CN104379753B - 位点特异性整合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及稳定且高产的位点特异性整合(SSI)宿主细胞，如源自中国仓鼠卵巢(CHO)的宿主细胞，其生产方法及其用途。

Description

位点特异性整合
说明
技术领域
本发明涉及稳定且高产的位点特异性整合(SSI)宿主细胞，如源自中国仓鼠卵巢(CHO)的宿主细胞，其生产方法及其用途。
背景技术
开发中的生物制药候选物的数量的增长已经刺激了开发有效且快速的用于开发细胞系的高通量技术的需求，因为使用常规方法生产商业细胞系是一个耗时、劳动密集且重复的过程。在构建和选择抗体生产细胞系的过程中，获得了具有宽范围的表达、生长和稳定曲线(profile)的细胞系。这些变化可由于哺乳动物基因组的固有可塑性而发生。这些变化也可来源于随机的基因调节网络或重组蛋白量的变化，重组蛋白的产生主要归因于“位置斑驳效应”(position variegation effect)的转基因的随机基因组整合。
做为这些变化和低(1/10,000)频率的基因组整合的结果，需要资源密集的和费时的工作以筛选群体(pool)中的许多转染体以查找这些罕见事件，以分离可商业应用的生产细胞系(例如生长良好、高产且生产稳定的组合，且其具有所希望的产物谱)。可以通过使用高严谨性选择系统如GS(谷氨酰胺合成酶)基因表达系统富集高产细胞系以改善此种情况。例如，在最近的一项研究中，大于30％的随机选择的产175mAb(单克隆抗体)的GS-CHOK1SV(GS Gene expression systemTM，Lonza)细胞系的组在分批补料摇瓶法中产生了>＝1g/L的mAb。CHOK1SV内源表达GS酶，因此，可以使用不含谷氨酰胺的培养基并用甲硫氨酸亚砜(MSX)选择来获得阳性转染体。尽管有这样的高效选择系统，还是需要严格费力的筛选机制。因此，构建生产性细胞系是一个费力且漫长的过程。不仅需要选择这些细胞系的阳性生长和生产特性，还需要对其进行克隆，并且基本上需要在生产过程中生产正确质量的产品。此外， 为了获得一个经济的过程，所产生的细胞系需要在许多世代的细胞中表现出一致的产率。令人满意的情况将是：提供一种高产的细胞系，其在每次表达新的目标蛋白(如新的单克隆抗体)时，具有阳性生长特性且具有最小的筛选活性。
发明内容
本发明的技术问题是克服上述的缺陷，特别是提供具有高稳定性和阳性生长以及生产率特性的高产细胞系，优选通过简单和有效的方式进行，尤其是在长期培养和生产周期中提供恒定生产率的细胞系。
根据独立权利要求教导的规定，本发明解决了下述技术问题。
特别地，本发明通过提供一种包含内源Fer1L4基因的位点特异性整合(SSI)宿主细胞，解决了该技术问题，其中将外源核苷酸序列整合到所述Fer1L4基因中。在一些实施方式中，外源核苷酸序列包含至少一个编码目标序列的基因。在一些实施方式中，外源核苷酸序列包含至少两个重组靶位点。在一些实施方式中，重组靶位点位于至少一个编码目标序列的基因的侧翼。在其它实施方式中，重组靶位点邻近但不位于至少一个编码目标序列的基因的侧翼。在一些实施方式中，编码目标序列的基因包含至少一个选择标记物基因。
在一个优选的实施方式中，本发明预见到，整合到内源Fer1L4基因中的外源核苷酸序列是两个重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列的基因的侧翼，优选地，位于至少一个选择标记物基因的侧翼，即一个第一重组靶位点位于至少一个编码目标序列的基因的5'上游并且一个第二重组靶位点位于至少一个编码目标序列的基因的3'下游，优选至少一个选择标记物基因。
优选地，编码目标序列的基因可以是编码目标蛋白的核苷酸序列，如抗体、抗原、酶、可检测的蛋白如荧光蛋白(如绿色荧光蛋白)、激素、生长因子、受体、融合蛋白或具有选择功能的蛋白。所述核苷酸序列可被功能性地连接到至少一种调控元件如启动子上。优选地，编码目标序列的基因是一个选择标记物基因。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的SSI宿主细胞，其中重组靶位点是FRT(FLP识别靶)位点。在本发明的一个优选实施方式中， FRT位点是野生型FRT位点，即F位点。
在本发明的另一个优选实施方式中，FRT位点是突变型FRT位点，优选F5位点，优选为如在Schlacke和Bode(1994)Biochemistry 33:12746-12752中所公开的。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，编码目标序列的基因如选择标记物基因的5'末端侧翼是野生型FRT位点并且其3'末端侧翼是突变型FRT位点。
在本发明的上下文中，术语“位于至少一个编码目标序列的基因的侧翼的重组靶位点”是指重组靶位点位于所述编码目标序列的基因的5'和3'，这意味着一个靶位点位于编码目标序列的基因的5'并且另一个靶位点位于编码目标序列的基因的3'。重组靶位点可以直接邻近于编码目标序列的基因或与编码目标序列的基因具有限定的距离。
侧翼序列(尤其是侧翼重组靶位点)正向或反向安置，优选两者都是正向的或优选两者都是反向的。
在本发明的另一个优选实施方式中，重组靶位点是lox位点。
在重组靶位点是FRT位点的情况下，宿主细胞需要存在并表达FLP(FLP重组酶)以获得交换(cross-over)或重组事件。在重组靶部位是lox位点的情况下，宿主细胞需要存在并表达Cre重组酶。
例如，可以通过将编码FLP或Cre重组酶的外源核苷酸序列引入到宿主细胞中(该核苷酸序列能够在所述宿主细胞中表达)来实现FLP或Cre重组酶的存在和表达。
因此，本发明提供了一种宿主细胞，优选为宿主细胞系，其将外源核苷酸序列如至少两个重组靶位点(尤其是FRT位点)和/或至少一个编码目标序列的基因整合入预先定义的“热点”(即Fer1L4基因)中，该宿主细胞支持生长、生产率和稳定性的阳性组合。例如，在一些实施方式中，本文提供的编码目标序列的基因在SSI宿主细胞中的表达在至少70、100、150、200或300代中是稳定的。如果表达下降小于30％或保持同一水平或随时间增加，则表达是“稳定的”。在一些实施方式中，如果容积产率下降小于30％或保持同一水平或随时间增加，则表达是稳定的。在一些实施方式中，本文提供的SSI宿主细胞产生了至少1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L或5g/L的编码目标序列的 基因的表达产物。在一些实施方式中，本文提供的SSI细胞(尤其是细胞系)是如此稳定，以至于使得其可以保持在无任何选择的培养基中，因此，本发明的细胞系具有更容易被调节剂(regulatory agencies)接受的潜力。在经济方面，本发明能够快速且资源高效地进行细胞系开发，因为由于本发明的细胞系的高度可预测性质，在过程的不同阶段中仅需要较少地筛选细胞系。因此，相比于标准过程，可以开发更多的针对给定目标的生物制药候选物如单克隆抗体(mAb)候选物或更多的针对多靶点的候选物。最终，缩短了目标蛋白(优选治疗性mAb)到临床的时间，使得患者受益。
在本发明的上下文中，术语“热点”是指一个位置，即在宿主细胞基因组中的一个位点，其提供了产物(即编码目标序列的基因的蛋白)的稳定且高表达活性(优选为转录活性)的生产，尤其提供了由编码目标序列的基因所编码的蛋白的强且稳定的生产，优选地，其中编码目标序列的基因在其转染后在所述位置上整合到宿主细胞中。
在本发明的上下文中，术语“位点”是指一个核苷酸序列，尤其是指定的核苷酸延伸，即指定长度的核苷酸序列，优选为较大的核苷酸延伸的一部分的所指定的核苷酸延伸。在一些实施方式中，位点(如是一个“热点”的位点)是基因组的一部分。在一些实施方式中，一个位点被引入到基因组中，如重组靶位点。“重组靶位点”是一段核苷酸延伸，其和重组酶对于靶向重组和限定此类重组的定位是必需的，并允许了靶向重组和限定此类重组的定位。
在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”在下文中也称为“受体细胞”，其是指在其基因组中携带(优选稳定地整合)有外源核苷酸序列的细胞。
在本发明的上下文中，“细胞”优选是哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物细胞，优选是小鼠细胞、仓鼠细胞，优选是中国仓鼠细胞，优选是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，优选是CHOK1细胞，优选CHOK1SV细胞。优选地，细胞是人类细胞。优选地，细胞是非人类细胞。
在本发明的上下文中，术语“细胞”优选是指细胞系的细胞。优选地，术语“细胞系”是指建立的永生化细胞系。
在一个实施方式中，术语“细胞”也指原代细胞。
在本发明的上下文中，术语“位点特异性整合(SSI)的宿主细胞”是指包含外源核苷酸序列的宿主细胞。在一些实施方式中，外源核苷酸序列包括重 组靶位点，使得外源核苷酸序列进行位点特异性整合，因此，使得所预期的核苷酸序列在所预期的位置上预先定位并定向整合到宿主细胞的基因组中。因此，在一些实施方式中，位点特异性整合的宿主细胞能靶向整合编码目标序列的基因。更优选地，位点特异性整合的宿主细胞能够通过重组介导的盒式交换(RMCE)靶向整合编码目标序列的基因。优选地，这样的方法仅引入编码序列的基因的一个功能性拷贝，优选地，在预定位置的仅一个拷贝的编码目标序列的基因。优选地，方法没有将载体序列(如原核表达载体序列)共同引入到宿主细胞中。
在进一步优选的实施方式中，将编码目标序列的基因的两个功能性拷贝引入到SSI宿主细胞中。
在本发明的上下文中，术语“选择标记物基因”是指一种核苷酸序列，尤其是编码序列的基因，即编码蛋白的核苷酸序列，在下文中也称为区域，其在至少一个调控元件的调节和功能性控制之下，尤其是启动子，其中所述编码蛋白的区域编码使得能选择表达所述蛋白的宿主细胞的蛋白。
在本发明的上下文中，术语FRT是指FLP识别靶。FRT是34个碱基对长的核苷酸序列，其使得位点定向重组技术能够进行，允许在体内在受控条件下操纵有机体DNA。FRT被FLP重组酶(FLP)结合，其随后将所述序列切割开，并使得在两个FRT位点之间整合的核苷酸序列发生重组。对于RMCE，需要两个由两个侧翼重组酶靶序列介导的交换事件；将位于盒的5'的一个和位于盒的3'的一个进行交换。交换可以发生于两个相同的FRT位点之间。使用FRT位点也需要表达并存在FLP重组酶。本文也称为“FRT/FLP”的整个系统公开于Seibler和Bode，Biochemistry 36(1997)，1740至1747页，和Seibler等人，Biochemistry 37(1998)，6229至6234页中。
在本发明的上下文中，Fer1L4基因是野生型Fer1L4基因，其所有的异型体和其所有的同系物，具体而言，只要同系物与野生型Fer1L4基因具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同源性即可，优选地，与野生型Fer1L4基因的全长相比，优选与野生型仓鼠Fer1L4基因相比，优选具有NCBI登录号NW_003613833或JH000254.1中的坐标1176191至1781992，优选为野生型CHO Fer1L4基因或其截短的形式。
最优选地，存在于本发明的SSI宿主细胞中的野生型Fer1L4基因的特征在于：首先，位于5'的侧翼序列的5'整合位点位于外显子39和40之间，其次，位于3'的侧翼序列的3'整合位点位于外显子28和29之间。因此，在一个优选的实施方式中，外源序列的整合涉及内源Fer1L4基因的一部分，优选此区域跨越并包括外显子28至40。在一些实施方式中，在SSI宿主细胞中至少一部分的Fer1L4基因被删除。
在本发明中，“同系物”或“同源序列”是核苷酸序列，其与具体给定的对比序列(如野生型CHO Fer1L4基因或其部分，如SEQ ID No.7、8或9)具有上述所确定的序列同源性。
在本发明的上下文中，术语“序列同源性”是指基于序列比对其将待比对的序列间的相似性最大化)测量的两个序列的同一性或相似性的程度，其是相同核苷酸的数量、总核苷酸的数量和序列比对中空位(gap)的存在和长度的函数。多种算法和计算机程序使用标准参数可用于确定序列相似性。优选地，使用BLASTn程序测量核酸序列的序列同源性，其可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，并描述于如Altschul等人(1990),J MoI.Biol.215:403-410；Gish和States(1993),Nature Genet.3:266-272；Madden等人(1996),Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等人(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang等人(2000),J.Comput.Biol.7(l-2):203-14。优选地，基于BLASTn算法的下列参数对两个核苷酸序列的序列同源性进行打分：字长＝11；空位开放罚分＝-5；空位延伸罚分＝-2；匹配奖励＝1和错配罚分＝-3。
因此，Fer1L4基因可以是CHO Fer1L4基因本身或也可以是如人类Fer1L4基因，例如Dysferlin(Fer1L1)、Otoferlin(Fer1L2)、Myoferlin(Fer1L3)、Fer1L4、Fer1L5或Fer1L6。
优选地，本发明的Fer1L4基因也可以是线虫(C.elegans)Fer1基因(NCBI基因号：172659，WormBase：WBGene00001414)或ferlin家族的任何其它成员(其在哺乳动物细胞中有六个成员)。Ferlin促进血管融合，尤其是膜融合事件。在蠕虫中，细胞器至质膜的融合和正常繁殖需要线虫Fer1(Achanzar,W.E.和Ward,S.,J.Cell Sci.110(1997),1073–108；Washington,N.L.和Ward,S.,J.Cell Sci.119(2006),2552–2562)。
随着C末端锚(anchor)，哺乳动物ferlin家族成员还包含多个(6或7)C2结构域(Sutton RB等人Cell 80(1995),929-38；Shao等人Science 273(1996),248-251)。因此，编码C2结构域的基因在下文中也认为是与本发明的野生型Fer1L4基因同源。
在本发明的上下文中，术语“外源基因”或“外源核苷酸序列”是指引入到宿主细胞中的核苷酸序列，如通过常规基因工程方法，优选通过转化、电穿孔或转染的方法，其在所述引入之前并不存在于所述宿主细胞中。这些序列也被称为“转基因”。
术语“内源基因”或“内源核苷酸序列”是指源自并存在于宿主细胞中的核苷酸序列，因此并没有从所述宿主细胞外引入到其内。
本文使用的术语“核苷酸序列”或“多核苷酸”优选是指核酸，优选为DNA或RNA。
在本发明的一个优选实施方式中，在至少两个重组靶位点侧翼的编码目标序列的基因是选择标记物基因或编码抗体的编码序列的基因，如单克隆抗体、抗体衍生物、融合蛋白、酶或生物活性蛋白如生长因子或肽激素、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、白细胞介素、干扰素等，尤其是可药用或营养功能性的蛋白。优选地，编码目标序列的基因对于宿主细胞而言是外源的。
在另一个优选的实施方式中，编码目标序列的基因也可以是在结构上或功能上确定的部分基因，如抗体片段，如其重链或轻链，或功能性蛋白的一部分。在一些实施方式中，编码目标序列的基因可以编码表达产物，此表达产物包含结构上或功能上确定的部分多肽，如不连续结构域、结构域的组或部分结构域，如抗体的重链或轻链或抗体的恒定区。
在一个优选实施方式中本发明涉及根据本发明的SSI宿主细胞，其中选择标记物是GS选择标记物、潮霉素选择标记物、嘌呤霉素选择标记物或胸苷激酶选择标记物。
在本发明的上下文中，GS选择标记物(由GS标记物基因编码)运行于GS标记物系统中。因此，在生长培养基中缺少谷氨酰胺时，谷氨酰胺合成酶(GS)活性对于培养物中的哺乳动物细胞的存活而言是必需的。一些哺乳动物细胞系如小鼠骨髓瘤细胞系，其在不添加谷氨酰胺时，不能够表达足够的GS用以生存。在这些细胞系中，转染的GS标记物基因可作为选择标记物起作用， 允许在不含谷氨酰胺的培养基的中生长。其它的细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系，其表达足够的GS用以生存而无需外源谷氨酰胺。在此类情况下，可以使用GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)以抑制内源GS活性，使得仅具有额外的GS活性的转染体才可以生存。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的SSI宿主细胞，其中宿主细胞是CHO宿主细胞或CHOK1SV(Porter,AJ等人Biotechnol Prog.26(2010),1455-1464)宿主细胞。
在一个优选的实施方式中，本发明还涉及SSI宿主细胞，其中将外源序列整合于横跨位置1750049(5'整合位点)至1760965(3'整合位点)的位置上(参见图7)。侧翼序列优选位于骨架(scaffold)坐标1750049至1750870(5'末端，SEQ ID No.9，822bp)和1758964至1760965(3'末端，SEQ ID No.7和8，2000bp)(参见图7)。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及本发明的SSI宿主细胞，其中位于整合的外源核苷酸序列侧翼的Fer1L4基因的核苷酸序列，即至少一个编码目标序列的基因(其本身在其5'和3'末端的侧翼分别具有一个重组靶位点)，选自SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9和其同源序列。
在本发明的一个优选实施方式中，侧翼序列与SEQ ID No.7、8或9中所给出的序列同源，其与野生型Fer1L4基因的这些区域优选与它们的全长具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同源性。
因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明的SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即至少一个编码目标序列的基因，其本身在其5'和3'末端的侧翼分别具有一个重组靶位点，并且其中SEQ ID No.7或8或其同源序列中的至少一个核苷酸序列位于整合到宿主细胞基因组中的外源核苷酸序列的3'末端。
因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明的SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即至少一个编码目标序列的基因，其本身在其5'和3'末端的侧翼分别具有一个重组靶位点，并且其中如SEQ ID No.9或其同源序列中所给的至少一个核苷酸序列位于整合到宿主细胞基因组中的外源核苷 酸序列的5'末端。
优选地，SSI宿主细胞包含外源核苷酸序列，即至少一个编码目标序列的基因，其本身在其5'和3'末端的侧翼分别具有一个重组靶位点，在其3'末端的侧翼具有SEQ IDNo.7、8或其同源序列中的至少一个核苷酸序列，且在其5'末端的侧翼具有如SEQ ID No.9所给出的核苷酸序列或其同源序列。
在一个特别地优选的实施方式中，SEQ ID No.7、8、9或其同源序列中所给出的5'和/或3'侧翼序列与整合在Fer1L4基因中的重组靶位点的5'末端或3'末端或5'和3'末端直接相邻且没有任何插入序列。
在本发明的另一个优选实施方式中，提供了一种分离的核苷酸分子，优选多核苷酸，其包含部分Fer1L4基因，如包含至少一个选自如SEQ ID No.7、8、9所给出的核苷酸序列和其同源序列的核苷酸序列。
特别优选的是一种分离的核苷酸分子，优选多核苷酸，其由至少一个选自如SEQID No.7、8、9所给出的核苷酸序列和其同源序列的核苷酸序列组成。
在本发明的另一个优选实施方式中，提供了载体(优选为表达载体)，其包含本发明的分离的核苷酸分子，尤其是SEQ ID No.7、8、9或其同系物，以及包含所述载体或所述核苷酸分子的转染的宿主细胞。
本文利用包含高水平表达报告蛋白的细胞系的表达盒的核酸构建体的整合位点上游和下游的序列经验性鉴定了定义Fer1L4基因座(locus)的核酸序列，即Fer1L4基因的核酸序列，即Fer1L4核苷酸序列，特别地，选自如SEQ ID No.7、8、9所给出的核苷酸序列和其同源序列的核苷酸序列。本发明的这些核酸序列提供了具有与增强的和稳定的核酸表达相关的新功能的序列，例如包含编码目标序列的基因的外源核酸，其展现出与之前所述的用于顺式作用元件(如启动子、增强子、基因座控制区、骨架附着区或基质附着区)的功能不同的功能。
本发明的核苷酸序列不具有任何的开放读码框(ORF)，使其不大可能编码反式激活蛋白。转染实验证明，本发明的序列显示了一些顺式作用元件的特性。在瞬时转染实验中未检测到本发明的序列的活性；本发明的序列也与用这些方法所检测到的启动子和增强子元件不同。
本发明还涉及Fer1L4核苷酸序列(尤其是选自如SEQ ID No.7、8、9所 给出的核苷酸序列和其同源序列的核苷酸序列)在载体(尤其是表达载体，尤其是包含至少一个编码目标序列的基因的非RMCE表达载体)中的用途，尤其是用于生产细胞系(优选在随机过程中)，尤其是用于生产显示出增强的表达的细胞系，尤其是用于生产高产(high producer)细胞系(优选在较高的频率且其优选提供了更高生产率的稳定性)。优选地，这样的用途预期是具有上述所确定的Fer1L4核苷酸序列的细胞的转染，优选是包含所述核苷酸序列的载体并从其获得稳定的转染细胞系。
因此，本发明还涉及生产细胞或细胞系(优选具有高生产率稳定性的高产(highproducer)细胞或细胞系)的方法，其中将Fer1L4核苷酸序列(尤其是选自如SEQ ID No.7、8、9所给出的核苷酸序列和其同源序列的核苷酸序列，优选为整合到载体中的序列，载体优选为表达载体，表达载体优选为非RMCE表达载体)转染入细胞或细胞系，并选择和获得稳定转染的细胞或细胞系。如本文所确定的Fer1L4基因座序列或其部分序列的存在提供了对目标基因的顺式作用效果，从而使其无论整合进基因组的任何位置都能增强它们的表达。在随机过程中按此种方式产生的细胞系预计显示出更高的生产率稳定性。
优选地，本发明涉及Fer1L4核苷酸序列在用于生产稳定和高转录活性的细胞系或细胞的表达载体中的用途。
优选地，本发明涉及上述所确定的用途，其中Fer1L4核苷酸序列选自如SEQ IDNo.7、8、9所给出的核苷酸序列和其同源序列。
优选地，本发明涉及一种用于生产编码目标序列的基因的产物的方法，其包括在合适的培养基中培养根据本发明的生产细胞或细胞系的方法制备的宿主细胞并从其中回收产物。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种根据本发明的SSI宿主细胞，其中外源核苷酸序列包括至少一个野生型FRT位点，优选至少两个野生型FRT位点，其在至少一个编码目标序列的基因的侧翼，或者至少一个突变的FRT位点，优选至少两个突变的FRT位点，其在至少一个编码目标序列的基因的侧翼。最优选地，外源核苷酸序列是在至少一个编码目标序列的基因的侧翼的一个野生型FRT位点和一个突变的FRT位点。特别优选地，编码目标序列的基因(优选为选择标记物基因)位于野生型FRT之间，优选位于编码目标序列的基因(优选为选择标记物基因)的5'，并以及突变的FRT位点，其 优选位于编码目标序列的基因(优选为选择标记物基因)的3'。优选地，这确保了重组介导的盒式交换(cassetteexchange)总发生于相同的方向上。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种根据本发明的用于生产SSI宿主细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含第一可交换盒的第一载体转染细胞(优选包含内源Fer1L4基因)，所述盒包括至少两个重组靶位点(尤其是FRT位点)，其位于至少一个编码目标序列(优选编码mAb)的第一基因的侧翼，随后，b)选择转染的细胞，转染的细胞包含至少两个重组靶位点，尤其是FRT位点，其位于至少一个整合进内源Fer1L4基因中的编码目标序列的第一基因的侧翼，并高水平且稳定地生产编码目标序列的第一基因的产物；随后，c)用包括第二可交换的盒的第二载体转染步骤b中所获得的细胞，该盒包括至少两个匹配的重组靶位点，尤其是FRT位点，其位于至少一个编码目标序列(即选择标记物基因)的第二基因的侧翼，随后，d)产生定点重组介导的盒式交换，以及随后，e)选择表达编码目标序列(优选选择标记物基因)的第二基因的转染的细胞，以获得根据本发明的包含稳定整合进宿主细胞基因组的第二可交换的盒的SSI宿主细胞(参见如图4)。
优选地，编码目标序列的第一和第二基因，在其一端的侧翼具有第一重组靶位点，并且在其另外一端具有与第一靶位点不同的第二重组靶位点。
因此，本发明提供了一种用于生产根据本发明的SSI宿主细胞的方法，该方法采用了重组酶介导的盒式交换，并且在此方法的过程中，将包括在重组靶位点的侧翼的编码目标序列(优选编码mAb)的第一基因的第一可交换的盒利用载体转染进宿主细胞，整合进宿主细胞的基因组(尤其是其“热点”)中，并且在选择“热点”转染体之后，将侧翼具有匹配的重组靶位点的的第二可交换盒转染进宿主细胞，并使其重组，从而用编码目标序列的第二基因交换编码目标序列的第一基因(如参见图4)，所述第二可交换盒如部分的环状交换质粒并包括至少一个编码目标序列的基因(尤其是编码目标序列(优选选择标记物基因)的第二基因)。有利地，仅有单拷贝的编码目标序列的基因于预定基因座插入，且没有载体序列(尤其是交换质粒的质粒序列)被整合进宿主基因组中。
本发明的用于制备SSI宿主细胞的方法是有利的，因为在步骤a)和b)中，可以使用至少一个编码目标序列的第一基因，如编码抗体如mAb或其部 分的基因或具有工业用途的基因如生物制药相关的蛋白，来鉴定显示出高且稳定地生产编码目标序列的基因的产物的“热点”，以及在步骤c)、d)和e)中，用于鉴定目标“热点”的所述编码目标序列的第一基因被所谓的空盒(null cassette)完全交换，尤其是被包含至少一个编码目标序列(即一个选择标记物基因)的第二基因的第二可交换盒完全交换。如此，创建了不含有预先存在的用于鉴定“热点”的编码目标序列的第一基因的序列的SSI宿主细胞，其允许进一步发生重组酶介导的盒式交换，以在所述“热点”上置入另一个编码目标序列的基因，即编码目标序列的第三基因取代了编码目标序列的第二基因(优选选择标记物基因)。因此，本发明所获得的SSI宿主细胞可以用来实现进一步的重组酶介导的盒式交换，以在确定的“热点”上将编码目标序列的第三基因置入宿主细胞的基因组中。
在本发明的上下文中，术语“匹配的重组靶位点”是指可交换盒的所述重组靶位点的第一位点与另一个可交换盒的第一重组靶位点相同，且首先提及的可交换盒的第二重组靶位点与另一个可交换盒的第二重组靶位点相同，从而允许核苷酸序列在重组靶位点之间的交换。优选地，两个可交换盒的第一重组靶位点都与两个可交换盒的第二重组靶部位不同。
在一个优选实施方式中，本发明涉及一种用于制备编码目标序列的基因的产物的方法，其包括以下步骤：i)用包含至少一个第三可交换盒的载体转染根据本发明的SSI宿主细胞，该盒包括至少两个位于至少一个编码目标序列的第三基因的侧翼的匹配的重组靶位点和至少一个选择标记物，ⅱ)产生定点重组介导的盒式交换，以便获得包含编码目标序列的第三基因的SSI宿主细胞，ⅲ)使在步骤ii)中获得的SSI宿主细胞表达编码目标序列的第三基因，以及iv)回收编码目标序列的第三基因的产物。
本发明的一个主要的优点是提供了固有的生产稳定性，其继承自产生于步骤b)的包括在确定的“热点”(即Fer1L4基因)上的编码目标序列的第一基因的SSI宿主细胞，以及包含编码目标序列的第三基因的SSI宿主细胞。这种稳定性独立于选择并可得出结论：步骤a)和b)中确定的“热点”是与“热点”周围或基因组中别处的序列相关的特点。在基于随机载体整合的细胞系的构建中，这是一种非常罕见的事件，且在找到这样的位点之前，需要付出的努力是巨大的。因此，本发明消除了选择合适的细胞系的延长的稳定性研究，进而整体缩短了开发周期并节省了资源。此外，本发明使得在重组介导的盒式交换之后，培养细胞而不进行选择，这意味着制造过程潜在地更容易被管理机构所接受。有利的是，本发明的“Fer1L4热点”是确定的，并用mAb来鉴定，优选不使用荧光标记物。
本发明提供了一种制备SSI宿主细胞的方法，其中通过靶向整合将外源核苷酸序列引入到细胞中的内源Fer1L4基因上。任何的用于将核苷酸序列引导至基因组的目标特定位点的各种方法均可以使用，这包括同源重组和核酸酶介导的方法，如使用细小病毒介导的同源重组，使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或工程化的大范围核酸酶(参见如Russell和Hirata,Nat.Med.18(4):325-30,1998；US Pat.Pub.No.20120070890；USPat.No.6,528,313；US Pat.Pub.No.20090258363)。通过此种方法引入的外源核苷酸序列可以包括任何本文所述的特征。例如，外源核苷酸序列可以包括至少一个编码目标序列的基因和/或至少两个重组靶位点。在一些实施方式中，编码目标序列的基因包含至少一个选择标记物基因。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种制备SSI宿主细胞的方法，该方法包括将外源核苷酸序列引入到细胞的内源Fer1L4基因上。优选地，外源核苷酸序列通过同源重组被引入到Fer1L4基因和多核苷酸之间，其中多核苷酸包括：a)与Fer1L4基因的第一部分同源的第一核苷酸序列，b)外源核苷酸序列，以及c)与Fer1L4基因的第二部分同源的第二核苷酸序列。在该进一步的实施方式中，外源核苷酸序列的引入优选使用病毒载体如介导同源重组的腺相关病毒载体，或外源核酸酶如锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或工程化的大范围核酸酶进行推进。特别优选的是，使用腺相关病毒载体。在一个特别优选的实施方式中，外源核苷酸序列位于重组靶位点(优选loxP位点)的侧翼。
在方面A中，本发明还涉及用于制备SSI宿主细胞的方法，其包含以下步骤：a)提供包括内源Fer1L4基因的细胞，其中将内源核苷酸序列整合进所述Fer1L4基因，并且其中内源核苷酸序列包括至少两个重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列的第一基因的侧翼；随后，b)用包含第一可交换盒的载体转染步骤a)中所提供的细胞，所述盒包括至少两个匹配的重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列(即选择标记物基因)的第二基因的侧翼，随后， c)产生定点重组介导的盒式交换，以及随后，d)选择表达编码目标序列(优选选择标记物基因)的第二基因的转染细胞，以获得包含稳定整合至SSI宿主细胞的基因组的第一可交换盒的SSI宿主细胞。
本发明还涉及一种用于制备SSI宿主细胞的方法，其包含如下步骤：a)提供包括内源Fer1L4基因的细胞，其中将外源核苷酸序列整合进所述Fer1L4基因，并且其中外源核苷酸序列包括至少两个重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列的第一基因的侧翼；随后，b)用包含第一可交换盒的载体转染步骤a)中所提供的细胞，所述盒包括至少两个匹配的重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列(即选择标记物基因)的第二基因的侧翼，随后，c)产生定点重组介导的盒式交换，以及随后，d)选择表达编码目标序列(优选选择标记物基因)的第二基因的转染细胞，以获得包含稳定整合至SSI宿主细胞的基因组的第一可交换盒的SSI宿主细胞。
本发明还涉及上述确定的方面A中的方法，其进一步包括：i)用包含至少一个第二可交换盒的载体转染SSI宿主细胞，该盒包括至少两个匹配的重组靶位点和至少一个选择标记物，其中重组靶位点位于至少一个编码目标序列的第三基因的侧翼，ⅱ)产生定点重组介导的盒式交换，以获得包含编码目标序列的第三基因的SSI宿主细胞，ⅲ)使步骤ii)中获得的SSI宿主细胞表达编码目标序列的第三基因，以及iv)回收编码目标序列的第三基因的产物。
本发明还提供了一种细胞用于生产稳定且高转录活性的细胞系的用途，所述细胞优选为包含内源Fer1L4基因(优选CHO Fer1L4基因)的CHO细胞。
在详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明并不限于所述的具体实施方式，因为其当然可能发生变化。还应当理解的是，本文所使用的术语的目的仅在于描述特定实施方式，并不意图限制，这是因为本发明的范围仅由所附的权利要求来限定。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，现在描述了一些可能的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与出版物中所引用的相关的方法和/或材料。应当理解的是，如果存在矛盾，则本发明所公开的内容替代任何并入的出版物的公开 内容。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“该载体”包括提及一个或多个载体和其本领域技术人员已知的等同物等。
本文所讨论的出版物仅仅提供了先于本申请的申请日的公开内容。此处的内容并不能解释为承认因借助在先发明而使本发明没有资格早于这些出版物。此外，所提供的出版物的日期可能与实际的出版物日期不同，这可能需要被独立地确认。
进一步的优选的实施方式是从属权利要求的主题。
SEQ ID No.1至3表示本发明所使用的载体的核苷酸序列，
SEQ ID No.4至6表示本发明所使用的引物，
SEQ ID No.7和8表示Fer1L4CHO基因的3'定位的序列，
SEQ ID No.9表示Fer1L4CHO基因的5'定位的序列，和
SEQ ID No.10和11表示本发明所使用的其它引物。
本发明将通过实施例和附图进一步进行描述。
附图说明
图1示出了用于鉴定CHOK1SV中的“热点”的载体pRY17(SEQ ID No.1)。LC1和HC1是嵌合单克隆IgG4抗体(cB72.3)的轻链和重链。hCMV是指hCMV-MIE早期基因启动子，其中“Int”是指其第一个内含子，内含子A和编码5'UTR的侧翼外显子分别被表示为“Ex1”和“Ex2”。将野生型和F5突变型FRT位点分别标记为F和F5。将多聚腺苷酸化、SV40早期启动子和β内酰胺酶序列分别表示为pA、SV40和bla。GS表示谷氨酰胺合成酶cDNA，以及Hyg(-ATG)表示缺少起始甲硫氨酸密码子和启动子的潮霉素磷酸转移酶基因。
图2示出了用于构建SSI宿主10E9的“中间”载体pRY37(SEQ ID No.2)。此载体包含突变型FRT(F5)和野生型FRT位点(F)，其位于包含胸苷激酶(TK)和嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)基因的转录单元的侧翼。各个转录均被SV40早期启动子(SV40E)驱动。将载体pRY37与编码FLP重组酶的载体 pOG44(Invitrogen)共转染到11A7细胞中。在含有嘌呤霉素的培养基中选择细胞系，并进一步筛选介于pRY37FRT序列和嵌入11A7基因组的pRY17的等同序列之间的RMCE(参见图3)。在筛选和克隆之后，分离细胞系10E9(“SSI宿主”)，其中cB72.3mAb转录单元被TK和PAC的转录单元交换。
图3示出了用于在SSI宿主10E9中创建生成mAb的细胞系的靶向载体。此载体pRY21(SEQ ID No.3)包含含有Myo mAb基因(HC2和LC2)的转录单元，其侧翼具有突变型(F5)和野生型FRT位点。将框内起始甲硫氨酸密码子添加到野生型FRT位点的5'端(ATG+F)并且在其上游是一个SV40早期启动子(SV)。通过hCMV主要立即早期基因1(hCMV-MIE)的启动子和其第一内含子内含子A(Int A)和分别表示为“Ex1”和“Ex2”的编码5'UTR的侧翼外显子来驱动HC2和LC2基因的转录。β-内酰胺酶基因表示为bla。
图4示出了从11A7细胞系产生SSI宿主10E9的过程。此示意图示出了细胞系11A7中包含mAb cB72.3转录单元(HC1和LC1)的线性基因组整合的单拷贝的pRY17，转录单元的侧翼具有突变型F5和野生型FRT位点。在转染之前，用PvuI于β内酰胺酶基因(bla)的中间切割载体pRY17，然后使线性载体的侧翼带有基因的5'(bla L)和3'(bla R)部分。将载体pRY37与编码FLP重组酶的质粒共转染到细胞系11A7中，且使重组(用叉表示)发生于相似的位点之间，导致了均受SV40早期启动子(SV)驱动的使用胸苷激酶(TK)的mAb转录单元和嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)转录单元的RMCE。
图5示出了从SSI宿主10E9产生生成mAb的细胞系的过程。靶向载体pRY21(图3，SEQID No.3)包含第二(Myo)mAb(HC2和LC2)转录单元，转录单元侧翼的上游具有突变型FLP位点(F5)且其下游具有SV40早期启动子(SV)，SV自身在野生型FRT位点的上游，其在框内与甲硫氨酸起始密码子(ATG-F)相连。在Flp重组酶和靶向载体pRY21存在的情况下，胸苷激酶(TK)和嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)基因和相关的启动子通过RMCE被新的Myo mAb抗体转录单元所取代。从而创建了野生型FRT位点和潮霉素基因的功能性融合基因(ATG-F-Lnk-Hyg)。因此，已发生特异性RMCE的细胞可以在潮霉素和更昔洛韦(ganciclovir)的存在下进行选择。
图6示出了来源自随机过程或FLP辅助位点特异性整合(SSI)的SSI群体和克隆细胞系的抗体表达的比较。使用与在阶段1中产生细胞系11A7所使 用的方法相同的方法产生随机整合克隆。在如方法部分所述的不同转染和选择条件下产生SSI群体(SSI的第1轮)和克隆细胞系(SSI的第2轮和SSI的第3轮)。对于SSI的第3轮，使用4个不同的选择条件：不具有MSX的200μg/mL(●)、具有MSX的200μg/mL潮霉素(◆)、不具有MSX的400μg/mL潮霉素(▲)或具有MSX的400μg/mL潮霉素
Figure BDA0000640040910000171
将所有过程中产生的克隆细胞系在摇瓶中进行扩增。在7天末对分批摇瓶中的克隆细胞系的生产率进行评估(参见方法)。
图7示出了在骨架1492aka.JH000254.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JH000254)的负链上的Fer1L4基因的外显子结构。已指出5'和3'整合位点的位置(分别是1750049和1760965)。
图8示出了使用BWA映射到(mapped to)pRY17-GA-Q的10E9读取(reads)的映射。通过对映射进行检查，发现多个未配对的映射到HC片段的5'末端(其从完整HC的5'末端删除了214bp)的读取(黑色线)。
图9示出了在SSI宿主细胞10E9的Fer1L4基因上的支持面(landing pad)的结构。(A)显示支持面的WGRS覆盖重叠于“单拷贝”模型的上方，下方示出了更详细的示意图。(B)Southern印迹的数据表明，可能有双拷贝的支持面。将来自10E9细胞的基因组DNA用Bmg I或Pml I限制性酶消化并通过Southern印迹进行分析。用TK探针杂交Southern印迹，揭示了跨越两个拷贝的支持面的两个片段(显示为映射到“双拷贝”模型)。“双拷贝”模型与WGRS数据一致。
图10示出了10E9(SSI宿主细胞)和RMCE细胞系(表达目标基因)的整合位点的示意图。基因组位置用垂直虚线表示，且核苷酸整合(coordinate)在未入选的(unplaced)CHO-K1骨架1492骨架(登录号为JH000254.1，与NW_003613833.1相同)。Fer1L4基因表示为箭头，同时基因组片段表示为实线。中断虚线代表非常大的距离。5'和3'侧翼序列分别用白色和黑色的指针表示。
图11显示了在整合载体的单拷贝模型上的映射的全基因组重测序读取的覆盖图。灰度图的高度等于在每个碱基上的无平滑的覆盖(示出了各个RMCE生成细胞系，1-4)。在侧翼区的覆盖在所有细胞系间大约相同。然而，在图顶部的两个高产者的覆盖是在底部的两个低产者的覆盖的约1.4至2.3 倍。wFRT特征由星号表示，而mFRT特征由黑色圆圈表示。(其它特征表示如下：缺失214bp的HC是在创建SSI宿主10E9之后在热点留下的剩余的cB72.3；BlaR是β-内酰胺酶基因的5'部分；Myo-LC和Myo-HC是抗筒箭毒碱mAb HC(重链)和LC(轻链)编码序列，在RMCE之后残留于热点上；Hyg＝潮霉素；BlaL是β-内酰胺酶基因的3'部分，且GS-cDNA是来自载体pRY17的谷氨酰胺合成酶编码序列)。
图12显示了在整合的载体的Myo LC和HC区域上映射的RNA-seq读取的覆盖图(对于RMCE生成细胞系1-4)。图表的高度等于在每个碱基的无平滑的覆盖。
实施例
实施例1：
A)材料和方法
1.载体构建
所有载体序列进行合成且完全测序。嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)、潮霉素磷酸转移酶(Hyg)和mAb基因在基因合成之前进行全基因优化并适应灰仓鼠的密码子偏好。pRY17(图1)的大部分源自pCB72.3-GA-HC-LC(Kalwy等人(2006)，Mol Biotechnol.34.页151至156)。存在于所有载体中的野生型FRT(F)的序列和突变型F5FRT(F5)重组序列出自Schlake和Bode(Schlake和Bode,1994,Biochemistry 33:12746-12751)。模板序列(在基因合成之前，有或没有基因优化)来源如下：在载体pRY17中的F重组序列和接头的框内融合(图1)取自载体pFRT/lacZeo(Invitrogen)。在pRY21中的甲硫氨酸起始密码子和F重组序列的框内融合(图3)获得自pcDNAT5/FRT(Invitrogen)。在所有载体中，所使用的SV40早期启动子(除了一个与GS转录单元相关的，其来源于pCB72.3-GA-HC-LC)获得自上述提及的Invitrogen载体。pRY37中的胸苷激酶(TK)和PAC基因序列分别来源自pWSTK6(gb：EU530625)和pPUR(Clontech，gb：U07648)。
2.分批和补料分批摇瓶分析
对于分批摇瓶分析，将细胞按3×105活细胞/mL接种于含有30mL的补 充有各种选择剂(如后述)的CD CHO的125mL摇瓶中，并在湿润的含有5％CO2(v/v)的空气中于37℃在140rpm的轨道摇动培养箱中孵育。在培养的第7天收获条件化的培养基并通过蛋白A HPLC测定条件化的培养基中的抗体浓度。
对于补料分批摇瓶分析，将细胞按3×105细胞/mL接种于500mL摇瓶中，每个均含有100mL的专用培养基并在湿润的含有5％CO2(v/v)的空气中于37℃在140rpm的轨道摇动培养箱中孵育。从培养的第3天开始，用由氨基酸和微量元素的混合物组成的专用饲料对细胞进行补料。使用Vi-CELLTM自动细胞活力分析仪确定每日存活率和活细胞浓度。从培养的第6天直至第14天收获，通过蛋白A HPLC确定培养基中的抗体浓度。
3.稳定性分析
将细胞每3天和每4天交替在含有30ml的补充有不同选择剂(如后述)的CD CHO的125mL摇瓶中进行传代培养。在不同的世代号(1代相当于1个群体倍增)中，建立如上所述的双份补料分批摇瓶。如上所述收集细胞浓度、活性和mAb浓度测量值。如果一个细胞系的生产率在70代中变化大于30％，则认为是不稳定的。
4.流式细胞仪检测单细胞克隆
在装配了FACSDiva V6.0软件的具有于488nm发射的空冷激光的FACS Aria II细胞分选仪上进行单细胞克隆分选。在FSC对SSC点图中排除死细胞，在FSC宽度对面积的点图中排除双联体(doublets)。对于活细胞的分选门槛(gate)是两个点图的组合。
5.SSI宿主细胞的世代
使用FreeStyleTM MAX CHO系统(Invitrogen)，利用空载体、包括编码目标序列(即选择标记物基因)的第二基因的pRY37转染亲本pRY17表达细胞系。为此目的，在用于RMCE的重转染之前24h，将选择的pRY17转染的细胞系(11A7)首先以5×105细胞/mL于125mL摇瓶中接种于FreeStyleTM CHO表达培养基中。在转染的当天，根据制造商说明书，以1×106细胞/mL的浓度将约3×107细胞与具有FreeStyleTM MAX试剂的33.75μg的pOG44质粒(Invitrogen，gb：X52327)和3.75μg的pRY37(9：1)于125mL的摇瓶中共转染。转染后，将细胞在含有补充有25μM的MSX和7μg/mL嘌呤霉素的专 用的化学成分已知的培养基的48孔板中进行铺板。铺板三周后，使用Protein A生物传感器于ForteBio筛选含有活细胞的每个孔中的培养基中的抗体生产。将没有可检测到的抗体的细胞系的培养基送入包含补充有25μM的MSX和1μg/mL嘌呤霉素的CD CHO培养基的125mL摇瓶中。
6.来源自10E9宿主的细胞系的世代
将RMCE实验分成3个不同的“轮次”，并在此处和之后的结果部分中涉及(轮次如图6所定义)。
在第1轮和第2轮中，使用FreeStyleTM MAX CHO系统(Invitrogen)，用SSI靶向载体pRY21转染SSI宿主细胞10E9。为此目的，在用于RMCE的重转染之前24h，将10E9SSI宿主细胞首先以5×105细胞/mL于含有补充有25μM的MSX和1μg/mL嘌呤霉素的FreeStyleTMCHO表达培养基(Invitrogen)的125mL摇瓶中接种。在转染的当天，根据制造商说明书，以1×106细胞/mL的浓度将约3×107细胞与具有FreeStyleTMMAX试剂的33.75μg的pOG44质粒(Invitrogen，gb：X52327)和3.75μg的pRY21(9：1)于125mL摇瓶中共转染。转染后，将细胞在含有30mL的补充有25μM的MSX的FreeStyleTM CHO表达培养基(Invitrogen)的125mL摇瓶中进行恢复。RMCE48h之后，将来自第1轮的转染体铺板于含有补充有25μM的MSX、400μg/mL潮霉素(阳性选择)和3μM更昔洛韦(阴性选择)的专用的已知化学成分的培养基的48孔板中。四周之后，使用Protein A生物传感器于ForteBio Octect测定来自包含可见聚集物(foci)的孔的培养基中的mAb浓度。将分泌mAb进入培养基的细胞扩增并保持于含有补充有200μg/mL潮霉素和25μM的MSX的CD CHO培养基的摇瓶中。将这些细胞群体进一步在分批摇瓶分析中评估抗体生产率(如前面所述)。对于稳定性分析，将MSX从图6中指定的传代培养条件中去除。
在摇瓶中恢复48小时之后，将第2轮的转染体以5×105细胞/mL的浓度接种于含有补充有400μg/mL潮霉素(阳性选择)的CD CHO培养基的125mL的摇瓶中。随后，在5天后加入3μM更昔洛韦作为阴性选择。将细胞每3-4天在同一培养基中在同一摇瓶中连续传代3周。使用FACS Aria II将存活的细胞单细胞克隆至含有补充有400μg/mL潮霉素和3μM更昔洛韦的专用的已知化学成分的培养基的96孔板中。三周后，使用Protein A生物 传感器于ForteBio Octect测定来自包含可见细胞生长的孔的培养基中的mAb浓度。将分泌mAb进入培养基的克隆扩增并保持于含有补充有200μg/mL潮霉素和25μM的MSX的CD CHO的摇瓶中。将这些克隆进一步在分批摇瓶分析中评估抗体生产率(如前面所述)。对于稳定性分析，将MSX从图6中指定的传代培养条件中去除。
对于第3轮转染，利用电穿孔用45μg的pOG44质粒(Invitrogen，gb：X52327)和5μg的pRY21在900μF、300V共转染1×107的10E9SSI宿主细胞。转染后，将细胞接种到含有20mL的专用的已知化学成分的培养基的T-75烧瓶中。48h之后，将200或400μg/mL的潮霉素加入到培养基中，随后，于6天后加入3μM更昔洛韦。在一些情况下(如图6说明中所述)，随潮霉素选择与25μM的MSX进行添加。对于所有测试的转染条件，在这些条件下选择细胞3周。在此期间，每3-4天将T-75烧瓶中的条件化的培养基交换成含阳性和阴性药物选择的新鲜培养基。一旦存活率达到>＝90％，使用FACS Aria II将细胞单细胞克隆至含有与之前所述相同的补充有200或400μg/mL潮霉素(有或没有25μM的MSX)的专用的已知化学成分的培养基的96孔板中(如图6说明中所述)。使用Protein A生物传感器于ForteBio Octect测定收集自包含生长的可见细胞的孔中的条件化的培养基中的抗体浓度。将选择的克隆细胞系扩增并传代培养于含有补充有200μg/mL潮霉素和25μM的MSX的CD CHO培养基的125mL摇瓶中。将这些克隆进一步在分批摇瓶分析中评估抗体生产率(如前面所述)。对于稳定性分析，将潮霉素和MSX从图6说明中指定的传代培养条件中去除。
7.数据分析
使用如Renard等人(Renard等人1988,Biotechnology Letters 10:91-96)所述的方法计算生长曲线下面积的时间积分(活细胞浓度的时间积分(IVC)；106细胞天/mL)
Figure BDA0000640040910000211
其中Xv0＝在第一样品的活细胞浓度(106/mL)，Xv1＝在第二样品的活细胞浓度(106/mL)，t0＝在第一样品的运行时间(天)，t1＝在第二样品的运行时间 (天)。
8.DNA步移
按制造商说明使用Seegene DNA Walking SpeedUpTM试剂盒II来提供3'基因组侧翼序列数据。使用了β-内酰胺酶(bla)基因特异性引物，其特异于在GS-CHOK1SV细胞系11A7中的线性整合的pRY17载体示意图的3'臂中的bla(bla R，图3)，TSP1fwd(SEQ ID No.4)、TSP2fwd(SEQ ID No.5)和TSP3fwd(Seq ID No.6)。
9.10E9宿主的基因组测序
将10E9基因组DNA碎片化，并使用TrueSeq DNA样品制备试剂盒按制造商说明书制备适合于HiSeq平台测序的配对末端文库。所产生的文库在300bp至500bp的预期大小范围内。使用Agilent2100生物分析仪对所产生的文库进行QC分析(这表明，文库是可接受的质量，其含有预期的片段大小和产量，以用于后续样品处理)。按制造商说明书，将所生成的文库用于cBot系统以用于簇生成。将含有扩增的簇的流动池(flow cells)使用2×100碱基对的配对末端测序在Hi-Seq 2000中进行测序。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)(Li H.和Durbin R.200925:1754-1760)将读取映射到CHO-K1重叠群上(Xu X et al.2011,NatureBiotechnol.29:735-742)。
B)结果
阶段1：亲本mAb表达细胞系的生成
阶段1的目的是产生高产的表达mAb的GS-CHOK1SV细胞系，其显示出良好的生长特性与稳定的生产率，其仅包含单个整合基因座和在此基因座上的最低可能数量的载体整合体。设计编码嵌合mAb(cB72.3)(Whittle等人1987,Protein Eng 1:499-505)的修饰的Lonza GS“双基因载体”(pRY17)(图1)。在pRY17中，48bp的野生型F和突变型F5重组序列位于mAb的HC和LC转录单元的侧翼。虽然F5和F重组序列在功能上等同，但其表现出极小的交叉重组活性，因此允许由FLP重组酶催化进行高效和定向RMCE(Schlake和Bode,1994,Biochemistry 33:12746-12751)。源自pRY17转染的初始GS-CHOK1SV细胞系不能有效转录或翻译潮霉素抗性基因，这是因为在这一杂交基因直接的上游没有引发剂甲硫氨酸密码子或启动子。
重要的是，来源于载体的GS基因被置于可交换的盒的外面，使得其在RMCE之后被保留于所获得的细胞系的基因组中。通过这样的操作，避免了在任何衍生细胞系中的谷氨酰胺代谢的任何潜在扰动；在不含谷氨酰胺的培养基和50μM甲硫氨酸亚砜(MSX)中、在存在内源和来源于载体的谷氨酰胺合成酶的表达的情况下选择亲本GS-CHOK1SV细胞系。将无启动子的和翻译起始甲硫氨酸缺陷(-ATG)的潮霉素B磷酸转移酶基因置于编码接头(Lnk)的序列和F重组序列之间(图1)。在本研究的第二阶段中用于RMCE的载体含有表达潮霉素抗性所需的SV40早期启动子和起始甲硫氨酸(ATG)。仅当重组发生于基因组中的野生型F重组序列上时，才创建全功能的潮霉素抗性基因(图1)。
将含有FRT重组序列的pRY17载体通过常规细胞系开发过程引入CHOK1SV细胞，随后，在此过程的关键阶段进行集中筛选，以确保所分离的细胞系具有生长和生产率的最佳组合。此外，来源于所选择的细胞系的cB72.3蛋白应显示出与来源于先前的GS-CHOK1SV细胞系的制备物相似的产品质量特征(Birch和Racher,2006,Adv Drug Deliv Rev 58:671-685)。优选来自候选细胞系的HC和LC基因拷贝数相互接近。为此，进行三个独立的电穿孔，并且每个都用50μg的线性化pRY17和1×107的CHOK1SV细胞进行。在含有50μM的MSX的培养基中选择来自全部三个电穿孔的转染体，并且在转染后3周筛选约1500个存活细胞群的抗体生产。最终，通过7天分批摇瓶评估了共计79个克隆，并测定了所有79个克隆的cB72.3mAb浓度。将所有来源自RMCE的细胞系保持于含有25μM的MSX的培养基中(除了其中指明的)。从进行评估的79个克隆中选择38个用于进一步在补料分批摇瓶培养中进行分析。基于生产率和生长特征选择前6个表现最好的克隆(表1)，用于遗传特征分析(见方法)。
Figure BDA0000640040910000231
Figure BDA0000640040910000241
表1：来自于阶段1的前6个克隆细胞系在分批和补料分批摇瓶中的生长和抗体生成(n＝2)。
为了研究pRY17在CKOK1SV基因组中的整合位点，制备并用DIG标记的pRY17探测来自于该6个克隆的中期染色体(数据未显示)。克隆1G11、6B5、8F10、14D11和11A7似乎都仅有一个位于个体染色体的端粒区的整合基因座。另一方面，克隆18C11似乎有两个不同的整合位点，因此没有选择其用于进一步研究。为了测定每个细胞系的基因拷贝数，从生长活跃的细胞中制备经超声处理的基因组DNA。对于qPCR分析，包含GAPDH作为内源对照并将pRY17“刺”入(spiked)宿主细胞DNA作为阳性对照。计算每个细胞的HC和LC的基因拷贝数为平均拷贝与平均GAPDH拷贝的比率。如表2所示，在5个分析的克隆中，11A7具有最低的HC和LC基因拷贝数。基因组DNA的Southern印迹分析表明，在所有5个克隆中都可以检测到HC和LC，带的强度反映了qPCR所确定的基因拷贝数(数据未显示)。
细胞系 HC平均拷贝/细胞 LC平均拷贝/细胞
1G11 15.58 13.95
6B5 44.46 47.91
8F10 40.46 38.41
11A7 6.57 3.57
14D1 9.75 9.31
表2：使用qPCR分析6个克隆细胞系中的5个的cB72.3HC和LC的基因拷贝
在所选择的进入目前的稳定性研究的5个克隆中(表3)，11A7保持了相似的产率超过7个月(220代)，而其它克隆在研究的前3个月(80代)都显示出了逐渐地产率损失。综合来看，11A7不仅具有良好生长和生产率配置的最佳 组合之一，还具有最低的具有单一整合位点的基因拷贝数。重要的是，在产率方面，11A7是6个克隆中最稳定的。最重要的是，在220代后产物质量也具有可比性。选择11A7作为亲本克隆用于RMCE：阶段II的第一轮。
Figure BDA0000640040910000261
阶段II-SSI宿主细胞的产生
尽管完全可能设计靶向载体，其可以将11A7中的初始mAb转录单元交换为新的mAb的转录单元，优选的是，将初始的mAb转录单元完全从基因组中去除。为此，设计额外的空靶向载体(pRY37)(图2)，其不编码mAb基因。相反地，其编码阳性和阴性选择标记物，分别是嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)和胸苷激酶(TK)，它们的侧翼为与pRY17同向的F和F5重组序列(图1)。RMCE之后，期望这些标志物在初始11A7基因组的相同基因座上取代初始的cB72.3mAb。需要PAC来选择经历了含有pRY37的RMCE的细胞系。TK将前体药物更昔洛韦转变成有毒的、磷酸化的核苷酸类似物(Wood和Crumpacker,1996,New England Journal of Medicine335，721至729页)。这对于之后的阶段III中的阴性选择的应用是重要的：更昔洛韦选择通过杀死未经过合理的RMCE的细胞来富集经过合理RMCE的RMCE细胞群。
在幸存的对于mAb表达而言均是阴性的细胞系群中，选择一个细胞系136-A4用于通过Southern印迹分析进行进一步表征(数据未显示)。已证实在136-A4基因组中存在TK。限制性作图表明在“热点”中仅存在两个拷贝的pRY37，随后通过子克隆(daughter clone)10E9的基因组测序进行了确定。拷贝数基本上低于11A7中所发现的pRY17(表2)。为了获得同源SSI宿主，使用FACS Aria II单细胞克隆了136-A4并获得了26个克隆衍生物的生长曲线。其中，选择2个具有最佳的生长曲线的克隆衍生物10E9和8C8，用于通过Northern印迹分析进行进一步表征。这些子克隆的RNA的Northern印迹分析确定了cB72.3HC和LC mRNA的缺失(数据未显示)。综合而言，这些结果表明，对于RMCE的阶段III的测试而言，10E9是合适的候选宿主细胞。
阶段III-带有Myo mAb靶向载体的RMCE
为了证明新的SSI宿主细胞系10E9的实用性，设计靶向载体pRY21(图3)。这种载体含有Myo mAb的HC和LC基因，其侧翼为与pRY17(阶段I)和pRY37(阶段II)载体中所发现的方向相同的F和F5重组序列。其还包含框内融合到F重组序列上的甲硫氨酸起始密码子(ATG+F)的上游的SV40早期启动子(SV40E)。当发生合理RMCE时，ATG+F序列与无启动子的和翻译起始甲硫氨酸缺陷(-ATG)的潮霉素B磷酸转移酶基因被置于框内。用pRY21 和pOG44对10E9细胞进行3轮共转染。在头2轮中，用Free styleTM MAX CHO系统转染细胞，而在第3轮中，通过电穿孔转染细胞。此外，第1轮用更昔洛韦和潮霉素进行共选择来选择细胞群体；第2轮按顺序先用400μg/mL潮霉素，再用更昔洛韦来选择细胞群体，随后使用FACS Aria II进行单细胞克隆；第3轮按顺序先用200或400μg/mL潮霉素，再用更昔洛韦来选择细胞群体，并随后使用FACS Aria II进行单细胞克隆(图6)。在第3轮中，在测试条件的两种中，培养基中不存在MSX。
在第1轮的不同群体中所获得的生产率数据是相似的，这表明每个群体中的细胞系成员可能具有相似的生产率。群体的产率范围比来自随机整合过程的克隆或非克隆细胞系的产率范围窄得多(图6)。当比较从第2轮和第3轮的不同选择条件所分离的克隆细胞系时，与存在MSX的组相比，最高产的克隆细胞系存在于在缺失MSX时选择的组中。在缺失MSX的情况下生长的细胞系中，似乎在不同浓度的潮霉素的选择培养基中具有不同的产率，而当培养基中存在MSX时，差异不明显。
首先，在阶段I中，分离了非常稳定的GS-CHOK1V细胞系11A7，其能稳定达220代。通过阶段III中的RMCE所产生的衍生细胞系可以继承这种稳定性特征。因此，在2种不同条件下的扩展稳定性研究中评估阶段III的第1轮的3个细胞群(表4)。
Figure BDA0000640040910000281
表4：第1轮：将3个所选的细胞系在摇瓶中扩增，并在两个不同的条件(+潮霉素/+MSX(+/+)或-MSX/+潮霉素(-/+))下持续培养。在不同的时间点， 将两种条件下所有3个SSI细胞系的连续培养物设置一式两份的补料分批摇瓶培养物，并在14天之后测定培养基中Myo mAb的浓度。
无论条件如何，所有3个所测试的群体都符合稳定细胞系的标准。此外，共计12个克隆细胞系，各6个分别来自第2轮和第3轮，在同类型的稳定性研究中(分别为表5和6)。发现所有12个克隆细胞系在选择下都保留了稳定性特征。有趣的是，来自第3轮的6个克隆细胞系(表4)是稳定的，即使不存在任何的选择试剂。这对生物药品的生产具有深远的影响。
Figure BDA0000640040910000301
Figure BDA0000640040910000311
在“热点”侧翼的基因组序列的表征
3'侧翼序列
500bp的3'侧翼序列(SEQ ID No.7)序列，其来源于bla R的Seegene DNA步移(图3)，其用于比对搜索(blast-search)CHO-K1基因组测序项目的重叠群(Xu X等人2011,Nature Biotechnol.29:735-742)，在NCBI数据库可公开获得。在1760466-1760965的负链上发现一个位于未入选的(unplaced)基因组骨架(骨架1492(登录号，JH000254.1，与NW_003613833.1相同))上的独特区域。基于10E9读取对骨架1492的高覆盖映射，将500bp序列(SEQ ID No.7)扩展至2000bp(SEQ ID No.8)(数据未显示)。
由Seegene DNA步移(见方法)鉴定的3'侧翼序列用于比对搜索CHO-K1基因组测序项目的重叠群(Xu X等人2011,Nature Biotechnol.29:735-742)，在NCBI数据库可公开获得。通过使用从10E9SSI宿主细胞系获得的这一数据和Illumina HiSeq基因组序列数据，发现了一个位于未入选的基因组骨架(骨架1492(登录号，JH000254.1，与NW_003613833.1相同))上的独特区域。发现这个区域位于预测的负链上的骨架1492上的Fer1L4(fer-1-样4)基因(NCBI基因ID：100755848)中(骨架1492核苷酸数1,746,191至1,781,992；总计35,802个核苷酸)。5'侧翼序列似乎位于外显子39和40之间，而3'侧翼序列似乎位于外显子28和29之间(见图7)。
5'侧翼序列
将来自10E9基因组DNA的Illumina读取使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)映射到pRY17(SEQ ID No.1)。通过映射检查，发现多个未配对读取(图8中的黑色箭头)映射到cB72.3HC的3'部分的5'末端。这一分析表明cB72.3HC(从5'末端删除214bp)的至少一个片段保留在10E9“热点”上。Northern印迹分析(数据未显示)表明，在10E9细胞中没有cB72.3LC或HC mRNA，这表明cB72.3中截短的HC是无功能的。然后将等同的配对读取用于比对搜索CHO-K1基因组测序项目的重叠群(Xu X等人2011,Nature Biotechnol.29:735-742)。它们全部都定位(aligned)于未入选的基因组骨架(骨架1492(登录号，JH000254.1，与NW_003613833.1相同))的相同位置(1750048-1750183)。这使得5'侧翼序列扩展至最大822bp(SEQ ID No.9)。
实施例2：
A)材料和方法
1.Southern印迹
将5-10μg分离自每个克隆的第2和4代且用QIAGEN(Qiagen)的Blood& CellCulture DNA Maxi试剂盒纯化的基因组DNA在37℃下用限制性内切酶消化15h。将消化的DNA用等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合物(pH 8.0，1:1v/v)提取2次，随后，在单独的氯仿和乙醇沉淀之后，在0.5×TBE(50×TBE：Lonza)或1×TAE(40mM Tris，pH 7.7，2.5mM EDTA)缓冲液中的0.7％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳。基本上根据制造商的说明书(Appligene，Pharmacia)，用真空歧管将凝胶转移到Hybond-N膜(Amersham)上。用UV固定Hybond-N膜，将其在含有制备自50×储备液(Sigma)的5×Denhardt氏、6×SSC(1×SSC：0.15M的氯化钠、15mM的柠檬酸钠)和10％(w/v)SDS的杂交缓冲液中或在单独的Rapid-hyb缓冲液(GEhealthcare)中预杂交。
使用以下引物组在PCR中生成TK探针：
TK-正向：5'-AGATCACCATGGGCATGCCTTAC-3'(SEQ ID No.10)；
TK-反向：5'AACACGTTGTACAGGTCGCCGTT-3'(SEQ ID No.11)；
使用载体pRY37作为模板用于探针生成的PCR，循环条件为：15ng模板/50μl反应；Taq DNA聚合酶(Roche)；94℃2min，30个循环的94℃30s、55℃1min和72℃30s，72℃7min进行最后的延伸。使用Megaprime试剂盒用[γ-32P]dCTP(111TBq/mmol，Perkin Elmer)标记25ng的PCR产物并在切口翻译(nick-translation)柱(Amersham)上纯化。在65℃在同样的预杂交缓冲液中进行杂交2-20h。杂交之后，将膜于65℃洗涤达到0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS的最终严谨度。将印迹暴露于存储荧光屏(Bio-Rad)上；使用Personal Molecular Imager(PMI)System(Bio-Rad)对所暴露的屏进行成像。
2.映射和比对
FASTQ格式的配对的末端读取是用于映射到基因组模板上的输入项。载体序列和CHOK1SV组件(assembly)被编入索引作为被映射的模板。使用Bowtie2(Langmead B,&Salzberg SL,2012,Nature methods,9(4),357-9)用用于非常快局部比对的默认参数(-D5-R 1-N 0-L 25-i S,1,2.00)将配对的末端读取与模板比对。为了比较不同的样品，覆盖按<原始覆盖>*500M/<读取的 数>进行标准化。
3.整合位点的鉴定
使用Illumina Hi-Seq 2000以40X的平均覆盖对10E9SSI宿主株的2×100的配对的末端读取进行测序。将序列读取映射到载体pRY17上，其是整合到CHOK1SV基因组中的第一载体。覆盖整合位点的读取被称为嵌合读取，这是因为它们含有映射到CHOK1SV基因组和整合的载体序列的序列。由于通过局部比对进行映射，嵌合读取具有的特征为：针对载体序列的部分匹配具有能映射到基因组序列上的突出端(overhang)尾。除了嵌合读取，还存在其它的读取，其中配对的读取的一端完全映射到载体序列且另一端映射到基因组序列上。这些读取对被称为不一致读取对。收集来自不一致读取对的突出端尾序列和未映射读取，并用于搜索CHOK1SV基因组装配，其使用比对(blast)以基于序列相似性来鉴定整合位点的侧翼序列。
4.支持面(landing pad)
支持面(引入到热点的外源序列，其含有利用RMCE整合目标基因的表达盒的重组位点)的结构基于10E9细胞系的Southern印迹分析和全基因组重测序(WGRS)分析数据(图9)。10E9来源的读取通过使用与用于映射整合位点的算法相同的算法映射到载体序列。嵌合读取也在复制、缺失或插入位点中观察到。假想的支持面序列的更正基于出现嵌合读取的位点的仔细研究而进行。
5.RNA-seq分析的定量
通过使用来源于全基因组重测序的支持面的“单拷贝”模型构建用于映射读取的模板(见上)。通过使用默认参数的BWA将RNA-seq测序读取映射到模板上。LC和HC上的读取计数归一化至RPKM测量，每千碱基转录组每百万映射的读取的读取，按下式：
Figure BDA0000640040910000341
使用bedtool(Quinlan AR和Hall IM,2010,Bioinformatics.26,6,pp.841–842)获得每个间隔的与外显子重叠的读取的数量，按下述命令，bedtools 覆盖–abam<bam文件>-b<在bed中的间隔>(bedtools coverage-abam<bam file>-b<intervals in bed>)。
B)结果
10E9SSI宿主细胞中支持面的结构
从使用空靶向载体pRY37从11A7创建细胞系10E9的过程中发生的预期的RMCE事件推测出Fer1L4热点中的支持面的结构的模型(图4)。此模型被称为“单拷贝”模型，并且与来自细胞系10E9的WGRS数据(图9A)相一致。然而，Southern印迹数据表明，此模型实际上应该包含双拷贝(图9B)。在数据的基础上改进这一“双拷贝”模型并将其用于帮助解释在10E9宿主中的来源于RMCE的mAb生成细胞系。“双拷贝”模型可以解释为什么单或双拷贝的抗体转录单元可以通过用靶向载体pRY21进行的RMCE并入到支持面上。
RMCE来源的细胞系中的侧翼序列
通过使用先前所述的方法，利用RMCE(使用靶向载体pRY21)创建4个10E9来源的表达抗筒箭毒碱单克隆抗体(Myo)的重组细胞系，并确定各自的5'和3'侧翼序列。在RMCE的过程中，发生一致的(consistent)基因组重排，生成衍生细胞系中的新3'侧翼序列(图10)。RMCE来源的细胞系的5'侧翼序列与10E9的相同，具有在核苷酸1750049上的整合位点(在未入选的CHO-K1骨架1492骨架(登录号JH000254.1，与NW_003613833.1相同)。然而，此时3'侧翼序列是不同：尽管10E9SSI宿主细胞系中的3'整合位点是在核苷酸1760965，在所有的RMCE衍生细胞系中，现在发现是在核苷酸1435427(在前述的骨架上，图10)。
在RMCE生成的细胞系中的整合盒的拷贝数的评估
将其各自基因组的测序读取映射到单拷贝整合到热点的模型中。Myo拷贝的数量来源于LC和HC区域的中值平均覆盖。这四个细胞系的平均覆盖分别是LC区域上的41、34、18、27，HC区域上的32、27、14、19。覆盖数据表明，对于高产者而言，可能存在至少一个或多个拷贝的HC和LC(表7)。覆盖数据以图形的方式示于图11。
Figure BDA0000640040910000351
Figure BDA0000640040910000361
表7：Myo生成RMCE细胞系的序列读取覆盖和具体产率(qP)。拷贝数示于覆盖值旁边的括号内。
基于该观察，生成了RMCE后的基因座的新模型，其中包括Myo的额外的拷贝。这是通过插入另一个拷贝的从第一wFRT位点的开始横跨至第二wFRT位点的开始(其在图11中均由星号表示)且正好在第二wFRT位点之前的片段而实现的。通过使用这种“双拷贝”模型，可以完全解释，当读取重映射到细胞系上时，在具有高qP的细胞系中所观察到的读取的数量。
从各个细胞系的RNA-Seq数据获得了高qP的Myo生成细胞系的“双拷贝”模型的进一步证据。通过使用采用默认参数运行的BWA(Li H.和Durbin R.2009,Bioinformatics,25:1754-60)，将来源自各个Myo细胞系的RNA的RNA-Seq的测序读取映射到一个初始的“单拷贝”模型(图12)。Myo拷贝的数量通过计算LC和HC区域的RPKM值(Mortazavi等人,(2008),Nature Methods 5,621-628)获得。此RPKM值分别在LC区域中是43135、40059、23204、29334，在HC区域中是38572、32384、17878、20751。这些数据也印证了所提出的用于来源于全基因组测序的高产者的“双拷贝”模型。
Figure IDA0000640041000000011
Figure IDA0000640041000000021
Figure IDA0000640041000000031
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Claims (27)

1.一种包含内源Fer1L4基因的位点特异性整合(SSI)宿主细胞，其中外源核苷酸序列被整合在所述Fer1L4基因中，并且其中所述外源核苷酸序列包括至少2个重组靶位点序列。
2.根据权利要求1所述的SSI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含编码目标序列的基因。
3.根据权利要求2所述的SSI宿主细胞，其中所述至少2个重组靶位点位于编码目标序列的基因的侧翼。
4.根据权利要求2所述的SSI宿主细胞，其中所述编码目标序列的基因包含一个或多个编码选择标记物、可检测的蛋白、抗体、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因。
5.根据权利要求3所述的SSI宿主细胞，其中所述编码目标序列的基因包含一个或多个编码选择标记物、可检测的蛋白、抗体、肽抗原、酶、激素、生长因子、受体、融合蛋白或其它生物活性蛋白的基因。
6.根据权利要求1所述的SSI宿主细胞，其中所述重组靶位点是FRT位点或lox位点。
7.根据权利要求4所述的SSI宿主细胞，其中所述选择标记物是GS选择标记物、潮霉素选择标记物、嘌呤霉素选择标记物或胸苷激酶选择标记物。
8.根据权利要求1到7任一项所述的SSI宿主细胞，其中所述宿主细胞是小鼠细胞、人类细胞或CHO宿主细胞、CHOK1宿主细胞或CHOK1SV宿主细胞。
9.根据权利要求1到7任一项所述的SSI宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞，并且其中外源核苷酸序列的3′端侧翼序列为如SEQ ID No.7、8给出的核苷酸序列的至少之一，且其5′端侧翼序列为如SEQ ID No.9给出的核苷酸序列。
10.根据权利要求1到7任一项所述的SSI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列替换了Fer1L4基因的一部分。
11.根据权利要求6所述的SSI宿主细胞，其中所述宿主细胞包含FRT位点，其是野生型FRT位点或突变型FRT位点。
12.根据权利要求1所述的SSI宿主细胞，其中所述重组靶位点包含至少一个野生型FRT位点和至少一个突变型FRT位点。
13.一种用于生产SSI宿主细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供一种包含内源Fer1L4基因的细胞，其中外源核苷酸序列被整合进所述Fer1L4基因，并且其中所述外源核苷酸序列包含至少两个重组靶位点，重组靶位点位于至少一个编码目标序列的第一基因的侧翼；然后
b)用包含第一可交换盒的载体转染步骤a)中所提供的细胞，所述盒包含至少两个匹配的重组靶位点，其位于至少一个编码目标序列，即选择标记物基因的第二基因的侧翼，然后
c)产生定点重组介导的盒式交换，并且然后
d)选择表达编码目标序列，即选择标记物基因的第二基因的转染的细胞，从而获得包含稳定整合在宿主细胞基因组中的第一可交换盒的所述SSI宿主细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括：i)用包含至少一个第二可交换盒的载体转染SSI宿主细胞，该盒包含至少两个位于至少一个编码目标序列的第三基因的侧翼的匹配的重组靶位点和至少一个选择标记物，ii)产生定点重组介导的盒式交换，以获得包含编码目标序列的第三基因的SSI宿主细胞，iii)使获得自步骤ii)的SSI宿主细胞表达编码目标序列的第三基因，和iv)回收编码目标序列的第三基因的产物。
15.一种分离的多核苷酸分子的组合用于制备显示增强的表达的CHO细胞系的用途，其中分离的多核苷酸分子的组合是如SEQ ID No.7所给出的核苷酸序列与如SEQ ID No.9所给出的核苷酸序列的组合或如SEQ ID No.8所给出的核苷酸序列与如SEQ ID No.9所给出的核苷酸序列的组合。
16.根据权利要求15所述的用途，其中多核苷酸包含于载体中。
17.一种宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞并包含a)分离的多核苷酸分子的组合，其中所述分离的核苷酸分子的组合是如SEQ ID No.7所给出的核苷酸序列与如SEQ IDNo.9所给出的核苷酸序列的组合或如SEQ ID No.8所给出的核苷酸序列与如SEQ ID No.9所给出的核苷酸序列的组合，或b)含有所述分离的核苷酸分子的组合的载体，或c)含有所述分离的核苷酸分子的组合和位于所述分离的核苷酸分子的组合物内或邻近于所述分离的核苷酸分子的组合的编码目标序列的外源基因的载体。
18.一种生产细胞或细胞系的方法，其中Fer1L4核苷酸序列被整合在包含至少一个编码目标序列的基因的载体中，其中，随后将所述载体稳定地转染到细胞或细胞系中，并且其中，随后选择并获得稳定转染的细胞或细胞系。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞或细胞系是具有高生产率稳定性的高产细胞或细胞系。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞或细胞系是CHO细胞或CHO细胞系且其中所述Fer1L4核苷酸序列是选自如SEQ ID No.7、8、9所给出的核苷酸序列的核苷酸序列。
21.一种生产编码目标序列的基因的产物的方法，其包括在合适的培养基中培养按权利要求13或18所述的方法制备的宿主细胞或细胞系，并从其中回收产物。
22.一种制备SSI宿主细胞的方法，所述方法包含将外源核苷酸引入到细胞内的内源Fer1L4基因中，其中外源核苷酸序列包括至少一个编码目标序列的基因和/或至少两个重组靶位点。
23.根据权利要求22所述的方法，其中通过同源重组利用多核苷酸在Fer1L4基因中引入所述外源核苷酸序列，其中所述多核苷酸包含：
a)与Fer1L4基因的第一部分同源的第一核苷酸序列，
b)外源核苷酸序列，和
c)与Fer1L4基因的第二部分同源的第二核苷酸序列。
24.根据权利要求22所述的方法，其中通过使用病毒载体或外源核酸酶促进外源核苷酸序列的引入。
25.根据权利要求24所述的方法，其中病毒载体是介导同源重组的腺相关病毒载体。
26.根据权利要求24所述的方法，其中外源核酸酶是锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶。
27.根据权利要求24所述的方法，其中外源核酸酶是工程化的大范围核酸酶。
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