WO2016027859A1 - 蛋白質溶液の粘度測定方法 - Google Patents

蛋白質溶液の粘度測定方法 Download PDF

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福田　正和
昭 早坂
智之 井川
敦彦 前田
麻智子 藤野
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the viscosity of a protein solution, and more particularly to a method for measuring the viscosity of a protein solution that can be measured with a small amount of sample.
  • SAXS Small angle X-ray scattering
  • the object of the present invention is to measure the viscosity of a protein solution that can be carried out particularly with a small amount of sample, to predict the viscosity of a protein, to select a protein with controlled viscosity, and to produce a modified protein with controlled viscosity
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a modified protein with reduced viscosity and a method for producing a protein having low viscosity.
  • the viscosity of a protein solution such as an antibody is measured by a rheometer that calculates the viscosity from the proportional coefficient between the shear rate and the shear stress, or the EMS viscosity that calculates the viscosity from the rotation speed of the metal sphere in the sample solution.
  • the mainstream is to use a meter, or a viscosity measuring device using a micro-channel that calculates the viscosity from the passage speed of the sample and the pressure loss at the time of passage.
  • viscosity measurement using a rheometer or EMS viscometer requires a large amount of sample, and the sample preparation work is complicated. Therefore, it was difficult to measure many samples at the same time. Further, in the viscosity measurement using the microchannel, it is difficult to accurately measure the viscosity of the protein solution having high adsorptivity with high reproducibility. Accordingly, it has been impossible to screen modified proteins using viscosity as an index, such as measuring many kinds of small samples.
  • the present inventors have made use of the technique of small-angle X-ray scattering (SAXS) that has been used for molecular shape analysis in protein solutions.
  • SAXS small-angle X-ray scattering
  • the measured values of the viscosity at a high concentration were obtained by changing the kind of the antibody and the solvent at room temperature (25 ° C.).
  • the apparent particle size was evaluated at a sub-low concentration (60 mg / mL) under the same conditions by SAXS measurement, they were found to correlate very well.
  • SAXS measurement at a low temperature we considered that the difference in associability between samples could be evaluated at a lower concentration, and when evaluating the apparent particle size and apparent molecular weight at 5 ° C / 15 mg / mL, It was found to correlate well with viscosity at 25 ° C / 160 mg / mL.
  • [1] Method for measuring viscosity of protein solution including the following steps: 1) Apparent particle size (apparent particle) using X-ray small angle scattering method (SAXS) or X-ray solution scattering method by irradiating X-rays to a sample whose protein concentration is 1-100mg / ml Measuring the maximum length (D max app ) or apparent particle radius of inertia (R g app )) or apparent molecular weight; 2) A step of calculating the viscosity of the protein from the measured value based on a calibration curve obtained in advance.
  • SAXS X-ray small angle scattering method
  • R g app apparent particle radius of inertia
  • a method for predicting the viscosity of a protein which comprises irradiating a sample having a protein concentration of 1 to 100 mg / ml with X-rays, X-ray small angle scattering (SAXS) or X-ray solution scattering Measuring the apparent particle size (apparent particle maximum length (D max app ) or apparent particle inertia radius (R g app )) or apparent molecular weight.
  • SAXS X-ray small angle scattering
  • X-ray solution scattering Measuring the apparent particle size (apparent particle maximum length (D max app ) or apparent particle inertia radius (R g app )) or apparent molecular weight.
  • the method of selection comprising measuring an apparent particle size (apparent particle maximum length (D max app ) or apparent particle inertia radius (R g app )) or apparent molecular weight using a method.
  • a method for producing a modified protein with controlled viscosity comprising the following steps: 1) A step of obtaining a modified protein by modifying a part of the amino acid of the original protein; 2) A step of predicting the viscosity of the protein using the prediction method of [11].
  • a method for producing a low-viscosity protein comprising the following steps: 1) A step of selecting a low-viscosity protein using the prediction method of [11].
  • a method for producing a modified protein with controlled viscosity comprising the following steps: 1) A step of obtaining a modified protein by modifying a part of the amino acid of the original protein; 2) A step of selecting a protein whose viscosity is controlled from the modified protein using the selection method of [12].
  • a method for producing a modified protein with reduced viscosity comprising the following steps: 1) A step of obtaining a modified protein by modifying a part of the amino acid of the original protein; 2) A step of selecting a modified protein having a viscosity lower than that of the original protein from the modified protein using the selection method of [12].
  • 3 is a graph showing the results of plotting the viscosity of each antibody solution as a function of R g app at 60 mg / mL, 15 to 35 ° C. obtained by SAXS measurement.
  • 3 is a graph showing the results of plotting the viscosity of each antibody solution as a function of D max app at 60 mg / mL, 15 to 35 ° C. obtained by SAXS measurement.
  • 3 is a graph showing the results of plotting the viscosity of each antibody solution as a function of I (0) at 15 mg / mL, 5 ° C. obtained by SAXS measurement.
  • FIG 3 is a graph showing the results of plotting the viscosity of each antibody solution as a function of R g app at 15 mg / mL, 5 ° C. obtained by SAXS measurement.
  • the viscosity of each antibody solution is a graph showing the results plotted as a function of D max app in 15 mg / mL, 5 °C obtained by SAXS measurement.
  • It is a figure which shows the crystal structure of Fab of Mab5-A.
  • the figure on the left shows the Fab-Fab interaction of Mab5-A.
  • the right figure is an enlarged view of the part surrounded by the ellipse in the left figure, and shows that His at position 97 in one Fab main chain is at a distance that can form a hydrogen bond with the other Fab main chain. ing.
  • the present invention produces a method for measuring the viscosity of a protein solution (estimation method), a method for predicting the viscosity of a protein, a method for selecting a protein with controlled viscosity, and a modified protein with controlled viscosity.
  • the present invention relates to a method, a method for producing a modified protein with reduced viscosity, and a method for producing a protein with low viscosity.
  • the term “protein with controlled viscosity” or “protein with controlled viscosity” means a protein that exists in a desired viscosity range in a solution, and preferably has a viscosity increased with increasing concentration.
  • a protein within a viscosity range suitable as an active ingredient in a protein solution formulation (preferably a solution formulation for subcutaneous administration) to be used as a medicament can be mentioned.
  • the viscosity range is preferably a viscosity range with high manufacturability and usability of the protein solution preparation, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the viscosity range is 2000 mPa ⁇ s from room temperature to body temperature (15 to 40 ° C.).
  • it is preferably 1500 mPa ⁇ s or less, more preferably 0.1 to 1000 mPa ⁇ s, and particularly preferably 1 to 700 mPa ⁇ s.
  • the modified protein in the method for producing a modified protein of the present invention is a modified protein in which a part of amino acid residues is substituted with a histidine (His) residue.
  • the present invention also relates to a modified protein produced by such a production method.
  • the protein is preferably a mutated antibody, more preferably a mutated antibody in which a part of the amino acid residues of the original antibody is placed in the histidine (His) residue, and the 97th amino acid in the Kabat numbering system It is a mutant antibody whose residue is not a His residue, wherein the amino acid residue at position 97 is preferably the amino acid residue of the original antibody. More preferably, the antibody is less viscous than an antibody in which the amino acid residue at position 97 is substituted with His.
  • “original protein” and “original antibody” are “protein before artificially modifying part of an amino acid” or “protein before artificially modifying part of an amino acid”. is there.
  • a low-viscosity protein or “a modified protein with reduced viscosity” or “a modified protein with reduced viscosity” means a protein within the above viscosity range.
  • the amount of the sample used in the method of the present invention is not particularly limited as long as the apparent particle size or the apparent molecular weight can be measured. For example, it is 3 to 100 ⁇ L, preferably 3 to 50 ⁇ L, particularly preferably. 5-30 ⁇ L.
  • the protein concentration in the sample used in the method of the present invention is not particularly limited as long as the apparent particle size or the apparent molecular weight can be measured, but is preferably 1 to 100 mg / ml, more preferably 10 to 100 mg. / ml, more preferably 15 to 30 mg / ml.
  • a protein solution having a lower concentration can be measured.
  • the modified protein with controlled viscosity, reduced viscosity, or low viscosity is used. Can be efficiently selected (screened), and such a modified protein can be efficiently produced.
  • the viscosity of the protein solution correlates well with the above particle size parameter (apparent particle maximum length (D max app ) or apparent particle inertia radius (R g app )) or apparent molecular weight.
  • the viscosity of the protein solution is estimated from the measured value of the apparent particle size or the apparent molecular weight.
  • the correlation is a positive correlation in which an increase in the viscosity of the protein solution correlates with an increase in apparent particle size or apparent molecular weight, and is preferably an exponential correlation or a linear correlation.
  • the temperature condition for the measurement of the particle size parameter is not limited as long as the temperature range allows the measurement, but is, for example, 40 ° C. or less, preferably room temperature or less, more preferably 0 to 25 ° C., particularly preferably 3 ⁇ 10 ° C.
  • D max app the maximum length of the apparent particle
  • R g app apparent radius of inertia
  • the maximum particle length (D max app ) and the apparent particle inertia radius (R g app ), which are the particle size parameters of the protein solution, can be calculated as described in the examples of the present application.
  • the apparent molecular weight is given as a value proportional to the scattering intensity (I (0)) at a scattering angle of 0. Detection of the scattering pattern of the sample irradiated with X-rays used for calculation of these parameters can be performed by a method known to those skilled in the art by the X-ray small angle scattering method (SAXS) or the X-ray solution scattering method.
  • SAXS X-ray small angle scattering method
  • the calibration curve used in the step (2) can be obtained by analyzing the correlation between the viscosity measured for various protein solution and SAXS measurement sample pairs and the apparent particle size or apparent molecular weight. .
  • the protein type and the solvent in the pair of the protein solution for viscosity measurement and the sample for SAXS measurement are the same, and the concentration and measurement temperature of the protein used for both measurements are not necessarily the same. Therefore, the viscosity to be analyzed for correlation is not limited to the viscosity under the same measurement conditions as in the step (1).
  • the viscosity under the conditions (for example, the viscosity at room temperature when the concentration is increased) can be estimated. Since the calibration curve can be applied to solutions of different proteins, the protein in the solution whose correlation is analyzed in this step is the protein in the solution used in the steps (1) to (2). The correlation may be analyzed using measurement results of protein solutions composed of various proteins and solvents.
  • the protein used in the present invention is not particularly limited as long as it is a protein capable of measuring the apparent particle size or the apparent molecular weight by the X-ray small angle scattering method (SAXS) or the X-ray solution scattering method. It is a protein for which development of a concentrated protein solution preparation is desired, and examples thereof include albumin such as BSA and antibodies.
  • the antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it binds to a desired antigen, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable in that a homogeneous antibody can be stably produced. .
  • the monoclonal antibodies used in the present invention include not only monoclonal antibodies derived from animals such as humans, mice, rats, hamsters, rabbits, sheep, camels, monkeys, but also artificial antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, and bispecific antibodies. Modified genetically modified antibodies are also included. In addition, antibody properties may be modified to modify antibody molecule physical properties (specifically, isoelectric point (pI) modification, Fc receptor affinity modification, etc.) for the purpose of improving blood retention and pharmacokinetics. Also included are genetically engineered antibodies in which the constant region and the like are artificially modified.
  • the immunoglobulin class of the antibody used in the present invention is not particularly limited, and may be any class such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, etc. IgM is preferred.
  • the antibodies used in the present invention include not only antibodies having constant regions and variable regions (whole antibodies), but also antibody fragments such as Fv, Fab, F (ab) 2 and variable regions of antibodies as peptide linkers. These include low-molecular-weight antibodies such as single-body Fv (scFv, sc (Fv) 2 ) and dibodies such as scFv dimers linked by a linker such as preferable.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically produced using a known technique as follows. That is, a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. And can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells (hybridomas) by a normal screening method.
  • the hybridoma can be prepared, for example, according to the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). When the immunogenicity of the antigen is low, immunization may be performed by binding to an immunogenic macromolecule such as albumin.
  • a recombinant antibody produced by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into a suitable vector, introducing it into a host, and using a gene recombination technique can be used (for example, Carl, A). K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • cDNA of the variable region (V region) of the antibody is synthesized from the hybridoma mRNA using reverse transcriptase.
  • DNA encoding the V region of the target antibody When DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding an antibody V region may be incorporated into an expression vector containing antibody C region DNA. It is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heteroantigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is a mammal other than a human, for example, a mouse antibody heavy chain, light chain variable region and a human antibody heavy chain, light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
  • a humanized antibody also called a reshaped human antibody, is a non-human mammal, such as a mouse antibody complementarity-determining region (CDR) grafted to the complementarity-determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity-determining region
  • an amino acid of an antibody in order to improve the activity, physical properties, pharmacokinetics, safety, etc. of the antibody, for example, the techniques described below are also known, and the antibody used in the present invention includes such a technique. Also included are antibodies with various amino acid substitutions (including deletions and additions).
  • the technology of amino acid substitution in the variable region of IgG antibody is humanized (Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May; 36 (1): 69 -83.), Affinity complementation region (CDR) amino acid substitution (Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102 (24): 8466-71.
  • CDR Affinity complementation region amino acid substitution
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to have a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with an antigen (WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94 / 25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, a suitable expression vector containing the sequence can be prepared and a human antibody can be obtained.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • animal cells When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells, such as Xenopus oocytes, or (3) insect cells.
  • sf9, sf21, Tn5, etc. are known.
  • plant cells cells derived from the genus Nicotiana (for example, Nicotiana tabacum) are known, and these may be cultured in callus.
  • Known fungal cells include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • prokaryotic cells there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro.
  • the antibodies used in the present invention include antibody fragments, low molecular weight antibodies, and modified antibodies.
  • Fab, F (ab ′) 2, Fv, or a mono-chain or bivalent or more single chain Fv (scFv, Fv of H chain and L chain linked by an appropriate linker) sc (Fv) 2 etc.) Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell.
  • Antibodies modified with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) and cytotoxic drugs can also be used as modified antibodies (Farmaco. 1999 Aug 30; 54 (8): 497-516., Cancer J. 2008 May-Jun; 14 (3): 154-69.).
  • the antibodies used in the present invention also include these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibodies used in the present invention include anti-tissue factor antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-IL-6 antibody, anti-glypican-3 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD20 antibody, anti-GPIIb / IIIa antibody, anti-TNF Antibody, anti-CD25 antibody, anti-EGFR antibody, anti-Her2 / neu antibody, anti-RSV antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD52 antibody, anti-IgE antibody, anti-CD11a antibody, anti-VEGF antibody, anti-VLA4 antibody, anti-HM1.24 antigen antibody
  • Anti-parathyroid hormone related peptide antibody anti-PTHrP antibody
  • anti-ganglioside GM3 antibody anti-TPO receptor agonist antibody
  • coagulation factor VIII substitute antibody anti-IL31 receptor antibody, anti-HLA antibody, anti-AXL antibody, anti-CXCR4 antibody
  • Examples include, but are not limited to, anti-NR10 antibodies, Bi-specific antibodies of Factor IX and Factor X, and the like.
  • Preferred reconstituted humanized antibodies for use in the present invention include humanized anti-interleukin 6 (IL-6) receptor antibodies (tocilitumab, hPM-1 or MRA, see WO92 / 19759), humanized anti-HM1.24 antigen monoclonals.
  • IL-6 interleukin 6
  • hPM-1 or MRA humanized anti-HM1.24 antigen monoclonals.
  • Antibody see WO98 / 14580
  • humanized anti-parathyroid hormone related peptide antibody see WO98 / 13388
  • humanized anti-tissue factor antibody see WO99 / 51743
  • anti-glypican-3 humanized IgG1 ⁇ Antibody see codrituzumab, GC33, WO2006 / 006693
  • anti-NR10 humanized antibody see WO2009 / 072604
  • Bi-specific humanized antibody of factor IX and factor X see ACE910, WO2012 / 067176
  • Particularly preferred as humanized antibodies for use in the present invention are humanized anti-IL-6 receptor antibodies, anti-NR10 humanized antibodies, and Bi-specific humanized antibodies of Factor IX and Factor X.
  • the human IgM antibody is preferably an anti-ganglioside GM3 recombinant human IgM antibody (see WO05 / 05636).
  • an anti-TPO receptor agonist Diabody see WO02 / 33072
  • an anti-CD47 agonist Diabody see WO01 / 66737
  • the like are preferable.
  • the antibody used in the present invention includes a modified antibody that binds to an antigen in an ion concentration-dependent manner (for example, pH-dependent or calcium ion concentration-dependent).
  • An antibody that binds to an antigen in a pH-dependent manner that binds strongly to the antigen under neutral pH conditions in plasma, and dissociates from the antigen under acidic pH conditions in the endosome.
  • An antibody that binds to an antigen in a calcium ion concentration-dependent manner an antibody that binds to an antigen under a high calcium ion concentration condition and dissociates under a low calcium ion concentration condition) It is possible to dissociate from the antigen within the endosome.
  • An antibody that binds to an antigen in a pH-dependent manner or an antigen that binds to an antigen in a calcium ion concentration-dependent manner can be bound to the antigen again after being dissociated and then recycled into plasma by FcRn.
  • one molecule of antibody can repeatedly bind to a plurality of antigen molecules.
  • the antigen bound to the antigen-binding molecule is dissociated from the antibody in the endosome and is not recycled into the plasma but is degraded in the lysosome.
  • an antibody having a low isoelectric point refers to an antibody having a low isoelectric point, which is hardly present in nature.
  • the isoelectric point of such an antibody include, but are not limited to, 3.0 to 8.0, preferably 5.0 to 7.5, more preferably 5.0 to 7.0, and particularly preferably 5.0 to 6.5.
  • natural (or normal) antibodies are usually considered to have an isoelectric point in the range of 7.5 to 9.5.
  • the antibody used in the present invention is preferably a pI-modified antibody in which the pI of the antibody is lowered by modifying amino acid residues exposed on the surface of the antibody.
  • a pI-modified antibody refers to an antibody having a pI lowered by 1 or more, preferably 2 or more, more preferably 3 or more, than the pI of the antibody before modification.
  • the isoelectric point of SA237 MAb2 in the present example
  • the amino acid sequence of tocilitumab isoelectric point: 9.4 was modified to control the isoelectric point
  • a fully humanized NS22 antibody produced by the method described in Example 12 of WO2009 / 072604 and having an isoelectric point controlled to 5.6 by modifying the amino acid sequence is also included.
  • antibodies having an improved isoelectric point examples include SA237 (MAb2, H chain / SEQ ID NO: 1, L chain / SEQ ID NO: 2), an anti-IL-6 receptor antibody described in WO2009 / 041621, Examples include, but are not limited to, a humanized NR10 antibody and a fully humanized NS22 antibody produced by the method described in Example 12 of WO2009 / 072604.
  • amino acid residues exposed on the surface of the antibody in the case of the heavy chain variable region, amino acid residues based on Kabat numbering are H1, 5H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H31, H39, H42, H43, H44, H46, H61, H62, H64, H65, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, Examples include, but are not limited to, amino acid residues selected from H108, 112H110, and H112.
  • modification refers to substitution of an original amino acid residue with another amino acid residue, deletion of the original amino acid residue, addition of a new amino acid residue, etc. Preferably, it refers to substitution of the original amino acid residue with another amino acid residue.
  • amino acids there are charged amino acids among amino acids.
  • lysine (K), arginine (R), and histidine (H) are known as positively charged amino acids (positively charged amino acids).
  • negatively charged amino acid negatively charged amino acid
  • aspartic acid D
  • glutamic acid E
  • Other amino acids are known as non-charged amino acids.
  • amino acid residue after modification in the present invention is preferably selected from amino acid residues included in any of the following groups (a) or (b), but is not particularly limited to these amino acids.
  • A Glutamic acid (E), aspartic acid (D)
  • B Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H)
  • the modification in the present invention includes (1) substitution from an amino acid having a charge to an amino acid having no charge, (2) substitution from an amino acid having a charge to an amino acid having an opposite charge to the amino acid, ( 3) Substitution from an amino acid having no charge to an amino acid having a charge.
  • the value of the isoelectric point can be measured by isoelectric focusing known to those skilled in the art.
  • the value of theoretical isoelectric point can be calculated using gene and amino acid sequence analysis software (Genetyx etc.).
  • An antibody having a modified amino acid residue charge can be obtained by modifying a nucleic acid encoding the antibody, culturing the nucleic acid in a host cell, and purifying the antibody from the host cell culture.
  • “modifying a nucleic acid” refers to modifying a nucleic acid sequence to be a codon corresponding to an amino acid residue introduced by the modification. More specifically, it means that the base sequence of the nucleic acid is modified so that the codon of the amino acid residue before modification becomes the codon of the amino acid residue introduced by modification. That is, the codon encoding the amino acid residue to be modified is replaced by the codon encoding the amino acid residue introduced by the modification.
  • Such nucleic acid modification can be appropriately performed by those skilled in the art using known techniques such as site-directed mutagenesis and PCR mutagenesis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be a solution preparation (antibody-containing solution preparation) or a lyophilization agent.
  • the solution preparation of the present invention includes a solution before lyophilization treatment or a solution after re-dissolution in the production process of the lyophilized preparation.
  • the solution preparation of the present invention is preferably a solution preparation produced without including a freeze-drying step in the production process.
  • the lyophilizing agent of the present invention can be obtained by lyophilizing the solution preparation of the present invention by a method known to those skilled in the art.
  • the preparation of the present invention includes, as necessary, a cryoprotectant, a suspending agent, a solubilizing agent, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a diluent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent.
  • a cryoprotectant such as an agent, a sulfur-containing reducing agent, and an antioxidant can be included.
  • cryoprotective agents include, but are not limited to, sugars such as trehalose, sucrose, and sorbitol.
  • solution adjuvant examples include, but are not limited to, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinamide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, tuna gol, castor oil fatty acid ethyl ester.
  • isotonic agents include, but are not limited to, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and the like.
  • preservatives include, but are not limited to, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, chlorocresol, and the like.
  • adsorption inhibitor examples include, but are not limited to, human serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyethylene glycol and the like.
  • sulfur-containing reducing agents include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, sodium thiosulfate, glutathione, carbon atoms
  • sulfur-containing reducing agents include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, sodium thiosulfate, glutathione, carbon atoms
  • sulfur-containing reducing agents include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thio
  • Antioxidants such as erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite
  • the chelating agent include, but are not limited to, sodium, triamyl gallate, propyl gallate, disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • the preparation of the present invention can be administered either orally or parenterally, but is usually administered by a parenteral route. Specifically, it is administered by injection, transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, or the like. As an example of an injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or the like. In the case of subcutaneous injection, the amount of injection solution is limited, but the dose of antibody per administration can be large (about 100 to 200 mg-). Therefore, the preparation of the present invention is particularly suitable for subcutaneous administration (injection). In addition, all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • ACE910 has an activity to substitute for the function of coagulation factor VIII as described in the above-mentioned patent document.
  • MAb2 An anti-IL-6 receptor antibody described in WO 2009/041621, which is an antibody (SA237) having a pI value of 5.8 by modifying the amino acid of tocilizumab.
  • the amino acid sequence of MAb2 antibody is represented by H chain / SEQ ID NO: 1, L chain / SEQ ID NO: 2.
  • MAb3 anti-glypican 3 humanized antibody (GC33, generic name: codrituzumab, antibody humanized by the method described in Example 24 of WO2006 / 006693 and modified in the L chain by the method of Example 25), antibody class is IgG1 .
  • FIG. 1 and FIG. 2 show the results of plotting as a function of R g app or D max app .
  • a good correlation was confirmed between the viscosity for any particle size parameter.
  • the correlation was well fitted by an exponential function, but a linear correlation was confirmed in the low viscosity region.
  • Example 2 Correlation between particle size parameter and molecular weight parameter and viscosity in MAb1, MAb3, MAb4 MAb1, MAb3 (all the same as those described in Example 1), MAb4 (humanized anti-IL-6 receptor antibody, (Generic name: tocilizumab), a sample having an antibody concentration of 15 mg / mL was prepared in the formulation solution of Table 2. About 10 ⁇ L of the sample is filled in a microcapillary cell, and the apparent radius of inertia R g app (nm) and the maximum length of the apparent particle D max app (particle size parameters) are measured with SAXSess mc 2 (Anton Paar).
  • the viscosity at the time of increasing the concentration can be predicted by using the particle size parameter obtained from the SAXS measurement as an index. Even when various modified proteins in which a part of the amino acid sequence of a protein such as an antibody is substituted with a different amino acid are prepared and the modified proteins with controlled viscosity are selected, the parameters and viscosity obtained by the method of the present invention are selected. Since the good correlation can be obtained in the same manner, the method of the present invention is also useful as a method for selecting a modified protein with a desired viscosity controlled.
  • Example 3 Correlation between particle size parameter and viscosity in MAb2 and MAb4 Using MAb2 and MAb4 (same as those described in Examples 1 and 2, respectively), the antibody (Mab4) before the amino acid sequence was modified It was investigated whether the difference in viscosity from an antibody (Mab2) in which a part of the amino acid sequence was substituted with another amino acid could be evaluated using the measurement method of the present invention. Using each antibody, a sample having an antibody concentration of 15 mg / mL was prepared in the formulation solution shown in Table 3.
  • Example 4 Correlation between particle size parameters and viscosity in MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, and BSA MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 (all the same as those described in Examples 1-2), and BSA A sample having a protein concentration of 15 mg / mL was prepared in the formulation solution shown in Table 4. About 10 ⁇ L of the sample is packed in a microcapillary cell, and the SAXSess mc 2 (Anton Paar) is used to measure the scattering intensity I (0) at the scattering angle 0, which is the particle size parameter, and the apparent radius of inertia R g app of the apparent particle. The maximum length D max app (nm) of the particles was calculated.
  • the particle size parameters (I (0), R g app , and D max app ) obtained at 15 mg / mL and 5 ° C obtained from SAXS measurement are certainly correlated with the viscosity at 160 mg / mL and 25 ° C. It has been confirmed that the viscosity evaluation method of the present invention can be applied to proteins other than antibodies.
  • Example 5 Correlation between particle size parameter and viscosity in MAb5 and its modified antibody MAb5-A (anti-IgE antibody) and MAb5-A, a modified antibody in which four amino acid residues at specific positions of MAb5 are substituted with histidine The viscosity was measured. Residues before and after modification are listed in Table 5. The modified positions in Table 5 are indicated based on Kabat numbering. Samples with protein concentrations of 151 and 155 mg / mL were prepared in the formulation solutions shown in Table 6. Using 90 ⁇ L of the sample, the viscosity ⁇ (mPa ⁇ s) of the sample was measured with an EMS viscometer (Kyoto Electronics) (J Artif Organs. 16: 359-367 (2013)). The experimental temperature was 25 ° C. The measurement results are shown in Table 6. Substantial increases in viscosity were observed with 4-residue histidine substitution.
  • MAb5-A In order to identify the alteration that causes this increase in viscosity and to design a low-viscosity modified antibody, MAb5, MAb5-A, and MAb5-A are substituted with histidine in 4 residues, one MAb5 residue at a time.
  • a sample having a protein concentration of 30 mg / mL was prepared in the formulation solution shown in Table 6. Residues before and after modification are listed in Table 5.
  • D max app (nm) of the apparent particle was calculated with SAXSess mc 2 (Anton Paar). This value is considered to represent the particle size of the protein in consideration of the association state.
  • measurement was performed at a low temperature of 5 ° C. The measurement results are shown in Table 6.
  • D max app for MAb5-A, MAb5-B, MAb5-D, MAb5-E compared to clearly greater than the MAb5 of D max app before modification, is D max app for MAb5-C of 21 nm The value was close to the D max app of MAb5 before modification.
  • FIG. 6 shows that Mab5-A molecules interact with each other through the Fab domain
  • the right figure shows that the side chain of His at position 97 in the Fab domain of the Mab5-A molecule is different. It is shown that it is at a distance that can form a hydrogen bond with the main chain of Trp in the Fab domain of Mab5-A molecule.
  • such a Fab-Fab interaction is not observed in Mab5. Therefore, the increase in viscosity due to substitution of Pro at position 97 of Mab5 with His may be attributed to the formation of hydrogen bonds between different Fabs.
  • the results of crystal structure analysis also suggested the validity of this screening method.
  • a method for easily measuring the viscosity of a protein solution with a small amount of sample is provided.
  • the present invention facilitates the development of a low-viscosity protein solution formulation, further enables selection (screening) of proteins with low viscosity in the solution, and provides a protein solution formulation such as an antibody having superior physical properties. It became possible.
  • the method of the present invention is particularly useful in the production of low viscosity biopharmaceuticals.

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Abstract

少量の試料で測定可能なX線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法により見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量を測定し、その測定結果を蛋白質溶液の粘度と相関づけることによって、蛋白質溶液の粘度を推定できることを見出した。

Description

蛋白質溶液の粘度測定方法
　本発明は蛋白質溶液の粘度の測定方法に関し、特に少量の試料で測定可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法に関する。
　近年、抗体などの蛋白質を活性成分として含有する医薬品製剤において、その利便性などを考慮して皮下投与用溶液製剤の開発が進んでいる。それに伴い、溶液製剤中の活性成分である抗体などの蛋白質の高濃度化が進んでいる。高濃度蛋白質溶液製剤の開発において、溶液の粘度は製造性や製剤の使用性を大きく左右するため、開発全体へ重大な影響を与える物性課題である。高濃度化に伴う溶液粘度の上昇（高粘性）は、蛋白質分子表面の電荷分布の偏りに起因する静電的引力とその結果としての分子の会合化（クラスター化）が原因であるとされている（非特許文献１）。すなわち、高粘性は蛋白質分子自身の性質に起因することから、処方設計によって粘度を確実に低下させることは困難であり、製造性及び使用性の高い低粘性の蛋白質製剤の開発を志向する場合、その分子開発の時点で粘度の低い分子をピックアップしなければならない。
　ところが、高濃度での粘度の実測値を得るためには大量の試料が必要であり、候補分子を評価する開発初期において粘度評価を実施することは現実的ではない。したがって、少量の試料で高濃度化した際の粘度を予測できる評価系の確立が望まれていた。
　これまでに、低濃度試料の動的光散乱測定から得られる抗体分子間の相互作用の強さを表すパラメータが、高濃度化した際の粘度と相関することが報告されている。しかし、大まかな相関しか得られておらず、特に分子間相互作用が強く働く抗体に関しては、粘度の予測系としてパラメータの精度に問題があった（非特許文献２～４）。
　小角X線散乱（SAXS）とは、X線を試料に照射し、散乱強度の散乱角依存性（散乱プロファイル）を解析することで、試料内の粒子の形状などに関する情報を少量（10μL）の試料で得ることができる技術である。しかし、本技術を蛋白質溶液の粘度測定のパラメータとして用いることは今まで知られていない。
Pharm Res. 31 :2549-2558 (2014) Pharm Res. 29 :397-410 (2012) J Pharm Sci. 101 :998-1011 (2012) Biophys J. 103 :69-78 (2012)
　本発明の目的は、特に少量の試料で実施可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法、蛋白質の粘性を予測する方法、粘性を制御した蛋白質の選抜方法、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法、および粘性の低い蛋白質を製造する方法を提供することである。
　一般的に、抗体等の蛋白質溶液の粘度の測定には、せん断速度とせん断応力との比例係数から粘度を算出するレオメーターや、試料溶液中の金属球の回転速度から粘度を算出するEMS粘度計、あるいは試料の通過速度や通過の際の圧力損失から粘度を算出するマイクロ流路を利用した粘度測定器を用いるのが主流である。
　しかし、レオメーターやEMS粘度計を利用した粘度測定には大量の試料を必要とし、試料調製作業も煩雑であった。従って、数多くの試料を同時期に測定することが困難であった。また、マイクロ流路を利用した粘度測定においては、吸着性の高い蛋白質溶液の粘度を正確に再現性よく測定することが困難であった。従って、少量の試料を多種類測定するような、粘度を指標とした改変蛋白質のスクリーニングは不可能であった。
　上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、従来、蛋白質の溶液中での分子形状の解析などに用いられていた小角X線散乱（SAXS）の技術を活用することにより、蛋白質溶液の粘度を、該蛋白質を含む微量の溶液試料で正確に測定（推定）できることを見出した。
　従来、SAXSを用いた分子形状の解析においては、立体構造が複雑である蛋白質の場合、通常、分子間の相互作用が無視できる低濃度条件下において形状を評価することが行われる。しかし本発明においては、相互作用すなわち分子間の会合化が現れる、比較的高濃度の領域において、相互作用が働いていないと仮定した解析方法を意図的に用いることで、見かけの形状情報、すなわち見かけの粒子サイズを測定した。このパラメータは分子間の相互作用が強く働き会合化が起きることで大きく見積もられると予想し、当該パラメータが、蛋白質溶液を高濃度化した際の粘度と相関するであろうとの仮説を立てた。
　本仮説を実証するために、室温（25℃）において、抗体と溶媒の種類を変化させ、高濃度（200 mg/mL）での粘度の実測値を得た。一方、SAXS測定により、同条件において準低濃度（60 mg/mL）での見かけの粒子サイズを評価したところ、両者が極めてよく相関することが見出された。また、SAXS測定を低温で実施することで、試料間の会合性の違いをより低濃度で評価できるだろうと考え、5℃/15mg/mLにおいて見かけの粒子サイズおよび見かけの分子量を評価したところ、25℃/160mg/mLでの粘度とよく相関することが見出された。すなわち、室温における高濃度抗体製剤の粘度は、低温でのSAXS測定から得られる見かけの粒子サイズおよび見かけの分子量により、少量（15mg/mL, 10μL）の試料で予測可能であることが示された。
　すなわち、本発明は以下〔１〕～〔１４〕を提供する。
〔１〕以下の工程を含む、蛋白質溶液の粘度の測定方法：
１）該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；
２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出する工程。
〔２〕試料中の蛋白質濃度が10～100mg/mlである、〔１〕の測定方法。
〔３〕試料中の蛋白質濃度が10～30mg/mlである、〔１〕または〔２〕の測定方法。
〔４〕試料中の蛋白質濃度が15～30mg/mlである、〔１〕～〔３〕のいずれかの測定方法。
〔５〕測定温度の条件が0～40℃である、〔１〕～〔４〕のいずれかの測定方法。
〔６〕測定温度の条件が0～25℃である、〔１〕～〔５〕のいずれかの測定方法。
〔７〕測定温度の条件が3～10℃である、〔１〕～〔６〕のいずれかの測定方法。
〔８〕測定する試料の量が1～100μLである、〔１〕～〔７〕のいずれかの測定方法。
〔９〕測定する試料の量が5～30μLである、〔１〕～〔８〕のいずれかの測定方法。
〔１０〕前記蛋白質が抗体である、〔１〕～〔９〕のいずれかの測定方法。
〔１１〕蛋白質の粘性を予測する方法であって、該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記方法。
〔１２〕粘性を制御した蛋白質の選抜方法であって、該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記選抜方法。
〔１３〕以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１１〕の予測方法を用いて、当該蛋白質の粘性を予測する工程。
〔１４〕以下の工程を含む、粘性の低い蛋白質を製造する方法：
１）〔１１〕の予測方法を用いて、粘性の低い蛋白質を選抜する工程。
〔１５〕以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１２〕の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から粘性の制御された蛋白質を選抜する工程。
〔１６〕以下の工程を含む、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法：
１）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
２）〔１２〕の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から元の蛋白質よりも粘性が低下した改変蛋白質を選抜する工程。
〔１７〕元の蛋白質が、アミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変蛋白質である、〔１３〕、〔１５〕または〔１６〕の方法：
〔１８〕蛋白質が抗体である、〔１１〕～〔１６〕のいずれかの方法。
〔１９〕元の抗体のアミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
〔２０〕97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、〔19〕の改変抗体。
〔２１〕元の抗体のアミノ酸残基の一部が別のアミノ酸に置換されている、抗原に対してイオン濃度依存的に結合する改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
〔２２〕97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、〔２１〕に記載の改変抗体。
各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた60 mg/mL, 15～35 ℃におけるRg appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた60 mg/mL, 15～35 ℃におけるDmax appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるI(0)の関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるRg appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 各抗体溶液の粘度を、SAXS測定により得られた15 mg/mL, 5 ℃におけるDmax appの関数としてプロットした結果を示すグラフである。 Mab5-AのFabの結晶構造を示す図である。左の図は、Mab5-AのFab-Fab間相互作用を示している。右の図は、左図中、楕円で囲んだ部分を拡大した図であり、一方のFab主鎖における97位のHisが、他方のFab主鎖と水素結合を形成できる距離にあることを示している。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、少量の試料で実施可能な蛋白質溶液の粘度の測定方法（推定方法）、蛋白質の粘性を予測する方法、粘性を制御した蛋白質の選抜方法、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法、および粘性の低い蛋白質を製造する方法に関する。
　本発明の方法においては、少量で、比較的低濃度の蛋白質溶液であっても、それを高濃度化した際の粘度を正確に推定することができる。
　具体的には、（１）蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定し、（２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出することにより、該蛋白質を含む溶液を高濃度化した際の粘度を推定することができる。
　また、上記測定値を利用して、蛋白質の粘性の予測、および粘性を制御した蛋白質の選抜を行うこともできる。本発明において「粘性を制御した蛋白質」または「粘性の制御された蛋白質」とは、溶液中で所望の粘度範囲内にて存在する蛋白質、好ましくは、高濃度化に伴って上昇した粘度が所望の粘度範囲内に制御された蛋白質を意味し、例えば、医薬として利用する蛋白質溶液製剤（好ましくは皮下投与用溶液製剤）中の活性成分として好適な粘度範囲内にある蛋白質が挙げられる。当該粘度範囲は、好ましくは蛋白質溶液製剤の製造性及び使用性の高い粘度範囲であり、当業者であれば適宜設定することができるが、例えば常温～体温（15～40℃）において2000mPa・s以下、好ましくは1500mPa・s以下、より好ましくは0.1～1000mPa・sであり、特に好ましくは1～700mPa・sである。
　また、種々の方法により得られた改変蛋白質の粘度を、上記予測方法を用いて予測することにより、粘性の制御された（又は粘性を低下させた）改変蛋白質の製造を効率よく実施することができる。当該改変蛋白質を得るために元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変する方法として種々の改変方法が知られており、当業者であれば、それらの既知の方法から適宜選択し、場合により一部改変して、実施することができる。一態様において、本発明の改変蛋白質の製造方法における元の蛋白質は、アミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変蛋白質である。また、本発明は、そのような製造方法により製造された改変蛋白質に関する。当該蛋白質は、好ましくは変異抗体であり、より好ましくは、元の抗体のアミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置された変異抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない変異抗体であり、ここで、97位のアミノ酸残基は元の抗体のアミノ酸残基であることが好ましい。さらに好ましくは、97位のアミノ酸残基がHisに置換された抗体と比べて抗体の粘性が低い抗体である。
　なお、ここで「元の蛋白質」や「元の抗体」とは、「人為的にアミノ酸の一部を改変する前の蛋白質」若しくは「人為的にアミノ酸の一部を改変する前の蛋白質」である。
　さらに、上記予測方法を用いて、粘性の低い蛋白質を選抜することにより、粘性の低い蛋白質または粘性を低下させた改変蛋白質の製造を効率よく実施することもできる。本発明において「粘性の低い蛋白質」または「粘性を低下させた改変蛋白質」もしくは「粘性が低下した改変蛋白質」とは、上記粘度範囲内の蛋白質を意味する。
　本発明の方法に使用する試料の量は、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量を測定可能な量であれば特に制限はないが、例えば3～100μL、好ましくは3～50μLであり、特に好ましくは5～30μLである。本発明の方法に使用する試料中の蛋白質濃度は、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量を測定可能な濃度であれば特に制限はないが、好ましくは1～100mg/ml、より好ましくは10～100mg/mlであり、更に好ましくは15～30mg/mlである。SAXS測定を低温（例えば、3～10℃）で実施することによって、より低濃度の蛋白質溶液も測定対象とすることができる。このように、少量、低濃度の試料で粘度の測定、粘性の予測が可能なため、本発明の方法を用いることにより、粘性の制御された、粘性を低下させた、又は粘性の低い改変蛋白質を効率的に選抜（スクリーニング）すること、およびそのような改変蛋白質を効率的に製造することができる。
　本発明の方法は、蛋白質溶液の粘度が上記の粒子サイズパラメータ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量と良好に相関することを利用して、見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定値から蛋白質溶液の粘度を推定することを特徴とする。当該相関は、蛋白質溶液の粘度の上昇が見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定値の上昇と相関する正の相関であり、好ましくは指数関数の相関または線形の相関である。前記粒子サイズパラメータの測定の温度条件は、当該測定が可能な温度範囲であれば制限はないが、例えば40℃以下、好ましくは室温以下、より好ましくは0～25℃であり、特に好ましくは3～10℃である。
　一態様において、本発明の蛋白質溶液の粘度測定方法(推定方法)は以下の工程を含む：
（１）前記蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射し、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、前記溶液中の蛋白質の見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；および
（２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出する工程。
　本発明において、蛋白質溶液の粒子サイズパラメータである見かけの粒子の最大長（Dmax app）および見かけの粒子の慣性半径（Rg app）は、本願実施例に記載のとおりに算出することができる。また、見かけの分子量は散乱角0における散乱強度（I(0)）に比例する値として与えられる。これらのパラメータの算出に用いる、X線を照射した試料の散乱パターンの検出は、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法により、当業者公知の方法により実施することができる。
　特定の態様において、前記工程（２）において用いる検量線は、種々の蛋白質溶液とSAXS測定試料の対について測定した粘度と見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の相関関係を解析して求めることができる。当該解析においては、粘度測定に係る蛋白質溶液とSAXS測定に係る試料の対において蛋白質の種類および溶媒が同一であればよく、両測定に用いる蛋白質の濃度および測定温度は同一である必要はない。そのため、相関関係の解析対象となる粘度は、前記工程（１）と同一の測定条件下での粘度に限定されず、所望の測定条件下での粘度について検量線を用意すれば、それを前記工程（２）で利用することにより、当該条件下での粘度（例えば、高濃度化した際の室温における粘度）を推定することができる。なお、当該検量線は、異なる蛋白質の溶液についても適用可能であるため、本工程において相関関係を解析する溶液中の蛋白質は、前記工程（１）～（２）で使用される溶液中の蛋白質と同じであっても異なってもよく、種々の蛋白質、溶媒で構成される蛋白質溶液についての測定結果を用いて相関関係を解析すればよい。
　本発明で使用される蛋白質は、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法による見かけの粒子サイズまたは見かけの分子量の測定が可能な蛋白質であれば特に制限はないが、好ましくは高濃度蛋白質溶液製剤の開発が望まれる蛋白質であり、例えば、BSAなどのアルブミンや抗体が挙げられる。
　本発明で使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
　本発明で使用されるモノクローナル抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、bispecific抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。さらに、血中滞留性や体内動態の改善を目的とした抗体分子の物性の改変（具体的には、等電点（pI）改変、Fc受容体の親和性改変等）を行うために抗体の定常領域等を人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。
　また、本発明で使用される抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのIgG、IgA、IgD、IgE、IgMなどいずれのクラスでもよいが、IgG及びIgMが好ましい。
　さらに本発明で使用される抗体には、定常領域と可変領域を有する抗体（wholeの抗体）だけでなく、Fv、Fab、F(ab)2などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカー等のリンカーで結合させた1価または2価以上の一本鎖Fv（scFv、sc(Fv)2）やscFvダイマーなどのDiabody等などの低分子化抗体なども含まれるが、wholeの抗体が好ましい。
　上述した本発明で使用される抗体は、当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
　また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAを得たら、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、WO 96/02576 参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
　抗体の活性、物性、薬物動態、安全性等を改善するために抗体のアミノ酸を置換する技術としては、例えば以下に述べる技術も知られており、本発明で使用される抗体には、このようなアミノ酸の置換（欠損や付加も含む）を施された抗体も含まれる。
　IgG抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化（Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.）をはじめとして、結合活性を増強させるための相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換によるaffinity maturation（Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.）、フレームワーク(FR)のアミノ酸置換による物理化学的安定性の向上（Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review）が報告されている。また、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換を施す技術として、抗体依存性細胞障害活性(ADCC)活性や補体依存性細胞障害活性(CDC)活性を増強させる技術が知られている（Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.）。さらに、このようなエフェクター機能を増強させるだけではなく、抗体の血中半減期を向上させるFcのアミノ酸置換の技術が報告されている（Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.、Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.）。さらには抗体の物性改善を目的とした定常領域の種々のアミノ酸置換技術も知られている（WO 09/41613）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（WO 93/12227, WO 92/03918、WO 94/02602, WO 94/25585、WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。本発明で使用される抗体には、このようなヒト抗体も含まれる。
　抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS、ミエローマ、BHK （baby hamster kidney）、HeLa、Vero、(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana)属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。
　さらに、本発明で使用される抗体には、抗体断片や低分子化抗体、並びに抗体修飾物が含まれる。例えば、抗体断片や低分子化抗体としてはFab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させた一価又は二価以上のシングルチェインFv(scFv、sc(Fv)2など) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
　抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性薬剤等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる（Farmaco. 1999 Aug 30;54(8):497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69.）。本発明で使用される抗体にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
　本発明で使用される抗体としては、抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体、抗HM1.24抗原抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子代替抗体、抗IL31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、ファクターIXとファクターXとのBi-specific抗体などを挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明で使用する好ましい再構成ヒト化抗体としては、ヒト化抗インターロイキン６（IL-6）レセプター抗体（トシリツマブ、hPM-1あるいはMRA、WO92/19759参照）、ヒト化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体（WO98/14580参照）、ヒト化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）（WO98/13388を参照）、ヒト化抗組織因子抗体（WO99/51743参照）、抗グリピカン-3 ヒト化IgG1κ抗体（codrituzumab、GC33、WO2006/006693参照）、抗NR10ヒト化抗体（WO2009/072604参照）、ファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体（ACE910、WO2012/067176を参照）などが挙げられる。本発明で使用するヒト化抗体として特に好ましいのは、ヒト化抗IL-6レセプター抗体、抗NR10ヒト化抗体、及びファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体である。
　ヒトIgM抗体としては、抗ガングリオシドGM3組み換え型ヒトIgM抗体（WO05/05636参照）などが好ましい。
　低分子化抗体としては、抗TPO受容体アゴニストDiabody（WO02/33072参照）、抗CD47アゴニストDiabody（WO01/66737参照）などが好ましい。
　また、本発明で使用される抗体としては、抗原に対してイオン濃度依存的（例えば、pH依存的またはカルシウムイオン濃度依存的）に結合する改変抗体を挙げることができる。抗原に対して血漿中のpH中性域の条件下においては強く結合し、エンドソーム内のpH酸性域の条件下において抗原から解離するpH依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対してpH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する抗体）や抗原に対して血漿中の高カルシウムイオン濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシウムイオン濃度の条件下において抗原から解離するカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体（抗原に対して高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシウムイオン濃度の条件下で解離する抗体）はエンドソーム内で抗原から解離することが可能である。pH依存的に抗原に対して結合する抗体やカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると、再び抗原に結合することが可能である。そのため一分子の抗体が複数の抗原分子に繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原はエンドソーム内で抗体から解離することによって血漿中にリサイクルされずライソソーム内で分解される。こうした抗原結合分子を生体に投与することによって、抗原の細胞内への取込みが促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
　本発明において等電点の低い抗体（低pI抗体）とは、特に天然では存在し難い、低い等電点を有する抗体をいう。このような抗体の等電点としては例えば3.0～8.0、好ましくは5.0～7.5、さらに好ましくは5.0～7.0、特に好ましくは5.0～6.5が挙げられるがこれらに限定されない。なお、天然の（または通常の）抗体は、通常7.5～9.5の範囲の等電点を有すると考えられる。
　さらに本発明で使用される抗体としては、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基を改変することにより抗体のpIを低下させた、pI改変抗体が好ましい。このようなpI改変抗体とは、改変前の抗体のpIよりも1以上、好ましくは2以上、さらに好ましくは3以上、pIを低下させた抗体をいう。後述の実施例に記載されるように、トシリツマブ（等電点：9.4）のアミノ酸配列を改変して等電点を制御したSA237（本願実施例のMAb2）の等電点は、5.8である。また、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した、アミノ酸配列を改変して等電点を5.6に制御した完全ヒト化NS22抗体も挙げられる。
　等電点が改良された抗体としては、例えば、WO2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体であるSA237（MAb2、H鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２）、抗NR10ヒト化抗体であり、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した、完全ヒト化NS22抗体などがあげられるがこれらに限定されない。
　抗体の表面に露出しているアミノ酸残基としては、H鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるH1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H31, H39, H42, H43, H44, H46, H61, H62, H64, H65, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110, H112の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。またＬ鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるL1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L24, L27, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L53, L54, L55, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において「改変」とは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等をいうが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
　アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が存在することが知られている。一般的に、正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸（負電荷アミノ酸）としては、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）等が知られている。これら以外のアミノ酸は電荷を有さないアミノ酸として知られている。
　本発明において改変後のアミノ酸残基としては、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から適宜選択されるが、特にこれらのアミノ酸に制限されない。
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）
　また、改変前のアミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さないアミノ酸残基となるように改変することも好ましい態様の一つである。
　すなわち、本発明における改変としては、（１）電荷を有するアミノ酸から電荷を有さないアミノ酸への置換、（２）電荷を有するアミノ酸から当該アミノ酸とは反対の電荷を有するアミノ酸への置換、（３）電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換が挙げられる。
　等電点の値は、当業者公知の等電点電気泳動により測定することが可能である。また、理論等電点の値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア（Genetyx等）を用いて計算することができる。
　アミノ酸残基の電荷が改変された抗体は、抗体をコードする核酸を改変し、当該核酸を宿主細胞で培養し、宿主細胞培養物から抗体を精製することによって取得することができる。本発明において「核酸を改変する」とは、改変によって導入されるアミノ酸残基に対応するコドンとなるよう核酸配列を改変することをいう。より具体的には、改変前のアミノ酸残基のコドンが改変によって導入されるアミノ酸残基のコドンになるように、核酸の塩基配列を改変することを言う。即ち、改変されるアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜行うことが可能である。
　本発明の医薬組成物は、溶液製剤（抗体含有溶液製剤）、あるいは凍結乾燥剤であることができる。本発明の溶液製剤には、凍結乾燥製剤の製造工程における凍結乾燥処理前の溶液または再溶解後の溶液も含まれる。本発明の溶液製剤は、製造過程に凍結乾燥工程を含まないで製造される溶液製剤であることが好ましい。また本発明の凍結乾燥剤は、本発明の溶液製剤を当業者に公知の手法により凍結乾燥させることにより得ることができる。
　また本発明の製剤には、必要に応じて、凍結保護剤、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の添加材や担体を含むことができる。
　凍結保護剤として例えば、トレハロース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を挙げることができるがこれらに限定されない。
　溶液補助剤として例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　等張化剤として例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　保存剤として例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　吸着防止剤として例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　含硫還元剤として例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
　酸化防止剤として例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の製剤は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、通常、非経口経路で投与される。具体的には、注射、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などにより投与される。注射剤型の例としては、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射などにより全身又は局所的に投与することができる。皮下注射の場合、注射液量の制限があるが1回あたりの抗体投与量を大量(100～200 mg-程度)とすることができる。そのため、本発明の製剤は皮下投与（注射）用として特に適している。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら実施例のみに限定されるものではない。
[実施例1] MAb1, MAb2, MAb3における粒子サイズパラメータと粘度との相関
　MAb1：血液凝固第IX因子および／または活性化血液凝固第IX因子ならびに血液凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子を認識する二重特異性抗体である。非特許文献（PLoS One. 2013;8(2):e57479）及び特許文献（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 （Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：５に記載のL鎖が会合し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：５に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体）を、前記非特許文献又は特許文献の記載に従って作製した。尚、ACE910は前記特許文献に記載されているように凝固第VIII因子の機能を代替する活性を有している。
　MAb2：WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、トシリツマブのアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体（SA237）である。MAb2抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２で表される。
　MAb3：抗グリピカン３ヒト化抗体（GC33、一般名：codrituzumab、WO2006/006693の実施例24に記載の方法でヒト化し、実施例25の方法でL鎖が改変された抗体）、抗体クラスはIgG1。
　MAb1, MAb2, MAb3を用い、表1の処方溶液において、抗体濃度が60 mg/mLの試料を調製した。当該試料約40 μLをキャピラリーセルに充てんしSAXSess mc2（アントンパール）にて粒子サイズパラメータであるみかけの粒子の慣性半径Rg app (nm)とみかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。実験温度及び測定結果を表1に記す。Rg app及びDmax appの算出方法を以下に記す。
R g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
　続いて、MAb1, MAb2, MAb3を用い、表1の処方溶液において、抗体濃度が200 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16 :359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度及び測定結果を表1に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　SAXS測定より得られた60 mg/mLにおける粒子サイズパラメータ（Rg app及びDmax app）と、200 mg/mLにおける粘度（実測値）との相関を調査すべく、MAb1, MAb2, MAb3の粘度をRg appまたはDmax appの関数としてプロットした結果を図1及び図2に示す。いずれの粒子サイズパラメータにおいても粘度との間に良好な相関が確認された。相関は指数関数によって良好にフィッティングされたが、粘度の低い領域においては線形の相関が確認された。以上より、測定に高濃度の試料を必要とする粘度の実測を行わずとも、低濃度の試料を用いたSAXS測定から得られるRg appまたはDmax appを指標とすることで、高濃度化した際の粘度の予測が可能であることが示された。
[実施例2] MAb1, MAb3, MAb4における粒子サイズパラメータおよび分子量パラメータと粘度との相関
　MAb1, MAb3（いずれも実施例1に記載のものと同じ）, MAb4（ヒト化抗IL-6レセプター抗体、一般名：トシリツマブ）を用い、表2の処方溶液において、抗体濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて粒子サイズパラメータであるみかけの粒子の慣性半径Rg app (nm)とみかけの粒子の最大長Dmax app (nm)に加え，みかけの分子量に比例する値として散乱角0における散乱強度I(0) (a.u.)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表2に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)およびR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
　続いて、MAb1, MAb3, MAb4を用い、表2の処方溶液において、抗体濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16 :359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表2に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　SAXS測定より得られた15 mg/mL, 5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL, 25 ℃における粘度との相関を調査すべく、MAb1, MAb3, MAb4の粘度をI(0)、Rg app、またはDmax app関数としてプロットした結果を図3、図4、及び図5に示す。いずれの粒子サイズパラメータにおいても粘度との間に良好な相関が確認されたことから、測定に大量かつ高濃度の試料を必要とする粘度の実測を行わずとも、少量かつ低濃度の試料を用いたSAXS測定から得られる粒子サイズパラメータを指標とすることで、高濃度化した際の粘度の予測が可能であることが示された。
　また、抗体等の蛋白質の一部アミノ酸配列を異なるアミノ酸に置換した種々の改変蛋白質を作製して、粘度が制御された改変蛋白質を選抜する場合においても、本発明の方法によって得られるパラメータと粘度の実測値について、同様に良好な相関がえられるので、所望とする粘度が制御された改変蛋白質の選抜方法としても本発明の方法は有用である。
[実施例3] MAb2、MAb4における粒子サイズパラメータと粘度との相関
　MAb2、MAb4（それぞれ実施例1、2に記載のものと同じ）を用いて、アミノ酸配列を改変する前の抗体（Mab4）と一部のアミノ酸配列を別のアミノ酸に置換した抗体（Mab2）との粘度の違いを本発明の測定方法を用いて評価できるかどうか検討を行った。それぞれの抗体を用い、表3の処方溶液において，抗体濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて，粒子サイズパラメータである散乱角0における散乱強度I(0)、みかけの粒子の慣性半径Rg app、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値が大きいほど抗体の会合性が高いことを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表3に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)及びR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
　続いて、MAb2、MAb4を用い、表3の処方溶液において、抗体濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表3に記す。
　SAXS測定より得られた15 mg/mL、5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL、25 ℃における粘度は確かに相関することが確認された。よって、本発明の方法を用いた、粘度を指標とする蛋白質のアミノ酸置換体のスクリーニング法の妥当性が実証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
[実施例4] MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、及びBSAにおける粒子サイズパラメータと粘度との相関
　MAb1、MAb2、MAb3、MAb4（いずれも実施例1～2に記載のものと同じ）、及びBSAを用い、表4の処方溶液において、蛋白質濃度が15 mg/mLの試料を調製した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて、粒子サイズパラメータである散乱角0における散乱強度I(0)、みかけの粒子の慣性半径Rg app、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。これらの値は会合状態を考慮した蛋白質の粒子サイズを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表3に記す。I(0)、Rg app、及びDmax appの算出方法を以下に記す。
I(0)及びR g app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対してギニエプロットを行い、q*Rg app<1.3を満たす条件下においてRg appを得る。同時にy切片からI(0)を得る。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
　続いて、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、及びBSAを用い、表4の処方溶液において、蛋白質濃度が160 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η（mPa・s）を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表4に記す。
　SAXS測定より得られた15 mg/mL、5 ℃における粒子サイズパラメータ（I(0)、Rg app、及びDmax app）と、160 mg/mL、25 ℃における粘度は確かに相関することが確認され、抗体以外の蛋白質にも本発明の粘度の評価法が適用できることが実証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
[実施例5] MAb5及びその改変抗体における粒子サイズパラメータと粘度との相関
　MAb5（抗IgE抗体）及びMAb5の特定の位置の4つのアミノ酸残基をヒスチジンに置換した改変抗体であるMAb5-Aの粘度を測定した。改変前後の残基を表5に記載した。なお、表5における改変位置は、Kabatナンバリングに基づき表記した。表6の処方溶液において、蛋白質濃度が151、155 mg/mLの試料を調製した。当該試料90 μLを用いてEMS粘度計（京都電子）（J Artif Organs. 16:359-367 (2013)）にて試料の粘度η (mPa・s)を測定した。実験温度は25 ℃とした。測定結果を表6に記す。4残基のヒスチジン置換により粘度の大幅な上昇が認められた。
　この粘度上昇の原因となる改変を特定し、低粘度の改変抗体をデザインすべく、MAb5、MAb5-A、及びMAb5-Aにおいてヒスチジンに置換された4残基を1残基ずつMAb5の残基に戻した4つの改変抗体（MAb5-B、MAb5-C、MAb5-D、MAb5-E）を用い、表6の処方溶液において、蛋白質濃度が30 mg/mLの試料を調製した。改変前後の残基を表5に記載した。当該試料約10 μLをマイクロキャピラリーセルに充てんし、SAXSess mc2（アントンパール）にて、みかけの粒子の最大長Dmax app (nm)を算出した。この値は会合状態を考慮した蛋白質の粒子サイズを表すと考えられる。試料間での会合性の違いをより顕著に検出するために、低温である5 ℃にて測定を実施した。測定結果を表6に記す。MAb5-A、MAb5-B、MAb5-D、MAb5-EのDmax appは、改変前のMAb5のDmax appと比べて明らかに大きいのに対し、MAb5-CのDmax appは21 nmという改変前のMAb5のDmax appに近い値であった。このMAb5-Cについて、蛋白質濃度が160 mg/mLの試料を調製し、Mab5及びMab5-Aと同様に25 ℃での粘度η (mPa・s)を測定したところ、10.4 mPa・sという改変前のMAb5の粘度に近い値であった。このことから、所定の位置のプロリンをヒスチジンに置換する改変が粘度上昇を引き起こしていることが強く示唆された。このように、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて見かけの粒子サイズを測定することにより、粘性の制御された（粘性の低い）蛋白質を少量の試料で効率良く選抜し、製造することができることが示された。なお、Dmax appの算出方法を以下に記す。
D max app の算出方法
1) 試料及び溶媒（ブランク）の散乱パターンを2次元のイメージングプレートを用いて検出する。
2) 2次元の散乱パターンをSAXSQuantソフトウェア（アントンパール）によって散乱ベクトルqを変数とした1次元の散乱強度に変換し、散乱曲線を得る。
3) ビームストッパーを透過したq=0における散乱強度で散乱曲線を規格化する。
4) 試料の散乱曲線からブランクの散乱曲線を差し引く（ブランク補正）。
5) デスメア補正（光学系補正）を行う。
6) 吸収補正、ブランク補正及びデスメア補正後の散乱曲線に対して間接フーリエ変換法（J Appl Cryst. 13 :577-584 (1980)）を適用し、散乱を与えている粒子の二体距離分布関数（p(r)）を得る。p(r)のx軸切片からDmax appを得る。
　SAXSスクリーニング法により、MAb5-AからMAb5-Cへのさらなる改変によって粘度を低減できる可能性が示唆された。そこで、上述の測定法にてMAb5-Cの粘度を実際に測定した。蛋白質濃度が160 mg/mLのMAb5-Cの測定結果を表6に記す。確かに粘度が大きく低減していることが確認され、本スクリーニング法の妥当性が実証された。
　また、Mab5-AのFabの結晶構造を図６に示す。図６の左図は、Mab5-A分子同士がFabドメインを介して互いに相互作用することを示しており、右図は、Mab5-A分子のFabドメインにおける97位のHisの側鎖が、別のMab5-A分子のFabドメインにおけるTrpの主鎖と水素結合を形成できる距離にあることを示している。一方、Mab5では、このようなFab-Fab間相互作用は観察されない。したがって、Mab5の97位のProをHisに置換したことによる粘度上昇は、当該置換により、異なるFab間で水素結合が形成されることに起因する可能性が考えられる。このように、結晶構造解析の結果からも、本スクリーニング法の妥当性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明により、少量の試料で簡便に蛋白質溶液の粘度を測定できる方法が提供された。本発明により、低粘度の蛋白質溶液製剤の開発が容易となり、さらには溶液中の粘性が低い蛋白質の選抜（スクリーニング）が可能となり、より物性面に優れた、抗体等の蛋白質溶液製剤を提供することが可能となった。本発明の方法は、特に低粘度のバイオ医薬品の製造において有用である。

Claims (22)

  1. 　以下の工程を含む、蛋白質溶液の粘度の測定方法：
    １）該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定する工程；
    ２）予め求めた検量線に基づき、上記測定値から該蛋白質の粘度を算出する工程。
  2. 　試料中の蛋白質濃度が10～100mg/mlである、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　試料中の蛋白質濃度が10～30mg/mlである、請求項１または２に記載の測定方法。
  4. 　試料中の蛋白質濃度が15～30mg/mlである、請求項１～３のいずれか一項に記載の測定方法。
  5. 　測定温度の条件が0～40℃である、請求項１～４のいずれか一項に記載の測定方法。
  6. 　測定温度の条件が0～25℃である、請求項１～５のいずれか一項に記載の測定方法。
  7. 　測定温度の条件が3～10℃である、請求項１～６のいずれか一項に記載の測定方法。
  8. 　測定する試料の量が1～100μLである、請求項１～７のいずれか一項に記載の測定方法。
  9. 　測定する試料の量が5～30μLである、請求項１～８のいずれか一項に記載の測定方法。
  10. 　前記蛋白質が抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の測定方法。
  11. 　蛋白質の粘性を予測する方法であって、該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記方法。
  12. 　粘性を制御した蛋白質の選抜方法であって、該蛋白質の濃度が1～100mg/mlである試料にX線を照射することによる、X線小角散乱法（SAXS）またはX線溶液散乱法を用いて、見かけの粒子サイズ（見かけの粒子の最大長（Dmax app）もしくは見かけの粒子の慣性半径（Rg app））または見かけの分子量を測定することを含む、前記選抜方法。
  13. 　以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
    １）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
    ２）請求項１１に記載の予測方法を用いて、当該蛋白質の粘性を予測する工程。
  14. 　以下の工程を含む、粘性の低い蛋白質を製造する方法：
    １）請求項１１に記載の予測方法を用いて、粘性の低い蛋白質を選抜する工程。
  15. 　以下の工程を含む、粘性の制御された改変蛋白質を製造する方法：
    １）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
    ２）請求項１２に記載の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から粘性の制御された蛋白質を選抜する工程。
  16. 　以下の工程を含む、粘性を低下させた改変蛋白質を製造する方法：
    １）元の蛋白質のアミノ酸の一部を改変して、改変蛋白質を得る工程；
    ２）請求項１２に記載の選抜方法を用いて、当該改変蛋白質から元の蛋白質よりも粘性が低下した改変蛋白質を選抜する工程。
  17. 　元の蛋白質が、アミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変蛋白質である、請求項１３、１５または１６に記載の方法：
  18. 　蛋白質が抗体である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　元の抗体のアミノ酸残基の一部がヒスチジン（His）残基に置換された改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
  20. 　97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、請求項19に記載の改変抗体。
  21. 　元の抗体のアミノ酸残基の一部が別のアミノ酸に置換されている、抗原に対してイオン濃度依存的に結合する改変抗体であって、Kabat numbering systemにおける97位のアミノ酸残基がHis残基でない改変抗体。
  22. 　97位のアミノ酸残基が元の抗体のアミノ酸残基である、請求項２１に記載の改変抗体。
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