KR101761709B1 - 부위 특이적 통합 - Google Patents

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론자 바이올로직스 피엘씨
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Abstract

본 발명은 안정한 고생산성 부위 특이적 통합(SSI) 숙주세포, 예를 들어 중국햄스터난소(CHO)로부터 유도된 숙주세포, 그의 제조 및 사용방법에 관한 것이다.

Description

부위 특이적 통합{SITE-SPECIFIC INTEGRATION}
본 발명은 안정한 고생산성 부위 특이적 통합(SSI) 숙주세포, 예를 들어 중국햄스터난소(CHO)로부터 유도된 숙주세포, 그의 제조 및 사용방법에 관한 것이다.
개발중인 생물학적 바이오의약품 후보물질의 증가는 기존의 방법을 사용하여 상업적인 세포주의 생성이 시간 소모적이고 노동 집약적인 반복 과정이기 때문에 세포주 개발을 위한 강력하고 신속한 높은 처리량의 기술을 개발할 필요성을 지원하고 있다. 항체 생산 세포주의 구성 및 선택 시, 넓은 범위의 발현, 성장 및 안정성 프로필을 갖는 세포주가 얻어진다. 이러한 변이는 포유동물 게놈의 고유한 가소성(plasticity)으로 인해 발생할 수 있다. 이들은 또한 확률적 유전자 조절 네트워크로부터 또는, "위치 반점 효과(position variegation effect)"로 인한 주로 전이유전자의 무작위 게놈 통합(integration)으로부터 기인하여 생성된 재조합 단백질 양의 변이에서 유래할 수 있다.
이러한 변이와 게놈 통합의 낮은 빈도(10,000 중 1)로 인하여, 상업적으로 적합한 생산 세포주(예를 들어, 양호한 생장, 높은 생산성 및 생산 안정성과 목적하는 생성물 프로파일의 조합)를 단리하기 위해서는 자원 집약적이고 시간 소모적인 노력이 이러한 희박한 경우들의 집합에서 수많은 형질감염체(transfectant)를 스크린하는데 필요하다. 이러한 상황은 고도의 엄격한 선별 시스템, 예컨대 GS(글루타민 신타제) 유전자 발현 시스템을 사용하는 고생산성 세포주를 강화하여 개선될 수 있다. 예를 들어, 최근의 한 연구에서 175 mAb (단일클로날 항체)-생산성 GS-CHOK1SV (GS Gene expression system™, Lonza) 세포주의 무작위로 선택된 패널 >30%가 유가(fed-batch) 진탕 플라스크 공정에서 >=1 g/L mAb를 생산하였다. CHOK1SV가 GS 효소를 내인성으로 발현하고, 그리하여 양성 형질전환체는 글루타민이 없는 배지와 메티오닌 설폭시민 (sulfoximine)(MSX)의 선별을 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 효율적인 선택 시스템에도 불구하고 엄격하고 힘든 스크리닝 체제가 여전히 필요하다. 따라서, 세포주를 제조하는 구성은 힘들고 긴 과정이다. 이러한 세포주들이 양성 생장 및 생산성 특성들을 위해 선별되어야 할 뿐만 아니라 이들은 또한 클론되어야 하고 제조공정의 지속기간 동안 본질적으로 정확한 품질의 생성물을 생산해야 한다. 또한, 경제적인 공정을 위해, 생성된 세포주들은 수많은 세포 분열 동안 일정한 생산성을 나타내야 한다. 바람직한 것은 양성 생장 특성을 갖는 고생산성 세포주가 매회 최소한의 스크리닝 활성으로 관심있는 신규한 단백질, 예를 들어 발현되어야 하는 신규한 단일클로날 항체를 제공하는 것이다.
본 발명이 놓여 있는 기술적 문제는 상기한 단점을 극복하는 것으로, 특히 바람직하게 간단하고 효율적인 방법으로 높은 안정성과 양성 생장 및 생산성 특성을 갖는 고생산성 세포주, 특히 장기간의 배양 및 생산 기간 동안 일정한 생산성을 제공하는 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 독립 청구항에 따른 요지를 제공하여 직면한 기술적 문제들을 해결하였다.
구체적으로, 본 발명은 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 부위 특이적 통합(SSI) 숙주세포를 제공하여 본 발명의 기술적 문제를 해결하였고, 여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 상기한 Fer1L4 유전자에 통합된다. 일부 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 목적하는 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 표적 부위는 목적하는 서열을 코팅하는 적어도 하나의 유전자 옆에 위치한다. 다른 구체예에서, 재조합 표적 부위는 목적하는 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자에 인접하고 옆에 위치하지 않는다. 일부 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열은 적어도 하나의 선택 마커 유전자를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 내인성 Fer1L4 유전자에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열이 목적하는 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자, 바람직하게 적어도 하나의 선택 마커 유전자 옆에 있는 2개의 재조합 표적 부위라고 예상하였으며, 이것은 하나의 제1 재조합 표적 부위가 목적하는 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자, 바람직하게 적어도 하나의 선택 마커 유전자에 대해 5' 상류에 위치하고 하나의 제2 재조합 표적 부위는 그에 대해 3' 하류에 위치하는 것을 의미한다.
바람직하게, 목적하는 유전자 코딩 서열은 목적하는 단백질, 예를 들어 항체, 항원, 효소, 검출가능한 단백질, 예를 들어 형광성 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질, 호르몬, 성장인자, 리셉터, 융합 단백질 또는 선택 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절인자, 예컨대 프로모터에 작용적으로 연결될 수 있다. 바람직하게, 목적하는 유전자 코딩 서열은 선택 마커 유전자이다.
본 발명은 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 재조합 표적 부위는 FRT (FLP 동정 표적) 부위이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, FRT 부위는 야생형 FRT 부위, 즉 F 부위이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, FRT 부위는 돌연변이 FRT 부위, 바람직하게 F5 부위, 바람직하게 예컨대 Schlacke and Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12752에 기술된 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열, 예를 들어 선택 마커 유전자는 그의 5' 말단에 야생형 FRT 부위, 그리고 그의 3' 말단에 돌연변이 FRT 부위가 플랭킹(flanking)한다.
본 발명의 내용에서, "목적하는 서열을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 플랭킹(flanking)하는 재조합 표적 부위"란 용어는 재조합 표적 부위가 상기한 목적하는 유전자 코딩 서열에 대해 5'와 3'에 위치하는 것을 의미하고, 이것은 하나의 표적 부위가 목적하는 유전자 코딩 서열에 대해 5'에, 다른 표적 부위는 3'에 위치하는 것을 의미한다. 재조합 표적 부위는 목적하는 유전자 코딩 서열에 직접 인접하거나 규정된 거리에 위치할 수 있다.
플랭킹 서열, 특히 플랭킹 재조합 표적 부위는 순배향(forward orientation) 또는 역배향으로 위치하고, 바람직하게 둘다 순배향이거나, 바람직하게 둘다 역배향이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 재조합 표적 부위는 lox 부위이다.
재조합 표적 부위가 FRT 부위인 경우에 교차(crossover) 또는 재조합을 얻기 위해 숙주세포는 FLP (FLP 재조합효소(recombinase))의 존재 및 발현이 필요하다. 재조합 표적 부위가 lox 부위인 경우에 숙주세포는 Cre 재조합효소의 존재 및 발현이 필요하다.
FLP 또는 Cre 재조합효소의 존재 및 발현은 모두, 예를 들어 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있는 숙주세포에 FLP 또는 Cre 재조합효소를 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 도입하여 얻어질 수 있다.
따라서, 본 발명은 숙주세포, 바람직하게 외인성 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 적어도 2개의 재조합 표적 부위, 특히 FRT 부위 및/또는 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열을 사전결정된 "핫스팟(hot-spot)", 즉 Fer1L4 유전자에 포함하여 생장, 생산성 및 안정성의 포지티브 조합을 지원하는 숙주세포주를 제공한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 원에서 제공된 SSI 숙주세포에서 목적하는 유전자 코딩 서열의 발현은 적어도 70, 100, 150, 200, 또는 300 세대 동안 안정하다. 발현이 30% 미만까지 감소하면 발현이 "안정"하거나, 시간이 지남에 따라 같은 수준에서 또는 증가된 수준에서 유지된다. 일부 구체예에서, 용량적 생산성이 30% 미만까지 감소하면 발현은 안정하거나, 시간이 지남에 따라 동일 수준으로 유지되거나 증가한다. 일부 구체예에서, 본 원에서 제공된 SSI 숙주세포는 목적하는 유전자 코딩 서열의 발현 생성물을 적어도 1.5 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 또는 5 g/L 생산한다. 일부 구체예에서, 본 원에서 제공된 SSI 세포, 특히 세포주는 너무 안정해서 선택 없이도 배양에서 유지될 수 있어서 현재의 세포주는 관리기관에서 보다 허용가능한 위치를 가진다. 경제적 측면에서, 본 발명은 본 세포주의 고도로 예측가능한 성능 때문에 과정의 상이한 단계에서 스크린하는데 적은 수의 세포주가 필요하기 때문에 신속하고 자원 효율적인 세포주 개발이 가능하다. 따라서, 더 많은 바이오의약품 후보물질, 예를 들어 단일클로날 항체(mAb) 후보물질이 제공된 표적에 대해서, 또는 복수 표적에 대해 더 많은 후보물질이 표준 방법보다 개발될 수 있다. 궁극적으로 이것은 목적하는 단백질, 바람직하게 치료 mAb에 대한 단축된 임상시간으로 환자에게 유리할 수 있다.
본 발명의 내용에서, "핫스팟"이란 용어는 위치를 의미하고, 생성물, 즉 목적하는 유전자 코딩 서열의 단백질의 안정하고 고도로 발현활성인, 바람직하게 전사 활성인 제조를 제공하는, 특히 목적하는 유전자 코딩 서열가 코딩하는 단백질의 강력하고 안정한 제조를 제공하는 숙주세포의 게놈 내 부위를 의미하고, 바람직하게 여기서 목적하는 유전자 코딩 서열은 숙주세포 내에 형질감염 후에 상기한 위치에 통합된다.
본 발명의 내용에서, "부위(site)"란 뉴클레오티드 서열, 특히 뉴클레오티드의 정의된 스트레치(defined stretch), 즉 뉴클레오티드 서열의 정의된 길이를 지칭하고, 바람직하게 뉴클레오티드의 정의된 스트레치는 뉴클레오티드의 거대 스트레치의 일부이다. 일부 구체예에서, 부위, 예를 들어 "핫스팟"인 부위는 게놈의 일부이다. 일부 구체예에서, 부위는 게놈, 예를 들어 재조합 표적 부위에 삽입된다. "재조합 표적 부위"는 재조합효소와 함께, 표적화된 재조합에 필수적이고 이를 가능하게 하며 이러한 재조합의 위치를 정하는 뉴클레오티드의 스트레치이다.
본 발명의 내용에서, "숙주세포"란 용어는 이하에서 "수용체 세포"라고도 하며, 그의 게놈 내에, 바람직하게는 안정하게 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포를 지칭한다.
본 발명의 내용에서, "세포"는 바람직하게 포유동물 세포, 특히 설치류 세포, 바람직하게 마우스 세포, 햄스터 세포, 바람직하게 중국 햄스터 세포, 바람직하게 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게 CHOK1 세포, 바람직하게 CHOK1SV 세포이다. 바람직하게, 세포는 인간 세포이다. 바람직하게, 세포는 비인간 세포이다.
본 발명의 내용에서, "세포"란 용어는 바람직하게 세포주의 세포를 의미한다. 바람직하게, "세포주"란 용어는 구축된 불멸화(immortalized) 세포주를 지칭한다.
일 구체예에서 "세포"란 용어는 또한 1차 세포(primary cell)를 의미한다.
본 발명의 내용에서, "부위 특이적 통합 (SSI) 숙주세포"란 용어는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포를 의미한다. 일부 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 재조합 표적 부위를 포함하여, 외인성 뉴클레오티드 서열의 부위 특이적 통합이 가능하고, 그에 따라 숙주세포 게놈의 원하는 위치에서 원하는 뉴클레오티드 서열의 미리 결정된 국소화된 방향성 통합이 가능하다. 따라서, 일부 구체예에서, 부위 특이적 통합 숙주세포는 목적하는 유전자 코딩 서열의 표적화된 통합을 할 수 있다. 더욱 바람직하게, 부위 특이적 통합 숙주세포는 재조합 매개 카세트 교환(RMCE)에 의해 목적하는 유전자 코딩 서열의 표적화된 통합을 할 수 있다. 바람직하게, 이러한 방법은 유전자 코딩 서열의 단 하나의 작용성 카피, 바람직하게 목적하는 유전자 코딩 서열의 단 하나의 카피를 사전결정된 위치에 삽입한다. 바람직하게, 이 방법은 벡터 서열, 예를 들어 원핵성(prokaryotic) 벡터 서열을 숙주세포에 동시에 삽입하지 않는다.
또다른 바람직한 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열의 2 작용성 카피가 SSI 숙주세포에 삽입된다.
본 발명의 내용에서, "선택 마커 유전자"란 뉴클레오티드 서열, 특히 유전자 코딩 서열을 지칭하고, 이것은 이하에서 영역이라 불리는 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열, 조절 및 작용적 제어 하 적어도 하나의 조절인자, 특히 프로모터를 의미하고, 여기서 단백질 코딩 영역은 상기 단백질을 발현하는 숙주세포의 선택이 가능한 단백질을 코딩한다.
본 발명의 내용에서, FRT란 용어는 FLP 인식(recognition) 표적을 의미한다. FRT는 생체 내에서 조절된 조건 하에 유기체 DNA의 조작이 가능한 부위 지정 재조합 기술을 실행할 수 있는 34염기쌍의 긴 뉴클레오티드 서열이다. FRT는 FLP 재조합효소(FLP)에 의해 결합되며, 이것은 나중에 상기 서열을 분해하여 2개 FRT 부위 사이에 통합된 뉴클레오티드 서열의 재조합을 할 수 있다. RMCE에 있어서, 2개의 플랭킹 재조합효소 표적 서열; 교환될 카세트의 5' 말단에 하나와 3'말단에 하나에 의해 매개된 2 교차 이벤트가 필요하다. 교차는 2개의 동일한 FRT 부위 사이에서 일어날 수 있다. 또한, FRT 부위의 사용은 FLP 재조합효소의 발현과 존재를 필요로 한다. 본 원에서 "FRT/FLP"라 불리는 전체 시스템은 Seibler and Bode, Biochemistry 36 (1997), pages 1740-1747, 및 Seibler et al., Biochemistry 37 (1998), pages 6229-6234에 기술되어 있다.
본 발명의 내용에서, 특히 동족체가 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 99.5 %의 서열 상동성을 야생형 Fer1L4 유전자, 바람직하게 야생형 Fer1L4 유전자의 전체 길이, 바람직하게 야생형 햄스터 Fer1L4 유전자, 바람직하게 NCBI 기탁번호 NW_003613833 또는 JH000254.1로부터의 좌표 1176191 내지 1781992를 갖는 것들, 바람직하게 야생형 CHO Fer1L4 유전자 또는 그의 단축형태에 대해 갖는 한, Fer1L4 유전자는 Fer1L4 야생형 유전자, 그의 모든 이성체 및 그의 모든 동족체이다.
가장 바람직하게, 본 SSI 숙주세포에 존재하는 야생형 Fer1L4 유전자는 먼저 5' 위치 플랭킹 서열의 5' 통합 부위가 엑손 39와 40 사이에 위치하고, 두 번째로, 3' 위치 플랭킹 서열의 3' 통합 부위가 엑손 28과 29 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 바람직한 일 구체예에서, 외인성 서열의 통합은 내인성 Fer1L4 유전자의 일부, 바람직하게 엑손 28 내지 40을 가로지르고(spanning) 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 Fer1L4 유전자 일부는 SSI 숙주세포에서 결실된다.
본 발명에서, "동족체(homologues)" 또는 "상동성 서열"은 특이적으로 제공된 비교 서열, 예를 들어 야생형 CHO Fer1L4 유전자 또는 그의 일부, 예를 들어 서열번호 7, 8 또는 9에 대해 상기한 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 내용에서, "서열 상동성"이란 용어는 정렬된 뉴클레오티드 간의 유사성을 최대화하고, 동일한 뉴클레오티드의 수, 전체 뉴클레오티드의 수 및 서열 정렬 내에서 갭의 존재 및 길이의 함수인 서열의 배열에 기초한 두 서열의 동일성 또는 유사성 정도의 척도를 지칭한다. 다양한 알고리즘과 컴퓨터 프로그램이 표준 매개변수를 사용하여 서열 유사성을 결정하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 서열 상동성은 핵산 서열에 대한 BLASTn 프로그램을 사용하여 측정되며, 이것은 National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 입수가능하고, 예를 들어 Altschul et al. (1990), J Mol. Biol. 215:403-410; Gish and States (1993), Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol. 266: 131-141 ; Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:33 89-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(l-2):203-14에 기술되어 있다. 바람직하게, 두 뉴클레오티드 서열의 서열 상동성은 BLASTn 알고리즘에서 다음 매개변수에 기초한 스코어이다: 단어 크기 = 11; 갭 오프닝 페널티 = -5; 갭 연장 페널티 = -2; 매치 보상(match reward) = 1; 및 미스매치 페널티 = -3.
따라서, Fer1L4 유전자는 CHO Fer1L4 유전자 자체이거나, 예를 들어 인간 Fer1L4 유전자, 예를 들어 Dysferlin (Fer1L1 ), Otoferlin (Fer1L2), Myoferlin (Fer1L3), Fer1L4, Fer1L5, 또는 Fer1L6일 수도 있다.
바람직하게, 본 Fer1L4 유전자는 또한 C. elegans Fer1 유전자 (NCBI 유전자 ID: 172659, WormBase: WBGene00001414) 또는 포유동물 세포 내에 6 멤버가 있는 펄린(ferlin)류의 다른 멤버일 수 있다. 펄린은 혈관 융합, 특히 멤브레인 융합을 촉진한다. C. elegans Fer1은 유충에서 세포소기관의 플라즈마 멤브레인으로의 융합과 정상적 재생에 필요하다(Achanzar, W. E., and Ward, S., J. Cell Sci. 110 (1997), 1073-108; Washington, N. L, and Ward, S., J. Cell Sci. 119 (2006), 2552-2562).
C-터미널 말단을 따라, 포유동물 펄린류 멤버들은 또한 다수(6 또는 7)의 C2 도메인을 함유한다(Sutton RB et al. Cell 80 (1995), 929-38; Shao et al. Science 273 (1996), 248-251). 따라서, C2 도메인을 코딩하는 유전자는 이하에서 본 야생형 Fer1L4 유전자에 대해 상동성인 것으로 간주된다.
본 발명의 내용에서, "외인성 유전자" 또는 "외인성 뉴클레오티드 서열"이란 용어는, 예를 들어 통상적인 유전자조작방법, 바람직하게 형질전환, 전기천공 또는 형질감염에 의해 숙주세포에 삽입된, 삽입 전에 숙주세포에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 서열은 또한 "유전자이식물(transgenic)"이라 한다.
"내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오티드 서열"은 숙주세포에서 유래하여 존재하고, 따라서 상기 숙주세포 외부로부터 삽입되지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
"뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 바람직하게 핵산, 바람직하게 DNA 또는 RNA를 지칭한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 적어도 2개의 재조합 표적 부위가 플랭킹하는 목적하는 유전자 코딩 서열은 선택 마커 유전자이거나 항체, 예를 들어 단일클로날 항체, 항체 유도체, 융합 단백질, 효소 또는 생물학적으로 활성인 단백질, 예를 들어 성장인자 또는 펩티드 호르몬, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, 인터루킨, 인터페론 등, 특히 약학적 또는 영양적 기능성 단백질을 코딩하는 유전자 코딩 서열이다. 바람직하게 목적하는 유전자 코딩 서열은 숙주세포에 대해 외인성이다.
다른 바람직한 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열은 또한 유전자의 구조적으로 또는 작용적으로 정의된 일부, 예를 들어 항체의 단편, 예컨대 그의 중쇄 또는 경쇄 또는 작용성 단백질의 일부일 수 있다. 일부 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열은 폴리펩티드의 구조적으로 또는 작용적으로 정의된 일부, 예를 들어 별도 도메인, 도메인 세트, 또는 도메인의 일부, 예컨대 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 항체의 정상 영역을 포함하는 발현 생성물을 코딩할 수 있다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 선택 마커는 GS 선택 마커, 하이그로마이신(hygromycin) 선택 마커, 퓨로마이신(puromycin) 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커이다.
본 발명의 내용에서, GS 마커 유전자에 의해 코딩되는 GS 선택 마커는 GS 마커 시스템에서 작동한다. 따라서, 글루타민 부재 하에 성장 배지에서 글루타민 신테타제(synthetase)(GS) 활성은 배양에서 포유동물 세포 생존에 필수적이다. 일부 포유동물 세포주, 예컨대 마우스 골수종 계통은 글루타민 첨가 없이 생존하는데 충분한 GS를 발현하지 않는다. 이러한 세포주들이라면 형질감염된 GS 마커 유전자는글루타민이 없는 배지에서 증식을 가능하게 함으로써 선택가능한 마커로서 작용할 수 있다. 다른 세포주, 예컨대 중국햄스터 난소 세포주는 외인성 글루타민 없이 생존하는데 충분한 GS를 발현한다. 이 경우, GS 저해제 메티오닌설폭시민 (MSX)을 사용하여 추가적인 GS 활성을 갖는 형질감염체 만이 생존할 수 있도록 내인성 GS 활성을 저해할 수 있다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 숙주세포는 CHO 숙주세포 또는 CHOK1SV (Porter, AJ et al. Biotechnol Prog. 26 (2010), 1455-1464) 숙주세포이다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 외인성 서열은 위치 1750049 (5' 통합 부위)에서 1760965 (3' 통합 부위) (도 7 참조)를 가로지르는 위치에 통합된다. 플랭킹 서열은 바람직하게 스캐폴드 좌표 1750049 내지 1750870 (5' 말단, 서열번호 9, 822 bp) 및 1758964 내지 1760965 (3' 말단, 서열번호 7 및 8, 2000bp)(도 7 참조)에 위치한다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 양 옆에 있는 Fer1L4 유전자의 뉴클레오티드 서열, 즉 그 자체가 5' 및 3' 말단에서 하나의 재조합 표적 부위 각각에 의해 플랭킹된 목적하는 유전자 코딩 서열 적어도 하나는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 서열번호 7, 8 또는 9에 제공된 서열에 상동성인 플랭킹 서열은 야생형 Fer1L4 유전자의 이들 영역, 바람직하게 그의 전체 길이에 대하여 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 99.5 %의 서열 상동성을 갖는다.
따라서, 특히 바람직한 구체예에서 본 발명의 SSI 숙주세포는 외인성 뉴클레오티드 서열, 즉 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열의 존재를 특징으로 하고, 그 자체는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 재조합 표적 부위 각각이 플랭킹되고, 여기에서 서열번호 7 또는 8 또는 그의 상동성 서열의 뉴클레오티드 서열 적어도 하나는 숙주세포 게놈에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 위치한다.
따라서, 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 SSI 숙주세포는 외인성 뉴클레오티드 서열, 즉 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열의 존재를 특징으로 하고, 그 자체는 그의 5' 및 3' 말단에서 재조합 표적 부위 각각으로 플랭킹되고, 여기에서 서열번호 9 또는 그의 상동성 서열로 제공된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 숙주세포 게놈에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 위치한다.
바람직하게, SSI 숙주세포는 외인성 뉴클레오티드 서열, 즉 목적하는 유전자 코딩 서열 적어도 하나를 포함하고, 그 자체는 5'과 3' 말단에서 하나의 재조합 표적 부위가 각각 플랭킹하고, 재조합 표적 부위는 그의 3' 말단에 서열번호 7, 8 또는 그의 상동성 서열의 뉴클레오티드 서열 적어도 하나 및, 그의 5' 말단에 서열번호 9 또는 그의 상동성 서열에 제공된 뉴클레오티드 서열이 플랭킹된다.
특히 바람직한 구체예에서, 서열번호 7, 8, 9 또는 그의 상동성 서열의 제공된 5'- 및/또는 3'-플랭킹 서열은 Fer1L4 유전자에 통합된 재조합 표적 부위(들)의 5' 말단 또는 3' 말단 또는 5' 말단 및 3' 말단에 직접 인접하여 개재(intervening) 서열 없이 위치한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서는 단리된 뉴클레오티드 분자, 바람직하게 Fer1L4 유전자의 일부, 예를 들어 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특히, 단리된 뉴클레오티드 분자, 바람직하게 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서는, 벡터, 바람직하게 본 발명의 단리된 뉴클레오티드 분자, 특히 서열번호 7, 8, 9 또는 그의 동족체를 포함하는 발현벡터 및 상기한 벡터 또는 상기한 뉴클레오티드 분자를 포함하는 형질감염된 숙주세포가 제공된다.
Fer1L4 위치를 정의하는 핵산 서열, 즉 Fer1L4 유전자의 핵산 서열, 즉 Fer1L4 뉴클레오티드 서열, 특히 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열은 본 원에서 리포터 단백질을 고농도로 발현하는 세포주의 발현 카세트를 포함하는 핵산 구조물의 통합부위 상부 및 하부 서열에 의해 실험적으로 동정된다. 본 발명의 이러한 핵산 서열은 핵산, 예를 들어 시스작용요소(cis-acting element), 예컨대 프로모터, 인핸서, 위치 조절 영역, 스캐폴드 부착 영역 또는 매트릭스 부착 영역에 대해 앞서 기술된 것과 달리 작용하는 것으로 보이는 목적하는 유전자 코딩 서열을 포함하는 외인성 핵산의 안정하고 강화된 발현과 연관된 신규한 작용성을 갖는 서열을 제공한다.
본 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 가지는 것으로 보이지 않아서 이들이 트랜스 활성체(trans-activator) 단백질을 코딩할 것 같지는 않다. 형질감염 실험에서는 본 서열이 시스작용요소의 일부 특징을 보이는 것으로 나타났다. 본 서열 활성은 일시적 형질감염 어세이에서 검출되지 않았으며; 본 서열은 또한 이러한 방법으로 검출된 프로모터와 인핸서 인자와는 다른 것으로 보인다.
본 발명은 또한 Fer1L4 뉴클레오티드 서열, 특히 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열의, 벡터, 특히 발현벡터, 특히 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열을 포함하는 비-RMCE 발현벡터에서, 특히 세포주를, 바람직하게 무작위 방법으로 제조하기 위한, 특히 강화된 발현을 나타내는 세포주를 제조하기 위한, 특히 바람직하게 고빈도로, 바람직하게 높은 생산 안정성을 제공하는 고생산체 세포주를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 이러한 용도는 상기한 Fer1L4 뉴클레오티드 서열, 바람직하게 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하고 그로부터 안정하게 형질감염된 세포주를 얻는 벡터를 사용한 세포의 형질감염을 예견한다.
따라서, 본 발명은 또한 세포 또는 세포주, 바람직하게 높은 생산 안정성을 갖는 고생산체 세포 또는 세포주를 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서 Fer1L4 뉴클레오티드 서열, 특히 바람직하게 벡터, 바람직하게 발현 벡터, 바람직하게 비-RMCE 발현벡터에 통합된, 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열은 세포 또는 세포주 내에 형질감염되고 안정하게 형질감염된 세포 또는 세포주가 선택 및 얻어진다. 본 원에서 동정된 Fer1L4 위치의 서열 또는 그 일부의 존재는 목적하는 유전자에 시스작용효과를 제공하여 이들이 게놈에 통합될 때 그의 발현을 강화한다. 무작위 공정에서 이 방법으로 생성된 세포주는 더 높은 생산 안정성을 나타낼 것으로 예상된다.
본 발명은 바람직하게 안정한 고도의 전사 활성 세포주 또는 세포의 제조를 위한 발현벡터 내 Fer1L4 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게 상기한 용도에 관한 것으로, 여기에서 Fer1L4 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7, 8, 9에 제공된 뉴클레오티드 서열 및 그의 상동성 서열로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명은 바람직하게 세포 또는 세포주를 제조하는 본 발명에 따라 제조된 숙주세포를 적합한 배지에서 배양하고 그로부터 생성물을 회수하는 것을 포함하는 목적하는 유전자 코딩 서열의 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 SSI 숙주세포에 관한 것으로, 여기에서 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 야생형 FRT 부위, 바람직하게 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 야생형 FRT 부위, 또는 적어도 하나의 돌연변이성 FRT 부위, 바람직하게 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 돌연변이성 FRT 부위를 포함한다. 가장 바람직하게, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 하나의 야생형 FRT 부위와 하나의 돌연변이성 FRT 부위이다. 특히 바람직하게, 목적하는 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자는 야생형 FRT, 바람직하게 목적하는 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자에 대해 5'에 위치하는 야생형 FRT와, 돌연변이성 FRT 부위, 바람직하게 목적하는 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자에 대해 3'에 위치한 돌연변이성 FRT 부위 사이에 위치한다. 이것은 바람직하게 재조합 매개 카세트 교환이 항상 동일한 배향으로 일어나도록 한다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 다음 단계들을 포함하는 본 발명에 따른 SSI 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것이다: a) 바람직하게 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 세포를 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 제1 벡터로 형질감염하고(여기서 카세트는 적어도 2개의 재조합 표적 부위, 특히 적어도 하나의 목적하는 제1 유전자, 바람직하게 mAb 코딩 서열에 플랭킹하는 FRT 부위를 포함한다); b) 적어도 2개의 재조합 표적 부위, 특히 내인성 Fer1L4 유전자에 통합된 적어도 하나의 목적하는 제1 유전자 코딩 서열에 플랭킹하고 목적하는 제1 유전자 코딩 서열의 생성물에 대하여 안정한 고생산성을 나타내는 FRT 부위를 포함하는 형질감염된 세포를 선별하고; c) b)에서 얻어진 세포를, 제2 교환가능한 카세트를 포함하는 제2 벡터로 형질감염하고(여기서 카세트는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위, 특히 적어도 하나의 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 즉 선택 마커 유전자에 플랭킹하는 FRT 부위를 포함한다); d) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행한 다음; e) 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자를 발현하는 형질감염된 세포를 선별하여 본 발명에 따라 게놈 내에 안정하게 통합된 제2 교환가능한 카세트를 포함하는 SSI 숙주세포를 얻는 단계(예를 들어, 도 4 참조).
바람직하게, 목적하는 제1 및 제2 유전자 코딩 서열은 그의 말단들 중 하나에 제1 재조합 표적 부위가, 그리고 그의 다른 말단에 제1 표적 부위와는 다른 제2 재조합 표적 부위가 플랭킹된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 SSI 숙주세포를 제조하는 방법을 제공하고, 이 방법은 재조합효소 매개 카세트 교환을 사용하고, 이 과정에서 재조합 표적 부위가 플랭킹하는 목적하는 제1 유전자, 바람직하게 mAb를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 교환가능한 카세트가 벡터에 의해 숙주세포에 감염되고, 숙주세포의 게놈, 특히 그의 "핫스팟"에 통합되고, "핫스팟" 형질감염체를 선별한 후, 예를 들어 환형 교환 플라스미드의 일부이고 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열, 특히 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자로 구성되고 재조합 표적 부위를 매칭하여 플랭킹되어 있는 제2 교환가능한 카세트가 숙주세포에 형질감염되고 재조합하여 목적하는 제1 유전자 코딩 서열이 목적하는 제2 유전자 코딩 서열로 교환된다(예를 들어, 도 4 참조). 유리하게, 목적하는 유전자 코딩 서열의 한 카피만이 사전 결정된 위치에 삽입되고, 벡터 서열, 특히 교환 플라스미드의 플라스미드 서열은 숙주 게놈에 통합되지 않는다.
a)와 b)에서 목적하는 유전자 코딩 서열 생성물의 안정하고 높은 생산을 나타내는 "핫스팟"이 적어도 목적하는 제1 유전자 코딩 서열, 예를 들어 항체, 예를 들어 mAb, 또는 그의 일부를 코딩하는 유전자를 사용하여 동정될 수 있고, 산업적으로 이용가능한, 예를 들어 바이오의약품 관련 단백질의 유전자이고, c), d) 및 e)에서 목적하는 "핫스팟"을 동정하기 위해 사용되는 목적하는 제1 유전자 코딩 서열이 소위 무효화(null) 카세트, 특히 적어도 하나의 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 즉 선택 마커 유전자를 포함하는 제2 교환 카세트로 완전히 교환되는 한 SSI 숙주세포를 제조하는 본 방법이 유리하다. 이 방법으로, "핫스팟" 동정에 사용된 목적하는 제1 유전자 코딩 서열 중 미리 존재하는 서열이 없는 SSI 숙주세포가 생성되어 추가적인 재조합효소 매개 카세트 교환이 상기한 "핫스팟"에 목적하는 다른 유전자 코딩 서열, 즉 목적하는 제3 유전자 코딩 서열이 위치하여 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자를 대체한다. 따라서, 현재 얻어진 SSI 숙주세포를 사용하여 다른 재조합효소 매개 카세트 교환을 초래하여 동정된 "핫스팟"에서 숙주세포 게놈 내에 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 배치할 수 있다.
본 발명의 내용에서, "매칭 재조합 표적 부위"란 용어는 교환가능한 카세트의 재조합 표적 부위의 제1 부위가 또다른 교환가능한 카세트의 제1 재조합 표적 부위에 일치하고, 먼저 언급된 교환가능한 카세트의 제2 재조합 표적 부위가 다른 교환가능한 카세트의 제2 재조합 표적 부위와 동일하여 재조합 표적 부위 사이에서 뉴클레오티드 서열의 교환이 가능한 것을 의미한다. 바람직하게, 교환가능한 카세트 둘 다의 제1 재조합 표적 부위는 양자의 교환가능한 카세트의 제2 재조합 표적 부위와는 다르다.
본 발명은 바람직한 구체예에서 다음을 포함하는 목적하는 유전자 코딩 서열의 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다: i) 적어도 하나의 목적하는 제3 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위와 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 적어도 하나의 제3 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 본 발명에 따른 SSI 숙주세포를 형질감염하고, ii) 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 포함하는 SSI 숙주세포를 얻도록 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행하고, iii) ii)에서 얻어진 SSI 숙주세포에서 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 발현하고, iv) 목적하는 제3 유전자 코딩 서열의 생성물을 회수하는 단계.
본 발명의 주요 이점은 동정된 "핫스팟" 내의 목적하는 제1 유전자 코딩 서열, 즉 Fer1L4 유전자를 포함하는 b)에서 생성된 SSI 숙주세포에서 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 포함하는 SSI 숙주세포까지 이어지는 고유한 생산 안정성의 제공이다. 이러한 안정성은 선별과 무관하고 a) 및 b)에서 특징으로서 동정된 "핫스팟"이 "핫스팟" 주위 또는 다른 곳으로 게놈 내 서열과 연관된다는 결론이 가능하다. 무작위 벡터 통합에 기초한 세포주 구성에 있어서, 이것은 매우 드문 일이고, 이러한 부위를 확인하기 전의 노력은 막대하다. 따라서, 본 발명은 적합한 세포주를 선택하는데 연장된 안정성 연구의 배제가 가능하여 전체적인 단축 개발 주기와 자원 감소를 얻는다. 또한, 본 발명은 재조합 매개 카세트 교환 후에 선별 없이 세포를 배양할 수 있는데, 이는 제조공정이 잠재적으로 관리기관에 대해 보다 허용가능한 것을 의미한다. 유리하게, 본 "Fer1L4 핫스팟"은 mAb를 사용하여, 바람직하게 형광 마커를 사용하지 않고 정의 및 동정된다.
본 발명은 SSI 숙주세포의 제조방법을 제공하며, 여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 세포 내의 내인성 Fer1L4 유전자 내로 표적화 통합에 의해 삽입된다. 뉴클레오티드 서열을 게놈 내 목적하는 특정 부위로 지정하는 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 상동성 재조합과, 뉴클레아제 매개 방법, 예를 들어 파보바이러스(parvovirus) 매개 상동성 재조합의 사용, 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 유사 이팩터 뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제의 사용이 있다(예를 들어, Russell and Hirata, Nat. Med. 18(4):325-30, 1998; 미국 공개특허 제20120070890호; 미국 특허 제6,528,313호; 미국 공개특허 제20090258363호 참조). 이러한 방법으로 삽입된 외인성 뉴클레오티드 서열은 본 원에 기술된 특징들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열 및/또는 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 목적하는 유전자 코딩 서열은 적어도 하나의 선택 마커 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 SSI 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 외인성 뉴클레오티드 서열을 세포 내 내인성 Fer1L4 유전자에 삽입하는 것을 포함한다. 바람직하게, 외인성 뉴클레오티드 서열은 상동성 재조합에 의해 Fer1L4 유전자와 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 여기서, 폴리뉴클레오티드는 a) Fer1L4 유전자의 제1 부분에 상동인 제1 뉴클레오티드 서열, b) 외인성 뉴클레오티드 서열 및 c) Fer1L4 유전자의 제2 부분에 상동인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열의 삽입은 바람직하게 바이러스 벡터, 예를 들어 상동성 재조합을 매개하는 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제, 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 유사 이팩터 뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 사용하여 촉진된다. 특히 바람직하게, 아데노 관련 바이러스 벡터가 사용된다. 특히 바람직한 구체예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 재조합 표적 부위, 바람직하게 loxP 부위가 플랭킹한다.
본 발명은 또한 측면 A에서, a) 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 세포를 제공하고(여기서 내인성 뉴클레오티드 서열은 Fer1L4 유전자 내에 통합되고, 적어도 하나의 목적하는 제1 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함한다); b) 적어도 하나의 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 즉 선택 마커 유전자에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위를 포함하는 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 a)에서 제공된 세포를 형질감염하고, c) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행한 다음, d) 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 선별하여 게놈 내에 안정하게 통합된 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 SSI 숙주세포를 얻는 단계를 포함하는 SSI 숙주세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, a) 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 세포를 제공하고(여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 Fer1L4 유전자 내에 통합되고, 적어도 하나의 목적하는 제1 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함한다); b) 적어도 하나의 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 즉 선택 마커 유전자에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위를 포함하는 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 a)에서 제공된 세포를 형질감염하고, c) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행한 다음, d) 목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 바람직하게 선택 마커 유전자를 발현하는 형질감염 세포를 선별하여 게놈 내에 안정하게 통합된 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 SSI 숙주세포를 얻는 단계를 포함하는 SSI 숙주세포의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다음을 추가로 포함하는 상기한 측면 A 방법에 관한 것이다: i) 적어도 하나의 목적하는 제3 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위와 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 적어도 하나의 제2 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 SSI 숙주세포를 형질감염하고, ii) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행하여 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 포함하는 SSI 숙주세포를 얻고, iii) ii)에서 얻어진 SSI 숙주세포가 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 발현하여, iv) 목적하는 제3 유전자 코딩 서열의 생성물을 회수하는 단계.
본 발명은 또한 안정하고 고도로 전사적으로 활성인 세포주의 제조를 위한, 세포, 바람직하게 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 CHO 세포, 바람직하게 CHO Fer1L4 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명을 보다 상세히 기술하기 전에, 본 발명이 기술된 특정 구체예에 제한되지 않고, 당연히 변화가능한 것을 이해하여야 한다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정되므로, 본 원에서 사용된 용어들은 단지 특정 구체예를 기술하기 위한 것이고 제한을 의미하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 원에서 사용된 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 사람들에게 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만 가능하고 바람직한 방법과 물질들을 이하에 기술하였다. 본 원에서 언급된 모든 간행물은 간행물에서 인용된 방법 및/또는 물질을 기재하고 기술하기 위해 참조로 본 원에 포함되었다. 본 명세서는 포함된 간행물의 내용을 모순이 있는 범위까지 대체할 수 있다.
본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 용어들은 내용상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 용어들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"란 용어는 이 세포의 복수를 포함하고, "벡터"란 하나 이상의 벡터와 당업자들에게 알려진 그의 등가물 등에 대한 용어를 포함한다.
본 원에서 언급된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 그 공개의 목적으로만 제공된다. 본 원의 어떤 것도 본 발명이 이전 발명에 따른 이러한 간행물에 선행하는 것을 인정받지 못하는 승인으로서 해석되지 않아야 한다. 또한, 제공된 간행물의 날짜는 실제 공개일과 상이할 수 있어서 독립적으로 확인하는 것이 필요할 수 있다.
보다 바람직한 구체예는 종속항의 요지이다.
서열번호 1 내지 3은 본 발명에서 사용된 벡터의 뉴클레오티드 서열을 나타내고,
서열번호 4 내지 6은 본 발명에서 사용된 프라이머(primer)를 나타내고,
서열번호 7과 8은 Fer1L4 CHO 유전자의 3'-위치 서열을 나타내고,
서열번호 9는 Fer1L4 CHO 유전자의 5'-위치 서열을 나타내고,
서열번호 10과 11은 본 발명에서 사용된 다른 프라이머를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예와 첨부된 도면에 의해 더욱 상세히 설명하였다.
도면은 다음을 나타낸다:
도 1은 CHOK1SV에서 "핫스팟"을 동정하기 위해 사용된 벡터 pRY17(서열번호 1)을 나타낸 것이다. LC1과 HC1은 키메릭 단일클로날 IgG4 항체, cB72.3의 경쇄와 중쇄이다. hCMV는 hCMV-MIE 조기 유전자 프로모터를 지칭하고, 여기서 'Int'는 그의 제1 인트론(intron)을 나타내고, 인트론 A와 5' UTR을 코딩하는 플랭킹 엑손은 각각 'EX1'과 'EX2'로 표시된다. 야생형 및 F5 돌연변이성 FRT 부위는 각각 F와 F5로 표지되었다. 폴리아데닐화, SV40 조기 프로모터 및 β-락타마제(lactamase) 서열은 각각 pA, SV40 및 bla로 표시되었다. GS는 글루타민 신타제 cDNA를 나타내고 Hyg (-ATG)는 개시 메티오닌 코돈과 프로모터가 없는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 나타낸다.
도 2는 SSI 숙주 10E9를 생성하기 위해 사용된 '중간체' 벡터, pRY37 (서열번호 2)을 나타낸 것이다. 이 벡터는 티미딘 키나제(TK)와 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC) 유전자를 함유하는 전사단위에 플랭킹하는 돌연변이 FRT (F5)와 야생형 FRT 부위(F)를 포함한다. 각각에서 전사는 SV40 조기 프로모터 (SV40E)로 유도된다. 벡터 pRY37은 11A7 세포 내에 FLP 재조합효소를 코딩하는 벡터 pOG44 (Invitrogen)로 동시형질감염된다. 세포주는 퓨로마이신 함유 배지의 존재 하에 선별되고, 추가로 pRY37 FRT 서열과 11A7 게놈에 내장된 pRY17의 등가 서열 사이에서 RMCE에 대해 스크리닝된다(도 3 참조). 스크리닝과 클로닝 후에, 세포주 10E9가 단리되었고('SSI 숙주'), 여기에서 cB72.3 mAb 전사단위가 TK 및 PAC에 대해 교환되었다.
도 3은 SSI 숙주 10E9에서 mAb 생산 세포주를 생성하는 표적 벡터를 나타낸 것이다. 이 벡터, pRY21 (서열번호 3)은 돌연변이체(F5)와 야생형 FRT 부위가 플랭킹된 Myo mAb 유전자(HC2 및 LC2)를 함유하는 전사단위를 포함한다. 인프레임(in-frame) 개시 메티오닌 코돈은 야생형 FRT 부위(ATG+F)의 5' 말단에 첨가되고 이것의 상부는 SV40 조기 프로모터 (SV)이다. HC2와 LC2 유전자의 전사는 hCMV 주요 전초기(immediate early) 유전자 1 (hCMV-MIE)의 프로모터와 그의 제1 인트론, 인트론 A (Int A) 및 각각 'EX1'과 'EX2'로 표시되는 5' UTR을 코딩하는 플랭킹 엑손으로 작동된다. β-락타마제 유전자는 bla로 표시되었다.
도 4는 11A7 세포주에서 SSI 숙주 10E9를 생성하는 방법을 나타낸 것이다. 이 구성도는 세포주 11A7에서 돌연변이 F5와 야생형 FRT 부위가 플랭킹된 mAb cB72.3 전사단위(HC1과 LC1)를 함유하는 선형으로 유전체적으로 통합된 pRY17의 단일 카피를 나타낸다. 형질감염 전에, 벡터 pRY17은 β-락타마제 유전자(bla)의 중앙에서 Pvu 1으로 절단되고, 이후 유전자의 5' (bla L)와 3' (bla R) 부분이 선형 벡터를 플랭킹한다. 벡터 pRY37은 FLP 재조합효소를 코딩하는 플라스미드로 세포주 11A7 내에 동시-형질감염되고 재조합(X로 표시)은 유사한 부위들 사이에서 발생하여 SV40 조기 프로모터 (SV)로 각각 작동된 티미딘 키나제(TK) 및 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC) 전사단위를 갖는 mAb 전사단위의 RMCE를 유도한다.
도 5는 SSI 숙주, 10E9로부터 mAb 생산 세포주를 생성하는 방법을 나타낸 것이다. 표적 벡터, pRY21 (도 3, 서열번호 3)는 돌연변이 FLP 부위 (F5)가 상부, 그리고 메티오닌 개시 코돈(ATG-F)으로 인프레임 연결된 야생형 FRT 부위의 상부에 SV40 조기 프로모터 (SV) 자체가 하부에 플랭킹된 제2 (Myo) mAb (HC2 및 LC2)의 전사단위를 포함한다. Flp 재조합효소와 표적 벡터 pRY21의 존재 하에, 티미딘 키나제 (TK) 및 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAC) 유전자 및 관련 프로모터들은 RMCE에 의해 새로운 Myo mAb 항체 전사단위로 치환된다. 그 결과, 야생형 FRT 부위와 하이그로마이신 유전자의 작용성 융합 유전자가 생성된다(ATG-F-Lnk-Hyg). 따라서, 특이적 RMCE가 일어난 세포는 하이그로마이신과 간시클로버(ganciclovir)의 존재 하에 선별될 수 있다.
도 6은 SSI 풀(pool) 및 무작위 공정 또는 FLP를 이용한 부위 특이적 통합(SSI)으로부터 유도된 클로날 세포주의 항체 발현의 비교를 나타낸 것이다. 무작위 통합 클론은 1기(Phase)에 세포주 11A7을 생성하기 위해 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 생성되었다. SSI 풀(SSI 라운드 1)과 클로날 세포주(SSI 라운드 2, 및 SSI 라운드 3)는 상이한 형질감염과 방법 섹션에 상세된 선별 조건 하에서 생성하였다. SSI 라운드 3에서는, 4가지 상이한 선별 조건이 사용되었다: 200 μg/mL, MSX 없음(●), 200 μg/mL 하이그로마이신과 MSX (◆), 400 μg/mL 하이그로마이신, MSX 없음(▲) 또는 400 μg/mL 하이그로마이신과 MSX (▼). 모든 공정에서 생성된 클로날 세포주를 진탕 플라스크 내에 증식하였다. 클로날 세포주의 생산성을 7일 최종 뱃치 진탕 플라스크에서 평가하였다(방법 참조).
도 7은 scaffold1492 aka. JH000254.1(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ nuccore/JH000254)의 마이너스 가닥에서 Fer1L4 유전자의 엑손 구조를 나타낸 것이다. 5'와 3' 통합 부위의 위치가 표시되었다(각각 1750049와 1760965).
도 8은 BWA를 사용하여 pRY17-GA-Q에 대해 도표화된 10E9 판독물의 맵핑 (mapping)을 나타낸 것이다. 맵핑의 조사를 통해, 다수의 쌍을 이루지 않은 판독물(검은색 화살표)이 (완전한 HC의 5' 말단으로부터 결실된 214 bp를 갖는)HC 단편의 5' 말단에 맵핑된 것을 발견하였다.
도 9는 SSI 숙주세포 10E9의 Fer1L4 유전자 내 랜딩 패드(landing pad)의 구조를 나타낸 것이다. (A) 랜딩 패드에서 WGRS 적용범위는 '싱글 카피' 모델의 맨 위에 겹쳐서 나타내었고, 아래에 더 상세한 도해를 나타내었다. (B) 써던 블로트 데이터는 랜딩 패드의 2 카피가 있을 수 있음을 시사하였다. 10E9 세포에서 유래한 게놈 DNA를 Bmg I 또는 Pml I 제한효소로 분해하여 써던 블로트로 분석하였다. 써던 블로트는 TK 프로브와 혼성화되어 2 카피의 랜딩 패드('2 카피' 모델에 대해 맵핑된 것으로 도시)을 가로지르는 두 단편을 나타내었다. '2 카피' 모델은 WGRS 데이터와 일치한다.
도 10은 10E9 (SSI 숙주세포)와 RMCE 세포주(목적하는 유전자 발현)의 통합부위에 대한 구성도이다. 게놈 위치는 미배치 CHO-K1 Scaffold1492 스캐폴드 (기탁번호 JH000254.1, NW_003613833.1과 일치) 상에 수직 점선과 뉴클레오티드 좌표로 표시하였다. Fer1L4 유전자는 화살표로 표시되었고 게놈 단편은 실선으로 표시하였다. 끼어있는 점선은 매우 먼 거리를 나타낸다. 5' 및 3' 플랭킹 서열은 흰색과 검은색 포인터 각각으로 표시하였다.
도 11은 통합 벡터 카피 모델에 대한 도표화된 전체 게놈 재서열화 판독물의 커버리지 그래프이다. 회색 차트의 높이는 평활화하지 않은 각 염기에서의 커버리지와 같다(각 RMCE-생성 세포주, 1-4 표시). 플랭킹 영역에서의 커버리지는 대략 모든 세포주에서 동일하다. 그러나, 도면 상단의 2개 고생산체의 커버리지는 하부의 2개 저생산체 커버리지의 대략 1,4 내지 2.3배이다. wFRT 특징은 별표로 표시하였고, mFRT 특징은 검은색 원으로 표시하였다(다른 특징들은 다음과 같이 표시하였다: 214bp 결실을 갖는 HC는 SSI 숙주 10E9 생성 후에 핫스팟에 남겨진 잔여 cB72.3이고; BlaR은 베타-락타마제 유전자의 5' 부분이고; Myo-LC 및 Myo-HC는 핫스팟 후-RMCE에 있는 항-Myostatin mAb HC (중쇄) 및 LC (경쇄) 코딩 서열이고; Hyg는 하이그로마이신이고; BlaL은 베타-락타마제 유전자의 3' 부분이고 GS-cDNA는 글루타민 신타제 코딩 서열 형성 벡터 pRY17이다).
도 12는 통합 벡터(RMCE-생성 세포주 1-4)의 Myo LC 및 HC 영역 상의 도표화된 RNA-seq 판독물의 커버리지 그래프이다. 차트의 높이는 평활화하지 않은 각 염기에서의 커버리지와 같다
실시예
실시예 1 :
A) 재료 및 방법
1. 벡터 구성
모든 벡터 서열을 합성하여 전체 서열화하였다. 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAC), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (Hyg) 및 mAb 유전자를 전체 유전자 최적화하여 유전자 합성 전에 Cricetulus griseus의 코돈 바이어스에 적응시켰다. 대부분의 pRY17(도 1)는 pCB72.3-GA-HC-LC (Kalwy et al. (2006), Mol Biotechnol. 34. pages 151-156)에서 유도되었다. 모든 벡터에 존재하는 야생형 FRT (F)와 돌연변이성 F5 FRT (F5) 재조합 서열에 대한 서열은 Schlake와 Bode (Schlake and Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751)에서 제공되었다. 템플레이트 서열(유전자 최적화가 있거나 없는 유전자 합성 이전)은 다음과 같이 얻어졌다: 벡터 pRY17(도 1) 내의 F 재조합 서열과 링커의 인프레임 융합은 벡터 pFRT/lacZeo (Invitrogen)로부터 얻어졌다. pRY21 (도 3)에서 메티오닌 개시 코돈과 F 재조합 서열의 인프레임 융합은 pcDNAT5/FRT (Invitrogen)로부터 얻었다. 모든 벡터에서, 사용된 SV40 조기 프로모터(pCB72.3-GA-HC-LC로부터 유도된, GS 전사단위와 연관된 것과는 별도)는 상기한 Invitrogen 벡터로부터 얻었다. pRY37 내의 티미딘 키나제 (TK)와 PAC 유전자 서열은 pWSTK6 (gb:EU530625)와 pPUR (Clontech, gb:U07648)에서 각각 유도되었다.
2. 뱃치식 및 유가식 진탕 플라스크 분석
뱃치식 진탕 플라스크 분석에서, 세포를 125 mL 진탕 플라스크에서 다양한 선택제(추후 기술)가 보충된 30 mL CD CHO에 3 x 105 생균수/mL로 접종하여 37 ℃, 습도조절된 5% CO2 하의 공기(v/v) 오비탈 진탕 인큐베이터에서 140 rpm으로 인큐베이션하였다. 조건화된 배지를 배양 7일째에 수집하여 조건화된 배지의 항체 농도를 Protein A HPLC로 측정하였다.
유가식 진탕 플라스크 분석에서, 세포를 각각 독자적인 배지 100 mL를 함유하는 500 mL 진탕 플라스크에 3 x 105 생균수/mL로 접종하여 37 ℃, 습도조절된 5% CO2 하의 공기(v/v) 오비탈 진탕 인큐베이터에서 140 rpm으로 인큐베이션하였다. 세포를 배양 3일째에 시작하여 아미노산과 미량 원소의 혼합물을 포함하는 독자적인 공급물과 함께 제공하였다. 매일 생존률과 생균수 농도를 Vi-CELL™ 자동화 세포 생존률 분석기로 측정하였다. 배지 중 항체 농도는 Protein A HPLC에 의해 배양 6일째에 시작하여 14일째 수확까지 측정하였다.
3. 안정성 분석
세포를 매 3일과 4일에 교대로 125 mL 진탕 플라스크에서 상이한 선택제(추후 기술)가 보충된 30 mL CD CHO로 서브-배양하였다. 상이한 세대수(1세대가 1개체군 배가에 해당)에서, 듀플리케이트 유가식 진탕 플라스크를 상기한 바와 같이 셋업하였다. 세포 농도, 생존률 및 mAb 농도 측정치를 위에서 기술한 바와 같이 수집하였다. 세포주의 생산성이 70 세대 이내에 >30%까지 변화하면 불안정한 것으로 간주하였다.
4. 단일세포 클로닝에 대한 유동세포계수법
단일세포 클로닝을 FACSDiva v6.0 소프트웨어가 구비된 FACS Aria II 세포분별장치에서 488 nm에서 발광하는 공냉식 레이저를 사용하여 수행하였다. 죽은 세포는 FSC vs. SSC 점도표에서 제외하였고, 이중선(doublet)은 FSC 폭 vs. 면적 점도표에서 제외하였다. 살아있는 세포의 선별 게이트는 두 점도표의 조합이다.
5. SSI 숙주세포의 생성
목적하는 제2 유전자 코딩 서열, 즉 선택 마커 유전자를 포함하는 무효화 벡터 pRY37로 모체 pRY17-발현 세포주의 형질감염을 Freestyle™ MAX CHO 시스템(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 이를 위하여, RMCE의 재-형질감염 24 h 전에 선별된 pRY17-형질감염 세포주(11A7)를 먼저 125 mL 진탕 플라스크에서 5 x 105 세포/mL로 Freestyle™ CHO 발현 배지에 접종하였다. 형질감염일에, 1x106 세포/mL 농도의 대략 3x107 세포를 33.75 μg의 pOG44 플라스미드 (Invitrogen, gb:X52327)와 3.75 μg의 pRY37 (9:1) 및 Freestyle™ MAX 시약을 사용하여 125 mL 진탕 플라스크 중에서 제조업체의 지시에 따라 동시형질감염하였다. 형질감염 후에, 세포를 25 μM MSX와 7 μg/mL 퓨로마이신이 보충된 독자적인 합성 배지를 함유하는 48웰 플레이트에 도포하였다. 도포한 3주 후에, 살아있는 세포를 함유하는 각 웰의 배지를 ForteBio에서 Protein A 바이오센서를 사용하여 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. 항체를 검출할 수 없는 세포주의 배지는 25 μM MSX와 1 μg/mL 퓨로마이신이 보충된 CD CHO 배지를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크로 보내졌다.
6. 10E9 숙주에서 유도된 세포주의 생성
RMCE 실험을 3개의 별도 '라운드'로 분리하여, 여기에서 그리고 나중에 하기한 결과에서 언급하였다(라운드는 도 6에서 정의하였다).
라운드 1과 2에서, SSI 표적화 벡터, pRY21로 SSI 숙주세포 10E9의 형질감염을 Freestyle™ MAX CHO 시스템(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 이를 위하여, RMCE의 재-형질감염 24 h 전에 10E9 SSI 숙주세포를 25 μM MSX와 1 μg/mL 퓨로마이신이 보충된 Freestyle™ CHO 발현 배지 (Invitrogen)를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크에서 5 x 105 세포/mL 농도로 먼저 접종하였다. 형질감염일에, 1x106 세포/mL 농도의 대략 3x107 세포를 33.75 μg의 pOG44 플라스미드(Invitrogen, gb: X52327)와 3.75 μg의 pRY37 (9:1) 및 Freestyle™ MAX 시약을 사용하여 125 mL 진탕 플라스크 중에서 제조업체의 지시에 따라 동시형질감염하였다. 형질감염 후에, 세포를 25 μM MSX가 보충된 30 mL의 Freestyle™ CHO 발현 배지 (Invitrogen)를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크에 회수하였다. 라운드 1의 RMCE 48 h 후의 형질감염체를 25 μM MSX, 400 μg/mL 하이그로마이신(양성 선별) 및 3 μM 간시클로버(음성 선별)가 보충된 독자적 합성 배지를 함유하는 48웰 플레이트에 도포하였다. 4주 후에, 가시적인 포커스를 함유하는 웰의 배지 중 mAb의 농도를 ForteBio Octect에서 Protein A 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 배지에 mAb를 분비하는 세포를 증식하고 200 μg/mL 하이그로마이신과 25 μM MSX가 보충된 CD CHO 배지를 함유하는 진탕 플라스크에서 유지하였다. 세포 풀을 (앞서 기술한)뱃치식 진탕 플라스크 분석으로 항체 생산성을 추가로 평가하였다. 안정성 분석을 위해 MSX는 도 6에 특정된 조건에서의 서브-배양으로부터 제거되었다.
진탕 플라스크에서 48 h 동안 회수한 후, 라운드 2 형질감염체를 5 x 105 세포/mL의 농도로 400 μg/mL 하이그로마이신 (양성 선별)이 보충된 CD CHO 배지를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크에 접종하였다. 이후, 5일 후에 음성 선별로서 3μM 간시클로버를 첨가하였다. 세포는 연속적으로 3-4일 마다 동일 배지 중에 3주 동안 동일 진탕 플라스크 내에서 통과하였다. 생존 세포를 FACS Aria II를 사용하여 400 μg/mL 하이그로마이신과 3 μM 간시클로버가 보충된 독자적 합성 배지를 함유하는 96웰 플레이트에 단일세포 클론하였다. 3주 후, 살아있는 세포 생장이 있는 웰의 배지 중 mAb 농도를 ForteBio Octect에서 Protein A 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 배양 배지 내에 mAb를 분비하는 클론을 증식하고 200 μg/mL 하이그로마이신과 25 μM MSX가 보충된 CD CHO를 함유하는 진탕 플라스크에서 유지하였다. 클론들을 (앞서 기술한)뱃치식 진탕 플라스크 분석으로 항체 생산성을 추가로 평가하였다. 안정성 분석을 위해 MSX는 도 6에 특정된 조건에서의 서브-배양으로부터 제거되었다.
라운드 3 형질감염체에 대하여, 1 x 107 10E9 SSI 숙주세포를 900 pF, 300V에서 45 μg의 pOG44 플라스미드 (Invitrogen, gb:X52327) 및 5 μg의 pRY21로 전기천공하여 동시형질감염하였다. 형질감염 후, 세포를 20 mL의 독자적 합성 배지를 함유하는 T-75 플라스크에 접종하였다. 48 h 후에 200 또는 400 μg/mL 하이그로마이신을 배지에 첨가하였고, 3 μM 간시클로버를 6일 후에 첨가하였다. 일부 경우(도 6 범례에 기술)에, 25 μM MSX를 하이그로마이신 선별과 함께 첨가하였다. 시험된 모든 형질감염 조건에 대해 세포를 3주 동안 이러한 조건들 하에서 선별하였다. 이 기간 동안 T-75 플라스크 중의 조건화된 배지를 3-4일마다 양성 및 음성 약물 선별을 함유하는 새로운 배지로 교환하였다. 생존률이 >= 90%에 이르면, (도 6 범례에 기술된 바와 같은)25 μM MSX를 갖거나 갖지 않는 200 또는 400 μg/mL 하이그로마이신이 보충된 앞서 기술된 동일한 독자적 합성 배지를 함유하는 96웰 플레이트에 FACS Aria II를 사용하여 세포를 단일세포 클론하였다. 조건화된 배지 중의 항체 농도를, 생육 중인 살아있는 세포를 함유하는 웰에서 수집하여 ForteBio Octect에서 Protein A 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 선별된 클로날 세포주를 증식하여 200 μg/mL 하이그로마이신과 25 μM MSX가 보충된 CD CHO 배지를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크에서 서브 배양하였다. 클론들을 (앞서 기술한)뱃치식 진탕 플라스크 분석에서 항체 생산성을 추가로 평가하였다. 안정성 분석을 위해, 하이그로마이신과 MSX는 모두 도 6 범례에 특정된 조건에서의 서브 배양으로부터 제거되었다.
7. 데이터 분석
생장곡선 하 면적의 시간 적분(생균수 농도의 시간 적분 (IVC); 106 세포 일/mL)을 Renard 등이 기술한 방법(Renard et al. 1988, Biotechnology Letters 10:91-96)을 사용하여 계산하였다.
Figure 112015001998827-pct00001
상기 식에서, XvO는 제1 샘플(106/mL)의 생균수 농도이고, Xv1은 제2 샘플 (106/mL)의 생균수 농도이고, t0는 제1 샘플의 경과 시간(일)이고, t1은 제2 샘플의 경과시간(일)이다.
8. DNA 워킹(walking)
Seegene DNA Walking SpeedUp™ Kit II를 3' 게놈 플랭킹 서열 데이터를 제공하기 위해 제조업체에 따라 사용하였다. GS-CHOK1SV 세포주 11A7, TSPIfwd (서열번호 4), TSP2fwd (서열번호 5) 및 TSP3fwd (서열번호 6)에서 선형적으로 통합된 pRY17 벡터(bla R, 도 3)의 도해 중 3' 분지의 bla에 특이적인 베타-락타마제(bla) 유전자 특이적 프라이머가 사용되었다.
9. 10E9 숙주의 게놈 시퀀싱
10E9 게놈 DNA를 단편화하고 HiSeq 플랫폼 시퀀싱에 적합한 쌍을 이룬 말단 라이브러리를 제조업체의 지시에 따라 TrueSeq DNA 샘플 제조 키트를 사용하여 제조하였다. 생성된 라이브러리는 300bp 내지 500bp의 예상된 크기 범위 내였다. 생성된 라이브러리를 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 QC 분석한 결과, 라이브러리는 연속 샘플 처리 동안 예상된 단편 크기와 수율을 함유하는 허용가능한 품질이었다. 생성된 라이브러리는 클러스터 생성을 위한 cBot System에서 제조업체 지시에 따라 사용되었다. 증폭된 클러스터를 함유하는 유동 세포를 2x100 염기쌍 말단 쌍(paired-end) 시퀀싱을 사용하여 Hi-Seq 2000에서 서열화하였다. 판독물을 CHO-K1 콘틱(contig)(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)에 대해 Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (Li H. and Durbin R. 2009 25:1754-1760)를 사용하여 맵핑하였다.
B) 결과
I기: 모체 mAb -발현 세포주의 생성
I기의 목표는 안정한 생산성으로 유리한 생장 특성을 나타내고, 단지 단일 통합 위치와 이 위치의 벡터 통합체의 가장 낮은 가능한 수를 함유하는 고생산성 mAb 발현 GS-CHOK1SV 세포주를 생성하는 것이다. 키메릭 mAb, cB72.3 (Whittle et al. 1987, Protein Eng 1 :499-505)을 코딩하는 변성된 Lonza GS '더블 유전자 벡터', pRY17(도 1)을 디자인하였다. pRY17에서, 48 bp 야생형 F와 돌연변이 F5 재조합 서열은 mAb의 HC와 LC 전사단위에 플랭킹한다. F5와 F 재조합 서열은 작용적으로 등가이지만, 최소한의 교차-재조합 활성을 나타내므로, FLP 재조합효소(Schlake and Bode, 1994, Biochemistry 33:12746-12751)로 촉매된 효율적이고 지향성인 RMCE가 가능하다. pRY17 형질감염으로부터 유도된 초기 GS-CHOK1SV 세포주는 하이그로마이신 내성 유전자를 효과적으로 전사하거나 번역하지 않는데, 왜냐하면 이 하이브리드 유전자의 바로 상부에 개시제 메티오닌 코돈 또는 프로모터가 없기 때문이다.
중요하게, 벡터 유도 GS 유전자는 교환가능한 카세트 외부에 배치하여 RMCE 후에 얻어진 세포주의 게놈에 보유되도록 하였다. 이렇게 하여 유도성 세포주 내에서 글루타민 대사의 잠재적 섭동(perturbation)을 방지하였고; 모체 GS-CHOK1SV 세포주를 글루타민이 없는 배지와 50 μM 메티오닌 설폭시민 (MSX)에서, 내인성 및 벡터 유도 글루타민 합성효소 발현의 존재 하에 선별하였다. 프로모터가 없고 번역 개시 메티오닌 결핍 (-ATG) 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자를 링커 (Lnk)를 코딩하는 서열과 F 재조합 서열 사이에 배치하였다(도 1). 본 연구의 제2 기에서 RMCE에 사용된 벡터는 SV40 조기 프로모터와 하이그로마이신 내성을 발현하는데 필요한 개시 메티오닌(ATG)을 함유하였다. 전체 작용성 하이그로마이신 내성 유전자는 유일하게 재조합이 게놈 내 야생형 F 재조합 서열로 발생할 경우 생성되었다(도 1).
FRT 재조합 서열을 함유하는 pRY17 벡터는 CHOK1SV 세포에 일반적인 세포주 발생 방법으로 삽입한 다음, 생장과 생산성의 최적 조합으로 세포주를 단리할 수 있는 방법의 주요 스테이지에서 집중 스크리닝을 수행하였다. 또한, 선택된 세포주로부터 유도된 cB72.3 단백질은 이전 GS-CHOK1SV 세포주(Birch and Racher, 2006, Adv Drug Deliv Rev 58:671-685)에서 유도된 제조물과 유사한 품질 특성을 나타내어야 한다. 후보 세포주로부터의 HC 및 LC 유전자 카피수는 각각에 대해 1에 가까운 것이 바람직하다. 이를 위하여, 3개의 독립적인 전기천공을 수행하였고, 각각은 50 μg의 직선형 pRY17 및 1 x 107 CHOK1SV 세포를 사용하였다. 3개 전기천공 모두에서 얻어진 형질감염체를 50 μM MSX를 함유하는 배지에서 선별하고 ~1500의 살아있는 세포 풀을 형질감염 3주 후의 항체 제조에 대해 스크리닝하였다. 결국, 총 79 클론을 7일의 뱃치식 진탕 플라스크로 평가하였고 모두 79 클론의 cB72.3 mAb 농도가 측정되었다. 언급된 것을 제외하고, 모든 RMCE 유도성 세포주는 25 μM MSX를 함유하는 배지에 유지되었다. 평가된 79 클론으로부터 38 클론을 유가 진탕 플라스크 배양에서의 추가 분석을 위해 선별하였다. 생산성과 생장 특성에 기초하여 상위 6개 최고 수행 클론을 유전자 특성화를 위해 선별하였다(표 1)(방법 참조).
Figure 112015001998827-pct00002

CKOK1SV 게놈에서 pRY17의 통합부위를 조사하기 위해, 6 클론의 중기 염색체를 제조하여 DIG-표지된 pRY17로 프로브하였다(데이터 미기재). 클론 1G11, 6B5, 8F10, 14D11 및 11A7 모두 개별 염색체의 텔로머(telomer) 영역에 단 하나의 통합 위치를 갖는 것으로 나타났다. 반면, 클론 18C11은 2개의 별개 통합부위를 갖는 것으로 보이므로 추가 시험에 선택하지 않았다. 각각의 세포주에서 유전자 카피수를 측정하기 위해 초음파처리된 게놈 DNA를 활성적으로 자라는 세포로부터 제조하였다. qPCR 분석을 위해, GAPDH를 내인성 대조군으로 포함하고 pRY17을 양성 대조군으로 숙주세포 DNA에 '스파이크(spike)'하였다. HC와 LC 둘 다에 있어서 세포 당 유전자 카피수는 평균 카피 대 평균 GAPDH 카피의 비율로 계산되었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 분석된 5 클론 중에서 11A7이 가장 낮은 HC와 LC 유전자 카피수를 가졌다. 게놈 DNA의 써던 블로트 분석에서는 HC와 LC 둘 다 5 클론 모두에서 검출될 수 있고 밴드의 강도가 qPCR 측정 유전자 카피수를 반영하는 것으로 나타났다(데이터 미기재).
Figure 112015001998827-pct00003

본 안정성 시험(표 3)에 투입된 선택된 5 클론 중에서, 11A7은 7개월(220 세대) 동안 유사한 생산성을 유지한 반면, 다른 클론들은 시험의 최초 3개월(80 세대) 동안 단계적인 생산성 상실을 나타냈다. 종합하면, 11A7은 양호한 생장과 생산성 특성의 최고 조합 중 하나를 가질 뿐만 아니라, 단일 통합부위를 갖는 가장 낮은 유전자 카피수를 가진다. 중요하게, 11A7은 생산성 측면에서 6 중 가장 안정한 클론이다. 가장 중요하게, 생성물 품질은 220 세대 이후에도 비슷하였다. 11A7은 RMCE의 제1 라운드: II기를 위한 모체 클론으로서 선택되었다.
Figure 112015001998827-pct00004
II 기- SSI 숙주세포의 생성
11A7 내의 원래 mAb 전사단위를 새로운 mAb의 것으로 교체할 수 있는 표적 벡터를 디자인하는 것이 전적으로 가능하지만, 게놈에서 원본을 완전히 잘라내는 것이 바람직하다. 이를 위하여 mAb 유전자를 코딩하지 않는 추가적인 무효화 표적 벡터, pRY37 (도 2)을 설계하였다. 대신에, 이것이 양성 및 음성 선택 마커, 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제(PAC)와 티미딘 키나제(TK) 각각을 코딩하고, 이들이 pRY17 (도 1)과 같은 배향으로 F와 F5 재조합 서열과 플랭킹된다. RMCE 후에, 이러한 마커들은 원래의 11A7 게놈 내 같은 위치에서 원래의 cB72.3 mAb를 대체할 것으로 예상된다. pRY37로 RMCE를 수행하는 세포주를 선별하기 위해 PAC가 필요하다. TK는 전구약물 간시클로버를 독성의 인산화 뉴클레오티드 동족체로 전환한다(Wood and Crumpacker, 1996, New England Journal of Medicine 335, pages 721-729). 이것은 추후 III기에 음성 선택의 적용에서 중요하고; 간시클로버 선택은 적당한 RMCE를 수행하지 않는 세포를 사멸하여 이를 수행하는 세포에 대한 RMCE 풀을 강화한다.
mAb 발현에 음성인 생존 세포주 풀 중에서 하나의 세포주, 136-A4를 써던 블로트 분석에 의한 추가 특성화를 위해 선택하였다(데이터 미기재). 136-A4 게놈 내에서 TK의 존재를 확인하였다. 제한 맵핑은 "핫스팟"에서 단지 2 카피의 pRY37 존재를 나타내었고 딸(daughter) 클론 10E9의 후속 게놈 시퀀싱에 의해 확인하였다. 카피수는 실질적으로 11A7에서 확인된 pRY17보다 더 적었다(표 2). 균질한 SSI 숙주를 얻기 위해 FACS Aha II를 사용하여 136-A4를 단일세포 클론하여 26 클로날 유도체의 생장 프로필을 얻었다. 이들 중에서, 최적의 생장 프로필을 갖는 2개의 클로날 유도체, 10E9과 8C8을 노던 블로트 분석에 의한 추가 특성화를 위해 선별하였다. 딸 클론 RNA의 노던 블로트 분석에서 cB72.3 HC 및 LC mRNAs의 부재를 확인하였다(데이터 미기재). 종합적으로, 이러한 결과들은 10E9이 III기의 시험에서 RMCE를 위한 적합한 후보 숙주세포주임을 나타낸다.
III 기 - Myo mAb 표적 벡터를 사용한 RMCE
신규한 SSI 숙주세포주 10E9의 유용성을 입증하기 위해, 표적 벡터, pRY21을 디자인하였다(도 3). 이 벡터는 pRY17(I기)과 pRY37(II기) 벡터에서 발견된 것과 동일한 배향으로 F와 F5 재조합 서열이 플랭킹하는, Myo mAb의 HC 및 LC 유전자를 함유한다. 또한, F 재조합 서열에 인프레임 융합된 메티오닌 개시 코돈(ATG + F)의 상부에 SV40 조기 프로모터 (SV40E)를 함유한다. 적당한 RMCE가 발생하면 ATG + F 서열은 프로모터가 없는 번역 개시 메티오닌-결핍(-ATG) 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자를 갖는 프레임 내에 배치된다. pRY21과 pOG44에 의한 10E9 세포의 동시형질감염 3개 라운드가 수행되었다. 처음 2개 라운드에서 세포는 Freestyle™ MAX CHO 시스템으로 형질감염되는 반면, 라운드 3에서는 전기천공으로 형질감염된다. 또한, 라운드 1은 간시클로버와 풀로서 하이그로마이신으로 동시선별되고; 라운드 2는 순차적으로 먼저 400 μg/mL의 하이그로마이신, 이어서 풀로서 간시클로버로 선별한 다음, FACS Aria II를 사용하여 단일세포 클론하며; 라운드 3은 순차적으로 먼저 200 또는 400 μg/mL의 하이그로마이신, 이어서 풀로서 간시클로버로 선별한 후, FACS Aria II를 사용하여 단일세포 클론하였다(도 6). 라운드 3에서, MSX는 2개 시험 조건의 배양 배지에 없었다.
라운드 1의 상이한 풀로부터 얻어진 생산성 데이터가 유사하여, 각 풀의 세포주 멤버가 유사한 생산성을 가질 수 있음을 시사하였다. 풀들의 생산성 범위는 무작위 통합 과정의 클로날 또는 비클로날 세포주보다 매우 협소하다(도 6). 라운드 2와 3의 상이한 선택 조건에서 단리된 클로날 세포주를 비교할 때, 고생산성 클로날 세포주는 MSX를 갖는 것과 비교하여 MSX 부재 시에 선택된 그룹에 있는 것으로 보인다. MSX 부재 하에 생육된 세포주에서, MSX가 배지에 존재할 때 나타나지 않은 선택성 배지에서 상이한 농도의 하이그로마이신으로 얻어진 생산성에서 차이가 있는 것으로 보인다.
먼저, I기에서 매우 안정한 GS-CHOK1V 세포주, 11A7을 단리하였고, 이것은 220 세대까지 안정하였다. 이러한 안정성 특성은 III기에 RMCE로 생성된 유도체 세포주에 유전될 수 있다. 따라서, III기 라운드 1으로부터의 세포 풀 3개를 2개의 상이한 조건 하에서 연장된 안정성 시험으로 평가하였다(표 4).
Figure 112015001998827-pct00005

조건에 상관없이, 시험된 3개 풀 모두 안정한 세포주의 기준을 만족하였다. 또한, 안정성 시험의 동일 유형에서, 라운드 2와 3으로부터 각 6, 총 12 클론 세포주(각각 표 5 및 6). 모두 12 클로날 세포주가 선별 하에 안정성 특성을 유지한 것을 확인하였다. 심지어 선택제 없이도 3 라운드 (표 4)에서 6클론 세포주가 안정한 것이 주목되었다. 이것은 바이오의약품 제조에 대한 깊은 의미를 가진다.
Figure 112015001998827-pct00006

Figure 112015001998827-pct00007

" 핫스팟 "에 플랭킹하는 게놈 서열의 특성화
3' 플랭킹 서열
bla R (도 3)로부터의 Seegene DNA 워킹에서 유도된 500 bp 3' 플랭킹 서열(서열번호 7)을 NCBI 데이터뱅크에서 공개적으로 입수할 수 있는 CHO-K1 게놈 시퀀싱 프로젝트의 콘틱(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)을 블라스트-검색하는데 사용하였다. 미배치 게놈 스캐폴드, scaffold1492 (기탁번호, JH000254.1, NW_003613833.1과 일치)에 위치한 독특한 영역을 1760466-1760965의 마이너스 가닥에서 발견하였다. 500 bp 서열(서열번호 7)은 10E9 판독물의 scaffold1492 (데이터 미기재)에 대한 높은 커버리지 맵핑에 기초하여 2000 bp (서열번호 8)까지 연장되었다.
3' 플랭킹 서열을 Seegene DNA 워킹으로 동정하였고(방법 참조), NCBI 데이터뱅크에서 공개적으로 입수할 수 있는 CHO-K1 게놈 시퀀싱 프로젝트의 콘틱(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)을 블라스트-검색하는데 사용하였다. 이 데이터와 10E9 SSI 숙주세포주에서 얻어진 Illumina HiSeq 게놈 시퀀스 데이터를 사용하여 미배치 게놈 스캐폴드, scaffold1492 (기탁번호, JH000254.1, NW_003613833.1과 일치)에 위치한 독특한 영역을 발견하였다. 이것은 마이너스 스트랜드 상의 scaffold1492에서 추정된 Fer1L4 (fer-1-like 4) 유전자(NCBI 유전자 ID: 100755848) 내에 위치하는 것을 확인하였다(scaffold1492 뉴클레오티드 수 1,746,191 내지 1,781,992; 전체 중 35,802 뉴클레오티드). 5' 플랭킹 서열은 엑손 39 내지 40 사이에 위치하는 것으로 보이는 반면, 3' 플랭킹 서열은 엑손 28 내지 29 사이에 위치하는 것으로 보인다(도 7 참조).
5' 플랭킹 서열
10E9 게놈 DNA로부터의 Illumina 판독물을 Burrows-Wheeler Aligner (BWA)를 사용하여 pRY17 (서열번호 1)에 대해 맵핑하였다. 맵핑 검사를 통해, 다수의 쌍을 이루지 않은 판독물(도 8의 검은색 화살표)이 cB72.3 HC의 3' 부분의 5' 말단에 맵핑된 것을 확인하였다. 이러한 분석은 적어도 하나의 (5' 말단에서 결실된 214 bp를 갖는)cB72.3 HC 단편이 10E9 "핫스팟"에 남아있는 것을 시사하고 있다. 노던 블로트 분석(데이터 미기재)에서는 10E9 세포에 cB72.3 LC 또는 HC mRNA가 없는 것으로 나타나서, cB72.3 내의 절단형 HC가 비작용성임을 시사하였다. 이후, 등가의 쌍을 이룬 판독물을 사용하여 CHO-K1 게놈 시퀀싱 프로젝트의 콘틱(Xu X et al. 2011, Nature Biotechnol. 29:735-742)을 블라스트 검색하였다. 이들은 모두 미배치된 게놈 스캐폴드, scaffold1492 (기탁번호, JH000254.1, NW_003613833.1과 일치)에서 동일한 위치(1750048-1750183)에 배열하였다. 이로써 5' 플랭킹 서열이 최대 822bp까지 확장되었다(서열번호 9).
실시예 2:
A) 재료 및 방법
1. 써던 블로트
각 클론의 패시지 2와 4에서 단리되어 QIAGEN (Qiagen)의 Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit를 사용하여 정제된 5-10 μg의 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제(들)로 15 h 동안 37 ℃에서 분해하였다. 분해된 DNA를 동일 부피의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 혼합물, pH 8.0 (1:1 v/v), 이어서 클로로포름만으로 2회 추출하고 에탄올 침전한 후, 0.5 x TBE (50 x TBE: Lonza) 또는 1 x TAE (40 mM Tris, pH 7.7, 2.5 mM EDTA) 완충액 중의 0.7% (w/v) 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 겔을 Hybond-N 멤브레인(Amersham) 상으로 제조업체의 지시(Appligene, Pharmacia)에 따라 진공 매니폴드를 사용하여 이송하였다. Hybond-N 멤브레인은 UV-고정하고, 50 x 스톡 용액 (Sigma), 6 x SSC (1 x SSC: 0.15 M 염화나트륨, 15 mM 시트르산 나트륨), 및 10 % (w/v) SDS로부터 제조된 5 x Denhardt 완충액을 함유하는 혼성화 완충액 또는 Rapid-hyb Buffer (GE healthcare)만에 사전 혼성화되었다.
TK 프로브는 다음 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 생성하였다:
μμTK-정방향: 5'-AGATCACCATGGGCATGCCTTAC-3' (서열번호 10);
TK-역방향: 5' AACACGTTGTACAGGTCGCCGTT-3' (서열번호 11);
벡터 pRY37를 프로브 생성 PCR의 템플레이트로서 사용하였고 사이클링 조건은 다음과 같다: 15 ng 템플레이트/50 μl 반응물; Taq DNA 폴리머라제(Roche); 94 ℃ 2 min, 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 1 min 및 72 ℃에서 30초 동안 30 사이클, 72 ℃에서 7 min 동안 최종 연장. 25 ng의 PCR 생성물을 [γ-32P] dCTP (111 TBq/mmol, Perkin Elmer)로 Megaprime Kit를 사용하여 표지하고 틈번역(nick-translation) 컬럼(Amersham)에서 정제하였다. 혼성화는 동일한 사전 혼성화 완충액에서 2 - 20 h 동안 65 ℃에서 수행하였다. 혼성화 후에, 멤브레인을 65 ℃에서 0.1 x SSC, 0.1 % (w/v) SDS의 최종 농도로 세척하였다. 블로트를 저장 형광 스크린(Bio-Rad)에 노출하였고; 노출된 스크린은 Personal Molecular Imager (PMI) System (Bio-Rad)을 사용하여 이미징되었다.
2. 맵핑과 정렬
FASTQ 포맷 내의 쌍을 이룬 말단 판독물은 게놈 템플레이트에 대한 맵핑을 위한 입력물이다. 벡터 서열과 CHOK1SV 어셈블리는 맵핑될 템플레이트로서 연동된다. 쌍을 이룬 말단 판독물은 템플레이트에 급속 국소 정렬을 위한 디폴트 매개변수(-D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00)를 갖는 Bowtie2 (Langmead B, & Salzberg SL, 2012, Nature methods, 9 (4), 357-9)를 사용하여 정렬되었다. 상이한 샘플들을 교차 비교하기 위하여 커버리지를 <원(raw) 커버리지>*500M / <판독물 수>로서 정규화하였다.
3. 통합부위의 동정(Identification of Integration Sites)
10E9 SSI 숙주 균주의 쌍을 이룬 말단 판독물 2 X 100을 Illumina Hi-Seq 2000을 사용하여 40 X의 평균 커버리지로 서열화하였다. 서열 판독물을 CHOK1SV 게놈에 통합된 최초 벡터인 pRY17 벡터에 대해 맵핑하였다. 통합부위를 커버하는 판독물이 CHOK1SV 게놈과 통합된 벡터 서열에 대해 맵핑하는 서열을 함유하기 때문에 이들을 키메라(chimerical) 판독물이라 한다. 맵핑은 국소 정렬로 수행되기 때문에 키메라 판독물은 게놈 서열에 대해 맵핑할 수 있는 돌출 테일(tail)을 갖는 벡터 서열에 대한 부분 일치의 특성을 갖는다. 키메라 판독물 이외에도, 쌍을 이룬 판독물의 한쪽 말단이 벡터 서열에 완전하게 맵핑하고 다른 말단이 게놈 서열에 맵핑하는 다른 판독물이 있다. 이러한 판독물 쌍을 부조화(discordant) 판독물 쌍이라 한다. 돌출 테일 서열과 맵핑되지 않은 판독물을 부조화 판독물 쌍으로부터 수집하여 블라스트를 사용한 CHOK1SV 게놈 어셈블리에 대해 검색하기 위해 사용하여 서열 유사성에 기초한 통합부위의 플랭킹 서열을 동정하였다.
4. 랜딩 패드(Landing pad)
랜딩 패드(RMCE에 의해 목적하는 유전자의 발현 카세트의 통합을 위한 재조합 부위를 포함하는 핫스팟에 삽입된 외인성 서열)의 구조는 써던 블로트 분석과 10E9 세포주(도 9)의 전체 게놈 재시퀀싱(WGRS) 분석 데이터에 기초하였다. 10E9-유도 판독물은 벡터 서열에 대해 통합부위를 맵핑하는데 사용된 것과 같은 알고리즘을 사용하여 맵핑하였다. 키메라 판독물은 또한 중복, 결실 또는 삽입 부위에서도 관찰되었다. 추정 랜딩 패드 서열에 대한 보정은 키메라 판독물이 발생하는 부위의 긴밀한 조사에 기초하여 이루어졌다.
5. RNA-seq 분석의 정량화
판독물을 맵핑하기 위해 사용된 템플레이트는 전체 게놈 재시퀀싱(상기 참조)에서 유도된 랜딩 패드의 원(one)-카피 모델을 사용하여 구성되었다. RNA-seq 시퀀싱 판독물을 템플레이트에 대해 BWA에 의해 디폴트 매개변수를 사용하여 맵핑하였다. LC와 HC에 대한 판독물 계수를 RPKM 측정, 즉 다음 식에 의한 백만 맵핑 판독물 당 킬로베이스 전사체에 대한 판독물로 정규화하였다:
Figure 112015001998827-pct00008
엑손과 오버랩핑하는 판독물 수는 매 간격 동안 베드툴(bedtools)(Quinlan AR and Hall IM, 2010, Bioinformatics. 26, 6, pp. 841-842)을 다음 명령어, bedtools coverage -abam <bam file> -b <intervals in bed>로서 사용하여 얻어졌다.
B) 결과
10E9 SSI 숙주세포에서 랜딩 패드의 구조
Fer1L4 핫스팟 내에서 랜딩 패드 구조 모델을 무효화 표적 벡터 pRY37 (도 4)을 사용한 11A7으로부터 세포주 10E9의 형성 동안 발생한 예상된 RMCE로부터 추론하였다. 이 모델을 '싱글카피(single-copy)' 모델이라 하였으며 세포주 10E9 (도 9A)로부터 얻어진 WGRS 데이터와 일치하였다. 그러나, 써던 블로트 데이터에서는 이 모델이 실제로 두 카피를 함유하는 것으로 나타났다(도 9B). '투-카피' 모델은 이 데이터를 근거로 정제되었고 10E9 숙주에서 RMCE로 유도된 mAb 생산 세포주를 설명하는데 사용되었다. '투-카피' 모델은 1 또는 2 카피의 항체 전사단위가 랜딩 패드에 표적 벡터 pRY21를 사용한 RMCE에 의해 통합될 수 있는 이유를 설명할 수 있다.
RMCE 유도성 세포주 내의 플랭킹 서열
4개의 10E9 유도 재조합 세포주를 생성하여 항-미오스타틴 단일클로날 항체 (Myo)를 RMCE (표적 벡터 pRY21 사용)에 의해 발현하여 각각의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 상기한 방법을 사용하여 측정하였다. RMCE의 공정 동안, 일치하는 게놈 재배열이 발생하여 유도체 세포주(도 10)에서 새로운 3' 플랭킹 서열을 생성하였다. RMCE 유도성 세포주 내의 5' 플랭킹 서열은 (미배치 CHO-K1 Scaffold1492 스캐폴드(기탁번호 JH000254.1, NW_003613833.1와 일치) 상의)뉴클레오티드 1750049에 통합부위를 갖는 10E9과 같다. 그러나, 3' 플랭킹 서열은 다르며: 10E9 SSI 숙주세포주에서 3' 통합부위는 뉴클레오티드 1760965에 있는 반면, 모든 RMCE 유도성 세포주에서는 뉴클레오티드 1435427(상기한 스캐폴드, 도 10)에서 발견된다
RMCE-생성 세포주 내의 통합 카세트 카피수의 추정
그 게놈 각각의 시퀀싱 판독물을 하나의 카피가 핫스팟에 통합된 모델에 대해 맵핑하였다. Myo 카피의 수를 LC 및 HC 영역의 평균 커버리지로부터 유도하였다. 이 4개 세포주의 평균 커버리지는 각각 LC 영역에 대해 41, 34, 18, 27이고 HC 영역에 대해 32, 27, 14, 19이다. 이 커버리지 데이터는 고생산체에 대하여 적어도 하나 이상의 LC 및 HC 카피가 있을 수 있음을 나타낸다(표 7). 커버리지 데이터를 도 11에 그래프로 나타내었다.
Figure 112015001998827-pct00009
이러한 관찰에 기초하여, Myo의 추가 카피가 포함된 RMCE 후 위치의 새 모델을 생성하였다. 이것은 제1 wFRT 부위의 시작부터 제2 wFRT 부위 시작(둘다 도 11에 별표로 표시)까지 스패닝하는 단편의 다른 카피를 제2 wFRT 개시 직전에 삽입하여 얻어진다. 이러한 '투-카피' 모델을 사용하여 높은 qP를 갖는 세포주에서 관찰된 판독물의 수에 대해 이들을 그에 대해 재맵핑했을 때 충분히 설명할 수 있다.
높은 qP Myo 생산 세포주에서 '투-카피' 모델에 대한 다른 증거는 각 세포주의 RNA-Seq 데이터로부터 얻어졌다. 각각의 Myo 세포주에서 유도된 RNA에서 RNA-Seq로부터의 시퀀싱 판독물을 디폴트 매개변수로 실행된 BWA (Li H. and Durbin R. 2009, Bioinformatics, 25:1754-60)를 사용하여 원래의 '원-카피' 모델(도 12)에 대해 맵핑하였다. Myo 카피의 수는 LC 및 HC 영역에 대한 RPKM값(Mortazavi et al.(2008), Nature Methods 5, 621-628)을 계산하여 유도하였다. RPKM값은 LC 영역에서 43135, 40059, 23204, 29334이었고 HC 영역에서 38572, 32384, 17878, 20751이었다. 이러한 데이터는 또한 전체 게놈 시퀀싱에서 유도된 고생산체에 대해 제안된 '투-카피' 모델을 확인하는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Lonza Biologics plc Pfizer Inc. <120> Site-specific integration <130> 204381 WO <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector <400> 1 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 60 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 120 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 180 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 240 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 300 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 360 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 420 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 480 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 540 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 600 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 660 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gtggcggtag ggtatgtgtc tgaaaatgag ctcggggagc gggcttgcac 5580 cgctgacgca tttggaagac ttaaggcagc ggcagaagaa gatgcaggca gctgagttgt 5640 tgtgttctga taagagtcag aggtaactcc cgttgcggtg ctgttaacgg tggagggcag 5700 tgtagtctga gcagtactcg ttgctgccgc gcgcgccacc agacataata gctgacagac 5760 taacagactg ttcctttcca tgggtctttt ctgcagtcac cgtccttgac acgggatccg 5820 ccgccaccat ggaatggagc tgggtctttc tcttcttcct gtcagtaact acaggtgtcc 5880 actccgaggt gcagctgttg gagtctgggg gaggcttggt acagcctggg gggtccctga 5940 gactctcctg tgcagcctct ggattcacct ttagcagctt tgccatgagc tgggtccgcc 6000 aggctccagg gaaggggctg gaatgggtct caactattag tggtagtggt ggttacacat 6060 tctacgcaga ctccgtgaag ggccggttca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc 6120 tgtatctgca aatgaacagc ctgagagccg aggacacggc cgtatattac tgtgcgaaag 6180 atggaaggta taactggaac tacggggctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca 6240 ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga 6300 gcacctccga gagcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg 6360 tgacggtgtc 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ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 8940 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 9000 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 9060 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctc 9097 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcagtgaggc acctatctca g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgttcatcca tagttgcctg act 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggagggctt accatctggc c 21 <210> 7 <211> 500 <212> DNA <213> Chinese hamster ovary <400> 7 tttttagctt tttgataaat ctccattctg acttccacgg aggctgtacc catttacact 60 cctaccagca ttaaataagg gttcctcttt gcccacatcc ttgccagcat ttcttgttac 120 tttttttttt taatttatta cattttaaat tgtgtttgtg ttcccacgtg ggcattgtgc 180 cagtctgagg acaatctgtg ggagtcgctt cttccttcca ccatgggaca gtagggactg 240 gatttagttc atctgccatg gcagcaagca cttttatgtg ctgaactact tctcttaatg 300 ttttcttaat gatagccact ctgactgggg agacatggaa atttcaaagt agttttaatt 360 tgcatttcct taatggctaa ggatgttgaa cactttaagg tgaggctgca gagacggcta 420 agcagttaag agcattggct actatttcag aggacctgga ttcaattccc agcacccaca 480 tggctgctca caattgtgta 500 <210> 8 <211> 2000 <212> DNA <213> Chinese hamster ovary <400> 8 tttttagctt tttgataaat ctccattctg acttccacgg aggctgtacc catttacact 60 cctaccagca ttaaataagg gttcctcttt gcccacatcc ttgccagcat ttcttgttac 120 tttttttttt taatttatta cattttaaat tgtgtttgtg ttcccacgtg ggcattgtgc 180 cagtctgagg acaatctgtg ggagtcgctt cttccttcca ccatgggaca gtagggactg 240 gatttagttc atctgccatg gcagcaagca cttttatgtg ctgaactact tctcttaatg 300 ttttcttaat gatagccact ctgactgggg agacatggaa atttcaaagt agttttaatt 360 tgcatttcct taatggctaa ggatgttgaa cactttaagg tgaggctgca gagacggcta 420 agcagttaag agcattggct actatttcag aggacctgga ttcaattccc agcacccaca 480 tggctgctca caattgtgta tgattcccct tctagggtat ccagcgcctt cttccggcct 540 cttttgacac tgcatgctca tggtgcacag acaaaatacc aacccacatt ttatttttta 600 ttttttggtt ttgttttggt ttttcgagac agggtttctc tgtggctttg gaggaggctg 660 gtctcaaact catatagatc cgcctgcctc tgcctcccaa gcactgggat taagggtgtg 720 tgagcaccac cactgcccag ctcaacccac atttttgttg ttgtggccat ttgtttcttc 780 tttttctttg tttttttttt ttaatttttg caaactatct acttaagatg ggggttaata 840 tctaggaaat ataaggaact gcaaaaatta aacacacaac caaacgacca atcttgtttc 900 tggtttttag aggcaaggac ccactatgga gctcaaactg gcatcaaact tgtcgtgtat 960 cccatgactc caaatactgg gaatacaggt gtgtgccacc acaccttggg catcaaagac 1020 cctattttaa tactgtcacc ctttgctccc tctaagtgat gtgtttatag gaacatagac 1080 attgagacta tactaagggc ttccctttca tcccttgttc caaggttcag atggggtggc 1140 cccacttttc ccactgtgca tctgaggtga gtgcaccctc ccgttgagct cagtggcctg 1200 tagatccatc agtcgggtca agttgcttca cagtgtttcc cacacctctt ctgtccatta 1260 tcaatattag ggcattgaaa tctcaagttg ttctgtgttt ctccagctct gttgcttctt 1320 ttttcagccc tgagtattag accttgtgaa ttgcacgtgc tagacgggct cagtacctct 1380 tggccactgt ccccagcctc atctgtcact tcttacttta ttttggattc tgttgttagg 1440 tgtgtatttg tatacagttg ttttagcttc caacttacca ctgtagaatg gccctcattg 1500 tctctggtaa ttatatagat agtccctcac tgagacgctt ttcctaggag agtctaggtt 1560 gtatccagtt gagaaacagt cacaagtgtg acttgaaagg tgtaaactaa actcaaaggc 1620 ttcacttcta ggaatgaagg gatcagaccc tcactcagcc cctgcttcag cagccatgac 1680 aggctaaaga aaggacatgt aggcctctga cacaagggga aacccagatc ctctggcctc 1740 ccagagccta gggctaaaac tgaacacaaa gaaactccag accccccctc cccagcctcc 1800 tagatacttg gttcctggga actgtttggc cacaaaagaa actccagggg agaccaaaac 1860 ctcccctgta gtttccagga tacagttctg aaaactattg ctatctgtgt acaacaggcc 1920 acctgcaagt aacaagacaa agccatagaa accacagaat gttccctctc agcactgacc 1980 aatgagaata attggtacac 2000 <210> 9 <211> 822 <212> DNA <213> Chinese hamster ovary <400> 9 cccacctccc accccttgct ttttgtgaat ggtggacttg ctctcccagg ctgcaggcca 60 cagacttttt gtctggggga gggacatagt tgttaaggag gtctctacat agtcttgtct 120 atcctagaac tcattttgta gaccaggctt gcctcaaact cctggaactc tgctgggatt 180 aaaggtgtaa accaccacgc catgtataga caaccagctt tatctagagg tgctgaggag 240 ggaggagagc tggggactgt ggtgaaccca agtccacacc cctcttgttt cagatggcag 300 ggatcccaag gggacaaatg aggcttctga agaggcccaa gcattgcttg tgcttcggcg 360 ttggcaggag atgccaggat ttgggatcca gctggtacct gaacatgtgg aaacacggcc 420 cctgtaccac ccccggagcc cagggctgct gcaggtgaag ggacctcaga ctcccaagac 480 tcattgagac accccaccac caccaccacc ctttccccaa gccctcttcc cacacactac 540 accgccactg accctgcttc tggtgtcagt gagaacctct gttacaggct gtacttacta 600 tccagccccc ccccacacac accctggtcc tacaggatcc ccaaccctga gccaacaagc 660 gtgagacctg gggctcctga tctgagctcc accctcattc actaaggtct gggcctcaag 720 accacaacct actcttgacc tcagttttct cactctggaa ccgcctcttc ctgaacccaa 780 acctggcctt gactgtggga ccctcatttc agactctact ac 822 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agatcaccat gggcatgcct tac 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aacacgttgt acaggtcgcc gtt 23

Claims (24)

  1. 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하고, 외인성 뉴클레오티드 서열이 상기 Fer1L4 유전자에 통합되며, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함하는, 부위 특이적 통합(SSI) 숙주세포.
  2. 제1항에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 목적하는 유전자 코딩 서열을 포함하는, SSI 숙주세포.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 2개의 재조합 표적 부위가 목적하는 유전자 코딩 서열에 플랭킹(flanking)하는, SSI 숙주세포.
  4. 제2항에 있어서, 목적하는 유전자 코딩 서열이 선택 마커, 검출가능한 단백질, 항체, 펩티드 항원, 효소, 호르몬, 성장인자, 리셉터, 융합 단백질 또는 다른 생물학적으로 활성인 단백질을 코딩하는 유전자를 하나 이상 포함하는, SSI 숙주세포.
  5. 제1항에 있어서, 재조합 표적 부위가 FRT 부위 또는 lox 부위인, SSI 숙주세포.
  6. 제4항에 있어서, 선택 마커가 글루타민 신타제(GS) 선택 마커, 하이그로마이신(hygromycin) 선택 마커, 퓨로마이신(puromycin) 선택 마커 또는 티미딘 키나제 선택 마커인, SSI 숙주세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주세포가 마우스 세포, 인간 세포, CHO 숙주세포, CHOK1 숙주세포 또는 CHOK1SV 숙주세포인 SSI 숙주세포.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열에 플랭킹하는 Fer1L4 유전자의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7, 8 및 9의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군에서 선택된, SSI 숙주세포.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 Fer1L4 유전자의 일부를 대체하는, SSI 숙주세포.
  10. 제5항에 있어서, 숙주세포가 야생형 FRT 부위 또는 돌연변이 FRT 부위인 FRT 부위를 포함하는, SSI 숙주세포.
  11. 제1항에 있어서, 재조합 표적 부위가 적어도 하나의 야생형 FRT 부위와 적어도 하나의 돌연변이 FRT 부위를 포함하는, SSI 숙주세포.
  12. a) 내인성 Fer1L4 유전자를 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 외인성 뉴클레오티드 서열이 Fer1L4 유전자 내에 통합되며, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 목적하는 제1 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 재조합 표적 부위를 포함하고;
    b) a)에서 제공된 세포를 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 형질감염하고, 여기서 상기 카세트는 적어도 하나의 목적하는 제2 유전자 코딩 서열에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위를 포함하고;
    c) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행한 다음;
    d) 목적하는 제2 유전자 코딩 서열을 발현하는 형질감염 세포를 선별하여 게놈 내에 안정하게 통합된 제1 교환가능한 카세트를 포함하는 SSI 숙주세포를 얻는 단계를 포함하는, SSI 숙주세포의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, i) 적어도 하나의 목적하는 제3 유전자 코딩 서열과 적어도 하나의 선택 마커에 플랭킹하는 적어도 2개의 매칭 재조합 표적 부위를 포함하는 적어도 하나의 제2 교환가능한 카세트를 포함하는 벡터로 SSI 숙주세포를 형질감염하고, ii) 부위 지정 재조합 매개 카세트 교환을 수행하여 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 포함하는 SSI 숙주세포를 얻고, iii) ii)에서 얻어진 SSI 숙주세포가 목적하는 제3 유전자 코딩 서열을 발현하고, iv) 목적하는 제3 유전자 코딩 서열의 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 목적하는 유전자의 발현을 나타내는 세포주를 제조하기 위한, 서열번호 7, 8 및 9에서 제공된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  15. 제14항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 벡터.
  16. a) 서열번호 7, 8 및 9에서 제공된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, b) 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터, 또는 c) 상기 폴리뉴클레오티드 분자, 및 상기 폴리뉴클레오티드 분자 내 또는 그에 인접한 목적하는 외인성 유전자 코딩 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  17. Fer1L4 뉴클레오티드 서열이 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열을 포함하는 벡터에 통합되고, 이후 벡터가 세포 또는 세포주에 안정하게 형질감염된 다음, 안정하게 형질감염된 세포 또는 세포주를 선별하여 얻는, 세포 또는 세포주를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, Fer1L4 뉴클레오티드 서열이 서열번호 7, 8 및 9에서 제공된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열인 방법.
  19. 제12항 또는 제17항의 방법에 따라 제조된 숙주세포 또는 세포주를 적합한 배지에서 배양하여 그로부터 생성물을 회수하는 것을 포함하는, 목적하는 유전자 코딩 서열의 생성물을 제조하는 방법.
  20. 적어도 하나의 목적하는 유전자 코딩 서열 및 적어도 2개의 재조합 표적 부위 중 하나 이상을 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 세포 내 내인성 Fer1L4 유전자에 삽입하는 것을 포함하는, SSI 숙주세포의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 상동성 재조합에 의해 Fer1L4 유전자와 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입되고, 여기서 폴리뉴클레오티드는
    a) Fer1L4 유전자의 제1 부분에 상동인 제1 뉴클레오티드 서열,
    b) 외인성 뉴클레오티드 서열 및
    c) Fer1L4 유전자의 제2 부분에 상동인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열의 삽입이 바이러스 벡터 또는 외인성 뉴클레아제를 사용하여 촉진된 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
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