MX2014015612A - Integracion especifica de sitio. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a células hospederas de integración específica de sitio (SSI) estables y de alta producción, por ejemplo células hospederas derivadas de ovario de hámster chino (CHO), a métodos para producirlas y para utilizarlas.

Description

INTEGRACION ESPECIFICA DE SITIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a células hospederas de integración especifica de sitio (SSI) estables y de alta producción, por ejemplo, células hospederas derivadas de ovario de hámster chino (CHO), a métodos para producirlas y para utilizarlas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los números incrementados de candidatos biofarmacéuticos biológicos en desarrollo ha motivado la necesidad de desarrollar teenologías de alto rendimiento robustas y rápidas para el desarrollo de línea celular debido a que la generación de líneas celulares comerciales utilizando métodos convencionales es un procedimiento tardado, laborioso y repetitivo. Durante la construcción y selección de líneas celulares productoras de anticuerpo, se obtienen líneas celulares con una gama grande de perfiles de expresión, crecimiento y de estabilidad. Estas variaciones pueden surgir debido a la plasticidad inherente del genoma mamífero. Éstas también se pueden originar a partir de redes de regulación de gen estocásticas o en la variación en la cantidad de proteína recombinante producida que resulta de la integración genómica aleatoria de un transgen principalmente debido al "efecto de variegación de posición".

Como consecuencia de estas variaciones y de la baja frecuencia (1 en 10,000) de la integración genómica, se requieren esfuerzos intensivos en cuanto a recursos y tardados para tamizar muchos transíectantes en el grupo respecto a estos eventos raros, con el fin de aislar una linea celular de producción comercialmente compatible (por ejemplo, una combinación de buen crecimiento, alta productividad y estabilidad de producción, con perfil de producto deseado). Esta situación se puede mejorar enriqueciendo respecto a líneas celulares de alta producción utilizando un sistema de selección altamente astringente, tal como el sistema de expresión de gen de GS (glutamina sintetasa). Por ejemplo, en un estudio reciente > 30% de un panel seleccionado en forma aleatoria de 175 líneas celulares GS-CHOK1SV (sistema de expresión de gen de GS™, Lonza) productoras de mAb (anticuerpo monoclonal) produjo > 1 g/1 de mAb en un procedimiento en matraz agitado de lote alimentado. CHOK1SV expresa la enzima GS en forma endógena, por lo tanto, se pueden obtener transfectantes positivos utilizando medios libres de glutamina y selección de metionina-sulfoximina (MSX). A pesar de dichos sistemas de selección eficientes, todavía sigue siendo requerido un régimen de tamizado riguroso y laborioso. Por lo tanto, la construcción de líneas celulares para fabricación es un procedimiento laborioso y prolongado. Estas lineas celulares no solamente necesitan ser seleccionadas respecto a características de crecimiento y productividad positivas, éstas también necesitan ser clonadas, y esencialmente necesitan producir el producto de la calidad correcta por toda la duración del procedimiento de fabricación. Asimismo, para que un procedimiento sea económico, las líneas celulares generadas necesitan exhibir productividad consistente a través de muchas generaciones de células. Lo que sería deseable es proveer líneas celulares de alta producción con características de crecimiento positivas con un mínimo de actividad de tamizaje cada vez que se va a expresar una nueva proteína de interés, por ejemplo, un nuevo anticuerpo monoclonal.

El problema téenico subyacente a la presente invención es superar las desventajas antes identificadas, en particular proveer, de preferencia en una manera simple y eficiente, líneas celulares de alta producción con una estabilidad elevada y características de crecimiento y productividad positivas, en particular líneas celulares que provean una productividad consistente a lo largo de un periodo de cultivo y producción prolongado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención resuelve su problema técnico subyacente mediante la provisión de la enseñanza de conformidad con las reivindicaciones independientes.

En particular, la presente invención resuelve su problema téenico mediante la provisión de una célula hospedera de integración especifica de sitio (SSI) que comprende un gen FerlL4 endógeno, en la cual una secuencia de nucleótido exógena está integrada en dicho gen FerlL4. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación. En algunas modalidades, los sitios objetivo de recombinación flanquean por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés. En otras modalidades, los sitios objetivo de recombinación están adyacentes a, y no flanquean, por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés. En algunas modalidades, el gen que codifica para la secuencia de interés comprende por lo menos un gen marcador para selección.

En una modalidad preferida, la presente invención contempla que las secuencias de nucleótido exógenas integradas en el gen FerlL4 endógeno sean dos sitios objetivo de recombinación que flanquean dicho por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia dicho por lo menos un gen marcador para selección, lo que significa que un primer sitio objetivo de recombinación está localizado 5' corriente arriba y un segundo sitio objetivo de recombinación está localizado 3' corriente debajo de dicho por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia dicho por lo menos un gen marcador para selección.

De preferencia, el gen que codifica para la secuencia de interés puede ser una secuencia de nucleótido que codifica para una proteina de interés, por ejemplo, un anticuerpo, un antigeno, una enzima, una proteina detectable, por ejemplo, una proteina fluorescente tal como la proteina fluorescente verde, una hormona, un factor de crecimiento, un receptor, una proteina de fusión, o una proteina con función selectiva. Dicha secuencia de nucleótido puede estar funcionalmente ligada a por lo menos un elemento regulador, tal como un promotor. De preferencia, el gen que codifica para la secuencia de interés es un gen marcador para selección.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a la célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención, en la cual el sitio objetivo de recombinación es un sitio FRT (Objetivo de reconocimiento de FLP). En una modalidad preferida de la presente invención, el sitio FRT es un sitio FRT de tipo silvestre, específicamente el sitio F.

En una modalidad preferida adicional de la presente invención, el sitio de FRT es un sitio FRT mutante, de preferencia el sitio F5, de preferencia tal como se describe en Schlacke y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12752.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención el gen que codifica para la secuencia de interés, por ejemplo, el gen marcador para selección, está flanqueado en su extremo 5' por el sitio FRT de tipo silvestre y en su extremo 3' por un sitio FRT mutante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras anexas ayudan a describir adicionalmente la invención Las figuras muestran: La Figura 1 muestra el vector pRY17 (SEQ ID No. 1) utilizado para identificar el "sitio clave" en CH0K1SV. LC1 y HCl son las cadenas ligera y pesada del anticuerpo de IgG4 monoclonal quimérico, CB72.3. hCMV se refiere al promotor de gen temprano hCMV-MIE en el cual "Int" representa su primer intrón, Intrón A y los exones de flanqueo que codifican para la UTR 5' están representados como "Exl" y "Ex2" respectivamente. Los sitios FRT de tipo silvestre y F5 mutante están marcados, F y F5, respectivamente. Las secuencias de poliadenilación, del promotor temprano SV40 y de b-lactamasa están indicados como pA, SV40 y bla, respectivamente. GS representa el ADNc de glutamina sintetasa y Hyg (-ATG) representa un gen de fosfotransferasa de higromicina que carece de un codón de metionina de inicio y de promotor.

La Figura 2 muestra el vector "Intermedio", pRY37 (SEQ ID No.2) utilizado para crear el hospedero SSI 10E9. Este vector contiene unidades de transcripción de flanqueo de un sitio FRT mutante (F5) y FRT de tipo silvestre (F) que contienen genes de timidina cinasa (TK) y puromicina acetil transferasa (PAC). La transcripción en cada uno es controlada por el promotor temprano de SV40 (SV40E). El vector pRY37 se co-transfecta en células 11A7 con el vector pOG44 (Invitrogen) que codifica para la FLP recombinasa. Las lineas celulares se seleccionan en presencia de medio que contiene puromicina y se tamizan adicionalmente respecto a RMCE entre las secuencias de FRT pRY37 y las secuencias equivalentes de pRY17 incrustadas en el genoma de 11A7 (véase figura 3). Después del tamizaje y clonación, se aísla la línea celular 10E9 (el hospedero SSI) en la cual las unidades de transcripción del mAb cB72.3 han sido intercambiadas por las de TK y PAC.

La Figura 3 muestra el vector para elección de blanco para crear líneas celulares productoras de mAb en el hospedero SSI 10E9. Este vector, pRY21 (SEQ ID No. 3) contiene unidades de transcripción que contienen los genes del mAb Myo (HC2 y LC2), flanqueados por sitios FRT mutante (F5) y de tipo silvestre. Se agregó un codón de metionina de inicio en marco al extremo 5' del sitio FRT de tipo silvestre (ATG+F) y corriente arriba de éste está un promotor temprano de SV40 (SV). La transcripción de los genes de HC2 y LC2 es controlada por el promotor del gen temprano inmediato principal de hCMV 1 (hCMV-MIE) y su primer intrón, Intrón A (Int A) y los exones de flanqueo que codifican para la UTR 5' representados como "Exl" y "Ex2", respectivamente. El gen de b-lactamasa se representa como bla.

La Figura 4 muestra el procedimiento para generar el hospedero 10E9 a partir de la linea celular 11A7. Este diagrama en esquema muestra una copia individual de pRY17 genómicamente integrado de manera lineal que contiene las unidades de transcripción del mAb cB72.3 (HCl y LC1) flanqueadas por un sitio FRT mutante F5 y FRT de tipo silvestre en la linea celular 11A7. Antes de la transfección, el vector pRY17 se corta a la mitad del gen de b-lactamasa (bla) con Pvu I, el vector lineal después es flanqueado por las porciones 5' (bla L) y 3' (bla R) del gen. El vector pRY37 se co-transfecta en la linea celular 11A7 con un plásmido que codifica para FLP recombinasa y la recombinación (indicada mediante cruces) ocurre entre sitios similares lo que conduce a RMCE de las unidades de transcripción del mAb con unidades de transcripción de timidina cinasa (TK) y puromicina acetil-transferasa (PAC) cada una controlada por el promotor temprano de SV40 (SV).

La Figura 5 muestra el procedimiento para generar una linea celular productora de mAb a partir del hospedero SSI, 10E9. El vector para elección de blanco, pRY21 (figura 3, SEQ ID No.3) contiene unidades de transcripción para el segundo mAb (Myo) (HC2 y LC2) flanqueadas hacia el extremo 5' por un sitio FLP mutante (F5) y hacia el extremo 3' por un promotor temprano de SV40 (SV) por sí mismo corriente arriba del sitio FRT de tipo silvestre ligado en marco con el codón de iniciación de metionina (ATG-F). En presencia de Flp recombinasa, y del vector para elección de blanco pRY21 los genes de timidina cinasa (TK) y puromicina acetil transferasa (PAC) y los promotores asociados son sustituidos mediante RMCE con las nuevas unidades de transcripción de anticuerpo mAb Myo. Como consecuencia de esto, se crea un gen de fusión funcional del sitio FRT de tipo silvestre y el gen de higromicina (ATG-F-Lnk-Hyg). Por lo tanto, las células en las cuales ha ocurrido RMCE especifica se pueden seleccionar en presencia de higromicina y ganciclovir.

La Figura 6 muestra una comparación de la expresión de anticuerpo de grupos de SSI y de líneas celulares clónales derivadas a partir del proceso aleatorio de integración especifica de sitio (SSI) asistida con FLP. Los clones de integración aleatoria se generan utilizando un procedimiento idéntico al utilizado para generar la linea celular 11A7 en la Fase 1. Los grupos de SSI (ronda 1 de SSI) y las lineas celulares clónales (ronda 2 de SSI, y ronda 3 de SSI) se generan bajo condiciones de transfección y selección diferentes como se especifica en la sección de métodos. Para la ronda 3 de SSI, se utilizan 4 condiciones de selección diferentes; 200 mg/ml, sin MSX (·), 200 pg/ml de higromicina con MSX (¨), 400 pg/ml de higromicina sin MSX (A) ó 400 pg/ml de higromicina con MSX (T). Las líneas celulares clónales generadas a partir de todos los procesos se expanden en matraces de agitación. La productividad de las líneas celulares clónales se evalúa en matraces de agitación del lote final de 7 días (véase métodos).

La Figura 7 muestra la estructura de exón del gen FerlL4 en la cadena menos (-) del andamio 1492 también conocido como JH000254.1 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/JH000254). Se indica la ubicación de los sitios de integración 5' y 3' (1750049 y 1760965, respectivamente).

La Figura 8 muestra el mapeo de las lecturas de 10E9 mapeadas hasta pRY17-GA-Q utilizando BWA. Aunque la inspección del mapeo, se encuentran que lecturas múltiples no apareadas (flechas negras) se mapean en el extremo 5'del fragmento de HC (el cual tiene 214 pares de bases eliminados del extremo 5'de la HC completa).

Las Figuras 9A-9B muestran la estructura del sitio de unión (landing pad) en el gen FerlL4 de la célula hospedera SSI 10E9. (Figura 9A) La cobertura de WGRS para el sitio de unión se muestra sobrepuesta sobre la parte superior del modelo de "una sola copia" y debajo se muestra un esquema más detallado. (Figura 9B) Los datos del análisis Southern blot sugieren que podría haber dos copias del sitio de unión. El ADN genómico proveniente de las células 10E9 se digiere con cualquiera de las enzimas de restricción Bmg I o Pml I y se analiza mediante Southern Blot. Los Southern blots se hibridan con una sonda de TK, que revela dos fragmentos que abarcan dos copias del sitio de unión (mostrados mapeados a un modelo de "dos copias"). El modelo de "dos copias" es consistente con los datos de WGRS.

La Figura 10 muestra el dibujo esquemático de los sitios de integración de las lineas celulares 10E9 (célula hospedera SSI) y RMCE (que expresan un gen de interés). La ubicación genómica se representa mediante una línea vertical discontinua y la coordenada de nucleótido en el andamio no colocado CH0-K1 Scaffoldl492 (número de acceso JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). El gen FerlL4 se representa como una flecha mientras que el fragmento genómico está representado como una linea sólida. La linea discontinua que interrumpe representa una distancia muy grande. Las secuencias de flanqueo 5' y 3' están representadas por punteros blancos y negros, respectivamente.

La Figura 11 muestra la gráfica de cobertura de las lecturas de re-secuenciación del genoma completo mapeadas en el modelo de una copia del vector integrado. La altura de la gráfica gris es igual a la cobertura en cada base sin corrección (mostrado para cada linea celular generada mediante RMCE, 1-4). La cobertura en la región de flanqueo es aproximadamente la misma entre todas las lineas celulares. Sin embargo la cobertura de las dos con producción alta en la parte alta de la figura es aproximadamente 1.4 a 2.3 veces la cobertura de las dos con producción baja en la parte inferior. Las características de wFRT están indicadas con asteriscos, mientras que las características de mFRT se representan mediante círculos negros. (Otras características se indican de la siguiente manera: HC con deleción de 214 pares de bases, es el cB72.3 remanente que queda detrás en el sitio clave después de la creación del hospedero SSI 10E9; BlaR es una porción 5' del gen de beta-lactamasa; Myo-LC y Myo-HC son las secuencias que codifican para la HC (cadena pesada) y la LC (cadena ligera) del mAb anti-Miostatina, residentes en el sitio clave post-RMCE; Hyg = higromicina; BlaL es la porción 3' del gen de beta-lactamasa y GS-ADNc es la secuencia que codifica para glutamina sintetasa del vector pRY17).

La Figura 12 muestra la gráfica de cobertura de las lecturas mapeadas de secuenciación de ARN en la región LC y HC de Myo del vector integrado (para las lineas celulares RMCE-generadas 1-4). La altura de la gráfica es igual a la cobertura en cada base sin corrección.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION En el contexto de la presente invención el término "sitios objetivo de recombinación que flanquean dicho por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés" significa que los sitios objetivo de recombinación están localizados 5' y 3' con respecto a dicho gen que codifica para la secuencia de interés, lo que significa que un sitio objetivo está localizado 5' y el otro sitio objetivo está localizado 3' con respecto al gen que codifica para la secuencia de interés. Los sitios objetivo de recombinación pueden estar localizados directamente adyacentes o a una distancia definida del gen que codifica para la secuencia de interés.

Las secuencias de flanqueo, en particular los sitios objetivo de recombinación de flanqueo, están posicionadas en la orientación sentido o antisentido, de preferencia ambas están en orientación sentido o de preferencia ambas están en orientación antisentido.

En una modalidad asimismo preferida de la presente invención, el sitio objetivo de recombinación es un sitio lox.

En caso que el sitio objetivo de recombinación sea un sitio FRT, las células hospederas necesitan la presencia y expresión de FLP (FLP recombinasa) para poder lograr un evento de cruza o recombinación. En caso que el sitio objetivo de recombinación sea un sitio lox, las células hospederas necesitan la presencia y expresión de la Cre recombinasa.

Ambas, la presencia y expresión de la FLP o Cre recombinasa se pueden lograr, por ejemplo, mediante introducción de secuencias de nucleótido exógenas que codifican para la FLP o Cre recombinasa dentro de una célula hospedera cuyas secuencias de nucleótido son capaces de ser expresadas en dicha célula hospedera.

La presente invención, por lo tanto, provee una célula hospedera, de preferencia una linea de célula hospedera, que incorpora una secuencia de nucleótido exógena, por ejemplo por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, en particular sitios FRT, y/o por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, en un "sitio clave" ("hot spot") predefinido, específicamente un gen FerlL4, que soporta la combinación positiva de crecimiento, productividad y estabilidad. Por ejemplo, en algunas modalidades, la expresión de un gen que codifica para la secuencia de interés en una célula hospedera SSI provista en la presente solicitud es estable a través de por lo menos 70, 100, 150, 200, ó 300 generaciones. La expresión es "estable" si ésta disminuye en menos de 30%, o se mantiene al mismo nivel o a un nivel incrementado, con respecto al tiempo. En algunas modalidades, la expresión es estable si la productividad volumétrica disminuye en menos de 30%, o se mantiene al mismo nivel o se incrementa con el paso del tiempo. En algunas modalidades, una célula hospedera SSI provista en la presente solicitud produce por lo menos 1.5 g/1, 2 g/1, 3 g/1, 4 g/1, ó 5 g/1 de un producto de expresión de un gen que codifica para la secuencia de interés. En algunas modalidades, las células SSI provistas en la presente solicitud, en particular lineas celulares, son tan estables que éstas se pueden mantener en cultivo sin ninguna selección, por lo tanto las presentes lineas celulares tienen el potencial de ser más aceptables para las agencias regulatorias. En términos de economía, la presente invención permite el desarrollo rápido y eficiente en cuanto a recursos de líneas celulares ya que se necesita tamizar menos líneas celulares en las diferentes etapas del procedimiento debido al desempeño altamente predecible de las presentes líneas celulares. Por lo tanto, se pueden desarrollar más candidatos biofarmacéuticos, por ejemplo candidatos de anticuerpo monoclonal (mAb), para un objetivo dado o más candidatos para objetivos múltiples en comparación con el procedimiento estándar. Por último, esto puede llevar a beneficio del paciente como resultado de un tiempo más corto para la fase clínica para proteínas de interés, de preferencia mAbs terapéuticos.

En el contexto de la presente invención, el término "sitio clave" significa una posición, lo que significa un sitio, en el genoma de una célula hospedera que provee una producción estable y altamente activa desde el punto de vista expresión, de preferencia desde el punto de vista de transcripción, de un producto, es decir, proteína de un gen que codifica para la secuencia de interés, en particular provee una producción fuerte y estable de la proteína codificada por el gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia en la cual el gen que codifica para la secuencia de interés se integra en dicha posición después de su transfección en la célula hospedera.

En el contexto de la presente invención, el término "sitio" se refiere a una secuencia de nucleótido, en particular un tramo definido de nucleótidos, es decir una longitud definida de una secuencia de nucleótido, de preferencia un tramo definido de nucleótidos que son parte de un tramo más grande de nucleótidos. En algunas modalidades, un sitio, por ejemplo un sitio el cual es un "sitio clave", es parte de un genoma. En algunas modalidades, se introduce un sitio en un genoma, por ejemplo un sitio objetivo de recombinación. Un "sitio objetivo de recombinación" es un tramo de nucleótidos que es necesario para y que permite, junto con una recombinasa, una recombinación dirigida y que define la localización de dicha recombinación.

En el contexto de la presente invención, el término "célula hospedera", llamada de aquí en adelante también "célula receptora", se refiere a una célula que aloja una secuencia de nucleótido exógena, de preferencia integrada de manera estable, en su genoma.

En el contexto de la presente invención, una "célula" de preferencia es una célula de mamífero, en particular una célula de roedor, de preferencia una célula de ratón, una célula de hámster, de preferencia una célula de hámster chino, de preferencia una célula de ovario de hámster chino (CHO), de preferencia una célula CHOK1, de preferencia una célula CHOK1SV. De preferencia, la célula es una célula humana. De preferencia, la célula es una célula no humana.

En el contexto de la presente invención, el término "célula" de preferencia significa la célula de una linea celular. De preferencia, el término "linea celular" se refiere a lineas celulares inmortalizadas establecidas.

El término "célula" en una modalidad también significa célula primaria.

En el contexto de la presente invención el término "célula hospedera de integración especifica de sitio (SSI)" significa una célula hospedera que comprende secuencias de nucleótido exógenas. En algunas modalidades, las secuencias de nucleótido exógenas incluyen sitios objetivo de recombinación, que permiten una integración especifica de sitio de secuencias de nucleótido exógenas, permitiendo, por lo tanto, una integración localizada y dirigida predeterminada de las secuencias de nucleótido deseadas en un lugar deseado en el genoma de una célula hospedera. Por lo tanto, en algunas modalidades, una célula hospedera de integración especifica de sitio es capaz de la integración dirigida del gen que codifica para las secuencias de interés. De manera más preferida, una célula hospedera de integración especifica de sitio es capaz de la integración dirigida de un gen que codifica para la secuencia de interés mediante intercambio de cassette mediado por recombinación (RMCE). De preferencia, dicho procedimiento introduce sólo una copia funcional de un gen que codifica para la secuencia, de preferencia sólo una copia de un gen que codifica para la secuencia de interés en un locus predeterminado. De preferencia, el procedimiento no co-introduce secuencias de vector, por ejemplo secuencias de vector procariota, dentro de la célula hospedera.

En una modalidad preferida adicional, se introducen dos copias funcionales de un gen que codifica para la secuencia de interés en la célula hospedera SSI.

En el contexto de la presente invención, el término "gen marcador para selección" se refiere a una secuencia de nucleótido, en particular un gen que codifica para secuencia, que significa una secuencia de nucleótido que codifica para proteina, denominada de aquí en adelante también región, bajo control regulatorio y funcional de por lo menos un elemento regulador, en particular un promotor, en el cual dicha región codificadora de proteina codifica para una proteina que permite la selección de células hospederas que expresan dicha proteina.

En el contexto de la presente invención, el término FRT significa Objetivo de Reconocimiento de FLP. El FRT es una secuencia de nucleótido de 34 pares de bases de longitud que permite una teenología de recombinación dirigida a sitio que permite la manipulación del ADN de un organismo bajo condiciones controladas in vivo. El FRT es ligado por la FLP recombinasa (FLP) la cual posteriormente corta dicha secuencia y permite la recombinación de secuencias de nucleótido integradas entre dos sitios FRT. Para RMCE, se requieren dos eventos de cruza mediados por dos secuencias objetivo de recombinasa de flanqueo, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3' del cassette que se va a intercambiar. Una cruza puede ocurrir entre dos sitios FRT idénticos. El uso de sitios FRT también requiere la expresión y presencia de la FLP recombinasa. El sistema completo llamado también en la presente solicitud "FRT/FLP", se describe en Seibler y Bode, Biochemistry 36 (1997), páginas 1740 a 1747, y Seibler et al., Biochemistry 37 (1998), páginas 6229 a 6234.

En el contexto de la presente invención, un gen FerlL4 es el gen de tipo silvestre FerlL4, todas sus isoformas y todos sus homólogos, en particular en tanto que los homólogos tengan una homología de secuencia de por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 95, por lo menos 96, por lo menos 97, por lo menos 98, por lo menos 99 o por lo menos 99.5% con el gen FerlL4 de tipo silvestre, de preferencia a lo largo de la longitud completa del gen FerlL4 de tipo silvestre, de preferencia el gen FerlL4 de hámster de tipo silvestre, que de preferencia tenga las coordenadas 1176191 a 1781992 del NCBI número de acceso NW 003613833 o JH000254.1, de preferencia el gen FerlL4 de CHO de tipo silvestre o una forma acortada del mismo.

De manera más preferida, el gen FerlL4 de tipo silvestre presente en las células hospederas SSI de la presente solicitud está caracterizado en primer lugar por el sitio de integración 5' de la secuencia de flanqueo localizada 5' está localizada entre el exón 39 y el 40 y en segundo lugar, el sitio de integración 3' de la secuencia de flanqueo localizada en 3' está localizada entre el exón 28 y el 29. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la integración de las secuencias exógenas implica partes del gen FerlL4 endógeno, de preferencia la región que abarca e incluye los exones 28 a 40. En algunas modalidades, por lo menos una porción del gen FerlL4 está eliminada en una célula hospedera SSI.

En la presente invención, "homólogos" o "secuencias homologas" son secuencias de nucleótido, las cuales tienen la homología de secuencia identificada anteriormente con la secuencia comparativa específicamente dada, por ejemplo con el gen FerlL4 de CHO de tipo silvestre o partes del mismo, por ejemplo, SEQ ID NO: 7, 8 ó 9.

En el contexto de la presente invención, el término "homología de secuencia" se refiere a una medida del grado de identidad o similitud de dos secuencias tomando como base una alineación de las secuencias la cual aumenta al máximo la similitud entre los nucleótidos alineados, y la cual es una función del número de nucleótidos idénticos, el número de nucleótidos totales, y de la presencia y longitud de espacios en la alineación de secuencia. Están disponibles una variedad de algoritmos y programas de computadora para determinar la similitud de secuencia utilizando parámetros estándar. De preferencia, la homología de secuencia se mide utilizando el programa BLASTn para secuencias de ácido nucleico, el cual está disponible a través del Centro Nacional para Información sobre Bioteenología (www.ncbi.nlm.nih.gov/), y se describe en, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J Mol. Biol. 215:403-410; Gish y States (1993), Nature Genet.3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266: 131-141; Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res.25:3389-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol.7(1-2):203-14. De preferencia, la homología de secuencia de dos secuencias de nucleótido es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de palabra = 11, castigo por abertura de espacio = -5; castigo por extensión de espacio = -2, premio por coincidencia = 1; y castigo por no coincidencia = -3.

Por lo tanto el gen FerlL4 puede ser el gen FerlL4 de CHO por sí mismo o también puede ser por ejemplo un gen FerlL4 de humano, por ejemplo Disferlina (FerlLl), Otoferlina (FerlL2), Mioferlina (FerlL3), FerlL4, FerlL5, o FerlL6.

De preferencia, el presente gen FerlL4 tambien puede ser el gen FerlL4 de C. elegans (ID del gen del NCBI: 172659, WormBase: WBGene00001414) o cualquier otro miembro de la familia de ferlina de la cual existen seis miembros en células de mamífero. Las ferlinas facilitan la fusión vascular, específicamente los eventos de difusión de membrana. Ferl de C. elegans es requerido para la fusión de los organelos a la membrana plasmática y la reproducción normal en gusanos (Achanzar, W. E., y Ward, S., J. Cell Sci. 110 (1997), 1073-108; Washington, N. L, y Ward, S., J. Cell Sci.119 (2006), 2552-2562).

Junto con un ancla C-terminal, los miembros de la familia de ferlina de mamífero también contienen dominios C2 múltiples (6 ó 7) (Sutton RB et al. Cell 80 (1995), 929-38; Shao et al. Science 273 (1996), 248-251). Por lo tanto, los genes que codifican para los dominios C2 son considerados también de aquí en adelante como homólogos al presente gen FerlL4 de tipo silvestre.

En el contexto de la presente invención, el término "gen exógeno" o "secuencia de nucleótido exógena" se refiere a una secuencia de nucleótido introducida dentro de una célula hospedera, por ejemplo, mediante métodos de ingeniería genética convencionales, de preferencia por medio de transformación, electroporación o transíección, la cual, antes de dicha introducción, no está presente en dicha célula hospedera. Dichas secuencias también son denominadas "transgénicas".

El término "gen endógeno" o "secuencia de nucleótido endógena" se refiere a una secuencia de nucleótido que se origina a partir de y que está presente en una célula hospedera y por lo tanto no es introducida en la misma desde el exterior de dicha célula hospedera.

El término "secuencia de nucleótido" o "polinucleótido" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere de preferencia a ácidos nucleicos, de preferencia un ADN o ARN.

En una modalidad preferida de la presente invención, un gen que codifica para la secuencia de interés flanqueado por dicho por lo menos dos sitios objetivo de recombinación es un gen marcador para selección o un gen que codifica para la secuencia que codifica para un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un derivado de anticuerpo, una proteína de fusión, una enzima o una proteína biológicamente activa, por ejemplo un factor de crecimiento u hormona peptídica, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, una interleucina, un interferón, etc., en particular una proteína farmacéutica o nutricionalmente funcional. De preferencia, el gen que codifica para la secuencia de interés es exógeno para la célula hospedera.

En modalidades asimismo preferidas, el gen que codifica para la secuencia de interés puede ser también una parte estructuralmente o funcionalmente definida de un gen, por ejemplo un fragmento de un anticuerpo, tal como una cadena pesada o ligera del mismo o una parte de una proteina funcional. En algunas modalidades, un gen que codifica para la secuencia de interés puede codificar para un producto de expresión que comprende una parte estructuralmente o funcionalmente definida de un polipéptido, por ejemplo, un dominio discreto, conjunto de dominios, o porción de un dominio, tal como una cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una región constante de un anticuerpo.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a la célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención, en la cual el marcador para selección es el marcador para selección de GS, el marcador para selección de higromicina, el marcador para selección de puromicina o el marcador para selección de timidina cinasa.

En el contexto de la presente invención, el marcador para selección de GS, codificado por un gen marcador de GS, funciona en un sistema de marcador de GS. Por consiguiente, en ausencia de glutamina en el medio de crecimiento, la actividad de glutamina sintetasa (GS) es esencial para la supervivencia de las células de mamífero en cultivo. Algunas líneas celulares de mamífero, tal como las líneas de mieloma de ratón, no expresan suficiente GS para sobrevivir sin glutamina agregada. Con estas líneas celulares un gen de marcador de GS transfectado puede funcionar como un marcador seleccionable al permitir el crecimiento en un medio libre de glutamina. Otras líneas celulares, tales como las líneas celulares de ovario de hámster chino, expresan suficiente GS para sobrevivir sin glutamina exógena. En estos casos, se puede utilizar el inhibidor de GS metionina-sulfoximina (MSX) para inhibir la actividad de GS endógena de modo tal que sólo los transfectantes con actividad de GS adicional puedan sobrevivir.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a la célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención, en la cual la célula hospedera es una célula hospedera CHO o una célula hospedera CHOK1SV (Porter, AJ et al. Biotechnol Prog.26 (2010), 1455-1464).

La presente invención también se refiere en una modalidad preferida a células hospederas SSI, en las cuales las secuencias exógenas están integradas en una ubicación que abarca desde la posición 1750049 (sitio de integración 5') hasta 1760965 (sitio de integración 3') (véase figura 7). Las secuencias de flanqueo de preferencia están localizadas en las coordenadas de andamio 1750049 hasta 1750870 (extremo 5', SEQ ID NO: 9, 822 pb) y 1758964 hasta 1760965 (extremo 3', SEQ ID NO: 7 y 8, 2000 pb) (véase figura 7).

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a la célula hospedera SSI de la presente invención, en la cual las secuencias de nucleótido del gen FerlL4 que flanquean las secuencias de nucleótido exógenas integradas, específicamente dicho por lo menos un gen que codifica para las secuencias de interés el cual por sí mismo está flanqueado en su extremo 5' y 3' por un sitio objetivo de recombinación cada uno, se seleccionan a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y una secuencia homologa de las mismas.

En una modalidad preferida de la presente invención, las secuencias de flanqueo que son homologas a las secuencias dadas en SEQ ID NO: 7, 8 o 9 tienen una homología de secuencia de por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 95, por lo menos 96, por lo menos 97, por lo menos 98, por lo menos 99 o por lo menos 99.5% con estas regiones del gen FerlL4 de tipo silvestre, de preferencia a lo largo de sus longitudes completas.

Por lo tanto, en una modalidad particularmente preferida, la célula hospedera SSI de la presente invención está caracterizada por la presencia de secuencias de nucleótido exógenas, específicamente dicho por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, el cual por sí mismo está flanqueado en sus extremos 5' y 3' por un sitio objetivo de recombinación cada uno, y en la cual por lo menos una de las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 7 u 8 o una secuencia homologa de las mismas está localizada en el extremo 3' de las secuencias de nucleótido exógenas integradas en el genoma de la célula hospedera.

Por lo tanto, en una modalidad particularmente preferida la célula hospedera SSI de la presente invención está caracterizada por la presencia de secuencias de nucleótido exógenas, específicamente dicho por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, el cual por sí mismo está flanqueado en sus extremos 5' y 3' por un sitio objetivo de recombinación cada uno, y en la cual por lo menos una secuencia de nucleótido como la dada en SEQ ID NO: 9 o una secuencia homologa de la misma está localizada en el extremo 5' de las secuencias de nucleótido exógenas integradas en el genoma de la célula hospedera.

De preferencia, la célula hospedera SSI comprende la secuencia de nucleótido exógena, específicamente por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés el cual por sí mismo está flanqueado en el extremo 5' y 3' por un sitio objetivo de recombinación cada uno, el cual está flanqueado en su extremo 3' por al menos una de las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 7, 8 o una secuencia homologa de las mismas y en su extremo 5' por una secuencia de nucleótido dada en SEQ ID NO: 9 o una secuencia homologa de la misma.

En una modalidad particularmente preferida, las secuencias de flanqueo 5' y/o 3' dadas de SEQ ID NO: 7, 8, 9 o una secuencia homologa de las mismas están localizadas directamente adyacentes y sin ninguna secuencia intercalada al extremo 5' cual extremo 3' o al extremo 5' y al extremo 3' del sitio o sitios objetivo de recombinación integrados en el gen FerlL4.

En una modalidad asimismo preferida de la presente invención se provee una molécula de nucleótido aislada, de preferencia polinucleótido, que comprende una porción de un gen FerlL4, por ejemplo que comprende por lo menos una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de las secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y una secuencia homologa de las mismas.

Se prefiere en particular una molécula de nucleótido aislada, de preferencia polinucleótido, que consiste de por lo menos una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de las secuencias de nucleótido como se dan en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y una secuencia homologa de las mismas.

En una modalidad asimismo preferida de la presente invención, se provee un vector, de preferencia un vector de expresión, que comprende la molécula de nucleótido aislada de la presente invención, en particular SEQ ID NO: 7, 8, 9 u homólogos de las mismas y una célula hospedera transfectada que comprende dicho vector o dicha molécula de nucleótido.

La secuencia de ácido nucleico que define al locus de FerlL4, es decir, la secuencia de ácido nucleico del gen FerlL4, es decir la secuencia de nucleótido de FerlL4, en particular secuencias de nucleótido que se seleccionan a partir del grupo que consiste de las secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas, se identifican en la presente solicitud empíricamente por las secuencias hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' del sitio de integración de una construcción de ácido nucleico que comprende un cassette de expresión de una línea celular que expresa una proteína reportera a un nivel alto. Éstas secuencias de ácido nucleico de la invención proveen secuencias con una nueva funcionalidad asociada con expresión incrementada y estable de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que comprende un gen que codifica para la secuencia de interés que parece funcionar en forma diferente de aquélla previamente descrita para elementos que actúan en cis tal como los promotores, incrementadores, regiones de control del locus, regiones de unión al andamio o regiones de unión a matriz.

Las presentes secuencias de nucleótido no parecen tener ningún marco de lectura abierto (ORF), haciendo improbable que estas codifiquen para proteínas trans-activadoras. Los experimentos de transfección demuestran que las presentes secuencias despliegan algunas características de elementos que actúan en cis. La actividad de la presente secuencia no es detectada en pruebas de transfección transitoria; las presentes secuencias también parecen ser distintas de·los elementos de promotor e incrementador, los cuales son detectados con estos métodos.

La presente invención también se refiere al uso de una secuencia de nucleótidos de FerlL4, en particular una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas, en un vector, en particular un vector de expresión, en particular un vector de expresión de tipo no RMCE que comprende por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, en particular para producir líneas celulares, de preferencia en un procedimiento aleatorio, en particular para producir lineas celulares que muestran expresión incrementada, en particular para producir lineas celulares de alta producción, de preferencia en frecuencias más altas y las cuales de preferencia proveen mayor estabilidad de productividad. De preferencia, dicho uso contempla la transfección de células con las secuencias de nucleótido de FerlL4 antes identificadas, de preferencia vectores que contienen dichas secuencias de nucleótido y obtener lineas de células establemente transfectadas a partir de las mismas.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para producir células o lineas celulares, de preferencia células o lineas celulares de alta producción con alta estabilidad de productividad, en las cuales las secuencias de nucleótido de FerlL4, en particular secuencias de nucleótido que se seleccionan a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas, de preferencia integradas en un vector, de preferencia un vector de expresión, de preferencia un vector de expresión tipo no RMCE, se transfectan en células o lineas celulares y se seleccionan y se obtienen células o lineas celulares establemente transfectadas. La presencia de secuencias del locus de FerlL4 o partes del mismo como se identifica en la presente solicitud provee un efecto que actúa en cis a los genes de interés con lo cual se incrementan sus expresiones en donde sea que éstos estén integrados en el genoma. Se espera que las lineas celulares generadas de esta manera en un procedimiento aleatorio muestren mayor estabilidad de productividad.

La presente invención de preferencia se refiere a un uso de una secuencia de nucleótido de FerlL4 en un vector de expresión para la producción de una linea celular o célula estable y altamente activa desde el punto de vista de transcripción.

La presente invención de preferencia se refiere al uso antes identificado, en el cual la secuencia de nucleótido de FerlL4 se selecciona a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID NO: 7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas.

La presente invención de preferencia se refiere a un método para la producción de un producto de un gen que codifica para la secuencia de interés que comprende cultivar una célula hospedera que se produce de conformidad con el presente método para producir una célula o linea celular en un medio apropiado y recuperar el producto a partir del mismo.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a una célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención, en la cual las secuencias de nucleótido exógenas incluyen por lo menos un sitio FRT de tipo silvestre, de preferencia por lo menos dos sitios FRT de tipo silvestre, que flanquean por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, o por lo menos un sitio FRT mutante, de preferencia por lo menos dos sitios FRT mutantes que flanquean por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés. De manera más preferida, las secuencias de nucleótido exógenas son un sitio FRT de tipo silvestre y un sitio FRT mutante que flanquean por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés. Particularmente preferido, un gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia un gen marcador para selección, está localizado entre un FRT de tipo silvestre, de preferencia localizado 5' con respecto al gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección, y un sitio FRT mutante, de preferencia localizado 3' con respecto al gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección. Esto de preferencia asegura que el intercambio de cassette mediado por recombinación ocurra siempre en la misma orientación.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a un método para producir una célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención que comprende los pasos de a) transfectar una célula, que de preferencia comprende un gen FerlL4 endógeno, con un primer vector que comprende un primer cassette intercambiable, el cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, en particular sitios FRT, que flanquean por lo menos un primer gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia que codifica para un mAb, posteriormente b) seleccionar las células transfectadas que comprenden dichos por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, en particular sitios FRT, que flanquean por lo menos un primer gen que codifica para las secuencias de interés integrados en el gen FerlL4 endógeno y que muestran una producción alta y estable del producto del primer gen que codifica para la secuencia de interés; posteriormente c) transfectar las células obtenidas en el paso b) con un segundo vector que comprende un segundo cassette intercambiable, el cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación coincidentes, en particular sitios FRT, que flanquean por lo menos un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un gen marcador para selección, posteriormente d) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio y posteriormente e) seleccionar las células transfectadas que expresan al segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección, para de esta manera obtener la célula hospedera SSI que comprende el segundo cassette intercambiable establemente integrado en su genoma de conformidad con la presente invención (véase por ejemplo figura 4).

De preferencia, el primer y segundo genes que codifican para la secuencia de interés están flanqueados en uno de sus extremos por un primer sitio objetivo de recombinación y en su otro extremo por un segundo sitio objetivo de recombinación el cual es diferente del primer sitio objetivo.

Por lo tanto, la presente invención provee un método para producir una célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención cuyo método utiliza un intercambio de cassette mediado por recombinasa y en el curso del cual un primer cassette intercambiable que comprende un primer gen que codifica la secuencia de interés, que de preferencia codifica para un mAb, flanqueado por sitios objetivo de recombinación es transfectado mediante un vector en una célula hospedera, integrado en el genoma de la célula hospedera, en particular un "sitio clave" del mismo, y después de la selección de los transfectantes del "sitio clave" un segundo cassette intercambiable, por ejemplo que es parte del plásmido de intercambio circular y que está constituido por lo menos por un gen que codifica para la secuencia de interés, en particular un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia un gen marcador para selección, que está flanqueado por sitios objetivo de recombinación coincidentes es transfectado en la célula hospedera y se deja recombinar con lo cual se intercambia el primer gen que codifica para la secuencia de interés por el segundo gen que codifica para la secuencia de interés (véase por ejemplo figura 4). De manera conveniente, solamente una copia del gen que codifica para la secuencia de interés se inserta en el locus predeterminado y ninguna de las secuencias de vector, en particular secuencias de plásmido del plásmido de intercambio está integrada en el genoma hospedero.

El presente método para producir una célula hospedera SSI es conveniente en la medida en la que en los pasos a) y b) se pueda identificar un "sitio clave" que muestre una producción alta y estable de un producto de un gen que codifica para la secuencia de interés utilizando por lo menos un primer gen que codifica para la secuencia de interés, por ejemplo un gen que codifica para un anticuerpo, por ejemplo, un mAb, o una parte del mismo y que sea un gen de utilidad industrial, por ejemplo una proteina biofarmacéuticamente relevante, y que en los pasos c), d) y e) dicho primer gen que codifica para la secuencia de interés que es utilizado para identificar el "sitio clave" de interés sea intercambiado completamente por un denominado cassette nulo, en particular por un segundo cassette intercambiable que comprende por lo menos un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un gen marcador para selección. De esta manera se crea una célula hospedera SSI libre de secuencias preexistentes del primer gen que codifica para la secuencia de interés utilizado para la identificación del "sitio clave" lo cual permite un intercambio adicional de cassette mediado por recombinasa para colocar en dicho "sitio clave" otro gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un tercer gen que codifica para la secuencia de interés que reemplaza al segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección. Por lo tanto, las células hospederas SSI actualmente obtenidas se pueden utilizar para efectuar intercambio adicional de cassette mediado por recombinasa para colocar un tercer gen que codifica para la secuencia de interés en el genoma de la célula hospedera en el "sitio clave" identificado.

En el contexto de la presente invención, el término "sitios objetivo de recombinación coincidentes" significa que un primer sitio de dichos sitios objetivo de recombinación de un cassette intercambiable es idéntico a un primer sitio objetivo de recombinación de otro cassette intercambiable y que un segundo sitio objetivo de recombinación del cassette intercambiable mencionado en primer lugar es idéntico al segundo sitio objetivo de recombinación del otro cassette intercambiable con lo cual se permite un intercambio de las secuencias de nucleótido entre los sitios objetivo de recombinación. De preferencia, el primer sitio objetivo de recombinación de ambos cassettes intercambiables es diferente del segundo sitio objetivo de recombinación de ambos cassettes intercambiables.

La presente invención se refiere en una modalidad preferida a un método para producir el producto de un gen que codifica para la secuencia de interés que comprende los pasos de i) transfectar una célula hospedera SSI de conformidad con la presente invención con un vector que comprende por lo menos un tercer cassette intercambiable, cuyo cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación coincidentes que flanquean por lo menos un tercer gen que codifica para la secuencia de interés y por lo menos un marcador para selección, ii) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio para obtener una célula hospedera SSI que comprende el tercer gen que codifica para la secuencia de interés, iii) permitir que la célula hospedera SSI obtenida en el paso ii) exprese el tercer gen que codifica para la secuencia de interés y iv) recuperar el producto del tercer gen que codifica para la secuencia de interés.

Una ventaja importante de la presente invención es la provisión de una estabilidad de producción intrínseca que es heredada de la célula hospedera SSI generada en el paso b) que comprende el primer gen que codifica para la secuencia de interés en un "sitio clave" identificado, específicamente el gen FerlL4, todo el camino hasta una célula hospedera SSI que comprende el tercer gen que codifica para la secuencia de interés. Esta estabilidad es independiente de la selección y permite la conclusión de que el "sitio clave" identificado en los pasos a) y b) como características asociadas con secuencias alrededor del "sitio clave" o en alguna otra parte en el genoma. En una construcción de línea celular basada en integración de vector aleatoria esto es un evento muy raro y el esfuerzo previo para encontrar dicho sitio es inmenso. Por lo tanto, la presente invención permite la eliminación de estudios de estabilidad prolongados para la selección de líneas celulares apropiadas que resultan en un ciclo de desarrollo más corto general y reducción de recursos. Asimismo, la presente invención permite cultivar células sin selección después del intercambio de cassette mediado por recombinación, lo que significa que el procedimiento de fabricación es potencialmente más aceptable para las agencias regulatorias. De manera conveniente, el presente "sitio clave FerlL4" se define e identifica utilizando un mAb, de preferencia sin utilizar un marcador de fluorescencia.

La presente invención provee un método para producir una célula hospedera SSI en la cual se introduce una secuencia de nucleótido exógena en un gen FerlL4 endógeno en una célula mediante integración dirigida. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos para dirigir una secuencia de nucleótido hacia un sitio de interés especificado en el genoma, e incluyen recombinación homologa, y métodos mediados por nucleasa por ejemplo el uso de recombinación homologa mediada por parvovirus, el uso de nucleasas de dedo de zinc, nucleasas efectoras tipo activador de transcripción o meganucleasas diseñadas (véase, por ejemplo Russell e Hirata, Nat. Med.18(4):325-30, 1998; publicación de patente E.U.A. No.20120070890; patente E.U.A. No.6,528,313; publicación de patente E.U.A. No. 20090258363). Una secuencia de nucleótido exógena introducida por dicho método puede incluir cualquiera de las características descritas en la presente solicitud. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido exógena puede incluir por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés y/o por lo menos dos sitios objetivo de recombinación. En algunas modalidades, el gen que codifica para la secuencia de interés comprende por lo menos un gen marcador para selección.

En una modalidad adicional la presente invención se refiere a un método para producir una célula hospedera SSI, el método comprende introducir una secuencia de nucleótido exógena en un gen FerlL4 endógeno en una célula. De preferencia, la secuencia de nucleótido exógena se introduce mediante recombinación homologa entre el gen FerlL4 y un polinucleótido, en el cual el polinucleótido comprende a) una primera secuencia de nucleótido homologa a una primera porción del gen FerlL4, b) la secuencias de nucleótido exógena, y c) una segunda secuencia de nucleótido homologa a una segunda porción del gen FerlL4. En esta modalidad adicional, la introducción de la secuencia de nucleótido exógena de preferencia se facilita utilizando un vector viral por ejemplo, un vector de virus adeno-asociado el cual media la recombinación homologa o una nucleasa exógena por ejemplo, una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa efectora tipo activador de transcripción, o una meganucleasa diseñada. Particularmente preferido, se utiliza un vector de virus adeno-asociado. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de nucleótido exógena está flanqueada por sitios objetivo de recombinación, de preferencia sitios loxP.

La presente invención se refiere en un aspecto A también a un método para producir una célula hospedera SSI que comprende los pasos de a) proveer una célula que comprende un gen FerlL4 endógeno, en el cual se integra una secuencia de nucleótido endógena en dicho gen FerlL4, y en el cual la secuencia de nucleótido endógena comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, que flanquean por lo menos un primer gen que codifica para la secuencia de interés; posteriormente b) transfectar las células provistas en el paso a) con un vector que comprende un primer cassette intercambiable, el cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo recombinantes coincidentes, que flanquean por lo menos un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un gen marcador para selección, posteriormente c) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio y posteriormente d) seleccionar las células transíectadas que expresan el segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección, para obtener la célula hospedera SSI que comprende el primer cassette intercambiable establemente integrado en su genoma.

La presente invención se refiere también a un método para producir una célula hospedera SSI que comprende los pasos de a) proveer una célula que comprende un gen FerlL4 endógeno, en el cual se integra una secuencia de nucleótido exógena en dicho gen FerlL4, y en el cual la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, que flanquean por lo menos un primer gen que codifica para la secuencia de interés; posteriormente b) transfectar las células provistas en el paso a) con un vector que comprende un primer cassette intercambiable, el cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo recombinantes coincidentes, que flanquean por lo menos un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un gen marcador para selección, posteriormente c) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio y posteriormente d) seleccionar las células transfectadas que expresan el segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador para selección, para obtener la célula hospedera SSI que comprende el primer cassette intercambiable establemente integrado en su genoma.

La presente invención también se refiere al método antes identificado del aspecto ? que comprende además i) transfectar la célula hospedera SSI con un vector que comprende por lo menos un segundo cassette intercambiable, cuyo cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación coíncidentes que flanquean por lo menos un tercer gen que codifica para la secuencia de interés y por lo menos un marcador para selección, ii) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio para obtener una célula hospedera SSI que comprende el tercer gen que codifica para la secuencia de interés, iii) permitir que la célula hospedera SSI obtenida en el paso ii) exprese el tercer gen que codifica para la secuencia de interés y iv) recuperar el producto del tercer gen que codifica para la secuencia de interés.

La presente invención también provee el uso de una célula, de preferencia una célula CHO, que comprende un gen FerlL4 endógeno, de preferencia un gen FerlL4 de CHO, para la producción de una linea celular estable y altamente activa desde el punto de vista de transcripción.

Antes que la presente invención se describa con mayor detalle, se debe entender que esta invención no está limitada a las modalidades particulares descritas, ya que las mismas desde luego, pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente solicitud es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no está pensada para que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención quedará limitado únicamente por las reivindicaciones anexas.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente solicitud tienen el mismo significado de aquel comúnmente entendido por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente solicitud en la práctica o análisis de la presente invención, a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente solicitud quedan incorporadas en la misma para referencia para describir y divulgar los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones. Se entiende que la presente descripción remplaza cualquier divulgación de una publicación incorporada hasta el grado en que haya una contradicción.

Se debe indicar que tal como se utiliza en la presente solicitud y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un" "una", y "el (la)" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte de otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el vector" incluye la referencia a uno o más vectores y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

Las publicaciones discutidas en la presente solicitud se proveen únicamente por sus divulgaciones antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente solicitud debe ser considerado como una admisión de que la presente invención no tiene el derecho a preceder dicha publicación en virtud de la invención antecedente. Además, las fechas de publicación provistas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales lo cual tendría que ser confirmado en forma independiente.

Las modalidades preferidas adicionales son la materia objeto de las sub-reivindicaciones.

SEQ ID No.1 a 3 representan las secuencias de nucleótido de los vectores utilizados en la presente invención, SEQ ID No. 4 a 6 representan los iniciadores utilizados en la presente invención, SEQ ID No. 7 y 8 representan las secuencias localizadas en 3' del gen de CHO FerlL4, SEQ ID No. 9 representa una secuencia localizada en 5' del gen de CHO FerlL4 y SEQ ID No. 10 y 11 representa iniciadores adicionales utilizados en la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 A) Materiales y métodos 1. Construcción del vector Todas las secuencias de vector se sintetizan y se secuencian completamente. Los genes de puromicina acetil-transferasa (PAC), higromicina fosfotransferasa (Hyg) y mAb se optimizan todos en cuanto a gen y se adaptan a la preferencia codónica (codon bias) de Cricetulus griseus antes de la síntesis del gen. La mayoría de pRY17 (figura 1) se deriva a partir de pCB72.3-GA-HC-LC (Kalwy et al. (2006), Mol Biotechnol. 34. páginas 151 a 156). Las secuencias para las secuencias de recombinación de FRT de tipo silvestre (F) y FRT F5 (F5), presentes en todos los vectores, se dan en Schlake y Bode (Schlake y Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751). Las secuencias de plantilla (antes de la síntesis del gen con o sin optimización del gen se obtuvieron de las siguientes fuentes: Fusión en marco de la secuencia de recombinación F y el enlazador en el vector pRY17 (figura 1) se tomaron a partir del vector pFRT/lacZeo (Invi-trogen). La fusión en marco del codón de inicio de metionina y la secuencia de recombinación F en pRY21 (figura 3) se obtienen a partir de pcDNAT5/FRT (Invitrogen). En todos los vectores, los promotores tempranos de SV40 utilizados (además del asociado con la unidad de transcripción de GS, la cual se obtiene a partir de pCB72.3-GA-HC-LC), se obtuvieron a partir de los vectores de Invitrogen antes mencionados. Las secuencias de gen de timidina cinasa (TK) y de PAC en pRY37 se obtuvieron a partir de pWSTK6 (gb:EU530625) y pPUR (Clontech, gb:U07648), respectivamente. 2. Análisis de matraz de agitación de lote alimentado y de lote Para el análisis de matraz agitado por lote, las células se siembran a 3 x 105 células viables/ml en matraces de agitación de 125 mi en 30 mi de CD CHO suplementado con varios agentes selectivos (como se describe posteriormente) y se incuban a 37°C en una incubadora de agitación orbital humedecida con 5% de CO2 en aire (v/v) a 140 rpm. El medio acondicionado se recolecta en el día 7 del cultivo y la concentración de anticuerpo en el medio acondicionado se determina mediante HPLC con Proteína A.

Para el análisis de matraz agitado de lote alimentado, las células se siembran a 3 x 105 células/ml en matraces de agitación de mi, conteniendo cada uno 100 mi de medio registrado y se incuban a 37°C en una incubadora de agitación orbital humedecida con 5% de C02 en aire (v/v) a 140 rpm. Las células se alimentan comenzando en el día 3 del cultivo con un alimento registrado gue consiste de una mezcla de aminoácido y elementos traza. Las viabilidades y concentraciones de célula viable diarias se determinan utilizando un analizador de viabilidad celular automatizado Vi-CELL™. La concentración de anticuerpo en el medio se determina mediante HPLC con Proteina A comenzando en el dia 6 del cultivo hasta su recolección en el dia 14. 3. Análisis de estabilidad Las células se sub-cultivan en forma alternada cada 3 y 4 dias en matraz de agitación de 125 mi en 30 mi de CD CHO suplementado con diferentes agentes de selección (como se describe posteriormente). En números de generación diferentes (1 generación es equivalente a 1 duplicación de la población), se establecen matraces de agitación de lote alimentado duplicados como se describió anteriormente. Las mediciones de concentración celular, viabilidad y concentración de mAb se recolectan como se describió anteriormente. Si la productividad de una linea celular cambia en > 30% dentro de 70 generaciones, entonces ésta se considera como inestable. 4. Citometria de flujo para clonación de célula individual La clonación de célula individual se efectúa en un clasificador de célula FACS Aria II equipado con software FACSDiva v6.0 con un láser enfriado por aire que emite a 488 nm. Las células muertas se excluyen en una gráfica de puntos de FSC contra SSC, y los dobletes se excluyen en una gráfica de puntos de anchura de FSC 'contra área. La compuerta de clasificación para las células vivas es una combinación de las dos gráficas de puntos. 5. Generación de celulas hospederas SSI La transfección de la linea celular progenitora que expresa pRY17 con el vector nulo, pRY37, que comprende el segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente el gen marcador para selección, se efectúa utilizando el sistema Freestyle™ MAX CHO (Invitrogen). Para este fin, 24 horas antes de la re-transfección para RMCE, una línea celular transfectada con pRY17 seleccionada (11A7) se siembra primero en medio de expresión de CHO Freestyle™ a 5 x 105 células/ml en un matraz de agitación de 125 mi. En el día de la transfección, se co-transfectan aproximadamente 3 x 107 células a una concentración de 1 x 106 células/ml con 33.75 mg del plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 3.75 pg de pRY37 (9:1) con reactivo Freestyle™ MAX en un matraz de agitación de 125 mi de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, las células se siembran en placas de 48 cavidades que contienen medio registrado definido con químico suplementado con 25 pM de MSX y 7 mg/ml de puromicina. Tres semanas después de la siembra, los medios provenientes de cada cavidad que contienen células viables se tamizan respecto a la producción de anticuerpo en un ForteBio utilizando biosensor de Proteína A. Los medios provenientes de líneas celulares sin anticuerpo detectable se pasan a matraces de agitación de 125 mi que contienen medio CD CHO suplementado con 25 mM de MSX y 1 mg/ml de puromicina. 6. Generación de lineas celulares derivadas del hospedero 10E9 Los experimentos de RMCE se dividen en 3 "rondas" distintas, y son referidas tanto aquí como posteriormente en la sección de resultados más adelante (las rondas se definen en la figura 6).

En las rondas 1 y 2, la transfección de la célula hospedera SSI 10E9 con el vector para elegir como blanco a SSI, pRY21 se efectúa utilizando el sistema Freestyle™ MAX CHO (Invitrogen). Para este fin, 24 horas antes de la re-transfección para RMCE, las células hospederas SSI 10E9 se siembran primero a una concentración de 5 x 105 células/ml en un matraz de agitación de 125 mi que contiene medio de expresión de CHO Freestyle™ (Invitrogen) suplementado con 25 mM de MSX y 1 pg/ml de puromicina. En el día de la transfección, se co-transfectan aproximadamente 3 x 107 células a una concentración de 1 x 106 células/ml con 33.75 pg de plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 3.75 mg de pRY21 (9:1) con reactivo Freestyle™ MAX en un matraz de agitación de 125 mi de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, las células se recuperan en un matraz de agitación de 125 mi que contiene 30 mi de medio de expresión de CHO Freestyle™ (Invitrogen) suplementado con 25 mM de MSX.48 horas después de RMCE los transfectantes provenientes de la ronda 1 se siembran en placas de 48 cavidades que contienen medio registrado definido con químico suplementado con 25 mM de MSX, 400 pg/ml de higromicina (selección positiva) y 3 mM de ganciclovir (selección negativa). Cuatro semanas después, la concentración de mAb en el medio proveniente de las cavidades que contienen foci visibles se determina en un ForteBio Octect utilizando un biosensor de Proteína A. las células que secretan mAb en el medio se expanden y se mantienen en matraces de agitación que contienen medio CD CHO suplementado con 200 mg/ml de higromicina y 25 mM de MSX. Estos grupos de células se evalúan además respecto a productividad de anticuerpo en análisis de matraz de agitación por lotes (como se describió anteriormente). Para el análisis de estabilidad, MSX se retira del sub-cultivo para la condición especificada en la figura 6.

Después de recuperar durante 48 horas en matraces de agitación, los transfectantes de la ronda 2 se siembran a una concentración de 5 x 105 células/ml en un matraz de agitación de 125 mi que contiene medio CD CHO suplementado con 400 pg/ml de higromicina (selección positiva). Esto es seguido por la adición de las 3 mM de ganciclovir 5 días después como la selección negativa. Las células se pasan continuamente cada 3-4 días en el mismo medio durante 3 semanas en el mismo matraz de agitación. Las células sobrevivientes se someten a clonación de célula individual utilizando un FACS Aria II en placas de 96 cavidades que contienen medio registrado definido con químico suplementado con 400 mg/ml de higromicina y 3 pM de ganciclovir. Tres semanas después, la concentración de mAb en el medio proveniente de las cavidades con crecimiento celular visible se determina en un ForteBio Octect utilizando un biosensor de Proteína A. Los clones que secretan mAb en el medio de cultivo se expanden y se mantienen en matraces de agitación que contienen CD CHO suplementado con 200 pg/ml de higromicina y 25 mM de MSX. Estos clones se evalúan además respecto a productividad de anticuerpo en análisis de matraz de agitación por lotes (como se describió anteriormente). Para el análisis de estabilidad, MSX se retira del sub-cultivo para las condiciones como se especifican en la figura 6.

Para la ronda 3 de transfecciones, se co-transfectan 1 x 107 células hospederas SSI 10E9 mediante electroporación con 45 mg de plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 5 pg de pRY21 a 900 pF, 300V. Después de la transíección, las células se siembran en un matraz T-75 que contiene 20 mi de medio registrado definido con químico. Después de 48 horas, se agregan ya sea 200 o 400 pg/ml de higromicina al medio seguido por la adición de 3 mM de ganciclovir 6 dias después. En algunos casos (como se describe en la lcyenda de la figura 6), se agregan 25 mM de MSX junto con la selección con higromicina. Para todas las condiciones de transfección analizadas, las células se seleccionan durante 3 semanas bajo estas condiciones. Durante este periodo, el medio acondicionado en el matraz T-75 se intercambia con medio nuevo que contiene la selección con fármaco positiva y negativa cada 3-4 dias. Una vez que la viabilidad llega a >= 90%, las células se someten a clonación de célula individual utilizando un FACS Aria II en placas de 96 cavidades que contienen el mismo medio registrado definido con químico descrito anteriormente suplementado ya sea con 200 ó 400 mg/ml de higromicina con o sin 25 mM de MSX (como se describe en la leyenda de la figura 6). La concentración de anticuerpo en el medio condicionado, recolectado a partir de las cavidades que contienen células visibles en crecimiento, se determina en un ForteBio Octect utilizando un biosensor de Proteina A. Las lineas celulares clónales seleccionadas se expanden y se sub-cultivan en matraces de agitación de 125 mi que contienen medio CD CHO suplementado con 200 pg/ml de higromicina y 25 mM de MSX. Estos clones se evalúan además respecto a productividad de anticuerpo en análisis de matraz de agitación por lotes (como se describió anteriormente). Para el análisis de estabilidad, tanto la higromicina como MSX se retiran del sub-cultivo para la condición especificada en la lcyenda de la figura 6. 7. Análisis de datos La integral con respecto al tiempo del área bajo la curva de crecimiento (la integral respecto al tiempo de la concentración de célula viable (IVC); 106 células por día/ml) se calcula utilizando el método descrito por Renard et al. (Renard et al.1988, Biotechnology Letters 10:91-96) en la cual XvO = concentración de célula viable en la primera muestra (106/ml), Xvl = concentración de célula viable en la segunda muestra (106/ml), tO = tiempo transcurrido en la primera muestra (día), ti = tiempo transcurrido en la segunda muestra (dia). 8. Recorrido por el ADN El Kit II Seegen DNA Walking SpeddUp™ se utiliza de conformidad con el fabricante para proveer los datos de la secuencia de flanqueo del genoma 3'. Se utilizan iniciadores específicos de gen de beta-lactamasa (bla), específicos para bla en el brazo 3' del esquema del vector pRY17 integrado linealmente (bla R, figura 3) en la línea celular 11A7 de GS-CH0K1SV, TSPlfwd (SEQ ID NO.4), TSP2fwd (SEQ ID NO.5) y TSP3fwd (SEQ ID NO.6). 9. Secuenciación de genoma del hospedero 10E9 Se fragmenta el ADN genómico de 10E9 y se prepara una genoteca de extremo apareado apropiada para secuenciación con la plataforma HiSeq utilizando el kit para preparación de muestra de ADN TrueSeq, siguiendo las instrucciones del fabricante. La genoteca generada está dentro del intervalo de tamaño esperado de 300 pb hasta 500 pb. El análisis de control de calidad de la genoteca generada utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (que indica que la genoteca es de calidad aceptable, que contiene el tamaño y rendimiento de fragmento esperado, para procesamiento de muestra continuo. La genoteca generada se utiliza en el sistema cBot para generación de conjunto (cluster), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las celdas de flujo que contienen los conjuntos amplificados se someten a secuenciación utilizando secuenciación de extremo apareado de 2x100 pares de bases en un aparato Hi-Seq 2000. Las lecturas se mapear hasta los contiguos de CHO-K1 (Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742) utilizando el alineador de Burrows-Wheeler (BWA) (Li H. y Durbin R.2009 25:1754-1760).

B. Resultados Fase I: Generación de las lineas celulares progenitoras que expresan mAb El objetivo de la fase I es generar una linea celular GS-CHOK1SV de alta producción que expresa mAb, que exhibe características de crecimiento favorables con productividad estable, que contienen solamente un locus de integración individual y el número más bajo posible de integrantes de vector en este locus. Se diseña un "vector de gen doble" de GS de Lonza, pRY17 (figura 1), que codifica para el mAb quimérico, CB72.3 (Whittle et al. 1987, Protein Eng 1:499-505). En pRY17, las secuencias de recombinación de 48 pares de bases de F de tipo silvestre y de F5 mutante flanquean las unidades de transcripción de HC y LC del mAb. Las secuencias de recombinación de F5 y F aunque funcionalmente equivalentes, muestran actividad de recombinación cruzada mínima permitiendo por lo tanto RMCE eficiente y direccional, catalizado por la FLP recombinasa (Schlake y Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751). Las líneas celulares GS-CHOK1SV iniciales derivadas a partir de una transfección de pRY17 no transcriben o traducen de manera eficiente el gen de resistencia a higromicina ya que no hay codón de metionina iniciador o promotor inmediatamente corriente arriba de este gen híbrido.

Como un aspecto importante, el gen de GS derivado de vector se coloca fuera del cassette intercambiable para que éste pueda ser retenido en el genoma de las líneas celulares resultantes después de RMCE. Al hacer esto, se evita cualquier perturbación potencial del metabolismo de glutamina en cualquier linea celular derivada; las lineas celulares GS-CHOK1SV progenitoras se seleccionan en medio libre de glutamina y 50 mM de metionina-sulfoximina (MSX), en presencia de expresión de glutamina sintetasa tanto endógena como derivada de vector. Se coloca un gen de higromicina B fosfotransferasa sin promotor y deficiente en metionina (-ATG) para inicio de traducción se coloca entré la secuencia que codifica para el enlazador (Lnk) y la secuencia de recombinación F (figura 1). Los vectores utilizados para RMCE en la segunda fase de este estudio contienen el promotor temprano de SV40 y la metionina de inicio (ATG) requeridos para expresar resistencia a higromicina. Un gen de resistencia a higromicina completamente funcional se crea solamente cuando ocurre la recombinación con la secuencia de recombinación F de tipo silvestre en el genoma (figura 1).

El vector pRY17 que contiene las secuencias de recombinación de FRT se introduce en células CHOK1SV mediante un procedimiento de desarrollo de linea celular convencional, seguido por un tamizaje intensivo efectuado en las etapas clave del procedimiento para asegurar que se aíslen líneas celulares con la mejor combinación de crecimiento y productividad. De manera adicional, la proteína cB72.3 derivada a partir de las líneas celulares elegidas tiene que exhibir características de calidad de producto similares que las de una preparación derivada a partir de una línea celular GS-CHOK1SV previa (Birch y Racher, 2006, Adv Drug Deliv Rev 58:671-685). Se prefiere que los números de copia del gen para HC y LC de las líneas celulares candidatas estén cerca de uno para cada uno. Para este fin, se efectúa tres electroporaciones independientes y cada una con 50 mg de pRY17 linealizado y 1 x 107 células CHOK1SV. Los transfectantes provenientes de todas las tres electroporaciones se seleccionan en medio que contiene 50 mM de MSX y se tamizan ~1500 grupos de células sobrevivientes respecto a la producción de anticuerpo a las 3 semanas después de la transfección. Eventualmente se evalúa un total de 79 clones mediante matraz agitado por lotes de 7 días y se determina la concentración del mAb CB72.3 de todos los 79. Todas las líneas celulares derivadas mediante RMCE se mantienen en medio que contiene 25 mM de MSX, excepto en donde se indique. A partir de los 79 clones evaluados, se seleccionan 38 para análisis adicional en cultivo en matraz de agitación de lote alimentado. Los 6 clones con mejor desempeño tomando como base las características de productividad y crecimiento se seleccionan (tabla 1) para caracterización genética (véase métodos).

Tabla 1 Crecimiento y producción de anticuerpo de las 6 mejores lineas celulares clónales provenientes de la fase 1 en matraz de agitación por lote y de lote alimentado (n=2) Con el fin de investigar el sitio de integración del pRY17 en el genoma de CKOK1SV, se preparan cromosomas en metafase a partir de los 6 clones y se sondean con pRY17 marcado con DIG (datos no mostrados). Los clones 1G11, 6B5, 8F10, 14D11 y 11A7 parecen tener, todos, solamente un locus de integración en la región telomérica de un cromosoma individual. Por otro lado, el clon 18C11 parece tener dos sitios de integración distintos y por lo tanto no se selecciona para estudio adicional. Para determinar el número de copias de gen en cada una de las lineas celulares, se prepara ADN genómico sometido a energía sónica a partir de células que crecen activamente. Para el análisis de qPCR, se incluye GAPDH como el control endógeno y se "siembra" pRY17 en el ADN de la célula hospedera como el control positivo. Los números de copia de gen por célula tanto para la HC como para LC se calculan como el coeficiente de copias promediadas a copias de GAPDH promediadas. Como se muestra en la tabla 2, de los 5 clones analizados, 11A7 tiene los números de copia de gen para HC y LC más bajos. El análisis Southern blot del ADN genómico revela que tanto HC como LC se pueden detectar en todos los 5 clones y la intensidad de las bandas refleja los números de copia de gen determinados mediante qPCR (datos no mostrados).

Tabla 2 Análisis de copia de gen de HC y LC de cB72.3 en 5 de las 6 lineas celulares clónales utilizando qPCR De los 5 clones seleccionados que ingresan al presente estudio de estabilidad (tabla 3), 11A7 mantiene productividad similar a lo largo de 7 meses (220 generaciones), mientras que los otros clones muestran pérdida de productividad gradual durante los primeros 3 meses del estudio (80 generaciones). Tomados juntos, 11A7 no solamente tiene una de las mejores combinaciones crecimiento bueno y perfiles de productividad, sino que también tiene el número de copia de gen más bajo con un solo sitio de integración. Como un aspecto importante, 11A7 es el clon más estable de los 6 en términos de productividad. De manera más importante la calidad del producto es comparable después de 220 generaciones.11A7 se elige como el clon progenitor para la primera ronda de RMCE: Fase II.

GO M (_P O en O Cn Tabla 3 Análisis de estabilidad de las mejores 5 líneas celulares clónales SSI. Las 5 mejores lineas celulares < \ clónales SSI se cultivan en forma continua en matraces de agitación durante varios números de generaciones en presencia de MSX. En diferentes números de generación como se indica, todas las 5 líneas celulares clónales SSI se analizan mediante matraz de agitación de lote alimentado respecto a la producción de anticuerpo (n-2) Fase II - Generación de células hospederas SSI Aunque es completamente posible diseñar un vector para elección de blanco que pudiera cambiar las unidades de transcripción de mAb originales en 11A7 por aquellas de un nuevo mAb, se prefiere que los originales se corten completamente del genoma. Para hacer esto se diseña un vector para elección de blanco nulo adicional, pRY37 (figura 2) que no codifica para los genes del mAb. En cambio éste codifica para los marcadores de selección positiva y negativa, puromicina acetil-transferasa (PAC) y timidina cinasa (TK), respectivamente, y estos se flanquean con las secuencias de recombinación F y F5 en la misma orientación que pRY17 (figura 1). Después de RMCE, se espera que estos marcadores reemplacen el mAb cB72.3 original en el mismo locus en el genoma de 11A7 original. PAC es requerida para seleccionar respecto a lineas celulares que hayan sido sometidas a RMCE con pRY37. TK convierte el profármaco ganciclovir en un análogo de nucleótido fosforilado, tóxico (Wood y Crumpacker, 1996, New England Journal of Medicine 335, páginas 721 a 729). Esto es importante para la aplicación de selección negativa posteriormente en la fase III: la selección con ganciclovir enriquece el grupo de RMCE para células que hayan sido sometidas a RMCE legitimo, aniquilando aquellas que no han sido sometidas.

De los grupos de línea celular sobreviviente que son negativas para la expresión del mAb, se elige una línea celular, 136-A4 para caracterización adicional mediante análisis Southern blot (datos no mostrados). Se confirma la presencia de TK en el genoma de 136-A4. El mapeo de restricción indica la presencia de solamente dos copias de pRY37 en el "sitio clave" y se confirma mediante secuenciación subsiguiente del genoma del clon hijo 10E9. El número de copia es sustancialmente más bajo que pRY17 encontrado en 11A7 (tabla 2). Para obtener un hospedero SSI homogéneo, se somete a clonación de célula individual a 136-A4 utilizando FACS Aria II y se obtienen los perfiles de crecimiento de 26 derivados clónales. De estos, se seleccionan dos derivados clónales con los mejores perfiles de crecimiento, 10E9 y 8C8, para caracterización adicional mediante análisis northern blot. El análisis Northern blot del ARN proveniente de estos clones hijo confirma la ausencia de los ARNm de HC y LC de cB72.3 (datos no mostrados). Tomados juntos, estos resultados muestran que 10E9 es una línea celular hospedera candidata apropiada para RMCE para análisis en la fase III.

Fase III - RMCE con el vector para elección de blanco del mAb Myo Con el fin de demostrar la utilidad de la nueva línea celular hospedera SSI 10E9, se diseña un vector para elección de blanco, pRY21 (figura 3). Este vector contiene los genes de HC y LC para el mAb Myo, flanqueados por secuencias de recombinación F y F5 en la misma orientación que la encontrada en ambos vectores pRY17 (fase I) y pRY37 (fase II). Este también contiene un promotor temprano de SV40 (SV40E) corriente arriba de un codón de inicio de metionina fusionado en marco a la secuencia de recombinación F (ATG + F). Cuando ocurre RMCE legítimo, la secuencia ATG + F se coloca en marco con el gen de higromicina B fosfotransferasa sin promotor y deficiente en metionina de inicio para traducción (-ATG). Se efectúan tres rondas de co-transfección de células 10E9 con pRY21 y pOG44. En las primeras dos rondas las células se transfectan con el sistema de CHO Free style™ MAX, mientras que en la ronda 3 las células se transfectan mediante electroporación. De manera adicional, la ronda 1 se co selecciona con ganciclovir e higromicina como grupos; la ronda 2 se selecciona en forma secuencial primero con 400 pg/ml de higromicina seguido por ganciclovir como grupos y después se someten en forma subsiguiente a clonación de célula individual utilizando un FACS Aria II; la ronda 3 se selecciona en forma secuencial primero con cualquiera de 200 ó 400 mg/ml de higromicina seguido por ganciclovir como grupos y después en forma subsiguiente se someten a clonación de célula individual utilizando un FACS Aria II (figura 6). En la ronda 3, MSX está ausente del medio de cultivo en dos de las condiciones de prueba.

Los datos de productividad obtenidos a partir de los diferentes grupos en la ronda 1 son similares, lo que sugiere que los miembros de la linea celular de cada grupo probablemente tienen productividades similares. El intervalo de productividades de los grupos es mucho más estrecho que el de cualesquiera líneas celulares ya sean clónales o no clónales provenientes de un procedimiento de integración aleatoria (figura 6). Cuando se comparan las líneas celulares clónales aisladas en diferentes condiciones de selección de las rondas 2 y 3, parece que las líneas celulares clónales de más alta producción residen en el grupo que se selecciona en ausencia de MSX en comparación con aquellas con MSX. En las líneas celulares cultivadas en ausencia de MSX, parece haber una diferencia en las productividades obtenidas con diferentes concentraciones de higromicina en el medio selectivo que no es aparente cuando MSX está presente en el medio.

Inicialmente, en la fase I se aísla una línea celular GS-CH0K1V muy estable, 11A7, que es estable hasta 220 generaciones. Este rasgo de estabilidad puede ser heredado en líneas celulares derivadas generadas mediante RMCE en la fase III. Por consiguiente, se evalúan 3 grupos celulares provenientes de la ronda I de la fase III en un estudio de estabilidad extendido bajo dos condiciones diferentes (Tabla 4).

Tabla 4 Ronda 1: Tres líneas celulares seleccionadas se expanden en matraces de agitación y se cultivan en forma continua en dos condiciones diferentes; + higromicina/+ MSX (+/+) o - MSX/+ higromicina (-/+). En diversos puntos de tiempo, se establecen duplicados de los matraces de agitación de lote alimentado a partir de los cultivos continuos de todas las 3 líneas celulares SSI en ambas condiciones y la concentración del mAb Myo se determina después de 14 días.

Independientemente de las condiciones, todos los tres grupos analizados satisfacen los criterios para una linea celular estable. Además, un total de 12 lineas celulares clónales, 6 de cada una de las rondas 2 y 3, en el mismo tipo de estudio de estabilidad (tablas 5 y 6, respectivamente). Se encontró que todas las 12 lineas celulares clónales retienen el rasgo de estabilidad bajo selección. Es interesante que las 6 lineas celulares clónales provenientes de la ronda 3 (tabla 4) son estables incluso sin la presencia de algún agente selectivo. Esto tiene implicaciones profundas para la fabricación de biofarmacéuticos. > (-P O en o Oí Tabla 5 Ronda 2: Seis clones de celula individual se cultivan en forma continua en dos condiciones diferentes; J + higromicina/+ MSX {+/+) o - MSX/- higromicina {-/-) y se analizan periódicamente:mediante cultivo de lote alimentado como se describe para la ronda 1 (tabla 4).

M N3 (_n O Cn O Cn Tabla 6 Ronda 3: Seis clones de célula individual se cultivan en forma continua en dos condiciones diferentes - MSX/+ higromicina (-/+} o - MSX/- higroraicina (-/-} y se analizan periódicamente mediante cultivo de lote alimentado como se describe para la ronda 1 (tabla 4).

Caracterización de las secuencias genómicas que flanquean el "sitio clave" Secuencia de flanqueo 3' Se utiliza la secuencia de flanqueo 3' de 500 pb (SEQ ID No.7) derivada del recorrido por el ADN Seegene de bla R (figura 3) para buscar mediante blast los contiguos de un proyecto de secuenciación de genoma de CHO-Kl (Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol.29:735-742), públicamente disponible en el banco de datos del NCBI. Se encontró una región única localizada en el andamio genómico no colocado, scaffoldl492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1) en la cadena menos (-) de 1760466-1760965. La secuencia de 500 pb (SEQ ID No. 7) se extiende hasta 2000 pb (Seq ID No.8) basándose en el mapeo de cobertura alta de las lecturas de 10E9 hasta el andamio 1492 (datos no mostrados).

La secuencia de flanqueo 3', identificada mediante el recorrido por el ADN Seegene (véase métodos) se utiliza para buscar mediante blast los contiguos de un proyecto de secuenciación de genoma de CHO-Kl (Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742), públicamente disponible en el banco de datos del NCBI. Utilizando estos datos y los datos de secuencia de genoma Illumina HiSeq obtenidos a partir de la linea de célula hospedera SSI 10E9, se encuentra una región única localizada en el andamio genómico no colocado, scaffoldl492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Este se encontró localizado dentro de un gen FerlL4 predicho (fer-1-tipo 4) (ID e gen del NCBI: 100755848) en el andamio 1492 en la cadena menos (-) (numero de nucleótido de scaffoldl492 1,746,191 a 1,781,992; 35,802 nucleótidos en total). La secuencia de flanqueo 5' parece estar localizada entre los exones 39 y 40 mientras que la secuencia de flanqueo 3' parece estar localizada entre los exones 28 y 29 (véase figura 7).

Secuencia de flanqueo 5' Las lecturas de Illumina del ADN genómico de 10E9 se mapean hasta pRYl7 (SEQ ID No. 1) utilizando el alineador de Burrows-Wheeler (BWA). A través de la inspección del mapeo, se encontraron lecturas no apareadas múltiples (flechas negras en la Figura 8) mapeadas hasta el extremo 5 ' de una porción 3' de la HC de CB72.3. Este análisis sugiere que por lo menos un fragmento de la HC de cB72.3 (con 214 pares de bases eliminadas del extremo 5') permanece en el "sitio clave" de 10E9. El análisis Northern blot (datos no mostrados) muestra que no hay ARNm de LC o HC de cB72.3 en las células 10E9, lo que sugiere que la HC truncada en cB72.3 no es funcional. Las lecturas apareadas equivalentes se utilizan después para buscar mediante blast los contiguos de un proyecto de secuenciación de genoma de CHO-K1 (Xu X et al.2011, Nature Bio-technol.29:735-742). Todos ellos se alinean a la misma ubicación (1750048-1750183) en el andamio genómico no colocado, scaffoldl492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Esto permite que la secuencia de flanqueo 5' se extienda hasta un máximo de 822 pares de bases (SEQ ID No.9).

Ejemplo 2 A) Materiales y métodos 1. Southern blot 5-10 mg de ADN genómico, aislado a partir de los pases 2 y 4 de cada clon y que se purifican utilizando el kit Blood & Cell Culture DNA Maxi de QIAGEN (Qiagen), se digieren con endonucleasa(s) de restricción durante 15 horas a 37°C. El ADN digerido se extrae dos veces con un volumen igual de una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico, pH8.0 (1:1 v/v) seguido por cloroformo sólo y se precipita con etanol antes de electroforesis en gel de agarosa 0.7% (p/v) que se corre en cualquiera de solución amortiguadora 0.5 x TBE (50 x TBE: Lonza) ó 1 x TAE (40 mM Tris, pH 7.7, 2.5 mM de EDTA). El gel se transfiere a una membrana Hybond-N (Amersham) utilizando un distribuidor al vacio esencialmente de conformidad con las instrucciones del fabricante (Appligene, Pharmacia) . Las membranas Hybond-N se fijan con UV, se pre-hibridan en cualquiera de solución amortiguadora para hibridación que contiene 5 x de Denhardt preparada a partir de solución de reserva 50 x (Sigma), 6 x SSC (1 x SSC: 0.15 M de cloruro de sodio, 15 mM de citrato de sodio), y SDS al 10% (p/v) o solución amortiguadora Rapid-hyb (GE healthcare) sola.

Se generan sondas de TK en PCRs utilizando los siguientes conjuntos de iniciadores: TK-sentido: 5'-AGATCACCATGGGCATGCCTTAC-3' (SEQ ID No. 10); TK-antisentido: 5'-AACACGTTGTACAGGTCGCCGTT-3' (SEQ ID No.11); El vector pRY37 se utiliza como una plantilla para la PCR generadora de sonda y las condiciones de cielado son: 15 ng de plantilla/50 ml de reacción; ADN polimerasa Taq (Roche); 94°C 2 minutos, 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 30 segundos, extensión final a 72°C durante 7 minutos. Se marcan 25 ng del producto de PCR con [g-32R] dCTP (111 TBq/mmol, Perkin Elmer) utilizando el kit Megaprime y se purifican en una columna de traducción de muesca (Amersham). Las hibridaciones se efectúan en la misma solución amortiguadora de pre-hibridación durante 2-20 horas a 65°C. Después de la hibridación, las membranas se lavan hasta una astringencia final de 0.1 x SSC, 0.1% (p/v) de SDS a 65°C. Los blots se exponen a una pantalla de fósforo en almacenamiento (Bio-Rad); las pantallas expuestas se someten a formación de imagen utilizando un sistema para formación de imagen Personal Molecular Imager (PMI) (Bio-Rad). 2. Mapeo y alineación Las lecturas de extremo apareado en formato FASTQ son la entrada para el mapeo para las plantillas genómicas. Las secuencias de vector y el ensamble CHOK1SV se indizan como las plantillas que se van a mapear. Las lecturas de extremo apareado se alinean con las plantillas utilizando Bowtie2 (Langmead B, & Salzberg SL, 2012, Nature methods, 9 (4), 357-9) con los parámetros predefinidos (-D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00) para alineación local muy rápida. La cobertura se normaliza como <cobertura sin tratamiento>*500M/<número de lecturas> para comparar a través de muestras diferentes. 3. Identificación de los sitios de integración 2 X 100 lecturas de extremo apareado de la cepa hospedera SSI 10E9 se someten a secuenciación utilizando Illumina Hi-Seq 2000 a una cobertura promedio de 40 X. Las lecturas de secuencia se mapean hasta el vector pRY17 el cual es el primer vector integrado en el genoma de CHOK1SV. Las lecturas que cubren los sitios de integración se denominan lecturas quiméricas debido a que éstas contienen secuencia que se mapea tanto al genoma de CHOK1SV asi como a la secuencia del vector integrada. Debido a que el mapeo se efectúa mediante alineación local, las lecturas quiméricas tienen características de coincidencia parcial con las secuencias del vector con colas salientes las cuales se puede apear hasta la secuencia genómica. Además de las lecturas quiméricas, hay otras lecturas en las cuales un extremo de una lectura apareada se mapea hasta la secuencia del vector completamente y el otro extremo se mapea hasta la secuencia genómica. Estos pares de lectura se denominan pares de lectura discordantes. Se recolectan las secuencias de cola saliente y las lecturas no mapeadas de los pares de lectura discordantes y se utilizan para buscar contra el ensamble de genoma de CHOK1SV utilizando blast para identificar la secuencia de flanqueo de los sitios de integración tomando como base la similitud de secuencia. 4. Sitio de unión La estructura del sitio de unión (landing pad) (secuencias exógenas introducidas en el sitio clave que contienen sitios de recombinación para la integración de los cassettes de expresión de los genes de interés mediante RMCE) se basa en los datos tanto del análisis Southern blot como del análisis de re-secuenciación del genoma completo (WGRS)de la línea celular 10E9 (figuras 9A-9B). Las lecturas derivadas de 10E9 se mapean hasta la secuencia del vector utilizando el mismo algoritmo que el utilizado para raapear los sitios de integración. Las lecturas quiméricas también se observan en los sitios de duplicación, deleción o inserción. Las correcciones a la secuencia de sitio de unión putativa se hacen tomando como base la investigación cercana de los sitios en los cuales surgen las lecturas quiméricas. 5. Cuantificación del análisis de ARN-seq La plantilla utilizada para mapear las lecturas se construye utilizando el modelo de "una copia" del sitio de unión derivado a partir de la re-secuenciación del genoma completo (véase sección anterior). Las lecturas de secuenciación de ARN-seq se mapean hasta la plantilla mediante BWA utilizando parámetros predeterminados. Los conteos de lectura en LC y HC se normalizan con respecto a la medida de RPKM, lecturas por kilobase de transcriptoma por millón de lecturas mapeadas, mediante la siguiente fórmula: Se obtiene el número de lecturas que se traslapan con los exones para cada intervalo utilizando bedtools (Quinlan AR y Hall IM, 2010, Bioinformatics. 26, 6, pp. 841-842) como el siguiente comando, cobertura de bedtools-abara <bam file> -b <intervalos en el lecho>.

B. Resultados Estructura del sitio de unión en la celula hospedera SSI 10E9 Se infiere un modelo de la estructura del sitio de unión dentro del sitio clave de FerlL4 a partir de los eventos de RMCE esperados que ocurren durante la creación de la línea celular 10E9 a partir de 11A7 utilizando el vector nulo para elección de blanco pRY37 (figura 4). Este modelo se denomina el modelo de "copia individual" y es consistente con los datos de WGRS provenientes de la línea celular 10E9 (figura 9A). Sin embargo, los datos de Southern blot sugieren que el modelo debería en realidad contener dos copias (figura 9B). Este modelo de "dos copias" se refina con base a los datos y se utiliza para ayudar a interpretar las líneas celulares productoras de mAb obtenidas mediante RMCE en el hospedero 10E9. El modelo de "dos copias" permite explicar por qué cualquiera de una o las dos copias de las unidades de transcripción de anticuerpo se puede incorporar en el sitio de unión mediante RMCE con el vector para elección de blanco pRY21.

Secuencias de flanqueo en las líneas celulares derivadas de RMCE Se crean cuatro líneas celulares recombinantes derivadas de 10E9 que expresan un anticuerpo monoclonal anti-Miostatina (Myo) mediante RMCE (utilizando el vector para elección de blanco pRY21) y se determina las secuencias de flanqueo 5' y 3' en cada una, utilizando los métodos previamente descritos. Durante el procedimiento de RMCE, ocurre un reacomodo genómico consistente que genera una nueva secuencia de flanqueo 3' en las lineas celulares derivadas (figura 10). La secuencia de flanqueo 5' en las lineas celulares derivadas de RMCE son las mismas que 10E9, con el sitio de integración en el nucleótido 1750049 (en el andamio Scaffoldl492 de CHO-K1 no colocado (número de acceso JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Sin embargo, las secuencias de franqueo 3' ahora son diferentes: mientras que el sitio de integración 3' en la linea celular hospedera SSI 10E9 está en el nucleótido 1760965, en todas las lineas celulares derivadas de RMCE éste ahora se encuentra en el nucleótido 1435427 (en el andamio antes mencionado, figura 10).

Estimación del número de copia del cassette integrado en lineas celulares generadas mediante RMCE Las lecturas de secuenciación proveniente de cada uno de sus genomas se mapean hasta un modelo en el cual está integrada una copia en el sitio clave. El número de copias de Myo se obtiene a partir de la media de la cobertura promedio en la región de LC y HC. La media de la cobertura para estas cuatro lineas celulares son 41, 34, 18, 27 en la región de LC y 32, 27, 14, 19 en la región de HC, respectivamente. Los datos de cobertura indican que para las que tienen alta producción, podría haber por lo menos una copia más de HC y LC (tabla 7). Los datos de cobertura se muestran gráficamente en la figura 11.

Tabla 7 Cobertura de la lectura de secuencia y tasa de producción especifica (qP) de lineas celulares de RMCE productoras de Myo . El número de copias se indica en paréntesis después del valor de cobertura Con base a esta observación, se genera un nuevo modelo el locus post-RMCE en el cual se incluye una copia adicional de Myo . Esto se logra insertando otra copia del fragmento que abarca desde el inicio del primer sitio wFRT hasta el comienzo del segundo sitio wFRT (ambos indicados mediante asteriscos en la figura 11 ) justo antes del inicio del segundo wFRT . Utilizando este modelo de "dos copias" se pudo explicar completamente el número de lecturas observado en líneas celulares con qP alta cuando éstas se vuelven a mapear hasta esto La evidencia adicional para un modelo de "dos copias" en lineas celulares productoras de Myo con qP alta se obtiene a partir de los datos de ARN-seq de cada linea celular. Las lecturas de secuenciación provenientes de ARN-Seq a partir del ARN derivado de cada linea celular Myo se mapean hasta el modelo de "una copia" original (figura 12) utilizando BWA (Li H. y Durbin R. 2009, Bioinformatics, 25:1754-60) que se corre con los parámetros predeterminados. El número de copias de Myo se deriva calculando los valores de RPKM (Mortazavi et al.(2008), Nature Methods 5, 621-628) para las regiones de LC y HC.

Los valores de RPKM son 43135, 40059, 23204, 29334 en la región de LC y 38572, 32384, 17878, 20751 en la región de HC, respectivamente. Estos datos también confirman el modelo de "dos copias" propuesto para las de producción alta que se obtiene a partir de la secuenciación del genoma completo.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1.- Una célula hospedera de integración especifica de sitio (SSI) que comprende un gen FerlL4 endógeno, caracterizada porque se integra una secuencia de nucleótido exógena en dicho gen FerlL4 y en el cual la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación.

2.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótido exógena comprende un gen que codifica para la secuencia de interés.

3.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque dichos por lo menos dos sitios objetivo de recombinación flanquean el gen que codifica para la secuencia de interés.

4.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizada porque el gen que codifica para la secuencia de interés comprende uno o más de un gen que codifica para un marcador de selección, una proteina detectable, un anticuerpo, un antígeno peptidico, una enzima, una hormona, un factor de crecimiento, un receptor, una proteina de fusión u otra proteina biológicamente activa.

5.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio objetivo de recombinación es un sitio FRT o un sitio lox.

6.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el marcador de selección es un marcador de selección de GS, un marcador de selección de higromicina, un marcador de selección de puromicina o un marcador de selección de timidina cinasa.

7.- La célula hospedera SSI de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de ratón, una célula de humano o una célula hospedera de CHO, una célula hospedera CH0K1 o una célula hospedera CHOK1SV..

8.- La célula hospedera SSI de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia de nucleótido del gen FerlL4 que flanquea la secuencia de nucleótido exógena integrada se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID No.7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas.

9.- La célula hospedera SSI de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la secuencia de nucleótido exógena reemplaza una porción del gen FerlL4.

10.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la célula hospedera comprende un sitio FRT el cual es un sitio FRT de tipo silvestre o un sitio FRT mutante.

11.- La célula hospedera SSI de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los sitios objetivo de recombinación comprenden por lo menos un sitio FRT de tipo silvestre y por lo menos un sitio FRT mutante.

12.- Un método para producir una célula hospedera SSI que comprende los pasos de a) proveer una célula que comprende un qen FerlL4 endógeno, caracterizado porque se integra una secuencia de nucleótido exógena en dicho gen FerlL4, y en el cual la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación, que flanquean por lo menos un primer gen que codifica para la secuencia de interés; posteriormente b) transfectar las células provistas en el paso a) con un vector que comprende un primer cassette intercambiable, el cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo recombinantes coincidentes, que flanquean por lo menos un segundo gen que codifica para la secuencia de interés, específicamente un gen marcador de selección, posteriormente c) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio y posteriormente d) seleccionar las células transíectadas que expresan el segundo gen que codifica para la secuencia de interés, de preferencia el gen marcador de selección, para obtener la célula hospedera SSI que comprende el primer cassette intercambiable establemente integrado en su genoma.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, que comprende además i) transfectar la célula hospedera SSI con un vector que comprende por lo menos un segundo cassette intercambiable, cuyo cassette comprende por lo menos dos sitios objetivo de recombinación coincidentes que flanquean por lo menos un tercer gen que codifica para la secuencia de interés y por lo menos un marcador de selección, ii) efectuar un intercambio de cassette mediado por recombinación dirigida a sitio para obtener una célula hospedera SSI que comprende el tercer gen que codifica para la secuencia de interés, iii) permitir que la célula hospedera SSI obtenida en el paso ii) exprese el tercer gen que codifica para la secuencia de interés y iv) recuperar el producto del tercer gen que codifica para la secuencia de interés.

14.- El uso de una molécula de polinucleótido aislada que comprende por lo menos una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID No.7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas con una homología de por lo menos 40 % para producir líneas celulares que muestran expresión incrementada.

15.- El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polinucleótido está contenido en un vector.

16.- Una célula hospedera, caracterizada porque la célula hospedera comprende una molécula de polinucleótido que comprende por lo menos una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID No.7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas con una homología de por lo menos 40 % o un vector que contiene dicha molécula de polinucleótido y un gen exógeno que codifica para la secuencia de interés dentro de o adyacente a la molécula de polinucleótido o el vector que contiene dicho polinucleótido.

17.- Un método para producir una célula o línea celular, en particular una célula o línea celular de alta producción con una estabilidad de productividad alta, caracterizado porque la secuencia de nucleótido de FerlL4 está integrada en un vector que comprende por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés, en el cual posteriormente el vector se transfecta de manera estable en una célula o línea celular y en el cual posteriormente se seleccionan y obtienen las células o líneas celulares establemente transfectadas.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de nucleótido de FerlL4 es una secuencia de nucleótido que se selecciona a partir del grupo que consiste de secuencias de nucleótido como las dadas en SEQ ID No. 7, 8, 9 y secuencias homologas de las mismas.

19.- Un método para la producción de un producto de un gen que codifica para la secuencia de interés que comprende cultivar una célula hospedera o linea celular que se produce de conformidad con el método de las reivindicaciones 12 ó 17 en un medio apropiado y recuperar a partir del mismo el producto.

20.- Un método para producir una célula hospedera SSI, el método comprende introducir una secuencia de nucleótido exógena en un gen FerlL4 endógeno en una célula, caracterizado porque la secuencia de nucleótido exógena comprende por lo menos un gen que codifica para la secuencia de interés y/o por lo menos dos sitios objetivo de recombinación.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia de nucleótido exógena se introduce mediante recombinación homologa entre el gen FerlL4 y un polinucleótido, en el cual el polinucleótido comprende a) una primera secuencia de nucleótido homologa a una primera porción del gen FerlL4, b) la secuencia de nucleótido exógena, y c) una segunda secuencia de nucleótido homologa a una segunda porción del gen FerlL4.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la introducción de la secuencia de nucleótido exógena se facilita utilizando un vector viral (por ejemplo, un vector de virus adeno-asociado el cual media la recombinación homologa) o una nucleasa exógena (por ejemplo, una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa efectora tipo activador de transcripción, o una meganucleasa diseñada).