JP6858559B2 - 蛋白質溶液の粘度測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は蛋白質溶液の粘度の測定方法に関し、特に少量の試料で測定可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法に関する。
近年、抗体などの蛋白質を活性成分として含有する医薬品製剤において、その利便性などを考慮して皮下投与用溶液製剤の開発が進んでいる。それに伴い、溶液製剤中の活性成分である抗体などの蛋白質の高濃度化が進んでいる。高濃度蛋白質溶液製剤の開発において、溶液の粘度は製造性や製剤の使用性を大きく左右するため、開発全体へ重大な影響を与える物性課題である。高濃度化に伴う溶液粘度の上昇（高粘性）は、蛋白質分子表面の電荷分布の偏りに起因する静電的引力とその結果としての分子の会合化（クラスター化）が原因であるとされている（非特許文献１）。すなわち、高粘性は蛋白質分子自身の性質に起因することから、処方設計によって粘度を確実に低下させることは困難であり、製造性及び使用性の高い低粘性の蛋白質製剤の開発を志向する場合、その分子開発の時点で粘度の低い分子をピックアップしなければならない。
ところが、高濃度での粘度の実測値を得るためには大量の試料が必要であり、候補分子を評価する開発初期において粘度評価を実施することは現実的ではない。したがって、少量の試料で高濃度化した際の粘度を予測できる評価系の確立が望まれていた。
これまでに、低濃度試料の動的光散乱測定から得られる抗体分子間の相互作用の強さを表すパラメータが、高濃度化した際の粘度と相関することが報告されている。しかし、大まかな相関しか得られておらず、特に分子間相互作用が強く働く抗体に関しては、粘度の予測系としてパラメータの精度に問題があった（非特許文献２〜４）。
小角X線散乱（SAXS）とは、X線を試料に照射し、散乱強度の散乱角依存性（散乱プロファイル）を解析することで、試料内の粒子の形状などに関する情報を少量（10μL）の試料で得ることができる技術である。しかし、本技術を蛋白質溶液の粘度測定のパラメータとして用いることは今まで知られていない。
Pharm Res. 31 :2549-2558 (2014) Pharm Res. 29 :397-410 (2012) J Pharm Sci. 101 :998-1011 (2012) Biophys J. 103 :69-78 (2012)
本発明の目的は、特に少量の試料で実施可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法、蛋白質の粘性を予測する方法、粘性を制御した蛋白質の選抜方法、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法、および粘性の低い蛋白質を製造する方法を提供することである。
一般的に、抗体等の蛋白質溶液の粘度の測定には、せん断速度とせん断応力との比例係数から粘度を算出するレオメーターや、試料溶液中の金属球の回転速度から粘度を算出するEMS粘度計、あるいは試料の通過速度や通過の際の圧力損失から粘度を算出するマイクロ流路を利用した粘度測定器を用いるのが主流である。
しかし、レオメーターやEMS粘度計を利用した粘度測定には大量の試料を必要とし、試料調製作業も煩雑であった。従って、数多くの試料を同時期に測定することが困難であった。また、マイクロ流路を利用した粘度測定においては、吸着性の高い蛋白質溶液の粘度を正確に再現性よく測定することが困難であった。従って、少量の試料を多種類測定するような、粘度を指標とした改変蛋白質のスクリーニングは不可能であった。
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、従来、蛋白質の溶液中での分子形状の解析などに用いられていた小角X線散乱（SAXS）の技術を活用することにより、蛋白質溶液の粘度を、該蛋白質を含む微量の溶液試料で正確に測定（推定）できることを見出した。
従来、SAXSを用いた分子形状の解析においては、立体構造が複雑である蛋白質の場合、通常、分子間の相互作用が無視できる低濃度条件下において形状を評価することが行われる。しかし本発明においては、相互作用すなわち分子間の会合化が現れる、比較的高濃度の領域において、相互作用が働いていないと仮定した解析方法を意図的に用いることで、見かけの形状情報、すなわち見かけの粒子サイズを測定した。このパラメータは分子間の相互作用が強く働き会合化が起きることで大きく見積もられると予想し、当該パラメータが、蛋白質溶液を高濃度化した際の粘度と相関するであろうとの仮説を立てた。
本仮説を実証するために、室温（25℃）において、抗体と溶媒の種類を変化させ、高濃度（200 mg/mL）での粘度の実測値を得た。一方、SAXS測定により、同条件において準低濃度（60 mg/mL）での見かけの粒子サイズを評価したところ、両者が極めてよく相関することが見出された。また、SAXS測定を低温で実施することで、試料間の会合性の違いをより低濃度で評価できるだろうと考え、5℃/15mg/mLにおいて見かけの粒子サイズおよび見かけの分子量を評価したところ、25℃/160mg/mLでの粘度とよく相関することが見出された。すなわち、室温における高濃度抗体製剤の粘度は、低温でのSAXS測定から得られる見かけの粒子サイズおよび見かけの分子量により、少量（15mg/mL, 10μL）の試料で予測可能であることが示された。
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔１４〕を提供する。
〔１〕以下の工程を含む、蛋白質溶液の粘度の測定方法：
１）該蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；
２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出する工程。
〔２〕試料中の蛋白質濃度が10〜100mg/mlである、〔１〕の測定方法。
〔３〕試料中の蛋白質濃度が10〜30mg/mlである、〔１〕または〔２〕の測定方法。
〔４〕試料中の蛋白質濃度が15〜30mg/mlである、〔１〕〜〔３〕のいずれかの測定方法。
〔５〕測定温度の条件が0〜40℃である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの測定方法。
〔６〕測定温度の条件が0〜25℃である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの測定方法。
〔７〕測定温度の条件が3〜10℃である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの測定方法。
〔８〕測定する試料の量が1〜100μLである、〔１〕〜〔７〕のいずれかの測定方法。
〔９〕測定する試料の量が5〜30μLである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの測定方法。
〔１０〕前記蛋白質が抗体である、〔１〕〜〔９〕のいずれかの測定方法。
〔１１〕蛋白質の粘性を予測する方法であって、該蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記方法。
〔１２〕粘性を制御した蛋白質の選抜方法であって、該蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記選抜方法。
〔１３〕以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１１〕の予測方法を用いて、当該蛋白質の粘性を予測する工程。
〔１４〕以下の工程を含む、粘性の低い蛋白質を製造する方法：
１）〔１１〕の予測方法を用いて、粘性の低い蛋白質を選抜する工程。
〔１５〕以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１２〕の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から粘性の制御された蛋白質を選抜する工程。
〔１６〕以下の工程を含む、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１２〕の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から元の蛋白質よりも粘性が低下した改変蛋白質を選抜する工程。
〔１７〕元の蛋白質が、アミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変蛋白質である、〔１３〕、〔１５〕または〔１６〕の方法：
〔１８〕蛋白質が抗体である、〔１１〕〜〔１６〕のいずれかの方法。
〔１９〕元の抗体のアミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
〔２０〕97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、〔19〕の改変抗体。
〔２１〕元の抗体のアミノ酸残基の一部が別のアミノ酸に置換されている、抗原に対してイオン濃度依存的に結合する改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
〔２２〕97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、〔２１〕に記載の改変抗体。
各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた60 mg/mL, 15〜35 ℃におけるRg appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた60 mg/mL, 15〜35 ℃におけるDmax appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるI(0)の関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるRg appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるDmax appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 Mab5-AのFabの結晶構造を示す図である。左の図は、Mab5-AのFab-Fab間相互作用を示している。右の図は、左図中、楕円で囲んだ部分を拡大した図であり、一方のFab主鎖における97位のHisが、他方のFab主鎖と水素結合を形成できる距離にあることを示している。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、少量の試料で実施可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法（推定方法）、蛋白質の粘性を予測する方法、粘性を制御した蛋白質の選抜方法、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法、および粘性の低い蛋白質を製造する方法に関する。
本発明の方法においては、少量で、比較的低濃度の蛋白質溶液であっても、それを高濃度化した際の粘度を正確に推定することができる。
具体的には、（１）蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定し、（２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出することにより、該蛋白質を含む溶液を高濃度化した際の粘度を推定することができる。
また、上記測定値を利用して、蛋白質の粘性の予測、および粘性を制御した蛋白質の選抜を行うこともできる。本発明において「粘性を制御した蛋白質」または「粘性の制御された蛋白質」とは、溶液中で所望の粘度範囲内にて存在する蛋白質、好ましくは、高濃度化に伴って上昇した粘度が所望の粘度範囲内に制御された蛋白質を意味し、例えば、医薬として利用する蛋白質溶液製剤（好ましくは皮下投与用溶液製剤）中の活性成分として好適な粘度範囲内にある蛋白質が挙げられる。当該粘度範囲は、好ましくは蛋白質溶液製剤の製造性及び使用性の高い粘度範囲であり、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば常温〜体温（15〜40℃）において2000mPa・s以下、好ましくは1500mPa・s以下、より好ましくは0.1〜1000mPa・sであり、特に好ましくは1〜700mPa・sである。
また、種々の方法により得られた改変蛋白質の粘度を、上記予測方法を用いて予測することにより、粘性の制御された（又は粘性を低下させた）改変蛋白質の製造を効率よく実施することができる。当該改変蛋白質を得るために元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変する方法として種々の改変方法が知られており、当業者であれば、それらの既知の方法から適宜選択し、場合により一部改変して、実施することができる。一態様において、本発明の改変蛋白質の製造方法における元の蛋白質は、アミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変蛋白質である。また、本発明は、そのような製造方法により製造された改変蛋白質に関する。当該蛋白質は、好ましくは変異抗体であり、より好ましくは、元の抗体のアミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置された変異抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない変異抗体であり、ここで、97位のアミノ酸残基は元の抗体のアミノ酸残基であることが好ましい。さらに好ましくは、97位のアミノ酸残基がHisに置換された抗体と比べて抗体の粘性が低い抗体である。
なお、ここで「元の蛋白質」や「元の抗体」とは、「人為的にアミノ酸の一部を改変する前の蛋白質」若しくは「人為的にアミノ酸の一部を改変する前の蛋白質」である。
さらに、上記予測方法を用いて、粘性の低い蛋白質を選抜することにより、粘性の低い蛋白質または粘性を低下させた改変蛋白質の製造を効率よく実施することもできる。本発明において「粘性の低い蛋白質」または「粘性を低下させた改変蛋白質」もしくは「粘性が低下した改変蛋白質」とは、上記粘度範囲内の蛋白質を意味する。
本発明の方法に使用する試料の量は、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量を測定可能な量であれば特に制限はないが、例えば3〜100μL、好ましくは3〜50μLであり、特に好ましくは5〜30μLである。本発明の方法に使用する試料中の蛋白質濃度は、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量を測定可能な濃度であれば特に制限はないが、好ましくは1〜100mg/ml、より好ましくは10〜100mg/mlであり、更に好ましくは15〜30mg/mlである。SAXS測定を低温（例えば、3〜10℃）で実施することによって、より低濃度の蛋白質溶液も測定対象とすることができる。このように、少量、低濃度の試料で粘度の測定、粘性の予測が可能なため、本発明の方法を用いることにより、粘性の制御された、粘性を低下させた、又は粘性の低い改変蛋白質を効率的に選抜（スクリーニング）すること、およびそのような改変蛋白質を効率的に製造することができる。
本発明の方法は、蛋白質溶液の粘度が上記の粒子サイズパラメータ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量と良好に相関することを利用して、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定値から蛋白質溶液の粘度を推定することを特徴とする。当該相関は、蛋白質溶液の粘度の上昇が見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定値の上昇と相関する正の相関であり、好ましくは指数関数の相関または線形の相関である。前記粒子サイズパラメータの測定の温度条件は、当該測定が可能な温度範囲であれば制限はないが、例えば40℃以下、好ましくは室温以下、より好ましくは0〜25℃であり、特に好ましくは3〜10℃である。
一態様において、本発明の蛋白質溶液の粘度測定方法(推定方法)は以下の工程を含む：
（１）前記蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射し、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、前記溶液中の蛋白質の見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；および
（２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出する工程。
本発明において、蛋白質溶液の粒子サイズパラメータである見かけの粒子の最大長（Dmax app）および見かけの粒子の慣性半径（Rg app）は、本願実施例に記載のとおりに算出することができる。また、見かけの分子量は散乱角0における散乱強度（I(0)）に比例する値として与えられる。これらのパラメータの算出に用いる、X線を照射した試料の散乱パターンの検出は、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法により、当業者公知の方法により実施することができる。
特定の態様において、前記工程（２）において用いる検量線は、種々の蛋白質溶液とSAXS測定試料の対について測定した粘度と見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の相関関係を解析して求めることができる。当該解析においては、粘度測定に係る蛋白質溶液とSAXS測定に係る試料の対において蛋白質の種類および溶媒が同一であればよく、両測定に用いる蛋白質の濃度および測定温度は同一である必要はない。そのため、相関関係の解析対象となる粘度は、前記工程（１）と同一の測定条件下での粘度に限定されず、所望の測定条件下での粘度について検量線を用意すれば、それを前記工程（２）で利用することにより、当該条件下での粘度（例えば、高濃度化した際の室温における粘度）を推定することができる。なお、当該検量線は、異なる蛋白質の溶液についても適用可能であるため、本工程において相関関係を解析する溶液中の蛋白質は、前記工程（１）〜（２）で使用される溶液中の蛋白質と同じであっても異なってもよく、種々の蛋白質、溶媒で構成される蛋白質溶液についての測定結果を用いて相関関係を解析すればよい。
本発明で使用される蛋白質は、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法による見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定が可能な蛋白質であれば特に制限はないが、好ましくは高濃度蛋白質溶液製剤の開発が望まれる蛋白質であり、例えば、BSAなどのアルブミンや抗体が挙げられる。
本発明で使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
本発明で使用されるモノクローナル抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、bispecific抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。さらに、血中滞留性や体内動態の改善を目的とした抗体分子の物性の改変（具体的には、等電点（pI）改変、Fc受容体の親和性改変等）を行うために抗体の定常領域等を人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。
また、本発明で使用される抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのIgG、IgA、IgD、IgE、IgMなどいずれのクラスでもよいが、IgG及びIgMが好ましい。
さらに本発明で使用される抗体には、定常領域と可変領域を有する抗体（wholeの抗体）だけでなく、Fv、Fab、F(ab)2などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカー等のリンカーで結合させた1価または2価以上の一本鎖Fv（scFv、sc(Fv)2）やscFvダイマーなどのDiabody等などの低分子化抗体なども含まれるが、wholeの抗体が好ましい。
上述した本発明で使用される抗体は、当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAを得たら、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、WO 96/02576 参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
抗体の活性、物性、薬物動態、安全性等を改善するために抗体のアミノ酸を置換する技術としては、例えば以下に述べる技術も知られており、本発明で使用される抗体には、このようなアミノ酸の置換（欠損や付加も含む）を施された抗体も含まれる。
IgG抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化（Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.）をはじめとして、結合活性を増強させるための相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換によるaffinity maturation（Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.）、フレームワーク(FR)のアミノ酸置換による物理化学的安定性の向上（Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review）が報告されている。また、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換を施す技術として、抗体依存性細胞障害活性(ADCC)活性や補体依存性細胞障害活性(CDC)活性を増強させる技術が知られている（Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.）。さらに、このようなエフェクター機能を増強させるだけではなく、抗体の血中半減期を向上させるFcのアミノ酸置換の技術が報告されている（Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.、Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.）。さらには抗体の物性改善を目的とした定常領域の種々のアミノ酸置換技術も知られている（WO 09/41613）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（WO 93/12227, WO 92/03918、WO 94/02602, WO 94/25585、WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。本発明で使用される抗体には、このようなヒト抗体も含まれる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney）、HeLa、Vero、(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana)属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。
さらに、本発明で使用される抗体には、抗体断片や低分子化抗体、並びに抗体修飾物が含まれる。例えば、抗体断片や低分子化抗体としてはFab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させた一価又は二価以上のシングルチェインFv(scFv、sc(Fv)2など) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性薬剤等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる（Farmaco. 1999 Aug 30;54(8):497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69.）。本発明で使用される抗体にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
本発明で使用される抗体としては、抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体、抗HM1.24抗原抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子代替抗体、抗IL31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、ファクターIXとファクターXとのBi-specific抗体などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明で使用する好ましい再構成ヒト化抗体としては、ヒト化抗インターロイキン６（IL-6）レセプター抗体（トシリツマブ、hPM-1あるいはMRA、WO92/19759参照）、ヒト化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体（WO98/14580参照）、ヒト化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）（WO98/13388を参照）、ヒト化抗組織因子抗体（WO99/51743参照）、抗グリピカン-3 ヒト化IgG1κ抗体（codrituzumab、GC33、WO2006/006693参照）、抗NR10ヒト化抗体（WO2009/072604参照）、ファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体（ACE910、WO2012/067176を参照）などが挙げられる。本発明で使用するヒト化抗体として特に好ましいのは、ヒト化抗IL-6レセプター抗体、抗NR10ヒト化抗体、及びファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体である。
ヒトIgM抗体としては、抗ガングリオシドGM3組み換え型ヒトIgM抗体（WO05/05636参照）などが好ましい。
低分子化抗体としては、抗TPO受容体アゴニストDiabody（WO02/33072参照）、抗CD47アゴニストDiabody（WO01/66737参照）などが好ましい。
また、本発明で使用される抗体としては、抗原に対してイオン濃度依存的（例えば、pH依存的またはカルシウムイオン濃度依存的）に結合する改変抗体を挙げることができる。抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内のpH酸性域の条件下において抗原から解離するpH依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対してpH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する抗体）や抗原に対して血漿中の高カルシウムイオン濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシウムイオン濃度の条件下において抗原から解離するカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対して高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシウムイオン濃度の条件下で解離する抗体）はエンドソーム内で抗原から解離することが可能である。pH依存的に抗原に対して結合する抗体やカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると、再び抗原に結合することが可能である。そのため一分子の抗体が複数の抗原分子に繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原はエンドソーム内で抗体から解離することによって血漿中にリサイクルされずライソソーム内で分解される。こうした抗原結合分子を生体に投与することによって、抗原の細胞内への取込みが促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
本発明において等電点の低い抗体（低pI抗体）とは、特に天然では存在し難い、低い等電点を有する抗体をいう。このような抗体の等電点としては例えば3.0〜8.0、好ましくは5.0〜7.5、さらに好ましくは5.0〜7.0、特に好ましくは5.0〜6.5が挙げられるがこれらに限定されない。なお、天然の（または通常の）抗体は、通常7.5〜9.5の範囲の等電点を有すると考えられる。
さらに本発明で使用される抗体としては、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基を改変することにより抗体のpIを低下させた、pI改変抗体が好ましい。このようなpI改変抗体とは、改変前の抗体のpIよりも1以上、好ましくは2以上、さらに好ましくは3以上、pIを低下させた抗体をいう。後述の実施例に記載されるように、トシリツマブ（等電点：9.4）のアミノ酸配列を改変して等電点を制御したSA237（本願実施例のMAb2）の等電点は、5.8である。また、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した、アミノ酸配列を改変して等電点を5.6に制御した完全ヒト化NS22抗体も挙げられる。
等電点が改良された抗体としては、例えば、WO2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体であるSA237（MAb2、H鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２）、抗NR10ヒト化抗体であり、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した、完全ヒト化NS22抗体などがあげられるがこれらに限定されない。
抗体の表面に露出しているアミノ酸残基としては、H鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるH1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H31, H39, H42, H43, H44, H46, H61, H62, H64, H65, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110, H112の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。またＬ鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるL1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L24, L27, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L53, L54, L55, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において「改変」とは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等をいうが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が存在することが知られている。一般的に、正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸（負電荷アミノ酸）としては、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）等が知られている。これら以外のアミノ酸は電荷を有さないアミノ酸として知られている。
本発明において改変後のアミノ酸残基としては、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から適宜選択されるが、特にこれらのアミノ酸に制限されない。
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）
また、改変前のアミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さないアミノ酸残基となるように改変することも好ましい態様の一つである。
すなわち、本発明における改変としては、（１）電荷を有するアミノ酸から電荷を有さないアミノ酸への置換、（２）電荷を有するアミノ酸から当該アミノ酸とは反対の電荷を有するアミノ酸への置換、（３）電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換が挙げられる。
等電点の値は、当業者公知の等電点電気泳動により測定することが可能である。また、理論等電点の値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア（Genetyx等）を用いて計算することができる。
アミノ酸残基の電荷が改変された抗体は、抗体をコードする核酸を改変し、当該核酸を宿主細胞で培養し、宿主細胞培養物から抗体を精製することによって取得することができる。本発明において「核酸を改変する」とは、改変によって導入されるアミノ酸残基に対応するコドンとなるよう核酸配列を改変することをいう。より具体的には、改変前のアミノ酸残基のコドンが改変によって導入されるアミノ酸残基のコドンになるように、核酸の塩基配列を改変することを言う。即ち、改変されるアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜行うことが可能である。
本発明の医薬組成物は、溶液製剤（抗体含有溶液製剤）、あるいは凍結乾燥剤であることができる。本発明の溶液製剤には、凍結乾燥製剤の製造工程における凍結乾燥処理前の溶液または再溶解後の溶液も含まれる。本発明の溶液製剤は、製造過程に凍結乾燥工程を含まないで製造される溶液製剤であることが好ましい。また本発明の凍結乾燥剤は、本発明の溶液製剤を当業者に公知の手法により凍結乾燥させることにより得ることができる。
また本発明の製剤には、必要に応じて、凍結保護剤、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の添加材や担体を含むことができる。
凍結保護剤として例えば、トレハロース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を挙げることができるがこれらに限定されない。
溶液補助剤として例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができるがこれらに限定されない。
等張化剤として例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができるがこれらに限定されない。
保存剤として例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
吸着防止剤として例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
含硫還元剤として例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
酸化防止剤として例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の製剤は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、通常、非経口経路で投与される。具体的には、注射、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などにより投与される。注射剤型の例としては、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射などにより全身又は局所的に投与することができる。皮下注射の場合、注射液量の制限があるが1回あたりの抗体投与量を大量(100〜200 mg-程度)とすることができる。そのため、本発明の製剤は皮下投与（注射）用として特に適している。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら実施例のみに限定されるものではない。
[実施例1] MAb1, MAb2, MAb3における粒子サイズパラメータと粘度との相関
MAb1：血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子ならびに血液凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子を認識する二重特異性抗体である。非特許文献（PLoS One. 2013;8(2):e57479）及び特許文献（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 （Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：５に記載のL鎖が会合し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：５に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体）を、前記非特許文献又は特許文献の記載に従って作製した。尚、ACE910は前記特許文献に記載されているように凝固第VIII因子の機能を代替する活性を有している。
MAb2：WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、トシリツマブのアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体（SA237）である。MAb2抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２で表される。
MAb3：抗グリピカン３ヒト化抗体（GC33、一般名：codrituzumab、WO2006/006693の実施例24に記載の方法でヒト化し、実施例25の方法でL鎖が改変された抗体）、抗体クラスはIgG1。
MAb1, MAb2, MAb3を用い、表1の処方溶液において、抗体濃度が60 mg/mLの試料を調製した。当該試料約40 μLをキャピラリーセルに充てんしSAXSess mc2（アントンパール）にて粒子サイズパラメータであるみかけの粒子の慣性半径Rg app (nm)とみかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。実験温度及び測定結果を表1に記す。Rg app及びDmax appの算出方法を以下に記す。
R g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
続いて、MAb1, MAb2, MAb3を用い、表1の処方溶液において、抗体濃度が200 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16 :359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度及び測定結果を表1に記す。
Figure 0006858559
SAXS測定より得られた60 mg/mLにおける粒子サイズパラメータ（Rg app及びDmax app）と、200 mg/mLにおける粘度（実測値）との相関を調査すべく、MAb1, MAb2, MAb3の粘度をRg appまたはDmax appの関数としてプロットした結果を図1及び図2に示す。いずれの粒子サイズパラメータにおいても粘度との間に良好な相関が確認された。相関は指数関数によって良好にフィッティングされたが、粘度の低い領域においては線形の相関が確認された。以上より、測定に高濃度の試料を必要とする粘度の実測を行わずとも、低濃度の試料を用いたSAXS測定から得られるRg appまたはDmax appを指標とすることで、高濃度化した際の粘度の予測が可能であることが示された。
[実施例2] MAb1, MAb3, MAb4における粒子サイズパラメータおよび分子量パラメータと粘度との相関
MAb1, MAb3（いずれも実施例1に記載のものと同じ）, MAb4（ヒト化抗IL-6レセプター抗体、一般名：トシリツマブ）を用い、表2の処方溶液において、抗体濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて粒子サイズパラメータであるみかけの粒子の慣性半径Rg app (nm)とみかけの粒子の最大長Dmax app (nm)に加え，みかけの分子量に比例する値として散乱角0における散乱強度I(0) (a.u.)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表2に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)およびR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
続いて、MAb1, MAb3, MAb4を用い、表2の処方溶液において、抗体濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16 :359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表2に記す。
Figure 0006858559
SAXS測定より得られた15 mg/mL, 5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL, 25 ℃における粘度との相関を調査すべく、MAb1, MAb3, MAb4の粘度をI(0)、Rg app、またはDmax app関数としてプロットした結果を図3、図4、及び図5に示す。いずれの粒子サイズパラメータにおいても粘度との間に良好な相関が確認されたことから、測定に大量かつ高濃度の試料を必要とする粘度の実測を行わずとも、少量かつ低濃度の試料を用いたSAXS測定から得られる粒子サイズパラメータを指標とすることで、高濃度化した際の粘度の予測が可能であることが示された。
また、抗体等の蛋白質の一部アミノ酸配列を異なるアミノ酸に置換した種々の改変蛋白質を作製して、粘度が制御された改変蛋白質を選抜する場合においても、本発明の方法によって得られるパラメータと粘度の実測値について、同様に良好な相関がえられるので、所望とする粘度が制御された改変蛋白質の選抜方法としても本発明の方法は有用である。
[実施例3] MAb2、MAb4における粒子サイズパラメータと粘度との相関
MAb2、MAb4（それぞれ実施例1、2に記載のものと同じ）を用いて、アミノ酸配列を改変する前の抗体（Mab4）と一部のアミノ酸配列を別のアミノ酸に置換した抗体（Mab2）との粘度の違いを本発明の測定方法を用いて評価できるかどうか検討を行った。それぞれの抗体を用い、表3の処方溶液において，抗体濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて，粒子サイズパラメータである散乱角0における散乱強度I(0)、みかけの粒子の慣性半径Rg app、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表3に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)及びR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
続いて、MAb2、MAb4を用い、表3の処方溶液において、抗体濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表3に記す。
SAXS測定より得られた15 mg/mL、5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL、25 ℃における粘度は確かに相関することが確認された。よって、本発明の方法を用いた、粘度を指標とする蛋白質のアミノ酸置換体のスクリーニング法の妥当性が実証された。
Figure 0006858559
[実施例4] MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、及びBSAにおける粒子サイズパラメータと粘度との相関
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4（いずれも実施例1〜2に記載のものと同じ）、及びBSAを用い、表4の処方溶液において、蛋白質濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて、粒子サイズパラメータである散乱角0における散乱強度I(0)、みかけの粒子の慣性半径Rg app、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値は会合状態を考慮した蛋白質の粒子サイズを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表3に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)及びR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
続いて、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、及びBSAを用い、表4の処方溶液において、蛋白質濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表4に記す。
SAXS測定より得られた15 mg/mL、5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL、25 ℃における粘度は確かに相関することが確認され、抗体以外の蛋白質にも本発明の粘度の評価法が適用できることが実証された。
Figure 0006858559
[実施例5] MAb5及びその改変抗体における粒子サイズパラメータと粘度との相関
MAb5（抗IgE抗体）及びMAb5の特定の位置の4つのアミノ酸残基をヒスチジンに置換した改変抗体であるMAb5-Aの粘度を測定した。改変前後の残基を表5に記載した。なお、表5における改変位置は、Kabatナンバリングに基づき表記した。表6の処方溶液において、蛋白質濃度が151、155 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η (mPa・s)を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表6に記す。4残基のヒスチジン置換により粘度の大幅な上昇が認められた。
この粘度上昇の原因となる改変を特定し、低粘度の改変抗体をデザインすべく、MAb5、MAb5-A、及びMAb5-Aにおいてヒスチジンに置換された4残基を1残基ずつMAb5の残基に戻した4つの改変抗体（MAb5-B、MAb5-C、MAb5-D、MAb5-E）を用い、表6の処方溶液において、蛋白質濃度が30 mg/mLの試料を調製した。改変前後の残基を表5に記載した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。この値は会合状態を考慮した蛋白質の粒子サイズを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表6に記す。MAb5-A、MAb5-B、MAb5-D、MAb5-EのDmax appは、改変前のMAb5のDmax appと比べて明らかに大きいのに対し、MAb5-CのDmax appは21 nmという改変前のMAb5のDmax appに近い値であった。このMAb5-Cについて、蛋白質濃度が160 mg/mLの試料を調製し、Mab5及びMab5-Aと同様に25 ℃での粘度η (mPa・s)を測定したところ、10.4 mPa・sという改変前のMAb5の粘度に近い値であった。このことから、所定の位置のプロリンをヒスチジンに置換する改変が粘度上昇を引き起こしていることが強く示唆された。このように、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて見かけの粒子サイズを測定することにより、粘性の制御された（粘性の低い）蛋白質を少量の試料で効率良く選抜し、製造することができることが示された。なお、Dmax appの算出方法を以下に記す。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
SAXSスクリーニング法により、MAb5-AからMAb5-Cへのさらなる改変によって粘度を低減できる可能性が示唆された。そこで、上述の測定法にてMAb5-Cの粘度を実際に測定した。蛋白質濃度が160 mg/mLのMAb5-Cの測定結果を表6に記す。確かに粘度が大きく低減していることが確認され、本スクリーニング法の妥当性が実証された。
また、Mab5-AのFabの結晶構造を図６に示す。図６の左図は、Mab5-A分子同士がFabドメインを介して互いに相互作用することを示しており、右図は、Mab5-A分子のFabドメインにおける97位のHisの側鎖が、別のMab5-A分子のFabドメインにおけるTrpの主鎖と水素結合を形成できる距離にあることを示している。一方、Mab5では、このようなFab-Fab間相互作用は観察されない。したがって、Mab5の97位のProをHisに置換したことによる粘度上昇は、当該置換により、異なるFab間で水素結合が形成されることに起因する可能性が考えられる。このように、結晶構造解析の結果からも、本スクリーニング法の妥当性が示唆された。
Figure 0006858559
Figure 0006858559
本発明により、少量の試料で簡便に蛋白質溶液の粘度を測定できる方法が提供された。本発明により、低粘度の蛋白質溶液製剤の開発が容易となり、さらには溶液中の粘性が低い蛋白質の選抜（スクリーニング）が可能となり、より物性面に優れた、抗体等の蛋白質溶液製剤を提供することが可能となった。本発明の方法は、特に低粘度のバイオ医薬品の製造において有用である。

Claims (10)

  1. 以下の工程を含む、蛋白質溶液の粘度の測定方法：
    １）該蛋白質の濃度が1〜100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；
    ２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質を160〜200mg/mlに高濃度化した際の粘度を算出する工程。
  2. 試料中の蛋白質濃度が10〜100mg/mlである、請求項１に記載の測定方法。
  3. 試料中の蛋白質濃度が10〜30mg/mlである、請求項１または２に記載の測定方法。
  4. 試料中の蛋白質濃度が15〜30mg/mlである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
  5. 測定温度の条件が0〜40℃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
  6. 測定温度の条件が0〜25℃である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
  7. 測定温度の条件が3〜10℃である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法。
  8. 測定する試料の量が1〜100μLである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法。
  9. 測定する試料の量が5〜30μLである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の測定方法。
  10. 前記蛋白質が抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
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