JP2015519914A - 部位特異的組込み - Google Patents
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Abstract
Description
A)材料及び方法
1.ベクター構築
全てのベクター配列は合成し、全て配列決定した。ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ(PAC)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(Hyg)及びmAb遺伝子は遺伝子合成の前に全て遺伝子最適化し、モンゴルキヌゲネズミ(Cricetulus griseus)のコドンバイアスに適合させた。pRY17(図1)の大部分は、pCB72.3-GA-HC-LC(Kalwy et al. (2006), Mol Biotechnol. 34. 151〜156頁)から誘導した。全てのベクターに存在している野性型FRT(F)の配列及び突然変異型F5FRT(F5)組換え配列は、Schlake and Bode(Schlake and Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751)に示されている。鋳型配列(遺伝子合成の前に遺伝子最適化を行う又は行わない)は以下のように得た:F組換え配列とベクターpRY17(図1)中のリンカーのインフレーム融合(図1)はベクターpFRT/lacZeo(Invitrogen)から得た。pRY21(図3)中のメチオニン開始コドンとF組換え配列とのインフレーム融合はpcDNAT5/FRT(Invitrogen)から得た。全てのベクターにおいて、使用するSV40初期プロモーター(pCB72.3-GA-HC-LCから誘導したGS転写単位に関連するものは別)は前記Invitrogenベクターから得た。pRY37のチミジンキナーゼ(TK)及びPAC遺伝子配列はそれぞれpWSTK6(gb:EU530625)及びpPUR(Clontech、gb:U07648)から誘導した。
バッチ振盪フラスコ解析については、細胞を、125mLの振盪フラスコにおいて、様々な選択薬剤(後述)を補充した30mLのCD CHO中に3×105生細胞/mLで播種し、37℃で加湿5%CO2含有空気(v/v)中、140rpmの軌道振盪インキュベータでインキュベートした。調整培地を培養7日目に回収し、調整培地中の抗体濃度をプロテインA HPLCによって測定した。
細胞を、125mLの振盪フラスコにおいて、様々な選択薬剤(後述)を補充した30mLのCD CHOを中で交互に3及び4日ごとに継代培養した。様々な世代数(1世代は1個体群を2倍にすることと等価)で、二重フェドバッチ振盪フラスコを上記のように設定した。細胞濃度、生存性、及びmAb濃度の測定値を上記の通り集めた。細胞株の生産性が70世代以内で>30%変化する場合は、不安定とみなす。
単細胞クローニングを、FACSDiva v6.0ソフトウェアを備えたFACS Aria II細胞セルソーターを用いて、488nmで放射する空冷レーザーにより実施した。死細胞をFSC対SSCドットプロットで排除し、重複分をFSC幅対面積ドットプロットで排除した。生細胞についての分別ゲートは2つのドットプロットの組合せとした。
目的配列をコードする第2の遺伝子、即ち、選択マーカー遺伝子を含む空ベクターであるpRY37による親pRY17発現細胞株のトランスフェクションは、FreeStyleTMMAX CHOシステム(Invitrogen)を使用して実施した。この目的のために、RMCEのための再トランスフェクションの24時間前に、選択したpRY17でトランスフェクトされた細胞株(11A7)を、最初にFreeStyleTMCHO Expression Mediumに5×105細胞/mLで125mL振盪フラスコにおいて播種した。トランスフェクションの日に、1×106細胞/mLの濃度で、およそ3×107の細胞をFreeStyleTMMAX試薬を用いて、製造業者の指示に従って、125mLの振盪フラスコにおいて、33.75μgのpOG44プラスミド(Invitrogen、gb:X52327)と3.75μgのpRY37(9:1)により共トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、25μMのMSX及び7μg/mLのピューロマイシンを補充した所有権のある化学規定培地を含む48ウェルプレートに播種した。播種の3週間後、生細胞を含む各ウェルからの培地を、プロテインAバイオセンサーを使用するForteBioにより、抗体生産に関してスクリーニングした。検出可能な抗体がなかった細胞株の培地は、さらに、25μMのMSX及び1μg/mLのピューロマイシンを補充したCD CHO培地を含む125mLの振盪フラスコに進めた。
RMCE実験は、3つの別個の「ラウンド」に分けて、この項目と下記の結果の項目の両方で言及する(ラウンドは図6で定義する)。
増殖曲線下面積の時間積分(生細胞濃度(IVC)の時間積分、106細胞 日/mL)を、レナードらによって記載された方法を使用して計算した(Renard et al. 1988, Biotechnology Letters 10:91-96)。
Seegene DNA Walking SpeedUpTMKit IIを、製造業者の指示に従って使用して3'ゲノムフランキング配列データを得た。GS-CHOK1SV細胞株11A7の直鎖状組込みpRY17ベクター(bla R、図3)の模式図の3'アームのblaに特異的なβ-ラクタマーゼ(bla)遺伝子特異的プライマー、TSP1fwd(配列番号4)、TSP2fwd(配列番号5)及びTSP3fwd(配列番号6)を使用した。
10E9ゲノムDNAを断片化し、HiSeqプラットフォームシーケンシングに適切なペアエンドライブラリを、製造業者の指示に従ってTrueSeq DNA試料調製キットを使用して調製した。作製したライブラリは、300bpから500bpの予期されたサイズの範囲内にあった。Agilent 2100 Bioanalyzerを使用して作製したライブラリのQC解析により、このライブラリが、継続的な試料処理のために予期されるフラグメントのサイズと収率を有し、許容される性質を有するものであることが示された。作製したライブラリを、製造業者の指示に従ってクラスタ生成のためにcBotシステムで使用した。増幅されたクラスタを含むフローセルを、Hi-Seq 2000を用いて2×100塩基対ペアエンドシーケンシングで配列決定した。リードを、CHO-K1コンティグ(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)に、Burrows-Wheeler Aligner (BWA)(Li H. and Durbin R. 2009 25:1754-1760)を使用してマッピングした。
フェーズI:親mAb発現細胞株の作製
フェーズIの目的は、好ましい増殖特性と、安定な生産性を有し、単一の組込み遺伝子座のみを含み、この遺伝子座でのベクター組込みの考えられる数が最小である高生産性mAb発現GS-CHOK1SV細胞株を作製することであった。キメラmAb cB72.3(Whittle et al. 1987, Protein Eng 1:499-505)をコードする改変Lonza GS「二重遺伝子ベクター」pRY17(図1)を設計した。pRY17では、48bp野性型F及び突然変異型F5組換え配列がmAbのHC及びLC転写単位を挟む。F5とFの組換え配列は機能的に等価であるが、最小限のクロス組換え活性を示し、それゆえにFLPリコンビナーゼで触媒される効率のよい一方向RMCEを可能にする(Schlake and Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751)。ハイブリッド遺伝子の直ぐ上流に開始メチオニンコドン又はプロモーターが存在しないため、pRY17トランスフェクション由来の初期GS-CHOK1SV細胞株は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を効率的に転写又は翻訳しない。
11A7の元のmAb転写単位を新しいmAbの転写単位に交換した標的ベクターを設計することは全く可能であるが、元のものはゲノムから完全に削除することが好ましい。これを実施するために、mAb遺伝子をコードしていない空のさらなる標的ベクターpRY37(図2)を設計した。代わりにこのベクターは正及び負の選択マーカー、それぞれピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ(PAC)及びチミジンキナーゼ(TK)をコードしており、これらはpRY17(図1)と同じ方向でF及びF5組換え配列により挟まれている。RMCE後、これらのマーカーは、当初の11A7ゲノムと同じ遺伝子座で当初のcB72.3mAbを置換すると予測される。PACは、pRY37と共にRMCEを受けた細胞株を選択するために必要である。TKは、プロドラッグのガンシクロビルを毒性のあるリン酸化されたヌクレオチドアナログに変換する(Wood and Crumpacker, 1996, New England Journal of Medicine 335, 721〜729頁)。このことは、後にフェーズIIIにおける負の選択の適用において重要となる:ガンシクロビル選択により、RMCEを受けていない細胞が殺傷されることによって、RMCEプールにおいて、正当なRMCEを受けた細胞が濃縮される。
新しいSSI宿主細胞株10E9の有用性を実証するために、標的ベクターpRY21を設計した(図3)。このベクターは、pRY17(フェーズI)及びpRY37ベクター(フェーズII)の両方で見られるのと同じ方向でF及びF5組換え配列により挟まれたMyo mAbのHC及びLC遺伝子を含む。さらに、F組換え配列にインフレーム融合されたメチオニン開始コドン(ATG+F)の上流にSV40初期プロモーター(SV40E)も含む。正当なRMCEが生じるとき、ATG+F配列は、プロモーターがなく、翻訳開始メチオニンが欠失している(-ATG)ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子と共にインフレームに配置される。pRY21とpOG44を有する10E9細胞の、3ラウンドの同時トランスフェクションを実施した。最初の2つのラウンドではFree styleTMMAX CHOシステムを用いて細胞にトランスフェクションを行ったのに対し、第3ラウンドではエレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクションを行った。さらに、ラウンド1は、ガンシクロビルとハイグロマイシンによりプールとして同時選択を行った;ラウンド2は、最初に400μg/mLのハイグロマイシン、次いでガンシクロビルによりプールとして連続的に選択を行い、その後、FACS Aria IIを使用して単細胞クローニングした;ラウンド3は、最初に200若しくは400μg/mLのハイグロマイシン、次いでガンシクロビルによりプールとして連続的に選択を行い、続いてFACS Aria IIを使用して単細胞クローニングした(図6)。ラウンド3においては、MSXを2つの試験条件の培地から取り除いた。
3'フランキング配列
bla R(図3)のSeegene DNAウォーキング由来の500bpの3'フランキング配列(配列番号7)を、NCBIデータバンクから公的に利用可能なCHO-K1ゲノムシーケンシングプロジェクト(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)のコンティグをblast検索するために使用した。非配置ゲノムスカフォールドscaffold1492(NW_003613833.1と同一であるアクセッション番号JH000254.1)に位置する固有の配列が、1760466〜1760965のマイナス鎖上で見出された。500bp配列(配列番号7)を、scaffold1492への10E9リードの高カバレッジのマッピングに基づき、2000bp(配列番号8)まで伸長させた。
10E9ゲノムDNA由来のIlluminaリードを、Burrows-Wheeler Aligner(BWA)を使用して、pRY17(配列番号1)にマッピングした。マッピングの精査により、cB72.3HCの3'部分の5'端にマッピングされた複数の非ペアリードが見出された(図8の黒い矢印)。この解析は、cB72.3HCの少なくとも1つのフラグメント(5'端から214bpが欠失)が、10E9「ホットスポット」に残っていることを示唆している。ノーザンブロット解析(データ示さず)は、10E9細胞にcB72.3LC若しくはHC mRNAがないことを示し、これはcB72.3のトランケートされたHCが非機能的であることを示唆している。次いで等価なペアリードを、CHO-K1ゲノムシーケンシングプロジェクト(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)のコンティグをblast検索するのに使用した。それらを全て非配置のゲノムスカフォールドscaffold1492(NW_003613833.1と同一であるアクセッション番号、JH000254.1)上の同じ位置(1750048-1750183)にアライメントした。これにより5'フランキング配列を最長822bp(配列番号9)まで伸長させた。
A)材料及び方法
1.サザンブロット
各クローンの継代2及び4から単離し、QIAGENのBlood & Cell Culture DNA Maxi Kit(Qiagen)を使用して精製した5〜10μgのゲノムDNAを、制限エンドヌクレアーゼにより15時間、37℃で消化した。消化したDNAを、等容積のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールの混合物(pH8.0)(1:1 v/v)で2回抽出し、次いでクロロホルム単独で抽出し、エタノールで沈殿させた後、0.7%(w/v)のアガロースゲル上で 0.5×TBE (50×TBE:Lonza)又は1×TAE(40mM Tris、pH7.7、2.5mM EDTA)のいずれかのバッファーを用いて電気泳動した。ゲルを製造者(Appligene, Pharmacia)の指示に本質的に従って真空マニホールドを使用してHybond-N膜(Amersham)上へ移した。Hybond-N膜をUV固定し、50×ストック(Sigma)から調製した5×Denhardt、6×SSC(1×SSC:0.15M塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム)、及び10%(w/v)SDSを含むハイブリダイゼーション緩衝液、又はRapid-hyb Buffer(GE healthcare)単独のいずれかにおいてプレハイブリダイズした。
TK-フォワード:5'-AGATCACCATGGGCATGCCTTAC-3'(配列番号10)
TK-リバース:5'-AACACGTTGTACAGGTCGCCGTT-3'(配列番号11)
ベクターpRY37を、プローブ作製PCRの鋳型として使用し、サイクル条件は:15ng鋳型/50μl反応;Taq DNAポリメラーゼ(Roche);94℃で2分、30サイクル×94℃で30秒、55℃で1分及び72℃で30秒、最終伸長72℃で7分であった。25ngのPCR産物を、Megaprimeキットを用いて[γ-32P]dCTP(111TBq/mmol、Perkin Elmer)で標識し、nick-translationカラム(Amersham)で精製した。ハイブリダイゼーションは、同じプレハイブリダイゼーション緩衝液で2〜20時間、65℃で行った。ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄し、0.1×SSC、0.1%(w/v)SDS、65℃の最終的なストリンジェンシーまで洗浄した。ブロットを、保存リン光体スクリーン(Bio-Rad)に暴露した。暴露したスクリーンを、Personal Molecular Imager(PMI)システム(Bio-Rad)を使用して画像化した。
FASTQフォーマットのペアエンドリードを、ゲノムテンプレートへのマッピングのための入力にする。ベクター配列及びCHOK1SVアセンブリに、マッピングするための鋳型として印をつける。ペアエンドリードを、Bowtie2(Langmead B, & Salzberg SL, 2012, Nature methods, 9 (4), 357-9)を用いて、高速ローカルアライメントのためにデフォルトパラメータ(-D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00)により鋳型にアライメントする。様々な試料を比較するために、カバレッジを、<未処理カバレッジ>*500M/<リード数>として規準化する。
10E9 SSI宿主株の2×100のペアエンドリードを、Illumina Hi-Seq 2000を使用して平均カバレッジ40Xで配列決定した。配列リードを、CHOK1SVゲノムへ組込んだ第1のベクターであるベクターpRY17にマッピングした。組込み部位をカバーするリードは、CHOK1SVゲノムと組込みベクター配列との両方にマッピングする配列を含んでいるため、キメラリードと称する。マッピングをローカルアライメントにより実施するため、キメラリードは、ゲノム配列にマッピング可能なオーバーハングテールと共に、ベクター配列と部分的に一致する特徴を有する。キメラリードに加えて、ペアリードの一端がベクター配列に完全にマッピングしており他端がゲノム配列にマッピングしている他のリードも存在する。これらのリードペアは、不一致リードペア(discordant read pair)と称される。配列相同性に基づき組込み部位のフランキング配列を同定するために、オーバーハングテール配列及び不一致リードペアのマッピングされたなかったリードを集め、blastを用いてCHOK1SVゲノムアセンブリを検索するのに用いた。
ランディングパッド(目的遺伝子の発現カセットの組込みのための組換え部位を含むホットスポットにRMCEにより導入された外来性配列)の構造は、10E9細胞株のサザンブロット解析及び全ゲノム再配列決定(WGRS)解析データ(図9)の両方を基にした。10E9由来リードを、組込み部位のマッピングに使用したものと同じアルゴリズムを用いて、ベクター配列にマッピングした。キメラリードは、重複、欠失又は挿入部位でも観察される。推定ランディングパッド配列への補正は、キメラリードが生じる部位の綿密な調査に基づいて行った。
リードをマッピングするために使用した鋳型は、全ゲノム再シーケンシング(上記参照)に由来するランディングパッドの「1コピー(one-copy)」モデルを使用して構築した。RNA-seqシーケンシングリードを、デフォルトパラメータを使用してBWAにより鋳型にマッピングした。LC及びHCのリードカウント数を、RPKM測定単位(トランスクリプトーム1キロベースあたりマッピングされたリード100万個あたりのリード)に対して、以下の式を用いて規準化した:
10E9 SSI宿主細胞におけるランディングパッドの構造
Fer1L4ホットスポット内のランディングパッドの構造モデルは、空の標的ベクターpRY37(図4)を使用した11A7から細胞株10E9の生成中に生じる予期されるRMCE事象から推定した。このモデルは、「単一コピー」モデルと称し、細胞株10E9からのWGRSデータと一致した(図9)。しかしながらサザンブロットのデータは、モデルが実際は2つのコピーを含むであろうことを示唆した(図9B)。この「2コピー」モデルをデータに基づいて精査し、このモデルを10E9宿主におけるRMCE誘導mAb生産細胞株の解釈に役立てるために使用した。「2コピー」モデルにより、なぜ抗体転写単位の1つ又は2ついずれかのコピーが、標的ベクターpRY21を用いたRMCEによってランディングパッドに組込まれ得るかを説明できる。
抗ミオスタチンモノクローナル抗体(Myo)を発現する4つの10E9誘導組換え細胞株を、(標的ベクターpRY21を使用する)RMCEによって作製し、それぞれの5'及び3'フランキング配列を上記の方法を用いて決定した。RMCEのプロセス中に一貫したゲノム再編成が生じ、誘導体細胞株に新たな3'フランキング配列を生成する(図10)。RMCE誘導体細胞株の5'フランキング配列は、(非配置CHO-K1 Scaffold1492スカフォールド(NW_003613833.1と同一であるアクセッション番号JH000254.1における)ヌクレオチド1750049に組込み部位を有し、10E9と同じである。しかしながら3'フランキング配列は現在異なっている:10E9 SSI宿主細胞株の3'組込み部位は、全てのRMCE誘導体細胞株においてヌクレオチド1760965にあるが、この配列では現在ヌクレオチド1435427で見出せる(上記のスカフォールド、図10)。
これらのゲノムのそれぞれからのシーケンシングリードを、1コピーがホットスポットに組込まれたモデルにマッピングした。Myoコピー数はLC及びHC領域の平均カバレッジから誘導した。これらの4つの細胞株に対する平均カバレッジは、それぞれ、LC領域において41、34、18、27であり、HC領域において32、27、14、19である。カバレッジデータは、高生産株について、少なくとも1つのさらなるHC及びLCのコピーが存在し得ることを示している(表7)。カバレッジデータを、図11にグラフで示す。
Claims (24)
- 内在性Fer1L4遺伝子を含む部位特異的組込み(SSI)宿主細胞であって、外来性ヌクレオチド配列が前記Fer1L4遺伝子に組込まれている、前記宿主細胞。
- 外来性ヌクレオチド配列が少なくとも2つの組換え標的部位を含む、請求項1に記載のSSI宿主細胞。
- 少なくとも2つの組換え標的部位が目的配列をコードする遺伝子を挟む、請求項2に記載のSSI宿主細胞。
- 外来性ヌクレオチド配列が目的配列をコードする遺伝子を含む、請求項1に記載のSSI宿主細胞。
- 目的配列をコードする遺伝子が、選択マーカー、検出可能なタンパク質、抗体、ペプチド抗原、酵素、ホルモン、成長因子、レセプター、融合タンパク質、又は他の生物学的に活性なタンパク質をコードする一以上の遺伝子を含む、請求項3又は4に記載のSSI宿主細胞。
- 組換え標的部位がFRT部位又はlox部位である、請求項2に記載のSSI宿主細胞。
- 選択マーカーがGS選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー、又はチミジンキナーゼ選択マーカーである、請求項5に記載のSSI宿主細胞。
- 宿主細胞がマウス細胞、ヒト細胞若しくはCHO宿主細胞、CHOK1宿主細胞、又はCHOK1SV宿主細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のSSI宿主細胞。
- 組込まれた外来性ヌクレオチド配列を挟むFer1L4遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号7、8、9、及びその相同配列からなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載のSSI宿主細胞。
- 外来性ヌクレオチド配列が、Fer1L4遺伝子の一部を置換している、請求項1〜9のいずれか一項に記載のSSI宿主細胞。
- 宿主細胞が、野生型FRT部位又は突然変異型FRT部位であるFRT部位を含む、請求項6に記載のSSI宿主細胞。
- 組換え標的部位が、少なくとも1つの野生型FRT部位及び少なくとも1つの突然変異型FRT部位を含む、請求項2に記載のSSI宿主細胞。
- SSI宿主細胞を生産するための方法であって、
a)内在性Fer1L4遺伝子を含む細胞を提供する工程であって、外来性ヌクレオチド配列が前記Fer1L4遺伝子に組込まれており、外来性ヌクレオチド配列が、目的配列をコードする少なくとも1つの第1の遺伝子を挟む少なくとも2つの組換え標的部位を含む前記工程、次いで
b)工程a)で提供された細胞を、第1の交換可能カセットを含むベクターによってトランスフェクトする工程であって、該カセットが目的配列をコードする少なくとも1つの第2の遺伝子、即ち選択マーカー遺伝子を挟む少なくとも2つのマッチング組換え標的部位を含む前記工程、次いで
c)部位特異的組換え媒介カセット交換を行う工程、及び、次いで
d)目的配列をコードする第2の遺伝子、好ましくは選択マーカー遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し、そのゲノムに安定に組込まれた第1の交換可能カセットを含むSSI宿主細胞を得る工程
を含む、前記方法。 - SSI宿主細胞を、少なくとも1つの第2の交換可能カセットを含むベクターによってトランスフェクトする工程であって、該カセットが目的配列をコードする少なくとも1つの第3の遺伝子及び少なくとも1つの選択マーカーを挟む少なくとも2つのマッチング組換え標的部位を含む前記工程、ii)部位特異的組換え媒介カセット交換を行って、目的配列をコードする第3の遺伝子を含むSSI宿主細胞を得る工程、iii)工程ii)で得られたSSI宿主細胞に目的配列をコードする第3の遺伝子を発現させる工程、並びにiv)目的配列をコードする第3の遺伝子の産物を回収する工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 配列番号7、8、9で示されるヌクレオチド配列、及びその相同配列からなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチド又は請求項16に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチド又は請求項16に記載のベクターの中に又は隣接した目的配列をコードする遺伝子を含む、請求項17に記載の宿主細胞。
- 細胞又は細胞株、特に高い生産安定性を有する高生産性細胞又は細胞株を生産するための方法であって、Fer1L4ヌクレオチド配列が目的配列をコードする少なくとも1つの遺伝子を含むベクターに組込まれており、次いで該ベクターが細胞又は細胞株に安定にトランスフェクトされ、次いで安定にトランスフェクトされた細胞又は細胞株が選択され、得られる、前記方法。
- Fer1L4ヌクレオチド配列が、配列番号7、8、9で示されるヌクレオチド配列、及びその相同配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列である、請求項19に記載の方法。
- 目的配列をコードする遺伝子の産物の生産のための方法であって、請求項13又は19に記載の方法に従って生産される宿主細胞又は細胞株を好適な培地で培養する工程、及びそれから産物を回収する工程を含む、前記方法。
- SSI宿主細胞を生産する方法であって、外来性のヌクレオチド配列を、細胞の内在性Fer1L4遺伝子に導入する工程を含む、前記方法。
- 外来性ヌクレオチド配列が、Fer1L4遺伝子とポリヌクレオチドの間の相同組換えによって導入され、該ポリヌクレオチドが、
a)Fer1L4遺伝子の第1の部分に相同な第1のヌクレオチド配列、
b)外来性のヌクレオチド配列、及び
c)Fer1L4遺伝子の第2の部分に相同な第2のヌクレオチド配列
を含む、請求項22に記載の方法。 - 外来性ヌクレオチド配列の導入が、ウイルスベクター(例えば、相同組換えを媒介するアデノ関連ウイルスベクター)又は外来性ヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、又は人工メガヌクレアーゼ)を用いて促進される、請求項22に記載の方法。
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