造方法，其係隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之製造方法，其係包含 a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠作用之狀態各自包含各自編碼如[1]至[43]中任一項記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟、g)培養經導入以連結為能夠作用之狀態插入經單離之聚核苷酸的載體之宿主細胞的步驟、h)由於g)所培養之培養液中回收抗原結合分子之步驟、[71]一種抗原結合分子之製造方法，其係隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之製造方法，其係包含a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠作用之狀態各自包含各自編碼如[1]至[43]中任一項所記載 之彼此序列互異的抗原結合分子或如[44]或[45]記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟、g)使經單離之聚核苷酸與編碼抗體恆定區域之聚核苷酸連結為同一讀框(in-frame)之步驟、h)培養經導入以連結為能夠作用之狀態插入於g)中經連結之聚核苷酸的載體之宿主細胞的步驟、i)由於h)所培養之培養液中回收抗原結合分子之步驟、[72]如[70]或[71]記載之製造方法，其中追加地重複由前述c)至d)的步驟至少1次、[73]如[70]至[72]中任一項記載之製造方法，其中離子濃度為鈣離子濃度、[74]如[73]記載之製造方法，其係選擇在低鈣濃度之 條件下對抗原的結合活性比在高鈣濃度之條件下的結合活性更低之抗原結合分子、[75]如[74]記載之製造方法，其中低鈣濃度之條件為0.1μM至30μM、[76]如[74]或[75]記載之製造方法，其中高鈣濃度之條件為100μM至10 mM、[77]如[70]至[72]中任一項記載之製造方法，其中離子濃度之條件為Ph之條件、[78]如[77]記載之製造方法，其係選擇在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性更低之抗原結合分子、[79]如[78]記載之製造方法，其中pH酸性區域條件為pH4.0至6.5、[80]如[78]或[79]記載之製造方法，其中pH中性區域條件為pH6.7至10.0、[81]一種抗原結合分子，其係藉由如[70]至[80]中任一項記載之製造方法所製造、[82]一種醫藥組成物，其係包含如[81]記載之抗原結合分子或其改變體醫藥組成物。
藉由本發明之揭示，係提供主要由隨著離子濃度之條件不同，對抗原之結合活性會變化之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫。又，藉由本發明之揭 示，主要由隨著金屬離子濃度及/或氫離子濃度之條件不同，對抗原之結合活性會變化之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫之新穎且系統的製造方法。如此之分子庫，例如可作為依照金屬離子濃度及/或氫離子濃度之條件所期望之活性，例如可作為有用於選擇及/或篩選具有結合親和性及總結合力(avidity)之合成的抗原結合分子之殖株的組合分子庫來使用。
該等之分子庫，係有用於鑑定可與多種多樣之對象抗原的任一者相互作用之抗原結合分子之多肽序列。例如，含有作為噬菌體展示(phage display)而表現之本發明之多樣化抗原結合分子的多肽之分子庫，特別有用於目標抗原結合分子之選擇及/或篩選，又，藉由本發明係提供用於其之高通量之有效率且可自動化之系統。依照本發明之方法，可提供對於對象抗原條件依存性地結合的抗原結合分子。進一步地，藉由本發明，係提供包含該抗原結合分子作為有效成分之醫藥組成物。
定義 胺基酸
本說明書中，例如以如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示的，胺基酸係以1字編碼或3字編碼、或其兩者來標記。
EU編號及Kabat編號
依照本發明中所使用之方法，定位於抗體之CDR與FR的胺基酸位置係遵照Kabat所規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區域之胺基酸係遵照Kabat編號，恆定區域之胺基酸係遵照根據Kabat之胺基酸位置的EU編號來表示。
胺基酸之改變
為了改變抗原結合分子之胺基酸序列中的胺基酸，可適當地採用部位特異性突變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等之公知方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸改變方法，亦可採用複數個公知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，亦適合使用含有使非天然胺基酸及與終止密碼子之1的UAG密碼子(琥珀(amber)密碼子)互補的琥珀抑制子tRNA經結合之tRNA的無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))等。又，做為表示胺基酸之改變的標記，可適當地使用在表示特定位置之數字前後使用改變前與改變後之胺基酸1字編碼的標記。例如，於抗體恆定區 域中所含之Fc區域加入胺基酸的取代時所用的P238D之改變，表示以EU編號表示之238位的Pro係取代為Asp。亦即，數字係表示以EU編號表示之胺基酸的位置，其之前所記載的胺基酸一字編碼係表示取代前之胺基酸、其後所記載之胺基酸1字編碼係表示取代後之胺基酸。
及/或本說明書中，「及/或」之用語的意義，係包含「及」與「或」呈適當組合之所有組合。具體而言，例如「33位、55位、及/或96位之胺基酸被取代」係指包含以下之胺基酸的改變之變化；(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位及55位、(e)33位及96位、(f)55位及96位、(g)33位及55位及96位。
抗原結合分子
本說明書中，用語「抗原結合分子」係作為表示包含抗原結合結構域之分子的最廣義的意義來使用，具體而言，只要該等係顯示對抗原之結合活性，則包含各種之分子型。例如，作為抗原結合結構域與FcRn結合結構域結合之分子的例子，可列舉抗體。抗體可包含單一之單株抗體(包含激動劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合體抗體等。又，作為抗體之片段來使用的情況時，可適合列舉抗原結合結構域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv及Fv)。本發明之抗原結合分子，亦可包含 使用既存之安定的α/β桶狀(barrel)蛋白質構造等之立體構造作為支架(scaffold)，且僅有其一部分之構造為了抗原結合結構域之構築而被分子庫化之支架分子。
本說明書中，「抗原結合結構域」只要與作為目標的抗原結合，何種構造之結構域均可使用。如此之結構域之例子，可列舉例如：抗體之重鏈及輕鏈的可變區域、生體內存在之細胞膜蛋白之Avimer中所含之35胺基酸左右稱為A結構域之模組(WO2004044011、WO2005040229)、包含表現於細胞膜之糖蛋白質的纖連蛋白(fibronectin)中與蛋白質結合的結構域之10Fn3結構域的Adnectin(WO2002032925)、以構成由蛋白質A(protein A)之58胺基酸所成之3個螺旋之束(bundle)之IgG結合結構域為支架之Affibody(WO1995001937)、具有包含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個逆並行螺旋及圈環(loop)之次單位重複堆積之構造的錨蛋白重複(ankyrin repeat：AR)的露出於分子表面的區域之DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002020565)、支持嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等之脂質運載蛋白分子中被高度保留的8個逆並行股於中央方向扭轉之桶狀構造的單側之4個圈環區域之Anticalin等(WO2003029462)、作為八目鰻、盲鰻等無頷類之獲得免疫系統而不具有免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之重複(leucine-rich-repeat(LRR))模組進行重複堆積之 馬蹄形構造之內部的並行型片狀構造之凹陷區域(WO2008016854)。本發明之抗原結合結構域的適合例子，可列舉包含抗體之重鏈及輕鏈可變區域之抗原結合結構域。
本說明書中，「抗體」係指天然者或藉由部分或完全合成而製造之免疫球蛋白。抗體可由其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞的培養上清液中單離、或藉由使用基因重組等手法部分或完全合成。抗體之例子可適合列舉免疫球蛋白之同型(isotype)及該等之同型的次類型(subclass)。人類之免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM之9種類型(同型)。本發明之抗體可包含該等之同型當中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。作為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4恆定區域，基因多型所致之複數異型(allotype)序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，然本發明中，其任意者均可。特別是人類IgG1之序列，以EU編號表示之356-358位織胺基酸序列可為DEL亦可為EEM。人類IgK(Kappa)恆定區域與人類IgL7(Lambda)恆定區域，基因多型所致之複數異型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，然本發明中，其任意者均可。製造具有所期望之結合活性之抗體之方法為所屬技術領域中具有通常知識者所公知。
抗體可使用公知之手段作為多株或單株抗體來取得。單株抗體可適合製造來自哺乳動物之單株抗體。來自哺乳動物之單株抗體，係包含藉由融合瘤所產生者、及藉由用基因步驟手法以含有抗體基因之表現載體轉形之宿主細胞所產生者等。
產生單株抗體之融合瘤，可藉由使用公知技術來製造。亦即，藉由致敏抗原，遵照通常之免疫方法來對哺乳動物誘發免疫。所得之免疫細胞係藉由通常之細胞融合法來與公知之親細胞融合。接著，藉由通常之篩選法，篩選單株之抗體產生細胞，藉此可選擇會產生對該致敏抗原之抗體的融合瘤。
以該致敏抗原誘發免疫之哺乳動物，雖不限定特定的動物，但較佳為考慮與細胞融合所使用之親細胞的適合性來選擇。一般而言，係適合使用囓齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠；或兔子、猿猴等。
遵照公知之方法，上述動物係藉由致敏抗原來誘發免疫。例如，作為一般的方法，致敏抗原係藉由對哺乳動物之腹腔內或皮下來注射而投與，藉以實施免疫。具體而言，以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當之稀釋倍率來稀釋的致敏抗原，係依期望與通常的佐劑、例如佛朗氏(Freund’s)完全佐劑混合，而被乳化後，每4至21日對哺乳動物投與該致敏抗原數次。又，在致敏抗原之誘發免疫時可使用適當的載劑。特別是使用分子量小之部分胜肽作為致敏抗原時，亦有時會期望將與白蛋 白、鑰孔笠貝血青素(keyhole limpet hemocyanin)等之載劑蛋白質結合之該致敏抗原胜肽誘發免疫。
又，產生對所期望之多肽的抗體之融合瘤，亦可使用DNA免疫，如以下之方式來製造。DNA免疫，係指在以能夠在免疫動物中表現編碼抗原蛋白質之基因的態樣所構築之載體DNA被投與之該免疫動物中，藉由使致敏抗原在該免疫動物之生體內表現，而給予免疫刺激之免疫方法。相較於對免疫動物投與蛋白質抗原之一般的免疫方法，DNA免疫被期待有如下的優越性。
-抗原為膜蛋白質時，可維持其構造而給予免疫刺激
-無純化免疫抗原之必要
作為與前述免疫細胞融合之細胞，係使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞較佳為具備用以篩選之適當的選擇標記。選擇標記係指在特定之培養條件下可生存(或無法生存)的生物性質。選擇標記中，公知者為次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶缺損(以下省略為HGPRT缺損)、或胸苷激酶缺損(以下省略為TK缺損)等。具有HGPRT或TK缺損之細胞，係具有次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷感受性(以下省略為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇性培養基中無法進行DNA合成而死滅，但與正常細胞融合時，則可利用正常細胞之補救路徑(salvage pathway)來繼續DNA之合成，因此在HAT選擇性培養基中亦會增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，可分別以含有6硫鳥嘌呤、8氮鳥嘌呤(以下省略為8AG)、或5’溴去氧尿苷之 培養基來選擇。將該等之嘧啶類似物導入DNA中之正常的細胞會死滅。另一方面，不導入該等嘧啶類似物之缺損該等酵素之細胞，可在選擇性培養基中生存。此外，稱為G418耐受性之選擇標記，因新黴素耐受性基因而賦予對2-去氧鏈黴胺系抗生素(健他黴素類似體)之耐受性。細胞融合所適合之各種骨髓瘤細胞係為公知。
作為如此之骨髓瘤細胞，例如可適合使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本而言係根據公知之方法，例如Galfrè與Milstein等之方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，進行前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，例如可在細胞融合促進劑之存在下，於通常之營養培養液中，實施前述細胞融合。融合促進劑係使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為了進一步提高融合效率，依期望而添加二甲亞碸等輔助劑來使用。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如，相對於骨髓瘤細胞，免疫細胞較佳為1至10倍。前述細胞融合所用之培養液，係使用例如適合前述骨髓瘤細 胞株之增殖的RPMI1640培養液、MEM培養液、其他之此種細胞培養所用之通常的培養液，可進一步適宜添加胎牛血清(FCS)等之血清補液。
細胞融合係使指定量的前述免疫細胞與骨髓瘤細胞在前述培養液中充分混合，以通常30至60%(w/v)之濃度添加預先加溫至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)。藉由使混合液和緩地混合，形成所期望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當的培養液，藉由重複離心以去除上清液的操作，可去除對融合瘤之成長不佳之細胞融合劑等。
如此方式所得之融合瘤，可藉由通常之選擇性培養液、例如HAT培養液(含有次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷之培養液)培養而選擇。使用上述HAT培養液之培養，可持續用以使所期望之融合瘤以外的細胞(非融合細胞)死滅所充分的時間(通常該充分的時間為數日至數週)。接著，藉由通常之極限稀釋法，來實施產生所期望之抗體的融合瘤之篩選及單一選殖。
如此方式所得到之融合瘤，可藉由利用因應了細胞融合所用之骨髓瘤所具有之選擇標記的選擇性培養液來選擇。例如具有HGPRT或TK之缺損的細胞，可藉由以HAT培養液(含有次黃嘌呤、胺喋呤及胸苷之培養液)培養而選擇。亦即，將HAT感受性之骨髓瘤細胞使用於細胞融合時，成功地與正常細胞進行細胞融合之細胞可在HAT培養液中選擇性地增殖。使用了上述HAT培養液的培 養，係持續用以使所期望之融合瘤以外的細胞(非融合細胞)死滅所需之充分的時間。具體而言，一般來說，可藉由數日至數週之培養，來選擇所期望之融合瘤。接著，可藉由通常之極限稀釋法，來實施產生所期望之抗體之融合瘤的篩選及單一選殖。
所期望之抗體之篩選及單一選殖，可藉由基於公知之抗原抗體反應的篩選方法來適當地實施。如此之單株抗體，可藉由例如FACS(fluorescence activated cell sorting)來篩選。FACS，係能夠以雷射光解析與螢光抗體接觸之細胞，並測定個別細胞所發出之螢光，藉以測定抗體對細胞表面之結合的系統。
或者，抗體對經固定化之抗原的結合活性可基於ELISA之原理做評估。例如，抗原係被固定化於ELISA盤之孔。使融合瘤之培養上清液與孔內之抗原接觸，而檢測與抗原結合之抗體。單株抗體來自小鼠時，與抗原結合之抗體可藉由抗小鼠免疫球蛋白抗體來檢測。藉由該等篩選而選擇之產生具有對抗原之結合能力的所期望之抗體之融合瘤，可藉由極限稀釋法等來選殖。產生以如此方式所製造之單株抗體的融合瘤，可在通常之培養液中進行繼代培養。又，該融合瘤可在液體氮中長期保存。
該融合瘤可遵照通常方法培養，且由其培養上清液中取得所期望之單株抗體。或者可將融合瘤對與其具有適合性之哺乳動物進行投與並使其增殖，由其腹水中取得單株抗體。前者之方法係適合得到高純度的抗體。
藉由從該融合瘤等之抗體產生細胞所選殖之抗體基因所編碼之抗體亦可適宜地利用。藉由將經選殖之抗體基因重組入適當之載體並導入宿主，藉由該基因所編碼之抗體會表現。用於抗體基因之單離、與對載體之導入、還有宿主細胞之轉形的方法，例如係已被Vandamme等人所確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。如下所述之重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，由產生目標抗體之融合瘤細胞中，取得編碼該抗體之可變區域(V區域)的cDNA。為此，通常係首先由融合瘤中萃取全RNA。用以由細胞萃取mRNA的方法，可利用例如如下之方法。
-胍超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
經萃取之mRNA，可使用mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience)等來純化。或者如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience)等之用以由細胞直接萃取全mRNA之套組亦有市售。使用如此之套組，可由融合瘤取得mRNA。可由所得之mRNA使用反轉錄酵素來合成編碼抗體V區域之cDNA。CDNA可藉由AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社)等來合成。又，為了合成及放大cDNA，可適當地利用使用了SMART RACE cDNA放大套組(Clontech)及PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8), 2919-2932)。可進一步地在合成此cDNA之過程中，於cDNA之兩末端導入後述之適當的限制酵素位置。
由所得之PCR產物中純化作為目標的cDNA片段，接著與載體DNA連結。如此地來製造重組載體，導入於大腸菌等，選擇菌落後，可由形成該菌落之大腸菌中調製所期望之重組載體。此外，關於該重組載體是否具有作為目標之cDNA的鹼基序列，係藉由公知方法，例如二去氧核苷酸連鎖終止法等來確認。
為了取得編碼可變區域之基因，簡便者為利用使用了可變區域基因放大用之引子的5’-RACE法。首先以由融合瘤細胞萃取之RNA作為模板來合成cDNA，得到5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適合使用SMART RACE cDNA放大套組等市售之套組。
以所得之5’-RACE cDNA庫作為模板，藉由PCR法來放大抗體基因。可基於公知之抗體基因序列來設計小鼠抗體基因放大用引子。該等引子，係隨著免疫球蛋白之次類型而不同的鹼基序列。因此，次類型較佳為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同型決定(isotyping)套組(Roche Diagnostics)等之市售套組來決定。
具體而言，例如以取得編碼小鼠IgG之基因為目的時，作為重鏈可利用可放大編碼γ1、γ2a、γ2b、γ3之基因的引子；作為輕鏈可利用可放大編碼κ鏈與λ鏈之基因的引子。為了放大IgG之可變區域基因，一般3’側之引子係利用黏著於相當於接近可變區域之恆定區域的部分之引 子。另一方面5’側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附屬之引子。
利用經如此放大之PCR產物，能夠再構成由重鏈與輕鏈組合而成的免疫球蛋白。以經過再構成之免疫球蛋白之對抗原的結合活性作為指標，可篩選所期望之抗體。例如以取得對抗原之抗體為目的時，抗體對抗原之結合，更佳為具特異性。與抗原結合之抗體，可例如以如下方式來篩選；(1)使含有以自融合瘤所得之cDNA編碼的V區域之抗體與抗原接觸之步驟、(2)檢測抗原與抗體之結合的步驟、及(3)選擇與抗原結合之抗體的步驟。
檢測抗體與抗原之結合的方法為公知。具體而言，可藉由之前敘述過的FACS或ELISA等手法，來檢測抗體與抗原之結合。
得到編碼作為目標之抗體的V區域之cDNA後，藉由認識插入於該cDNA之兩末端的限制酵素位置之限制酵素，來消化該cDNA。較佳的限制酵素係認識而消化於構成抗體基因之鹼基序列中出現頻率低之鹼基序列。為了進一步將1複本之消化片段以對載體正確的方向插入，較佳為插入賦予黏性末端之限制酵素。藉由將編碼經上述方式消化之抗體的V區域之cDNA插入適當的表現載體，可取得抗體表現載體。此時，若編碼抗體恆定區域(C區域)之基因、與編碼前述V區域之基因係融合為同一讀框(in- frame)，則可取得嵌合體抗體。此處，嵌合體抗體意指恆定區域與可變區域之來源相異。因此，除了小鼠-人類等之異種嵌合體抗體之外，人類-人類同種嵌合體抗體亦包含在本發明之嵌合體抗體中。藉由預先於具有恆定區域之表現載體中插入前述V區域基因，可構築嵌合體抗體表現載體。具體而言，例如，於保持有編碼所期望之抗體恆定區域(C區域)之DNA的表現載體5’側，可適當地配置消化前述V區域基因之限制酵素的限制酵素認識序列。藉由使以同樣組合之限制酵素消化之兩者融合為同一讀框，來構築嵌合體抗體表現載體。
為了製造所期望之抗體，抗體基因係與控制序列連結而成為能夠作用，以接入表現載體。用以表現抗體之控制序列，係含有例如促進子(enhancer)或啟動子(promoter)。又，可於胺基末端附加適當的訊息序列，使表現的抗體分泌至細胞外。例如，作為訊息序列可使用具有胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：13)之胜肽，但此外亦可附加適合的訊息序列。經表現之多肽係在上述序列之羧基末端部分切斷，經切斷之多肽可作為成熟多肽而分泌至細胞外。接著，藉由以此表現載體對適當之宿主細胞轉形，可取得表現編碼所期望之抗體的DNA之重組細胞。
為了表現抗體基因，編碼抗體之重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)的DNA，係分別接入不同的表現載體。藉由接入有重鏈與輕鏈之載體，對相同宿主細胞同時轉形(co-transfect)，可表現具備重鏈與輕鏈之抗體分子。或可藉由使編碼重鏈 及輕鏈之DNA接入單一之表現載體，使宿主細胞轉形(參照WO19994011523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當的宿主而製造抗體之宿主細胞與表現載體之多數組合已為公知。該等表現系統，均可應用於單離本發明之抗原結合分子。使用真核細胞作為宿主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，作為動物細胞可舉例如下之細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(baby hamster kidney cell line)、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus(Ad)5 DNA)、PER.C6 cell(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes)、Hela、Vero等(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,Table 5.9.1))
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或者，作為植物細胞，來自菸草(Nicotiana tabacum)等之菸草(Nicotiana)屬之細胞的抗體基因表現系統為公知。植物細胞之轉形，可適當地利用經癒傷組織培養之細胞。
進一步地，作為真菌細胞。可利用如下之細胞。
-酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等之酵母菌 (Saccharomyces)屬、甲醇利用酵母(Pichia pastoris)等之Pichia屬
-絲狀菌：黑麴菌(Aspergillus niger)等之麴菌(Aspergillus)屬
又，利用了原核細胞之抗體基因的表現系統亦為公知。例如，使用細菌細胞時，可適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等之細菌細胞。藉由轉形而導入包含作為目標之抗體基因之表現載體於該等細胞中。藉由將經轉形之細胞在in vitro培養，可由該轉形細胞之培養物中取得所期望之抗體。
重組抗體之產生，在上述宿主細胞之外，亦可利用基因轉殖動物。亦即可由經導入編碼所期望之抗體的基因之動物中得到該抗體。例如，可於編碼乳汁中固有而產生之蛋白質的基因內部插入為同一讀框而作為融合基因來構築抗體基因。作為分泌於乳汁中之蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白等。包含經插入抗體基因之融合基因的DNA片段被注入山羊之胚，該經注入之胚係被導入雌之山羊。由自接受胚之山羊所產生之基因轉殖山羊(或其子孫)所產生的乳汁中，可作為與乳汁蛋白質之融合蛋白質而取得所期望之抗體。又，為了增加含有由基因轉殖山羊所產生之所期望之抗體的乳汁量，可對基因轉殖山羊投與激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
當對人類投與本說明書中所記載之抗原結合分子時，作為該分子中之抗原結合結構域，可適當地採用以使對人類之異種抗原性降低等為目的，而來自經人為改變之基因 重組型抗體的抗原結合結構域。基因重組型抗體係包含例如人類化(Humanized)抗體等。該等之改變抗體，可使用公知之方法適當地製造。
用於製造本說明書中所記載之抗原結合分子中的抗原結合結構域的抗體之可變區域，通常係以夾在4個框架區域(FR)當中之3個互補性決定區域(complementarity-determining region；CDR)所構成。CDR係為實質上決定抗體之結合特異性的區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，在具有不同之結合特異性的抗體之間，亦常顯示高度的同一性。因此，一般而言，藉由CDR之移植，可將某抗體之結合特異性移植到其他抗體。
人類化抗體亦稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物、例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體之人類化抗體等係為公知。亦已知用以得到人類化抗體之一般的基因重組手法。具體而言，作為用以將小鼠之抗體CDR移植至人類FR之方法，例如重疊．伸長(Overlap Extension)PCR係為公知。Overlap Extension PCR中，係於用以合成人類抗體之FR的引子，附加編碼欲移植之小鼠抗體CDR的鹼基序列。準備各別4個FR之引子。一般而言，於將小鼠CDR對人類FR之移植當中，選擇與小鼠FR同一性高之人類FR，係於CDR之功能維持上有利。亦即，一般而言，較佳為利用由與鄰接於欲移植之小鼠CDR的FR胺基酸序列同一性高的胺基酸序列所構成之人類FR。
又，所連結之鹼基序列，係設計為互以同一讀框連接。藉由各引子而個別地合成人類FR。結果，可得到於各FR附加有編碼小鼠CDR之DNA的產物。編碼各產物之小鼠CDR的鹼基序列，係設計為互相重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物所重疊的CDR部分互相黏著，進行互補鏈合成反應。藉由此反應，人類FR會透過小鼠CDR之序列而連結。
最終連結有3個CDR與4個FR之V區域基因，係藉由於其5’末端與3’末端黏著而附加適當的限制酵素認識序列之引子而放大其全長。藉由插入於表現載體中而使如上述方式得到之DNA與編碼人類抗體C區域之DNA融合為同一讀框，可製成人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入宿主以建立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼該人類化抗體之DNA表現，藉以於該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(EP239400、WO1996002576)。
定性或定量地測定如上述方式製造之人類化抗體之對抗原的結合活性並評估，藉以適當地選擇透過CDR連結時該CDR會形成良好的抗原結合部位之人類抗體FR。亦可依照需要，取代FR之胺基酸殘基，使得再構成人類抗體之CDR形成適當的抗原結合部位。例如，可應用使用了小鼠CDR對人類FR之移植所用的PCR法，來於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可於黏著於FR的引子中導入部分鹼基序列之變異。於藉由如此引子而合成之FR導入鹼基序列之變異。藉由以上述方法測定並評估經 取代胺基酸之變異型抗體對抗原之結合活性，可選擇具有所期望之性質之變異FR序列(Sato等人(Cancer Res(1993)53,851-856)。
又，能夠以具有人類抗體基因之全部基因譜(repertoire)的基因轉殖動物(WO1993012227、WO1992003918、WO1994002602、WO1994025585、WO1996034096、WO1996033735參照)作為免疫動物，藉由DNA免疫來取得所期望之人類抗體。
進一步地，亦已知使用人類抗體庫，藉由篩選(panning)來取得人類抗體之技術。例如，藉由噬菌體展示法，將人類抗體之V區域作為單鏈抗體(scFv)表現於噬菌體之表面。可選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析經選擇之噬菌體的基因，可決定編碼與抗原結合之人類抗體的V區域之DNA序列。決定與抗原結合之scFv的DNA序列後，將該V區域序列與所期望之人類抗體C區域序列融合為同一讀框後，藉由插入適當的表現載體，可製造表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適合的表現細胞中，藉由表現編碼該人類抗體之基因，來取得該人類抗體。該等之方法係已公知(參照WO1992001047、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、WO1993019172、WO1995001438、WO1995015388)。
本說明書中之「抗原結合結構域」，係指與抗原之一部分或全部特異性結合且互補之區域。作為抗原結合結構域之例子，可列舉具有抗體之抗原結合結構域的結構域。 作為抗體之抗原結合結構域的例子，可列舉CDR或可變區域。抗體之抗原結合結構域為CDR的情況時，可包含抗體中所含之6個CDR全部、亦可包含1個或2個以上之CDR。抗體之結合區域包含CDR的情況時，只要具有對抗原之結合活性，所包含之CDR中可進行胺基酸之缺失、取代、附加及/或插入等，亦可使用之CDR之一部分。抗原之分子量大的情況時，抗體可僅與抗原之特定部分結合。該特定部分稱為抗原決定部位(epitope)。抗原結合結構域可由一或複數個抗體之可變結構域來提供。較佳為抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區域(VL)與抗體重鏈可變區域(VH)。作為如此之抗原結合結構域的例子，可適合列舉「scFv(single chainFv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv2)」、「Fab」、「雙鏈抗體(diabody)」、「線狀抗體」或「F(ab’)2」等。
如本說明書中使用的「抗體可變區域」，係指包含互補性決定區域(CDR；亦即、CDR1、CDR2及CDR3)以及框架區域(FR)之胺基酸序列之抗體分子的輕鏈及重鏈部分。VH係指重鏈之可變區域(Heavy chain variable region)。VL係指輕鏈之可變區域(Light chain variable region)。依照本發明中所使用之方法，分配為CDR與FR之胺基酸位置係遵照Kabat來規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗體或抗原結合片段之胺基酸編號亦以根據Kabat之胺基酸位置 的Kabat編號來表示。
如本說明書中使用的用語「互補性決定區域(CDR；亦即、CDR1、CDR2及CDR3)」係指有必要為了抗原結合而存在之抗體可變區域的胺基酸殘基。各可變區域一般係包含標示為CDR1、CDR2及CDR3之3個CDR區域。各互補性決定區域可包含由如Kabat記載之「互補性決定區域」的胺基酸殘基(亦即、輕鏈可變區域之殘基約24~34(CDR1)、50~56(CDR2)、及89~97(CDR3)以及重鏈可變區域之31~35(CDR1)、50~65(CDR2)及95~102(CDR3)；Kabat等人、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda、MD.(1991))、及/或由「超可變圈環」之殘基(亦即、輕鏈可變區域之殘基約26~32(CDR1)、50~52(CDR2)及91~96(CDR3)以及重鏈可變區域之26~32(CDR1)，53~55(CDR2)及96~101(CDR3)；Chothia及Lesk、J.Mol.Biol.(1987)196,901-917)。在有的情況下，互補性決定區域可包含由以Kabat之記載所定義之CDR區域及超可變圈環之兩者的胺基酸。
用語「Fab」片段係包含輕鏈之可變及恆定區域與重鏈之可變區域及第1恆定區域(CH1)。F(ab’)2抗體片段係包含一對Fab片段，通常該等係藉由其間之絞鏈(hinge)區域中的半胱胺酸，於其羧基末端附近以共價鍵來連結。抗體片段之其他化學鍵結亦為本發明所屬技術領域所公知。
用語「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段係包含抗體之 VH及VL區域，該等區域係形成單一之多肽鏈。通常，Fv多肽係於VH及VL區域之間進一步包含多肽連結子(linker)，此連結子可使得scFv對於抗原結合形成期望之構造。scFv之總論係記載於例如Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(1994)Vol.113,269-315(Rosenburg and Moore編、Springer-Verlag,New York)等。
用語「雙鏈抗體(diabody)」係指具備2個抗原結合部位之小抗體片段，此抗體片段係包括在相同多肽鏈(VH及VL)內連結於輕鏈可變區域(VL)之重鏈可變區域(VH)。其係於相同鏈上之2個區域之間的對合，使用極短之連結子，將此區域與其他鏈之互補性區域強制地對合，形成2個抗原結合部位。雙鏈抗體，係於例如歐洲專利第404097號、WO1993011161等專利文獻或Holliger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,6444-6448)等非專利文獻中有詳細記載。
用語「線狀抗體」係指Zapata et al.,Protein Eng.(1995)8(10),1057-1062中所記載之抗體。換言之，該等抗體係包含與互補性之輕鏈多肽一起形成一對抗原結合結構域之一對縱列(tandem)Fd區段(segment)(VH-CH1-VH-CH1)。線狀抗體可為二重特異性或單一特異性。
抗原
本說明書中，「抗原」只要包含抗原結合結構域所結 合之抗原決定部位，其構造並不限定為特定之構造。就另一意義上，抗原可為無機物亦可為有機物。作為抗原可舉例如下述之分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3結合蛋白(integrin)、Ax1、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素、骨由來神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、抑鈣素、cAMP、癌胚胎抗原 (CEA)、癌相關抗原、細胞自溶酶A、細胞自溶酶B、細胞自溶酶C/DPPI、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V、細胞自溶酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、維耳西菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角質蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、地谷新(digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素受體、Enkephalinase、eNOS、Eot、趨化激素(eotaxin)1、EpCAM、肝配蛋白(ephrin)B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、線維芽細胞活性化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激激素、趨化因子(fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生長抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長激素放出因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外膜糖蛋白質、HCMV gH 外膜糖蛋白質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、Heparanase、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白質、HSV gD糖蛋白質、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3圈環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心臓肌凝蛋白、人類巨細胞病毒(HCMV)、人類成長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣增殖因子1、結合蛋白α2、結合蛋白α3、結合蛋白α4、結合蛋白α4/β1、結合蛋白α4/β7、結合蛋白α5(αV)、結合蛋白α5/β1、結合蛋白α5/β3、結合蛋白α6、結合蛋白β1、結合蛋白β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、血管舒緩素(kallikrein)2、血管舒緩素5、血管舒緩素6、血管舒緩素11、血管舒緩素12、血管舒緩素14、血管舒緩素15、血管舒緩素L1、血管舒緩素L2、血管舒緩素L3、血管舒緩素L4、KC、KDR、角質細胞增殖因子(KGF)、基膜素5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在的TGF-1、潛在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、路易士-Y抗原、路易士- Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白質、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體形成激素、淋巴毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏液素(Muc1)、MUC18、抗穆氏管激素、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-鈣黏素、NCA90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶(Neprilysin)、神經營養因子-3、-4、或-6、Neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏素、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、前胰島素、前鬆弛素、蛋白質C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈、腎活素、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕因子、RLIP76、RPA2、 RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白質-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如，T細胞受體α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸PLAP樣鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan Specific、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCER)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、 TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配位子、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配位子ODF、OPG配位子)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配位子、DR3配位子)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配位子、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配位子AITR配位子、TL6)、TNFSF1A(TNF-a連接蛋白(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配位子gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配位子CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配位子Apo-1配位子、APT1配位子)、TNFSF7(CD27配位子CD70)、TNFSF8(CD30配位子CD153)、TNFSF9(4-1BB配位子CD137配位子)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原CA125、腫瘤相關抗原表現路易士Y相關碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒 抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR結合蛋白、溫韋伯氏因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL,PCSK9,prekallikrein,RON,TMEM16F、SOD1,Chromogranin A,Chromogranin B、tau,VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1,C1q,C1r,C1s,C2,C2a,C2b,C3,C3a,C3b,C4,C4a,C4b,C5,C5a,C5b,C6,C7,C8,C9，factor B,factor D,factor H,properdin、sclerostin、fibrinogen,fibrin,prothrombin,thrombin，組織因子，factor V,factor Va,factor VII,factor VIIa,factor VIII,factor VIIIa,factor IX,factor IXa,factor X,factor Xa,factor XI,factor XIa,factor XII,factor XIIa,factor XIII,factor XIIIa,TFPI,antithrombin III,EPCR,凝血調節素、TAPI,tPA,plasminogen,plasmin,PAI-1,PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P、Acetylcholine receptor、AdipoR1、AdipoR2、ADP ribosyl cyclase-1、alpha-4/beta-7 integrin、alpha-5/beta-1 integrin、alpha-v/beta-6 integrin、alphavbetal integrin、Angiopoietin ligand-2、Angpt12、Anthrax、Cadherin、Carbonic anhydrase-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin 18、Clostridium difficile toxin、CS1、Delta-like protein ligand 4、DHICA oxidase、Dickkopf-1 ligand、Dipeptidyl peptidase IV、EPOR、F protein of RSV、Factor Ia、FasL、Folate receptor alpha、Glucagon receptor、Glucagon-like peptide 1 receptor、Glutamate carboxypeptidase II、GMCSFR、Hepatitis C virus E2 glycoprotein、Hepcidin、IL-17 receptor、IL-22 receptor、IL-23 receptor、IL-3 receptor、Kit tyrosine kinase、Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein 1(LRG1)、Lysosphingolipid receptor、Membrane glycoprotein OX2、Mesothelin、MET、MICA、MUC-16、Myelin associated glycoprotein、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nogo receptor、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNC1、PLXND1、Programmed cell death ligand 1、Proprotein convertase PC9、P-selectin glycoprotein ligand-1、RAGE、Reticulon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga like toxin II、Sphingosine-1-phosphate receptor-1、ST2、Staphylococcal lipoteichoic acid、Tenascin、TG2、Thymic stromal lymphoprotein receptor、TNF superfamily receptor 12A、Transmembrane glycoprotein NMB、TREM-1、TREM-2、Trophoblast glycoprotein、TSH receptor、TTR、Tubulin、ULBP2以及激素及成長因子之受體。其他，亦可舉例前述受體當中，於生體體液中不停留於細胞而以可溶型存在的分子。
意指存在於抗原中之抗原決定基的抗原決定部位，係意指本說明書所揭示之抗原結合分子中的抗原結合結構域所結合之抗原上的部位。因而，例如抗原決定部位可由其構造來定義。又，藉由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對抗原的結合活性亦可定義該抗原決定部位。抗原為胜肽或多肽時，藉由構成抗原決定部位之胺基酸殘基亦可特定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，亦可藉由特定之糖鏈構造來特定抗原決定部位。
直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列之抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位，典型而言，於固有序列中係包含至少3個及最普通為至少5、例如約8個至約10個、6至20個之胺基酸。
立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對地，包含抗原決定部位之胺基酸一次序列，並非為被認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如，胺基酸之一次序列並非一定係被規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，亦可 能包含相對於直線狀抗原決定部位之數目更加多之數目的胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識而言，抗體係認識胜肽或蛋白質之三次元構造。例如，蛋白質分子摺疊而形成三次元構造時，形成立體構造抗原決定部位之有的胺基酸及/或多肽主鏈係成為並列，可使抗體認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造的方法，雖包含例如X射線結晶學、二次元核磁共振分光學以及部位特異性自旋標示及電磁常磁性共振分光學，但不限定於該等。參照例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
基因重組手法
用語「密碼子組」，意指用以編碼所期望之胺基酸之一組相異核苷酸三字密碼序列。一組寡核苷酸，係包含表示由密碼子組提供之核苷酸三字密碼的所有可能之組合的序列，且為編碼所期望之胺基酸群的序列。如此之一組寡核苷酸，可藉由例如固相法來合成。標準的密碼子指定形式為IUB編碼之形式，此編碼為本技術領域所公知。密碼子組，一般以3個大寫字母，例如NNK、NNS、DVK、DVD等來表示。
IUB編碼
G鳥嘌呤
A腺嘌呤
T胸腺嘧啶
C胞嘧啶
R(A或G)
Y(C或T)
M(A或C)
K(G或T)
S(C或G)
W(A或T)
H(A或C或T)
B(C或G或T)
V(A或C或G)
D(A或G或T)
N(A或C或G或T)
例如，密碼子組DVK中，D為核苷酸A或G或T、V為A或G或C、K為G或T。此密碼子組係表示18個相異之密碼子，可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及Cys。
於特定之位置具有「簡併(degenerate)」核苷酸之寡核苷酸的設計方法在本發明所屬技術領域中為公知。(例如，Garrard and Henner,Gene(1993)128,103-109等)。具有如此之某種密碼子組的寡核苷酸組，可使用市售之核酸合成劑(可由Applied Biosystems,Foster City,CA等獲得)來合成，或以市售品來獲得(例如，Life Technologies,Rockville,MD)。因此，具有特定之密碼子組的合成寡核 苷酸組，一般係包含相異序列之複數個寡核苷酸。又，作為本發明之非限定的態樣，亦可包含例如有用於選殖之限制酵素部位。
「細胞」、「細胞系」及「細胞培養」，在本說明書中係作為相同意義使用，此一稱呼可包含細胞系之全部子孫。如此地，例如「轉形體」及「轉形細胞」之用語，係包含與繼代數無關且來自該等之一次對象細胞及培養物。又，亦理解藉由故意或偶發的突變異，或有並非全部子孫中的DNA內容均正確地相同的情況。亦可包含具有如以當初之轉形細胞篩選者之實質相同功能或生物學的活性的變異體子孫。意圖以相異的稱呼來記載時，由該記載之前後關係即可明白如此之意圖。
述及編碼序列之表現時的用語「控制序列」，亦指用以表現於特定宿主生物中連結為能夠作用之編碼序列所必要之DNA鹼基序列。例如原核生物中適合的控制序列，係包含啟動子、依情況之操作子序列、核糖體結合部位、及可能尚未充分理解之其他序列。真核細胞中為了表現編碼序列，利用啟動子、聚腺苷酸化訊息及促進子者為公知。
關於核酸之「連結為能夠作用」意指該核酸與其他核酸序列處於功能上的關係。例如，前序列(presequence)或分泌前導(secretory leader)之DNA，作為某多肽分泌相關之前驅物蛋白質而表現時，係與該多肽之DNA結合為能夠作動。啟動子或促進子當對有的編碼序列之轉錄有影響 時係與該序列連結為能夠作用。或者，核糖體結合部當其位於轉譯容易的位置時，係與編碼序列連結為能夠作用。通常、「連結為能夠作用」意味著所結合之DNA序列係連續的，且分泌前導的情況時係連續地在讀取框內。但是，促進子並無連續的必要。連結係藉由在適當之限制部位接合(ligation)而達成。如此部位不存在時，合成寡核苷酸接頭(adaptor)或連結子係遵照以往的習慣來使用。又藉由前述之Overlap Extension PCR手法亦可製造經連結之核酸。
「接合」係為2個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之方法。為了接合2個片段，片段之末端必須互相適合。依情況不同，此末端在核酸內切酶消化後立即具有適合性。但是，為了使適合接合，首先在核酸內切酶消化之後一般所形成之黏性末端必須變為平滑末端。為了成為平滑末端，DNA在適當之緩衝液中於15℃處理至少15分鐘，在4個去氧核糖核苷酸三磷酸之存在下以DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶之克列諾(Klenow)片段的約10單位處理。接著，將DNA以酚氯仿萃取與乙醇沈澱、或二氧化矽純化來純化。欲連結之DNA片段係以與溶液等莫耳量添加。於此溶液中添加ATP、連接酶緩衝液，DNA每0.5 μg含有約10單位之如T4DNA連接酶之連接酶。將DNA與載體連結的情況時，載體係藉由適當之限制核酸內切酶的消化作用，首先成為線狀。將成為線狀之片段接著以細菌之鹼性磷酸酶或胎牛腸管之磷酸酶處理，藉以預防接合步 驟之間該片段的自我接合。
用語「外殼蛋白質」係指蛋白質當中，至少其一部分存在於病毒粒子表面者。由功能上的觀點而言，外殼蛋白質係病毒於宿主細胞之構築過程中，與病毒粒子結合之任意蛋白質，其係維持與其結合直到病毒感染其他宿主細胞為止。外殼蛋白質可為主要之外殼蛋白質、亦可為次要之外殼蛋白質。次要之外殼蛋白質，通常為存在於病毒外殻之外殼蛋白質，較佳為每10億存在至少約5個、更佳為至少約7個、又更佳為至少約10個或其以上之蛋白質複本(copy)。主要之外殼蛋白質，每10億可存在數十、數百或數千個複本。主要之外殼蛋白質的例子，可列舉纖維狀噬菌體之p8蛋白質。
特定之檢定中，某化學無機體、有機體、生物等物體之「檢測極限」，係指該檢定中檢測出比背景水準高之其物體最小限度的濃度。例如，噬菌體ELISA中，展現出特定抗原結合片段之特定噬菌體的「檢測極限」，意指特定噬菌體所生產之相較於由未展現其抗原結合片段之對照噬菌體所產生者更多之ELISA訊息的噬菌體濃度。
「噬菌體展示」係為將變異體多肽作為與噬菌體、例如與纖維狀噬菌體之粒子表面的外殼蛋白質之至少一部分融合之蛋白質而展現的手法。噬菌體展示之用處，係可由隨機化蛋白質變異體之大型分子庫中迅速且有效率地篩選與對象抗原以高親和性結合之序列。噬菌體上之胜肽及蛋白質分子庫的展現，以往即利用在用以篩選達數百 萬之多肽的特異性結合特性。多價噬菌體展示方法，以往即利用在用以透過與纖維狀噬菌體之基因III或基因VIII的融合以展現小的隨機胜肽及小蛋白質(Wells及Lowman(Curr.Opin.Struct.Biol.(1992)3,355-362)與其中之引用文獻)。一價之噬菌體展示中，蛋白質或胜肽之分子庫係與基因III或其一部分融合，噬菌體粒子係在野生型基因III蛋白質之存在下以低水準表現，以展現融合蛋白質之1個或0個複本。總結合力效果相較於多價噬菌體係有降低，因此篩選係根據內在性之配位子親和性而使用噬粒載體，此載體係使DNA操作單純化(Lowman及Wells、Methods：A Companion to Methods in Enzymology(1991)3,205-216)。
「噬粒」係具有細菌之複製起點、例如Co1E1及噬菌體之基因間區域的複本之質體載體。噬粒亦可適當使用任何公知之噬菌體、例如纖維狀噬菌體及λ型噬菌體。質體通常亦包含抗生素耐受性之選擇標記。經選殖於該等載體之DNA片段，可作為質體來增殖。經導入該等載體之細胞具備用以生產噬菌體粒子所必要之所有基因時，質體之複製樣式係變為滾圓(rolling circle)複製，而生成質體DNA之1條鏈的複本與包裝之噬菌體粒子。噬粒可形成感染性或非感染性噬菌體粒子。此用語係作為使異種多肽展現於噬菌體粒子表面的方式之基因融合，而包括與此異種多肽基因結合之噬菌體外殼蛋白質基因、或包含其片段之噬粒。
用語「噬菌體載體」，意指含有異種基因而可複製之噬菌體的雙鏈複製型。噬菌體載體，係具有可複製噬菌體及形成噬菌體粒子之噬菌體複製起點。噬菌體較佳為纖維狀噬菌體、例如M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物、或λ型噬菌體、例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434、其他或其衍生物。
「寡核苷酸」，係為藉由公知方法(例如利用固相手法、例如EP266032所記載之手法的磷酸三酯、亞磷酸鹽、或亞磷胺(phosphoramidite)化學法、或者透過Froeshler等人(Nucl.Acids.Res.(1986)14,5399-5407)記載之去氧核苷酸H-膦酸鹽中間體之方法)所化學合成之短的、單鏈或雙鏈之聚去氧核苷酸。其他方法包括以下記載之聚合酶連鎖反應及其他之自動引子(autoprimer)法、及固體載劑上之寡核苷酸合成。該等方法均由Engels等人(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.(1989)28,716-734)所記載。若基因之全部的核酸序列為公知，或若可利用與編碼鏈互補的核酸序列，可使用該等方法。或者，若對象胺基酸序列為公知，則可使用各胺基酸殘基之公知且較佳之編碼殘基，適當推測可能的核酸序列。寡核苷酸能夠以聚丙烯醯胺凝膠或分子大小管柱，或藉由沈澱法來純化。
用語「融合蛋白質」及「融合多肽」，係指具有以共價鍵相互之結合2個部分的多肽，各部分為具有相異特性之多肽。此特性可為例如in vitro或in vivo活性等之生物學性質。又，此特性亦可為單一之化學或物理性質，例 如與對象抗原之結合、反應之觸媒等。此2個部分可藉由單一胜肽鍵直接結合、或透過含有1個或複數個胺基酸殘基之胜肽連結子來結合。通常，此2個部分與連結子係存在於相同之讀取框中。較佳為多肽之2個部分係由異種或相異之多肽所得到。
用語「異種DNA」，係指導入宿主細胞之任意DNA。DNA可來自包含基因體DNA、cDNA、合成DNA及該等之融合或組合之各種起源。DNA可包含來自與宿主或受體細胞相同之細胞或細胞型的DNA、或來自不同細胞型、例如來自哺乳類或植物之DNA。DNA可包含任意選擇之標記或選擇基因，例如抗生素耐受性基因、耐熱性基因、其他。
如本說明書中所使用的，用語「非常多樣之位置」意指比較公知且/或天然抗體或抗原結合片段之胺基酸序列時，具有於其位置展現之幾個不同胺基酸的輕鏈及重鏈可變區域上之胺基酸位置。非常多樣之位置一般係存在於CDR區域。於其一態樣中，決定公知且/或天然抗體之非常多樣之位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)所提供之資料為有效。又，網際網路上之複數個資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供了經收集之多數人類輕鏈及重鏈序列與其配置，該等序列與其配置資訊係有用於本發明中非常多樣之位置的決定。依照本發明，胺基酸在某位置具有較佳為約2至約 20、較佳為約3至約19、較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個之可能的不同胺基酸殘基之多樣性時，可說該位置係非常地多樣。在數個實施形態中，一胺基酸位置可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的不同胺基酸殘基之多樣性。本說明書中，將如此之胺基酸殘基亦稱為柔性殘基(flexible residue)。用語「非隨機密碼子組」，意指編碼部分地、較佳為完全地滿足用以選擇本說明書中記載之胺基酸的基準所選擇之胺基酸的密碼子組。又，如本說明書中所使用的，用語「隨機密碼子組」意指編碼20個胺基酸(Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V)當中任意之胺基酸的密碼子所組合的密碼子組。
分子庫
依照其一態樣，本發明係提供隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基係包含於主要由抗原結合結構域中之彼此序列互異之複數個抗原結合分子所構成之分子庫。離子濃度之例子，可適當列舉金屬離子濃度或氫離子濃度。
本說明書中，「分子庫」意指包含複數個抗原結合分 子或抗原結合分子之複數個融合多肽、或編碼該等序列之核酸、聚核苷酸。包含分子庫中所含之複數個抗原結合分子或抗原結合分子之複數個融合多肽之序列非為單一序列，而為包含彼此序列互異之抗原結合分子或抗原結合分子的融合多肽。
本說明書中，「金屬離子」意指氫以外之鹼金屬及銅族等之第I族、鹼土類金屬及鋅族等之第II族、硼以外之第III族、碳與矽以外之第IV族、鐵族及鉑族等之第VIII族、V、VI及VII族之各A亞族所屬之元素、與銻、鉍、釙等金屬元素之離子。金屬原子具有放出原子價電子而成為陽離子之性質，此稱為離子化傾向。離子化傾向大之金屬，富有化學活性。
本發明中適合的金屬離子例子可列舉鈣離子。鈣離子係與多數生命現象之調節相關，鈣離子與骨格肌、平滑肌及心肌等之肌肉的收縮、白血球之運動及吞噬作用等的活性化、血小板之變形及分泌等的活性化、淋巴球之活性化、組織胺之分泌等之肥胖細胞的活性化、透過兒茶酚胺α受體或乙醯膽鹼受體之細胞應答、胞吐作用、由神經元終端放出傳導物質、神經元之軸突流動等相關。作為細胞內之鈣離子受體，已知有具有複數個鈣離子結合部位，分子進化上被認為來自共通的起源之肌鈣蛋白C、調鈣素、微小白蛋白、肌凝蛋白輕鏈等，其結合模式結構(motif)亦多為已知。例如，鈣黏素結構域、調鈣素中所含之EF hand、Protein kinase C中所含之C2結構域、血液凝固蛋 白質FactorIX中所含之G1a結構域、去唾液酸糖蛋白質受體或甘露糖結合受體中所含之C型凝集素、LDL受體中所含之A結構域、annexin、thrombospondin 3型結構域及類EGF結構域已充分為人所知。
本發明中，金屬離子為鈣離子時，作為鈣離子濃度之條件可列舉低鈣離子濃度之條件與高鈣離子濃度之條件。隨著鈣離子濃度之條件不同，結合活性會變化，意指隨著低鈣離子濃度與高鈣離子濃度之條件的不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化。例如，可列舉高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性比低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性高的情況。又，亦可列舉低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性比高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性高的情況。
本說明書中，高鈣離子濃度雖非以單一定義之數值來限定，較適合可為由100μM至10 mM之間選擇的濃度。又，其他態樣中，亦可為由200μM至5 mM之間選擇的濃度。又，不同態樣中，亦可為由500μM至2.5 mM之間選擇的濃度，其他態樣中，亦可為由200μM至2 mM之間選擇的濃度。再者亦可為由400μM至1.5 mM之間選擇的濃度。特別適合可列舉接近於生體內之血漿中(血中)的鈣離子濃度之由500μM至2.5 mM之間所選擇的濃度。
本說明書中，低鈣離子濃度雖非以單一定義之數值來限定，較適合可為由0.1μM至30μM之間選擇的濃度。 又，其他態樣中，可為由0.2μM至20μM之間選擇的濃度。又，不同態樣中，亦可為由0.5μM至10μM之間選擇的濃度，其他態樣中，亦可為由1μM至5μM之間選擇的濃度。再者亦可為由2μM至4μM之間選擇的濃度。特別適合可列舉接近於生體內之於早期內體內的離子化鈣濃度之由1μM至5μM之間所選擇的濃度。
本發明中，抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性低，意指抗原結合分子在由0.1 μM至30μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原之結合活性，比在由100μM至10 mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原之結合活性更弱。較佳為意指抗原結合分子在由0.5μM至10μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性，比在由200μM至5 mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性更弱；特佳為意指於生體內之於早期內體內的鈣離子濃度之抗原結合活性，比生體內之血漿中的鈣離子濃度之抗原結合活性更弱，具體而言，意指抗原結合分子在由1μM至5μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性，比在由500μM至2.5 mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性更弱。
隨著金屬離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性是否變化，可藉由使用公知之測定方法來決定。例如，為了確認於高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性，比在低鈣離子濃度之條件下抗原結 合分子對抗原之結合活性變得更高，係比較在低鈣離子濃度及高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性。
進一步地，本發明中，「抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性低」之表述方式，亦可表述為抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性比在低鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性高。再者本發明中，「在低鈣離子濃度條件下之抗原結合活性比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低」，亦有記載為「在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合能力弱」者，又，亦有將「使在低鈣離子濃度條件下之抗原結合活性變得比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性更低」記載為「使在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力變得比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合能力更弱」。
測定對抗原之結合活性時，鈣離子濃度以外之條件，可由所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇，並無特殊限定。例如能夠於HEPES緩衝液、37℃之條件來測定。例如能夠使用Biacore(GE Healthcare)等來測定。抗原結合分子與抗原之結合活性的測定，當抗原為可溶型抗原時，可將抗原結合分子加入經固定化之晶片，將抗原作為待分析物(analyte)而流動，藉此評估對可溶型抗原之結合活性，當抗原為膜型抗原時，可將抗原加入經固定化之晶 片，將抗原結合分子作為待分析物而流動，藉以評估對膜型抗原之結合活性。
本發明之抗原結合分子中，在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低時，在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性與在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性之比並無特殊限定，但較佳為在低鈣離子濃度條件下對抗原之KD(Dissociation constant：解離常數)與在高鈣離子濃度條件下之KD的比即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為2以上、更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為10以上、又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值的上限並無特殊限定，只要在所屬技術領域中具有通常知識者之技術上能夠製造，則400、1000、10000等任何值均可。又，KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值亦可特定。亦即，KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為2以上、更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為10以上、又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值的上限並無特殊限定，只要在所屬技術領域中具有通常知識者之技術上能夠製造，則400、1000、10000等任何值均可。
作為對抗原之結合活性的值，抗原為可溶型抗原時可使用KD(解離常數)，抗原為膜型抗原時可使用表觀KD(Apparent dissociation constant：表觀解離常數)。KD(解離常數)、及表觀KD(表觀解離常數)，可藉由所屬技術領 域中具有通常知識者所公知之方法來測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯克加圖(scatchard plot)、流式細胞儀(flow cytometer)等。
又，做為顯示本發明之抗原結合分子在低鈣濃度條件下對抗原的結合活性與在高鈣濃度條件下對抗原的結合活性之比的其他指標，亦可適合地使用例如解離速度常數之kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。使用kd(解離速度常數)作為顯示結合活性之比的指標來取代KD(解離常數)時，在低鈣濃度條件下對抗原之kd(解離速度常數)與在高鈣濃度條件下之kd(解離速度常數)的比即kd(低鈣濃度條件下)/kd(高鈣濃度條件下)之值，較佳為2以上、更佳為5以上、又更佳為10以上、又更佳為30以上。kd(低鈣濃度條件下)/kd(高鈣濃度條件下)之值的上限雖無特殊限定，只要在所屬技術領域中具有通常知識者之技術常識上能夠製造，則50、100、200等任何值均可。
作為抗原結合活性之值，抗原為可溶型抗原時可使用kd(解離速度常數)、抗原為膜型抗原時可使用表觀kd(Apparent dissociation rate constant：表觀解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及表觀kd(表觀解離速度常數)，可藉由所屬技術領域中具有通常知識者所公知之方法來測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞儀等。再者本發明中，測定不同鈣離子濃度中抗原結合分子對抗原之結合活性時，鈣濃度以外之條件較佳為相同。
本發明中，質子亦即氫原子之原子核的濃度條件，亦 視為與氫指數(pH)之條件相同意義。水溶液中之氫離子的活動量以aH+表示時，pH則定義為-log10aH+。若水溶液中之離子強度為(例如比10-3)低時，aH+大致等於氫離子強度。例如25℃、1氣壓中之水的離子積為Kw=aH+aOH=10-14，因此在純水中為aH+=aOH=10-7。此時之pH=7為中性、pH比7小之水溶液為酸性、pH比7大之水溶液為鹼性。
本發明中，使用pH之條件作為氫離子濃度之條件時，作為pH之條件可列舉pH酸性區域之條件與pH中性區域之條件。隨著pH之條件不同而結合活性會變化，意指隨著pH酸性區域與pH中性區域之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化。例如，可列舉pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性比pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性更高的情況。又，亦可列舉pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性比pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性更高的情況。
本說明書中，pH中性區域雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可由pH6.7至pH10.0之間來選擇。又，其他態樣中，可由pH6.7至pH9.5之間來選擇。又，不同態樣中，可由pH7.0至pH9.0之間來選擇，其他態樣中，可由pH7.0至pH8.0之間來選擇。特別適合可列舉接近於生體內之血漿中(血中)的pH之pH7.4。
本說明書中，pH酸性區域雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可由pH4.0至pH6.5之間來選擇。又， 其他態樣中，可由pH4.5至pH6.5之間來選擇。又，不同態樣中，可由pH5.0至pH6.5之間來選擇，其他態樣中，可由pH5.5至pH6.5之間來選擇。特別適合可列舉接近於生體內之於早期內體內的pH之pH5.8。
本發明中，抗原結合分子在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下對抗原的結合活性低，意指抗原結合分子於由pH4.0至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH6.7至pH10.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。較佳為意指抗原結合分子於由pH4.5至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH6.7至pH9.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱；更佳為意指抗原結合分子於由pH5.0至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH7.0至pH9.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。又，又更佳為意指抗原結合分子於由pH5.5至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH7.0至pH8.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。特佳為意指於生體內之於早期內體內的pH中之抗原結合活性，比於生體內之於血漿中的pH中之抗原結合活性更弱，具體而言，意指抗原結合分子於pH5.8時對抗原的結合活性，比於pH7.4時對抗原的結合活性更弱。
隨著pH條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性是否變化，係根據例如前述之不同pH條件下之結合活性的測定方法來實施。例如，為了確認於pH中性區域之條 件下抗原結合分子對抗原之結合活性，比於pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性變得更高，係比較於pH酸性區域及pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性。
進一步地，本發明中，「抗原結合分子在pH酸性區域之條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域之條件下對抗原的結合活性低」之表述方式，亦可表述為抗原結合分子在pH中性區域之條件下對抗原的結合活性比在pH酸性區域之條件下對抗原的結合活性更高。再者，本發明中，「在pH酸性區域之條件下之抗原結合活性比在pH中性區域之條件下對抗原的結合活性低」，亦有記載為「在pH酸性區域之條件下的抗原結合能力比在pH中性區域之條件下對抗原的結合能力更弱」者、又，亦有將「使在pH酸性區域之條件下的抗原結合活性變得比在pH中性區域之條件下對抗原的結合活性更低」記載為「使在pH酸性區域之條件下的抗原結合能力變得比在pH中性區域之條件下對抗原的結合能力更弱」。
如前所述，隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之胺基酸殘基的例子，例如金屬離子為鈣離子的情況時，只要是形成鈣結合模式結構(motif)的胺基酸，則其種類無限制。鈣結合模式結構，為所屬技術領域中具有通常知識者所廣為周知，且有詳細記載(例如Springer等人(Cell(2000)102,275-277)、Kawasaki及Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)、 Moncrief等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)、Chauvaux等人(Biochem.J.(1990)265,261-265)、Bairoch及Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2,410-419)、Schaefer等人(Genomics(1995)25,638~643)、Economou等人(EMBO J.(1990)9,349-354)、Wurzburg等人(Structure.(2006)14,6,1049-1058))。亦即，ASGPR,CD23、MBR、DC-SIGN等之C型凝集素等的任意公知鈣結合模式結構，可包含於本發明之抗原結合分子中。上述之外，作為如此之鈣結合模式結構的適當例子，如後所述，亦可列舉存在於具有Vk5-2等之生殖細胞系列序列之抗體輕鏈可變區的Vk5之部分所含有的鈣結合模式結構。
又，作為隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之胺基酸殘基的例子，亦可適合使用具有金屬鉗合作用之胺基酸。作為具有金屬鉗合作用之胺基酸例子，可適合列舉例如絲胺酸(Ser(S))、蘇胺酸(Thr(T))、天門冬醯胺(Asn(N))、麩醯胺(Gln(Q))、天門冬胺酸(Asp(D))及麩胺酸(Glu(E))等。
前述之胺基酸殘基被包含的抗原結合結構域之位置並不限定特定的位置，只要隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化，則可為形成抗原結合結構域之重鏈可變區域或輕鏈可變區域中之任意位置。亦即，於本發明之一態樣中，係提供主要由隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之 胺基酸殘基係包含於重鏈之抗原結合結構域中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成的分子庫。又，其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於重鏈之CDR3中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於重鏈CDR3中之以Kabat編號表示的95位、96位、100a位及/或101位中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。
又，本發明之其一態樣中，係提供主要由隨著鈣離子濃度之條件不同抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之胺基酸殘基係包含於輕鏈之抗原結合結構域中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。又，其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。再其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1之以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。
又，其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。再其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2之以Kabat編號表示之50位中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。
進一步其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。再其他態樣中，係提供主要由該胺基酸殘基 係包含於輕鏈之CDR3之以Kabat編號表示之92位中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。
又，作為本發明的又一不同態樣，係提供主要由該胺基酸殘基係包含於前述記載之輕鏈之由CDR1、CDR2及CDR3中選擇之2個或3個CDR中之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。進一步地，亦提供主要由該胺基酸殘基係包含於輕鏈之以Kabat編號表示之30位、31位、32位、50位及/或92位的任一者以上之彼此序列互異的抗原結合分子所構成之分子庫。
於特別適合的實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區域之框架序列，較佳係具有人類之生殖細胞系框架序列。因此，於本發明之其一態樣中，框架序列若完全地為人類序列，則對人類投與(例如疾病治療)時，可認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不引起免疫原性反應。由上述意義來看，本發明之「包含生殖細胞系列之序列」意指本發明之框架序列的一部分係與任一之人類生殖細胞系框架序列的一部分相同。例如，當本發明之抗原結合分子之重鏈FR2序列為組合複數之不同人類生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列而得的序列的情況時，亦為本發明之「包含生殖細胞系列之序列」的抗原結合分子。
作為框架之例子，可適當地列舉例如V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站中所包含之現在已知的完全人類型之框架區域序列。該等之框架區域的序列可作為本發明之抗原結合分子中所含之生殖細胞系列的 序列來適當地使用。生殖細胞系列之序列可基於其類似性來分類(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可由分類為分為7個亞群(subgroup)之Vκ10之亞群的Vλ、分類為7個亞群之VH中適當選擇適合的生殖細胞系列之序列。
完全人類型之VH序列，雖不僅限定於下述，但可適當列舉例如VH1亞群(例如VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亞群(例如VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亞群(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亞群(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亞群(VH5-51)、VH6亞群(VH6-1)、VH7亞群(VH7-4、VH7-81)之VH序列等。該等亦記載於公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等，所屬技術領域中具有通常知識者基於該等序列資訊，可適當地設計本發明之抗原結合分子。該等以外之完全人類型之框架或框架的準區域亦可適合地使用。
完全人類型之VK序列，雖不僅限定於下述，但可適當列舉例如分類為Vk1亞群之A20、A30、L1、L4、L5、 L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分類為Vk2亞群之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分類為Vk3亞群之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分類為Vk4亞群之B3；分類為Vk5亞群之B2(本說明書中亦稱為Vk5-2)；分類為VK6亞群之A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))。
完全人類型之VL序列，雖不僅限定於下述，但可適當列舉例如分類VL1亞群之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分類為VL2亞群之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分類為VL3亞群之V3-2、V3-3、V3-4；分類為VL4亞群之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分類為VL5亞群之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))。
通常該等框架序列係藉由一個或以上之胺基酸殘基的相異而互相不同。該等之框架序列可與本發明之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用。本發明之可與「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性 會變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架的例子，不僅限定於此，其他亦可列舉KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本發明雖不被特定的理論所拘束，但使用生殖細胞系之序列，期待於絕大多數之個人上排除有害的免疫反應，其一理由可認為係如下所述。通常之免疫反應中所產生之親和性成熟步驟的結果，於免疫球蛋白之可變區域會頻繁地產生體細胞之突變。該等之突變主要而言，其序列係產生於超可變之CDR周邊，但對框架區域之殘基亦會產生影響。該等之框架的突變不存在於生殖細胞系之基因，且亦可認為成為患者之免疫原性的可能性少。另一方面，通常之人類集團，係接觸於大多數由生殖細胞系之基因所表現的框架序列，免疫寬容的結果，可預測該等生殖細胞系之框架在患者中為免疫原性低、或為非免疫原性。為了使免疫寬容之可能性達到最大，可由編碼化可變區域之基因所普遍存在的功能性生殖細胞系基因之集合中選擇。
為了製造本發明之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」係包含於前述框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位特異性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知之方法。
例如，藉由組合作為預先包含「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之框架序列而選擇之輕鏈可變區域、與作為隨機化可變區域序列分子庫而製造之重鏈可變區域，可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫。作為如此非限定的例子，當離子濃度為鈣離子濃度時，可適當列舉例如組合序列編號：1(Vk5-2)所記載之輕鏈可變區域序列與作為隨機化可變區域序列分子庫而製造之重鏈可變區域之分子庫。包含存在於具有上述之Vk5-2等生殖細胞系列之序列的抗體之輕鏈可變區域的Vk5結構域之輕鏈可變區域序列的較佳例子，除了序列編號：1(Vk5-2)記載之輕鏈可變區域序列，其他亦可適當使用後述之以序列編號：2表示之Vk5-2變異型(variant)1或以序列編號：3表示之Vk5-2變異型2等。包含該等分子中所含的「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之Vk5-2的部分，可作為含有本發明之鈣結合模式結構之結構域來使用。本發明之非限定的其一態樣中，形成鈣結合模式結構之至少一個胺基酸可作為本發明之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」來使用。
又，亦可於作為前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」所預先被包含之框架序列而選擇之輕鏈可變區域序 列中，設計為含有多樣之胺基酸來作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中如此之殘基係被稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對抗原的結合活性，只要係隨著離子濃度條件而變化，則該柔性殘基之數目及位置並不限定為特定之態樣。亦即，於重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中可含有一個或其以上之柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，作為於序列編號：1(Vk5-2)所記載之輕鏈可變區域序列中所導入的柔性殘基之非限定的例子，可列舉表13、表14、表17或表18所記載之胺基酸殘基。
又，藉由組合經導入前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而製造之重鏈可變區域，亦可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子的分子庫。作為如此之非限定的例子，於離子濃度為鈣離子濃度時，可適當列舉組合例如序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的特定殘基經取代為「鈣隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域序列與作為隨機化可變區域序列分子庫而製造之重鏈可變區域而得之分子庫。作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例輕鏈之CDR1中所含之胺基酸殘基。其他，作為該胺基酸殘基之非限定的例子，亦可舉例輕鏈之CDR2中所含之胺基酸殘基。又，作為該胺基酸殘基之非 限定的別的例子，亦可舉例輕鏈之CDR3中所含之胺基酸殘基。
如前所述，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1中的胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR1中以Kabat編號表示之30位、31位、及/或32位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2中的胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR2中以Kabat編號表示之50位之胺基酸殘基。進一步地，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3中的胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR3中以Kabat編號表示之92位之胺基酸殘基。又，該等之胺基酸殘基只要係形成鈣結合模式結構，及/或隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化，則可單獨含有該等胺基酸殘基、亦可組合含有二個以上之該等胺基酸。又，已知有具有複數個鈣離子結合部位，且認為係由分子進化上共通之起源而由來的肌鈣蛋白C、調鈣素、微小白蛋白、肌凝蛋白輕鏈等，亦可以含有其結合模式結構的方式來設計輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3。例如，可以上述目的適當地使用鈣黏素結構域、調鈣素所含有之EF hand、Protein kinase C所含有之C2結構域、血液凝固蛋白質FactorIX所含有之G1a結構域、去唾液酸糖蛋白質受體或甘露糖結合受體所含有之C型凝集素、LDL受體所含有之A結構域、annexin、thrombospondin 3型結構域及類EGF結構域。
組合經導入前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而製造之重鏈可變區域的情況時，亦與前述同樣地，亦能夠以柔性殘基係包含於該輕鏈可變區域序列中的方式來設計。本發明之抗原結合分子對抗原的結合活性，只要係隨著離子濃度條件不同而會變化，則該柔性殘基之數目及位置並不限定於特定之態樣。亦即，可於重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中包含一個或其以上之柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，作為被導入輕鏈可變區域序列之柔性殘基的非限定之例子。可列舉表13、表14、表17或表18所記載之胺基酸殘基。
所組合之重鏈可變區域的例子。可適當地列舉隨機化可變區域分子庫。隨機化可變區域分子庫之製造方法係適當組合公知之方法。本發明之非限定的其一態樣中，基於經特定之抗原誘發免疫之動物、感染症患者或接種疫苗使血中抗體價上昇之人類、癌患者、來自自體免疫疾病之淋巴球之抗體基因所構築之免疫分子庫，可適當地使用作為隨機化可變區域分子庫。
又，本發明之非限定的其一態樣中，基因體DNA中之V基因或經再構築之有功能性之V基因的CDR序列，經包含編碼適當長度之密碼子組之序列的合成寡核苷酸組取代之合成分子庫，亦可適當地使用作為隨機化可變區域分子庫。此時，由觀察到重鏈CDR3之基因序列的多樣性 來看，亦可僅取代CDR3之序列。抗原結合分子之可變區域中產生出胺基酸之多樣性的基準，係為使露出於抗原結合分子表面之位置的胺基酸殘基具有多樣性。露出於表面的位置，雖指根據抗原結合分子之構造、構造集團、及/或經模式化之構造，而判斷為可露出於表面、且/或可與抗原接觸之位置，但一般而言為其CDR。較佳為，露出於表面之位置，係使用如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之3次元模式的座標來決定。露出於表面之位置，可使用本技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))來決定。露出於表面之位置決定，可使用由適合蛋白質結構模擬(protein modeling)之軟體及抗體所得之三次元構造資訊來進行。作為用於如此目的而可利用之軟體，可適當列舉SYBYL生體高分子模擬軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為，演算法必須有使用者之輸入大小參數時，計算時使用的探針「大小」係設定為半徑約1.4埃以下。進一步地，使用了個人電腦用軟體之露出於表面之區域及面積之決定法，係記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
進一步地，本發明之非限定的其一態樣中，由來自健康人之淋巴球的抗體基因所構築，且其基因譜中不含偏差(bias)之抗體序列之天然序列所構成的天然分子庫，亦可特別適合作為隨機化可變區域分子庫來使用(Gejima等人 (Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。包含本發明中記載之天然序列之胺基酸序列，意指由如此之天然分子庫中取得的胺基酸序列。
本發明之其一態樣中，藉由組合作為預先包含「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之框架序列而被選擇之重鏈可變區域、與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域，可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫。作為如此之非限定的例子，離子濃度為鈣離子濃度時，可適當地列舉例如，將序列編號：10(6RL#9H-IgG1)或序列編號：11(6KC4-1#85H-IgG1)所記載之重鏈可變區域序列與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域組合之分子庫。又，亦可由具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域中適當選擇藉以製造，來取代作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域。可適當地列舉例如，將序列編號：10(6RL#9H-IgG1)或序列編號：11(6KC4-1#85H-IgG1)記載之重鏈可變區域序列與具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域組合之分子庫。
又，亦能夠以於作為預先包含前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之框架序列而被選擇之重鏈可變區域的序列中包含有柔性殘基的方式來設計。本發明之抗原結 合分子對抗原的結合活性，只要係隨著離子濃度之條件不同而變化，則該柔性殘基之數目及位置並不限定為特定之態樣。亦即，可於重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中包含一個或其以上之柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，作為導入於序列編號：10(6RL#9H-IgG1)所記載之重鏈可變區域序列的柔性殘基之非限定的例子，除了重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基之外，可列舉重鏈CDR3之95位、96位及/或100a位以外之CDR3的胺基酸殘基。或者，作為導入於序列編號：11(6KC4-1#85H-IgG1)所記載之重鏈可變區域序列之柔性殘基之非限定的例子，除了重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基之外，亦可列舉重鏈CDR3之95位及/或101位以外之CDR3的胺基酸殘基。
又，藉由組合經導入前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」的重鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域，亦可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫。作為如此之非限定的例子，離子濃度為鈣離子濃度時，可適當地列舉例如，組合重鏈可變區域之特定殘基經取代為「鈣隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之重鏈可變區域序列與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系 列之序列的輕鏈可變區域之分子庫。作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例重鏈之CDR1中所含之胺基酸殘基。其他，作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例重鏈之CDR2中所含之胺基酸殘基。又，作為該胺基酸殘基之非限定的別的例子，亦可舉例重鏈之CDR3中所含之胺基酸殘基。作為該胺基酸殘基係包含於重鏈之CDR3中之胺基酸殘基的非限定的例子，可列舉重鏈可變區域之CDR3中之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之胺基酸。又，該等之胺基酸殘基，只要係形成鈣結合模式結構，及/或隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化，則可單獨包含該等胺基酸殘基、亦可包含該等胺基酸之二個以上的組合。
組合經導入前述之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」的重鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域的情況時，亦與前述同樣地能夠以柔性殘基包含於該重鏈可變區域之序列中的方式來設計。本發明之抗原結合分子對抗原的結合活性，只要係隨著離子濃度之條件不同而變化，該柔性殘基之數目及位置並不限定為特定之態樣。亦即，可於重鏈之CDR序列及/或FR序列中包含一個或其以上之柔性殘基。又，作為「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之胺基酸殘基」以外之重鏈可變區域之CDR1、CDR2及/或CDR3 的胺基酸序列，亦可適當地使用隨機化可變區域分子庫。使用生殖細胞系列之序列作為輕鏈可變區域時，可列舉例如，序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的序列作為非限定的例子。
前述之隨著鈣離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之胺基酸殘基，只要係形成鈣結合模式結構，任意之胺基酸殘基均可適合地使用，但作為如此的胺基酸殘基，具體而言可列舉具有電子供與性之胺基酸。作為如此之具有電子供與性之胺基酸，較佳可舉例絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺、天門冬胺酸或麩胺酸。
作為本發明之其一態樣，藉由組合經導入「氫隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之重鏈可變區域，亦可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫。
作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例輕鏈之CDR1所包含之胺基酸殘基。其他，作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例輕鏈之CDR2所包含之胺基酸殘基。又，作為該胺基酸殘基之非限定的別的例子，亦可舉例輕鏈之CDR3所包含之胺基酸殘基。
如前所述，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1中之 胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR1中之以Kabat編號表示之24位、27位、28位、30位、31位、32位及/或34位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2中之胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR2中之以Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位及/或56位之胺基酸殘基。進一步地，該胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3中之胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉輕鏈可變區域之CDR3中之以Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93位、94及/或95a位之胺基酸殘基。又，該等之胺基酸殘基，只要係隨著氫離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化，則可單獨包含該等胺基酸殘基、亦可包含該等胺基酸之二個以上的組合。
組合經導入前述之「氫隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」的輕鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之重鏈可變區域的情況時，與前述同樣地，亦能夠以柔性殘基包含於該輕鏈可變區域之序列中的方式來設計。本發明之抗原結合分子對抗原的結合活性，只要係隨著氫離子濃度之條件不同而變化，擇該柔性殘基之數目及位置並不限定為特定之態樣。亦即，可於重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中包含一個或其以上之柔性殘基。例如，作為經導入於輕鏈可變區域序列之柔性殘基的 非限定的例子，可列舉表4或表5記載之胺基酸殘基。又，作為隨著氫離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之胺基酸殘基或柔性殘基以外之輕鏈可變區域的胺基酸序列，以非限定的例子而言可適合使用Vk1(序列編號：6)、Vk2(序列編號：7)、Vk3(序列編號：8)、Vk4(序列編號：9)等之生殖細胞系列之序列。
所組合之重鏈可變區域的例子，可適當地列舉隨機化可變區域分子庫。隨機化可變區域分子庫之製造方法可適當地組合公知之方法。本發明之非限定的其一態樣中，基於經特定抗原誘發免疫之動物、感染症患者或經疫苗接種而使血中抗體價上昇的人類、癌患者、來自自體免疫疾病之淋巴球的抗體基因所構築之免疫分子庫，亦可適合作為隨機化可變區域分子庫來使用。
又，本發明之非限定的其一態樣中，與前述同樣地，基因體DNA中之V基因或經再構築之有功能性之V基因的CDR序列，經包含編碼適當長度之密碼子組之序列的合成寡核苷酸組取代之合成分子庫，亦可適當地使用作為隨機化可變區域分子庫。
進一步地，本發明之非限定的其一態樣中，由來自健康人之淋巴球的抗體基因所構築，且其基因譜中不含偏差(bias)之抗體序列之天然序列所構成的天然分子庫，亦可特別適合作為隨機化可變區域分子庫來使用(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。
作為本發明之別的態樣，藉由組合經導入「氫隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之重鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域，亦可製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫。作為如此之非限定的例子，可適當列舉例如，將重鏈可變區域之特定殘基經「氫隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」取代之重鏈可變區域序列與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域組合之分子庫。作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例重鏈之CDR1中所含之胺基酸殘基。其他，作為該胺基酸殘基之非限定的例子，可舉例重鏈之CDR2中所含之胺基酸殘基。又，作為該胺基酸殘基之非限定的別的例子，亦可舉例重鏈之CDR3中所含之胺基酸殘基。
作為該胺基酸殘基係包含於重鏈之CDR1中之胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉重鏈可變區域之CDR1中之以Kabat編號表示之27位、31位、32位、33位及/或35位之胺基酸。作為包含於重鏈之CDR2中之胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉重鏈可變區域之CDR2中之以Kabat編號表示之50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位及/或62位之胺基酸。作為包含於重鏈之CDR3中之胺基酸殘基之非限定的例子，可列舉重鏈可 變區域之CDR3中之以Kabat編號表示之95位、96位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位及/或107位之胺基酸。又，該等之胺基酸殘基，只要係隨著氫離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化，則可單獨包含該等胺基酸殘基、亦可包含該等胺基酸之二個以上的組合。
組合經導入前述之「氫隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」的重鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之輕鏈可變區域或具有生殖細胞系列之序列的輕鏈可變區域的情況時，亦與前述同樣地，亦能夠以柔性殘基包含於該重鏈可變區域之序列中的方式來設計。本發明之抗原結合分子對抗原的結合活性，只要係隨著氫離子濃度之條件不同而變化，則該柔性殘基之數目及位置並不限定為特定之態樣。亦即、可於重鏈之CDR序列及/或FR序列中包含一個或其以上之柔性殘基。又，作為「隨著氫離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化的胺基酸殘基」以外之重鏈可變區域之CDR1、CDR2及/或CDR3的胺基酸序列，亦可適當地使用隨機化可變區域分子庫。又，使用生殖細胞系列之序列作為輕鏈可變區域時，可列舉例如，序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的序列作為非限定的例子。
作為前述之隨著氫離子濃度之條件不同，抗原結合 分子對抗原之結合活性會變化的胺基酸殘基，任意之胺基酸殘基均可適合使用，作為如此之胺基酸殘基，具體而言可列舉側鏈之pKa為4.0-8.0的胺基酸。作為如此之具有電子供與性的胺基酸，除了組胺酸或麩胺酸等天然胺基酸外，可適當舉例組胺酸類似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)等非天然之胺基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17),3761-2768。又，該胺基酸殘基之特別適合的例子，可列舉側鏈之pKa為5.5-7.0之胺基酸。作為如此之具有電子供與性的胺基酸，，可適當舉例組胺酸。
為了改變抗原結合結構域之胺基酸，可適當採用部位特異性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等之公知方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸改變方法，亦可採用複數個公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，亦適合使用含有使非天然胺基酸及與終止密碼子之1的UAG密碼子(琥珀(amber)密碼子)互補的琥珀抑制子tRNA經結合之tRNA的無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))等。
所組合之輕鏈可變區域的之例子，可適當列舉隨機化可變區域分子庫。隨機化可變區域分子庫之製造方法係適當地組合公知的方法。本發明之非限定的其一態樣中，基 於經特定抗原誘發免疫之動物、感染症患者或經疫苗接種而使血中抗體價上昇的人類、癌患者、來自自體免疫疾病之淋巴球的抗體基因所構築之免疫分子庫，亦可適合作為隨機化可變區域分子庫來使用。
又，本發明之非限定的其一態樣中，基因體DNA中之V基因或經再構築之有功能性之V基因的CDR序列，經包含編碼適當長度之密碼子組之序列的合成寡核苷酸組取代之合成分子庫，亦可適當地使用作為隨機化可變區域分子庫。此時，由觀察到重鏈CDR3之基因序列的多樣性來看，亦可僅取代CDR3之序列。抗原結合分子之可變區域中產生出胺基酸之多樣性的基準，係為使露出於抗原結合分子表面之位置的胺基酸殘基具有多樣性。露出於表面的位置，雖指根據抗原結合分子之構造、構造集團、及/或經模式化之構造，而判斷為可露出於表面、且/或可與抗原接觸之位置，但一般而言為其CDR。較佳為，露出於表面之位置，係使用如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之3次元模式的座標來決定。露出於表面之位置，可使用本技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))來決定。露出於表面之位置決定，可使用由適合蛋白質結構模擬之軟體及抗體所得之三次元構造資訊來進行。作為用於如此目的而可利用之軟體，可適當列舉SYBYL生體高分子模擬軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為，演算法 必須有使用者之輸入大小參數時，計算時使用的探針的「大小」係設定為半徑約1.4埃以下。進一步地，使用了個人電腦用軟體之露出於表面之區域及面積之決定法，係記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
進一步地，本發明之非限定的其一態樣中，由來自健康人之淋巴球的抗體基因所構築，且其基因譜中不含偏差(bias)之抗體序列之天然序列所構成的天然分子庫，亦可特別適合作為隨機化可變區域分子庫來使用(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。
隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之胺基酸殘基以外的胺基酸，只要本發明之抗原結合分子會與抗原結合，可使用任意之胺基酸，較適合的例子可適當地應用J.D.Marks等人(J.Mol.Biol.(1991)222,581-597)等之公知的抗體噬菌體展示分子庫技術。亦即，隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之胺基酸殘基以外的胺基酸序列，係採用上述之抗體噬菌體庫。
本發明之彼此序列互異的複數個抗原結合分子之記載中「彼此序列互異的」之用語，意指分子庫中各抗原結合分子之序列互相不同。亦即，分子庫中互相不同之序列的數目，係反映分子庫中之序列不同的獨立殖株(clone)數目，有時亦稱為「分子庫大小(library size)」。通常之噬 菌體展示分子庫中為106至1012、藉由應用核糖體展示法等公知之技術，可使分子庫大小擴大為1014。但是，噬菌體庫之篩選選擇時所使用之噬菌體粒子的實際數目，通常係比分子庫大小大10至10,000倍。此過量之倍數，亦稱為「分子庫當量數」，表示具有同樣胺基酸序列之各殖株可存在10至10,000個。因而本發明中之「彼此序列互異的」之用語，意指除了分子庫當量數以外之分子庫中的各抗原結合分子之序列互相不同、更具體而言，係指彼此序列互異的抗原結合分子存在有106至1014分子、較佳為107至1012分子、更佳為108至1011、特佳為108至1010個。
又，本發明之主要由複數個抗原結合分子所構成之分子庫的記載中之「複數個」之用語，例如在本發明之抗原結合分子、融合多肽、聚核苷酸分子、載體或病毒，通常係指其物質之2個以上種類的集合。例如，若某2個以上之物質在關於特定生物性質上互相不同，則表示其物質存在有2種以上。作為例子，可列舉於胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如，柔性殘基以外、或露出於表面之非常多樣的胺基酸位置之特定變異體胺基酸以外係實質相同、較佳為具有同一序列之本發明的2個以上抗原結合分子的情況時，則本發明之抗原結合分子係存在複數個。在其他實施例中，若除了編碼柔性殘基之鹼基以外、或編碼露出於表面之非常多樣的胺基酸位置之特定的變異體胺基酸之鹼基以外係實質相同，較佳係具 有同一序列之本發明的2個以上之聚核苷酸分子的話，則本發明之聚核苷酸分子係存在複數個。
進一步，本發明之主要由複數個抗原結合分子所構成之分子庫之記載中之「主要由...構成」之用語，係反映分子庫中之序列不同的獨立殖株數目中，隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性不同之抗原結合分子的數目。具體而言，較佳顯示如此之結合活性的抗原結合分子於分子庫中至少存在有104分子。又，更佳本發明係提供顯示如此之結合活性的抗原結合分子至少存在有105分子的分子庫。又更佳本發明係提供顯示如此之結合活性的抗原結合分子至少存在有106分子的分子庫。特佳本發明係提供顯示如此之結合活性的抗原結合分子至少存在有107分子的分子庫。又，較佳本發明係提供顯示如此之結合活性的抗原結合分子至少存在有108分子的分子庫。於別的表述中，分子庫中之序列相異之獨立殖株之數目中，亦可適合地表述作為隨著離子濃度之條件不同抗原結合分子對抗原之結合活性會不同之抗原結合分子的比例。具體而言，本發明係提供含有顯示如此之結合活性的抗原結合分子在分子庫中之序列不同之獨立殖株的數目之0.1%至80%、較佳為0.5%至60%、更佳為1%至40%、又更佳為2%至20%、特佳為4%至10%之分子庫。融合多肽、聚核苷酸分子或載體的情況時，亦與上述同樣地，能夠以分子數目或分子全體中之比例來表述。又，病毒的情況時，亦與上述同樣地，能夠以病毒個體數目數或個體全 體中之比例來表述。
包含抗原結合分子之融合多肽
本發明之其一實施形態中，可製造本發明之抗原結合分子與異種多肽之融合分子。在一實施形態中，融合多肽可與病毒外殼蛋白質，例如由pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體所構成群組中選擇之病毒外殼蛋白質的至少一部分融合。
在一實施形態中，本發明之抗原結合分子可為ScFv、Fab片段、F(ab)2或F(ab’)2，因此在其他之一實施形態中，係提供主要由該等之抗原結合分子與異種多肽的融合分子，且為彼此序列互異的複數個融合分子所構成之分子庫。具體而言，係提供該等之抗原結合分子與病毒外殼蛋白質，例如與由pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體所構成之群組中選擇之病毒外殼蛋白質的至少一部分融合之融合蛋白質，且主要由彼此序列互異的複數個融合分子所構成之分子庫。本發明之抗原結合分子可進一步包含二聚體化結構域。在一實施形態中，前述二聚體化結構域可存在於抗體之重鏈或輕鏈之可變區域與病毒外殼蛋白質的至少一部分之間。此二聚體化結構域中可包含二聚體化序列之至少1個、及/或包含1個或複數之半胱胺酸殘基之序列。此二聚體化結構域較佳可為與重鏈可變區域或恆定區域之C末端連結。二聚體化結構域係隨著前述抗體可變區域被作為與病毒之外殼蛋白 質成分的融合蛋白質成分而製造(二聚體化結構域之後不具有琥珀終止密碼子)與否，或者前述抗體可變區域主要不含有病毒外殼蛋白質成分來製造(例如，二聚體化結構域之後具有琥珀終止密碼子)與否，而可採取各種構造。當前述抗體可變區域主要係作為與病毒之外殼蛋白質成分的融合蛋白質而被製造時，係藉由1個或複數之雙硫鍵及/或單一之二聚體化序列來進行二價展現。當本發明之抗原結合分子主要為不與病毒之外殼蛋白質成分融合而被製造之抗體可變區域(例如，具有琥珀終止密碼子)的情況時，較佳為具有含有半胱胺酸殘基與二聚體化序列之兩者的二聚體化結構域。在一實施形態中，F(ab)2之重鏈，係藉由不含絞鏈區域之二聚體化結構域而被二聚體化。此二聚體化結構域中，可包含例如公知之GCN4序列：GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG(序列編號：12)等的白胺酸拉鍊序列。
編碼抗原結合分子之聚核苷酸
用以製造編碼抗原結合分子之聚核苷酸之寡核苷酸或引子組，可使用標準之方法來合成。例如，可藉由固相法來合成包含由密碼子組提供之核苷酸三字密碼之所有可能的組合，且包含編碼所期望之胺基酸群之序列的一組寡核苷酸。因此，具有特定之密碼子組的合成寡核苷酸組，一般而言係包含不同序列之複數個寡核苷酸，此相異係來自序列全體中之密碼子組。具有在某位置被選擇之「簡併」 核苷酸之寡核苷酸的合成，為所屬技術領域中公知。具有如此之某種密碼子組的核苷酸組，可使用市售之核酸合成劑(Applied Biosystems)來合成、或為可獲得其市售品(例如，Life Technologies)。如本發明中所使用之寡核苷酸係具有可對可變結構域核酸模板雜交之序列，亦可包含可用於選殖之限制酵素部位。
分子庫可藉由使用上游及下游之寡核苷酸組來生成。各寡核苷酸組係具有具備藉由於寡核苷酸序列內提供之密碼子組而確立的不同序列之複數個寡核苷酸。上游及下游之寡核苷酸組，能夠與可變結構域模板核酸序列一起使用於製造PCR產物之「分子庫」。PCR產物係能夠使用經確立之分子生物學的手法，與其他之相關、或無關之核酸序列，例如編碼病毒之外殼蛋白質構成成分及二聚體化結構域之核酸序列融合，因此如此之寡核苷酸組亦有時稱為「核酸匣(nucleic acid cassette)」。
PCR引子序列，係包含為了露出於抗原結合分子之表面且非常多樣之柔性殘基所設計之1個或複數個密碼子組。如前所述，密碼子組係用於編碼所期望之變異體胺基酸之一組不同的核苷酸三字密碼序列。又，寡核苷酸組之序列的長度係用以與模板核酸雜交所充分的長度，又，雖非必須，但可包含限制部位。DNA模板係由來自噬菌體M13載體之載體、或包含Viera等人(Meth.Enzymol.(1987)153,3)所記載之單鏈噬菌體之複製起點的載體所生成。如此地，欲進行突變的DNA，係為了生成單鏈模板而插入該 等載體之一。單鏈模板之生產，係記載於Sambrook等之教科書。
又，於本發明之非限定的一實施態樣中記載之將經選擇之胺基酸導入抗原結合分子之方法，在本技術領域已被確立，其中數個係記載於本說明書中。例如，可使用Kunkel等人(Methods Enzymol.(1987)154,367-382)之Kunkel方法，可藉由導入於露出於至少1個抗原結合分子之表面及/或「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」或非常多樣之柔性殘基，來製造分子庫。例如，藉由經導入本發明之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域與作為隨機化可變區域序列分子庫而被製造之重鏈可變區域的組合，在製造本發明之包含複數個彼此序列互異的抗原結合分子之分子庫時，可適當採用如此方法。作為如此之非限定的例子，金屬離子為鈣離子時，可列舉製造例如序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的特定殘基被取代為「鈣隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域序列，可於如此之輕鏈可變區域的製造中採用如此之方法。
此時，作為用以製造核酸匣之模板，可使用寡核苷酸組，作為使用可變區域之核酸模板(template)序列的PCR 反應之引子。可變區域之模板序列，係包含對象核酸序列(亦即、編碼作為取代之對象之胺基酸的核酸序列)之免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的任何部分均可適合使用。以前述例子來說，可使用序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的可變區域作為模板序列。可變區域之模板序列，至少包含可變區域之一部分、且包含至少1個CDR。隨情況不同，可變區域之模板序列係包含複數個CDR。可變區域之模板序列的上游部及下游部，可作為上游區域之寡核苷酸組及下游區域之寡核苷酸組的構成部分之雜交的對象。上游之引子組的第1寡核苷酸可與第1核酸鏈雜交、下游之引子組的第2寡核苷酸可與第2核酸鏈雜交。寡核苷酸引子係包含1個或複數個密碼子組，可設計為與可變區域之模板序列的一部分雜交。藉由使用該等寡核苷酸，於PCR後可將2個以上之密碼子組導入於PCR產物(亦即核酸匣)中。與編碼抗體可變區域之核酸序列區域雜交之寡核苷酸引子，可包含編碼作為胺基酸取代之對象的CDR殘基之部分。
又，本發明之非限定的一實施態樣中記載之將經選擇之胺基酸導入抗原結合分子之方法，如本說明書中所記載的，亦可適當採用Overlap Extension PCR法(WO1993003151)。藉由導入露出於至少1個抗原結合分子之表面及/或「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」或非常多樣之柔性殘基， 可製造分子庫。Overlap Extension PCR法中所使用之上游區域及下游區域的寡核苷酸組中，可一起包含「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」或非常多樣之柔性殘基、及用以與可變區域之模板序列雜交所充分長的框架序列。
例如，為了製造本發明之非限定的一實施態樣中記載之編碼經導入「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區域的聚核苷酸分子，係製造編碼該胺基酸殘基之密碼子組及附加地編碼柔性殘基之密碼子組的寡核苷酸組。於該寡核苷酸組中，用以與可變區域之模板序列雜交所充分長的框架序列係與其上游或下游連結為同一讀框。
例如，於輕鏈可變區域之CDR2及CDR3中導入該胺基酸殘基或附加的柔性殘基時，係製造編碼鄰接於CDR2之充分長度之FR2之胺基酸序列的寡核苷酸連結於寡核苷酸組之5’末端、編碼鄰接於CDR2之FR3之胺基酸序列的寡核苷酸連結於3’末端之引子。進一步地，亦製造編碼鄰接於CDR3之充分長度之FR4的胺基酸序列的寡核苷酸連結於與寡核苷酸組互補的寡核苷酸組之5’末端、編碼鄰接於CDR3之FR3之胺基酸序列的寡核苷酸連結於3’末端之互補引子。當包含編碼該引子之FR3的胺基酸之寡核苷酸與編碼該互補引子之FR3的胺基酸之寡核苷酸以能夠互相雜交之程度的長度重疊之序列時、藉由於模板序列不存在的條件下之PCR反應，可製造於CDR2及CDR3導入該胺 基酸殘基或附加的柔性殘基之輕鏈可變區域。不包含如此之重疊序列時，例如藉由將序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等之生殖細胞系列的可變區域作為模板序列的PCR反應，可同樣地製造於CDR2及CDR3導入該胺基酸殘基或附加的柔性殘基之輕鏈可變區域。
例如，於輕鏈可變區域之CDR3導入該胺基酸殘基或附加的柔性殘基，來製造包含CDR1及CDR2經隨機化之可變區域的分子庫時，藉由使用使編碼鄰接於CDR3之充分長度的FR4之胺基酸序列之寡核苷酸連結於與寡核苷酸組互補的寡核苷酸組之5’末端、使編碼鄰接於CDR3之FR3的胺基酸序列之寡核苷酸連結於3’末端的引子；與具有編碼FR1之核苷酸序列的引子，且以包含天然序列等經隨機化之可變區域之分子庫作為模板序列的PCR，可同樣地於CDR2導入該胺基酸殘基及附加的柔性殘基、製造編碼經隨機化之CDR1及CDR2之輕鏈可變區域的聚核苷酸之分子庫。於上述輕鏈中導入「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」及/或柔性殘基之聚核苷酸分子庫的製造方法，在用以製造於重鏈導入該胺基酸殘基及附加的柔性殘基之聚核苷酸分子庫時亦可適當採用。
又，能夠以於寡核苷酸序列內包含限制部位的方式來合成上游區域及下游區域之寡核苷酸組。該等之限制部位，係使得核酸匣(亦即PCR反應生成物)容易插入具有進 一步抗體序列之表現載體。較佳為，以在限制部位不導入外來核酸序列、或不去除原本之CDR或框架核酸序列下，使核酸匣之選殖變容易的方式來設計。
為了表現構成被製造之本發明之抗原結合分子的輕鏈或重鏈序列之一部分或全部，可將核酸匣選殖於適當的載體。依據本發明詳述之方法，核酸匣係選殖於可生產與病毒外殼蛋白質之全部或一部分融合之輕鏈或重鏈序列之一部分或全部(亦即，形成融合蛋白質)的載體。如後所述，如此之載體，可為以前述融合蛋白質展現於粒子或細胞表面的方式來設計之表現載體。為了如此之目的，獲得了數種載體，該等係用於本發明之實施，然本說明書中較佳使用之載體為噬粒載體。如所屬技術領域中具有通常知識者所公知的，噬粒載體中通常可含有包含啟動子、訊息序列等控制序列、表現型選擇基因、複製起點部位及其他必要構成成分之各種構成成分。
表現特定之變異體胺基酸的組合之非限定的實施形態中，核酸匣中，可編碼重鏈或輕鏈可變區域之全部或一部分。例如，以本發明之非限定的其一態樣之「隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基」及/或柔性殘基係包含於重鏈之CDR3中的方式來設計時，在製造具有重鏈CDR3之序列多樣性的核酸匣後，可連結於編碼天然序列等之經隨機化之可變區域的核酸匣。如分子庫的情況，為了製造包含該等之變異體胺基酸或變異體胺基酸之組合的抗原結合分 子，核酸匣可插入包含進一步之抗體序列、例如包含輕鏈及重鏈可變區域之可變或恆定區域的全部或一部分之表現載體。該等之進一步之抗原結合分子之序列係與其他核酸序列、例如編碼病毒外殼蛋白質構成成分之序列融合，結果，可生產融合蛋白質。
載體
本發明之非限定的其一態樣中，係包含含有編碼基因融合之核酸序列之可複製的表現載體，前述基因融合，係與病毒外殼蛋白質之全部或一部分融合，且編碼包含1個抗原結合分子之可變區域、或編碼包含1個抗原結合分子之可變區域與1個恆定區域之融合蛋白質。如前所述，亦包含多樣且可複製之表現載體的分子庫，該分子庫係包含編碼含有以多樣序列生成之彼此序列互異的複數個抗原結合分子之可變區域的複數個不同融合蛋白質之複數個基因融合。載體可包含各種構成成分，較佳為以使抗原結合分子之可變區域可於不同載體之間移動的方式、及/或以不同形式展現融合蛋白質的方式來構築。
載體之例子可適合列舉噬菌體載體。噬菌體載體具有可形成噬菌體複製及噬菌體粒子之噬菌體複製起點。噬菌體較佳可列舉包含M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物之纖維狀噬菌體；或包含λ、21、phi80、phi81、82、424、434、其他、或其衍生物之λ型噬菌體作為適合的例子。
病毒外殼蛋白質之例子，係包含感染性蛋白質PIII、主外殼蛋白質PVIII、pVII、pIX、Soc(T4)、Hoc(T4)、gpD(噬菌體λ)、次要噬菌體外殼蛋白質6(pVI)(纖維狀噬菌體(J.Immunol.Methods.(1999)231(1-2),39-51)、M13噬菌體主外殼蛋白質變異體(P8)(Protein Sci.(2000)9(4),647-654))。融合蛋白質係展現於噬菌體表面，適當的噬菌體系係包含M13KO7輔助噬菌體(helper phage)、M13R408、M13-VCS及Phi X 174、pJuFo噬菌體系(J.Virol.(2001)75(15),7107-7113)、超噬菌體(hyper phage)(Nat.Biotechnol.(2001)19(1),75-78)、KM13(Fold Des.(1998)3(5),321-328)。較佳之輔助噬菌體為M13KO7、較佳之外殼蛋白質為M13噬菌體基因III外殼蛋白質。較佳之宿主為大腸菌、及大腸菌之蛋白酶缺損株。例如fth1載體(Nucleic Acids Res.(2001)29(10)e50)等載體，可有用於融合蛋白質之表現。
表現載體亦可包含與編碼抗原結合分子之重鏈可變區域或輕鏈可變區域或其片段的DNA融合之分泌訊息序列。此序列典型而言係位於編碼融合蛋白質之基因所鄰接之5’側，因此係於融合蛋白質之胺基末端轉錄。但是，有的情況下，證明了訊息序列係在編碼欲分泌之蛋白質的基因之5’以外之位置。此序列係以其橫切細菌細胞之內膜而結合的蛋白質作為對象。編碼訊息序列之DNA可由編碼具有訊息序列之蛋白質的基因之任一者中作為限制核酸內切酶片段而得到。原核生物之適當訊息序列，亦可使用例 如編碼LamB或OmpF(Wong等人(Gene(1983),68(2),193-203)、MalE、PhoA之基因及其他基因。用以實施本發明之較佳原核生物訊息序列，為Chang等人(Gene(1987)55(2-3),189-196)記載之大腸菌耐熱性腸毒素II(STII)訊息序列、pelB及malE。
載體一般而言係包含啟動子，作為促進融合蛋白質表現之控制序列。原核生物載體中一般使用的啟動子包含lac Z啟動子系、鹼性磷酸酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λPL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子(藉由lac抑制子所控制之混成trp-lac啟動子)、色胺酸啟動子、pBAD啟動子及噬菌體T7啟動子。關於啟動子之總論，係記載於前述Sambrook等人之教科書。該等為最一般使用之啟動子，但亦同樣地可使用其他適當之微生物啟動子。
又，載體可包含其他核酸序列、例如，gD標籤、c-Myc抗原決定部位、聚組胺酸標籤、螢光蛋白質(例如，GFP)或編碼有用於檢測或純化於噬菌體或細胞表面表現之融合蛋白質的β-半乳糖苷酶蛋白質之序列。例如，藉由編碼gD標籤之核酸序列，可正或負地選擇表現融合蛋白質之細胞或病毒。在數個實施形態中，gD標籤較佳為與不與病毒外殼蛋白質之構成成分融合之抗原結合分子的可變區域融合。例如，編碼聚組胺酸標誌之核酸序列，有益於鑑定包含使用免疫組織化學手法而與特異的抗原結合之抗原結合分子的可變區域之融合蛋白質。抗原結合之檢測所有用的標籤，可與不與病毒外殼蛋白質構成成分融合之抗原 結合分子的可變區域、或與融合於病毒外殼蛋白質構成成分之抗原結合分子的可變區域融合。
實施本發明所用之載體的其他有用構成成分，可適合列舉表現型選擇基因。典型的表現型選擇基因，係編碼賦予宿主細胞抗生素耐受性之蛋白質的基因。作為如此的例子，可適合使用安比西林耐受性基因(ampr)及四環黴素耐受性基因(tetr)等。
載體亦可包含含有獨特之限制部位及抑制性終止密碼子的核酸序列。獨特之限制部位係有用於在不同載體及表現系統之間使抗原結合分子的可變區域移動。特別是有用於生產細胞培養之全長的抗原結合分子或抗原結合片段。抑制性終止密碼子係有用於調節融合蛋白質之表現水準，使可溶型之抗原結合分子片段易於純化。例如，琥珀終止密碼子在可進行噬菌體展示之supE宿主中可轉譯為Gln，在非supE宿主中，其被解釋為產生不與噬菌體外殼蛋白質融合之可溶型抗原結合分子之片段的終止密碼子。該等之合成序列，可與載體內之1個或複數個抗原結合分子之可變區域融合。
可適合使用可將編碼目標之抗原結合分子序列之核酸輕易地由載體取出而接入其他載體之載體。例如，為了使編碼本發明之抗原結合分子或其可變區域之核酸序列的取出變得容易，可將適當的限制部位接入載體。通常為了使有效率的切出及對新載體之接合變得容易，而在載體內選擇特別的限制序列。抗原結合分子或其可變區域，可作為 其後外來之融合序列、例如具有不含病毒外殼蛋白質或其他序列標籤之構造的分子而由載體表現。
編碼抗原結合分子之可變區域或恆定區域的核酸(基因1)與病毒之外殼蛋白質構成成分(基因2)之間，可插入編碼終結或終止密碼子之DNA。如此之終結密碼子係包含UAG(琥珀)、UAA(赭石，ochre)及UGA(蛋白石，opal)。(Davis等人(Microbiology(1980),237,245-247,374 Harper & Row,New York))。於野生型宿主細胞表現之終結或終止密碼子，係帶來基因2蛋白質所不結合之基因1蛋白質產物的合成。但是，藉由於抑制宿主細胞之增殖，會合成能夠檢測之量的融合蛋白質。如此之抑制宿主細胞為公知，記載有大腸菌抑制基因株(Bullock等人(BioTechniques(1987)5,376-379))等。如此之終結密碼子，可插入編碼融合多肽之mRNA中。
抑制性密碼子可插入編碼抗原結合分子之可變或恆定區域的第1基因與編碼噬菌體外殼蛋白質之至少一部分的第2基因之間。或者，抑制性終結密碼子可藉由取代抗原結合分子可變區域之最後的胺基酸三字密碼或噬菌體外殼蛋白質之最初的胺基酸，以鄰接於融合部位而插入。抑制性終結密碼子可插入於二聚體化結構域之C末端或其之後。包含抑制性密碼子之質體在抑制子宿主細胞中複製時，係生產含有可檢測量之多肽及外殼蛋白質之融合多肽。質體在非抑制子宿主細胞中複製時，因為經插入之抑制性三字密碼UAG、UAA或UGA中的轉譯終結，故抗原 結合分子之可變區域係實質上不與噬菌體外殼蛋白質融合地來合成。因而，在非抑制子細胞中表現之抗原結合分子的可變區域，因為不含固定於宿主細胞膜之融合噬菌體外殼蛋白質，故合成後係由宿主細胞分泌。
抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈之可變區域或恆定區域，可與在病毒粒子或細胞表面之1個或複數個合多肽能夠相互作用之胜肽序列進一步地融合。該等胜肽序列，在本說明書中稱為「二聚體化結構域」。二聚體化結構域，可含有至少1個或複數之二聚體化序列、或含有半胱胺酸殘基之序列的至少1個、或其兩者。適當的二聚體化序列，每隔一定的間隔存在有疏水殘基，含有具有因各蛋白質之疏水殘基的相互作用而可形成二聚體之兩親媒性的α螺旋之蛋白質的該等。如此之蛋白質及蛋白質部分係包含例如白胺酸拉鍊(leucine zipper)區域。二聚體化結構域，亦可包含1個或複數個半胱胺酸殘基(例如，藉由於二聚體化結構域內含有抗體絞鏈序列而提供)。半胱胺酸殘基可進行因形成1個或複數個雙硫鍵所致之二聚體化。終止密碼子存在於二聚體化結構域之後方的一實施形態中，二聚體化結構域至少包含1個半胱胺酸殘基。二聚體化結構域較佳為位於抗體可變或恆定結構域與病毒外殼蛋白質構成成分之間。
隨情況不同，載體係編碼包含融合於例如外殼蛋白質之重鏈及輕鏈之可變區域的單鏈形態之單一抗原結合分子之噬菌體多肽。該等情況時，載體可認為係為在某 種啟動子之控制下表現1個轉錄產物之「一作用子性(monocistronic)」。重鏈可變區域及輕鏈可變區域之間具有連結子胜肽，可舉例為了促進編碼VL及VH結構域之一作用子性序列的表現而利用鹼性磷酸酶(AP)或Tac啟動子之載體。如此之作用子序列，於5’末端係與大腸菌之malE或耐熱性腸毒素II(STII)訊息序列連結、於3’末端係與(例如，pIII蛋白質等之)病毒外殼蛋白質的全部或一部分連結。於幾個實施形態中，載體於第2可變區域序列與病毒外殼蛋白質序列之間的其3’末端可進一步包含如以編碼(例如白胺酸拉鍊等之)二聚體化結構域之序列編號：12所示之序列。
其他情況時，重鏈及輕鏈之可變區域係作為各別之多肽表現，如此之載體為「二作用子性」，可表現各自的轉錄產物。該等載體中，適當之啟動子、例如tac或PhoA啟動子可利用於促進二作用子性mRNA之表現。例如，編碼輕鏈可變區域及恆定區域之第1作用子係於5’末端連結大腸菌之malE、pelB或耐熱性腸毒素II(STII)訊息序列、於3’末端係連結編碼gD標籤之核酸序列。例如，編碼重鏈可變區域及恆定區域CH1之第2作用子，係於5’末端連結大腸菌之malE或耐熱性腸毒素II(STII)訊息序列、於3’末端連結病毒外殼蛋白質之全部或一部分。
生成二作用子性mRNA，展現F(ab’)2-pIII之載體中，例如，適當的啟動子、例如tac或PhoA(AP)啟動子，於5’末端係與大腸菌malE或耐熱性腸毒素II(STII)訊息 序列連結而成為能夠作用、於3’末端係促進編碼與編碼gD標籤之核酸序列連結之輕鏈可變區域及恆定區域的第1作用子的表現。第2作用子係例如於5’末端編碼與大腸菌之malE或耐熱性腸毒素II(STII)訊息序列連結而成為能夠作用之重鏈可變區域及恆定區域、於3’末端係包含IgG絞鏈序列及白胺酸拉鍊序列、且進一步於其後方包含含有至少一部分病毒外殼蛋白質之二聚體化結構域。
融合多肽之展現
抗原結合分子之可變區域的融合多肽，能夠於細胞、病毒或噬粒粒子之表面以各種態樣展現。該等態樣中包含單鏈Fv片段(scFv)、F(ab)片段及該等片段之多價形態。多價形態較佳為ScFv、Fab或F(ab’)之二聚體，該等在本說明書中分別稱為(ScFv)2、F(ab)2及F(ab’)2。多價形態展現較佳的理由之一，可認為係藉由多價形態的展現，通常可鑑定低親和性殖株、或係在選擇過程中具有可更有效率地選擇稀有殖株之複數個抗原結合部位。
於噬菌體表面展現包含抗體片段之融合多肽的方法為本技術領域中公知，例如記載於WO1992001047及本說明書。其他於WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236及1993019172亦記載了相關方法，所屬技術領域中具有通常知識者可適當使用該等方法。其他公知文獻(H.R.Hoogenboom & G.Winter(1992)J.Mol.Biol.227,381-388、WO1993006213及WO1993011236)中，顯示了經人 工再配置之可變區域基因基因譜的抗體對於噬菌體表面展現之各種抗原之鑑定。
為了以scFv態樣來展現而構築載體時，編碼抗原結合分子之輕鏈可變區域及重鏈可變區域之核酸序列係包含於此載體中。一般而言，編碼抗原結合分子之重鏈可變區域的核酸序列，係與病毒外殼蛋白質構成成分融合。編碼抗原結合分子之輕鏈可變區域的核酸序列，係藉由編碼胜肽連結子之核酸序列而連結於抗原結合分子之重鏈可變區域。胜肽連結子一般而言包含約5至15個胺基酸。任意地，例如編碼有用於純化或檢測之標誌之其他序列，可與編碼抗原結合分子之輕鏈可變區域或抗原結合分子之重鏈可變區域之任一者或兩者之核酸序列的3’末端融合。
為了以F(ab)態樣來展現而構築載體時，編碼抗原結合分子之可變區域及抗原結合分子之恆定區域的核酸序列係包含於此載體中。編碼輕鏈可變區域之核酸，係與編碼輕鏈恆定區域之核酸序列融合。編碼抗原結合分子之重鏈可變區域的核酸序列，係與編碼重鏈恆定CH1區域之核酸序列融合。一般而言，編碼重鏈可變區域及恆定區域之核酸序列，係與編碼病毒外殼蛋白質之全部或一部分的核酸序列融合。重鏈可變區域及恆定區域較佳為作為與病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合體來表現，輕鏈可變區域及恆定區域。係與重鏈病毒外殼融合蛋白質各自表現。重鏈及輕鏈互相結合，其結合可為共價鍵或非共價鍵。任意地，例如編碼有用於純化或檢測之多肽標誌之其他序列， 可與編碼抗原結合分子之輕鏈恆定區域或抗原結合分子之重鏈恆定區域任一者或兩者的核酸序列3’末端融合。
載體對宿主細胞之導入
如前述方式構築之載體，係為了放大及/或表現而導入宿主細胞。載體可藉由包括電穿孔、磷酸鈣沈澱等之公知轉形法，以導入宿主細胞。載體為如病毒之感染性粒子時，載體本身會入侵宿主細胞。藉由以經插入編碼融合蛋白質之聚核苷酸的可複製表現載體來轉染宿主細胞及以公知手法來生產噬菌體粒子，融合蛋白質會展現在噬菌體粒子表面。
可複製之表現載體，可使用各種方法來導入宿主細胞。在非限定的其一實施態樣中，載體可如WO2000106717所記載，使用電穿孔法導入細胞。細胞係在標準培養液中任意於37℃培養約6至48小時(或至600 nm之OD成為0.6至0.8)，接著藉由將培養液離心分離(例如藉由傾析)由培養上清液中取出。在純化之初期階段中，較佳為在緩衝液(例如1.0 mM之HEPES(pH7.4))中使細胞沈澱物再懸濁。接著藉由再度的離心分離，由懸濁液取出上清液。所得之細胞沈澱物係再懸濁於例如稀釋為5-20%V/V之甘油。藉由再度離心分離而由懸濁液中去除上清液藉以得到細胞沈澱物。基於將該細胞沈澱物再懸濁於水或稀釋之甘油中而得之菌體濃度的測定值，使用水或稀釋之甘油，將最終菌體濃度調製為所期望之濃度。
例如，作為較佳之受體細胞，可列舉電穿孔勝任之大腸菌株SS320(Sidhu等人(Methods Enzymol.(2000)328,333-363))。在使生殖性游離副體(episome)(F’質體)或XL1-BLUE轉移至MC1061細胞所充分之條件下，使MC1061細胞與XL1-BLUE細胞交接而調製大腸菌株SS320。對寄存於ATCC(10801 University Boulevard,Manassas,Virginia)之大腸菌株SS320賦予寄存編號98795。以此菌株使噬菌體複製成為可能之任何F’游離副體均可用於本發明。適當之游離副體可由寄存於ATCC之株獲得、或由市售品亦可獲得(TG1，CJ236、CSH18、DHF’、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等)。
以電穿孔使用更高DNA濃度(約10倍)時，轉形率會提高、對宿主細胞轉形之DNA量會增加。使用高菌體濃度亦會使效率提高(約10倍)。藉由轉移之DNA量的增加，可製造具有更大多樣性，且序列不同之獨立殖株數目大之分子庫。轉形細胞通常係藉由於含有抗生素之培養基上的增殖與否來選擇。
隨著條件不同，結合活性會變化之抗原結合分子的選擇方法及編碼該分子之聚核苷酸的單離方法
用以鑑定對抗原顯示所期望之結合活性之抗原結合分子的噬菌體展示之使用方法，亦包含施加各種改變之方法，於本技術領域已然確立。於非限定之其一態樣中，以 包含與編碼融合多肽之基因融合體連結為能夠作用之轉錄調節要素的方式構築之可複製載體之分子庫，係對適當之宿主細胞轉形。培養經轉形之細胞，形成將前述融合多肽展現於噬菌體粒子表面之噬菌體粒子。之後，以在選擇過程中使結合之粒子集團相較於不與抗原結合之粒子增加為目的，實施伴隨著以至少粒子集團之一部分與抗原結合的方式使重組體噬菌體粒子與對象抗原接觸之選擇、區分的「選擇結合分子」步驟。為了以不同或相同反應條件將同一集團進一步篩選1次，係將區分之集團，例如對新鮮之XL1-Blue細胞等宿主細胞感染，藉以放大該集團。接著，實施將所得之抗原結合分子經放大的集團、在不同離子濃度之條件下與抗原接觸的步驟，以所期望之條件來篩選與抗原結合之抗原結合分子。又，可將在不同離子濃度之條件下與抗原接觸的步驟作為前述選擇方法之最初步驟來實施、亦可將「選擇結合分子」步驟與選擇在離子濃度不同的條件下結合活性會變化之結合分子的步驟的組合作適當變更。又，前述之選擇及區分的步驟係不管實施幾次均可。在該等之離子濃度不同的條件下，與抗原結合之抗原結合分子，在對生體投與時，係有用於作為具有將病因抗原迅速由生體去除之能力之治療藥。
本發明之包含隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之胺基酸及/或柔性殘基之可變區域或其一部分的融合多肽，係表現於噬菌體、噬粒粒子或細胞之表面。接著可對於離子濃度不同的條件下之融 合多肽之集團中構成成員與抗原結合的能力進行選擇及/或區分。對融合多肽選擇、區分及篩選之方法，亦包含與如與protein L或噬菌體上展現之抗原結合分子或其片段結合的標誌抗體之抗原結合分子可變區域具有親和性之一般的蛋白質上的選擇、區分及篩選方法。如此方法可使用於使展現正確摺疊之抗原結合分子(包含該抗原結合分子之融合多肽)之片段之分子庫大小或分子庫當量數變豐富。
為了進行前述之選擇、區分及篩選，可使用2個主要方法。第1方法為固體載劑方法、盤篩選(plate screening)或固定化抗原篩選、第2方法為溶液結合方法。
「固體載劑方法」中，抗原可與本技術領域公知之適當固體或半固體介質，例如洋菜糖珠、丙烯醯胺珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚合物、甲基丙烯酸羥基烷基凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸共聚合物、尼龍、中性及離子性載劑等結合。抗原對介質之結合，可藉由Methods in Enzymology(1976)44記載之方法、或本技術領域公知之其他手段來達成。
抗原對介質結合後，在噬菌體粒子集團之至少1個次組(subset)與固定化抗原之結合所適合的條件下，使經固定化之抗原與表現融合多肽之分子庫接觸。通常，包含pH、離子強度、溫度等之條件，係選擇模仿生理學條件之條件。與前述之固定化抗原結合的粒子(「結合體」)，係藉由水洗而與不與對象結合的粒子分離。洗淨條件可調節 為使高親和性結合體以外之全部均被去除。結合體可藉由各種方法由經固定化之對象解離。該等方法包含例如使用過量抗原等之野生型配位子的競爭性解離、pH及/或離子強度的變更、以及本技術領域公知之方法。結合體一般可藉由如0.1 M之HCl等酸或配位子的適當溶出材料而由親和性介質溶出。藉由使配位子濃度上昇而溶出，亦可使經展現之親和性更高的結合分子溶出。
藉由使經單離之結合體的病毒粒子(及、例如病毒粒子為噬粒粒子的情況時依需要的輔助噬菌體)感染細胞，能夠以適當宿主細胞再放大結合體。如此方式得到之宿主細胞係在適合放大展現所期望之融合多肽之粒子的條件下培養。接著採取噬菌體粒子，將選擇步驟重複1次或複數次直到抗原之結合體佔相當比例為止。選擇或篩選不管進行幾次均可。作為選擇或篩選方法之一，亦可包含單離抗存在於protein L或被展現之多肽的多肽標籤之抗體、例如抗gD蛋白質或聚組胺酸標籤之抗體之與一般親和性蛋白質結合之結合體。
作為本發明之其一態樣，可適當使用稱為「溶液結合方法」之溶液相篩選法。為了由隨機之分子庫中、或由以改善所期望之結合殖株或殖株群之結合活性為目的之分子庫中得到經改善之結合體，可使用溶液結合方法。複數之多肽、例如展現於噬菌體或噬粒粒子(分子庫)上之多肽、與經標籤分子標誌之抗原或與標籤分子融合之抗原的接觸，係包含於此方法中。標籤可利用生物素或其 他特異性結合體。使用於第1溶液結合相中濃度階段性減低之經標誌抗原或經融合抗原，可變化溶液相之嚴格度(stringency)。再者為了提高嚴格度，亦可適當實施與在第1溶液相中經最初標籤分子標誌之抗原或與標誌標籤分子融合之抗原結合之後，與具有不經標籤分子標誌之抗原或不與標誌標籤分子融合之高濃度抗原的第2溶液相追加地接觸。此時，通常於第2相中係使用不經標誌對象之100至1000倍量的標籤分子標誌之抗原或不與標誌標籤分子融合之抗原。第1溶液相之培養時間，至達到平衡為止係為2、3分鐘至1、2小時或其以上之範圍。結合速度快的結合體係有具有在該第1相中之結合時間短的性質之傾向，故可採用結合時間短之接觸條件。第2相培養時間及溫度，可為了使嚴格度增高而變化。藉由如此變化培養條件，會產生對於由對象離開速度(解離速度)慢的結合體之選擇偏差。使展現於噬菌體/噬粒粒子上之複數個多肽與抗原接觸後，與經標籤分子標誌之抗原或與標誌標籤分子融合之抗原結合之噬菌體或噬粒粒子，會由不結合之噬菌體或噬粒粒子分離。以與經標籤分子標誌之抗原或與標誌標籤分子融合之抗原的結合成為可能之範圍，使噬菌體或噬粒粒子與抗原接觸短時間(例如2~5分鐘)，藉以由溶液相單離噬菌體或噬粒粒子與抗原之混合物。經標籤分子標誌之抗原或與標誌標籤分子融合之抗原的初期濃度之範圍為約0.1 nM至約1000 nM。由該混合物溶出之粒子，可為了接下來的篩選而增殖。於各次篩選中，較佳為使用經標 籤分子標誌之抗原或與標誌標籤分子融合之低濃度抗原重複複數次篩選篩選。如後述實施例所記載，使用生物素作為標誌標籤分子時，於溶液結合方法中可適當使用塗覆有鏈黴蛋白素(streptavidin)之磁珠等。
固體載劑方法與溶液結合方法之組合，可為了單離具有所期望之特性的結合體，適當地單獨或組合來實施。對抗原重複選擇及篩選2次、3次或4次後，通常係為了鑑定具有所期望之性質/特性之特異性結合體，實行由經選擇之集團篩選各個殖株。較佳為，篩選之過程，可藉由能夠對分子庫進行高通量篩選之自動化系統來實行。
藉由對抗原之結合來鑑定結合體後，可由該結合體萃取核酸。經萃取之DNA接著係直接用於轉形大腸菌宿主細胞。或者，其編碼序列可藉由例如PCR使用適當的引子來放大後，藉由典型的定序方法決定其序列。接著為了表現其編碼之抗原結合分子，編碼結合體之可變區域的DNA，可插入使用限制酵素消化之載體中。
為了選擇、篩選會表現本發明之隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化之抗原結合分子或其融合多肽的噬菌體粒子，藉由使經固定化之抗原與包含表現抗原結合分子或融合多肽之噬菌體粒子的分子庫接觸之條件變化，會區分對抗原的結合活性會變化之噬菌體粒子集團。
例如，作為金屬離子之適合例子，著眼於鈣離子的情況時，作為鈣離子濃度之條件可列舉低鈣離子濃度之條件 與高鈣離子濃度之條件。隨著鈣離子濃度之條件不同，結合活性會變化，意指隨著低鈣離子濃度與高鈣離子濃度之條件的不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化。例如，可列舉高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性比低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性高的情況。又，亦可列舉低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性比高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性高的情況。
本說明書中，高鈣離子濃度雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可為由100μM至10mM之間選擇的濃度。又，其他態樣中，亦可為由200μM至5mM之間選擇的濃度。又，不同態樣中，亦可為由500μM至2.5mM之間選擇的濃度，其他態樣中，亦可為由200μM至2mM之間選擇的濃度。再者亦可為由400μM至1.5mM之間選擇的濃度。特別適合可列舉接近於生體內之血漿中(血中)的鈣離子濃度之由500μM至2.5mM之間所選擇的濃度。
本說明書中，低鈣離子濃度雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可為由0.1μM至30μM之間選擇的濃度。又，其他態樣中，可為由0.2μM至20μM之間選擇的濃度。又，不同態樣中，亦可為由0.5μM至10μM之間選擇的濃度，其他態樣中，亦可為由1μM至5μM之間選擇的濃度。再者亦可為由2μM至4μM之間選擇的濃度。特別適合可列舉接近於生體內之於早期內體內的離子化鈣濃度之由1μM至5μM之間所選擇的濃度。
本發明中，抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性低，意指抗原結合分子在由0.1μM至30μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原之結合活性，比在由100μM至10mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原之結合活性更弱。較佳為意指抗原結合分子在由0.5μM至10μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性，比在由200μM至5mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性更弱；特佳為意指於生體內之於早期內體內的鈣離子濃度之抗原結合活性，比生體內之血漿中的鈣離子濃度之抗原結合活性更弱，具體而言，意指抗原結合分子在由1μM至5μM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性，比在由500μM至2.5mM之間所選擇的鈣離子濃度下對抗原的結合活性更弱。
例如，為了選擇、篩選表現抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性比抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下之對抗原的結合活性高之抗原結合分子或其融合多肽的噬菌體粒子，最初係在高鈣濃度條件下區分結合於經固定化之抗原之噬菌體粒子集團後，將其經區分之集團與抗原在低鈣濃度條件下經固定化之抗原與包含表現抗原結合分子或融合多肽之噬菌體粒子的分子庫接觸。不結合於在低鈣濃度條件下經固定化之抗原的噬菌體粒子係區分於上清液或其後之洗淨液。高鈣濃度及低鈣濃度之條件，可在上述記載之範圍內適當採用。於非限定之其一態 樣中，可基於在由0.1μM至30μM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合與在由100μM至10mM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合活性的不同來區分。又，在別的非限定態樣中可基於在由0.5μM至10μM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合與在由200μM至5mM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合活性的不同來區分。進一步在別的非限定態樣中，可基於在生體內之早期內體內的鈣離子濃度下對抗原的結合、與在生體內之血漿中的鈣離子濃度下對抗原的結合活性的不同、具體而言，可基於在由1μM至5μM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合、與在由500μM至2.5mM之間選擇之鈣離子濃度下對抗原的結合活性的不同來區分。
例如，作為離子濃度之適合的例子，著眼於氫離子濃度的情況時，作為氫離子濃度之條件可列舉pH酸性區域之條件與pH中性區域之條件。隨著pH之條件不同而結合活性會變化，意指隨著pH酸性區域與pH中性區域之條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性會變化。例如，可列舉pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性比pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性更高的情況。又，亦可列舉pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性比pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性更高的情況。
本說明書中，pH中性區域雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可由pH6.7至pH10.0之間來選擇。 又，其他態樣中，可由pH6.7至pH9.5之間來選擇。又，不同態樣中，可由pH7.0至pH9.0之間來選擇，其他態樣中，可由pH7.0至pH8.0之間來選擇。特別適合可列舉接近於生體內之血漿中(血中)的pH之pH7.4。
本說明書中，pH酸性區域雖非特別以單一定義之數值來限定，較適合可由pH4.0至pH6.5之間來選擇。又，其他態樣中，可由pH4.5至pH6.5之間來選擇。又，不同態樣中，可由pH5.0至pH6.5之間來選擇，其他態樣中，可由pH5.5至pH6.5之間來選擇。特別適合可列舉接近於生體內之於早期內體內的離子化鈣濃度之pH5.8。
本發明中，抗原結合分子在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下對抗原的結合活性低，意指抗原結合分子於由pH4.0至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH6.7至pH10.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。較佳為意指抗原結合分子於由pH4.5至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH6.7至pH9.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱；更佳為意指抗原結合分子於由pH5.0至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH7.0至pH9.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。又，又更佳為意指抗原結合分子於由pH5.5至pH6.5之間選擇之pH中對抗原的結合活性，比由pH7.0至pH8.0之間選擇之pH中對抗原的結合活性更弱。較佳為意指於生體內之於早期內體內的pH中之抗原結合活性，比於生體內之於 血漿中的pH中之抗原結合活性更弱，具體而言，意指抗原結合分子於pH5.8時對抗原的結合活性，比於pH7.4時對抗原的結合活性更弱。
隨著pH條件不同，抗原結合分子對抗原之結合活性是否變化，係根據例如前述之不同pH條件下之結合活性的測定方法來實施。例如，為了確認於pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性，比於pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性變得更高，係比較於pH酸性區域及pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原之結合活性。
例如，為了選擇、篩選表現pH中性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性比pH酸性區域之條件下抗原結合分子對抗原的結合活性更高之抗原結合分子或其融合多肽的噬菌體粒子，最初係在pH中性區域條件下區分結合於經固定化之抗原之噬菌體粒子集團後，將其經區分之集團與抗原在pH酸性區域條件下經固定化之抗原與包含表現抗原結合分子或融合多肽之噬菌體粒子的分子庫接觸。不結合於在pH酸性區域條件下經固定化之抗原的噬菌體粒子係區分於上清液或其後之洗淨液。pH中性區域及pH酸性區域之條件，可在上述記載之範圍內適當採用。於非限定之其一態樣中，可基於在pH4.0至pH6.5之間選擇之pH下對抗原的結合與在由pH6.7至pH10.0之間選擇之pH下對抗原的結合活性的不同來區分。又，在別的非限定之態樣中，可基於在pH4.5至pH6.5之間選擇之 pH下對抗原的結合與在由pH6.7至pH9.5之間選擇之pH下對抗原的結合活性的不同來區分。進一步地，在別的非限定之態樣中，可基於在pH5.0至pH6.5之間選擇之pH下對抗原的結合與在由pH7.0至pH9.0之間選擇之pH下對抗原的結合活性的不同來區分。其他，可基於在pH5.5至pH6.5之間選擇之pH下對抗原的結合與在由pH7.0至pH8.0之間選擇之pH下對抗原的結合活性的不同來區分。進一步在別的非限定態樣中，可基於在生體內之早期內體內之pH下對抗原的結合與在生體內之血漿中的pH下對抗原的結合活性的不同、具體而言，在pH5.8下對抗原的結合與在pH7.4下對抗原的結合活性的不同來區分。
隨著條件不同，結合活性會變化之抗原結合分子的製造方法
本發明之非限定的其一態樣中，藉由如前述選擇之條件來單離編碼結合活性會變化之抗原結合分子分子的聚核苷酸後，該聚核苷酸係插入於適當之表現載體中。亦即，在得到編碼目標之抗原結合分子的可變區域之cDNA後，藉由認識插入於該cDNA之兩末端的限制酵素位置之限制酵素來消化該cDNA。較佳的限制酵素係認識而消化於構成抗原結合分子基因之鹼基序列中出現頻率低之鹼基序列。為了進一步將1複本之消化片段以對載體正確的方向插入，較佳為插入賦予黏性末端之限制酵素。藉由將編碼經上述方式消化之抗原結合分子之可變區域之cDNA插入適當的表現載體，可取得本發明之抗原結合分子的表現載 體。此時，編碼抗體恆定區域(C區域)之基因、與編碼前述可變區域之基因可融合為同一讀框。
為了製造所期望之抗原結合分子，編碼抗原結合分子之聚核苷酸係以與控制序列連結而成為能夠作用的態樣以接入表現載體。控制序列，係含有例如促進子或啟動子。又，可於胺基末端附加適當的訊息序列，使表現的抗原結合分子分泌至細胞外。例如，作為訊息序列可使用具有胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：13)之胜肽，但此外亦可附加適合的訊息序列。經表現之多肽係在上述序列之羧基末端部分切斷，經切斷之多肽可作為成熟多肽而分泌至細胞外。接著，藉由以此表現載體對適當之宿主細胞轉形，可取得表現編碼所期望之抗原結合分子之聚核苷酸的重組細胞。
為了表現編碼抗原結合分子之聚核苷酸，編碼抗原結合分子之重鏈及輕鏈的聚核苷酸，係分別接入不同的表現載體。藉由接入有重鏈與輕鏈之載體，對相同宿主細胞同時轉形(co-transfect)，可表現具備重鏈與輕鏈之抗體分子。或可藉由使編碼重鏈及輕鏈之聚核苷酸接入單一之表現載體，使宿主細胞轉形(參照WO19994011523)。
用以藉由將經單離之編碼抗原結合分子之聚核苷酸導入適當的宿主而製造抗原結合分子之宿主細胞與表現載體之多數組合已為公知。該等表現系統，均可應用於單離本發明之抗原結合分子。使用真核細胞作為宿主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言， 作為動物細胞可舉例如下之細胞。
(1)哺乳類細胞：CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(baby hamster kidney cell line)、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus(Ad)5 DNA)、PER.C6 cell(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes)、Hela、Vero、等(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,Table 5.9.1))
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或者，作為植物細胞，來自菸草(Nicotiana tabacum)等之菸草(Nicotiana)屬之細胞的抗體基因表現系統為公知。植物細胞之轉形，可適當地利用經癒傷組織培養之細胞。
進一步地，作為真菌細胞。可利用如下之細胞。
-酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等之酵母菌(Saccharomyces)屬、甲醇利用酵母(Pichia pastoris)等之Pichia屬
-絲狀菌：黑麴菌(Aspergillus niger)等之麴菌(Aspergillus)屬
又，利用了原核細胞之編碼抗原結合分子之聚核苷酸的表現系統亦為公知。例如，使用細菌細胞時，可適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等之細菌細胞。藉由轉形而導入包含作為目標之編碼抗原結合分子之聚核苷酸的表現載 體於該等細胞中。藉由將經轉形之細胞在in vitro培養，可由該轉形細胞之培養物中取得所期望之抗原結合分子。
重組抗原結合分子之產生，在上述宿主細胞之外，亦可利用基因轉殖動物。亦即可由經導入編碼所期望之編碼抗原結合分子之聚核苷酸之動物中得到該抗原結合分子。例如，可於編碼乳汁中固有而產生之蛋白質的基因內部插入為同一讀框而作為融合基因來構築編碼抗原結合分子之聚核苷酸。作為分泌於乳汁中之蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白等。包含經插入編碼抗原結合分子之聚核苷酸之融合基因的DNA片段被注入山羊之胚，該經注入之胚係被導入雌之山羊。由自接受胚之山羊所產生之基因轉殖山羊(或其子孫)所產生的乳汁中，可作為與乳汁蛋白質之融合蛋白質而取得所期望之抗原結合分子。又，為了增加含有由基因轉殖山羊所產生之所期望之抗原結合分子的乳汁量，可對基因轉殖山羊投與激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
當對人類投與本說明書中所記載之抗原結合分子時，作為該分子中之抗原結合結構域，可適當地採用以使對人類之異種抗原性降低等為目的，而來自經人為改變之基因重組型抗體的抗原結合結構域。基因重組型抗體係包含例如人類化(Humanized)抗體等。該等之改變抗原結合分子，可使用公知之方法適當地製造。
用於製造本說明書中所記載之抗原結合分子中的抗原結合結構域的抗原結合分子之可變區域，通常係以夾在4個框 架區域(FR)當中之3個互補性決定區域(complementarity-determining region；CDR)所構成。CDR係為實質上決定抗原結合分子之結合特異性的區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，在具有不同之結合特異性的抗原結合分子之間，亦常顯示高度的同一性。因此，一般而言，藉由CDR之移植，可將某抗原結合分子之結合特異性移植到其他抗原結合分子。
人類化抗體亦稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物、例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體之人類化抗體等係為公知。亦已知用以得到人類化抗體之一般的基因重組手法。具體而言，作為用以將小鼠之抗體CDR移植至人類FR之方法，例如Overlap Extension PCR係為公知。Overlap Extension PCR中，係於用以合成人類抗體之FR的引子，附加編碼欲移植之小鼠抗體CDR的鹼基序列。準備各別4個FR之引子。一般而言，於將小鼠CDR對人類FR之移植當中，選擇與小鼠FR同一性高之人類FR，係於CDR之功能維持上有利。亦即，一般而言，較佳為利用由與鄰接於欲移植之小鼠CDR的FR胺基酸序列同一性高的胺基酸序列所構成之人類FR。
又，所連結之鹼基序列，係設計為互以同一讀框連接。藉由各引子而個別地合成人類FR。結果，可得到於各FR附加有編碼小鼠CDR之DNA的產物。編碼各產物之小鼠CDR的鹼基序列，係設計為互相重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物所重疊的CDR部分 互相黏著，進行互補鏈合成反應。藉由此反應，人類FR會透過小鼠CDR之序列而連結。
最終連結有3個CDR與4個FR之V區域基因，係藉由於其5’末端與3’末端黏著而附加適當的限制酵素認識序列之引子而放大其全長。藉由插入於表現載體中而使如上述方式得到之DNA與編碼人類抗體C區域之DNA融合為同一讀框，可製成人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入宿主以建立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼該人類化抗體之DNA表現，藉以於該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(EP239400、WO1996002576)。
定性或定量地測定如上述方式製造之人類化抗體之對抗原的結合活性並評估，藉以可適當地選擇透過CDR連結時該CDR會形成良好的抗原結合部位之人類抗體FR。亦可依照需要，取代FR之胺基酸殘基，使得再構成人類抗體之CDR形成適當的抗原結合部位。例如，可應用使用了小鼠CDR對人類FR之移植所用的PCR法，來於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可於黏著於FR的引子中導入部分鹼基序列之變異。於藉由如此引子而合成之FR導入鹼基序列之變異。藉由以上述方法測定並評估經取代胺基酸之變異型抗體對抗原之結合活性，可選擇具有所期望之性質之變異FR序列(Sato等人(Cancer Res(1993)53,851-856)。
於本發明之非限定的其一態樣中，單離編碼隨著如前述方式選擇之條件，其結合活性會變化之抗原結合分子之 聚核苷酸後，該聚核苷酸之改變體係插入適當的表現載體。作為如此改變體之一，就隨機化可變區域分子庫而言，可適合列舉藉由使用以合成分子庫或非人類動物作為起源而製造之免疫分子庫而篩選之本發明的編碼抗原結合分子之聚核苷酸序列經人類化的改變體。經人類化之抗原結合分子之改變體的製造方法，採用與前述人類化抗體之製造方法同樣的方法。
又，改變體的其他態樣，作為隨機化可變區域分子庫，可適合列舉對經單離之聚核苷酸序列施以使用合成分子庫或天然分子庫藉以篩選之帶來本發明之抗原結合分子對抗原的結合親和性之增強(親和性成熟化)之改變的改變體。如此之改變體可藉由包括CDR之變異誘導(Yang等人(J.Mol.Biol.(1995)254,392-403))、鏈改組(chain shuffling)(Marks等人(Bio/Technology(1992)10,779-783))、E.coli變異誘發株之使用(Low等人(J.Mol.Biol.(1996)250,359-368))、DNA改組(Patten等人(Curr.Opin.Biotechnol.(1997)8,724-733))、噬菌體展示(Thompson等人(J.Mol.Biol.(1996)256,77-88))及有性PCR(sexual PCR)(Clameri等人(Nature(1998)391,288-291))之各種親和性成熟化的公知順序來取得。
如前所述，藉由本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，可列舉包含FcRn(特別是人類FcRn)結合結構域之抗原結合分子，但可使用各種改變體作為FcRn(特別是人類FcRn)結合結構域。具有編碼如此之FcRn(特別是人類 FcRn)結合結構域之改變體的聚核苷酸、與編碼藉由如前述方式選擇之條件條件其結合活性會變化之抗原結合分子分子之聚核苷酸連結為同一讀框之重鏈的編碼抗原結合分子之聚核苷酸，亦可作為本發明之改變體的其一態樣而適當地列舉。
本發明之非限定的其一態樣中，作為FcRn(特別是人類FcRn)結合結構域，可適合列舉例如，以序列編號：14表示之IgG1(於N末端附加Ala之AAC82527.1)、以序列編號：15表示之IgG2(於N末端附加Ala之AAB59393.1)、以序列編號：16表示之IgG3(CAA27268.1)、以序列編號：17表示之IgG4(於N末端附加Ala之AAB59394.1)等之抗體恆定區域。IgG分子之血漿中滯留性比較長(由血漿中消失慢)，係因為已知為IgG分子的補救受體之FcRn發揮功能所致。藉由胞飲作用而攝入內體之IgG分子，係結合於在內體內之酸性條件下表現於內體內的FcRn。無法結合於FcRn之IgG分子係進入溶體，於該處分解，結合於FcRn之IgG分子會移動至細胞表面，於血漿中之中性條件下藉由自FcRn解離而再度回到血漿中。
於血漿中之高鈣濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內之低鈣濃度條件下由抗原解離之本發明之「隨著鈣離子濃度之條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」在內體內可由抗原解離。於血漿中之高鈣濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內之低鈣濃度條件下由抗原解離之本發明之「隨著鈣離子濃度之條件不同對抗原的結合 活性會變化之抗原結合分子」，在解離抗原之後藉由FcRn回收至血漿中時可再度與抗原結合。亦即，1分子之該抗原結合分子可與複數個抗原重複地結合。又，結合於抗原結合分子之抗原不會因在內體內解離而回收至血漿中，因此會促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入，藉由抗原結合分子之投與會促進抗原的消失，可使血漿中之抗原濃度降低。
又，於血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之酸性條件下由抗原解離之本發明之「隨著pH條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」在內體內可由抗原解離。於血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之酸性條件下由抗原解離之本發明之「隨著pH條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」，在解離抗原之後藉由FcRn回收至血漿中時可再度與抗原結合。亦即，1分子之該抗原結合分子可與複數個抗原重複地結合。又，結合於抗原結合分子之抗原不會因在內體內解離而回收至血漿中，因此會促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入，藉由抗原結合分子之投與會促進抗原的消失，可使血漿中之抗原濃度降低。
藉由對在血漿中之高鈣濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內之低鈣濃度條件下由抗原解離之本發明之「隨著鈣離子濃度之條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」賦予在血漿中之高鈣濃度條件下對FcRn之結 合，會促進該抗原結合分子與抗原之複合體對細胞內之攝入。亦即，藉由該抗原結合分子之投與，會促進抗原由血漿中消失，可使血漿中之抗原濃度降低。
又，藉由對在血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之pH酸性條件下由抗原解離之本發明之「隨著pH條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」賦予在血漿中之pH中性區域條件下對FcRn之結合，會促進該抗原結合分子與抗原之複合體對細胞內之攝入。亦即，藉由該抗原結合分子之投與，會促進抗原由血漿中消失，可使血漿中之抗原濃度降低。
包含通常之Fc區域的抗體在血漿中之pH中性區域條件下不具有對FcRn之結合活性，因此通常之抗體及抗體-抗原複合體係藉由非特異性內吞作用被攝入於細胞中、且在內體內之pH酸性區域條件下與FcRn結合藉以輸送至細胞表面。FcRn係將抗體由內體內輸送至細胞表面，因此可認為FcRn之一部分亦存在於細胞表面，但在細胞表面之pH中性區域條件下，抗體由FcRn解離，因此抗體係被回收到血漿中。
考慮前述之包含FcRn結合結構域之Fc區域之抗體在生體內之動態時，於血漿中之高鈣濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內之低鈣濃度條件下由抗原解離之本發明之「隨著鈣離子濃度之條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」在血漿中會與抗原結合，且在內體內結合的抗原會解離，因此抗原之消失速度可認為會變得與非 特異性內吞作用所致之對細胞的攝入速度相等。抗原結合分子對抗原結合之鈣離子濃度依存性不充分時，不於內體內解離之抗原會被回收到血漿中，抗原結合分子對抗原結合之鈣離子濃度依存性充分時，抗原之消失速度之非特異性內吞作用所致之對細胞的攝入係變成速率決定步驟。
又，於血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之pH酸性條件下由抗原解離之本發明之「隨著pH條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子」，在血漿中與抗原，且在內體內結合的抗原會解離，因此抗原之消失速度可認為會變得與非特異性內吞作用所致之對細胞的攝入速度相等。抗原結合分子對抗原結合之pH依存性不充分時，不於內體內解離之抗原會被回收到血漿中，抗原結合分子對抗原結合之pH依存性充分時，抗原之消失速度之非特異性內吞作用所致之對細胞的攝入係變成速率決定步驟。
因而，藉由對包含FcRn結合結構域之抗原結合分子賦予pH中性區域中對FcRn之結合能力，藉合於存在細胞表面之FcRn的該抗原結合分子，係FcRn依存性地被攝入於細胞中。透過FcRn之對細胞的攝入速度，係比非特異性地內吞作用所致之對細胞之攝入速度快，因此藉由賦予對pH中性區域中之FcRn的結合能力，能夠使抗原由血漿中之消失速度變得更快。亦即，於pH中性區域具有對FcRn之結合能力的抗原結合分子，相較於包含通常之(血漿中之pH中性區域條件下不具有對FcRn之結合活性 之)Fc區域的抗原結合分子會更快地將抗原送入細胞內，於內體內解離抗原，再度回收至細胞表面或血漿中，於該處再度與抗原結合，或透過FcRn被攝入細胞內。藉由提高pH中性區域中對FcRn之結合能力，可使此循環之循環速度增快，因此使抗原由血漿中消失之速度會增快。進一步地，藉由使抗原結合分子在pH酸性區域之抗原結合活性變得比在pH中性區域的抗原結合活性更低，可更提高其效率。又，可認為藉由使1分子之抗原結合分子之此循環數增多，可藉由1分子之抗原結合分子而結合之抗原數亦增多。
本發明之抗原結合分子，因為係由抗原結合結構域與FcRn(特別是人類FcRn)結合結構域所構成，FcRn結合結構域對與抗原結合不會帶來影響，又，由上述機制來考慮，與抗原種類無關地，可認為藉由使抗原結合分子在低鈣離子濃度條件下之抗原結合活性(結合能力)變得比高鈣離子濃度條件下之抗原結合活性低、及/或使於血漿中之pH中性區域中對FcRn之結合活性增大，可促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入，使抗原之消失速度增快。
又，本發明之抗原結合分子，因為係由抗原結合結構域與FcRn結合結構域所構成，FcRn結合結構域對與抗原結合不會帶來影響，又，由上述機制來考慮，與抗原種類無關地，可認為藉由使抗原結合分子在pH酸性區域之條件下的抗原結合活性(結合能力)變得比pH中性區域之條 件下的抗原結合活性低、及/或使於血漿中之pH中性區域中對FcRn之結合活性增大，可促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入，使抗原之消失速度增快。
抗體恆定區域等之FcRn結合結構域對FcRn的結合活性，如前述結合活性之項目中敘述過的，可藉由所屬技術領域中具有通常知識者所公知之方法來測定，對於pH以外之條件，可由所屬技術領域中具有通常知識者適當地決定。抗原結合分子之抗原結合活性與人類FcRn結合活性，能夠以KD(Dissociation constant：解離常數)、表觀KD(Apparent dissociation constant：表觀解離常數)、解離速度之kd(Dissociation rate：解離速度)、或表觀kd(Apparent dissociation：表觀解離速度)等來評估。該等可藉由所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法來測定。例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯克加圖、流式細胞儀等。
測定抗體恆定區域等之FcRn結合結構域對人類FcRn的結合活性時之pH以外的條件可由所屬技術領域中具有通常知識者適當地選擇，並無特殊限定。例如，可於如WO2009125825記載之MES緩衝液、37℃之條件下測定。又，抗體恆定區域等之FcRn結合結構域對人類FcRn的結合活性之測定可藉由所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法來進行，例如，可使用Biacore(GE Healthcare)等來測定。抗體恆定區域等之FcRn結合結構域與人類FcRn之結合活性的測定，可藉由將FcRn結合結構域或包含FcRn結合結構域之本發明之抗原結合分子加入經固定化 之晶片，分別將人類FcRn或包含FcRn結合結構域或FcRn結合結構域之本發明之抗原結合分子作為待分析物(analyte)而流動來評估。
抗體恆定區域等之FcRn結合結構域或包含FcRn結合結構域之抗原結合分子與FcRn之具有結合活性的條件之pH中性區域，通常意指pH6.7~pH10.0。pH中性區域較佳為藉由pH7.0~pH8.0之任意pH值所示範圍；更佳為由pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0中選擇；特佳為接近體內(in vivo)之血漿中(血中)之pH的pH7.4。於pH7.4下人類FcRn結合結構域與人類FcRn之結合親和性低因而難以評估其結合親和性的情況時，可使用pH7.0來取代pH7.4。本發明中，人類FcRn結合結構域或包含人類FcRn結合結構域之抗原結合分子與FcRn之具有結合活性的條件之pH酸性區域，通常意指pH4.0~pH6.5。較佳為意指pH5.5~pH6.5；特佳為意指接近體內(in vivo)之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。關於測定條件所使用之溫度，人類FcRn結合結構域或包含人類FcRn結合結構域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性，可在10℃~50℃之任意溫度評估。較佳為，為了決定人類FcRn結合結構域或包含人類FcRn結合結構域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性，而使用15℃~40℃之溫度。更佳為，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃之任一者之由20℃至35℃的任意溫度亦同樣可使用於決定人類FcRn結 合結構域或包含人類FcRn結合結構域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性。25℃之溫度為本發明之態樣的非限定的一例。
依照The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671，天然型人類IgG1之人類FcRn結合活性，在pH酸性區域(pH6.0)為KD 1.7μM，在pH中性區域中，幾乎無法檢測活性。因而，在較佳態樣中，可篩選包含pH酸性區域中人類FcRn結合活性為KD 20μM或比其強，pH中性區域中人類FcRn結合活性係與天然型人類IgG同等或比其強之抗原結合分子之在pH酸性區域及pH中性區域具有人類FcRn結合活性之本發明之抗原結合分子。在更佳態樣中，可篩選pH酸性區域中人類FcRn結合活性為KD 2.0μM或比其強，pH中性區域中人類FcRn結合活性為KD 40μM或比其強之抗原結合分子。在又更佳態樣中，可篩選pH酸性區域中人類FcRn結合活性為KD 0.5μM或比其強，pH中性區域中人類FcRn結合活性為KD 15μM或比其強之抗原結合分子。上述KD值係藉由The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定於晶片，將人類FcRn作為待分析物流動)來決定。
本發明中，較佳為在pH酸性區域及pH中性區域中具有人類FcRn結合活性之FcRn結合結構域。該結構域只要係預先於pH酸性區域及pH中性區域具有人類FcRn結合活性之FcRn結合結構域，則可直接使用。該結構域在 pH酸性區域及/或pH中性區域不具有人類FcRn結合活性或者為弱的情況時，藉由改變抗原結合分子中之胺基酸，可取得具有對所期望之人類FcRn之結合活性之FcRn結合結構域，藉由改變人類FcRn結合結構域中之胺基酸亦可適合地取得具有pH酸性區域及/或pH中性區域中具有對所期望之人類FcRn之結合活性的FcRn結合結構域。又，藉由預先改變於pH酸性區域及/或pH中性區域中具有人類FcRn結合活性之FcRn結合結構域中的胺基酸，亦可取得具有對所期望之人類FcRn之結合活性的FcRn結合結構域。帶來如此之所期望之結合活性的人類FcRn結合結構域之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性區域及/或pH中性區域中之人類FcRn結合活性來發現。所屬技術領域中具有通常知識者可使用公知手法適當地實施胺基酸的改變。
本發明中，FcRn結合結構域之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，係包括改變為與起始FcRn結合結構域之胺基酸序列不同的胺基酸序列。起始FcRn結合結構域之修飾改變體只要在pH酸性區域及/或中性區域中可與人類FcRn結合(因此，起始FcRn結合結構域不一定非得在pH酸性區域及/或中性區域條件下對人類FcRn具有結合活性)，則任意FcRn結合結構域均可使用作為起始結構域。起始FcRn結合結構域之例子可適合列舉IgG抗體之恆定區域、亦即由序列編號：14至17之任一者表示之天然型之恆定區域。又，將已施加改變之FcRn結合結構域 作為起始FcRn結合結構域而施加進一步改變的改變FcRn結合結構域亦可適合作為本發明之改變FcRn結合結構域來使用。起始FcRn結合結構域，可意指多肽本身、包含起始FcRn結合結構域之組成物、或編碼起始FcRn結合結構域之胺基酸序列。起始FcRn結合結構域中可包含於抗體項目中已概說過之藉由重組所產生之公知IgG抗體的FcRn結合結構域。起始FcRn結合結構域之起源雖無限定，但可由非人類動物之任意生物或由人類中取得。較佳任意生物可適合列舉由小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔子、狗、山羊、羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類中選擇的生物。在別的態樣中，起始FcRn結合結構域亦可由食蟹獼猴、狨猿、恆河猴、黑猩猩、或人類中取得。較佳起始Fc區域為由人類IgG1中取得，但IgG並非限定為特定類型。此係意味著可將人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區域作為起始Fc區域來適當使用。作為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4 Fc區域者，Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中記載了基因多形所致複數的異型序列，本發明中亦可為其任意者。特別是作為人類IgG1之序列者，EU編號356-358號之胺基酸序列可為DEL亦可為EEM。同樣地，本說明書中，意味著可將前述任意生物中之IgG的任意類型或次類型之FcRn結合結構域較佳作為起始FcRn結合結構域來使用。天然存在之IgG變異型或經操作之型的例子，雖記載於公知文獻 (Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、及WO2006105338)，但不限定於該等。
為了對包含FcRn(特別是人類FcRn)結合結構域之抗原結合分子賦予pH中性區域中之對FcRn(特別是人類FcRn)之結合能力，可於與FcRn之結合相關的FcRn結合結構域中之胺基酸中添加適當變異。使用抗體IgG分子之恆定區域作為FcRn結合結構域的情況時，可列舉例如，EU編號表示之221位~225位、227位、228位、230位、232位、233~241位、243~252位、254~260位、262~272位、274位、276位、278~289位、291~312位、315~320位、324位、325位、327~339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375~378位、380位、382位、385~387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426~438位、440位及442位之位置的胺基酸改變為與天然型IgG恆定區域相當之胺基酸所不同的恆定區域。更具體而言，可列舉例如EU編號表示之256位胺基酸為Pro、280位胺基酸為Lys、339位胺基酸為Thr、385位胺基酸為His、428位胺基酸為Leu、及/或434位胺基酸為Trp、Tyr、Phe、Ala或His之任一者的恆定區域改變體。藉由使用該等改變體，可使IgG型免疫球蛋白之Fc區域在pH中性區域中對人類FcRn的結合活性增強。
又，亦可適當使用能夠使pH酸性區域中對人類FcRn之結合變得比天然型IgG之恆定區域強之改變體。該等改變體當中，可適當選擇即使於pH中性區域亦可使對人類FcRn之結合增強的改變體，可使用於本發明。作為如此之例子，可列舉恆定區域中以EU編號表示之胺基酸改變為與天然型IgG恆定區域相當之胺基酸所不同的恆定區域。作為如此之胺基酸的改變例，可適合使用包含表1所列舉之胺基酸之恆定區域的改變體。
作為特佳之胺基酸的改變，可列舉例如以EU編號237位、238位、239位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位及436位表示之胺基酸取代為與天然型IgG恆定區域相當之胺基酸所不同的胺基酸之改變。藉由將由該等胺基酸中選擇之至少1個胺基酸改變為其他胺基酸，可使FcRn結合結構域在pH中性區域中對人類FcRn的結合活性增高。
作為特佳之改變，可適合列舉例如，天然型IgG之恆定區域之以EU編號表示之237位胺基酸為Met、238位胺基酸為Ala、239位胺基酸為Lys、248位胺基酸為Ile、250位胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr之任一者、252位胺基酸為Phe、Trp、或Tyr之任一者、254位胺基酸為Thr、255位胺基酸為Glu、256位胺基酸為Asp、Glu、或Gln之任一者、 257位胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val之任一者、258位胺基酸為His、265位胺基酸為Ala、270位胺基酸為Phe、286位胺基酸為Ala或Glu之任一者、289位胺基酸為His、297位胺基酸為Ala、298位胺基酸為Gly、303位胺基酸為Ala、305位胺基酸為Ala、307位胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr之任一者、308位胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr之任一者、309位胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg之任一者、311位胺基酸為Ala、His、或Ile之任一者、312位胺基酸為Ala或His之任一者、314位胺基酸為Lys或Arg之任一者、315位胺基酸為Ala或His之任一者、317位胺基酸為Ala、325位胺基酸為Gly、332位胺基酸為Val、 334位胺基酸為Leu、360位胺基酸為His、376位胺基酸為Ala、380位胺基酸為Ala、382位胺基酸為Ala、384位胺基酸為Ala、385位胺基酸為Asp或His之任一者、386位胺基酸為Pro、387位胺基酸為Glu、389位胺基酸為Ala或Ser之任一者、424位胺基酸為Ala、428位胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr之任一者、433位胺基酸為Lys、434位胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr之任一者、及436位胺基酸為His之改變。又，被改變之胺基酸數目並無特殊限定，可僅改變1處之胺基酸、亦可改變2處以上之胺基酸。2處以上胺基酸之改變的組合，可列舉例如表2記載之組合。
作為改變的例子，係包含一個以上之變異、例如，包含取代為與起始Fc區域之胺基酸不同的胺基酸殘基之變異、或由對起始Fc區域之胺基酸插入一個以上胺基酸殘基或由起始Fc區域之胺基酸缺失一個以上之胺基酸等。較佳為，包含於改變後之Fc區域的胺基酸序列中包含天然不產生之Fc區域的至少一部分的胺基酸序列。如此之變種必然具有與起始Fc區域低於100%之序列同一性或類似性。在較佳之實施形態中，變種係具有與起始Fc區域之胺基酸序列低於約75%~100%之胺基酸序列同一性或類似性、更佳為低於約80%~100%、又更佳為低於85%~100%、又更佳為低於約90%~100%、最佳為具有低於約95%~100%之同一性或類似性之胺基酸序列。在本發明之 非限定的其一態樣中，起始Fc區域及本發明之經改變之Fc區域之間至少具有1個胺基酸的差。起始Fc區域與改變Fc區域之胺基酸的不同，藉由特別於以前述EU編號特定之胺基酸殘基位置的特定之胺基酸的不同亦可適合地來特定。
為了改變Fc區域之胺基酸，可適當採用部位特異性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等之公知方法。又，作為取代為天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸改變方法，亦可採用複數之公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，含有非天然胺基酸與終止密碼子之一的UAG密碼子(琥珀密碼子)之互補的琥珀抑制子tRNA結合的tRNA之無細胞轉譯系統(Clover Direct(Protein Express))等亦可適合使用。
具有編碼如前述之施加胺基酸變異的FcRn結合結構域之改變體之聚核苷酸、與編碼隨著如前述之經選擇的條件其結合活性會變化之抗原結合分子分子的聚核苷酸連結為同一讀框之重鏈的編碼抗原結合分子之聚核苷酸，亦作為本發明之改變體的其一態樣被製造。
藉由本發明，提供了包含了由經導入與編碼FcRn結合結構域之聚核苷酸連結為同一讀框且與由本發明之病毒中單離之聚核苷酸連結為能夠作用之載體的細胞培養液中回收抗原結合分子的抗原結合分子之製造方法。又，亦提 供包含了由經導入與編碼於載體中預先連結為能夠作用之FcRn結合結構域之聚核苷酸連結為同一讀框且與由本發明之病毒中單離之聚核苷酸連結為能夠作用之載體的細胞培養液中回收抗原結合分子的抗原結合分子之製造方法。
醫藥組成物
本發明不拘束於特定理論，例如，使在pH酸性區域對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下對抗原的結合活性低的方式，將包含隨著離子濃度條件不同對抗原的結合活性會變化之抗原結合結構域及附加地在pH中性區域條件下具有對人類FcRn之結合活性的抗體恆定區域等之FcRn結合結構域的抗原結合分子投與至生體時促進對生體中之細胞之攝入，藉以使1分子的抗原結合分子能夠結合之抗原數目會增加的理由、及血漿中抗原濃度之消失被促進的理由，可為例如以下所說明者。
例如，將抗原結合分子結合於膜抗原之抗體對生體內投與時，該抗體與抗原結合後，藉由在與抗原結合的狀態下與抗原一起內化(internalization)而被攝入細胞內之內體。之後，在與抗原結合的狀態下移動至溶體之抗體，係與抗原一起藉由溶體而被分解。透過內化而由血漿中之消失，係被稱為抗原依存性消失，於多數抗體分子中有被報導(Drug Discov Today(2006)11(1-2),81-88)。1分子之IgG抗體以2價結合至抗原時，係在1分子抗體結合至2分子抗原的狀態下被內化，以該狀態下於溶體被分解。因 此，通常之抗體的情況時，1分子IgG抗體無法與3分子以上之抗原結合。例如，具有中和活性之1分子的IgG抗體的情況時，無法中和3分子以上之抗原。
IgG分子之血漿中滯留性較長(消失慢)，係因為已知作為IgG分子之補救受體的人類FcRn發揮功能。藉由胞飲作用被攝入於內體的IgG分子，係與內體內之酸性條件下表現於內體內之人類FcRn結合。無法與人類FcRn結合之IgG分子會在之後移動的溶體內被分解。另一方面，結合於人類FcRn之IgG分子係移動至細胞表面。在血漿中之中性條件下，IgG分子會由人類FcRn解離，因此該IgG分子會再度被回收至血漿中。
又抗原結合分子為與可溶型抗原結合之抗體的情況時，對生體內投與之抗體係與抗原結合，之後抗體係在與抗原結合的狀態下被攝入細胞內。被攝入細胞內之抗體大多於內體內與FcRn結合後移動至細胞表面。血漿中之中性條件下，抗體會由人類FcRn解離，故被放出至細胞外。但是，包含隨著pH等離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性不變之通常的抗原結合結構域之抗體，係在與抗原結合的狀態下被放出至細胞外，因此無法再度與抗原結合。因此，與結合於膜抗原之抗體同樣地，隨著pH等離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性不變之通常的1分子IgG抗體，無法與3分子以上之抗原結合。
於血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之pH酸性區域條件下由抗原解離之pH依存性 地對抗原結合之抗體(於pH中性區域條件下對抗原結合、於pH酸性區域條件下解離的抗體)或於血漿中之高鈣離子濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內脂低鈣離子濃度條件下由抗原解離之鈣離子濃度依存性地對抗原結合之抗體(於高鈣離子濃度條件下對抗原結合、於低鈣離子濃度條件下解離的抗體)可在內體內由抗原解離。pH依存性地對抗原結合的抗體或鈣離子濃度依存性地對抗原結合的抗體，在解離抗原後藉由FcRn而被回收至血漿中時，可再度與抗原結合。因此一分子之抗體能夠與複數個抗原分子重複地結合。又，與抗原結合分子結合之抗原藉由在內體內自抗體解離，不回收至血漿中而在溶體內被分解。藉由將如此之抗原結合分子對生體投與，可促進抗原對細胞內之攝入、且使血漿中之抗原濃度降低。
藉由對於血漿中之pH中性區域條件下對抗原強力結合、且在內體內之pH酸性區域條件下由抗原解離之pH依存性地對抗原結合之抗體(於pH中性區域條件下對抗原結合、於pH酸性區域條件下解離的抗體)或於血漿中之高鈣離子濃度條件下對抗原強力結合、且在內體內脂低鈣離子濃度條件下由抗原解離之鈣離子濃度依存性地對抗原結合之抗體(於高鈣離子濃度條件下對抗原結合、於低鈣離子濃度條件下解離的抗體)，賦予在pH中性區域條件下(pH7.4)對人類FcRn的結合能力，會進一步促進抗原結合分子所結合的抗原對細胞內之攝入。亦即，藉由將如此之抗原結合分子對生體投與，可促進抗原的消失、且使血漿 中之抗原濃度降低。不具有pH依存性地對抗原的結合能力、或鈣離子濃度依存性地對抗原的結合能力之通常的抗體及其抗體-抗原複合體，藉由非特異性內吞作用而被攝入細胞中，藉由在內體內之酸性條件下與FcRn結合而被輸送至細胞表面，藉由在細胞表面之中性條件下由FcRn解離而被回收至血漿中。因此，充分對pH依存性地對抗原結合(在pH中性區域條件下結合、在pH酸性區域條件下解離)、或充分對鈣離子濃度依存性地對抗原結合(在高鈣離子濃度條件下結合、在低鈣離子濃度條件下解離)之抗體在血漿中與抗原結合、在內體內，使結合之抗原解離時，可認為抗原之消失速度變得與非特異性內吞作用所致之抗體及其抗體-抗原複合體對細胞之攝入速度相等。抗體與抗原間之結合的pH依存性或鈣離子濃度依存性不充分時，於內體內不自抗體解離之抗原亦與抗體一起被回收至血漿中、pH依存性充分時，關於抗原之消失速度，非特異性內吞作用所致之對細胞的攝入速度係成為速率決定步驟。又，FcRn係將抗體由內體內輸送至細胞表面，因此可認為FcRn之一部分亦存在於細胞表面。
通常、抗原結合分子之其一態樣之IgG型免疫球蛋白，幾乎沒有在pH中性區域中對FcRn的結合活性。本發明者等人認為，在pH中性區域中具有對FcRn的結合活性之IgG型免疫球蛋白，可與存在於細胞表面之FcRn，藉由與存在於細胞表面之FcRn結合，該IgG型免疫球蛋白係FcRn依存性地被攝入細胞中。透過FcRn對細胞之攝入 速度，比非特異性內吞作用所致對細胞之攝入速度更快。因此，藉由賦予在pH中性區域中對FcRn之結合能力，可認為能夠使抗原結合分子所致之抗原的消失速度進一步增快。亦即，在pH中性區域中具有對FcRn的結合能力之抗原結合分子，相較於通常(天然型人類)之IgG型免疫球蛋白，係更快地將抗原送入細胞內，於內體內使抗原解離、再度回收於細胞表面或血漿中，於該處再度與抗原結合，或透過FcRn被攝入細胞內。藉由使pH中性區域中對FcRn的結合能力提高，可使此循環之循環速度變快，因此使抗原由血漿中消失的速度增快。進一步地，藉由將抗原結合分子在pH酸性區域對抗原的結合活性變得比在pH中性區域對抗原的結合活性更低，可進一步使抗原由血漿中消失的速度增快。又，因為使此循環之循環速度變快，結果產生之其循環數目增大，可認為1分子之抗原結合分子所能夠結合之抗原的分子數亦變多。本發明之抗原結合分子，因為係由抗原結合結構域與FcRn結合結構域所構成，FcRn結合結構域對與抗原結合不會帶來影響，又，由上述機制來考慮，與抗原種類無關地，可認為藉由使抗原結合分子在pH酸性區域或低鈣離子濃度條件等之離子濃度下之抗原結合活性(結合能力)變得比pH中性區域或高鈣離子濃度條件等之離子濃度下之抗原結合活性(結合能力)低、及/或使於血漿中之pH中對FcRn之結合活性增大，可促進抗原結合分子所致之抗原對細胞內之攝入，使抗原之消失速度增快。因而本發明之抗原結合分子，可認 為就抗原所帶來之副作用降低、抗體之投與量上昇、抗體之生體內動態的改善等方面，係發揮比習知之治療用抗體更優良的效果。
亦即，本發明係關於本發明之抗原結合分子、藉由本發明之篩選方法而單離之抗原結合分子、或包含藉由本發明之製造方法所製造之抗原結合分子的醫藥組成物。本發明之抗原結合分子或藉由本發明之製造方法所製造之抗原結合分子，藉由其投與，相較於通常之抗原結合分子，使血漿中之抗原濃度降低的作用高，故有用於作為醫藥組成物。本發明之醫藥組成物中可包含醫藥上容許的載劑。
本發明之醫藥組成物，通常係指用於疾病之治療或預防、或檢査/診斷之藥劑。
本發明之醫藥組成物，可使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法予以製劑化。例如，能夠以與水或其以外之藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸濁液劑之注射劑的形式非經口地使用。例如，藥理學上容許的載劑或媒介，具體而言，可與滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸濁劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、媒介物(vehicle)、防腐劑、結合劑等適當組合，藉由以一般所認可的製藥實施上被要求之單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，係設定為可得到所指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組成物可使用如注射用蒸餾水之媒介物，遵照通常之製劑實施來處方。作為注射用之水溶液 者，可列舉例如包含生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。可併用適當的溶解輔助劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液可列舉芝麻油、大豆油，作為溶解輔助劑亦可併用安息香苄酯及/或苄醇。又，可摻合緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、無痛化劑(例如，鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如，苄醇及酚)、抗氧化劑。調製之注射液通常係填充於適當的安瓿。
本發明之醫藥組成物，較佳為藉由非經口投與來投與。例如係投與注射劑型、經鼻投與劑型、經肺投與劑型、經皮投與型之組成物。例如，可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等來全身或局部地投與。
投與方法可隨患者之年齡、症狀來適當選擇。含有抗原結合分子之醫藥組成物的投與量，例如，可設定為每一次體重每1 kg為0.0001 mg至1000 mg之範圍。或例如，可設定為每名患者0.001~100000 mg之投與量，但本發明並非必然限定於該等數值。投與量及投與方法，係隨著患者之體重、年齡、症狀等而變動，只要係所屬技術領域中具有通常知識者即可考慮該等條件來設定適當投與量及投與方法。
再者，本發明記載之胺基酸序列中所含之胺基酸亦有 接受轉譯後修飾(例如，N末端之麩醯胺的焦麩胺醯化所致對焦麩胺酸之修飾為所屬技術領域中具有通常知識者所眾所周知之修飾)的情況，如此之胺基酸經轉譯後修飾的情況亦當然包含於本發明記載之胺基酸序列。
再者本說明書中引用之全部先前技術文獻，係作為參照而編入本說明書中。
本說明書中使用時，以「包含(包括、含有)．．．(comprising)」之表現方式所表示的態樣，係包括「本質上由．．．所構成(essentially consisting of)」之表現方式所表示的態樣、以及「由．．．所構成(consisting of)」之表現方式所表示的態樣。
[實施例]
以下藉由實施例具體說明本發明，但本發明不被該等實施例所限制。
[實施例1]pH依存的結合抗體庫之設計 (1-1)pH依存性結合抗體之取得方法
WO2009125825揭示了藉由於抗原結合分子中導入組胺酸，於pH中性區域與pH酸性區域性質會變化之pH依存性地對抗原結合的抗體。所揭示之pH依存性結合抗體，係藉由將所期望之抗原結合分子之胺基酸序列的一部分取代為組胺酸之改變而取得。為了在不預先得到改變之對象的抗原結合分子之下，更有效率地取得pH依存性結 合抗體，可考慮由將組胺酸導入於可變區域(更佳為可能與抗原結合相關之位置)的抗原結合分子集團(稱為His庫)取得與所期望之抗原結合之抗原結合分子。由His庫得到之抗原結合分子相較於通常之抗體庫，組胺酸係更高頻率地出現，因此認為能夠有效率地取得具有所期望之性質的抗原結合分子。
(1-2)設計經導入組胺酸殘基於可變區域之抗體分子集團(His庫)，以能夠有效率地取得pH依存性地對抗原結合之結合抗體
首先，選擇於His庫導入組胺酸之位置。WO2009125825中揭示了藉由將IL-6受體抗體、IL-6抗體及IL-31受體抗體之序列中的胺基酸殘基取代為組胺酸，來製造pH依存性地對抗原結合的抗體。進一步地，藉由將抗原結合分子之胺基酸序列取代為組胺酸，可製造具有pH依存性抗原結合能力之抗蛋白溶菌酶抗體(FEBS Letter 11483,309,1,85-88)及抗鐵調素(hepcidin)抗體(WO2009139822)。於IL-6受體抗體、IL-6抗體、IL-31受體抗體、蛋白溶菌酶抗體及鐵調素抗體導入組胺酸之位置係表示於表3。表3所示位置，可列舉為能夠控制抗原與抗體之結合的位置之候補。再者表3所示位置以外，與抗原接觸之可能性高的位置亦可被認為適合作為導入組胺酸之位置。
由重鏈可變區域與輕鏈可變區域所構成之His庫當中，重鏈可變區域係使用人類抗體序列、輕鏈可變區域中係導入組胺酸。作為以His庫導入組胺酸之位置，係選擇上述列舉之位置、與可能與抗原結合相關之位置，亦即輕鏈之30位、32位、50位、53位、91位、92位及93位(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。又，作為導入組胺酸之輕鏈可變區域的模板序列，係選擇Vk1序列。於模板序列出現複數之胺基酸而構成分子庫之抗原結合分子的多樣性會擴大。出現複數胺基酸之位置，係選擇露出於與抗原相互作用之可能性高的可變區域之表面的位置。具體而言，作為如此之柔性殘基，係選擇輕鏈之30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。
接著設定出現之胺基酸殘基的種類與其出現率。解析登錄於Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：‘Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)之hVk1與hVk3序列中的柔性殘基中胺基酸之出現頻率。根據解析結果，由於各位置出現頻率高之胺基酸選擇於His庫出現之胺基酸的種類。此時，亦選擇於解析結果中判定為出現頻率少的胺基酸以使胺基酸之性質不偏差。又，被選擇之胺基酸的出現頻率，係參考Kabat資料庫之解析結果來設定。
藉由考慮如以上方式設定之胺基酸及出現頻率，設計組胺酸於各CDR必定有1個而固定之His庫1與相較於His庫1更重視序列多樣性之His庫2以作為His庫。His庫1及His庫2之詳細設計係如表4及表5所示(各表中之位置表示Kabat編號)。又，表4及5所記載之胺基酸的出現頻率，以Kabat編號表示之92位為Asn(N)時，94位可將Ser(S)除外。
[實施例2]用以取得pH依存性地與抗原結合之抗體之人類抗體噬菌體展示分子庫(His庫1)的製造
以由人類PBMC製成之多A RNA、或市售之人類多A RNA等作為模板，以PCR法放大抗體重鏈可變區域之基因庫。將實施例1記載之作為His庫1所設計之抗體輕鏈可變區域的基因庫使用PCR法放大。如此方式製造之抗體重鏈可變區域的基因庫與抗體輕鏈可變區域之基因庫的組合係插入噬粒載體，構築展現由人類抗體序列所構成之Fab結構域的人類抗體噬菌體展示分子庫。構築方法係參考(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。上述分子庫構 築時，係使用連接噬粒之Fab與噬菌體pIII蛋白質之連結子部分、及輔助噬菌體pIII蛋白基因之N2結構域與CT結構域之間經插入胰蛋白酶切斷序列之噬菌體展示分子庫的序列。確認由經導入抗體基因庫之大腸菌單離之抗體基因部分的序列，得到132殖株之序列資訊。設計之胺基酸分布、與確認之序列中的胺基酸分布係如圖1所示。構築了包含對應於設計之胺基酸分布之多樣序列的分子庫。
[實施例3]pH依存性地與IL-6R結合之抗體的取得 (3-1)由珠篩選之分子庫取得pH依存性地與抗原結合之抗 體片段
由構築之His庫1的最初選拔，係藉由僅濃縮具有對抗原(IL-6R)之結合能力的抗體片段來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。藉由於噬菌體庫液中添加BSA及CaCl2，調製為終濃度4% BSA、1.2mM鈣離子。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS)洗淨3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)進一步洗淨2次。之後，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選，係以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標進行噬菌體之濃縮。具體而言，藉由於調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨複數次。之後以抗原結合能力為指標而濃縮時，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌 體溶液。以pH依存性抗原結合能力為指標而濃縮時，將添加0.1mL之50mM MES/1.2mM CaCl2/150mM NaCl(pH5.5)後之磁珠於室溫懸濁後、立即使用磁性架台將磁珠分離，藉由於回收之噬菌體溶液中添加100mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使對不展現Fab之噬菌體的大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標之篩選係重複2次。
(3-2)噬菌體ELISA之評估
遵習一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由藉由上述方法所得之大腸菌單一菌落，回收含有噬菌體之培養上清液。
將添加BSA及CaCl2使成為終濃度4%BSA及鈣離子濃度1.2 mM之含有噬菌體之培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST(含有0.1% Tween20之PBS)洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除 4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加以4% BSA及離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
以抗原結合能力為指標來濃縮時，對實施過2次篩選者實施噬菌體ELISA後，抗原特異性地ELISA陽性者在96殖株中為17殖株，因此解析經實施3次篩選者。另一方面，以pH依存性的抗原結合能力為指標來濃縮時，對實施過2次篩選者實施噬菌體ELISA後，ELISA陽性者在94殖株中為70殖株，因此解析經實施2次篩選者。
對經實施上述之噬菌體ELISA的殖株，係解析使用特異的引子放大之基因的鹼基序列。
噬菌體ELISA及序列解析之結果如以下表6所示。
藉由同樣方法，由天然人類抗體噬菌體展示分子庫，進行具有pH依存性抗原結合能力之抗體的取得。以抗原結合能力為指標來濃縮時，88殖株評估中取得了13種之pH依存性結合抗體。又，以pH依存性抗原結合能力為指標來濃縮時，83殖株評估中取得了27種之pH依存性結合抗體。
由以上結果，確認了相較於天然人類抗體噬菌體展示分子庫，His庫1所得之具有pH依存性抗原結合能力之殖株的變化較多。
(3-3)抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，判斷為具有pH依存性地對抗原的結合能力之殖株，係導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。調製之 質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(3-4)取得之抗體對人類IL-6受體之pH依存性結合能力的評估
為了判斷於(3-3)中取得之抗體6RpH#01(重鏈序列編號：18、輕鏈序列編號：19)、及6RpH#02(重鏈序列編號：20)、輕鏈序列編號：21)、及6RpH#03(重鏈序列編號：22)、輕鏈序列編號：23)對人類IL-6受體之結合活性是否為pH依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)來解析該等抗體與人類IL-6受體之相互作用。作為不具有對人類IL-6受體之pH依存性的結合活性之對照抗體，係使用tocilizumab(重鏈序列編號：24)、輕鏈序列編號：25)。作為中性區域pH及酸性區域pH之條件，分別於pH7.4及pH6.0之溶液中解析抗原抗體反應之相互作用。於以胺偶合法固定化適當量之protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，各捕捉目的抗體300RU左右。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在37℃實施。
在使用了對照抗體之tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體之抗原抗體反應之相互作用的解析時，藉由將IL-6受體之稀釋液與空白的跑動緩衝液以流速5μL/min注入3分鐘，使IL-6受體與被捕捉於感應晶片(sensor chip)上之tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體相互作用。之後，藉由將10 mMGlycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。
藉由前述方法所測定之pH7.4之表面電漿共振感應圖(sensorgram)係如圖2所示。又，以同樣方法取得之在pH6.0之條件下的表面電漿共振感應圖(sensorgram)係如圖3所示。
由前述結果，可觀察到6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體，藉由使緩衝液中之pH由pH7.4變為pH6.0，對IL6受體之結合能力大幅降低。
[實施例4]用於取得pH依存性地與抗原結合之抗體之人類抗體噬菌體展示分子庫(His庫2)之製造
藉由以自人類PBMC製成之多A RNA、或市售之人類多A RNA等作為模板，以PCR法放大抗體重鏈可變區域 之基因庫。如實施例1所記載般地，為了提高具有pH依存性抗原結合能力之抗體的出現頻率，設計了在抗體可變區域之輕鏈部分當中，經提高成為抗原接觸部位之可能性高之部位的組胺酸殘基出現頻率之抗體可變區域輕鏈部分。又，作為柔性殘基當中經導入組胺酸之殘基以外的胺基酸殘基，設計了由在天然人類抗體之胺基酸出現頻率的資訊所特定之出現頻率高的胺基酸呈均等分布之抗體輕鏈可變區域的分子庫。合成如上述方式設計之抗體輕鏈可變區域的基因庫。分子庫之合成亦可委託商業上受委託的公司等來製造。如此所製造之抗體重鏈可變區域之基因庫與抗體輕鏈可變區域之基因庫的組合係被插入噬粒載體，根據公知之方法(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)，構築展現由人類抗體序列所構成之Fab結構域之人類抗體噬菌體展示分子庫。根據實施例2所記載之方法，確認由經導入抗體基因庫之大腸菌中單離之抗體基因部分的序列。
[實施例5]pH依存性地與IL-6R結合之抗體的取得 (5-1)磁珠篩選之由分子庫中取得pH依存性地與抗原結合 之抗體片段
由經構築之His庫2的最初選拔，係藉由僅濃縮具有對抗原(IL-6受體)之結合能力的抗體片段來實施。
進行由保持有構築之噬菌體展示用噬粒的大腸菌中產生噬菌體。藉由將於經進行噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG藉以沈澱之噬菌體集團以TBS 稀釋而得到噬菌體庫液。接著，於噬菌體庫液添加作為阻斷劑之BSA或脫脂奶。篩選方法係參照一般方法之使用了固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原，使該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經阻斷劑阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1 mL之TBST洗淨3次後，以1 mL之TBS進一步洗淨2次。之後，將添加1 mg/mL之胰蛋白酶0.5 mL的磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液，添加於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738中。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將被感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自播種之大腸菌的培養液中回收噬菌體，以調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選中，以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標來進行噬菌體的濃縮。具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原， 使噬菌體庫在室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA或脫脂奶阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1 mL之TBST與TBS洗淨。之後，以抗原結合能力作為指標來濃縮的情況時，係將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。以pH依存性抗原結合能力作為指標來濃縮的情況時，係將經添加0.1 mL之50 mM MES/1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl(pH5.5)的磁珠在室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使對不展現Fab之噬菌體的大腸菌之感染能力喪失。將經回收之噬菌體添加於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738中。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將被感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。重複複數次之以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標之篩選。
(5-2)噬菌體ELISA之評估
遵習一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由藉由上述方法所得之大腸菌單一菌落，回收含有 噬菌體之培養上清液。
將添加BSA及CaCl2之含有噬菌體的培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)，將該盤於37℃靜置而培養30分鐘。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將於在各孔添加有經成為4% BSA及離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後，藉由450 nm之吸光度來測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，以判斷為具有pH依存性地對抗原之結合能力的抗體片段為模板，進行經特異引子放大之基因的鹼基序列解析。
(5-3)抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，判斷為具有pH依存性地對抗原之結合能力的殖株係被導入動物細胞表現用質體。抗體 之表現係使用以下方法來進行。來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)係懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計，測定純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(5-4)取得之抗體對人類IL-6受體之pH依存性結合能力的評估
為了判斷實施例5中取得之抗體對人類IL-6受體之結合活性是否為pH依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)來進行該等抗體與人類IL-6受體之相互作用解析。作為不具有對人類IL-6受體之pH依存性的結合活性之對照抗體，係使用tocilizumab(重鏈序列編號：24)、輕鏈序列編號：25)。作為中性區域pH及酸性區域pH之條件，分別於pH7.4及pH6.0之溶液中解析抗原抗體反應之相互作用。於以胺偶合法固定化適當量之protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，捕捉 目的抗體。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在37℃實施。
在使用了對照抗體之tocilizumab抗體、實施例5中取得之抗體的抗原抗體反應之相互作用的解析時，藉由注入IL-6受體之稀釋液與空白的跑動緩衝液，使IL-6受體與被捕捉於感應晶片上之抗體相互作用。之後，藉由將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。pH6.0之條件下的表面電漿共振感應圖(sensorgram)亦以同樣方法取得。
[實施例6]與鈣離子結合之人類生殖細胞系列序列的探索 (6-1)鈣依存性地與抗原結合之抗體
鈣依存性地與抗原結合之抗體(鈣依存性抗原結合之抗體)係隨著鈣濃度不同，與抗原之相互作用會變化的抗體。鈣依存性抗原結合之抗體，可認為是透過鈣離子與抗原結合，因此形成抗原側之抗原決定部位的胺基酸，係能夠鉗合鈣離子之負電荷胺基酸或成為氫結合接受體之胺基酸(圖4B)。由形成如此抗原決定部位之胺基酸性質，可鎖定藉由導入圖4A所示之組胺酸而製造之pH依存性地與抗原結合的結合分子以外之抗原決定部位。進一步地，如圖4C所示，藉由使用兼具鈣依存性及pH依存性地與抗原 結合之性質的抗原結合分子，可認為可製造能夠個別鎖定具有廣泛性質之多樣的抗原決定部位之抗原結合分子。因而，若構築包含鈣所結合之模式結構的分子集合(Ca庫)，由此分子集團取得抗原結合分子，則可認為能夠有效率地得到鈣依存性抗原結合之抗體。
(6-2)人類生殖細胞系列序列之取得
作為包含鈣所結合之模式結構的分子集合之例子，可考慮該分子為抗體的例子。換言之可考慮包含鈣所結合之模式結構的抗體庫為Ca庫的情況。
至今為止並未被報導包含人類生殖細胞系列序列之抗體且為鈣離子會結合者。因而，為了判定包含人類生殖細胞系列序列之抗體是否會與鈣離子結合，以由Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)所調製之cDNA作為模板，選殖包含人類生殖細胞系列序列之抗體的生殖細胞系列之序列。經選殖之DNA片段係被插入動物細胞表現載體。所得之表現載體的鹼基序列，係以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法決定，胺基酸序列之序列編號係如表7所示。編碼序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)以及序列編號：1(Vk5)之聚核苷酸藉由PCR法與編碼天然型Kappa鏈之恆定區域(序列編號：26)的聚核苷酸連結的DNA片段係接入動物細胞表現用載體。又，編碼序列編號：27(Vk1)、序列編號：28(Vk2)、序列編號：29(Vk3)以及序列編號：30(Vk4) 之重鏈可變區域聚核苷酸藉由PCR法與編碼序列編號：14之C末端2胺基酸缺失之IgG1的聚核苷酸連結的DNA片段係接入動物細胞表現用載體。所製造之改變體序列係以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法確認。再者，人類之Vk1亦有記載為hVk1、人類之Vk2亦有記載為hVk2、人類之Vk3亦有記載為hVk3、人類之Vk4亦有記載為hVk4者。
(6-3)抗體之表現與純化
將插入有包含所取得之5種人類生殖細胞系列序列的DNA片段之動物細胞表現載體導入動物細胞。抗體之表現係使用以下方法進行。來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)係懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3mL。調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。在CO2培養器(37度、8% CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化 抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(6-4)包含人類生殖細胞系列序列之抗體的鈣離子結合活性評估
評估經純化抗體之鈣離子結合活性。作為鈣離子對抗體結合之評估的指標，測定了示差掃描型熱量測定(DSC)之熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性之指標，藉由鈣離子之結合使蛋白質安定化時，熱變性中間溫度(Tm值)係比鈣離子未結合時高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。藉由評估因應抗體溶液中之鈣離子濃度變化之抗體Tm值的變化，評估鈣離子對抗體之結合活性。經純化之抗體係供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液為外液的透析(EasySEP、TOMY)處理。使用透析所用之溶液，以調製為大約0.1 mg/mL之抗體溶液作為被驗物質，由20℃至115℃，以240℃/hr之昇溫速度進行DSC測定。基於所得到之DSC的變性曲線而算出之各抗體之Fab結構域的熱變性中間溫度(Tm值)係如表8所示。
結果，包含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列之抗體的Fab結構域之Tm值，不隨包含該Fab結構域之溶液中的鈣離子濃度不同而變動。另一方面，包含hVk5序列之抗體之Fab結構域的Tm值，隨著包含該Fab結構域之抗體溶液中的鈣離子濃度不同而變動，故顯示hVk5序列係與鈣離子結合。
(6-5)hVk5-2序列之鈣結合評估
於實施例6之(6-2)中，在Vk5-2(使序列編號：26與序列編號：1融合者)之外，得到了分類為Vk5-2之Vk5-2變異型1(序列編號：2)及Vk5-2變異型2(序列編號：3)。對該等變異型亦進行了鈣結合評估。Vk5-2、Vk5-2變異型1及Vk5-2變異型2之DNA片段係分別被接入動物細胞用表現載體。以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法來決定所得表現載體之鹼基序列。分別接入有Vk5-2、Vk5-2變異型1及Vk5-2變異型2之DNA片段的動物細胞用表現載體，係與以表現CIM_H(序列編號：4)作為重鏈的方式接入的動物表現用載體一起藉由實施例6之(6- 3)中記載之方法導入動物細胞中，純化抗體。評估經純化之抗體的鈣離子結合活性。經純化之抗體係供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)之溶液(表9中表述為鈣離子濃度0mM)為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。使用透析所用之溶液，以調製為大約0.1 mg/mL之抗體溶液作為被驗物質，由20℃至115℃，以240℃/hr之昇溫速度進行DSC測定。基於所得到之DSC的變性曲線而算出之各抗體之Fab結構域的熱變性中間溫度(Tm值)係如表9所示。
結果，包含Vk5-2、Vk5-2變異型1及Vk5-2變異型2之序列的抗體之Fab結構域之Tm值，隨著包含該Fab結構域之抗體溶液中的鈣離子濃度不同而變動，故顯示具有分類為Vk5-2之序列的抗體係與鈣離子結合。
[實施例7]人類Vk5(hVk5)序列之評估 (7-1)hVk5序列
Kabat資料庫中，僅登錄有hVk5-2序列作為hVk5序列。以下係將hVk5與hVk5-2視為同意義。WO2010136598 中，記載了hVk5-2序列在生殖細胞系列序列中之存在比為0.4%。在其他報告中亦敘述hVk5-2序列在生殖細胞系列序列中之存在比為0~0.06%(J.Mol.Biol.(2000)296,57-86、Proc.Natl.Acad.Sci.(2009)106,48,20216-20221)。如上所述，hVk5-2序列係為在生殖細胞系列序列中出現頻率低之序列，因此可認為藉由對表現以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或人類抗體的小鼠誘發免疫所取得之B細胞中，取得與鈣結合之抗體，其效率不佳。因而，雖可考慮設計包含人類hVk5-2序列之Ca庫的可能性，但已報導之合成抗體庫(WO2010105256或WO2010136598)中不含hVk5序列。而且，hVk5-2序列之物性亦未被報導，其實現的可能性為未知。
(7-2)糖鏈非附加型hVk5-2序列之構築、表現及純化
hVk5-2序列係具有於20位(Kabat編號)胺基酸附加有N型糖鏈之序列。於蛋白質附加之糖鏈係存在異質性(heterogeneity)，因此由物質之均一性觀點來看，較期望不附加糖鏈。因而，製造了20位(Kabat編號)之Asn(N)殘基被取代為Thr(T)殘基之改變體hVk5-2_L65(序列編號：5)。胺基酸之取代係以使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)之所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法進行。編碼改變體hVk5-2_L65之DNA係接入動物表現用載體。所製造之改變體hVk5-2_L65經接入DNA之動物表現用載體，係與以表現CIM_H(序列編 號：4)作為重鏈的方式接入之動物表現用載體以實施例6記載之方法一起導入動物細胞中。包含於導入之動物細胞中表現的hVk5-2_L65及CIM_H之抗體，係以實施例6記載之方法純化。
(7-3)包含糖鏈非附加型hVk5-2序列之抗體的物性評估
使用離子交換層析，來分析包含經取得之改變序列hVk5-2_L65的抗體，相較於包含改變前原來的hVk5-2序列的抗體，其異質性是否減少。離子交換層析之方法示於表10。分析之結果，如圖5所示之糖鏈附加部位被改變的hVk5-2_L65，相較於原來的hVk5-2序列，顯示了異質性有減少。
接著，使用實施例6記載之方法，來評估包含異質性經減少之hVk5-2_L65序列的抗體是否與鈣離子結合。結果，如表11所示，包含糖鏈附加部位被改變之hVk5-2_L65之抗體的Fab結構域的Tm值，亦隨著抗體 溶液中鈣離子濃度之變化而變動。亦即，顯示鈣離子會與包含糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65之抗體的Fab結構域結合。
[實施例8]鈣離子對包含hVk5-2序列之CDR序列的抗體分子之結合活性的評估 (8-1)包含hVk5-2序列之CDR序列的改變抗體之製造、表現及純化
hVk5-2_L65序列為存在於人類Vk5-2序列之框架的糖鏈附加部位之胺基酸被改變的序列。於實施例7雖顯示即使改變糖鏈附加部位，鈣離子亦會結合，但框架序列由免疫原性之觀點來看，一般較佳為生殖細胞系列之序列。因而，探討了在維持鈣離子對該抗體之結合活性之下，將抗體之框架序列取代為不附加糖鏈之生殖細胞系列序列之框架序列是否可能。
將使編碼將化學合成之hVk5-2序列的框架序列改變為hVk1、hVk2、hVk3及hVk4序列之序列(分別為CaVk1(序列編號：31)、CaVk2(序列編號：32)、CaVk3(序列編號：33)、CaVk4(序列編號：34))的聚核苷酸藉由PCR法與編碼天然型Kappa鏈之恆定區域(序列編號：26)的聚核 苷酸連結之DNA片段，接入動物細胞表現用載體中。以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法確認所製造之改變體的序列。如上述方式製造之各質體，係與編碼CIM_H(序列編號：4)之聚核苷酸所接入的質體，以實施例6記載之方法一起導入動物細胞。由如上述方式導入之動物細胞的培養液中，純化所表現之所期望之抗體分子。
(8-2)包含hVk5-2序列之CDR序列的改變抗體之鈣離子結合活性評估
藉由實施例6記載之方法評估鈣離子是否會結合於包含hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的改變抗體。評估之結果如表12所示。顯示了各改變抗體之Fab結構域的Tm值，係隨著抗體溶液中之鈣離子濃度的變化而變動。因此，顯示了包含hVk5-2序列之框架序列以外之框架序列的抗體亦會與鈣離子結合。
進一步地，明顯得知以包含hVk5-2序列以外之生殖 細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的方式來改變之各抗體的Fab結構域之熱安定性指標即熱變性溫度(Tm值)，比包含改變前原來的hVk5-2序列之抗體的Fab結構域之Tm值更增加。由此結果，發現了包含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4之框架序列及hVk5-2序列之CDR序列的抗體，不只具有與鈣離子結合之性質，由熱安定性觀點亦為優良的分子。
[實施例9]存在於人類生殖細胞系列hVk5-2序列之鈣離子結合部位的鑑定 (9-1)hVk5-2序列之CDR序列中變異部位的設計
如實施例8所記載，顯示了包含hVk5-2序列之CDR部分被導入於其他生殖細胞系列之框架序列的輕鏈之抗體，亦會與鈣離子結合。由此結果，暗示了存在於hVk5-2之鈣離子結合部位，係存在於CDR中。與鈣離子結合、亦即鉗合鈣離子之胺基酸，可列舉負電荷之胺基酸或可成為氫結合之接受體之胺基酸。因而，評估了包含存在於hVk5-2序列之CDR序列中的Asp(D)殘基或Glu(E)殘基被取代為Ala(A)殘基之變異hVk5-2序列的抗體是否會與鈣離子結合。
(9-2)hVk5-2序列之Ala取代體的製造以及抗體的表現及純化
製造包含存在於hVk5-2序列之CDR序列中的Asp及 /或Glu殘基被改變為Ala殘基之輕鏈的抗體分子。如實施例7所記載，由未附加糖鏈之改變體hVk5-2_L65維持與鈣離子結合看來，就鈣離子結合性的觀點可認為與hVk5-2序列同等。本實施例中以hVk5-2_L65作為模板序列來進行胺基酸取代。所製造之改變體如表13所示。胺基酸之取代係藉由QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等之所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法來進行，構築胺基酸經取代之改變輕鏈的表現載體。
以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法來決定所得到之表現載體之鹼基序列。將所製造之改變輕鏈之表現載體與重鏈CIM_H(序列編號：4)之表現載體一起暫時性地(transiently)導入來自人類胎兒腎癌細胞之HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen)，藉以使抗體表現。由所得之培養上清液中，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法純化抗體。使用分光光度計來測定純化之抗體溶液在280 nm的吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(9-3)包含hVk5-2序列之Ala取代體的抗體之鈣離子結合活性評估
藉由實施例6記載之方法判定所得之純化抗體是否會與鈣離子結合。結果如表14所示。藉由將存在於hVk5-2序列之CDR序列中之Asp或Glu殘基取代為與鈣離子之結合或鉗合無關的Ala殘基，存在了隨著抗體溶液之鈣離子濃度變化，其Fab結構域之Tm值不會變動的抗體。顯示了隨著Ala取代而Tm值不變動的取代部位(32位及92位(Kabat編號))，對鈣離子與抗體的結合特別重要。
[實施例10]包含具有鈣離子結合模式結構之hVk1序列的抗體評估 (10-1)具有鈣離子結合模式結構之hVk1序列的製造以及抗體之表現及純化
由實施例9記載之Ala取代體與鈣之結合活性結果來看，顯示了hVk5-2序列之CDR序列中，Asp或Glu殘基對於鈣結合很重要。因而，評估了僅將30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基導入其他生殖細胞系列之可變區域序列，是否亦可與鈣離子結合。具體而言，製造了將人類生殖細胞系序列之hVk1序列的30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)殘基取代為hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基的改變體LfVk1_Ca(序列編號：43)。亦即，判定包含hVk5-2序列中之僅導入該等5殘基的hVk1序列之抗體是否可與鈣結合。改變體之製造係與實施例9同樣方式進行。將所得之包含輕鏈改變體LfVk1_Ca及輕鏈hVk1序列之LfVk1(序列編號：44)與重鏈CIM_H(序列編號：4)一起表現。抗體之表現及純化係以與實施例9同樣之方法實施。
(10-2)包含具有鈣離子結合模式結構之人類hVk1序列的抗體之鈣離子結合活性評估
以實施例6記載之方法判定如上述方式得到之純化抗體是否會與鈣離子結合。其結果示於表15。包含具有 hVk1序列之LfVk1的抗體之Fab結構域的Tm值不隨著抗體溶液中鈣濃度的變化而變動，另一方面，包含LfVk1_Ca之抗體序列的Tm值係隨著抗體溶液中鈣濃度之變化而變化1℃以上，由此顯示包含LfVk1_Ca之抗體會與鈣結合。由上述結果，顯示了鈣離子之結合，不一定必需要hVk5-2之CDR序列全部，僅有構築LfVk1_Ca序列時所導入之殘基亦已充分。
(10-3)分解抑制型LfVk1_Ca序列之構築、表現及純化
於實施例10之(10-1)製造了將人類生殖細胞系序列之hVk1序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)殘基取代為hVk5-2序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)殘基的改變體LfVk1_Ca(序列編號：43)，顯示鈣離子會結合。因而，雖可考慮設計包含LfVk1_Ca序列之Ca庫的可能性，但LfVk1_Ca序列之物性並未被報導，其實現可能性為未知。LfVk1_Ca序列，係於30位、31位及32位(Kabat編號)存在Asp，被報導在酸性條件下會分之Asp-Asp序列係存在於CDR1序列中(J.Pharm.Biomed.Anal.(2008)47(1),23-30)。由保存安定性之觀點而言，期望避免在酸性條件之分解。因而，製造 了將有分解可能性之Asp(D)殘基取代為Ala(A)殘基之改變體LfVk1_Ca1(序列編號：45)、LfVk1_Ca2(序列編號：46)及LfVk1_Ca3(序列編號：47)。胺基酸之取代係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法進行。將編碼改變體之DNA接入動物表現用載體。所製造之改變體之DNA被接入的動物表現用載體，係與以表現GC_H(序列編號：48)作為重鏈而接入的動物表現用載體，以實施例6記載之方法一起導入動物細胞中。在導入之動物細胞中表現的抗體，係以實施例6記載之方法純化。
(10-4)包含分解抑制型LfVk1_Ca序列之抗體的安定性評估
藉由熱加速後之各抗體異質性的比較，來評估於實施例10之(10-3)取得之抗體，是否相較於包含改變前原來的LfVk1_Ca序列之抗體，在pH6.0溶液中之分解得到抑制。將各抗體在20 mM Histidine-HCl、150 mM NaCl、pH6.0之溶液中以一晚4℃之條件透析。將經透析之抗體調製為0.5mg/mL，於5℃或50℃保存3日。將保存後之各抗體以實施例7記載之方法進行離子交換層析。分析之結果，顯示了如圖6所示之分解部位經改變的LfVk1_Ca1，比原來的LfVk1_Ca序列異質性更少，熱加速所致之分解係顯著被抑制。亦即，表示於存在於LfVk1_Ca序列中之30位的Asp(D)殘基顯示之分解，可藉由胺基酸改變而迴避。
(10-5)輕鏈30位Asp殘基分解抑制型LVk1_Ca序列之製造以及抗體的表現及純化
由實施例10之(10-4)記載之Ala取代體的分解抑制結果，顯示了LfVk1_Ca序列之CDR序列中30位(Kabat編號)之Asp(D)殘基在酸性條件分解，可藉由將30位(Kabat編號)取代為其他胺基酸(於(10-4)中，係取代為Ala(A)殘基)而抑制分解。因而，評估了將30位(Kabat編號)殘基取代為鈣離子可鉗合之殘基的代表之Ser(S)殘基之序列(稱為LfVk1_Ca6。序列編號：49)是否亦會抑制分解。改變體之製造係與實施例10同樣方式進行。將所得之輕鏈改變體LfVk1_Ca6及輕鏈LfVk1_Ca序列，與重鏈GC_H(序列編號：48)一起表現。抗體之表現及純化係與實施例10同樣之方法實施。
(10-5)輕鏈30位Asp殘基分解抑制型LVk1_Ca序列之評估
以於實施例10之(10-4)記載之方法來判定如上述方式所得之純化抗體在酸性條件下之保存安定性。結果，如圖7所示，顯示了包含LfVk1_Ca6序列之抗體，相較於包含原來之LfVk1_Ca序列之抗體，其分解更被抑制。
進一步地，以實施例6記載之方法來判定包含LfVk1_Ca序列之抗體及包含LfVk1_Ca6序列之抗體是否與鈣離子結合。其結果示於表16。包含LfVk1_Ca序列之抗體及包含分解抑制型之LfVk1_Ca6序列的抗體之Fab結 構域的Tm值，分別隨著抗體溶液中鈣濃度之變化而變化1℃以上。
[實施例11]為了能夠有效率地取得Ca濃度依存性地與抗原結合之結合抗體，設計鈣離子結合模式結構被導入可變區域之抗體分子集團(Ca庫)
作為鈣結合模式結構，可適合列舉例如hVk5-2序列或其CDR序列、進一步可列舉殘基經縮小範圍的30位、31位、32位、50位、92位(Kabat編號)。其他，與鈣結合之蛋白質所具有的EF hand模式結構(調鈣素等)或C型凝集素(ASGPR等)亦符合鈣結合模式結構。
Ca庫係由重鏈可變區域與輕鏈可變區域所構成。重鏈可變區域係使用人類抗體序列、輕鏈可變區域係導入鈣結合模式結構。作為經導入鈣結合模式結構之輕鏈可變區域的模板序列，係選擇hVk1序列。包含於hVk1序列導入鈣結合模式結構之一即hVk5-2之CDR序列的LfVk1_Ca序列之抗體，係如實施例10所示，顯示與鈣離子結合。於模板序列出現複數之胺基酸，擴大了構成分子庫之抗原結合分子的多樣性。出現複數之胺基酸的位置，係選擇與抗原之相互作用可能性高之露出於可變區域之表 面的位置。具體而言，作為如此之柔性殘基，係選擇30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號)。
接著，設定所出現之胺基酸殘基種類與其出現率。解析登錄於Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：‘Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)中之hVk1與hVk3序列中之柔性殘基中的胺基酸出現頻率。基於解析結果，由在各位置出現頻率高之胺基酸來選擇於Ca庫出現之胺基酸種類。此時，亦選擇於解析結果中判定為出現頻率少的胺基酸以使胺基酸之性質不偏差。又，被選擇之胺基酸的出現頻率，係參考Kabat資料庫之解析結果來設定。
藉由考慮如以上方式設定之胺基酸及出現頻率，作為Ca庫，設計包含鈣結合模式結構，且於該模式結構以外之各殘基包含複數之胺基酸之重視序列多樣性的Ca庫。於表17及18顯示Ca庫之詳細設計(各表中的位置表示Kabat編號)。又，表17及18記載之胺基酸出現頻率，Kabat編號表示之92位為Asn(N)時，94位可不為Ser(S)而為Leu(L)。
[實施例12]Ca庫之製造
以由人類PBMC製成之多A RNA、或市售之人類多A RNA等作為模板，以PCR法放大抗體重鏈可變區域之基因庫。關於抗體輕鏈可變區域部分，係如實施例11所記載，設計了維持鈣結合模式結構且可鈣濃度依存性地對抗原結合之抗體的出現頻率經提高之抗體可變區域輕鏈部分。又，作為柔性殘基當中經導入鈣結合模式結構之殘基以外的胺基酸殘基，參考於天然人類抗體中之胺基酸出現頻率的資訊((KABAT,E.A.ET AL.：‘Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)， 設計使於天然人類抗體序列中出現頻率高之胺基酸呈均等分布之抗體輕鏈可變區域的分子庫。如此方式製造之抗體重鏈可變區域之基因庫與抗體輕鏈可變區域之基因庫的組合係被插入噬粒載體，構築展現由人類抗體序列所構成之Fab結構域的人類抗體噬菌體展示分子庫(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。
根據實施例2記載之方法，確認了由經導入抗體基因庫之大腸菌中單離之抗體基因部分的序列。所得之290種殖株之序列的胺基酸分布、與設計之胺基酸分布係如圖8所示。
[實施例13]Ca庫中所含之分子的鈣離子結合活性評估 (13-1)Ca庫中所含之分子的鈣離子結合活性
如實施例7所示，顯示與鈣離子結合之hVk5-2序列為在生殖細胞系列序列中出現頻率低之序列，因此由以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或藉由對表現人類抗體之小鼠誘發免疫而取得之B細胞中，取得與鈣結合之抗體可認為是效率不佳的。因而，於實施例12中構築了Ca庫。評估於構築的Ca庫中是否存在顯示鈣結合的殖株。
(13-2)抗體之表現與純化
Ca庫中所含的殖株係被導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)係懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。將經調製之質體藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8% CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science (1995)4,2411-2423)。
(13-3)對取得之抗體的鈣離子結合評估
以實施例6記載之方法來判定如上述方式得到之純化抗體是否會與鈣離子結合。其結果示於表19。Ca庫中所含之複數的抗體之Fab結構域的Tm，係隨著鈣離子濃度而變動，顯示了含有與鈣離子結合之分子。
[實施例14]Ca依存性地與IL-6受體結合之抗體的取得 (14-1)磁珠篩選之由分子庫中取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由構築之Ca庫的最初選拔，係藉由僅濃縮具有對抗原(IL-6受體)之結合能力的抗體片段來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。接著，藉由於噬菌體庫液中添加BSA及CaCl2，調製為終濃度4%BSA、1.2mM鈣離子。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2之TBST)洗淨3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)進一步洗淨2次。之後，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，調製噬菌體庫液。
第2次之篩選中，係以抗原結合能力或Ca依存性結合能力為指標來進行噬菌體之濃縮。
具體而言，在以抗原結合能力為指標進行濃縮時，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST洗淨3 次、以1.2 mM CaCl2/TBS洗淨2次。之後，將添加1 mg/mL之胰蛋白酶0.5 mL的磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。
在以Ca依存性結合能力為指標進行濃縮時，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨。之後，將經添加0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(含有2 mM之EDTA的TBS)之磁珠於室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期 (OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。
(14-2)噬菌體ELISA之評估
遵習一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由藉由上述方法所得之大腸菌單一菌落，回收含有噬菌體之培養上清液。
將經添加BSA及CaCl2之含有噬菌體的培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，藉以使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後將添加藉由以離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
對經實施上述之噬菌體ELISA的殖株，使用特異性引子來進行經放大基因之鹼基序列解析。噬菌體ELISA、序列解析之結果如以下表20所示。
(14-3)抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，將判斷為具有Ca依存性地對抗原之結合能力的殖株導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得 之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(14-4)對所取得之抗體對人類IL-6受體之Ca依存性結合能力的評估
為了判斷於實施例14取得之抗體6RC1IgG_010(重鏈序列編號：72、輕鏈序列編號：73)、及6RC1IgG_012(重鏈序列編號：74、輕鏈序列編號：75)、及6RC1IgG_019(重鏈序列編號：76、輕鏈序列編號：77)對人類IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)來解析該等抗體與人類IL-6受體之相互作用。作為不具有對人類IL-6受體之Ca依存性的結合活性之對照抗體，係使用tocilizumab(重鏈序列編號：24)、輕鏈序列編號：25)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，分別於1.2 mM及3μM鈣離子濃度之溶液中進行相互作用解析。於以胺偶合法固定化適當量之protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，捕捉目的抗體。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μM CaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在37℃實施。
在使用了對照抗體之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之抗原抗 體反應之相互作用的解析時，藉由將IL-6受體之稀釋液與空白的跑動緩衝液以流速5μL/min注入3分鐘，使IL-6受體與被捕捉於感應晶片(sensor chip)上之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體相互作用。之後，藉由將10 mMGlycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。
藉由此方法測定之高鈣離子濃度中之表面電漿共振感應圖(sensorgram)，係如圖9所示。
低鈣離子濃度之條件下的tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體的表面電漿共振感應圖(sensorgram)，亦以同樣方法取得。低鈣離子濃度中之表面電漿共振感應圖(sensorgram)，係如圖10所示。
由上述結果，觀察到6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體，藉由使在緩衝液中之鈣離子濃度成為1.2mM至3μM，對IL6受體之結合能力會大幅降低。
[實施例15]由使用了噬菌體展示技術之人類抗體庫中取得Ca依存性地與IL-6受體結合之抗體 (15-1)天然人類抗體噬菌體展示分子庫之製造
以由人類PBMC製成之多A RNA、或市售之人類多A RNA等作為模板，遵照所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，構築由展現彼此相異之人類抗體序列的Fab結 構域之複數個噬菌體所構成之人類抗體噬菌體展示分子庫。
(15-2)磁珠篩選之由分子庫中取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由經構築之天然人類抗體噬菌體展示分子庫的最初選拔，係藉由僅濃縮具有對抗原(IL-6受體)之結合能力的抗體片段、或藉由以對Ca濃度依存性的抗原(IL-6受體)之結合能力作為指標之抗體片段的濃縮來實施。以對Ca濃度依存性的抗原(IL-6受體)之結合能力作為指標之抗體片段的濃縮，係藉由使用鉗合Ca離子之EDTA，在Ca離子存在下由與IL-6受體結合之噬菌體庫中溶出噬菌體來實施。作為抗原係使用經生物素標誌之IL-6受體。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。藉由於噬菌體庫液中添加BSA及CaCl2，調製為終濃度4% BSA、1.2mM鈣離子。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)洗淨1次。之後，濃縮具有對IL-6受體之結合能力的抗體片段時，藉由一般的方法之溶出；以對Ca濃度依存性的IL-6受體之結合能力作為指標來濃縮抗體片段時，係藉由由懸濁於2 mM EDTA/TBS(含有2mMEDTA之TBS)之磁珠中溶出，來回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株TG1。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選中，係以Ca依存性結合能力為指標進行噬菌體之濃縮。具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨。之後，將經添加0.1mL之2 mM EDTA/TBS的磁珠在室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。 將回收之噬菌體溶液添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株TG1。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標之篩選係重複複數次。
(15-3)噬菌體ELISA之評估
遵習一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由藉由上述方法所得之大腸菌單一菌落，回收含有噬菌體之培養上清液。
將添加BSA及CaCl2使成為終濃度4%BSA及鈣離子濃度1.2 mM之含有噬菌體之培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後將經添加藉由終濃度4%之BSA及1.2 mM之離子化鈣濃度之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST 洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，進行以判斷為具有對Ca依存性的抗原之結合能力的抗體片段作為模板而以特異性引子放大之基因的鹼基序列解析。
(15-4)抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，將判斷為具有對Ca依存性的抗原具有結合能力之殖株導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
[實施例16]所取得之抗體對人類IL-6受體之Ca依存性結 合能力之評估
為了判斷實施例15中取得之抗體6RL#9-IgG1(重鏈(使來自IgG1之恆定區域與序列編號：78、序列編號：10連結之序列)、輕鏈序列編號：79)、及FH4-IgG1(重鏈序列編號：80、輕鏈序列編號：81)對人類IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)，來進行該等抗體與人類IL-6受體之抗原抗體反應的速度論解析。作為不具有對人類IL-6受體之Ca依存性結合活性的對照抗體，係使用WO2009125825記載之H54/L28-IgG1(重鏈序列編號：82、輕鏈序列編號：83)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，分別在2 mM及3μM之鈣離子濃度的溶液中進行抗原抗體反應之速度論解析。於以胺偶合法固定化適當量之protein A(Invitrogen)之Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，捕捉目的抗體。跑動緩衝液係使用10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、2 mM CaCl2(pH7.4)或10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μmol/LCaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在37℃實施。
在使用了H54/L28-IgG1抗體之抗原抗體反應的速度論解析時，藉由將IL-6受體之稀釋液與空白的跑動緩衝液以流速20μL/min注入3分鐘，使IL-6受體與被捕捉於感應晶片(sensor chip)上之H54/L28-IgG1抗體相互作用。之後，以流速20μL/min流動跑動緩衝液10分鐘，觀察 IL-6受體之解離後，藉由將10 mMGlycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。由測定而得之表面電漿共振感應圖(sensorgram)，算出動態參數(kinetics parameter)之結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。使用該等之值算出H54/L28-IgG1抗體對人類IL-6受體之解離常數KD(M)。各參數之算出，係使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)。
在使用了FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之抗原抗體反應的速度論解析時，藉由以流速5μL/min將IL-6受體之稀釋液與空白之跑動緩衝液注入15分鐘，使IL-6受體與被捕捉於感應晶片上之FH4-IgG1抗體或6RL#9-IgG1抗體相互作用。之後，藉由將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。由測定所得之表面電漿共振感應圖(sensorgram)，使用steady state affinity model算出解離常數KD(M)。各參數之算出係使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)。
藉由此方法所決定之在2 mM CaCl2存在下之各抗體與IL-6受體的解離常數KD係如表21所示。
Ca濃度為3μM之條件下的H54/L28-IgG1抗體之KD，可藉由與2 mMCa濃度存在下同樣的方法來算出。Ca 濃度為3μM之條件下，FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體幾乎沒有觀察到對IL-6受體之結合，因此難以用上述方法算出KD。但是，藉由使用下述式1(Biacore T100 Software Handbook,BR-1006-48,AE 01/2007)，可預測在Ca濃度為3μM之條件下之該等抗體的KD。
[式1]Req=C x Rmax/(KD+C)+RI
上述式1中各項目之意義如下述；Req(RU)：恆定狀態結合水準(Steady state binding levels)
Rmax(RU)：待分析物之面結合能力(Analyte binding capacity of the surface)
RI(RU)：試樣中之容積折射率貢獻(Bulk refractive index contribution in the sample)
C(M)：待分析物濃度(Analyte concentration)
KD(M)：平衡解離常數(Equilibrium dissociation constant)表示之。
使用了上述式1之於Ca濃度為3μmol/L時各抗體與IL-6受體之解離常數KD之預測的概算結果係示於表22。表22中之Req、Rmax、RI、C係基於測定結果而假定的值。
由上述結果，預測了FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體，藉由使緩衝液中之CaCl2濃度由2 mM減少至3μM，對IL-6受體之KD分別上昇約60倍、約120倍(親和性降低60倍、120倍以上)。
於表23整理了H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1之3種抗體在2 mM CaCl2存在下及3μM CaCl2存在下之KD值、及KD值之Ca依存性。
並沒有觀察到因Ca濃度不同所致H54/L28-IgG1抗體對IL-6受體之結合的不同。另一方面，於低濃度Ca條件下，觀察到FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體對IL-6受體之結合係顯著地減弱(表23)。
[實施例17]對所取得之抗體之鈣離子結合評估
接著，作為鈣離子對抗體結合之評估的指標，測定了示差掃描型熱量測定(DSC)之熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性之指標，藉由鈣離子之結合使蛋白質安定化時，熱變性中間溫度(Tm值)係比鈣離子未結合時高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。藉由評估因應抗體溶液中之鈣離子濃度變化之抗體Tm值的變化，評估鈣離子對抗體之結合活性。經純化之抗體係供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液為外液的透析(EasySEP、TOMY)處理。使用透析所用之溶液，以調製為大約0.1 mg/mL之抗體溶液作為被驗物質，由20℃至115℃，以240℃/hr之昇溫速度進行DSC測定。基於所得到之DSC的變性曲線而算出之各抗體之Fab結構域的熱變性中間溫度(Tm值)係如表24所示。
由表24之結果，顯示了展現鈣依存性結合能力之FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab的Tm值係隨著 鈣離子濃度之變化而變動；不展現鈣依存性結合能力之H54/L28-IgG1抗體之Fab的Tm值不隨著鈣離子濃度之變化而變動。FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab的Tm值變動，係表示鈣離子與該等抗體結合，Fab部分會安定化。由上述結果，顯示鈣離子會與FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體結合，另一方面，鈣離子不與H54/L28-IgG1抗體結合。
[實施例18]6RL#9抗體之鈣離子結合部位之X射線結晶構造解析的鑑定 (18-1)X射線結晶構造解析
如實施例17所示，由熱變性溫度Tm值之測定，暗示了6RL#9抗體會與鈣離子結合。但是，無法預測6RL#9抗體之何部位會與鈣離子結合，因此藉由使用X射線結晶構造解析之手法，特定了鈣離子會相互作用之6RL#9抗體序列中之殘基。
(18-2)6RL#9抗體之表現及純化
純化用於X射線結晶構造解析而表現的6RL#9抗體。具體而言，將調製為可分別表現6RL#9抗體之重鏈(序列編號：78)與輕鏈(序列編號：79)的動物表現用質體暫時地導入動物細胞。於對FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)懸濁，使最終細胞密度成為1 x 106細胞/mL之800 mL來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株 (Invitrogen)中，以脂質體轉染法導入調製的質體。經導入質體之細胞係在CO2培養器(37℃、8%CO2、90 rpm)中培養5日。遵照使用了rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)之所屬技術領域中具有通常知識者公知的方法，由如上述方式得到之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。使用藉由PACE法算出之吸光係數，由測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(18-3)由6RL#9抗體純化Fab片段
使用分子量區分尺寸10000MWCO之超微過濾膜，濃縮6RL#9抗體至成為21 mg/mL。使用L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，調製以5 mg/mL稀釋之2.5 mL該抗體試樣。將添加0.125 mg之Papain(RocheApplied Science)而經攪拌之該試樣在35℃靜置2小時。靜置後，進一步於該試樣中添加溶解有蛋白酶抑制劑雞尾酒mini、EDTAfree(Roche Applied Science)1錠之10 mL的25 mM MES緩衝液(pH6)，於冰中靜置藉以使Papain之蛋白酶反應停止。接著，將該試樣添加於在下游縱列連接有1 mL尺寸之蛋白質A載劑管柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)之經25 mM MES緩衝液pH6平衡化的1 mL尺寸的陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)。將同緩衝液中NaCl濃度直線上昇至300 mM而進行溶出，藉以得到6RL#9抗體之Fab片段的純化 部分。接著，將所得之純化部分藉由5000MWCO之超微過濾膜濃縮至0.8 mL左右。將濃縮液添加至經含有50 mM NaCl之100 mM HEPES緩衝液(pH 8)平衡化的凝膠過濾管柱Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)中。使用同緩衝液，由管柱溶出結晶化用之純化6RL#9抗體的Fab片段。再者，上述之全部的管柱操作係在6至7.5℃之低溫下實施。
(18-4)6RL#9抗體之Fab片段在Ca存在下之結晶化
預先以一般的條件設定，得到6RL#9 Fab片段之種晶。接著將經添加CaCl2成為5 mM之純化6RL#9抗體之Fab片段，使用5000MWCO之超微過濾膜濃縮為12 mg/mL。接著，藉由懸滴(hanging drop)蒸氣擴散法，實施如前述濃縮之試樣的結晶化。作為蛋白結晶溶液(reservoir solution)係使用含有20-29%之PEG4000的100 mMHEPES緩衝液(pH7.5)。於蓋玻片上，對0.8μl之蛋白結晶溶液及0.8μl之前述濃縮試樣的混合液，添加經於含有29% PEG4000及5 mM CaCl2之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎的前述種晶被稀釋100-10000倍之稀釋系列溶液0.2μl藉以調製結晶滴。測定將該結晶滴於20℃靜置2日至3日而得之薄板狀結晶之X射線繞射數據。
(18-5)6RL#9抗體之Fab片段在Ca非存在下之結晶化
使用5000MWCO之超微過濾膜，使純化之6RL#9抗 體的Fab片段濃縮至15 mg/ml。接著，藉由懸滴蒸氣擴散法，如前述方式實施濃縮試樣之結晶化。作為蛋白結晶溶液係使用含有18-25%之PEG4000的100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)。於蓋玻片上，對0.8μl之蛋白結晶溶液及0.8μl之前述濃縮試樣的混合液，添加經於含有25% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎的在Ca存在下所得之6RL#9抗體Fab片段之結晶被稀釋100-10000倍之稀釋系列溶液0.2μl藉以調製結晶滴。測定將該結晶滴於20℃靜置2日至3日而得之薄板狀結晶之X射線繞射數據。
(18-6)6RL#9抗體之Fab片段在Ca存在下之結晶的X射線繞射數據測定
將浸於包含35% PEG4000及5 mM CaCl2之100mM HEPES緩衝液(pH7.5)溶液之6RL#9抗體Fab片段在Ca存在下得到之一單結晶，使用附有微小尼龍圈環之針用連同外液一起撈起，將該單結晶在液體氮中冷凍。使用高能加速器研究機構之放射光設施photon factory之射束BL-17A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。再者，測定中係將冷凍結晶經常放置於-178℃之氮氣流中藉以維持冷凍狀態。使用射束所安裝之CCD偵測器Quantum315r(ADSC)，將結晶一次旋轉1°，收集總共180枚之繞射影像。晶格常數之決定，賦予繞射斑點之指數，及繞射數據之處理係藉由程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package (Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終得到解析度高達2.2Å之繞射強度數據。本結晶屬於空間群P212121，晶格常數a=45.47Å、b=79.86Å、c=116.25Å、α=90°、β=90°、γ=90°。
(18-7)6RL#9抗體之Fab片段在Ca非存在下之結晶的X射線繞射數據測定
將浸於包含35% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)溶液之6RL#9抗體Fab片段在Ca非存在下得到之一單結晶，使用附有微小尼龍圈環之針用連同外液一起撈起，將該單結晶在液體氮中冷凍。使用高能加速器研究機構之放射光設施photon factory之射束BL-5A，測定前述之冷凍結晶的X射線繞射數據。再者，測定中係將冷凍結晶經常放置於-178℃之氮氣流中藉以維持冷凍狀態。使用射束所安裝之CCD偵測器Quantum210r(ADSC)，將結晶一次旋轉1°，收集總共180枚之繞射影像。晶格常數之決定，賦予繞射斑點之指數，及繞射數據之處理係藉由程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終得到解析度高達2.3Å之繞射強度數據。本結晶屬於空間群P212121，晶格常數a=45.40Å、b=79.63Å、c=116.07Å、α=90°、β=90°、γ=90°，與Ca存在下之結晶為同型。
(18-8)6RL#9抗體之Fab片段在Ca存在下之結晶構造解析
藉由使用了程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法，決定6RL#9抗體之Fab片段在Ca存在下之結晶構造。由所得之結晶格子大小與6RL#9抗體Fab片段之分子量，預測了非對稱單位中之分子數為一個。基於一次序列上之相同性，將由PDB code：1ZA6之構造座標取出之A鏈112-220號及B鏈116-218號胺基酸殘基部分作為CL及CH1區域之探索用模式分子。接著將由PDB code：1ZA6之構造座標取出之B鏈1-115號胺基酸殘基部分作為VH區域之探索用模式分子。最後將由PDB code 2A9M之構造座標取出之輕鏈3-147號胺基酸殘基作為VL區域之探索用模式分子。遵此順序決定由旋轉函數及轉換函數決定各探索用模式分子在結晶格子內之方向與位置，藉以得到6RL#9抗體之Fab片段初期構造模式。藉由對該初期構造模式運動VH、VL、CH1、CL之各結構域以進行剛體精密化，使相對於25-3.0Å之反射數據的結晶學信賴度因子R值為46.9%、Free R值為48.6%。進一步地進行了使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之構造精密化；與以使用實驗決定之構造因子Fo與由模式計算之構造因子Fc及位相而計算之2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數，一邊參照電子密度圖同時重複地修正模式之程式Coot(Paul Emsley)上來進行的模式精密化。最後基於以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數之電子密度圖，將Ca離子及水分子加入模式，藉以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)來進行精密化。使用解析度25-2.2Å之21020個反射數據，最終對3440原 子之模式的結晶學信賴度因子R值為20.0%、Free R值為27.9%。
(18-9)6RL#9抗體之Fab片段在Ca非存在下之結晶X射線繞射數據測定
6RL#9抗體之Fab片段在Ca非存在下之結晶構造，係使用同型之在Ca存在下結晶構造來決定。由6RL#9抗體Fab片段在Ca存在下之結晶構造座標中去除水分子與Ca離子分子，藉由運動VH、VL、CH1、CL之各結構域以進行剛體精密化。相對於25-3.0Å之反射數據的結晶學信賴度因子R值為30.3%、FreeR值為31.7%。進一步地進行了使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之構造精密化；與以使用實驗決定之構造因子Fo與由模式計算之構造因子Fc及位相而計算之2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數，一邊參照電子密度圖同時重複地修正模式之程式Coot(Paul Emsley)上來進行的模式精密化。最後基於以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數之電子密度圖，將水分子加入模式，藉以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)來進行精密化。使用解析度25-2.3Å之18357個反射數據，最終對3351原子之模式的結晶學信賴度因子R值為20.9%、Free R值為27.7%。
(18-10)6RL#9抗體Fab片段在Ca存在或非存在下之結晶的X射線繞射數據比較
比較6RL#9抗體Fab片段在Ca存在下之結晶及在Ca非存在下之結晶構造時，可見到於重鏈CDR3有大的變化。以X射線結晶構造解析決定之6RL#9抗體的Fab片段之重鏈CDR3構造係如圖11所示。具體而言，在Ca存在下之6RL#9抗體的Fab片段結晶中，鈣離子存在於重鏈CDR3圈環部分之中心部分。鈣離子可認為與重鏈CDR3之95位、96位及100a位(Kabat編號)相互作用。在Ca存在下，認為與抗原之結合重要之重鏈CDR3圈環藉由與鈣結合而安定化，成為與抗原結合最適合的構造。至今為止，鈣與抗體之重鏈CDR3結合之例尚未被報導，鈣與抗體之重鏈CDR3結合之構造為新穎的構造。
由6RL#9抗體之Fab片段構造而明確化之重鏈CDR3中存在的鈣結合模式結構，亦可成為設計如實施例11記載之Ca庫之新的要素。亦即，實施例11中係於輕鏈可變區域導入鈣結合模式結構，但可考慮例如包含6RL#9抗體重鏈CDR3，且包含輕鏈之其以外的CDR中含有柔性殘基的分子庫。
[實施例19]由使用了噬菌體展示技術之人類抗體庫中取得Ca依存性地與IL-6結合之抗體 (19-1)天然人類抗體噬菌體展示分子庫之製造
以由人類PBMC製成之多A RNA、或市售之人類多A RNA等作為模板，遵照所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，構築了由展現彼此相異之人類抗體序列Fab結 構域的複數噬菌體所構成之人類抗體噬菌體展示分子庫。
(19-2)磁珠篩選之由分子庫中取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由構築之天然人類抗體噬菌體展示分子庫中的最初選拔，係藉由僅濃縮具有對抗原(IL-6)之結合能力的抗體片段來實施。抗原係使用生物素標誌之IL-6。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。接著，藉由於噬菌體庫液中添加BSA及CaCl2，使成為終濃度4% BSA及1.2mM鈣離子濃度。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2之TBST)洗淨3次後，以 1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)進一步洗淨2次。之後，將經添加0.5 mL之1 mg/mL胰蛋白酶的磁珠在室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株TG1。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選中，係以Ca依存性結合能力為指標來進行噬菌體濃縮。具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨。之後將經添加0.1mL之2 mM EDTA/TBS的磁珠在室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由在回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將自經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液中回收的噬菌體添加至對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株TG1中。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌 係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標的篩選係重複3次。
(19-3)噬菌體ELISA之評估
遵習一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，由藉由上述方法所得之大腸菌單一菌落，回收含有噬菌體之培養上清液。
將含有經添加BSA及CaCl2而成為終濃度4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度的含有噬菌體之培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，藉以使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之後，將經終濃度4%之BSA及1.2 mM之離子化鈣濃度的TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
藉由使用單離之96殖株來進行噬菌體ELISA，得到具有對IL-6之Ca依存性結合能力的6KC4-1#85抗體。上述噬菌體ELISA之結果，以判斷為具有Ca依存性地對抗原之結合能力的抗體片段為模板，進行經特異引子放大之基因的鹼基序列解析。6KC4-1#85抗體之重鏈可變區域序列記載於序列編號：11；及輕鏈可變區域之序列係記載於序列編號：84。編碼6KC4-1#85抗體之重鏈可變區域(序列編號：11)的聚核苷酸藉由PCR法與編碼來自IgG1之序列的聚核苷酸連結的DNA片段，係被接入動物細胞表現用載體，構築表現以序列編號：85表示之重鏈的載體。編碼6KC4-1#85抗體之輕鏈可變區域(序列編號：84)的聚核苷酸藉由PCR法與編碼天然型Kappa鏈恆定區域(序列編號：26)之聚核苷酸連結的DNA片段，係被接入動物細胞表現用載體。所製造之改變體序列係以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法確認。所製造之改變體序列係以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法確認。
(19-4)抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，判斷為具有對Ca依存性的抗原之結合能力之殖株6KC4-1#85，係被導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。經調製 之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。在CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
[實施例20]6KC4-1#85抗體之鈣離子結合評估
評估由人類抗體庫取得之鈣依存性抗原結合之抗體6KC4-1#85抗體是否與鈣結合。在離子化鈣濃度不同的條件下，以實施例6記載之方法評估所測定之Tm值是否變動。
6KC4-1#85抗體之Fab結構域的Tm值係如表25所示。如表25所示，6KC4-1#85抗體之Fab結構域的Tm值隨著鈣離子濃度而變動，故明顯得知6KC4-1#85抗體會與鈣結合。
[實施例21]6KC4-1#85抗體之鈣離子結合部位的鑑定
如實施例20所示，雖顯示6KC4-1#85抗體與鈣離子結合，但6KC4-1#85不具有由hVk5-2序列之探討而明確之鈣結合模式結構。因而，為了確認鈣離子係與6KC4-1#85抗體之重鏈結合、與輕鏈結合或與兩者結合，係評估鈣離子對於與鈣離子不結合之抗磷脂肌醇聚糖3抗體(重鏈序列GC_H(序列編號：48)、輕鏈序列GC_L(序列編號：86))之重鏈與輕鏈各自交換之改變抗體的結合。根據實施例6所示方法所測定之改變抗體的Tm值係如表26所示。結果，具有6KC4-1#85抗體之重鏈的改變抗體之Tm值隨著鈣離子濃度而變化，因此可認為6KC4-1#85抗體之重鏈與鈣結合。
因而，為了進一步鑑定鈣離子係與6KC4-1#85抗體之重鏈殘基的何者結合，製造了將存在於6KC4-1#85抗體CDR之Asp(D)殘基取代為與鈣離子之結合或鉗合無關的Ala(A)殘基之改變重鏈(6_H1-11(序列編號：87)、6_H1-12(序列編號：88)、6_H1-13(序列編號：89)、6_H1-14(序列編號：90)、6_H1-15(序列編號：91))、或改變輕鏈 (6_L1-5(序列編號：92)及6_L1-6(序列編號：93))。由經導入包含改變抗體基因之表現載體的動物細胞之培養液中，遵照實施例19記載之方法來純化改變抗體。純化之改變抗體的鈣結合，係遵照實施例6記載之方法測定。測定結果示於表27。如表27所示，藉由將6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3的95位或101位(Kabat編號)取代為Ala殘基，而喪失6KC4-1#85抗體之鈣結合能力，故可認為此殘基在與鈣之結合上為重要。存在於由6KC4-1#85抗體之改變抗體的鈣結合性而明確化之6KC4-1#85抗體重鏈CDR3之圈環根部附近之鈣結合模式結構，亦可成為如實施例11記載之Ca庫設計之新的要素。亦即，於實施例11中係於輕鏈可變區域導入鈣結合模式結構，但可考慮於例如包含6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3、且包含輕鏈之其以外的CDR中包含柔性殘基的分子庫。
[實施例22]Ca依存性地與人類IgA結合之抗體的取得 (22-1)MRA-hIgA、GC-hIgA及附加生物素之人類IgA-Fc的調製
作為人類IgA，如以下方式調製MRA-hIgA(重鏈序列編號97、輕鏈序列編號25)GC-hIgA(重鏈序列編號98、輕鏈序列編號99)及附加生物素之人類IgA-Fc(亦稱為生物素標誌hIgA-Fc、hIgA_CH2-CH3-Avitag：序列編號100)。
(22-1-1)MRA-hIgA之調製
如以下方式調製人類IgA之重組體即MRA-hIgA(以下稱為MRA-hIgA)。包含表現之H(WT)-IgA1(序列編號：97)與L(WT)(序列編號：25)之hIgA，係藉由所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，使用離子交換層析及凝膠過濾層析來純化。
(22-1-2)GC-hIgA之調製
人類IgA之重組體的GC-hIgA，係如以下方式調製。編碼GC-hIgA(重鏈序列編號：98、輕鏈序列編號：99)之基因片段係被接入動物細胞表現用載體。所構築之質體載體，係使用293Fectin(Invitrogen)，與表現EBNA1之基因一起導入FreeStyle293(Invitrogen)。之後，將經導入基因之細胞在37℃、CO2 8%培養6日，使GC-hIgA蛋白質分泌於培養上清液中。
將含有GC-hIgA之細胞培養液以0.22μm瓶頂過濾器(bottle top filter)過濾而得到培養上清液。將經20 mM Tris-HCl,pH8.0稀釋之培養上清液加入經同溶液平衡化之HiTrap Q HP(GE healthcare)，藉由NaCl之濃度梯度使GC-hIgA溶出。之後，以由Superdex200之凝膠過濾層析進行結合體之去除與對20 mM His-HCl,150 mM NaCl,pH6.0之取代，得到純化GC-hIgA。
(22-1-3)生物素標誌hIgA-Fc之調製
為了使生物素附加於目的蛋白質(人類IgA-Fc)之C末 端，將編碼藉由生物素連接酶會附加生物素之特異序列(Avitag序列)之基因片段連結於於編碼人類IgA-Fc區域之基因片段的下游。將編碼經連結人類IgA與Avitag序列之蛋白質(hIgA_CH2-CH3-Avitag(序列編號：100))之基因片段接入動物細胞表現用載體。所構築之質體載體係使用293Fectin(Invitrogen)將基因導入FreeStyle293(Invitrogen)。此時將表現EBNA1之基因及表現生物素連接酶(BirA)之基因同時導入，藉由添加生物素來標誌生物素。將遵照前述順序經導入基因之細胞在37℃、CO2 8%培養6日，使目的蛋白質分泌於培養上清液中。
將含有目的人類IgA-Fc之細胞培養液以0.22μm瓶頂過濾器過濾，得到培養上清液。將以20 mM Tris-HCl,pH7.4溶液稀釋之培養上清液加入經同溶液平衡化之HiTrap Q HP(GE healthcare)，藉由NaCl之濃度梯度來溶出目的之人類IgA-Fc。將以50 mM Tris-HCl,pH8.0稀釋之HiTrap Q HP溶出液，加入經同溶液平衡化之SoftLink Avidin column，以5 mM Biotin,150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl,pH8.0溶出。之後，以由Superdex200之凝膠過濾層析進行結合體之去除與對20 mM His-HCl,150 mM NaCl,pH6.0之取代，得到純化人類IgA-Fc。
(22-2)磁珠篩選之由Ca庫取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由經構築Ca依存性地與抗原結合之抗體庫(Ca庫)的 最初選拔，係以對抗原(人類IgA-Fc)之結合能力作為指標來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。接著，藉由於噬菌體庫液中添加BSA或SkimMilk、及CaCl2，成為終濃度4%BSA、1.2 mM鈣離子或3%SkimMilk、1.2 mM鈣離子，以調製經阻斷的噬菌體庫液。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原(生物素標誌IgA-Fc)，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA或SkimMilk阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將磁珠以1mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS)與1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)洗淨。之後，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將 回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次、第3次之篩選中，係以Ca離子濃度依存性抗原結合能力為指標進行噬菌體濃縮。具體而言，係與第1次之篩選同樣地進行阻斷，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨。之後，將經添加0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(含有2 mM之EDTA的TBS)之磁珠於室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。
(22-3)Biacore之人類IgA結合抗體的篩選
將由第2次篩選結束後所得大腸菌中取得之噬粒中萃取之抗體片段基因插入動物細胞表現用載體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以2.63 x 105細胞/mL之細胞密度對96孔盤之各孔各播種190μL。經調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。在CO2培養器(37度、8% CO2)中進行4日培養。
使用藉由上述方法所得之培養上清液，使用BiacoreA100解析對GC-hIgA之結合能力。對以胺偶合法固定化適當量之蛋白質A(invitrogen)之sensor chip CM5(GE Healthcare)，固定化培養上清液中之抗體。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)之緩衝液。GC-hIgA之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在25℃實施。
上述之於IgG Biacore的結合能力解析結果，對判斷為具有對GC-hIgA之結合能力的抗體，解析由用於表現之動物細胞表現用載體使用特異之引子放大的抗體基因之鹼基序列。
(22-4)Phage ELISA之hIgA結合抗體篩選
由在(22-2)實施之第3次篩選後所得之大腸菌單一菌落中，遵照一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133- 145)進行噬菌體培養，回收含有噬菌體之培養上清液。將添加BSA及CaCl2使成為終濃度4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含有噬菌體的培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌IgA-Fc之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，藉以使展現噬菌體之抗體與存在於各孔的IgA-Fc結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中，添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加以4% BSA及離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，對於判斷為隨著Ca離子濃度不同，對IgA-Fc之結合能力會變化之殖株，進行抗體片段基因之鹼基序列解析。
(22-5)以固層篩選法由Ca庫取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由構築之Ca依存性地與抗原結合之抗體庫(Ca庫)的 最初選拔，係以對抗原(人類IgA-Fc)之結合能力作為指標來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。接著，藉由於噬菌體庫液中添加BSA或SkimMilk、及CaCl2，成為終濃度4%BSA、1.2 mM鈣離子或3%SkimMilk、1.2 mM鈣離子，以調製經阻斷的噬菌體庫液。篩選方法係參照第1次篩選中之一般方法、即使用了固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原(生物素標誌IgA-Fc)，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經SkimMilk阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS)與1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)洗淨。之後，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使 用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次篩選中，係進行使用了固層化於盤上之抗原的篩選。具體而言，於被覆有鏈黴蛋白素之10孔盤(Streptawell,Roche)中各孔添加5pmol之生物素標誌抗原，在室溫與抗原接觸60分鐘後，製造以TBST(含有0.1% Tween20之TBS)洗淨3次之抗原固相化盤。於其中添加經含有1.2mM Ca之SkimMilk阻斷之噬菌體庫，在室溫與抗原接觸60分鐘。盤係以1.2 mM CaCl2/TBST，藉由盤洗淨器(Skan WASHER,SKARON)洗淨3次。之後，進一步浸漬於2L之1.2 mM CaCl2/TBST，和緩震盪60分鐘。將經添加0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(含有2 mM之EDTA的TBS)之孔在室溫懸濁後，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。
(22-6)Phage ELISA之hIgA結合抗體的篩選
由上述篩選後所得之大腸菌單一菌落中，遵照一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)進行噬菌體培養，回收含有噬菌體之培養上清液。於(22-4)記載之方法中，實施PhageELISA，對於判斷具有Ca依存性抗原結合能力之殖株進行鹼基序列解析，插入於動物細胞表現用載體，作為抗體而表現、純化。
[實施例23]所取得之抗體對人類IgA之Ca依存性結合能力評估 (23-1)所取得之抗人類IgA抗體表現及純化
作為於實施例22中判斷為具有對人類IgA之結合能力的抗體而取得之抗體當中，使用以下的方法來表現GA1-IgG1((22-3)中取得之重鏈序列編號101、輕鏈序列編號102)、GA2-IgG1((22-4)中取得之重鏈序列編號103、輕鏈序列編號104)、GA3-IgG1((22-6)中取得之重鏈序列編號105、輕鏈序列編號106)、GA4-IgG1((22-3)中取得之重鏈序列編號107、輕鏈序列編號108)，進行該抗體之純化。將懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)之來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。經調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37度、8%CO2、90 rpm)中進行 4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(23-2)所取得之抗體對人類IgA之Ca依存性結合能力評估
使用Biacore T200(GE Healthcare)，評估於(23-1)取得之抗體(GA1-IgG1,GA2-IgG1,GA3-IgG1及GA4-IgG1)對人類IgA的結合活性(解離常數KD(M))。使用含有3μM或1.2 mM CaCl2之0.05% Tween20,20 mmol/l ACES,150 mmol/l NaCl(pH7.4及pH5.8)；含有0.1μM或10 mM CaCl2之0.05% Tween20,20 mmol/l ACES,150 mmol/l NaCl、pH8.0作為跑動緩衝液來測定該結合活性。
使抗體與以胺偶合法在Sensor chip CM5(GE Healthcare)上固定化適當量之重組型蛋白質A/G(Thermo Scientific)結合。作為待分析物，注入適當濃度之MRA-hIgA((22-1)所記載)，與感應晶片上之抗體相互作用。之後，注入10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，使感應晶片再生。測定係在37℃進行。藉由使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)之測定結果曲線擬合之解析及平衡值解析，算出解離常數KD(M)。其結果示於表28。又，所得之表面電漿共振感應圖(sensorgram)示於圖12。GA2-IgG1、GA3- IgG1、GA4-IgG1明顯地顯示在Ca2+濃度為1.2 mM時與人類IgA強力結合，然在Ca離子濃度3μM時與人類IgA微弱結合。
於實施例14中由Ca庫取得了對IL6受體，Ca離子濃度依存性地與抗原(IL6受體)之相互作用會變化的抗體，但明顯可知Ca離子濃度依存性地與抗原結合之抗體，不僅由IL6受體，由人類IgA亦可取得。
[實施例24]Ca依存性地與人類磷脂肌醇聚糖3(GPC3)結合之抗體的取得 (24-1)人類磷脂肌醇聚糖3之調製
如以下方式調製作為抗原使用之重組人類磷脂肌醇 聚糖3(以下GPC3)。使將表現6殘基組胺酸經連結於不含人類磷脂肌醇聚糖3之膜貫通區域的胺基酸序列之序列(序列編號：109)之質體恆定地導入之CHO細胞，回收培養上清液。將所得之培養上清液離子交換層析純化後，進行使用了His標籤之親和性純化及凝膠過濾層析純化，得到GPC3。使用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo SCIENTIFIC)，調製對該GPC3標誌生物素之生物素標誌GPC3。
(24-2)磁珠篩選之由分子庫取得Ca依存性地與抗原結合之抗體片段
由構築之Ca依存性地與GPC3結合之抗體庫的最初選拔，係以對抗原(GPC3)之結合能力為指標來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。接著，於噬菌體庫液添加BSA或SkimMilk、及CaCl2，使成為終濃度4%BSA、1.2 mM鈣離子或3%SkimMilk、1.2 mM鈣離子，以調製經阻斷之噬菌體庫液。篩選方法係參照一般方法之使用了固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原(生物素標誌GPC3)，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。BSA或添加經SkimMilk阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2之TBST)與1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS)洗淨。之後，將添加1mg/mL胰蛋白酶0.5mL後之磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選中，係以Ca依存性結合能力為指標來進行噬菌體濃縮。具體而言，係與第1次之篩選同樣地進行阻斷，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。BSA或添加經SkimMilk阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨。之後，將經添加0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(含有2 mM之EDTA的 TBS)之磁珠於室溫懸濁後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。藉由於回收之噬菌體溶液中添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬菌體庫液。
(24-3)Phage ELISA之GPC3結合抗體的篩選
由經上述方法實施之第2次及第3次篩選後所得的大腸菌單一菌落中，遵照一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)進行噬菌體培養，回收含有噬菌體之培養上清液。
將添加BSA及CaCl2成為終濃度4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含有噬菌體的培養上清液依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以PBST(含有0.1% Tween20之PBS)洗淨藉以去除抗原後，將該孔以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，藉以使展現噬菌體之抗體與存在於各 孔之抗原結合。於經1.2 mM CaCl2/TBST洗淨之各孔中添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後，將經添加以4% BSA及離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)至各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗淨後、將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，以判斷為具有Ca依存性的對抗原之結合能力之抗體片段作為模板，解析藉由特異引子放大之基因的鹼基序列。
(24-4)與人類GPC3結合之抗體之表現與純化
噬菌體ELISA之結果，將判斷為具有Ca依存性地對抗原的結合能力之4抗體、CSCM-01_005(重鏈序列：110、輕鏈序列：111)、CSCM-01_009(重鏈序列：112、輕鏈序列：113)、CSCM-01_015(重鏈序列：114、輕鏈序列：115)、及CSCM-01_023(重鏈序列：116、輕鏈序列：117)以及作為控制組的抗人類GPC3抗體之GC-IgG1(重鏈序列：118、輕鏈序列：119)分別插入動物細胞表現用質體。使用以下方法表現抗體。將懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)之來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)以1.33 x 106個 /mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。經調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37℃、8%CO2,90 rpm)進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。再者，對於GC-IgG1抗體，由恆定地表現GC-IgG1抗體之CHO細胞培養上清液中以同樣方法純化抗體，算出濃度。
(24-5)所取得之抗體對人類GPC3之Ca依存性結合能力評估
將取得之抗體依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌抗原之100μL PBS被覆一晚。將該盤之各孔以ACES buffer(10 mM ACES,150 mM NaCl,100 mM CaCl2，0.05% Tween20,pH7.4)洗淨藉以去除抗原後，將該孔以含有2%BSA之ACES Buffer 250μL阻斷1小時以上。於經去除含有2%BSA之ACES Buffer的各孔中，添加預先進行過由10μg/mL起每次稀釋4倍之純化IgG各100μL，將該盤靜置一小時，藉以使IgG與存在於各孔之抗原結合。於經ACES Buffer洗淨之各孔中添加「10 mM ACES，150 mM NaCl,1.2 mM CaCl2,pH7.4」、「10 mM ACES,150 mM NaCl,3μM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES,150 mM NaCl,1.2 mM CaCl2,pH5.8」或「10 mM ACES,150 mM NaCl,3μM CaCl2,pH5.8」，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。以ACES Buffer洗淨後，將經於各孔中添加藉由含有2%BSA之ACES Buffer稀釋之HRP結合抗人類IgG抗體(BIOSOURCE)之盤培養1小時。以ACES Buffer洗淨後，將經添加TMB single溶液(ZYMED)之各孔中溶液之發色反應藉由添加硫酸以停止後、以450 nm吸光度來測定該發色。
測定結果如圖13所示。GC-IgG1中，與鈣離子濃度無關地，吸光度相同，相對於此，CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015及CSCM-01_023，比起1.2 mM鈣離子濃度(高鈣離子濃度)之吸光度，3μM鈣離子濃度(低鈣離子濃度)之吸光度為顯著地低之結果。由此結果，顯示CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015及CSCM-01_023具有隨著鈣離子濃度不同，與抗原之結合會變化的性質，顯示了對於人類磷脂肌醇聚糖3亦可取得鈣依存性抗體。
[實施例25]pH依存性地與小鼠IgA結合之抗體的取得 (25-1)附加GC-mIgA及生物素之小鼠IgA-Fc的調製
作為小鼠IgA，由以下方式調製附加GC-mIgA(重鏈序列編號120、輕鏈序列編號121)及生物素之小鼠IgA-Fc(亦稱為生物素標誌mIgA-Fc、mIgA_CH2-CH3-Avitag：序列編號122)。
(25-1-1)GC-mIgA之調製
將小鼠IgA重組體之GC-mIgA由如以下方式調製。將編碼GC-mIgA(重鏈序列編號：120、輕鏈序列編號：121)之基因片段接入動物細胞表現用載體。經構築之質體載體，係使用293Fectin(Invitrogen)，與表現EBNA1之基因一起導入FreeStyle293(Invitrogen)。之後，將經基因導入之細胞在37℃、CO2 8%培養4日，使GC-mIgA蛋白質分泌於培養上清液中。
將含有GC-mIgA之細胞培養液以0.22μm瓶頂過濾器過濾，得到培養上清液。於經20 mM Tris-HCl,pH8.0平衡化後，將以同溶液稀釋之培養上清液加入HiTrap Q HP(GE healthcare)，藉由NaCl濃度梯度溶出GC-mIgA。之後，藉由使用了Superdex200之凝膠過濾層析經去除結合體之含有GC-mIgA之緩衝液取代為20 mM His-HCl,150 mM NaCl,pH6.0，得到純化GC-mIgA。
(25-1-2)生物素標誌mIgA-Fc之調製
為了將生物素附加於目的蛋白質(小鼠IgA-Fc)之C末端，將編碼藉由生物素連接酶會附加生物素之特異序列(Avitag序列)之基因片段連結於於編碼小鼠IgA-Fc區域之基因片段的下游。將編碼經連結小鼠IgA與Avitag序列之蛋白質(mIgA_CH2-CH3-Avitag(序列編號：122))之基因片段接入動物細胞表現用載體。所構築之質體載體係使用 293Fectin(Invitrogen)將基因導入FreeStyle293(Invitrogen)。此時將表現EBNA1之基因及表現生物素連接酶(BirA)之基因同時導入，藉由添加生物素來標誌生物素。將遵照前述順序經導入基因之細胞在37℃、CO2 8%培養6日，使目的蛋白質分泌於培養上清液中。
將含有目的小鼠IgA-Fc之細胞培養液以0.22μm瓶頂過濾器過濾，得到培養上清液。將以20 mM Tris-HCl,pH7.4溶液稀釋之培養上清液加入經同溶液平衡化之HiTrap Q HP(GE healthcare)，藉由NaCl之濃度梯度來溶出目的之小鼠IgA-Fc。接著，以50 mM Tris-HCl,pH8.0平衡化後，由經加入以同溶液稀釋之前述HiTrap Q HP溶出液之SoftLink Avidin column中，以5 mMBiotin,150 mM NaCl,50 mM Tris-HCl,pH8.0溶出目標的小鼠IgA-Fc。之後，藉由使用了Superdex200之凝膠過濾層析將經去除結合體之含有小鼠IgA-Fc的緩衝液取代為20 mM His-HCl,150 mM NaCl,pH6.0，得到純化小鼠IgA-Fc。
(25-2)磁珠篩選之由His庫取得pH依存性地與抗原結合之抗體片段
由經構築之pH依存性地與抗原結合的抗體庫(His庫1)之最初選拔，係以對抗原(小鼠IgA-Fc)之結合能力作為指標來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。將於經產生噬菌體之大腸菌培養液中添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，藉以得到噬菌體庫液。接著，於噬菌體庫液中添加Skim Milk使終濃度成為3%SkimMilk，調製經阻斷之噬菌體庫液。篩選方法係參照一般方法之使用了固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加生物素標誌抗原(生物素標誌mIgA-Fc)，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。第1次篩選中使用250pmol、第2次篩選中使用40 pmol、第3次篩選中使用10pmol之生物素標誌抗原。添加經Skim Milk阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST(含有1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS,pH7.6)與1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含有1.2 mM CaCl2之TBS,pH7.6)洗淨。之後，將添加1 mg/mL之胰蛋白酶0.5 mL的磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於 225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。篩選係合計重複3次。
(25-3)Biacore之小鼠IgA結合抗體的結合能力評估
將由第3次篩選結束後所得之大腸菌中所取得的噬粒中萃取之抗體片段基因插入動物細胞表現用載體。抗體之表現係使用以下方法進行。將來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以2.63 x 105細胞/mL之細胞密度對96孔盤之各孔各播種190μL。經調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37℃、8%CO2)中進行4日l培養。
使用藉由上述方法所得之培養上清液，使用BiacoreA100來解析對GC-mIgA之結合能力。於以胺偶合法經固定化適當量之蛋白質A/G(PIERCE)的sensor chip CM5(GE Healthcare)捕捉培養上清液中之抗體。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)及20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH5.8)之2種緩衝液，解析中性區域pH及酸性區域pH之條件中的抗原抗體反應相互作用。GC-mIgA之稀釋亦使用各自的緩衝液，藉由以流速10μL/min注入60秒，與捕捉於感應晶片上之抗體相互作用。之後，藉由將10 mM Glycine-HCl(pH1.5) 以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。測定全部在25℃實施。
上述Biacore之結合評估結果，作為被判斷對GC-mIgA具有pH依存性結合能力之抗體，得到了mIAP1B3-3_#024(重鏈序列編號：123、輕鏈序列編號：124)、mIAP1B3-3_#130(重鏈序列編號：125、輕鏈序列編號：126)、mIAP1B3-3_#230(重鏈序列編號：127、輕鏈序列編號：128)。該等抗體之pH7.4及pH5.8之表面電漿共振感應圖(sensorgram)如圖14所示。藉由使緩衝液中之pH由pH7.4變為pH5.8，觀察到對小鼠IgA的結合能力降低。
對該等抗體，由用於表現之動物細胞表現用載體解析抗體基因之鹼基序列。
實施例3中由His庫1取得對於IL-6R而言pH依存性地與抗原(IL-6R)相互作用會變化的抗體，但明顯得知pH依存性地與抗原結合之抗體，不僅由IL6R，由小鼠IgA亦可取得。
[實施例26]pH依存性地與人類HMGB1結合之抗體的取得 (26-1)人類HMGB1及附加生物素之人類HMGB1的調製
由如以下的方式來調製人類HMGB1(序列編號：129)、及附加生物素之人類HMGB1-Avi(亦稱為生物素標誌hHMGB1、hHMGB1-Avitag：序列編號130)。
(26-1-1)人類HMGB1之調製
人類HMGB1之重組體的hHMGB1係由以下方式調製。將編碼hHMGB1(序列編號：129)之基因片段接入動物細胞表現用載體。將構築之質體載體使用293Fectin(Invitrogen)，與表現EBNA1之基因一起導入FreeStyle293(Invitrogen)。之後，將經基因導入之細胞在37℃、CO2 8%培養，使hHMGB1蛋白質分泌於培養上清液中。以PBS平衡化之後，將所得培養上清液加入HiTrap SP Sepharose HP(GE Healthcare社)，以PBS洗淨後，藉由氯化鈉之直線濃度梯度使吸附於管柱之蛋白質溶出。以20 mM Histidine-HCl,pH5.0平衡化之後，加入以同緩衝液稀釋為3倍之包含前述hHMGB1的溶出部分。將吸附於管柱之蛋白質藉由氯化鈉之直線濃度梯度由經同緩衝液洗淨之管柱中溶出。將經超微過濾膜濃縮之含有hHMGB1部分，加入經300 mM NaCl,20 mM組胺酸，pH6.0平衡化之Superdex200管柱(GE Healthcare公司)。藉由以同緩衝液分離而得到hHMGB1純化部分。
(26-1-2)生物素標誌人類HMGB1之調製
為了將生物素附加於目的蛋白質(人類HMGB1)之C末端，將編碼藉由生物素連接酶會附加生物素之特異序列(Avitag序列)之基因片段連結於於編碼人類HMGB1區域之基因片段的下游。將編碼經連結人類HMGB1與Avitag序列之蛋白質(hHMGB1-Avitag(序列編號：130))之基因片段接入動物細胞表現用載體。所構築之質體載體係使用 293Fectin(Invitrogen)將基因導入FreeStyle293(Invitrogen)。此時將表現EBNA1之基因及表現生物素連接酶(BirA)之基因同時導入，藉由添加生物素來標誌生物素。將遵照前述順序經導入基因之細胞在37℃、CO2 8%培養，使目的蛋白質分泌於培養上清液中。
經PBS平衡化之後，將前述所得培養上清液加入HiTrap SP Sepharose HP(GE Healthcare公司)，以PBS洗淨後，藉由氯化鈉之直線濃度梯度使吸附於管柱之蛋白質溶出。將經100 mM Tris-HCl,pH7.4稀釋為2倍之含有HMGB1-Avi的部分，加入經TBS平衡化之SoftLink Soft Release Avidin Resin管柱(Promega公司)。將吸附於管柱之蛋白質以含有5 mMBiotin之TBS(pH8.0)由經TBS洗淨之管柱中溶出。將經超微過濾膜濃縮之含有HMGB1-Avi的部分，加入經300 mM NaCl,20 mM組胺酸，pH6.0平衡化之Superdex200管柱(GE Healthcare公司)。藉由以同緩衝液分離，得到Biotin化之HMGB1-Avi純化部分。
(26-2)磁珠篩選之由His庫取得pH依存性地與抗原結合之抗體片段
由構築之pH依存性地與抗原結合之抗體庫(His庫1)的最初選拔，係以對抗原(人類HMGB1)之結合能力作為指標來實施。
由保持構築之噬菌體展示用噬粒之大腸菌中進行噬菌體產生。藉由將經於進行過噬菌體產生之大腸菌培養液中 添加2.5 M NaCl/10%PEG而沈澱之噬菌體集團以TBS稀釋，以得到噬菌體庫液。藉由於噬菌體庫液中添加BSA、及CaCl2，成為終濃度4% BSA、1.2mM鈣離子，以調製經阻斷之噬菌體庫液。作為篩選方法，係參照使用了一般方法之固定化於磁珠之抗原的篩選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁珠係使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加250 pmol之生物素標誌抗原(生物素標誌hHMGB1)，將該噬菌體庫液於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1mL之1.2 mM CaCl2/TBST(50mM Tris,300mM NaCl,1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20,pH7.6)與1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(50mM Tris,300mM NaCl,1.2 mM CaCl2,pH7.6)洗淨。之後，將添加1 mg/mL之胰蛋白酶0.5 mL的磁珠於室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，來調製噬菌體庫液。
第2次以後之篩選中，係以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標來進行噬菌體濃縮。具體而言，藉由於經調製之噬菌體庫液中添加40 pmol之生物素標誌抗原，使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷之磁珠，將抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。磁珠係以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗淨複數次。之後以抗原結合能力作為指標來濃縮的情況時，係將經添加1mg/mL之胰蛋白酶0.5 mL的磁珠在室溫懸濁15分鐘後，立即使用磁性架台將磁珠分離，回收噬菌體溶液。以pH依存性抗原結合能力為指標而濃縮時，於Round2係添加0.4 mL、於Round3以後係添加0.1 mL之50 mM MES/1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl(pH5.5)，將磁珠在室溫懸濁後，使用磁性架台將磁珠分離。於回收之噬菌體溶液中，在Round2添加20μL、在Round3以後係添加5μL之100 mg/mL之胰蛋白酶，藉以使不展現Fab之噬菌體的pIII蛋白質(來自輔助噬菌體之pIII蛋白質)被切斷，使不展現Fab之噬菌體對大腸菌之感染能力喪失。將回收之噬菌體添加於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738。藉由於37℃緩慢地進行上述大腸菌之攪拌培養1小時，使噬菌體感染大腸菌。經感染之大腸菌係播種於225 mm x 225 mm之盤。接著，藉由自經播種之大腸菌培養液中回收噬菌體，回收噬 菌體庫液。以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標的篩選係重複3次。
(26-3)Phage ELISA之人類HMGB1結合抗體的篩選
由於(26-2)實施之第3次、第4次篩選後所得之大腸菌單一菌落，遵照一般方法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)進行噬菌體培養，回收含有噬菌體之培養上清液。添加BSA及CaCl2使成為終濃度4%BSA及1.2 mM 鈣離子濃度之含有噬菌體的培養上清液係依以下順序供ELISA。將StreptaWell 96微量孔盤(Roche)以含有生物素標誌hHMGB1之100μL的PBS被覆4小時以上。將該盤之各孔以PBST洗淨藉以去除抗原後，將該孔以250μL之4%BSA-TBS(50mM Tris,300mM NaCl,2.5mM CaCl2,4% BSA)阻斷1小時以上。將於去除4% BSA-TBS之各孔中添加有所調製之培養上清液的該盤於37℃靜置1小時，藉以使展現噬菌體之抗體與存在於各孔之HMGB1結合。在經1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)洗淨之各孔中，添加1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl/50 mM MES(pH5.5)，該盤係在37℃靜置30分鐘培養。以1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)洗淨後，將經添加藉由4%BSA-TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)於各孔的盤培養1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)洗淨後，使經添加TMB single溶液(invitrogen)之各孔中的溶液之發色反應藉由添加硫酸停止後，以450 nm吸光 度來測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，解析判斷為隨著pH不同，對人類HMGB1之結合能力會變化的殖株中所含之體片段基因的鹼基序列。
(26-4)與人類HMGB1結合之抗體的表現與純化
噬菌體ELISA之結果，將判斷為具有pH依存性地對抗原之結合能力的3抗體、HM_3_2_R_017(重鏈序列編號：131、輕鏈序列編號：132)、HM_3_2_R_054(重鏈序列編號：133、輕鏈序列編號：134)、及HM_4_1_R_001(重鏈序列編號：135、輕鏈序列編號：136)分別插入動物細胞表現用質體。抗體係使用以下方法來表現。將懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)之來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)以1.33 x 106個/mL之細胞密度對6孔盤之各孔各播種3 mL。經調製之質體係藉由脂質體轉染法導入細胞。於CO2培養器(37℃、8%CO2,90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。藉由使用以PACE法算出之吸光係數，由所得之測定值算出抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(26-5)所取得之抗體對人類HMGB1之pH依存性結合能力評估
為了判斷(26-4)中取得之抗體HM_3_2_R_017(重鏈序列編號：131、輕鏈序列編號：132)、HM_3_2_R_054(重鏈序列編號：133、輕鏈序列編號：134)、及HM_4_1_R_001(重鏈序列編號：135、輕鏈序列編號：136)對hHMGB1的結合活性是否為pH依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)解析該等抗體與hHMGB1之相互作用。作為中性區域pH及酸性區域pH之條件，分別在pH7.4及pH5.8之溶液中解析抗原抗體反應之相互作用。於經胺偶合法固定化適當量之protein A/G(PIERCE)的Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，分別捕捉目的抗體200RU左右。跑動緩衝液係使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH5.8)之2種緩衝液。hHMGB1之稀釋亦使用各自的緩衝液。測定全部在25℃實施。
在使用了HM_3_2_R_017抗體及HM_3_2_R_054抗體及HM_4_1_R_001抗體之抗原抗體反應相互作用的解析時，藉由將hHMGB1之稀釋液與空白之跑動緩衝液以流速10μL/min注入60秒，捕捉於感應晶片上。使hHMGB1與HM_3_2_R_017抗體及HM_3_2_R_054抗體及HM_4_1_R_001抗體相互作用。之後，藉由將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。
藉由前述方法所測定之pH7.4,pH5.8之表面電漿共振 感應圖(sensorgram)係如圖15所示。
由前述結果，HM_3_2_R_017抗體、HM_3_2_R_054抗體及HM_4_1_R_001抗體，藉由將緩衝液中之pH由pH7.4變為pH5.8，觀察到對hHMGB1之結合能力降低，顯示對人類HMGB1亦可取得pH依存性結合抗體。
[參考實施例1]使用正常小鼠之Ca依存性結合抗體對抗原之血漿中滯留性之影響的評估 (1-1)使用正常小鼠之in vivo試驗
對正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)單獨投與hsIL-6R(可溶型人類IL-6受體：於參考實施例4中製造)或同時投與hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體後，評估hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體內動態。將hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或、hsIL-6R與抗人類IL-6受體抗體之混合溶液對尾靜脈以10 mL/kg單次投與。抗人類IL-6受體抗體係使用前述之H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1。
混合溶液中之hsIL-6R濃度全部為5μg/mL，但抗人類IL-6受體抗體濃度隨著各抗體而不同，H54/L28-IgG1為0.1 mg/mL、6RL#9-IgG1及FH4-IgG1為10 mg/mL，此時，相對於hsIL-6R，抗人類IL-6受體抗體存在充分過剩的量，因此可認為hsIL-6R大部分與抗體結合。在投與後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日之時點進行採血。將採取之血液立即在4℃、 12,000 rpm離心分離15分鐘藉以得到血漿。分離之血漿，至實施測定為止係保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(1-2)ELISA法正常小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度的測定
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度係以ELISA法測定。首先將Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab’)2 Fragment of Antibody(SIGMA)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚藉以製成Anti-Human IgG固相化盤。作為血漿中濃度，將0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL之校準曲線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣分別分注至Anti-Human IgG固相化盤，於25℃培養1小時。之後使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)在25℃反應1小時後，使Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)在25℃反應0.5小時。使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質進行發色反應。藉由1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)停止發色反應後，使用微孔盤讀取器測定發色液在450 nm之吸光度。使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)，以校準曲線之吸光度為基準來算出小鼠血漿中濃度。用此方法測定之靜脈內投與後正常小鼠中之H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1在血漿中之抗體濃度轉變係如圖16所示。
(1-3)電化學發光法之血漿中hsIL-6R濃度的測定
以電化學發光法測定小鼠之血漿中hsIL-6R濃度。將調整為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL之hsIL-6R校準曲線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣、經SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)及tocilizumab(重鏈序列編號：24、輕鏈序列編號：25)溶液之混合液在4℃反應一晚。使樣品中之Free Ca濃度降低，使樣品中之大致全部之hsIL-6R由6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解離，為了成為與添加之tocilizumab結合的狀態，此時之Assay buffer中含有10 mMEDTA。之後，將該反應液分注於MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。進一步地將經在25℃反應1小時之盤的各孔洗淨後，於各孔中分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定反應液。hSIL-6R濃度係由校準曲線之反應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算出。經前述方法測定之靜脈內投與後正常小鼠中血漿中之hsIL-6R濃度轉變，係如圖17所示。
結果，單獨hsIL-6R時顯示非常快的消失，相對於此，與hsIL-6R不進行Ca依存性的結合之通常抗體即H54/L28-IgG1同時投與時，hsIL-6R之消失會大幅延遲。 相對於此，與會與hsIL-6R進行100倍以上之Ca依存性的結合之6RL#9-IgG1或FH4-IgG1同時投與時，hsIL-6R之消失係大幅地加速。相較於將H54/L28-IgG1同時投與時的情況，將6RL#9-IgG1及FH4-IgG1同時投與時，一日後血漿中之hsIL-6R濃度分別降低39倍及2倍。由此可確認鈣依存性結合抗體由血漿中可加速抗原的消失。
[參考實施例2]Ca依存性抗原結合抗體之抗原消失加速效果的提高探討(抗體製造) (2-1)關於IgG抗體對FcRn之結合
IgG抗體藉由與FcRn結合，而具有長的血漿中滯留性。IgG與FcRn之結合僅在酸性條件下(pH6.0)被觀察到，於中性條件下(pH7.4)幾乎觀察不到其結合。IgG抗體係非特異性地被攝入細胞，但在內體內之酸性條件下藉由與內體內之FcRn結合，回到細胞表面上，在血漿中之中性條件下會由FcRn解離。於IgG之Fc區域導入變異，使酸性條件下對FcRn之結合喪失時，會變得不自內體內回收到血漿中，因此抗體之血漿中滯留性顯著地受損。
作為改善IgG抗體之血漿中滯留性的方法，係報導有在酸性條件下使對FcRn之結合提高之方法。藉由於IgG抗體之Fc區域導入胺基酸取代，使酸性條件下對FcRn之結合提高，藉以使由內體內至血漿中之IgG抗體回收效率上昇。結果，IgG抗體在血漿中之滯留性會改善。導入胺基酸之取代時重要者，為不使中性條件下對FcRn之結合 提高。中性條件下與FcRn結合之IgG抗體，即使在內體內之酸性條件下能夠與FcRn結合藉以回到細胞表面上，因為在中性條件下之血漿中，IgG抗體不由FcRn解離，不回收到血漿中，因此IgG抗體在血漿中滯留性反而受損。
例如，如Dall’Acqua等人(J.Immunol.(2002)169(9),5171-5180)所記載，報導了對小鼠投與之藉由導入胺基酸取代而在中性條件下(pH7.4)觀察到對小鼠FcRn之結合的IgG1抗體在血漿中滯留性會惡化。又，如Yeung等人(J.Immunol.(2009)182(12),7663-7671)、Datta-Mannan等人(J.Biol.Chem.(2007)282(3),1709-1717)、Dall’Acqua等人(J.Immunol.(2002)169(9),5171-5180)所記載，藉由導入胺基酸取代，在酸性條件下(pH6.0)對人類FcRn之結合提高的IgG1抗體改變體，在中性條件下(pH7.4)同時觀察到對人類FcRn之結合。有報導對食蟹獼猴投與之該抗體之血漿中滯留性未改善，未觀察到血漿中滯留性之變化。因此，在提高抗體功能之抗體工程技術中，係致力於不使在中性條件下(pH7.4)對人類FcRn之結合增加，而使在酸性條件下對人類FcRn之結合增加，藉以改善抗體之血漿中滯留性。亦即，至今為止並未有報導藉由於其Fc區域導入胺基酸取代，在中性條件下(pH7.4)對人類FcRn之結合會增加之IgG1抗體的優點。
Ca依存性地與抗原結合之抗體，具有使可溶型抗原之消失加速，使一個抗體分子重複複數次地與可溶型抗原 結合之效果，故極為有用。作為使此抗原消失加速效果進一步提高的方法，在中性條件下(pH7.4)使對FcRn之結合增強之方法被驗證。
(2-2)中性條件下具有對FcRn之結合活性之Ca依存性的人類IL-6受體結合抗體之調製
藉由於具有鈣依存性抗原結合能力之FH4-IgG1、6RL#9-IgG1、及作為對照使用之不具有鈣依存性抗原結合能力之H54/L28-IgG1的Fc區域中導入胺基酸變異，製造於中性條件下(pH7.4)具有對FcRn之結合的改變體。胺基酸變異之導入係使用使用了PCR之所屬技術領域中具有通常知識者公知方法來進行。具體而言，製造對IgG1之重鏈恆定區域，將EU編號表示之434位之胺基酸之Asn以Trp取代之FH4-N434W(重鏈序列編號：94、輕鏈序列編號：81)、6RL#9-N434W(重鏈序列編號：95、輕鏈序列編號：79)與H54/L28-N434W(重鏈序列編號：96、輕鏈序列編號：83)。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，使用所附說明書記載之方法製造插入有編碼其胺基酸經取代之變異體的聚核苷酸之動物細胞表現載體。抗體之表現、純化、濃度測定係根據實施例15記載之方法來實施。
[參考實施例3]使用正常小鼠之Ca依存性結合抗體的消失加速效果評估 (3-1)使用了正常小鼠之in vivo試驗
對正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)評估單獨投與hsIL-6R(可溶型人類IL-6受體：於參考實施例4製造)、或同時投與hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體後之hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體的體內動態。將hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R與抗人類IL-6受體抗體之混合溶液對尾靜脈以10 mL/kg單次投與。抗人類IL-6受體抗體係使用上述之H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W。
混合溶液中之hsIL-6R濃度全部為5μg/mL，但抗人類IL-6受體抗體之濃度隨著抗體而不同，H54/L28-N434W調製為0.042 mg/mL、6RL#9-N434W調製為0.55 mg/mL、FH4-N434W調製為1 mg/mL。此時，相對於hsIL-6R，抗人類IL-6受體抗體存在充分過剩的量，因此可認為hsIL-6R之大部分係與抗體結合。在投與後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日之時點進行採血。將採取之血液立即以4℃、12,000 rpm離心分離15分鐘藉以得到血漿。分離之血漿，到實施測定為止係保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(3-2)ELISA法之正常小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度的測定
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度，係以與參考實施例1同樣之ELISA法來測定。經此方法測定之靜脈 內投與後正常小鼠中H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W抗體在血漿中抗體濃度之轉變，係如圖18所示。
(3-3)電化學發光法之血漿中hsIL-6R濃度測定
小鼠血漿中hsIL-6R濃度係以電化學發光法測定。將調製為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL之hsIL-6R校準曲線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣、與經SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)之混合液在4℃反應1晚。使樣品中之Free Ca濃度降低，為了使樣品中之大致全部之hsIL-6R係由6RL#9-N434W或FH4-N434W解離，使成為作為free體存在之狀態，此時之Assay buffer中含有10 mMEDTA。之後，將該反應液分注於MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。進一步地，經於25℃反應1小時反應之盤的各孔洗淨後，於各孔中分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定反應液。hSIL-6R濃度係由校準曲線之回應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)來算出。以前述方法測定之靜脈內投與後正常小鼠中，血漿中之hsIL-6R的濃度轉變係如圖19所示。
結果，經同時投與pH7.4時具有對FcRn之結合活 性，另一方面，不具有對hsIL-6R之Ca依存性的結合活性之H54/L28-N434W抗體時，相較於單獨投與hsIL-6R之情況，hsIL-6R之消失係大幅地延遲。相對於此，同時投與對hsIL-6R具有100倍以上之Ca依存性結合，且pH7.4時具有對FcRn之結合的6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體時，相較於單獨投與hsIL-6R時，hsIL-6R之消失更為加速。相較於單獨投與hsIL-6R時的情況，同時投與6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體時，投與後一日之血漿中的hsIL-6R濃度分別降低3倍及8倍。結果，確認了藉由對鈣依存性地對抗原結合之抗體賦予在pH7.4對FcRn之結合活性，抗原由血漿中之消失可進一步加速。
相較於不具有對hsIL-6R之Ca依存性結合的H54/L28-IgG1抗體，對hsIL-6R具有100倍以上之Ca依存性結合活性之6RL#9-IgG1抗體或FH4-IgG1抗體，確認了會增大hsIL-6R消失之效果。對hsIL-6R具有100倍以上之Ca依存性的結合，且具有在pH7.4對FcRn之結合的6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體，被確認了hsIL-6R之消失比起hsIL-6R單獨投與更為加速。該等數據暗示了與pH依存性地與抗原結合之抗體同樣地，Ca依存性地與抗原結合之抗體在內體內會使抗原解離。
[參考實施例4]可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之調製
抗原之人類IL-6受體的重組人類IL-6受體係如以下 方式調製。以所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法構築Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152,4958-4968)所報導之N末端側第1號至第357號之胺基酸序列所構成的可溶型人類IL-6受體(以下稱為hsIL-6R)之CHO恆定表現株。藉由培養該表現株，表現hsIL-6R。由所得之培養上清液中，藉由Blue Sepharose 6 FF管柱層析、凝膠過濾管柱層析來純化hsIL-6R。將最終步驟中作為主要波峰而溶出的部分，作為最終純化品來使用。
[參考實施例5]NMR之包含具有鈣離子結合模式結構之人類hVk1序列的抗體之鈣離子結合活性評估 (5-1)抗體之表現與純化
純化用於NMR測定所表現之包含LfVk1_Ca之抗體與包含LfVk1之抗體。具體而言，就包含LfVk1_Ca之抗體(亦稱為LfVk1_Ca抗體)方面，係將調製為可分別表現重鏈(序列編號：24)與輕鏈(序列編號：43)之動物表現用質體暫時地導入動物細胞。又，就包含LfVk1之抗體(亦稱為LfVk1抗體)方面，係將調製為可分別表現重鏈(序列編號：24)與輕鏈(序列編號：44)之動物表現用質體暫時地導入動物細胞。以最終細胞密度成為1 x 106細胞/mL的方式，於懸濁於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)之100 mL來自人類胎兒腎細胞之FreeStyle 293-F株(Invitrogen)細胞懸濁液中，添加標誌胺基酸。具體而言，就Asp/Glu/Gln/Asn標誌體，係添加將使L-Aspartic acid-13C4，15N(10 mg)、L-Glutamic acid-13C5，15N(2.5 mg)、L-Glutamine-13C5，15N2(60 mg)、L-Asparagine-13C4，15N2．H2O(2.5 mg)、β-chloro-L-alanine(6 mg)懸濁於10 mL水的溶液，經0.22μm濾膜而過濾的液體。就Leu標誌體而言，係添加將使L-Leucine-15N(30 mg)、β-chloro-L-alanine(6 mg)懸濁於10 mL水的溶液，經0.22μm濾膜而過濾的液體。藉由脂質體轉染法，將調製之質體導入細胞。經導入質體之細胞係在CO2培養器(37℃、8%CO2、90 rpm)中進行5日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，遵照所屬技術領域中具有通常知識者公知之方法，由上述所得之培養上清液中純化抗體。使用分光光度計測定經純化之抗體溶液在280 nm之吸光度。使用由PACE法算出之吸光係數，由測定值算出抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(5-2)Fab片段之調製
使用分子量區分尺寸30,000MWCO之超微過濾膜，將各種抗體濃縮至8.2-11.8 mg/mL。使用L-Cystein 1 mM、EDTA 2 mM、50 mM乙酸/125 mM TRIS緩衝液(pH 6.8)調製稀釋為8 mg/mL之該抗體的試樣。將對各抗體添加1/240量之Papain(Roche Applied Science)且經攪拌之該試樣，在37℃靜置1小時。靜置後，分別添加於在下游縱列聯結有1 mL尺寸之蛋白質A載劑管柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)的經50 mM乙酸/125 mM TRIS緩衝 液(pH 6.8)平衡化之結合有Gly-Gly-Tyr-Arg(Sigma)胜肽的1 mL尺寸的HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)。藉由上游之Gly-Gly-Tyr-Arg胜肽將活性化Papain去除，而且以下游之蛋白質A載劑管柱將Fc片段及未消化抗體去除，藉以得到Fab片段之純化部分。為了防止Fab部分所含之不活性Papain活化，於Fab部分添加半胱胺酸蛋白酶阻礙劑E64(Sigma)10μM。再者，上述全部的管柱操作均在20至25℃之室溫下實施。
(5-3)LfVk1_Ca抗體及LfVk1抗體之Fab片段之NMR試樣調製
將抗體溶液使用MWCO 5000之超微過濾器Vivaspin(Sartorius)藉由離心濃縮至0.5 mL。接著於上述超微過濾器設置濾洗杯，將緩衝液取代為NMR用緩衝液：5 mM d-BisTris,20 mM NaCl,0.001%(w/v)NaN3,5%(v/v)2H2O,pH 7.0(使用NaOH、HCl調整pH)(重複3次於濾洗杯中加入上述緩衝液5 mL，且離心濃縮至0.5 mL)，最後濃縮至0.25 mL。最後，以NMR緩衝液潤洗超微過濾器，與濃縮液合併，使LfVk1_Ca抗體溶液成為420μL、LfVk1抗體溶液成為270μL。於此階段再度確認pH，依照需要藉由NaOH、HCl調整為pH 7.0。使用UV測定器Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)，測定280 nm之吸光度，使280 nm之莫耳吸光係數為70000 M-1．cm-1來定量Fab片段。使Leu標誌LfVk1_Ca抗體、Leu標誌LfVk1抗體成 為0.12 mM；使Asp、Glu、Asn、Gln標誌LfVk1_Ca抗體、Asp、Glu、Asn、Gln標誌LfVk1抗體成為0.24 mM。該等之試樣內，使用巴斯德吸管，對於LfVk1_Ca抗體而言係填充於直徑5 mm之NMR試樣管(shigemi)中、對於LfVk1抗體而言係填充於直徑5 mm之水溶液用對稱形微試樣管(shigemi)中。在LfVk1_Ca抗體之Ca2+滴定實驗中，依次添加CaCl2溶液於抗體溶液中，使得相對於抗體而言，Ca2+成為1、2、5、10、20莫耳當量。添加所用之CaCl2溶液，係準備了溶解於NMR緩衝液之10、20、50、100 mM CaCl2溶液。藉由使注射器部分比習知品更延長之特注微注射器(ITO)，以添加容量為3-10μL的範圍之方式，將CaCl2溶液之必要量直接添加於填充於NMR試樣管之抗體溶液中，藉由旋渦混合器攪拌試樣管後，藉由手動離心器(Shimadzu)離心分離。
(5-3)用於觀測LfVk1_Ca抗體及LfVk1_Ca抗體之Fab片段的醯胺基訊息之NMR測定
NMR測定係使用設置有TCI CryoProbe之NMR分光器DRX750(Bruker Biospin)。將設定溫度設為307K(GasFlow 535 L/h)。用於觀測醯胺基訊息之NMR測定，係使用1H-15N HSQC。測定法係使用於15N進化期間(evolution period)將α碳與羰基碳同時13C去偶合、及伴隨使用用於消除溶劑水訊息之3-9-19脈衝群(pulse train)的1H-15N FHSQC，控制其之控制脈衝程式係使用製造商(Bruker Biospin)訂為標準所準備者。NMR之測定條件如以下所示。光譜寬度：12019Hz(f2),1976 Hz(f1)、數據點數：2048(f2),128(f1)。數據處理係使用Topspin 3.0(Bruker Biospin)。數據處理條件如以下所示。f2、f1一起作為窗函數乘上shifted Sine(QSINE)，以成為2倍數據點數的方式進行補零(zero filling)後，進行傅立葉轉換。訊息之化學位移係使用NMR解析軟體Sparky(UCSF)算出。
(5-4)主鏈醯胺基之NMR訊息的設算
至今為止tocilizumab(重鏈序列編號：24、輕鏈序列編號：25)Fab片段之主鏈醯胺基的NMR訊息中，80%已被設算(數據未公開)。LfVk1_Ca抗體之Fab片段的胺基酸序列，除了輕鏈CDR1、CDR2、CDR3之一部分，及輕鏈73、83號胺基酸殘基以外，tocilizumab與Fab片段之胺基酸序列係為相同。對兩抗體中胺基酸序列相同的部分，其NMR訊息具有相同之化學位移，或該等化學位移接近，故可沿用tocilizumab設算資訊。關於Leu標誌試樣，輕鏈11、(33)、(46)、(47)、(54)、(78)、125、135、136、154、175、179、181、201；重鏈18、46、64、71、81、83、114、144、147、165、176、181、184、195可沿用設算。上述之未附有括弧之編號係為與tocilizumab相同之化學位移，可沿用設算之殘基編號，附有括弧之編號，係具有與tocilizumab接近之化學位移，此外並無具有接近之化學位移的訊息，因此為能夠設算之殘基編號。 另一方面，對於Asp、Glu、Asn、Gln標誌試樣，比較LfVk1_Ca抗體與LfVk1抗體之光譜，於LfVk1_Ca新觀測到4個訊息。此可分類為於此兩抗體間，Asp、Glu、Asn、Gln殘基之內，作為Ca2+結合模式結構而導入之序列相異的輕鏈Asp30、31、32、92、Glu50之5殘基當中任4殘基所由來。
(5-5)Ca2+之在LfVk1_Ca抗體上之結合部位鑑定
比較LfVk1_Ca抗體之Fab片段的Ca2+未添加狀態、與添加20莫耳當量之1H-15N HSQC光譜，萃取化學位移有變化之訊息。結果，由Leu標誌試樣可知輕鏈Leu33係與結合相關聯，此外之Leu殘基與結合無關。又，由Asp、Glu、Asn、Gln標誌試樣，可知輕鏈Asp30、31、32、92、Glu50之5殘基當中的任意4殘基係與結合相關聯，此外之Asp、Glu、Asn、Gln殘基當中除了1殘基之外，全部與結合無關。由以上所述，可知作為Ca2+結合模式結構而導入之胺基酸序列當中，至少輕鏈CDR1、此外輕鏈CDR2、CDR3之兩者或任一者之胺基酸係與Ca2+結合相關聯。此係與實施例15中所確認之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)當中之4個為hVk5-2序列之胺基酸此一條件對鈣離子之結合很重要之結果一致。
(5-6)算出滴定實驗中之Ca2+解離常數
利用了Ca2+濃度相對於LfVk1_Ca抗體之Fab片段為 0、1、2、5、10、20莫耳當量時之1H-15N HSQC光譜。以作為結合部位而被鑑定之輕鏈Leu33訊息之1H或15N化學位移為縱軸、以上述Ca2+之莫耳當量為橫軸來作圖，使用製圖軟體Gnuplot來進行以下之式2所示之函數擬合。
[式2]f(x)=s×[1-0.5/a×{(a×x+a+Kd)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}+t×[0.5/a×{(a×x+a+Kd)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}
式2表示之函數中，s、t分別顯示Ca2+非結合時之化學位移[ppm]、Ca2+飽和結合時之推測化學位移[ppm]；a顯示抗體Fab片段濃度[M]；Kd顯示解離常數；x顯示對抗體Fab片段所添加之Ca2+的莫耳當量。擬合時，係以s，t，Kd為擬合參數。結果，由1H化學位移，估計Kd=7.1×10-5[M]、由15N化學位移，估計Kd=5.9×10-5[M]。
[圖1]顯示由經導入pH依存性地與抗原結合之抗體基因庫之大腸菌中單離之132殖株序列資訊的胺基酸之分布(表示為Library)與經設計之胺基酸分布(表示為Design)的關係之圖。橫軸表示以Kabat編號表示之胺基酸的部位。縱軸表示胺基酸之分布的比例。
[圖2]顯示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH7.4之表面電漿共振感應圖(sensorgram)。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
[圖3]顯示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH6.0之表面電漿共振感應圖(sensorgram)。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
[圖4A]顯示pH依存性結合抗體在血漿中(pH7.4)與內體內(pH6.0)對抗原之相互作用的樣式之圖。
[圖4B]顯示鈣依存性結合抗體在血漿中(Ca2+ 2mM)與內體內(Ca2+ 3μM)對抗原的相互作用樣式之圖。
[圖4C]顯示pH及鈣依存性結合抗體在血漿中(Ca2+ 2mM)與內體內(Ca2+ 3μM)對抗原之相互作用的樣式之圖。
[圖5]為包含人類Vk5-2序列之抗體、與包含人類Vk5-2序列中之糖鏈附加序列被改變之h Vk5-2_L65序列之抗體的離子交換層析圖。實線表示包含人類Vk5-2序列之抗體(重鏈：CIM_H、序列編號：4及輕鏈：hVk5-2、序列編號：1與序列編號：26融合者)之層析圖、虛線表示具有hVk5-2_L65序列之抗體(重鏈：CIM_H(序列編號：4)、輕鏈：hVk5-2_L65(序列編號：5))之層析圖。
[圖6]為包含LfVk1_Ca序列之抗體(重鏈：GC_H、序列編號：48及輕鏈：LfVk1_Ca、序列編號：43)、與包含LfVk1_Ca序列中之Asp(D)殘基被改變為Ala(A)殘基之序列的抗體在5℃保存後(實線)或50℃保存後(點線)之離子交換層析圖。將各自在5℃保存後之離子交換層析圖中最高 之波峰作為主要波峰(main peak)，以主要波峰進行y軸標準化後之圖。
[圖7]為包含LfVk1_Ca序列之抗體(重鏈：GC_H、序列編號：48及輕鏈：LfVk1_Ca、序列編號：43)、與包含LfVk1_Ca序列中之30位(Kabat編號)Asp(D)殘基被改變為Ser(S)殘基之LfVk1_Ca6序列(重鏈：GC_H、序列編號：48及輕鏈：LfVk1_Ca6、序列編號：49)的抗體在5℃保存後(實線)或50℃保存後(點線)之離子交換層析圖。將各自在5℃保存後之離子交換層析圖中最高之波峰作為主要波峰，以主要波峰進行y軸標準化後之圖。
[圖8]為顯示由經導入Ca依存性地與抗原結合之抗體基因庫之大腸菌中單離的290殖株之序列資訊的胺基酸分布(表示為Library)與經設計之胺基酸分布(表示為Design)之關係圖。橫軸為以Kabat編號表示之胺基酸部位。縱軸表示胺基酸分布之比例。
[圖9]為表示在高鈣離子濃度之條件(1.2 mM)下的抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之表面電漿共振感應圖(sensorgram)。橫軸顯示時間、縱軸顯示RU值。
[圖10]表示在低鈣離子濃度之條件(3μM)下的抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之表面電漿共振感應圖(sensorgram)。橫軸顯示時間、縱軸顯示RU值。
[圖11]表示於X射線結晶構造解析中決定之6RL#9 抗體Fab片段的重鏈CDR3構造。(i)為顯示於存在鈣離子之結晶化條件中得到之結晶構造之重鏈CDR3的圖、(ii)為顯示於不存在鈣離子之結晶化條件中得到之結晶構造之重鏈CDR3的圖。
[圖12]為顯示使用了Biacore之抗人類IgA抗體在Ca2+1.2 mM及Ca2+ 3μM下對人類IgA之相互作用的表面電漿共振感應圖(sensorgram)的圖。
[圖13]為顯示使用了ELISA法之抗人類磷脂肌醇聚糖3(GPC3)抗體在Ca2+1.2 mM及Ca2+ 3μM下對重組人類磷脂肌醇聚糖3之相互作用的圖。
[圖14]為顯示使用了Biacore之抗小鼠IgA抗體在pH7.4及pH5.8下對小鼠IgA之相互作用的表面電漿共振感應圖(sensorgram)之圖。實線表示pH7.4、虛線表示pH5.8之條件。
[圖15]為顯示使用了Biacore之抗人類HMGB1抗體在pH7.4及pH5.8下對人類HMGB1之相互作用的表面電漿共振感應圖(sensorgram)之圖。實線表示pH7.4、虛線表示pH5.8之條件。
[圖16]為顯示H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及6RL#9-IgG1抗體在正常小鼠血漿中之抗體濃度轉變的圖。
[圖17]為顯示經投與H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及、6RL#9-IgG1抗體之正常小鼠血漿中的可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度轉變之圖。
[圖18]為顯示H54/L28-N434W抗體、FH4-N434W抗體、及、6RL#9-N434W抗體在正常小鼠血漿中之抗體濃度轉變的圖。
[圖19]為顯示經投與H54/L28-N434W抗體、FH4-N434W抗體、及、6RL#9-N434W抗體在正常小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度轉變之圖。
<110> Chugai Seivaku Kabushiki Kaisha
<120> library of ionic concentration-dependent binding molecules
<130> PCG-9036WO
<150> JP 2011-218006
<151> 2011-09-30
<150> JP 2012-123479
<151> 2012-05-30
<160> 136
<170> PatentIn version 3.1
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Claims (82)

  1. 一種分子庫，其係主要由彼此序列互異的複數個抗原結合分子所構成之分子庫，其特徵在於，前述抗原結合分子中之抗原結合結構域，係包含隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基。
  2. 如申請專利範圍第1項之分子庫，其中離子濃度為鈣離子濃度。
  3. 如申請專利範圍第2項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之重鏈的抗原結合結構域中。
  4. 如申請專利範圍第3項之分子庫，其中重鏈之抗原結合結構域為重鏈可變區域。
  5. 如申請專利範圍第4項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈可變區域之CDR3中。
  6. 如申請專利範圍第2至5項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈CDR3之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位中。
  7. 如申請專利範圍第2至6項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基以外之胺基酸序列係包含天然序列之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第3至7項中任一項之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈可變區域係包含天然序列之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第2項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之輕鏈的抗原結合結構域中。
  10. 如申請專利範圍第9項之分子庫，其中輕鏈之抗原結合結構域為輕鏈可變區域。
  11. 如申請專利範圍第10項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之CDR1中。
  12. 如申請專利範圍第11項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於CDR1之以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位中。
  13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之CDR2中。
  14. 如申請專利範圍第13項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2之以Kabat編號表示之50位中。
  15. 如申請專利範圍第10至14項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基為輕鏈之CDR3。
  16. 如申請專利範圍第15項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3之以Kabat編號表示之92位中。
  17. 如申請專利範圍第2或9至16項中任一項之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈的框架係包含生殖細胞系列之框架序列。
  18. 如申請專利範圍第2或9至17項中任一項之分子庫，其中前述抗原結合分子之重鏈可變區域係包含天然序列之胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係形成鈣結合模式結構。
  20. 如申請專利範圍第19項之分子庫，其中鈣結合模式結構為鈣黏素結構域、EF hand、C2結構域、Gla結構域、C型凝集素、結構域、annexin、thrombospondin 3型結構域及類EGF結構域、Vk5之部分、序列編號10、序列編號11之任一者之鈣結合模式結構。
  21. 如申請專利範圍第2至20項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係具有金屬鉗合作用之胺基酸。
  22. 如申請專利範圍第21項之分子庫，其中具有金屬鉗合作用之胺基酸，係絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺、天門冬胺酸或麩胺酸之任一者以上之胺基酸。
  23. 如申請專利範圍第1項之分子庫，其中離子濃度之條件為pH。
  24. 如申請專利範圍第23項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之重鏈的抗原結合結構域中。
  25. 如申請專利範圍第24項之分子庫，其中重鏈之抗原結合結構域為重鏈可變區域。
  26. 如申請專利範圍第25項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於重鏈可變區域之以Kabat編號表示之27 位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位或107位之任一者以上中。
  27. 如申請專利範圍第26項之分子庫，其中重鏈可變區域之以Kabat編號表示之27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位或107位之任一者的胺基酸殘基以外之胺基酸序列係包含天然序列之胺基酸序列。
  28. 如申請專利範圍第23至27項中任一項之分子庫，其中前述抗原結合分子之輕鏈可變區域係包含生殖細胞系列之序列。
  29. 如申請專利範圍第23項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於前述抗原結合分子之輕鏈的抗原結合結構域中。
  30. 如申請專利範圍第29項之分子庫，其中輕鏈之抗原結合結構域為輕鏈可變區域。
  31. 如申請專利範圍第30項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之以Kabat編號表示之24位、27位、28位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位或95a位之任一者以上 中。
  32. 如申請專利範圍第30或31項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈可變區域之CDR1中。
  33. 如申請專利範圍第32項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR1之以Kabat編號表示之24位、27位、28位、30位、31位、32位或34位的任一者以上中。
  34. 如申請專利範圍第30至33項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2中。
  35. 如申請專利範圍第34項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR2之以Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位或56位之任一者以上中。
  36. 如申請專利範圍第30至35項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3中。
  37. 如申請專利範圍第36項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係包含於輕鏈之CDR3之以Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93、94位或95a位之任一者以上中。
  38. 如申請專利範圍第29至37項中任一項之分子庫，其中輕鏈之框架係包含生殖細胞系列之框架序列。
  39. 如申請專利範圍第29至38項中任一項之分子庫，其中重鏈可變區域為天然序列。
  40. 如申請專利範圍第23至39項中任一項之分子 庫，其中前述胺基酸殘基係側鏈之pKa為4.0-8.0的胺基酸。
  41. 如申請專利範圍第23至40項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基為麩胺酸。
  42. 如申請專利範圍第23至39項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基係側鏈之pKa為5.5-7.0的胺基酸。
  43. 如申請專利範圍第23至40或42項中任一項之分子庫，其中前述胺基酸殘基為組胺酸。
  44. 一種分子庫，其係主要由包含如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之抗原結合分子之複數個融合多肽所構成之分子庫，其特徵在於，前述融合多肽係抗原結合分子之重鏈可變區域與病毒外殼蛋白質之至少一部分經融合者。
  45. 如申請專利範圍第44項之分子庫，其中前述病毒外殼蛋白質係選自由蛋白質pIII、主外殼蛋白質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變異體所構成群組。
  46. 一種組成物，其係包含各自編碼如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸分子。
  47. 一種組成物，其係包含：以連結為能夠作用的狀態各自包含如申請專利範圍第46項之複數個聚核苷酸分 子之複數個載體。
  48. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中載體為可複製之表現載體。
  49. 如申請專利範圍第48項之組成物，其中可複製之表現載體係使選自由lac Z啟動子系、鹼性磷酸酯酶pho A啟動子(Ap)、噬菌體λPL啟動子(溫度感受性啟動子)、tac啟動子、色胺酸啟動子、pBAD啟動子及噬菌體T7啟動子所構成群組之啟動子區域在表現載體中與前述聚核苷酸連結為能夠作用。
  50. 如申請專利範圍第48或49項之組成物，其中可複製之表現載體為M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物；或者λ型噬菌體或其衍生物。
  51. 一種組成物，其係包含：各自包含如申請專利範圍第47至50項中任一項所記載之載體的複數個病毒。
  52. 一種組成物，其係包含：各自於其表面展現如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個病毒。
  53. 一種分子庫，其係包含如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之分子庫，且其係具有1 x 106至1 x 1014個之彼此相異之可變區域序列。
  54. 如申請專利範圍第53項之分子庫，其係具有1 x 108以上個之彼此相異之可變區域序列。
  55. 一種分子庫之製造方法，其係主要由彼此序列互異的複數個抗原結合分子所構成之分子庫之製造方法，且其係包含製造以前述抗原結合分子中之抗原結合結構域係包含隨著離子濃度之條件不同，抗原結合分子對抗原的結合活性會變化之至少一個胺基酸殘基的方式所設計之複數個抗原結合分子。
  56. 如申請專利範圍第55項之製造方法，其中前述抗原結合分子為如申請專利範圍第2至43項中任一項所記載之抗原結合分子。
  57. 如申請專利範圍第55或56項之製造方法，其中前述抗原結合分子之重鏈可變區域係與病毒外殼蛋白質之至少一部分融合。
  58. 如申請專利範圍第55至57項中任一項之製造方法，其中前述病毒外殼蛋白質係選自由蛋白質pIII、主外殼蛋白質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pvl及其變異體所構成群組。
  59. 一種選擇抗原結合分子之方法，其係選擇隨著離子濃度之條件不同，對抗原之結合活性會變化之抗原結合分子之方法，且其係包含a)製造主要由如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽所構成之分子庫之步驟、 b)將前述分子庫在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、c)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子的集團之步驟、d)由於c)所區分的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之步驟。
  60. 一種單離聚核苷酸之方法，其係單離編碼隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子的聚核苷酸之方法，且其係包含a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠作用之狀態各自包含各自編碼如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟。
  61. 如申請專利範圍第60項之方法，其中追加地重複由前述c)至d)的步驟至少1次。
  62. 如申請專利範圍第59至61項中任一項之方法，其中離子濃度為鈣離子濃度。
  63. 如申請專利範圍第62項之方法，其係選擇在低鈣濃度之條件下對抗原的結合活性比在高鈣濃度之條件下的結合活性更低之抗原結合分子。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中低鈣濃度之條件為0.1μM至30μM。
  65. 如申請專利範圍第63或64項之方法，其中高鈣濃度之條件為100μM至10 mM。
  66. 如申請專利範圍第59至61項中任一項之方法，其中離子濃度之條件為pH。
  67. 如申請專利範圍第66項之方法，其係選擇在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下的結合活性更低之抗原結合分子。
  68. 如申請專利範圍第66項之方法，其中pH酸性區域條件為pH4.0至6.5。
  69. 如申請專利範圍第67或68項之方法，其中pH中性區域條件為pH6.7至10.0。
  70. 一種抗原結合分子之製造方法，其係隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之製造方法，其係包含a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠 作用之狀態各自包含各自編碼如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟、g)培養經導入以連結為能夠作用之狀態插入經單離之聚核苷酸的載體之宿主細胞的步驟、h)由於g)所培養之培養液中回收抗原結合分子之步驟。
  71. 一種抗原結合分子之製造方法，其係隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之抗原結合分子之製造方法，其係包含a)製造分子庫之步驟，該分子庫係包含以連結為能夠作用之狀態各自包含各自編碼如申請專利範圍第1至43項中任一項所記載之彼此序列互異的抗原結合分子或如申 請專利範圍第44或45項所記載之彼此序列互異的融合多肽之複數個聚核苷酸的複數個可複製之表現載體、b)於經導入前述分子庫所包含之各自的表現載體之複數個病毒表面，表現由前述聚核苷酸所編碼之前述彼此序列互異的抗原結合分子或融合多肽之步驟、c)使前述複數個病毒在離子濃度相異之二個以上的條件下與抗原接觸之步驟、d)由前述分子庫中區分隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒的集團之步驟、e)由於d)所區分之病毒的集團中單離隨著離子濃度之條件不同，對抗原的結合活性會變化之病毒之步驟、f)由經單離之病毒中單離聚核苷酸之步驟、g)使經單離之聚核苷酸與編碼抗體恆定區域之聚核苷酸連結為同一讀框之步驟、h)培養經導入以連結為能夠作用之狀態插入於g)中經連結之聚核苷酸的載體之宿主細胞的步驟、i)由於h)所培養之培養液中回收抗原結合分子之步驟。
  72. 如申請專利範圍第70或71項之製造方法，其中追加地重複由前述c)至d)的步驟至少1次。
  73. 如申請專利範圍第70至72項中任一項之製造方法，其中離子濃度為鈣離子濃度。
  74. 如申請專利範圍第73項之製造方法，其係選擇在低鈣濃度之條件下對抗原的結合活性比在高鈣濃度之條件 下的結合活性更低之抗原結合分子。
  75. 如申請專利範圍第74項之製造方法，其中低鈣濃度之條件為0.1μM至30μM。
  76. 如申請專利範圍第74或75項之製造方法，其中高鈣濃度之條件為100μM至10mM。
  77. 如申請專利範圍第70至72項中任一項之製造方法，其中離子濃度之條件為pH之條件。
  78. 如申請專利範圍第77項之製造方法，其係選擇在pH酸性區域條件下對抗原的結合活性比在pH中性區域條件下之結合活性更低之抗原結合分子。
  79. 如申請專利範圍第78項之製造方法，其中pH酸性區域條件為pH4.0至6.5。
  80. 如申請專利範圍第78或79項之製造方法，其中pH中性區域條件為pH6.7至10.0。
  81. 一種抗原結合分子，其係藉由如申請專利範圍第70至80項中任一項之製造方法所製造。
  82. 一種醫藥組成物，其係包含如申請專利範圍第81項之抗原結合分子或其改變體。
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Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
CN108715614A (zh) 2010-11-30 2018-10-30 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
BR112013021526B1 (pt) 2011-02-25 2021-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) * 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
MX366968B (es) 2011-09-30 2019-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno que induce la inmunorespuesta al antigeno objetivo.
BR112014013081A2 (pt) 2011-11-30 2020-10-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha veículo contendo fármaco em célula para formação de um complexo imune
BR112014022855A2 (pt) 2012-03-16 2017-07-18 Regeneron Pharma animal não humano geneticamente modificado, mamífero geneticamente modificado, e, método para fabricar um animal não humano
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
US9301510B2 (en) 2012-03-16 2016-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that produce antigen-binding proteins with pH-dependent binding characteristics
EP2883449B1 (en) 2012-03-16 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
MX360368B (es) * 2012-04-27 2018-10-29 Bioatla Llc Regiones de anticuerpo modificado y sus usos.
RU2743463C2 (ru) 2012-05-30 2021-02-18 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Специфичная к ткани-мишени антигенсвязывающая молекула
CA2882272C (en) 2012-08-24 2023-08-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc.gamma.riib-specific fc region variant
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
BR112016005912A2 (pt) * 2013-09-18 2017-09-26 Regeneron Pharma sequência de ácido nucleico de cadeia leve de imunoglobulina recombinante, animal não humano geneticamente modificado, métodos para gerar um anticorpo e uma proteína de ligação e para produzir um animal não humano, célula ou tecido, vetor de alvejamento, proteína de ligação, e, ácido nucleico
EP3763813A1 (en) 2013-12-04 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
US10329556B2 (en) * 2014-05-13 2019-06-25 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
CN106459192B (zh) 2014-06-30 2021-08-03 默克专利股份公司 具有pH依赖性抗原结合的抗TNFa抗体
JP6858559B2 (ja) * 2014-08-20 2021-04-14 中外製薬株式会社 蛋白質溶液の粘度測定方法
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP3186284B1 (en) 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US10870704B2 (en) * 2014-10-23 2020-12-22 Kira Biotech Pty Limited CD83 binding proteins and uses thereof
JP6227191B1 (ja) 2014-12-19 2017-11-08 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体、変異Ｆｃ領域を含むポリペプチド、および使用方法
EP3247723A1 (en) 2015-01-22 2017-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
KR102286801B1 (ko) * 2015-02-24 2021-08-09 바이오아트라, 인코퍼레이티드 조건부 활성 생체 단백질
EP3549606A1 (en) 2015-05-28 2019-10-09 Bio-rad Laboratories, Inc. Affinity ligands and methods relating thereto
TWI751300B (zh) 2015-09-18 2022-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8 結合抗體及其用途
EP3371349A4 (en) 2015-11-02 2018-09-12 Bioatla, LLC Conditionally active polypeptides
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
US11254742B2 (en) 2016-05-13 2022-02-22 Bioatla, Inc. Anti-Ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
JP6527643B2 (ja) 2016-08-05 2019-06-05 中外製薬株式会社 Ｉｌ−８関連疾患の治療用又は予防用組成物
GB201615254D0 (en) * 2016-09-08 2016-11-23 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Novel Ligand and use thereof
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US20200095327A1 (en) * 2017-02-08 2020-03-26 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
KR20190120782A (ko) 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
EP3609915A1 (en) * 2017-04-12 2020-02-19 Pfizer Inc Antibodies having conditional affinity and methods of use thereof
JP2020522266A (ja) * 2017-06-05 2020-07-30 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 非対称なｃｈ２−ｃｈ３領域の変異を有する、操作された多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質
WO2019064463A1 (ja) * 2017-09-28 2019-04-04 学校法人中部大学 バイオアフィニティーを利用したウイルス又は細菌の濃縮方法及び装置
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
SG11202009010RA (en) 2018-03-15 2020-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use
KR102115300B1 (ko) * 2018-06-01 2020-05-26 재단법인 목암생명과학연구소 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법
WO2020041532A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Sf17 Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating progressive neurodegenerative diseases
CN112805302B (zh) * 2018-10-10 2023-01-31 深圳华大生命科学研究院 抗BCMA单链抗体scFv及其制备方法和应用
WO2020186111A2 (en) * 2019-03-12 2020-09-17 xCella Biosciences, Inc. Vista-binding antibodies and uses thereof
CN114729039A (zh) * 2019-03-12 2022-07-08 西恩斯医疗公司 Vista结合抗体及其用途
CN114846028A (zh) * 2019-11-01 2022-08-02 美真达治疗公司 抗cd45抗体及其结合物
KR20220113791A (ko) 2019-12-18 2022-08-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
CN112086160B (zh) * 2020-08-26 2023-09-22 江西中医药大学 基于Softmax和混合粒子群的中药量效拟合方法
EP4355775A1 (en) 2021-06-18 2024-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-ccl2 antibodies

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
JPH0636741B2 (ja) 1989-11-08 1994-05-18 帝人株式会社 ヒト・プロテインｃの分離方法
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2130177T3 (es) 1991-08-10 1999-07-01 Medical Res Council Tratamiento de poblaciones de celulas.
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
FR2707189B1 (fr) 1993-07-09 1995-10-13 Gradient Ass Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé.
AU690171B2 (en) 1993-12-03 1998-04-23 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
CA2177988A1 (en) * 1993-12-03 1995-06-08 Kazuo Higuchi Expression vector for preparing an anti-body-variable-region library
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1100890A2 (en) 1998-07-27 2001-05-23 Genentech, Inc. Improved transformation efficiency in phage display through modification of a coat protein
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP2141243A3 (en) 2000-10-16 2010-01-27 Brystol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
DE10207178A1 (de) * 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
US20060141456A1 (en) 2002-06-12 2006-06-29 Cynthia Edwards Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
RS58420B1 (sr) * 2003-11-05 2019-04-30 Roche Glycart Ag Cd20 antitela sa povećanim afinitetom za vezivanje fc receptora i efektornom funkcijom
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
CA2602663A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
EP2049564B1 (en) 2006-08-02 2017-05-17 The UAB Research Foundation Methods and compositions related to soluble monoclonal variable lymphocyte receptors of defined antigen specificity
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
EP2196541B1 (en) 2007-09-28 2012-11-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
US8728982B2 (en) 2007-12-19 2014-05-20 Centoco Ortho Biotech Inc. Engineered hybrid phage vectors for the design and the generation of a human non-antibody peptide or protein phage library via fusion to pIX of M13 phage
SI2235059T1 (sl) 2007-12-26 2015-06-30 Xencor, Inc. Fc variante s spremenjeno vezjo na fcrn
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
EP3670538A1 (en) * 2008-04-25 2020-06-24 Dyax Corp. Antibodies against fcrn and use thereof
CA2722600C (en) 2008-05-01 2014-01-21 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
WO2010058860A1 (ja) * 2008-11-18 2010-05-27 株式会社シノテスト 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬
JP5804521B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-04 モルフォシス・アー・ゲー コレクション及びその使用方法
SA111320266B1 (ar) * 2010-03-11 2015-06-21 رينات نيوروساينس كوربوريشن أجسام مضادة مع ارتباط مولد مضاد يعتمد على الأس الهيدروجيني
JP2011184418A (ja) 2010-03-11 2011-09-22 Tokyo Institute Of Technology 親和性可変抗体
CN108715614A (zh) * 2010-11-30 2018-10-30 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子

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