WO2020204055A1 - 標的特異的な外来遺伝子の導入方法 - Google Patents

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WO2020204055A1
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exogenous dna
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cell
cells
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将大 小松
健太 小村
裕二 若原
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中外製薬株式会社
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    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for target-specifically introducing foreign DNA into the genome of an animal cell, a transformed cell obtained by using the foreign DNA, and a method for producing a polypeptide encoded by the foreign DNA.
  • a method of expressing a polypeptide such as a cytokine or an antibody in cultured cells by gene recombination technology and producing it in large quantities is known.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide is introduced into a cell in an expressible form to form a transformed cell, and the target polypeptide to be accumulated in the culture is recovered.
  • Including the step of Microorganisms, insects, plants, or animal cells are widely used as the transforming cells.
  • animal cells are widely used as suitable host cells for obtaining polypeptide derived from animals.
  • Target integration has been proposed as one of the techniques capable of solving the problem of introducing foreign DNA into the genome (Patent Document 1-3).
  • a genomic region suitable for introduction and expression of exogenous DNA is identified in advance, and the exogenous DNA to be expressed is site-specifically incorporated into the identified genomic region.
  • TI can be said to be a new gene recombination technology created with the improvement of genome site-specific recombination technology.
  • the predictability of the obtained transformed cells such as the expression level of exogenous DNA is improved, and efficient acquisition of transformed cells having the required traits can be expected.
  • genomic regions suitable for introducing exogenous DNA are often referred to as HotSpots.
  • the subject of this disclosure is the provision of new hotspots that are useful for target integration (TI).
  • the present inventors continued to search for a region in which foreign DNA encoding a polypeptide such as an antibody can be expressed at a high level in animal cells.
  • the initial expression level could not be maintained for a long period of time, and the expression level may eventually decrease during culturing (PLoS ONE, 2017 12).
  • the production amount of the expression product becomes unstable, and the production efficiency may be lowered.
  • the production line will need to be restructured.
  • the present inventors suspected that the decrease in the expression level of the polypeptide in culture may occur depending on the genome introduction position of the exogenous polynucleotide. Therefore, as a result of attempting to search for a hotspot that can be expected to maintain the expression level of exogenous DNA for a long period of time, the present inventors have succeeded in finding a new hotspot and have reached the present disclosure.
  • the introduction site of the exogenous DNA is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1
  • CCDC91 coiled-coil domain-containing protein 91
  • [4] The method according to [3], wherein the introduction site of the exogenous DNA is in the first intron of the CCDC91 gene.
  • the exogenous DNA is site-specifically introduced into the genomic region by any method selected from homologous recombination, recombinant enzyme-mediated gene substitution (RMCE), and genome editing [1]. ] To [4].
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the target polypeptide is an antigen-binding molecule.
  • [7] The method according to [6], wherein the antigen-binding molecule is an antibody.
  • the introduction site of the exogenous DNA is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [ 8].
  • CCDC91 coiled-coil domain-containing protein 91
  • the introduction site of the DNA cassette is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [15].
  • the method described in. [17] The method according to [16], wherein the introduction site of the DNA cassette is selected from the CCDC91 gene region.
  • the introduction site of the exogenous DNA is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [22].
  • the exogenous DNA is site-specifically introduced into the genomic region by any method selected from homologous recombination, recombinant enzyme-mediated gene substitution (RMCE), and genome editing [21]. ] To [24].
  • the CHO cell according to any one of. [26] The CHO cell according to any one of [21] to [25], wherein the target polypeptide is an antigen-binding molecule.
  • the introduction site of the DNA cassette is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [28].
  • the CHO cell according to. [30] The CHO cell according to [29], wherein the introduction site of the DNA cassette is selected from the CCDC91 gene region.
  • the CHO cell according to [30] wherein the introduction site of the DNA cassette is in the first intron of the CCDC91 gene.
  • [34] A method for producing a polypeptide using CHO cells in which exogenous DNA encoding the target polypeptide is introduced into the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1.
  • the introduction site of the exogenous DNA is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [] 34].
  • CCDC91 coiled-coil domain-containing protein 91
  • the exogenous DNA is site-specifically introduced into the genomic region by any method selected from homologous recombination, recombinant enzyme-mediated gene substitution (RMCE), and genome editing [37]. ] The method described in. [39] The method according to any one of [34] to [38], wherein the target polypeptide is an antigen-binding molecule. [40] The method according to [39], wherein the antigen-binding molecule is an antibody.
  • a method for producing a polypeptide which comprises the following steps; (1) A step of introducing an exogenous DNA encoding a target polypeptide into a CHO cell, in which the exogenous DNA is introduced into a genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the CHO cell genome. Process to do; (2) A step of culturing CHO cells into which foreign DNA has been introduced; and (3) a step of recovering the target polypeptide.
  • the introduction site of the exogenous DNA is selected from the region containing the coiled-coil domain-containing protein 91 (CCDC91) gene and its promoter region in the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 [ 41].
  • hotspots suitable for obtaining animal cells transformed by TI have been found.
  • the hotspots provided by the present disclosure can maintain stable expression levels of the polypeptide encoded by the foreign DNA introduced into the region over a long period of time.
  • FIG. 1 shows a map of the landing pad used for searching for hot spots.
  • Recognition sequences of the recombinant enzyme Cre (loxP1 and loxP2) are inserted at both ends of these two genes to form a DNA cassette.
  • FIG. 2 shows a map of a recombinant plasmid (Recombination plasmid) for cassette exchange reaction with the DNA cassette of the landing pad integrated into the genome.
  • FIG. 3 shows the results of a 2-week production culture of antibody-expressing cell clones established after TI.
  • the horizontal axis shows the name of the established antibody-producing cell clone, and the vertical axis shows the antibody production level (mg / L) per liter of the culture solution.
  • FIG. 4 shows the time course of antibody production of antibody-producing cell clones TI-L and TI-J after freezing and thawing.
  • the horizontal axis shows the time (days) after thawing of the cryopreserved cells, and the vertical axis shows the antibody production level (mg / L) per liter of the culture solution.
  • FIG. 5 shows the antibody production level by another antibody-producing cell clone prepared by incorporating genes of different antibodies into the recombinant plasmid of FIG.
  • the horizontal axis shows the name of the produced antibody, and the vertical axis shows the antibody production level (mg / L) per liter of the culture solution.
  • FIG. 6 schematically shows the introduction position of the landing pad on the genome of the parent cell TI-L (transformed cell before replacing the landing pad with the exchange cassette) of the antibody-producing cell clone having the highest antibody production level. ..
  • the part indicated by "Integration site” is the introduction position of the landing pad identified in the present disclosure.
  • the introduction position is 6651 bp downstream from the (5'end) of the CCDC91 gene and 6454 bp downstream from the upstream (5'end) of Intron1.
  • the base sequences of 5 kb upstream (5'side in the genome sequence) and 5 kb downstream (3'side in the genome sequence) of the "Integration site" are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the "antigen-binding molecule” is limited only by binding to the target antigen.
  • the antigen-binding molecule can use a domain of any structure as long as it binds to the antigen of interest. Examples of such domains include, but are not limited to, heavy chain variable regions (VHs) of antibodies and light chain variable regions (VL) of antibodies, monodomain antibodies (sdAb), which are present in vivo.
  • VHs heavy chain variable regions
  • VL light chain variable regions
  • sdAb monodomain antibodies
  • Adnectin International Publication WO2002 / 032925
  • Affibody International Publication WO1995 / 001937
  • whose scaffold is the IgG binding domain constituting three helix bundles consisting of 58 amino acids of Protein A, Turn containing 33 amino acid residues DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins)
  • DARPins Designed Ankyrin Repeat proteins
  • NGAL neutrophil gelatinase-associated lipocalin
  • Etc. International Publication WO 2003/029462
  • Acquired of jawless species such as Yatsume eel and Nuta eel Rich in leucine residues of variable lymphocyte receptor (VLR) that does not have immunoglobulin structure as an immune system
  • VLR variable lymphocyte receptor
  • An example is the recessed area of a parallel sheet structure inside a horse-shaped structure in which repeat (leucine-rich-repeat (LRR)) modules are repeatedly stacked (International Publication WO2008 / 016854).
  • an antigen-binding molecule capable of exerting an antigen-binding function with a molecule composed only of the antigen-binding domain, and an antigen-binding function alone after being released from other linked peptides.
  • antigen-binding molecules include antigen-binding molecules that can be exerted.
  • antigen-binding molecules include, but are not limited to, single domain antibodies, scFv, Fv, Fab, Fab', F (ab') 2, and the like.
  • One of the preferred examples of the antigen-binding molecule of the present invention is an antigen-binding molecule having a molecular weight of 60 kDa or less.
  • antigen-binding molecules include, but are not limited to, single domain antibodies, scFv, Fab, Fab'.
  • Antigen-binding molecules with a molecular weight of 60 kDa or less are usually likely to cause renal clearance when present in the blood as a monomer (J Biol Chem. 1988 Oct 15; 263 (29): 15064-70). reference).
  • antibody is used in the broadest sense herein and is not limited to, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg,) as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. , Bispecific antibody) and antibody fragments, including various antibody structures.
  • antibody fragment refers to a molecule other than the complete antibody, which comprises a portion of the complete antibody that binds to the antigen to which the complete antibody binds.
  • antibody fragments are, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 ; Diabody; Linear antibody; Single chain antibody molecule (eg, scFv). ); And includes multispecific antibodies formed from antibody fragments. As described above, antibodies and antibody fragments are typical examples of antigen-binding molecules.
  • Fc Region is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region.
  • the term includes the Fc region of a native sequence and the mutant Fc region.
  • the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl end of the heavy chain.
  • the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) in the Fc region may or may not be present.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc or constant region is Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, follow the EU numbering system (also known as the EU index) described in MD 1991.
  • nucleic Acid / Polynucleotide An "isolated" nucleic acid is a / polynucleotide, a nucleic acid / polynucleotide molecule isolated from its original environmental components.
  • An isolated nucleic acid / polynucleotide comprises a nucleic acid / polynucleotide molecule contained within a cell that normally contains the nucleic acid / polynucleotide molecule, but the nucleic acid / polynucleotide is extrachromosomal or inherent. It exists at a position on the chromosome different from the position on the chromosome of.
  • the nucleic acid / polynucleotide when the nucleic acid / polynucleotide is artificially constructed or naturally occurring but obtained from an environment other than the host cell (endogeneus), the nucleic acid / polynucleotide is the nucleic acid / polynucleotide. Nucleotides are exogenous to the host cell. Thus, for example, when a nucleic acid / polynucleotide contains a cDNA, the nucleic acid / polynucleotide is usually exogenous to the host cell.
  • exogenous DNA When the exogenous nucleic acid / polynucleotide of the present disclosure contains DNA, it is particularly described as “exogenous DNA” (exogeneous DNA).
  • the exogenous DNA can also contain components other than DNA as long as it retains the required genetic information.
  • a DNA complexed with a component other than DNA such as a protein or a liposome that constitutes a virus particle is also an exogenous DNA.
  • the host cell is Chinese hamster (Chinese hamster; Pricetulus griseus, Japanese name is Cricetulus rat). Therefore, DNA containing base sequence information that is not normally contained in the genome can be referred to as "foreign DNA”.
  • the nucleotide sequence information of the Chinese hamster genome can be obtained, for example, as a reference sequence of GenBank. If the base sequence information of a certain DNA contains a base sequence that does not match even if it is partially in the reference sequence, it is known that the DNA is foreign.
  • exogenous DNA includes the genetic information of the Chinese hamster itself, but a part of which is rearranged into the genetic information or artificial information derived from other species. As described above, most of the exogenous DNA becomes exogenous by including artificially constructed base sequence information.
  • DNA eg, cDNA
  • DNA from which the introns contained in the genomic sequence have been removed from the Chinese hamster gene is also usually exogenous.
  • vector refers to a nucleic acid molecule to which it can augment another nucleic acid to which it is linked.
  • the term includes a vector as a self-replicating nucleic acid structure and a vector incorporated into the genome of the host cell into which it has been introduced. Certain vectors can result in the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as "expression vectors.”
  • host cell refers to any suitable cell that uses foreign nucleic acid-introduced cells, including progeny of such cells.
  • Host cells include “transformants” and “transformants”, including primary transformants and progeny derived from those cells regardless of the number of passages.
  • the progeny does not have to be exactly the same in the content of the parent cell and nucleic acid and may contain mutations. Mutant progeny with the same function or biological activity as those used when the original transformed cells were screened or selected are also included herein.
  • the present disclosure is, in one embodiment, a method of introducing an exogenous DNA encoding a polypeptide of interest into a CHO cell, wherein the exogenous DNA is introduced into the NCBI accession number NW_003614838 of the genome of the CHO cell.
  • a method including a step of site-specific introduction into the genomic region specified by .1.
  • CHO cells Choinese Hamster Ovaly Cell
  • Various polypeptides are produced by gene recombination using CHO cells as a host. For example, dhfr-CHO (Proc.
  • Etc. are widely used as host cells in gene recombination technology. Mutants of these CHO cells are also included in the CHO cells in the present disclosure.
  • CHO-DG44 and CHO-DXB11 strains are used as host cells as cells derived from CHO cells. Known cell lines derived from these CHO cells are also included in the CHO cells in the present disclosure.
  • the CHO cells constituting the present disclosure can be obtained as a cell bank such as ATCC or a commercially available commercially available cell line.
  • a CHO cell theoretically consists of a group of cells established from a single cell, it is particularly referred to as a "CHO cell line".
  • the "CHO cell” may be a CHO cell line unless otherwise specified.
  • the genomic region identified as a hotspot is identified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the CHO cell genome.
  • NW_003614838.1 is a genomic nucleotide sequence of CHO cells revealed by the whole genome shotgun sequence method (whole genome shotgun sequence), and consists of about 170.6 kbp. Therefore, in the present disclosure, the region into which the exogenous DNA is introduced may be any location within the approximately 170.6 kbp.
  • the base sequence as a preferable introduction position in the present disclosure, for example, a region specified by a sequence existing on the LOC103164262 (coiled-coil domain-containing protein 91; CCDC91) gene and its promoter can be mentioned.
  • the region comprises approximately 159.4 kbp containing the gene and its promoter region.
  • a base sequence of about 121.3 kbp in this region that does not contain the promoter is also preferable as the introduction position of the exogenous DNA.
  • a range of about 20 kbp including 10 kbp upstream and downstream of the first intron, or a range of about 10 kbp including 5 kbp upstream and downstream of the first intron refers to exogenous DNA in the present disclosure. It is preferable as an area to be introduced.
  • the nucleotide sequences of 5 kbp each upstream and downstream of the first intron are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. Therefore, the relationship between each sequence number and the introduction position can be shown as follows, for example. 5'-(SEQ ID NO: 1)-[Introduction position (ie hotspot)]-(SEQ ID NO: 2) -3'
  • the base sequence constituting the CCDC91 gene when the base sequence constituting the CCDC91 gene is mapped on the base sequence of the genome, it is located in the reverse complementary sequence (that is, the antisense sequence) when viewed from the genome sequence. Therefore, in the nucleotide sequence of the CCDC91 gene, the first intron contains the 5'end of SEQ ID NO: 2 (position 1-6454 in SEQ ID NO: 2) to the region containing the 3'end of SEQ ID NO: 1 (position 1-6454). SEQ ID NO: 3190-5040) in 1 is mapped. The nucleotide sequence of the first intron in which both are linked is shown in SEQ ID NO: 3. Therefore, in a preferred embodiment of the present disclosure, the site-specific introduction position of exogenous DNA can be selected from the region specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (reverse complementary sequence) on the CHO cell genome. it can.
  • the region specified by a certain base sequence includes the case where a plurality of base sequences are homologous. That is, even if the target base sequence X contains some mutations or modifications, if it is homologous to the base sequence A as a whole, it is a "region specified by the base sequence A".
  • multiple nucleotide sequences are homologous, they can usually be aligned. By aligning a different base sequence A and a base sequence X, a position corresponding to a specific position in the base sequence A can be specified on the base sequence X. Algorithms for aligning multiple base sequences are known. BLASTN, for example, is one of the common tools for sequencing base sequences.
  • the base sequences that can be regarded as homologous to NCBI accession number NW_003614838.1, the CCDC91 gene and its promoter, the first intron, etc. are referred to as "regions specified by each base sequence" in the present disclosure. It is nothing but.
  • CHO cells As described above, several cell lines with different properties such as drug resistance and auxotrophy are known for CHO cells. If these differences in properties are caused by mutations or alterations in the nucleotide sequence information of the genome, and even if they occur in the regions specified by the present disclosure, the regions can be identified. It is a region specified by each base sequence. Mutations and modifications of genomic sequence information include additions, deletions, insertions, and substitutions of nucleotide sequence information. Alternatively, changes in base sequence information (polymorphism, etc.) that are not accompanied by changes in apparent cellular traits can be tolerated. In addition, as long as the base sequence information is maintained, differences in epigenetic modification states between DNAs such as DNA methylation are allowed.
  • exogenous DNA can be site-specifically introduced into the above region by a known homologous recombination technique or genome editing technique.
  • Site-specific refers to selecting a position specified by a certain base sequence in the base sequence constituting the genome as a position for introducing the target DNA and introducing the target DNA at that place. Therefore, “site-specific” can also be referred to as "targeting".
  • introduction of nucleic acids / polynucleotides into the genome can be achieved by inserting DNA at the target site or replacing a portion of the genome with the DNA to be introduced.
  • Homologous recombination is a method that utilizes the DNA repair mechanism inherent in cells. Foreign DNA having a base sequence homologous to the target position on the genome is introduced into the cell to replace the DNA existing at the target position with the foreign DNA.
  • homologous recombination because it does not use a special enzyme which specifically recognizes a nucleotide sequence artificially, generally efficiency is very low (about 10 -5 to 10 7%).
  • RMCE is a method used in the examples of the present invention, and is a gene transfer method using a recombinant enzyme and its recognition base sequence.
  • a recombinant enzyme and its recognition base sequence By introducing the recognition base sequence of the recombinant enzyme into the target position on the genome in advance and introducing the exogenous DNA having the same recognition base sequence into the cell, the DNA existing at the target position is replaced with the foreign DNA. ..
  • Typical combinations of recombinant enzyme / recognition sequence are "Cre / loxP" and "FLP / FRT", but there are several others.
  • Gene editing is a gene transfer method that uses genome editing technology that can target and cleave a target position on the genome.
  • An enzyme designed to target a target position on the genome is introduced into a cell, and the target position is cleaved to promote DNA repair in the cell.
  • the exogenous DNA is easily linked to the cleavage site.
  • CRISPR / Cas, TALEN, and ZFN are typical enzymes used in genome editing technology.
  • CRISPR-Cas9 a typical genome editing tool, recognizes a base sequence complementary to a guide RNA and cleaves double-stranded DNA (that is, genomic DNA).
  • the exogenous DNA loaded in the vector can be introduced into the double-stranded DNA. Therefore, by utilizing the guide RNA corresponding to the base sequence of the introduction position, CRISPR-Cas9 can be used to introduce a position-specific foreign DNA.
  • the introduction site of exogenous DNA is specified by NCBI accession number NW_003614838.1. Furthermore, in identifying the introduction position, it has already been described that the introduction position can be identified from the base sequence homologous to the base sequence referred to in NCBI accession number NW_003614838.1.
  • the base sequence of the genome of the CHO cell in which DNA is planned to be introduced is determined in advance. Can be left. By considering not only the reference sequence but also the genomic base sequence of a specific CHO cell to be actually introduced into the guide RNA base sequence, a more specific base sequence design becomes possible.
  • the donor vector can include any element, such as a selectable marker, in addition to the exogenous DNA to be introduced.
  • Selectable markers include antibiotic resistance genes and metabolic selectable markers.
  • the expression levels of exogenous DNA in the resulting cell population can be compared, and transformed cells that exceed the desired expression level can be screened and cloned to incorporate the exogenous DNA into the hotspot identified in the present disclosure.
  • Transformed cells can also be established as cell lines.
  • the method for introducing exogenous DNA provided in the present disclosure is useful for producing CHO cells or CHO cell lines.
  • the present disclosure is a method for producing a CHO cell or a CHO cell line, in which the exogenous DNA encoding the polypeptide of interest is identified by NCBI accession number NW_003614838.1 in the genome of the CHO cell.
  • a method including a step of selectively introducing into.
  • the method of the present disclosure can further include a step of determining the expression level of the introduced foreign DNA and a step of comparing the determined expression level. After comparing the expression levels, more desirable transformed cells can be obtained by selecting and cloning the cells having the higher expression levels.
  • the expression level of exogenous DNA in all transformed cells is ranked, and transformed cells contained within, for example, the top 20%, or 10%, preferably 8%, more preferably 5% are selected as desirable transformed cells. be able to.
  • the expression level can be compared using the signal intensity as an index, and transformed cells can be screened.
  • Signal-producing polypeptides include green fluorescent protein (GFP) and its derivatives.
  • GFP green fluorescent protein
  • a selectable marker can be used as the exogenous DNA.
  • the CHO cell can be cultured under the culture conditions according to the marker, and the CHO cell in which the exogenous DNA is introduced into the hot spot identified by the present disclosure can be selected.
  • Nucleic acids / polynucleotides encoding selectable markers, signal-generating polypeptides, etc. that are integrated into the genome from the donor vector can also be linked to form a DNA cassette.
  • “Landing pad” is DNA containing the "DNA cassette” and is synonymous with “DNA cassette” in that foreign DNA is introduced into the genome.
  • the recognition sequence of the recombinant enzyme can be additionally added to the DNA cassette.
  • Cre recombinase and FLP recombinase are known as recombinant enzymes. These recombinant enzymes recognize their respective recognition sequences, loxP and FRT. Therefore, if these recognition sequences are added to both ends of the DNA cassette, the exogenous nucleic acid / polynucleotide introduced by the DNA cassette can be easily and selectively replaced with another DNA by a recombination reaction. Can be done. Recombining (replacement) foreign DNA once introduced into the genome with a different DNA cassette is called an exchange reaction.
  • the base sequence selectively recognized by the recombinant enzyme involved in the exchange reaction can be referred to as a recombination targeting sequence (recombination targeting sequence).
  • the transformed cells according to the present disclosure can express any polypeptide by substituting the exogenous DNA incorporated in the hotspot with DNA encoding any exogenous polypeptide. .. Then, in the transformed cells in which the DNA cassette is introduced into the hotspot and the exogenous DNA can be expressed at a high level, even after the exogenous DNA in the DNA cassette is replaced with another exogenous DNA, before the replacement. High expression levels equivalent to those of foreign DNA can be expected. That is, the transformed cell established according to the present disclosure is useful as a parent cell (Master cell) because it can be applied to the production of any polypeptide.
  • the present disclosure is a method for producing a CHO cell or a CHO cell line, in which a DNA cassette for introducing exogenous DNA by an exchange reaction is specified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the CHO cell.
  • a method including a step of introducing into a genomic region.
  • the present disclosure also relates to isolated CHO cells containing exogenous DNA introduced into the region identified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the genome.
  • the CHO cells of the present disclosure can include a recombinant target site for introducing arbitrary DNA into the exogenous DNA. That is, the present disclosure relates to isolated CHO cells containing a DNA cassette for introducing exogenous DNA by exchange reaction into the genomic region identified by NCBI accession number NW_003614838.1.
  • the integration of exogenous DNA into a specific region in the genome held by CHO cells means that the genomic DNA is amplified using the genomic DNA as a template, for example, with a primer containing a base sequence specific to the base sequence constituting the region. It can be confirmed by.
  • isolated refers to a cell or cell population isolated from at least some component of its natural environment, such as a substantially homogeneous cell population. “Substantially homogeneous” means that the frequency of the number of cells having the characteristics of the present disclosure in the cell population is 1/20 or more, preferably 1/10 or more, more preferably 1/5 or more, still more preferably 1 It means that it is / 3 or more, more preferably 1/2 or more, and most preferably 1/1.
  • a cell with the features of the present disclosure is usually defined by including exogenous DNA introduced into a region identified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the genome.
  • the exogenous DNA incorporated into the hotspot as a DNA cassette is then replaced by DNA encoding any polypeptide for the production of any polypeptide.
  • the polypeptide intended for production is optional.
  • various polypeptides conventionally produced by culturing CHO cells can be applied to the present disclosure. Therefore, the present disclosure provides, in some embodiments, a method for producing a polypeptide using CHO cells into which exogenous DNA encoding the polypeptide of interest has been introduced into the genomic region identified by NCBI accession number NW_003614838.1. To do.
  • the method for producing a polypeptide can preferably include the following steps; (1) A step of introducing an exogenous DNA encoding a target polypeptide into a CHO cell, wherein the exogenous DNA is sited in a genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the CHO cell genome. The process of introducing specifically; (2) A step of culturing CHO cells into which foreign DNA has been introduced in (1); and (3) a step of recovering the target polypeptide.
  • the step of site-specific introduction into the genomic region specified by NCBI accession number NW_003614838.1 of the genome of CHO cells is based on a nucleotide sequence-specific recombination reaction of the genome.
  • the base sequence-specific recombination reaction means, in a preferred embodiment, site-specific introduction of the foreign DNA of interest into a target site selected from the base sequence of the genome.
  • the introduction of site-specific exogenous DNA into the genome includes the insertion of the exogenous DNA into the genome.
  • the target DNA can be introduced at the target position.
  • the exogenous DNA once introduced site-specifically can be replaced with another DNA.
  • a cell into which a recombinant enzyme recognition sequence for substitution has been introduced into a hotspot is useful as a parent cell (master cell) in the present disclosure.
  • Transformed cells in which the parent cell (master cell) or the exogenous DNA in the genome is replaced with the exogenous DNA encoding the polypeptide intended for production analyzes the genome sequence as necessary. By collating with the original genome sequence, the integration position and direction of exogenous DNA can be confirmed. For example, when genomic DNA is amplified by PCR with a primer specific to the base sequence constituting the genomic region selected as the target (introduction position), the foreign nucleic acid / polynucleotide is selectively amplified and its presence is detected. Can be done. Alternatively, the nucleotide sequence of the amplification product can be determined to confirm the introduction of the foreign nucleic acid / polynucleotide of interest.
  • Transformed cells in which the parent cell (master cell) or the exogenous DNA in its genome is replaced with the exogenous DNA encoding the polypeptide intended for production are divided into small portions after expansion culture and frozen. Can be saved.
  • the expression level of exogenous DNA of transformed cells thawed after cryopreservation and its stability can be evaluated to further select transformed cells that are advantageous for production.
  • the transformed cells obtained according to the present disclosure can be adapted to the conditions for producing the polypeptide to obtain cells advantageous for production.
  • polypeptides examples include cytokines, peptide hormones, growth factors, their receptors, antigen-binding molecules and enzymes typified by antibodies, and the like. These polypeptides can be expressed by introducing polynucleotides encoding full-length or fragment into the genome, if desired. Alternatively, it can be fused with any polypeptide. It can also be partially modified or expressed as an artificially linked molecule of multiple fragments.
  • CHO cells into which foreign DNA encoding a target polypeptide has been introduced can be cultured under conditions suitable for CHO cells.
  • the conditions for culturing in a commercially available basal medium are widely known.
  • basal medium basic medium for culturing animal cells
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 medium, F12 medium and the like are known as culture solutions for animal cells.
  • Animal serum can be added to the medium, and serum-free culture can be adopted if possible.
  • the culture conditions for CHO cells are 1-, in an atmosphere where the CO 2 concentration in the gas phase is 0-40%, preferably 2-10%, at 30-39 ° C, preferably about 37 ° C. It is generally cultured for 14 days.
  • the culture can be continued for a longer period of time as long as the production of the target polypeptide continues.
  • a part or all of the medium can be replaced with a new medium as needed, and the medium can be recovered.
  • various culturing devices for culturing animal cells for example, fermenter tank culture.
  • Equipment, air lift type culture equipment, culture flask type culture equipment, spinner flask type culture equipment, microcarrier type culture equipment, fluidized layer type culture equipment, holofiber type culture equipment, roller bottle type culture equipment, filling tank type culture equipment, etc. Can be cultured using.
  • the polypeptide can be recovered by separating the culture supernatant.
  • the polypeptide can be purified to a substantially pure and homogeneous state. Isolation and purification of the polypeptide can be made by applying the isolation / purification methods used in conventional purification steps. For example, column chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected. , Combined and the antibody can be suitably separated and purified.
  • Chromatography includes affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like. These chromatographies are performed using liquid chromatography, such as HPLC and FPLC.
  • a polypeptide containing an Fc domain, such as an antibody can also be purified by affinity chromatography such as a protein A column or a protein G column. Examples of the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F.F. (manufactured by Pharmacia) and the like.
  • Landing pad plasmid A “Landing pad” containing a DNA cassette that functions as a target position for introducing a target gene during a cassette exchange reaction was prepared and incorporated into the plasmid (Fig. 1).
  • This Landing pad plasmid carries the green fluorescent protein (GFP) gene as a marker gene for identifying a gene-high expression region on the CHO cell genome. It also has the dihydrofolate reductase (DHFR) gene as a selection marker after introduction of the Landing pad plasmid.
  • GFP green fluorescent protein
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • DNA sequences (loxP1 and loxP2) recognized by the recombinant enzyme Cre are inserted at both ends of the two genes, the DHFR gene and the GFP gene.
  • DHFR gene and GFP gene existing between these two loxPs are removed during the cassette exchange reaction and replaced with the gene encoding the polypeptide to be produced loaded on the recombinant plasmid.
  • antibody production was attempted by substituting with an antibody gene.
  • Example 2 Preparation of recombinant plasmid A “recombinant plasmid” was prepared for cassette exchange reaction with the DNA cassette of the landing pad inserted on the CHO cell genome (Fig. 2).
  • the recombinant plasmid carries the DHFR gene and the antibody gene consisting of heavy and light chains, and loxP is inserted at both ends of these genes.
  • the evaluation antibody one kind of IgG1 antibody (mAb-A) and two kinds of IgG2 antibody (mAb-B, C) were used as the evaluation antibody. Each antibody recognizes a different antigen as follows.
  • mAb-A GYM329 / Anti latent myostatin antibody / IgG1
  • mAb-B CIM331 / Anti IL-31 receptor antibody / IgG2 (WO2010 / 064697)
  • mAb-C SA237 / Anti IL-6 receptor antibody / IgG2 (WO2016 / 027859)
  • a recombinant plasmid carrying an antibody gene consisting of one set of heavy and light chains is used, but in the case of a bispecific antibody, an antibody gene consisting of two sets of heavy and light chains is used.
  • the composition of the recombinant plasmid can be appropriately changed depending on the type of antibody to be expressed.
  • Example 3 Preparation of Targeted integration (TI) host cell Transfection of the Landing pad plasmid into the host cell (CHO-DXB11) was carried out using LONZA's Nucleofector 2b (Nucleofector is a registered trademark of Lonza Cologne GmbH). .. The Landing pad plasmid used for transfection was linearized with restriction enzymes EcoRV and SalI. Four hours after transfection, the cells were replaced with a hypoxanthine / thymidine-free medium, and shaking culture of cells was started. About two weeks later, single cell sorting was performed using Sony's cell sorter SH800. At the time of sorting, the cell population within the top 2% with high GFP fluorescence intensity was sorted.
  • a 488 nm semiconductor laser was used to excite GFP.
  • Single-cell sorted cells were expanded and cultured, and genomic DNA was extracted from each cell clone.
  • genomic DNA was extracted from each cell clone.
  • the number of copies of the GFP gene introduced into each cell clone was measured by Bio-Rad's QX200 Droplet Digital PCR system (Droplet Digital is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories, Inc.).
  • the copy number of the GFP gene was used as the copy number of the landing pad possessed by the cell, and cell clones into which 1 or 2 copies of the landing pad were introduced were selected.
  • Each obtained cell clone was used as a TI host cell candidate in subsequent experiments.
  • Example 4 Introduction and evaluation of antibody gene into TI host cell by cassette exchange reaction
  • the antibody gene was introduced and evaluated using the TI host cell candidate established in Example 3.
  • a recombinant plasmid carrying an mAb-A antibody gene (one copy each of H chain and L chain) and a Cre expression plasmid were co-introduced into each TI host cell, and a cassette exchange reaction was carried out.
  • the cassette exchange reaction the DNA cassette introduced into the TI host cell genome is replaced by the DNA cassette containing the mAb-A antibody gene.
  • Medium exchange was performed 4 hours after transfection, and about 2 weeks later, cells having no GFP fluorescence were fractionated to establish antibody-expressing cells derived from each TI host.
  • Example 5 Evaluation of long-term stability of production ability using antibody-expressing cells derived from TI host A recombinant plasmid carrying the mAb-A antibody gene (2 copies each of H chain and L chain) was newly prepared. A cassette exchange reaction was carried out on two types of TI host cells (TI-J and L) in the same manner as in Example 4. The obtained antibody-expressing cell clones were cryopreserved and subjected to long-term subculture for about 140 days after thawing. During this period, production cultures were carried out at intervals of about 30 days to evaluate changes in antibody-producing ability after cell thawing. As a result, TI-J and TI-L cell-derived antibody-expressing clones maintained high antibody-producing ability for a long period of 140 days, with mean values of about 2400 and 4200 mg / L for 140 days, respectively. (Fig. 4).
  • Example 6 Evaluation of production ability of TI host cells using different antibody genes A new recombinant plasmid carrying three antibody genes of mAb-A, B and C (two copies each of H chain and L chain) was newly prepared. A cassette exchange reaction was carried out in the same manner as in Example 4 for TI-L cells, which are the parent cells of the cell clones prepared and having the highest antibody-producing ability in the production culture. Then, cells having no GFP fluorescence were fractionated, and three types of antibody-expressing cells derived from the TI host were established. As a result of two weeks of production culture, the antibody-expressing cells derived from TI-L cells had high production ability even among the three antibodies having different mAbs-A, B and C (Fig. 5).
  • Genomic DNA was extracted from TI-L cells, which are parent cells of cell clones having the highest antibody-producing ability in production culture.
  • Whole-genome sequencing of TI host cells was performed using two next-generation sequencers, the Pacific Biosciences Pac Bio Sequel system and the Illumina HiSeq sequencing system.
  • Eight long reads with Landing pad DNA sequences were extracted from all read data obtained from the PacBio Sequel system and put into the CHO cell genome sequence (CHO-K1 [ATCC] _RefSeq_2014) on the public Nucleotide Database. I searched for Blast.
  • the genomic region with the highest homology was identified as the introduction site for the Landing pad plasmid, and the theoretical genomic structure of the introduction site containing the Landing pad was designed.
  • the Landing pad is the first intron of the CCDC91 (coiled-coil domain-containing protein 91) gene (Gene symbol: LOC103164262) on NW_003614838.1 registered in CHOK1 RefSeq scaffold (as of January 2019). SEQ ID NO: 3) It was inserted above (Fig. 6).
  • the hotspots provided by the present disclosure are useful for the production of transformed cells by TI for causing animal cells to produce exogenous DNA.
  • transformed cells useful for antibody production can be obtained with high probability.

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Abstract

本開示は、動物細胞のTIによる形質転換に有用なホットスポットを提供する。本開示のホットスポットは、ＣＨＯ細胞ゲノムの、LOC103164262付近に見出された。あるいは本開示は、当該ホットスポットに外来性ＤＮＡを導入した形質転換細胞と、その細胞を培養してＤＮＡによってコードされるポリペプチドを製造する方法に関する。

Description

標的特異的な外来遺伝子の導入方法
　本開示は、動物細胞のゲノムに、外来性ＤＮＡを標的特異的に導入する方法、それを利用して得られる形質転換細胞、ならびに外来性ＤＮＡがコードするポリペプチドの製造方法に関する。
　サイトカインや抗体のようなポリペプチドを、遺伝子組み換え技術によって培養細胞に発現させ、大量に生産する方法が公知である。このようなポリペプチドの生産技術は、一般に、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形で細胞に導入して形質転換細胞とし、その培養物に蓄積する目的のポリペプチドを回収する工程を含む。形質転換する細胞には、微生物、昆虫、植物、あるいは動物の細胞が広く利用されている。中でも動物細胞は、動物に由来するポリペプチドを得るために好適な宿主細胞として広く利用されている。動物細胞にポリペプチドを発現させることによって、ポリペプチドの糖化やホールディング等の翻訳後修飾が、実際の生体中で生産される環境に近くなると期待される。
　動物細胞に外来性のＤＮＡを発現させるときには、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターで動物細胞を形質転換するのが一般的である。しかし、発現ベクターとして細胞に導入された外来性のＤＮＡは、ゲノムに導入した場合とは異なり一般的には複製されず、細胞分裂を介して受け継がれないため、形質が安定に保持されにくい。そのため、発現ベクターによる形質転換は、実験的な環境で一過性の発現のために利用するのには有用だが、工業的な生産に応用するには課題を残す。
　外来性のＤＮＡを、動物細胞のゲノム中に導入することで、発現ベクター由来の形質を安定に保持させることが可能となる。ゲノムに導入したポリヌクレオチドは、細胞分裂を介して複製されて安定に保持される可能性が高いためである。このような考え方に基づいて、多くの生体物質が動物細胞をプラットフォームとして工業的な規模で安定に生産できるようになった。
　ところが、ゲノムへの外来性ＤＮＡの導入においても、必ずしも、発現レベルの高い形質転換細胞を得られるわけではないことがわかってきた。ゲノムに導入された外来性のＤＮＡは、導入された位置に依存して、発現レベルが異なるのが一般的で、所望の形質転換細胞を必ずしも効率的に選択できるわけではなかった。
　ゲノムへの外来性ＤＮＡの導入における問題点を解消し得る技術の一つとして、標的組込み（Ｔａｒｇｅｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；ＴＩ）が提案された（特許文献１－３）。ＴＩにおいては、外来性ＤＮＡの導入および発現に適したゲノム領域を予め同定しておき、発現させるべき外来性ＤＮＡが、同定したゲノム領域に部位特異的に組込まれる。TIは、ゲノムの部位特異的な組換え技術の向上に伴って生み出された新しい遺伝子組み換え技術と言える。TIの結果、得られる形質転換細胞の、外来性DNAの発現レベルなどの予測性が高まり、必要とする形質を備えた形質転換細胞の効率的な取得が期待できる。ＴＩにおいて、外来性ＤＮＡの導入に適したゲノム領域は、しばしばホットスポット（Ｈｏｔ Spot）と呼ばれる。これまでに、形質転換の宿主細胞として用いられている種々の細胞において、ゲノムの幅広い領域にホットスポットが見出されてきた。そして、TIを動物細胞によるモノクローナル抗体の産生に応用して、その生産に有用な形質転換細胞を得る試みも報告されている（特許文献４、非特許文献１－２）。
国際公開公報ＷＯ２００８／１５１２１９ 国際公開公報ＷＯ２０１３／１９００３２ 国際公開公報ＷＯ２０１６／０６４９９９ 国際公開公報ＷＯ２０１７／１８４８３１
Biotechnol. Prog., 2015, Vol. 31, No. 6, pp 1645-1656 Methods 95 (2016) pp 3-12
　本開示においては、標的組込み（ＴＩ）に有用な新たなホットスポットの提供を課題とする。
　本発明者らは、抗体などのポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを動物細胞において高いレベルで発現させることが可能な領域の探索を続けた。これまでに報告されたTIによる形質転換細胞の作製においては、初期の発現レベルを長期間にわたって維持することができず、培養中にやがて発現レベルが低下することがあった（PLoS ONE, 2017 12(6): e0179902、Biotechnology Letters, 2018, Volume 40, Issue 8, pp 1209-1218）。このような形質転換細胞をポリペプチドの製造に用いると、発現産物の生産量が不安定となり、製造効率を低下させかねない。あるいは、形質転換細胞が工業的な生産レベルを維持できなくなれば、製造ラインの再構築が必要となる。本発明者らは、培養中のポリペプチドの発現レベルの低下が、外来性ポリヌクレオチドのゲノム導入位置に依存して起きている可能性を疑った。そこで、外来性ＤＮＡの発現レベルの長期にわたる維持を期待できるホットスポットの探索を試みた結果、本発明者らは新規のホットスポット見出すことに成功し本開示に至った。
　本開示は、具体的には以下に例示的に記載する態様を包含する。
〔１〕目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する方法であって、該方法が、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程を含む方法。
〔２〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記外来性DNAを、相同組換え、組換え酵素を媒介した遺伝子置換（RMCE）、およびゲノム編集から選択されるいずれかの手法によって、前記ゲノム領域に部位特異的に導入する〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記目的とするポリペプチドが、抗原結合分子である〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記抗原結合分子が抗体である〔６〕に記載の方法。
〔８〕ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株の製造方法であって、該方法が、目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAを、ＣＨＯ細胞のNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程を含む方法。
〔９〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記外来性DNAを、相同組換え、組換え酵素を媒介した遺伝子置換（RMCE）、およびゲノム編集から選択されるいずれかの手法によって、前記ゲノム領域に部位特異的に導入する〔８〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記目的とするポリペプチドが、抗原結合分子である〔８〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記抗原結合分子が抗体である〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株の製造方法であって、該方法が、外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットを、ＣＨＯ細胞のNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程を含む方法。
〔１６〕前記DNAカセットの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記外来性DNAが、目的とする抗原結合分子をコードする外来性DNAである〔１５〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記抗原結合分子が抗体である〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入された目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAを含む、単離されたCHO細胞。
〔２２〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔２１〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔２３〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔２２〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔２４〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔２３〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔２５〕前記外来性DNAを、相同組換え、組換え酵素を媒介した遺伝子置換（RMCE）、およびゲノム編集から選択されるいずれかの手法によって、前記ゲノム領域に部位特異的に導入する〔２１〕～〔２４〕のいずれかに記載のCHO細胞。
〔２６〕前記目的とするポリペプチドが、抗原結合分子である〔２１〕～〔２５〕のいずれかに記載のCHO細胞。
〔２７〕前記抗原結合分子が抗体である〔２６〕に記載のCHO細胞。
〔２８〕NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に、外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットを含む、単離されたCHO細胞。
〔２９〕前記DNAカセットの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔２８〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔３０〕前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔２９〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔３１〕前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔３０〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔３２〕前記外来性DNAが、目的とする抗原結合分子をコードする外来性DNAである〔２８〕～〔３１〕のいずれかに記載のCHO細胞。
〔３３〕前記抗原結合分子が抗体である〔３２〕に記載のCHO細胞。
〔３４〕NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAを導入したCHO細胞を用いた、ポリペプチドの製造方法。
〔３５〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記外来性DNAを、相同組換え、組換え酵素を媒介した遺伝子置換（RMCE）、およびゲノム編集から選択されるいずれかの手法によって、前記ゲノム領域に部位特異的に導入する〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕前記目的とするポリペプチドが、抗原結合分子である〔３４〕～〔３８〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕前記抗原結合分子が抗体である〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕以下の工程を含むポリペプチドの製造方法；
（１）目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する工程であって、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程；
（2）外来性DNAの導入されたCHO細胞を培養する工程；および
（3）目的とするポリペプチドを回収する工程。
〔４２〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される〔４２〕に記載の方法。
〔４４〕前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である〔４３〕に記載の方法。
〔４５〕目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する工程が、次の工程(i)-(ii)を含む〔４１〕に記載の方法；
（ｉ）外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットをＣＨＯ細胞に導入する工程、および
（ｉｉ）(i)のDNAカセットを標的部位として認識する組み換え酵素によって、外来性ＤＮＡを、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程。
〔４６〕前記目的とするポリペプチドが抗原結合分子である〔４１〕～〔４５〕のいずれかに記載の方法。
〔４７〕前記抗原結合分子が抗体である〔４６〕に記載の方法。
　本開示によって、TIによって形質転換された動物細胞の取得に好適なホットスポットが見出された。好ましい態様において、本開示が提供するホットスポットは、その領域に導入された外来性ＤＮＡがコードするポリペプチドの発現レベルを、長期にわたって安定に維持することができる。
図１は、ホットスポットの探索に利用したランディングパット（ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）のマップを示す。形質転換細胞の選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）と、高発現細胞をスクリーニングするためのマーカーとなる緑色蛍光タンパク（ＧＦＲ）をコードする遺伝子が組み込まれている。これら2つの遺伝子の両端には、組換え酵素Ｃｒｅの認識配列（ｌｏｘＰ１とｌｏｘＰ２）が挿入されてＤＮＡカセットを構成している。 図２は、ゲノムに組み込まれたランディングパットのＤＮＡカセットとカセット交換反応するための組換えプラスミド（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ）のマップを示す。選択マーカーＤＨＦＲと、軽鎖（Ｌ）と重鎖（Ｈ）をコードする各遺伝子の両端に組換え酵素認識配列ｌｏｘＰが配置され、ＤＮＡカセットを構成している。 図３は、ＴＩの後に樹立された抗体発現細胞クローンの、２週間の生産培養の結果を示す。横軸は樹立された抗体産生細胞クローンの名称、縦軸は培養液１リットル当たりの抗体生産レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図４は、抗体産生細胞クローンＴＩ－ＬおよびＴＩ－Ｊの、凍結溶解後の抗体生産量の経時的な変化を示す。横軸は凍結保存細胞の溶解後の時間（日）、縦軸は培養液１リットル当たりの抗体生産レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図５は、図２の組換えプラスミドに異なる抗体の遺伝子を組込んで作成した別の抗体産生細胞クローンによる抗体生産レベルを示す。横軸は生産させた抗体の名称、縦軸は培養液１リットル当たりの抗体生産レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図６は、最も抗体生産レベルが高かった抗体産生細胞クローンの親細胞TI-L（ランディングパットを交換カセットで置換する前の形質転換細胞）のゲノム上におけるランディングパットの導入位置を模式的に示す。図中、「Integration site」で示した部分が、本開示において同定されたランディングパットの導入位置である。導入位置は、CCDC91遺伝子の（５’端）から6651 bp下流で、Intron1の上流（５’端）からは6454 bp下流に位置する。「Integration site」の上流（ゲノム配列における５’側）の５ｋｂと、下流（ゲノム配列における３’側）の５ｋｂの塩基配列をそれぞれ、配列番号：１および２に示した。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
　以下の定義および詳細な説明は、本明細書において説明する本開示の理解を容易にするために提供される。
　本明細書において、「抗原結合分子」は目的とする抗原に結合することのみで制限される。抗原結合分子は、目的とする抗原に結合するかぎりどのような構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、それだけに限定するものではないが、例えば、抗体の重鎖可変領域（VH）および抗体の軽鎖可変領域（VL）、単ドメイン抗体（sdAb）、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール（国際公開WO2004/044011、WO2005/040229）、細胞膜に発現する糖たんぱく質であるfibronectin中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin（国際公開WO2002/032925）、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束（bundle）を構成するIgG結合ドメインをscaffoldとするAffibody（国際公開WO1995/001937）、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復（ankyrin repeat：AR）の分子表面に露出する領域であるDARPins（Designed Ankyrin Repeat proteins）（国際公開WO2002/020565）、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等（国際公開WO2003/029462）、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体（variable lymphocyte receptor（VLR））のロイシン残基に富んだリピート（leucine-rich-repeat（LRR））モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域（国際公開WO2008/016854）が挙げられる。
　本発明の抗原結合分子の好適な例として、当該抗原結合ドメインのみで構成される分子で抗原結合機能を発揮出来る抗原結合分子、連結されている他のペプチドから遊離した後に単独で抗原結合機能を発揮できる抗原結合分子等が挙げられる。そのような抗原結合分子の例として、それだけに限定されないが、単ドメイン抗体、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2等が挙げられる。
　本発明の抗原結合分子の好適な例の一つとして、分子量60kDa以下の抗原結合分子が挙げられる。そのような抗原結合分子の例として、それだけに限定されないが、単ドメイン抗体、scFv、Fab、Fab'が挙げられる。分子量が60kDa以下である抗原結合分子は通常、単量体として血中に存在する時、腎臓によるクリアランスが発生する可能性が高い（J Biol Chem. 1988 Oct 15;263(29):15064-70参照）。
抗体
　本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
抗体断片
　「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。以上のように、抗体や抗体断片は、抗原結合分子の代表的な例である。
Fc領域
　本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
核酸／ポリヌクレオチド
　「単離された」核酸は／ポリヌクレオチド、そのもともとの環境の成分から分離された核酸／ポリヌクレオチド分子のことをいう。単離された核酸／ポリヌクレオチドは、その核酸／ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸／ポリヌクレオチド分子を含むが、その核酸／ポリヌクレオチドは染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。本開示において、核酸／ポリヌクレオチドが、人工的に構築されたものや、あるいは天然に存在したものであっても、宿主細胞（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）以外の環境から得たものである場合、その核酸／ポリヌクレオチドは、当該宿主細胞にとって、外来性である。したがって、たとえば、核酸／ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡを含む場合、当該核酸／ポリヌクレオチドは、通常、宿主細胞にとっては外来性である。
　本開示の外来性核酸／ポリヌクレオチドが、DNAを含む場合、特に「外来性ＤＮＡ」（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ＤＮＡ）と記載する。外来性ＤＮＡは、必要とされる遺伝情報を保持している限り、ＤＮＡ以外の成分を含むこともできる。たとえば、ウイルス粒子を構成するタンパク質やリポソーム等のＤＮＡ以外の成分と複合化したＤＮＡも、外来性ＤＮＡである。本開示においては、宿主細胞はＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｎｓｔｅｒ（チャイニーズハムスター；Cricetulus griseus、和名はモンゴルキヌネズミ）である。したがって、そのゲノムに通常は含まれていない塩基配列情報を含むＤＮＡを「外来性ＤＮＡ」ということができる。
　チャイニーズハムスターのゲノムの塩基配列情報は、たとえばGenBankの参照配列（Reference Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として得ることができる。あるＤＮＡの塩基配列情報が、当該参照配列に部分的にであれ、一致しない塩基配列を含んでいれば、外来性ＤＮＡであることがわかる。たとえば、チャイニーズハムスター自身の遺伝情報を含みながら、その一部を他の生物種由来の遺伝情報や人為的な情報に組み替えたものは、外来性ＤＮＡに含まれる。このように、外来性ＤＮＡの多くは、人為的に構築された塩基配列情報を含むことによって、外来性となる。あるＤＮＡがアミノ酸配列をコードしているとき、ＤＮＡの塩基配列の変更後に元のアミノ酸配列情報が維持される場合も、人為的に構築されたＤＮＡである。あるいはチャイニーズハムスターの遺伝子から、ゲノム配列には含まれているイントロンが除去されたＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）も、通常は外来性である。
ベクター
　本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組込まれるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
宿主細胞
　用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
　本開示は、ある態様において、目的とするポリペプチドをコードする外来性のＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入する方法であって、該方法が、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に部位特異的に導入する工程を含む方法を提供する。
　ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌ）は、チャイニーズハムスターの卵巣から樹立された繊維芽細胞株の総称である。増殖能力に優れ、接着培養や浮遊培養によって人工的な培地中で培養することができる。ＣＨＯ細胞を宿主として、種々のポリペプチドが遺伝子組換えによって製造されている。たとえば、DHFR遺伝子を欠損したdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）や、CHO-K1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）等は、遺伝子組換え技術において、宿主細胞として広く利用されている。これらのＣＨＯ細胞の変異株も、本開示においてはＣＨＯ細胞に含まれる。その他にも、ＣＨＯ細胞に由来する細胞として、CHO-DG44やCHO-DXB11株が、宿主細胞として用いられている。これらＣＨＯ細胞に由来する公知の細胞株も、本開示においてはＣＨＯ細胞に含まれる。
　本開示を構成するCHO細胞は、ＡＴＣＣ等の細胞バンクや、商業的に流通している市販の細胞株として入手することができる。CHO細胞が、理論上、単一の細胞から樹立された細胞群からなる場合、特に「CHO細胞株」という。本開示においては、特に断りがなければ、「CHO細胞」は、CHO細胞株であってもよい。
　本開示において、ホットスポットとして同定されたゲノム領域は、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定される。NW_003614838.1は、ホールゲノムショットガンシーケンス法（whole genome shotgun sequence）によって明らかにされたＣＨＯ細胞のゲノム塩基配列で、約１７０．６ｋｂｐからなっている。したがって、本開示において、外来性のＤＮＡを導入する領域は、当該約１７０．６ｋｂｐ内の任意の場所であって良い。
　当該塩基配列中、本開示において、好ましい導入位置として、たとえば、ＬＯＣ１０３１６４２６２（coiled-coil domain-containing protein 91；ＣＣＤＣ９１）遺伝子とそのプロモーター上に存在する配列によって特定される領域を挙げることができる。ある態様において、この領域は、当該遺伝子とそのプロモーター領域を含む約１５９．４ｋｂｐからなる。あるいは別の態様において、この領域の、当該プロモーターを含まない約１２１．３ｋｂｐの塩基配列も、外来性のＤＮＡの導入位置として好ましい。たとえば、ＣＣＤＣ９１遺伝子を構成する塩基配列中、第１イントロンの上下流１０ｋｂｐを含む約２０ｋｂｐの範囲、あるいは、第１イントロンの上下流５ｋｂｐを含む約１０ｋｂｐの範囲は、本開示において外来性のＤＮＡを導入する領域として好ましい。その例として、第１イントロンの上下流各５ｋｂｐの塩基配列をそれぞれ配列番号：１および２に示す。したがって各配列番号と導入位置の関係は、たとえば次のように示すことができる。
５’－（配列番号：１）－［導入位置（すなわちホットスポット）］－（配列番号：２）－３’
　ここで、ゲノムの塩基配列上にＣＣＤＣ９１遺伝子を構成する塩基配列をマッピングすると、ゲノム配列から見て逆向き相補配列（すなわちアンチセンス配列）に位置している。そのため、ＣＣＤＣ９１遺伝子の塩基配列中、第１イントロンは、配列番号：２の５’末端を含む（配列番号：２中の１－６４５４位）から配列番号：１の３’、末端を含む領域（配列番号：１中の３１９０－５０４０）にかけて、マッピングされる。両者を連結した第１イントロンの塩基配列を配列番号：３に示した。したがって、本開示の好ましい態様において、外来性のＤＮＡの部位特異的な導入位置は、ＣＨＯ細胞ゲノム上の配列番号：３の塩基配列（逆向き相補配列）で特定される領域から選択することができる。　
　本開示において、ある塩基配列によって特定される領域は、複数の塩基配列が相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である場合を含む。つまり、対象となる塩基配列Ｘが、いくつかの変異や改変を含んでいても、全体として塩基配列Ａと相同であれば、「塩基配列Ａによって特定される領域」である。複数の塩基配列が相同である場合、通常、それらは整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）させることができる。異なる塩基配列Ａと塩基配列Ｘを整列させることによって、塩基配列Ａの中の特定の位置に対応する位置を塩基配列Ｘ上で特定することができる。複数の塩基配列を整列させるためのアルゴリズムは公知である。たとえばＢＬＡＳＴＮは、塩基配列の整列のための一般的なツールの一つである。これらの公知のアルゴリズムに従って、NCBI accession number NW_003614838.1や、ＣＣＤＣ９１遺伝子とそのプロモーター、あるいは第1イントロン等と相同とみなしうる塩基配列は、本開示においては、「各塩基配列によって特定される領域」に他ならない。
　先に記載したようにＣＨＯ細胞には、薬剤耐性や栄養要求性等の性状が異なるいくつかの細胞株が知られている。これらの性状の相違がゲノムの塩基配列情報の変異や改変としてもたらされていて、それが、本開示によって特定された領域に生じていても、領域を特定することができるのであれば、「各塩基配列によって特定される領域」である。ゲノム塩基配列情報の変異や改変には、塩基配列情報の付加、欠失、挿入、および置換が含まれる。あるいは、見かけ上の細胞形質の変化を伴わない、塩基配列情報の変化（多型等）も許容しうる。また、塩基配列情報が維持される限り、ＤＮＡのメチル化等のＤＮＡ間のエピジェネティックな修飾状態の違いも許容される。
　本開示において、外来性ＤＮＡは、公知の相同組換え技術やゲノム編集技術によって上記の領域に部位特異的に導入することができる。部位特異的とは、ゲノムを構成する塩基配列中の、ある塩基配列で特定される位置を導入するための位置として選択し、その場所を標的として目的のＤＮＡを導入することをいう。したがって「部位特異的」は、「標的化」（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）と言うこともできる。本開示において、核酸／ポリヌクレオチドのゲノムへの導入は、標的部位にＤＮＡを挿入するか、あるいはゲノムの一部を導入すべきＤＮＡで置換することによって達成することができる。
　TIによる外来性ＤＮＡの組込みに用いられる手法としては、例えば、次のような方法が知られている；
　Homologous recombination（相同組換え）、
　RMCE (recombinase-mediated cassette exchange)（組換え酵素を媒介した遺伝子置換）および
　Gene editing（ゲノム編集）
　Homologous recombination（相同組み換え）は、細胞が本来持つDNA修復機構を利用した手法である。ゲノム上の標的位置と相同な塩基配列をもつ外来性DNAを細胞に導入して、標的位置に存在するDNAと外来性DNAを置換する。相同組み換えにおいては、塩基配列を特異的に認識する特別な酵素を人工的に利用しないため、一般的に効率は非常に低い（約10-5 ～ 10-7 %）。
　RMCEは本発明の実施例で用いた手法であり、組換え酵素とその認識塩基配列を利用した遺伝子導入方法である。ゲノム上の標的位置にあらかじめ組換え酵素の認識塩基配列を導入しておき、同じく認識塩基配列をもつ外来性DNAを細胞に導入することで、標的位置に存在するDNAと外来性DNAを置換する。組換え酵素 /認識配列の組合せは「Cre / loxP」,「FLP / FRT」が代表的であるが、他にもいくつか存在する。
　Gene editing（ゲノム編集）はゲノム上の標的位置を狙って切断できるゲノム編集技術を利用した遺伝子導入方法である。ゲノム上の標的位置を狙うようにデザインした酵素を細胞に導入し、標的位置を切断することで細胞のDNA修復を促す。この時、酵素とともに外来性DNAを導入することで外来性DNAが切断部位へ連結されやすくなる。ゲノム編集技術に用いられる酵素としては、CRISPR/Cas, TALEN, ZFNが代表的である。たとえば、代表的なゲノム編集ツールであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと相補的な塩基配列を認識して２本鎖ＤＮＡ（すなわちゲノムＤＮＡ）を切断する。切断された２本鎖ＤＮＡが修復される過程で、ドナーベクターを共導入しておけば、ベクターに搭載した外来性ＤＮＡを２本鎖ＤＮＡに導入することができる。
　したがって、上記の導入位置の塩基配列に応じたガイドＲＮＡを利用することによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を利用して、位置特異的に外来性のＤＮＡを導入することができる。
　さて、本開示において、外来性ＤＮＡの導入部位は、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定される。更に導入位置の特定にあたり、NCBI accession number NW_003614838.1で参照される塩基配列に対して、相同な塩基配列の中から導入位置を同定できることも既に述べたとおりである。ここで、前記の相同な塩基配列に対して、外来性ＤＮＡを導入するためのガイドＲＮＡをデザインしようとするときには、あらかじめＤＮＡの導入を予定しているＣＨＯ細胞のゲノムの塩基配列を決定しておくことができる。ガイドＲＮＡの塩基配列を、参照配列のみならず、実際に導入を予定している特定のＣＨＯ細胞のゲノム塩基配列を考慮することによって、より特異的な塩基配列のデザインが可能となる。
　本開示のある態様において、ドナーベクターは導入すべき外来性ＤＮＡに加えて選択マーカー等の任意の要素を含むことができる。選択マーカーには、抗生物質耐性遺伝子や代謝選択マーカーが含まれる。ゲノム編集後のCHO細胞を、選択マーカーに応じた培養条件に置くことにより、ドナーベクターに搭載した外来性ＤＮＡが発現可能な状態でゲノムに導入された細胞を選択的に維持増殖させることができる。以上のような工程を経て選択的に維持された細胞群は、ＣＨＯ細胞のゲノムの同じ位置に共通の外来性ＤＮＡが導入された細胞群を構成する。あるいは、得られる細胞群の外来性ＤＮＡの発現レベルを比較し、目的とする発現レベルを越える形質転換細胞をスクリーニングしてクローニングすれば、外来性ＤＮＡを本開示において同定されたホットスポットに組込まれた形質転換細胞を細胞株として樹立することもできる。本開示が提供する外来性ＤＮＡの導入方法は、ＣＨＯ細胞あるいはＣＨＯ細胞株の製造に有用である。
　すなわち本開示は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株の製造方法であって、該方法が、目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定される領域に選択的に導入する工程を含む方法を提供する。本開示の方法は、さらに付加的に、導入された外来性DNAの発現レベルを決定する工程と、決定した発現レベルを比較する工程を含むことができる。発現レベルの比較の後、発現レベルの高かった細胞を選択してクローニングすることによって、より望ましい形質転換細胞を取得することができる。全ての形質転換細胞における外来性ＤＮＡの発現レベルをランキングし、たとえば上位２０％、あるいは１０％、好ましくは８％、より好ましくは５％以内に含まれる形質転換細胞を望ましい形質転換細胞として選択することができる。
　外来性ＤＮＡとしてシグナルを生成するポリペプチドをコードするＤＮＡを利用した場合、シグナル強度を指標としてその発現レベルを比較し、形質転換細胞をスクリーニングすることができる。シグナルを生成するポリペプチドには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やその誘導体が含まれる。あるいは、外来性ＤＮＡとして、選択マーカーを利用することもできる。選択マーカーを利用した場合には、マーカーに応じた培養条件でＣＨＯ細胞を培養して、本開示によって同定されたホットスポットに外来性ＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞を選択することもできる。ドナーベクターからゲノムに組み込まれる選択マーカーやシグナル生成ポリペプチド等をコードする核酸／ポリヌクレオチドは連結して、ＤＮＡカセットを構成することもできる。
　本開示において、「Ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ」とは前記「ＤＮＡカセット」を含むＤＮＡで、ゲノムに外来性ＤＮＡを導入する点で「ＤＮＡカセット」とは同義である。
　本開示にしたがってゲノムのホットスポットにドナーベクターのＤＮＡカセットを導入するとき、ＤＮＡカセットには、更に付加的に、組み換え酵素の認識配列を付加することができる。組換え酵素としてはＣｒｅリコンビナーゼやＦＬＰリコンビナーゼが知られている。これらの組換え酵素は、それぞれの認識配列であるｌｏｘＰやＦＲＴを認識する。したがって、ＤＮＡカセットの両端にこれらの認識配列を付加しておけば、ＤＮＡカセットによって導入された外来性核酸／ポリヌクレオチドを、組換え反応によって容易に、かつ選択的に他のＤＮＡに置換することができる。いったんゲノムに導入された外来性ＤＮＡを、異なるＤＮＡカセットと組み替える(置換する)ことを、交換反応という。そして、交換反応に携わる組み換え酵素が選択的に認識する塩基配列は、組み換え組み換え標的配列（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）ということができる。
　いったん樹立された本開示に基づく形質転換細胞は、ホットスポットに組込んだ外来性ＤＮＡを、任意の外来性ポリペプチドをコードするＤＮＡに置換することによって、任意のポリペプチドの発現が可能となる。そして、ＤＮＡカセットがホットスポットに導入され、かつ外来性ＤＮＡを高いレベルで発現することができる形質転換細胞においては、ＤＮＡカセットの外来性ＤＮＡを他の外来性ＤＮＡに置換した後も、置換前の外来性ＤＮＡと同等の高い発現レベルが期待できる。つまり、本開示に従って樹立された形質転換細胞は、任意のポリペプチドの生産に応用することができるので、親細胞（Ｍａｓｔｅｒ ｃｅｌｌ；マスターセル）として有用である。すなわち本開示は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株の製造方法であって、該方法が、外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットを、ＣＨＯ細胞のNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程を含む方法を提供する。
　また本開示は、ゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定される領域に導入された外来性DNAを含む、単離されたCHO細胞に関する。本開示のＣＨＯ細胞は、好ましい態様において、外来性DNAが、任意のDNAを導入するための組換え標的部位を含むことができる。すなわち本開示は、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に、外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットを含む、単離されたCHO細胞に関する。ＣＨＯ細胞が保持しているゲノム中の特定の領域に外来性DNAが組み込まれていることは、たとえば当該領域を構成する塩基配列に特異的な塩基配列を含むプライマーでゲノムDNAを鋳型として増幅することにより確認することができる。増幅の結果、目的とする長さの塩基配列長を持つ産物が確認できれば、CHO細胞が、目的としている領域に外来性ＤＮＡが組み込まれたものであることを知ることができる。
　本開示において、「単離された」は、その自然環境の少なくともいくつかの成分から分離された細胞または細胞集団、例えば実質的に均質な細胞集団をいう。「実質的に均質」とは、細胞集団に占める本開示の特徴を備えた細胞数の頻度が、1/20以上、好ましくは1/10以上、より好ましくは1/5以上、さらに好ましくは1/3以上、さらに好ましくは1/2以上、最も好ましくは1/1であることをいう。ここで、本開示の特徴を備えた細胞とは、通常、ゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定される領域に導入された外来性DNAを含むことによって定義される。
　ＤＮＡカセットとしてホットスポットに組込まれた外来性ＤＮＡは、その後、任意のポリペプチドの生産のために、任意のポリペプチドをコードするＤＮＡによって置換する。本開示において、生産を目的とするポリペプチドは任意である。たとえば、従来ＣＨＯ細胞の培養によって生産していた種々のポリペプチドを、本開示に応用することができる。したがって、本開示は、ある態様において、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAを導入したCHO細胞を用いた、ポリペプチドの製造方法を提供する。本開示において、ポリペプチドの製造方法は、好ましくは次の工程を含むことができる；
（１）目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する工程であって、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に部位特異的に導入する工程；
（２）（１）で外来性DNAを導入したCHO細胞を培養する工程；および
（３）目的とするポリペプチドを回収する工程。
　本開示において、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に部位特異的に導入する工程は、ゲノムの塩基配列特異的な組み換え反応に基づいている。塩基配列特異的な組み換え反応は、好ましい態様において、ゲノムの塩基配列から選択した標的部位に目的とする外来性ＤＮＡを部位特異的に導入することを意味する。本開示において、ゲノムへの部位特異的な外来性ＤＮＡの導入とは、外来性ＤＮＡのゲノム中への挿入を含む。あるいは、ゲノムを構成する塩基配列の一部を、外来性ＤＮＡで置換することで、目的とするＤＮＡを目的とする位置に導入することもできる。
　本開示においては、いったん部位特異的に導入した外来性ＤＮＡを、更に別のＤＮＡと置換することもできる。置換用の組み換え酵素認識配列がホットスポットに導入された細胞は、本開示における親細胞（マスターセル）として有用である。
　親細胞（マスターセル）、あるいはそのゲノム中の外来性ＤＮＡを、生産を目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAに置き換えた形質転換細胞は、必要に応じて、ゲノムの塩基配列を解析し、もとのゲノム配列との照合によって、外来性DNAの組込み位置や方向を確認することができる。たとえば、標的（導入位置）として選択したゲノム領域を構成する塩基配列に特異的なプライマーによってゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅すると、外来性核酸／ポリヌクレオチドを選択的に増幅し、その存在を検出することができる。あるいは、増幅産物の塩基配列を決定して、目的とする外来性核酸／ポリヌクレオチドの導入を確認することもできる。
　親細胞（マスターセル）、あるいはそのゲノム中の外来性ＤＮＡを、生産を目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAに置き換えた形質転換細胞は、拡大培養の後に小分けして分注し、凍結保存しておくことができる。また、凍結保存後に融解した形質転換細胞の外来性ＤＮＡの発現レベルや、その安定性を評価して、製造に有利な形質転換細胞を更に選択することもできる。あるいは本開示に従って得られた形質転換細胞を、ポリペプチドの製造条件に順化（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）させて、製造に有利な細胞を得ることもできる。
　本開示に基づく製造方法に応用することができるポリペプチドの例として、サイトカイン、ペプチドホルモン、成長因子、それらの受容体、抗体に代表される抗原結合分子や酵素などを挙げることができる。これらのポリペプチドは、必要に応じて、全長や断片をコードするポリヌクレオチドをゲノムに導入して発現させることができる。あるいは、任意のポリペプチドと融合させることもできる。部分的な改変や、複数の断片を人為的に結合させた分子として発現させることもできる。
　目的とするポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ細胞に好適な条件で培養することができる。たとえば、市販の基礎培地（動物細胞培養用基礎培地）で培養するための条件が広く知られている。たとえば、動物細胞の培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM、Ｆ１０培地、Ｆ１２培地などが公知である。培地には動物血清を加えることもできるし、可能な場合には無血清培養を採用することもできる。ＣＨＯ細胞の培養条件は、具体的には、気相のＣＯ２濃度が０－４０％、好ましくは、２－１０％の雰囲気下、３０－３９℃、好ましくは、３７℃程度で、１－１４日間培養するのが一般的である。あるいは目的とするポリペプチドの産生が継続している限り、さらに長期にわたり培養を継続することもできる。培養期間中には、必要に応じて培地の一部、あるいは全量を新しい培地に置換し培地を回収することができる
　また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いて培養することができる。
　目的とするポリペプチドが培養物中に分泌されておれば、培養上清を分取することによってポリペプチドを回収することができる。ポリペプチドは、実質的に純粋で均一な状態に精製することができる。ポリペプチドの単離および精製は、通常の精製工程に使用されている単離／精製方法を応用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、および再結晶等が適宜選択、組み合わされて抗体が好適に分離、および精製され得る。クロマトグラフィーとしては、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー、例えばHPLCおよびFPLCを用いて行われる。抗体のようなＦｃドメインを含むポリペプチドは、プロテインAカラムやプロテインGカラム等の親和性クロマトグラフィーにより精製することもできる。プロテインAカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F. F.（Pharmacia製）等が挙げられる。
　以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
〔実施例１〕Landing padプラスミドの作製
　カセット交換反応時に目的遺伝子を導入するための標的位置として機能するDNAカセットを含む「Landing pad」を作成し、プラスミドに組込みんだ（図１）。このLanding padプラスミドには、CHO細胞ゲノム上の遺伝子高発現領域を特定するためのマーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク(GFP)遺伝子が搭載されている。また、Landing padプラスミド導入後の選抜マーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子を有する。DHFR遺伝子およびGFP遺伝子の2遺伝子の両端には組換え酵素Creによって認識されるDNA配列(loxP1およびloxP2)が挿入されている。この2種のloxP間に存在するDHFR遺伝子およびGFP遺伝子はカセット交換反応時に除去され、組換えプラスミドに搭載された製造すべきポリペプチドをコードする遺伝子に置換される。以下の実施例においては、抗体遺伝子に置換して、抗体の生産を試みた。
〔実施例２〕組換えプラスミドの作製
　CHO細胞ゲノム上に挿入されたLanding padのＤＮＡカセットとカセット交換反応させるための「組換えプラスミド」を作成した（図２）。組換えプラスミドにはDHFR遺伝子、重鎖・軽鎖からなる抗体遺伝子が搭載されており、これらの両端にはloxPが挿入されている。また、評価抗体としては1種類のIgG1抗体(mAb-A)および2種類のIgG2抗体(mAb-B, C)を用いた。各抗体は次のようにそれぞれ異なる抗原を認識する。
mAb-A : GYM329 / Anti latent myostatin antibody / IgG1
mAb-B : CIM331 / Anti IL-31 receptor antibody / IgG2 (WO2010/064697)
mAb-C : SA237 / Anti IL-6 receptor antibody / IgG2 (WO2016/027859)
　尚、図2は１組の重鎖・軽鎖からなる抗体遺伝子を搭載した組換えプラスミドを用いているが、二重特異性抗体の場合には２組の重鎖・軽鎖からなる抗体遺伝子を搭載するなど、組換えプラスミドの構成は、発現させる抗体の種類により適宜変更することができる。
〔実施例３〕Targeted integration(TI)宿主細胞の作製
　宿主細胞（CHO-DXB11）へのLanding padプラスミドのトランスフェクションはLONZA社のNucleofector 2b（Nucleofector はLonza Cologne GmbHの登録商標）を用いて実施した。トランスフェクション時に使用するLanding padプラスミドは制限酵素EcoRVおよびSalIによって直鎖化したものを使用した。トランスフェクション実施4時間後に、ヒポキサン・チミジン不含培地に交換し、細胞の振とう培養を開始した。約2週間後にソニー社のセルソーターSH800を用いてシングルセルソーティングを実施した。ソーティング時には、GFP蛍光強度が高い上位2%以内の細胞集団をソーティングした。GFPの励起には488 nm半導体レーザーを使用した。シングルセルソーティングした細胞を拡大培養していき、各細胞クローンからゲノムDNAを抽出した。回収したゲノムDNAを用いて、各細胞クローンに導入されたGFP遺伝子のコピー数をBio-Rad社のQX200 Droplet Digital PCR システム（Droplet DigitalはBio-Rad Laboratories, Inc.の登録商標）により測定した。GFP遺伝子のコピー数を、その細胞がもつLanding padコピー数とし、1または2コピーのLanding padが導入された細胞クローンを選抜した。取得した各細胞クローンはTI宿主細胞候補として以後の実験に使用した。
〔実施例４〕カセット交換反応によるTI宿主細胞への抗体遺伝子の導入および評価
　実施例３にて樹立したTI宿主細胞候補を用いて抗体遺伝子の導入および評価を行った。Nucleofector 2bを用いてmAb-Aの抗体遺伝子（H鎖およびL鎖それぞれ1コピー）を搭載した組換えプラスミドおよびCre発現プラスミドを各TI宿主細胞へ共導入し、カセット交換反応を実施した。カセット交換反応によって、ＴＩ宿主細胞ゲノムに導入されていたDNAカセットは、mAb-Aの抗体遺伝子を含むＤＮＡカセットによって置換される。トランスフェクション実施4時間後に培地交換を行い、約2週間後にGFP蛍光を有さない細胞を分画取得して、各TI宿主由来の抗体発現細胞を樹立した。この時、いくつかのTI宿主細胞からはカセット交換反応後に生存細胞を得ることができかった。樹立した抗体発現細胞クローンを用いて2週間の生産培養を行い、抗体産生能を評価した。その結果、3種類のTI宿主由来（TI-J, LおよびM）の抗体発現細胞クローンが生産培養14日目において1000 mg/L以上の抗体産生量を示した（図３）。
〔実施例５〕TI宿主由来の抗体発現細胞を用いた産生能の長期安定性評価
　mAb-Aの抗体遺伝子（H鎖およびL鎖それぞれ2コピー）を搭載した組換えプラスミドを新たに作成し、2種類のTI宿主細胞（TI-JおよびL）に対して、実施例4と同様にカセット交換反応を実施した。得られた抗体発現細胞クローンを凍結保存し、融解後から約140日間の長期継代培養を行った。この期間において、約30日間隔で生産培養を実施し、細胞融解後の抗体産生能の変化を評価した。その結果、TI-JおよびTI-L細胞由来の各抗体発現クローンは140日の長期間にわたり高い抗体産生能を維持しており、140日間の平均値はそれぞれ約2400 および4200 mg/Lであった（図４）。
〔実施例６〕異なる抗体遺伝子を用いたTI宿主細胞の産生能評価
　mAb-A, BおよびCの3つの抗体遺伝子（H鎖およびL鎖それぞれ2コピー）をそれぞれ搭載した組換えプラスミドを新たに作成し、生産培養にて最も高い抗体産生能を有した細胞クローンの親細胞であるTI-L細胞に対して、実施例4と同様にカセット交換反応を実施した。その後、GFP蛍光を有さない細胞を分画取得し、TI宿主由来の3種類の抗体発現細胞を樹立した。2週間の生産培養の結果、mAb-A, BおよびCの異なる3抗体においても、TI-L細胞由来の抗体発現細胞は高い産生能を有していた（図５）。
〔実施例7〕Landing padの導入サイトの同定
生産培養にて最も高い抗体産生能を有した細胞クローンの親細胞であるTI-L細胞からゲノムDNAを抽出した。Pacific Biosciences 社のPacBio SequelシステムおよびIllumina社のHiSeqシーケンスシステムの2つの次世代シークエンサーを用いてTI宿主細胞の全ゲノムシーケンスを行った。まず、PacBio Sequelシステムより得られた全リードデータからLanding padのDNA配列を有する8つのロングリードを抽出し、これらを公共のNucleotide Database上のCHO細胞ゲノム配列（CHO-K1[ATCC]_RefSeq_2014）に対してBlast検索した。検索結果から最も相同性の高いゲノム領域をLanding padプラスミドの導入サイトとして同定し、Landing padを含む導入サイトの理論ゲノム構造を設計した。設計した理論ゲノム構造に対して、HiSeqシーケンスシステムより得られた全リードデータをマッピング処理した結果、設計したゲノム構造に理論通りマッピングされていることを確認した。同定の結果、Landing padはCHOK1 RefSeq scaffold（2019年1月現在）に登録されているNW_003614838.1上のCCDC91 (coiled-coil domain-containing protein 91)遺伝子（Gene symbol : LOC103164262）の1番目イントロン（配列番号：３）上に挿入されていた（図６）。なお実際には、CCDC91遺伝子は、NW_003614838.1のアンチセンス配列上にマッピングされる。そのため、配列番号：３の塩基配列も、NW_003614838.1のアンチセンス配列上にマッピングされる。また、CCDC91遺伝子の約32 kbp上流には、Mouseゲノム配列（GRCm38.p6）中のCCDC91遺伝子のプロモーターと相同性の高い領域が存在した。同定した導入サイトを中心として、ゲノム配列上の、５’側と３’側に位置する５ｋｂの塩基配列は、それぞれ配列番号：１および２のとおりである。したがって、各塩基配列とLanding padの位置関係は、次のとおりである。５’－（配列番号：１）－[Landing pad]－（配列番号：２）－３’
　本開示によって提供されるホットスポットは、動物細胞に外来性ＤＮＡを産生させるためのTIによる形質転換細胞の作製に有用である。たとえば本開示のホットスポットに抗体をコードするＤＮＡを導入した場合、抗体の産生に有用な形質転換細胞を高い確率で得ることができる。

Claims (15)

  1. 　目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する方法であって、該方法が、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程を含む方法。
  2. 　NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAを導入したCHO細胞を用いた、ポリペプチドの製造方法。
  3. 　以下の工程を含むポリペプチドの製造方法；
    （１）目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する工程であって、前記外来性ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞のゲノムのNCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程；
    （2）外来性DNAの導入されたCHO細胞を培養する工程；および
    （3）目的とするポリペプチドを回収する工程。
  4. 　目的とするポリペプチドをコードする外来性DNAをＣＨＯ細胞に導入する工程が、次の工程(i)-(ii)を含む請求項３に記載の方法；
    （ｉ）外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットをＣＨＯ細胞に導入する工程、および
    （ｉｉ）(i)のDNAカセットを標的部位として認識する組み換え酵素によって、外来性ＤＮＡを、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に導入する工程。
  5. 　前記外来性ＤＮＡの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される請求項５に記載の方法。
  7. 　前記外来性ＤＮＡの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である請求項６に記載の方法。
  8. 　前記目的とするポリペプチドが抗原結合分子である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記抗原結合分子が抗体である請求項８に記載の方法。
  10. 　NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域に、外来性DNAを交換反応により導入するためのDNAカセットを含む、単離されたCHO細胞。
  11. 　前記DNAカセットの導入部位が、NCBI accession number NW_003614838.1によって特定されるゲノム領域中のcoiled-coil domain-containing protein 91(CCDC91)遺伝子およびそのプロモーター領域を含む領域から選択される請求項１０に記載のＣＨＯ細胞。
  12. 　前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子領域から選択される請求項１１に記載のＣＨＯ細胞。
  13. 　前記DNAカセットの導入部位が、CCDC91遺伝子の第1イントロンの中である請求項１２に記載のＣＨＯ細胞。
  14. 　前記外来性DNAが、目的とする抗原結合分子をコードする外来性DNAである請求項１０～請求項１３のいずれかに記載のCHO細胞。
  15. 　前記抗原結合分子が抗体である請求項１４に記載のCHO細胞。
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