ES2629509T3 - Integración específica de sitio - Google Patents

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Abstract

Una célula hospedadora para integración específica de sitio (IES) que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, en donde una secuencia nucleotídica exógena está integrada en dicho gen de Fer1L4 y en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos dos sitios diana de recombinación.

Description

Integración específica de sitio
La presente descripción hace referencia a células hospedadoras estables de gran producción para integración específica de sitio (IES), p. ej., células hospedadoras derivadas de ovario de hámster chino (CHO), métodos para producirlas y para utilizarlas.
El creciente número de candidatos biológicos biofarmacéuticos en desarrollo ha impulsado la necesidad de desarrollar tecnologías de alto rendimiento rápidas y potentes para el desarrollo de líneas celulares porque la generación de líneas celulares comerciales mediante el uso de los métodos convencionales es un proceso lento, laborioso y repetitivo. Durante la construcción y la selección de líneas celulares productoras de anticuerpos, se obtienen líneas celulares con un gran abanico de perfiles de expresión, crecimiento y estabilidad. Estas variaciones pueden surgir debido a la plasticidad inherente del genoma de los mamíferos. Pueden surgir también por la naturaleza estocástica de las redes de regulación génica o por la variación en la cantidad de proteína recombinante producida como resultado de la integración al azar de un transgén en un genoma, principalmente debido al «efecto de la irregularidad posicional».
Como consecuencia de estas variaciones y la baja frecuencia (1 de 10.000) de la integración genómica, se necesita más dedicación, lo que resulta lento y consume muchos recursos, para el cribado de muchos transfectantes en el conjunto de estos acontecimientos infrecuentes para aislar una línea celular productora que sea compatible con su producción comercial (p. ej., una combinación de buen crecimiento, alta productividad y estabilidad de la producción, con un perfil del producto deseado). Esta situación se puede mejorar si se enriquecen en líneas celulares que sean grandes productoras mediante un sistema de selección muy riguroso, tal como el sistema de expresión génica basado en la GS (glutamina sintasa). Por ejemplo, en un estudio reciente, >30% de un conjunto seleccionado al azar de líneas celulares GS-CHOK1SV (GS Gene Expression SystemTM, Lonza) productoras de 175 Acm (anticuerpos monoclonales) produjeron ≥ 1 g/l de Acm en un proceso con matraces en agitación por lote alimentado. Las CHOCK1SV expresan de forma endógena la enzima GS, por lo que se pueden obtener transfectantes positivos con el empleo de medios sin glutamina y la selección con la sulfoximina de metionina (MSX). A pesar de la eficacia de tales sistemas de selección, sigue siendo necesario un programa de cribado riguroso y laborioso. Así pues, la construcción para fabricar líneas celulares es un proceso largo y laborioso. No solo hay que seleccionar estas líneas celulares por las características positivas de crecimiento y productividad, también hay que clonarlas y necesitan esencialmente producir el producto de la calidad correcta durante todo el proceso de fabricación. Además, para que un proceso sea rentable, las líneas celulares generadas tienen que mostrar una productividad constante a lo largo de muchas generaciones celulares. Lo que sería deseable es proporcionar líneas celulares de gran producción con características de crecimiento positivas con un mínimo de actividad de cribado cada vez que hay que expresar una nueva proteína de interés, p. ej., un nuevo anticuerpo monoclonal.
El problema técnico que subyace a la presente invención es la solución de las desventajas identificadas más arriba, en particular, proporcionar, preferiblemente de una manera eficaz y sencilla, líneas celulares de gran producción de gran estabilidad y con características positivas de crecimiento y productividad, en particular, líneas celulares que proporcionan una productividad constante a lo largo de un largo periodo de cultivo y producción.
La presente invención soluciona su problema técnico subyacente al dar a conocer las enseñanzas de acuerdo con las reivindicaciones independientes.
En particular, la presente invención soluciona su problema técnico por medio de dar a conocer una célula hospedadora para la integración específica de sitio (IES) que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, en donde una secuencia nucleotídica exógena está integrada en dicho gen de Fer1L4, y en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos dos sitios diana de recombinación. En algunas realizaciones, la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos una secuencia génica codificante de interés. En algunas realizaciones, los sitios diana de recombinación flanquean al menos una secuencia génica codificante de interés. En otras realizaciones, los sitios diana de recombinación son adyacentes a al menos una secuencia génica codificante de interés, en lugar de flanquearla. En algunas realizaciones, la secuencia génica codificante de interés comprende al menos un gen marcador de selección.
En una realización preferida, la presente invención prevé que las secuencias nucleotídicas exógenas integradas en el gen de Fer1L4 endógeno son dos sitios diana de recombinación que flanquean la al menos una secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el al menos un gen marcador de selección, lo que significa que un primer sitio diana de recombinación está localizado por delante del 5' y que un segundo sitio diana de recombinación está localizado después del 3' en al menos una secuencia génica codificante de interés, preferiblemente en al menos un gen marcador de selección.
Preferiblemente, la secuencia génica codificante de interés podría ser una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de interés, p. ej., un anticuerpo, un antígeno, una enzima, una proteína detectable, p. ej., una proteína fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde, una hormona, un factor de crecimiento, un receptor, una proteína de fusión, o una proteína con función selectiva. Dicha secuencia de nucleótidos podría estar funcionalmente
unida a al menos un elemento regulador, tal como un promotor. Preferiblemente, la secuencia génica codificante de interés es un gen marcador de selección.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a la célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, en donde el sitio diana de recombinación es un sitio FRT (diana de reconocimiento de FLP). En una realización preferida de la invención, el sitio FRT es un sitio FRT de tipo silvestre, a saber, el sitio F.
En otra realización preferida de la presente invención, el sitio FRT es un sitio FRT mutante, preferiblemente el sitio F5, preferiblemente tal como está descrito en Schlacke y Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12752.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, la secuencia génica codificante de interés, p. ej., el gen marcador de selección, está flanqueada en su extremo 5' por el sitio FRT de tipo silvestre y en su extremo 3' por un sitio FRT mutante.
En el contexto de la presente invención, la terminología «sitios diana de recombinación que flanquean la al menos una secuencia génica codificante de interés» significa que los sitios diana de recombinación están localizados en 5' y en 3' con respecto a dicha secuencia génica codificante de interés, esto significa que un sitio diana está localizado en 5' y el otro sitio diana está localizado en 3' de la secuencia génica codificante de interés. Los sitios diana de recombinación podrían estar localizados directamente adyacentes o a una distancia definida de la secuencia génica codificante de interés.
Las secuencias flanqueantes, en particular los sitios diana de recombinación flanqueantes, están posicionados en una dirección directa o inversa, preferiblemente ambas están en la orientación directa o preferiblemente ambas están en la orientación inversa.
Además, en una realización preferida de la presente invención, el sitio diana recombinante es un sitio lox.
En el caso de que el sitio diana de recombinación sea un sitio FRT, las células hospedadoras necesitan la presencia y la expresión de FLP (la recombinasa FLP) para que tenga lugar un entrecruzamiento o una recombinación. En el caso de que el sitio diana de recombinación sea un sitio lox, la célula hospedadora necesita la presencia y la expresión de la recombinasa Cre.
Se puede conseguir tanto la presencia como la expresión de la recombinasa FLP o Cre, por ejemplo, mediante la introducción de secuencias nucleotídicas exógenas que codifican la recombinasa FLP o Cre en una célula hospedadora cuyas secuencias de nucleótidos son capaces de expresarse en dicha célula hospedadora.
Así pues, la presente invención da a conocer una célula hospedadora, preferiblemente una línea celular hospedadora, que incorpora una secuencia nucleotídica exógena, que son al menos dos sitios diana de recombinación, en particular sitios FRT, y opcionalmente al menos una secuencia génica codificante de interés, en un «punto caliente» definido previamente, a saber un gen de Fer1L4, que mantiene la combinación positiva de crecimiento, productividad y estabilidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la expresión de una secuencia génica codificante de interés en una célula hospedadora para IES dada a conocer en la presente memoria es estable a lo largo de al menos 70, 100, 150, 200 o 300 generaciones. La expresión es «estable» si disminuye menos del 30%, o se mantiene al mismo nivel, o su nivel se incrementa con el tiempo. En algunas realizaciones, la expresión es estable si la productividad volumétrica disminuye menos del 30%, o se mantiene al mismo nivel, o se incrementa con el tiempo. En algunas realizaciones, una célula hospedadora para IES dada a conocer en la presente memoria produce al menos 1,5 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l o 5 g/l de un producto de expresión de una secuencia génica codificante de interés. En algunas realizaciones, las células para IES dadas a conocer en la presente memoria, en particular las líneas celulares, son tan estables que se pueden mantener en el cultivo sin ninguna selección, con lo que las presentes líneas celulares tienen la capacidad de resultar más aceptables para las agencias de control. En términos de rentabilidad, la presente invención permite el desarrollo rápido de líneas celulares con un uso tan eficaz de los recursos que hay que cribar menos líneas celulares en diferentes etapas del proceso debido al funcionamiento muy predecible de las presentes líneas celulares. Así pues, se pueden desarrollar más candidatos biofarmacéuticos, p. ej., anticuerpos monoclonales (Acm) candidatos, contra una diana dada o más candidatos contra varias dianas en comparación con el proceso estándar. En última instancia, esto podría conducir al beneficio del paciente como resultado de un acortamiento del tiempo que tardan en aplicarse en la clínica las proteínas de interés, preferiblemente los Acm terapéuticos.
En el contexto de la presente invención, el término «punto caliente» significa una posición, esto es, un sitio, en el genoma de una célula hospedadora que garantiza una producción estable y en gran cantidad, preferiblemente activa desde el punto de vista transcripcional, de un producto, a saber, una proteína de una secuencia génica codificante de interés, en particular, garantiza una producción fuerte y estable de la proteína codificada por la secuencia génica codificante de interés, preferiblemente en donde la secuencia génica codificante de interés está integrada en dicha posición después de su transfección en la célula hospedadora.
En el contexto de la presente invención, el término «sitio» hace referencia a una secuencia de nucleótidos, en particular a un tramo definido de nucleótidos, a saber, una longitud definida de una secuencia de nucleótidos, preferiblemente un tramo definido de nucleótidos que forman parte de un tramo de nucleótidos más grande de
nucleótidos. En algunas realizaciones, un sitio, p. ej., un sitio que es un «punto caliente», es parte de un genoma. En algunas realizaciones, se introduce un sitio en un genoma, p. ej., un sitio diana de recombinación. Un «sitio diana de recombinación» es un tramo de nucleótidos que son necesarios y que permiten, en presencia de una recombinasa, una recombinación específica de sitio y definir la localización de tal recombinación.
En el contexto de la presente invención, el término «célula hospedadora», que de aquí en adelante también se denominará «célula contenedora», hace referencia a una célula que alberga una secuencia nucleotídica exógena, preferiblemente integrada de manera estable, en su genoma.
En el contexto de la presente invención, una «célula» es preferiblemente una célula de mamífero, en particular una célula de roedor, preferiblemente una célula de ratón, una célula de hámster, preferiblemente una célula de hámster chino, preferiblemente una célula de ovario de hámster chino (CHO), preferiblemente una célula CHOK1, preferiblemente una célula CHOK1SV. Preferiblemente, la célula es una célula de humano. Preferiblemente, la célula es una célula que no es de humano.
En el contexto de la presente invención, el término «célula» significa preferiblemente célula de una línea celular. Preferiblemente, el término «línea celular» hace referencia a líneas celulares inmortalizadas consolidadas.
El término «célula» en una realización también significa una célula primaria.
En el contexto de la presente invención, el término «célula hospedadora para la integración específica de sitio (IES)» significa una célula hospedadora que comprende secuencias nucleotídicas exógenas. En algunas realizaciones, las secuencias nucleotídicas exógenas incluyen sitios diana de recombinación, que permiten la integración específica de sitio de las secuencias nucleotídicas exógenas, con lo que se permite que las secuencias nucleotídicas deseadas se integren directamente en un sitio concreto determinado con anterioridad en un lugar deseado del genoma de la célula hospedadora. Así pues, en algunas realizaciones, una célula hospedadora para la integración específica de sitio es capaz de llevar a cabo la integración dirigida de las secuencias génicas codificantes de interés. Más preferiblemente, una célula hospedadora para la integración específica de sitio es capaz de llevar a cabo la integración dirigida de una secuencia génica codificante de interés mediante el intercambio de casete mediado por recombinación (ICMR). Preferiblemente, tal proceso introduce solo una copia funcional de una secuencia génica codificante, preferiblemente solo una copia de una secuencia génica codificante de interés en un locus predeterminado. Preferiblemente, el proceso no cointroduce secuencias de vectores, p. ej., secuencias de vectores procariotas, en la célula hospedadora.
En otra realización preferida, se introducen dos copias funcionales de una secuencia génica codificante de interés en la célula hospedadora para IES.
En el contexto de la presente invención, la terminología «gen marcador de selección» hace referencia a una secuencia de nucleótidos, en particular una secuencia génica codificante, esto es, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, de aquí en adelante también se denominará región, bajo el control regulador y funcional de al menos un elemento regulador, en particular un promotor, en donde dicha región codificante de proteína codifica una proteína que permite la selección de células hospedadoras que expresan dicha proteína.
En el contexto de la presente invención, el término FRT significa diana de reconocimiento de FLP. La FRT es una secuencia de nucleótidos de 34 pares de bases de longitud que posibilita una tecnología de recombinación específica de sitio que permite la manipulación del ADN de un organismo en condiciones controladas in vivo. A la FRT se le fija la recombinasa FLP (FLP) que posteriormente escinde dicha secuencia y permite la recombinación de las secuencias de nucleótidos integradas entre dos sitios FRT. Para el ICMR, se necesitan dos entrecruzamientos mediados por dos secuencias flanqueantes que sean diana de la recombinasa; una en el extremo 5' y la otra en el extremo en 3' del casete a intercambiar. Se puede producir un entrecruzamiento entre dos sitios FRT idénticos. El uso de los sitios FRT también requiere la expresión y la presencia de la recombinasa FLP. El sistema completo, en la presente memoria también denominado «FRT/FLP», se describe en Seibler y Bode, Biochemistry 36 (1997), páginas 1740 a 1747, y en Seibler et al., Biochemistry 37 (1998), páginas 6229 a 6234.
En el contexto de la presente invención, un gen de Fer1L4 es el gen de tipo silvestre de Fer1L4, todas sus isoformas y todos sus homólogos, en particular siempre y cuando los homólogos tengan una homología de secuencia de al menos el 40, al menos el 50, al menos el 60, al menos el 70, al menos el 80, al menos el 90, al menos el 95, al menos el 96, al menos el 97, al menos el 98, al menos el 99 o al menos el 99,5%, con el gen de Fer1L4 de tipo silvestre, preferiblemente a lo largo toda la longitud del gen de tipo silvestre de Fer1L4, preferiblemente el gen de Fer1L4 de tipo silvestre de hámster, preferiblemente que tiene las coordenadas 1176191 a 1781992 del número de acceso del NCBI NW_003613833 o JH000254.1, preferiblemente el gen de Fer1L4 de tipo silvestre de CHO o una forma acortada del mismo.
Lo más preferiblemente, el gen de Fer1L4 de tipo silvestre presente en las presentes células hospedadoras para IES se caracteriza primero por tener el sitio de integración en 5' de la secuencia flanqueante localizada en 5' localizado entre el exón 39 y 40, y segundo, por tener el sitio de integración en 3' de la secuencia flanqueante localizada en 3' localizado entre el exón 28 y el 29. Así pues, en una realización preferida, la integración de las secuencias exógenas implica partes del gen de Fer1L4 endógeno, preferiblemente la región que abarca e incluye los exones 28 a 40. En
algunas realizaciones, al menos una porción del gen de Fer1L4 está delecionada en una célula hospedadora para IES.
En la presente invención, «homólogos» o «secuencias homólogas» son secuencias de nucleótidos que tienen la homología de secuencia identificada más arriba con la secuencia comparativa dada específicamente, p. ej., con el gen de Fer1L4 de CHO de tipo silvestre o partes del mismo, p. ej., las SEQ ID n.os 7, 8 o 9.
En el contexto de la presente invención, el término «homología de secuencias» hace referencia a una medición del grado de identidad o similitud de dos secuencias basándose en un alineamiento de las secuencias que eleva al máximo la similitud entre los nucleótidos alineados, y que está en función del número de nucleótidos idénticos, el número de nucleótidos totales, y la presencia y longitud de huecos en el alineamiento de las secuencias. Están disponibles una gran variedad de algoritmos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencias mediante el uso de parámetros estándares. Preferiblemente, la homología de secuencias se mide con el programa BLASTn para las secuencias de ácidos nucleicos, que está disponible en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (www.ncbi.nlm.nih.gov/) y que se describe en, por ejemplo, Altschul et al. (1990), J Mol. Biol. 215: 403410; Gish y States (1993), Nature Genet. 3: 266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402); Zhang et al (2000) J. Comput. Biol. 7 (1-2): 203-14. Preferiblemente, la homología de secuencia de dos secuencias de nucleótidos es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de la palabra = 11; penalización por apertura de huecos = –5; penalización por extensión de huecos = –2; recompensa por concordancia = 1; y penalización por discordancia = –3.
Así pues, el gen de Fer1L4 podría ser el propio gen de Fer1L4 de CHO o podría también ser, p. ej., un gen de Fer1L4 de humano, por ejemplo, disferlina (Fer1L1), otoferlina (Fer1L2), mioferlina (Fer1L3), Fer1L4, Fer1L5 o Fer1L6.
Preferiblemente, el presente gen de Fer1L4 podría también ser el gen de Fer1 de C. elegans (ID del gen en el NCBI: 172659, WormBase: WBGene00001414) o cualquier otro miembro de la familia de las ferlinas de la cual hay seis miembros en las células de mamíferos. Las ferlinas facilitan la fusión vascular, específicamente las fusiones de membranas. El Fer1 de C. elegans es necesario para la fusión de los orgánulos a la membrana plasmática y la reproducción normal de los gusanos (Achanzar, W. E. y Ward, S., J. Cell. Sci. 110 (1997), 1073-108; Washington, N.
L. y Ward, S., J. Cell Sci. 119 (2006), 2552-2562).
Junto con un anclaje en el extremo carboxilo, los miembros de la familia de las ferlinas de los mamíferos también contienen varios (6 o 7) dominios C2 (Sutton R. B. et al. Cell 80 (1995), 929-38; Shao et al. Science 273 (1996), 248251). Así pues, los genes que codifican los dominios C2 se consideran de aquí en adelante que también son homólogos al presente gen de Fer1L4 de tipo silvestre.
En el contexto de la presente invención, la terminología «gen exógeno» o «secuencia nucleotídica exógena» hace referencia a una secuencia de nucleótidos introducida en una célula hospedadora, p. ej., mediante los métodos convencionales de ingeniería genética, preferiblemente por medio de la transformación, electroporación o transfección, que anteriormente a dicha introducción no estaba presente en dicha célula hospedadora. Tales secuencias también se denominan «transgénicas».
La terminología «gen endógeno» o «secuencia nucleotídica endógena» hace referencia a una secuencia de nucleótidos que se origina en una célula hospedadora, y que está presente en la misma, y, por lo tanto, no se introduce en esta desde fuera de dicha célula hospedadora.
La terminología «secuencia nucleotídica» o «polinucleótido», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia preferiblemente a ácidos nucleicos, preferiblemente un ADN o ARN.
En una realización preferida de la presente invención, una secuencia génica codificante de interés flanqueada por los al menos dos sitios diana de recombinación es un gen marcador de selección o una secuencia génica codificante que codifica un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo monoclonal, un derivado de anticuerpo, una proteína de fusión, una enzima o una proteína biológicamente activa, p. ej., un factor del crecimiento o una hormona peptídica, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, una interleucina, un interferón, etc., en particular, una proteína funcional desde el punto de vista farmacéutico o alimenticio. Preferiblemente, la secuencia génica codificante de interés es exógena a la célula hospedadora.
En otras realizaciones más preferidas, la secuencia génica codificante de interés podría también ser una parte de un gen definido desde el punto de vista estructural o funcional, por ejemplo, un fragmento de un anticuerpo, tal como una cadena pesada o ligera del mismo, o una parte de una proteína funcional. En algunas realizaciones, una secuencia génica codificante de interés podría codificar un producto de expresión que comprende una parte de un polipéptido definido desde el punto de vista estructural o funcional, p. ej., un dominio discreto, conjunto de dominios,
o una porción de un dominio, tal como una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una región constante de un anticuerpo.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a la célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, en donde el marcador de selección es el marcador de selección basado en la GS, el marcador
de selección para higromicina, el marcador de selección para puromicina o el marcador de selección basado en la timidina cinasa.
En el contexto de la presente invención, el marcador de selección basado en la GS, codificado por un gen marcador de GS, opera en un sistema de marcadores de la GS. Por consiguiente, en ausencia de glutamina en el medio de crecimiento, la actividad de la glutamina sintetasa (GS) es esencial para la supervivencia de las células de los mamíferos en cultivo. Algunas líneas celulares de mamíferos, tales como las líneas de mieloma de ratón, no expresan suficiente GS para sobrevivir sin añadirles glutamina. Con estas líneas celulares, un gen marcador de GS transfectado puede funcionar como un marcador de selección al permitir el crecimiento en un medio sin glutamina. Otras líneas celulares, tales como las líneas de células de ovario de hámster chino, expresan suficiente GS para sobrevivir sin glutamina exógena. En estos casos, se puede usar el inhibidor de la GS, la sulfoximina de metionina (MSX), para inhibir la actividad de la GS endógena, de tal modo que sólo los transfectantes con una actividad GS adicional pueden sobrevivir.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a la célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, en donde la célula hospedadora es una célula hospedadora de CHO o una célula hospedadora CHOK1SV (Porter, A. J. et al., Biotechnol. Prog. 26 (2010), 1455-1464).
La presente invención también hace referencia en una realización preferida a las células hospedadoras para IES, en donde las secuencias exógenas están integradas en una localización que abarca desde la posición 1750049 (sitio de integración en 5') a la 1760965 (sitio de integración en 3') (véase la figura 7). Las secuencias flanqueantes están localizadas preferiblemente en las coordenadas 1750049 a 1750870 (extremo en 5', SEQ ID n.º 9, 822 pb) y 1758964 a 1760965 (extremo en 3', SEQ ID n.os 7 y 8, 2.000 pb) del scaffold (véase la figura 7).
La presente invención hace referencia en una realización preferida a la célula hospedadora para IES de la presente invención, en donde las secuencias de nucleótidos del gen de Fer1L4 que flanquean las secuencias nucleotídicas exógenas integradas, a saber, la al menos una secuencia génica codificante de interés que ella misma está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por un sitio diana de recombinación, cada una se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ n.º 9 y una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40%.
En una realización preferida de la presente invención, las secuencias flanqueantes que son homólogas a las secuencias dadas en las SEQ ID n.os 7, 8 o 9 tienen una homología de secuencia de al menos el 50, al menos el 60, al menos el 70, al menos el 80, al menos el 90, al menos el 95, al menos el 96, al menos el 97, al menos el 98, al menos el 99 o al menos el 99,5%, con estas regiones del gen de Fer1L4 de tipo silvestre, preferiblemente a lo largo de toda su longitud.
Así pues, en una realización particularmente preferida, la célula hospedadora para IES de la presente invención se caracteriza por la presencia de secuencias nucleotídicas exógenas, a saber, la al menos una secuencia génica codificante de interés, que ella misma está flanqueada en cada uno de los extremos 5' y 3' por un sitio diana de recombinación, y en donde al menos una de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID n.os 7 u 8 o una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40% está localizada en el extremo 3' de las secuencias nucleotídicas exógenas integradas en el genoma de la célula hospedadora.
Así pues, en una realización particularmente preferida, la célula hospedadora para IES de la presente invención se caracteriza por la presencia de secuencias nucleotídicas exógenas, a saber, la al menos una secuencia génica codificante de interés, que ella misma está flanqueada en cada uno de sus extremos 5' y 3' por un sitio diana de recombinación y en donde al menos una secuencia de nucleótidos como la que se ofrece en la SEQ ID n.º 9 o una secuencia homóloga de la misma con una homología de al menos el 40% está localizada en el extremo 5' de las secuencias nucleotídicas exógenas integradas en el genoma de la célula hospedadora.
Preferiblemente, la célula hospedadora para IES comprende la secuencia nucleotídica exógena, a saber, al menos una secuencia génica codificante de interés, la cual está flanqueada en cada uno de los extremos 5' y 3' por un sitio diana de recombinación, que está flanqueada en su extremo 3' por al menos una de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID n.os 7, 8 o una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40% y en su extremo 5' por una secuencia nucleotídica ofrecida en la SEQ ID n.º 9 o una secuencia homóloga de la misma con una homología de al menos el 40%.
En una realización particularmente preferida, las secuencias flanqueantes en 5'-y/o 3'-dadas de las SEQ ID n.os 7, 8, 9 o una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40% están localizadas directamente adyacentes y sin ninguna secuencia intermedia al extremo 5' o al extremo 3', o al extremo 5' y al extremo 3' del sitio
o de los sitios diana de recombinación integrados en el gen de Fer1L4.
En otra realización más preferida de la presente invención, se da a conocer el uso de una molécula nucleotídica aislada, preferiblemente un polinucleótido, que comprende una porción de un gen de Fer1L4, a saber, que comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40%, para producir las líneas celulares que muestran una expresión mejorada.
Se prefiere en particular el uso de una molécula nucleotídica aislada, preferiblemente un polinucleótido, que consiste en al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y una secuencia homóloga de las mismas con una homología de al menos el 40%, para producir la línea celular que muestra una expresión mejorada.
En otra realización preferida de la presente invención, se da a conocer el uso de tal polinucleótido aislado en un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende la molécula nucleotídica aislada de la presente invención, a saber, las SEQ ID n.os 7, 8, 9 u homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%, para producir una línea celular que muestra una expresión mejorada.
Además, se da a conocer una célula hospedadora transfectada, en donde la célula hospedadora comprende una molécula polinucleotídica que comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos como las que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%, o un vector que contiene dicha molécula polinucleotídica y una secuencia génica codificante exógena de interés dentro de la molécula polinucleotídica o adyacente a ella, o un vector que contiene dicho polinucleótido.
Las secuencias de ácido nucleico que definen el locus de Fer1L4, a saber, la secuencia de ácido nucleico del gen de Fer1L4, a saber, la secuencia de nucleótidos de Fer1L4, en particular las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas, se identificaron en la presente memoria de forma empírica mediante secuencias delante y detrás del sitio de integración de una construcción de ácido nucleico que comprende un casete de expresión de una línea celular que expresa una proteína indicadora a una concentración elevada. Estas secuencias de ácido nucleico de la invención dan a conocer secuencias con una nueva funcionalidad asociada a la expresión mejorada y estable de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia génica codificante de interés que parece funcionar de manera diferente de la descrita anteriormente para los elementos que actúan en cis, tales como promotores, potenciadores, regiones de control del locus, regiones de adhesión al armazón o regiones de adhesión a la matriz.
Las presentes secuencias de nucleótidos no parecen tener ningún marco de lectura abierto (ORF, por su nombre en inglés), lo que hace poco probable que codifiquen proteínas transactivadoras. Los experimentos de transfección demostraron que las presentes secuencias muestran algunas características de los elementos que actúan en cis. La presente actividad de secuencia no se detecta en los ensayos de transfección transitoria; las presentes secuencias también parecen ser diferentes de los elementos promotores y potenciadores, que se detectan con estos métodos.
La presente invención también hace referencia al uso de una secuencia de nucleótidos de Fer1L4, a saber, una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos como las que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%, en un vector, en concreto, un vector de expresión, en concreto un vector de expresión que no es para ICMR que comprende al menos una secuencia génica codificante de interés, en concreto para producir líneas celulares, preferiblemente en un proceso aleatorio, en concreto para producir líneas celulares que muestran una expresión mejorada, en concreto para producir líneas celulares de gran producción, preferiblemente con mayor frecuencia y que preferiblemente proporcionan una mayor estabilidad de la producción. Preferiblemente, tal uso prevé la transfección de células con las secuencias de nucleótidos de Fer1L4 identificadas más arriba, preferiblemente vectores que contienen dichas secuencias de nucleótidos, y obtener líneas celulares transfectadas de manera estable a partir de ellas.
Así pues, la presente invención también hace referencia a un método para producir células o líneas celulares, preferiblemente células o líneas celulares de gran producción con una estabilidad de productividad alta, en donde las secuencias de nucleótidos de Fer1L4, en particular las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%, integradas en un vector que comprende al menos un gen de interés, preferiblemente un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión que no es para ICMR, se transfectan al interior de células o líneas celulares, y se seleccionan y obtienen células o líneas celulares transfectadas de manera estable. La presencia de secuencias del locus de Fer1L4 o partes de las mismas tal y como se identifican en la presente memoria proporciona un efecto que actúa en cis sobre los genes de interés, mediante lo cual se mejora su expresión allí donde estén integrados en el genoma. Se espera que las líneas celulares generadas de esta manera en un proceso aleatorio muestren una mayor estabilidad de la productividad.
La presente invención hace referencia preferiblemente al uso de una secuencia de nucleótidos de Fer1L4 en un vector de expresión para la producción de una célula o línea celular estable y muy activa desde el punto de vista transcripcional, en donde la secuencia de nucleótidos de Fer1L4 se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos como las que se ofrecen en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%.
La presente invención hace referencia preferiblemente a un método para producir un producto de una secuencia génica codificante de interés que comprende el cultivo de una célula hospedadora producida de acuerdo con el
presente método para la producción de una célula o línea celular en un medio idóneo y la recuperación del producto a partir del mismo.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a una célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, en donde las secuencias nucleotídicas exógenas incluyen al menos un sitio FRT de tipo silvestre, preferiblemente al menos dos sitios FRT de tipo silvestre, flanqueando al menos una secuencia génica codificante de interés, o al menos un sitio FRT mutante, preferiblemente al menos dos sitios FRT mutantes flanqueando al menos una secuencia génica codificante de interés. Lo más preferiblemente, las secuencias nucleotídicas exógenas son un sitio FRT de tipo silvestre y un sitio FRT mutante que flanquean al menos una secuencia génica codificante de interés. Particularmente preferida, una secuencia génica codificante de interés, preferiblemente un gen marcador de selección, está localizada entre un FRT de tipo silvestre, que está preferiblemente localizado en 5' de la secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección, y un sitio FRT mutante, preferiblemente localizado en 3' de la secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección. Esto asegura preferiblemente que el intercambio de casete mediado por recombinación siempre se produce en la misma orientación.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a un método para producir una célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, que comprende las etapas de a) transfectar una célula, que comprende preferiblemente un gen de Fer1L4 endógeno, con un primer vector que comprende un primer casete intercambiable, en donde el casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación, en particular sitios FRT, que flanquean al menos una primera secuencia génica codificante de interés, que codifica preferiblemente un Acm, posteriormente b) seleccionar las células transfectadas que comprenden los al menos dos sitios diana de recombinación, en particular, sitios FRT, que flanquean al menos un primera secuencia génica codificante de interés integrada en el gen de Fer1L4 endógeno y que muestra una producción alta y estable del producto de la primera secuencia génica codificante de interés; posteriormente c) transfectar las células obtenidas en la etapa b) con un segundo vector que comprende un segundo casete intercambiable, en donde el casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes, en particular sitios FRT, que flanquean al menos una segunda secuencia génica codificante de interés, a saber, un gen marcador de selección; posteriormente d) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio y, posteriormente, e) seleccionar las células transfectadas que expresan la segunda secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección, para obtener la célula hospedadora para IES que comprende el segundo casete intercambiable integrado de manera estable en su genoma de acuerdo con la presente invención (véase, por ejemplo, la figura 4).
Preferiblemente la primera y segunda secuencia génica codificante de interés está flanqueada en uno de sus extremos por un primer sitio diana de recombinación y en su otro extremo por un segundo sitio diana de recombinación que es diferente al primer sitio diana.
Así pues, la presente invención da a conocer un método para producir una célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención, en donde dicho método utiliza un intercambio de casete mediado por recombinasa y en cuyo transcurso, un primer casete intercambiable que comprende una primera secuencia génica codificante de interés, que codifica preferiblemente un Acm, flanqueada por sitios diana de recombinación, se transfecta mediante un vector en el interior de una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora, en particular en un «punto caliente» del mismo, y tras la selección de los transfectantes del «punto caliente», un segundo casete intercambiable, por ejemplo que forma parte del plásmido circular de intercambio y que está compuesto por al menos una secuencia génica codificante de interés, en particular una segunda secuencia génica codificante de interés, preferiblemente un gen marcador de selección, que está flanqueada por sitios diana de recombinación que concuerdan, se transfecta en la célula hospedadora y se deja recombinar, por lo que se intercambia la primera secuencia génica codificante de interés por la segunda secuencia génica codificante de interés (véase, por ejemplo, la figura 4). Ventajosamente, solo una copia de la secuencia codificante génica de interés se inserta en el locus determinado con anterioridad y ninguna secuencia de vector, en particular secuencias plasmídicas del plásmido de intercambio, se integran en el genoma hospedador.
El presente método para producir una célula hospedadora para IES es ventajoso en la medida en que las etapas a) y b), un «punto caliente» que muestra una producción alta y estable de un producto de una secuencia génica codificante de interés se puede identificar con el uso de al menos una primera secuencia génica codificante de interés, por ejemplo, un gen que codifica un anticuerpo, p. ej., un Acm, o una parte del mismo, y que es un gen de utilidad industrial, por ejemplo, una proteína biofarmacéuticamente relevante, y que en las etapas c), d) y e), dicha primera secuencia génica codificante de interés se utiliza para identificar el «punto caliente» interesante está completamente intercambiado por el mal llamado casete vacío, en particular por un segundo casete intercambiable que comprende al menos una segunda secuencia génica codificante de interés, a saber, un gen marcador de selección. De este modo, se crea una célula hospedadora para IES libre de secuencias preexistentes de la primera secuencia génica codificante de interés utilizada para identificar el «punto caliente», lo que permite otro intercambio de casete mediado por recombinasa para colocar en dicho «punto caliente» otra secuencia génica codificante de interés, a saber, una tercera secuencia génica codificante de interés que remplaza la segunda secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección. Así pues, las células hospedadoras para IES obtenidas actualmente se pueden utilizar para efectuar otro intercambio de casete mediado por recombinasa para colocar una tercera secuencia génica codificante de interés en el genoma de la célula hospedadora en el «punto
caliente» identificado.
En el contexto de la presente invención, la terminología «sitios diana de recombinación concordantes» significa que un primer sitio de dichos sitios diana de recombinación de un casete intercambiable es idéntico a un primer sitio diana de recombinación de otro casete intercambiable, y que un segundo sitio diana de recombinación del primer casete intercambiable mencionado es idéntico al segundo sitio diana de recombinación del otro casete intercambiable, gracias a lo cual se permite un intercambio de las secuencias de nucleótidos entre los sitios diana de recombinación. Preferiblemente, el primer sitio diana de recombinación de ambos casetes intercambiables es diferente del segundo sitio diana de recombinación de ambos casetes intercambiables.
La presente invención hace referencia en una realización preferida a un método para producir el producto de una secuencia génica codificante de interés que comprende las etapas de i) transfectar una célula hospedadora para IES de acuerdo con la presente invención con un vector que comprende al menos un tercer casete intercambiable, en donde dicho casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes que flanquean al menos una tercera secuencia génica codificante de interés y al menos un marcador de selección, ii) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio para obtener una célula hospedadora para IES que comprende la tercera secuencia génica codificante de interés, iii) permitir que la célula hospedadora para IES obtenida en la etapa ii) exprese la tercera secuencia génica codificante de interés, y iv) recuperar el producto de la tercera secuencia génica codificante de interés.
Una ventaja importante de la presente invención es que se da a conocer una estabilidad de producción intrínseca que se hereda desde la célula hospedadora para IES generada en la etapa b) que comprende la primera secuencia génica codificante de interés en un «punto caliente» identificado, a saber, el gen de Fer1L4, por todas las células hospedadoras para IES que comprenden la tercera secuencia génica codificante de interés. Esta estabilidad es independiente de la selección y permite la conclusión de que el «punto caliente» identificado en las etapas a) y b) como características asociadas con las secuencias que rodean el «punto caliente» o cualquier otro lugar del genoma. En una construcción de línea celular basada en la integración aleatoria del vector, esto es un acontecimiento muy infrecuente y el esfuerzo anterior por encontrar tal sitio es inmenso. Así pues, la presente invención permite la eliminación de estudios de estabilidad prolongados para seleccionar líneas celulares idóneas que dan lugar a un ciclo global de desarrollo más corto y a una reducción de los recursos. Además, la presente invención permite cultivar células sin selección después del intercambio de casetes mediado por recombinación, lo que significa que el proceso de fabricación es posiblemente más aceptable para las agencias de control. Ventajosamente, el presente «punto caliente de Fer1L4» se definió y se identificó con un Acm, preferiblemente sin el uso de un marcador fluorescente.
La presente invención da a conocer un método para producir una célula hospedadora para IES en la que se introduce una secuencia nucleotídica exógena en un gen de Fer1L4 endógeno en una célula mediante integración dirigida. Se puede emplear cualquiera de una serie de métodos para dirigir una secuencia de nucleótidos a un sitio específico de interés del genoma, e incluye la recombinación homóloga y los métodos mediados por nucleasas, p. ej., uso de la recombinación homóloga mediada por parvovirus, uso de nucleasas con dedo de cinc, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción o meganucleasas manipuladas genéticamente (véase, p. ej., Russel y Hirata, Nat. Med. 18 (4): 325-30; 1998; publicación de patente de los EE. UU. n.º 20120070890; patente de los EE. UU. n.º 6.528.313; publicación de patente de los EE. UU. 20090258363). Una secuencia nucleotídica exógena introducida mediante tal método puede incluir cualquiera de las características descritas en la presente memoria. Por ejemplo, una secuencia nucleotídica exógena puede incluir al menos una secuencia génica codificante de interés y/o al menos dos sitios diana de recombinación. En algunas realizaciones, la secuencia génica codificante de interés comprende al menos un gen marcador de selección.
En otra realización, la presente invención hace referencia a un método para producir una célula hospedadora para IES, en donde el método comprende la introducción de una secuencia nucleotídica exógena en un gen de Fer1L4 endógeno en una célula, en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos una secuencia génica codificante de interés y/o al menos dos sitios diana de recombinación. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica exógena se introduce mediante recombinación homóloga entre el gen de Fer1L4 y un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende a) una primera secuencia nucleotídica homóloga a una primera porción del gen de Fer1L4, b) la secuencia nucleotídica exógena y c) una segunda secuencia nucleotídica homóloga a una segunda porción del gen de Fer1L4. En esta otra realización, la introducción de la secuencia nucleotídica exógena se facilita preferiblemente mediante el uso de un vector vírico, p. ej., un vector de dependovirus que interviene en la recombinación homóloga, o una nucleasa exógena, p. ej., una nucleasa con dedos de cinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, o una meganucleasa manipulada genéticamente. Resulta particularmente preferido el uso de un vector dependovírico. En una realización particularmente preferida, la secuencia nucleotídica exógena está flanqueada por sitios diana de recombinación, preferible sitios loxP.
La presente invención hace referencia también a un método para producir una célula hospedadora para IES que comprende las etapas de a) proporcionar una célula que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, en donde una secuencia nucleotídica exógena está integrada en dicho gen de Fer1L4 y en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos dos sitios diana de recombinación, que flanquean al menos una primera secuencia génica codificante de interés; posteriormente b) transfectar las células proporcionadas en la etapa a) con un vector
que comprende un primer casete intercambiable, en donde el casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes, que flanquean al menos una segunda secuencia génica codificante de interés, a saber, un gen marcador de selección, posteriormente c) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio, y posteriormente d) seleccionar las células transfectadas que expresan una segunda secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección, para obtener la célula hospedadora para IES que comprende el primer casete intercambiable integrado de manera estable en su genoma.
La presente invención también hace referencia al método identificado más arriba que además comprende i) transfectar la célula hospedadora para IES con un vector que comprende al menos un segundo casete intercambiable, en donde dicho casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes que flanquean al menos una tercera secuencia génica codificante de interés y al menos un marcador de selección, ii) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio para obtener una célula hospedadora para IES que comprende la tercera secuencia génica codificante de interés, iii) permitir que la célula hospedadora para IES obtenida en la etapa ii) exprese la tercera secuencia génica codificante de interés, y iv) recuperar el producto de la tercera secuencia génica codificante de interés.
La presente invención también describe el uso de una célula, preferiblemente una célula CHO, que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, preferiblemente un gen de Fer1L4 de CHO, para la producción de una línea celular estable y muy activa desde el punto de vista transcripcional.
Antes de describir la presente invención con más detalle, se debe saber que esta invención no se limita a las realizaciones concretas descritas, ya que estas pueden variar, por supuesto. También se debe saber que la terminología utilizada en la presente memoria tiene únicamente el propósito de describir realizaciones concretas y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que conocen corrientemente los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden utilizar en la puesta en práctica o para comprobaciones de la presente invención, a continuación, se describen algunos posibles y preferidos materiales y métodos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria se incorporan en la presente memoria por referencia para describir los métodos y/o materiales en conexión con las publicaciones que los citan. Se entiende que la presente descripción remplaza cualquier descripción de una publicación incorporada hasta el punto de que haya una contradicción.
Se debe advertir que, tal y como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares, «un», «una», «la» y «el» incluyen referentes plurales, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así pues, por ejemplo, la referencia a «una célula» incluye una multitud de tales células, y la referencia a «el vector» incluye la referencia a uno o varios vectores y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Las publicaciones explicadas en la presente memoria se dan a conocer únicamente para su descripción antes de registrar los datos de la presente solicitud. Nada en la presente memoria se entiende como una admisión de que la presente invención no da derecho a preceder tal publicación por virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas podrían ser diferentes de las fechas de publicación reales que podrían necesitar una confirmación independiente.
Otras realizaciones preferidas son el tema objeto de las subreivindicaciones.
Las SEQ ID n.os 1 a 3 representan las secuencias nucleotídicas de los vectores utilizados en la presente invención,
las SEQ ID n.os 4 a 6 representan los cebadores utilizados en la presente invención,
las SEQ ID n.os 7 y 8 representan las secuencias localizadas en 3' del gen de Fer1L4 de CHO,
la SEQ ID n.º 9 representa una secuencia localizada en 5' del gen de Fer1L4 de CHO, y
las SEQ ID n.os 10 y 11 representan otros cebadores utilizados en la presente invención.
La invención se describirá adicionalmente por medio de los ejemplos y de las figuras acompañantes.
Las figuras muestran:
En la figura 1 se muestra el vector pRY17 (SEQ ID n.º 1) utilizado para identificar el «punto caliente» en las CHOK1SV. LC1 y HC1 son las cadenas ligera y pesada del anticuerpo IgG4 monoclonal quimérico, cB72.3. hCMV hace referencia al promotor del gen temprano de hCMV-MIE donde «Int» representa su primer intrón. El intrón A y los exones flanqueantes que codifican la UTR en 5' se representan como «Ex1» y «Ex2», respectivamente. Los sitios FRT mutante F5 y de tipo silvestre están marcados como F5 y F, respectivamente. La poliadenilación, el promotor temprano de SV40 y las secuencias de la β-lactamasa están indicadas como pA, SV40 y bla,
respectivamente. GS representa el ADNc de la glutamina sintetasa, e Hyg (-ATG) representa un gen de la higromicina fosfotransferasa que carece del codón de iniciación de metionina y del promotor.
En la figura 2 se muestra el vector «intermedio», pRY37 (SEQ ID n.º 2) utilizado para crear el hospedador para IES denominado 10E9. Este vector contiene un sitio FRT mutante (F5) y un sitio FRT de tipo silvestre (F) flanqueando las unidades de transcripción que contienen los genes de la timidina cinasa (TK) y de la puromicina acetiltransferasa (PAC). La transcripción en cada uno está impulsada por el promotor temprano de SV40 (SV40E). El vector pRY37 se cotransfectó en las células 11A7 con el vector pOG44 (Invitrogen) que codifica la recombinasa FLP. Se seleccionaron las líneas celulares en presencia del medio que contiene puromicina y se cribó adicionalmente por el ICMR entre las secuencias de FRT de pRY37 y las secuencias equivalentes de pRY17 incluidas en el genoma de 11A7 (véase la figura 3). Después del cribado y la clonación, se aisló la línea celular 10E9 (el «hospedador para IES»), en la que las unidades de transcripción del Acm cB72.3 se habían intercambiado por las de TK y PAC.
En la figura 3 se muestra el vector orientador para crear líneas celulares productoras de Acm en 10E9, el hospedador para IES. Este vector, pRY21 (SEQ ID n.º 3) contiene unidades de transcripción que contienen los genes del Acm Myo (HC2 y LC2), flanqueadas por los sitios FRT de tipo silvestre y mutante (F5). Se ha añadido en fase un codón de inicio de metionina al extremo en 5' del sitio FRT de tipo silvestre (ATG+F) y delante de este está un promotor temprano de SV40 (SV). La transcripción de los genes HC2 y LC2 está impulsada por el promotor del gen 1 temprano inmediato principal de hCMV (hCMV-MIE) y su primer intrón. El intrón A (Int A) y los exones flanqueantes que codifican la UTR en 5' están representados como «Ex1» y «Ex2», respectivamente. El gen de la βlactamasa está representado como bla.
En la figura 4 se muestra el proceso de generación de 10E9, el hospedador para IES, desde la línea celular 11A7. Este diagrama esquemático muestra una sola copia de pRY17 integrado en el genoma de forma lineal que contiene unidades de transcripción del Acm cB72.3 (HC1 y LC1) flanqueadas por un sitio FRT de tipo silvestre y uno mutante F5 en la línea celular 11A7. Antes de la transfección, el vector pRY17 se cortó en medio del gen de la β-lactamasa (bla) con PvuI, con lo que el vector linealizado queda flanqueado por las porciones del gen en 5' (bla L) y en 3' (bla R). El vector pRY37 se cotransfecta en la línea celular 11A7 con un plásmido que codifica la recombinasa FLP y la recombinación (indicada con cruces) se produce entre los sitios similares, lo que conduce al ICMR de las unidades de transcripción del Acm con las unidades de transcripción de la timidina cinasa (TK) y de la puromicina acetiltransferasa (PAC), cada una impulsada por el promotor temprano de SV40 (SV).
En la figura 5 se muestra el proceso de generación una línea celular productora de Acm a partir de 10E9, el hospedador para IES. El vector orientador, pRY21 (figura 3, SEQ ID n.º 3) contiene las unidades de transcripción para el segundo Acm (Myo) (HC2 y LC2) flanqueadas por delante por un sitio FLP mutante (F5) y por detrás por un promotor temprano de SV40 (SV) que está a su vez delante del sitio FRT de tipo silvestre conectado en fase al codón de inicio de metionina (ATG-F). En presencia de la recombinasa Flp, y del vector orientador pRY21, los genes de la timidina cinasa (TK) y de la puromicina acetiltransferasa (PAC) y los promotores asociados se sustituyen mediante ICMR por las nuevas unidades de transcripción del anticuerpo Acm Myo. Como consecuencia de esto, se crea un gen de fusión funcional del sitio FRT de tipo silvestre y el gen de higromicina (ATG-F-Lnk-Hyg). Por lo tanto, se pueden seleccionar en presencia de higromicina y ganciclovir las células donde se había producido el ICMR específico.
En la figura 6 se muestra una comparación de la expresión del anticuerpo de los conjuntos para IES y de líneas celulares clonales procedentes de un proceso aleatorio o de la integración específica de sitio (IES) asistida por FLP. Se generaron clones de integración aleatoria mediante un proceso idéntico al utilizado para generar la línea celular 11A7 en la fase 1. Los conjuntos para IES (ronda 1 de IES) y las líneas celulares clonales (ronda 2 de IES y ronda 3 de IES) se generaron bajo diferentes condiciones de transfección y selección, tal y como está especificado en el apartado de los métodos. Para la ronda 3 de IES, se emplearon 4 condiciones de selección diferentes; 200 µg/ml, sin MSX (●), 200 μg/ml de higromicina con MSX (♦), 400 μg/ml de higromicina sin MSX (▲) o 400 μg/ml de higromicina con MSX (▼). Las líneas celulares clonales generadas de todos los procesos se expandieron en matraces en agitación. La productividad de las líneas celulares clonales se valoró en matraces en agitación por lotes a término el día 7 (véanse los métodos).
En la figura 7 se muestra la estructura exónica del gen de Fer1L4 en la hebra menos de scaffold1249, también denominado JH000254.1 (http://www.ncbi.nim.nih.gov/nuccore/JH000254). Se ha indicado la localización de los sitios de integración en 5' y 3' (1750049 y 1760965, respectivamente).
En la figura 8 se muestra el mapeo de las lecturas de 10E9 mapeadas sobre el pRY17-GA-Q con el uso de BWA. Al inspeccionar el mapeo, se halló que muchas lecturas sin parear (flechas negras) se mapeaban en el extremo en 5' del fragmento HC (que carece de 214 pb en el extremo 5' de la HC completa).
En la figura 9 se muestra la estructura de la zona de integración en el gen de Fer1L4 de 10E9, la célula hospedadora para IES. (A) La cobertura por WGRS para la zona de integración se muestra superpuesta en la parte superior del modelo de «copia única» y por debajo se muestra un esquema más detallado. (B) Los datos de la transferencia Southern sugirieron que podrían existir dos copias de la zona de integración. El ADN genómico de las células 10E9 se digirió con la enzima de restricción BmgI, o bien con la PmlI, y se analizaron mediante transferencia Southern.
Las transferencias Southern se hibridaron con una sonda de TK, lo que reveló dos fragmentos que abarcan dos copias de la zona de integración (que se muestra mapeada sobre un modelo de «dos copias»). El modelo de «dos copias» es coherente con los datos de WGRS.
En la figura 10 se muestra el dibujo esquemático de los sitios de integración de 10E9 (la célula hospedadora para IES) y las líneas celulares de ICMR (que expresan un gen de interés). La localización genómica se representa por una línea vertical discontinua y la coordenada nucleotídica sobre Scaffold1492, el scaffold de CHO-K1 sin colocar (número de acceso JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). El gen de Fer1L4 se describe como una flecha, mientras que el fragmento genómico se representa como una línea continua. La interrupción de la línea discontinua representa una distancia muy grande. Las secuencias flanqueantes en 5' y 3' se representan mediante indicadores blanco y negro, respectivamente.
En la figura 11 se muestra el gráfico de la cobertura de las lecturas de resecuenciación del genoma entero mapeadas sobre el modelo de una copia del vector integrado. La altura del diagrama gris es igual a la cobertura en cada base sin suavizado (mostrado para cada línea celular generada por ICMR, 1-4). La cobertura en la región flanqueante es aproximadamente la misma entre todas las líneas celulares. Sin embargo, la cobertura de los dos grandes productores sobre la parte superior de la figura es de aproximadamente 1,4 a 2,3 veces la cobertura de los dos poco productores en la parte inferior. La presencia de los wFRT se indica con asteriscos, mientras que la presencia de mFRT se representa con círculos negros. (Otras peculiaridades se indican del siguiente modo: HC con una deleción de 214 pb es el cB72.3 restante que queda detrás en el punto caliente después de crear la 10E9, la hospedadora para IES; BlaR es una porción en 5' del gen de la β-lactamasa; Myo-LC y Myo-HC son las secuencias codificantes de la HC (cadena pesada) y la LC (cadena ligera) del Acm antimiostatina, residentes en el punto caliente tras el ICMR; Hyg = higromicina; BlaL es la porción en 3' del gen de la β-lactamasa, y ADNc de GS es la secuencia codificante de la glutamina sintetasa del vector pRY17).
La figura 12 muestra el gráfico de cobertura de las lecturas de RNA-seq mapeadas sobre la región de LC y HC de Myo del vector integrado (para las líneas celulares 1-4 generadas por ICMR). La altura del gráfico es igual a la cobertura en cada base sin suavizado.
Ejemplos
Ejemplo 1:
A) Materiales y métodos
1.
Construcción de vectores
Todas las secuencias de vectores que se sintetizaron, se secuenciaron totalmente. Los genes de la puromicina acetiltransferasa (PAC), de la higromicina fosfotransferasa (Hyg) y del Acm eran todos genes optimizados y adaptados al sesgo de los codones de Cricetulus griseus antes de la síntesis del gen. La mayor parte de pRY17 (figura 1) procedía de pCB72.3-GA-HC-LC (Kalwy et al. (2006), Mol. Biotechnol. 34, páginas 151 a 156). Las secuencias para las secuencias de recombinación de FRT de tipo silvestre (F) y de FRT mutante F5 (F5), presentes en todos los vectores, se dan en Schlake y Bode (Schlake y Bode, 1994, Biochemistry 33: 12746-12751). Las secuencias modelo (antes de la síntesis del gen con o sin optimización génica tenían el siguiente origen: la fusión en fase de la secuencia de recombinación F y el conector del vector pRY17 (figura 1) se tomaron del vector pFRT/lacZeo (Invitrogen). La fusión en fase del codón de inicio de metionina y la secuencia de recombinación F de pRY21 (figura 3) se obtuvieron de pcDNAT5/FRT (Invitrogen). En todos los vectores, los promotores tempranos de SV40 utilizados (además del asociado a la unidad de transcripción de GS, que procede del pCB72.3-GA-HC-LC), se obtuvieron de los vectores de Invitrogen mencionados más arriba. Las secuencias de los genes de la timidina cinasa (TK) y de PAC en el pRY37 se obtuvieron de pWSTK6 (gb:EU530625) y pPUR (Clontech, gb:U07648), respectivamente.
2.
Análisis en matraces en agitación por lote alimentado y por lotes
Para el análisis en matraces en agitación por lotes, se inocularon células a 3 × 105 células viables/ml en matraces para agitación de 125 ml en 30 ml de CHO en CD suplementadas con distintos agentes selectivos (tal y como se describe después) y se incubaron a 37°C en CO2 al 5% (v/v) en el aire humidificado en una incubadora de agitación orbital a 140 rpm. El medio acondicionado se recogió el día 7 del cultivo y la concentración del anticuerpo en el medio acondicionado se determinó por HPLC con proteína A.
Para el análisis en matraces en agitación por lotes alimentados, se inocularon las células a 3 × 105 células/ml en matraces para agitación de 500 ml, cada uno con 100 ml del medio propietario y se incubaron a 37°C en CO2 al 5% (v/v) humidificado en el aire en una incubadora de agitación orbital a 140 rpm. Se alimentaron las células a partir del día 3 del cultivo con una alimentación propietaria que consiste en una mezcla de aminoácidos y elementos traza. Las viabilidades diarias y las concentraciones de células viables se determinaron con un analizador automático de la viabilidad de las células Vi-CELLTM. La concentración de los anticuerpos en el medio se determinó mediante HPLC con proteína A a partir del día 6 del cultivo hasta su recogida el día 14.
3.
Análisis de la estabilidad
Las células se subcultivaron en alternanca cada 3 y 4 días en un matraz para agitación de 125 ml en 30 ml de CHO en CD suplementadas con diferentes agentes de selección (tal y como se describe a continuación). A diferente número de generaciones (1 generación es equivalente a 1 duplicación de la población), los matraces en agitación por lotes alimentados por duplicado se prepararon como está descrito más arriba. Las mediciones de concentración de células, de viabilidad y de concentración del Acm se recogieron como está descrito más arriba. Si la productividad de una línea celular cambia a >30% en 70 generaciones, entonces se considera que es inestable.
4.
Citometría de flujo para la clonación de células individuales
La clonación de células individuales se realizó en un clasificador celular por FACS Aria II equipado con el programa informático FACSDiva v 6.0 con un láser enfriado con aire que emite a 488 nm. Se excluyeron las células muertas en un gráfico de puntos de FSC (tamaño) frente a SSC (granularidad), y los dobletes se excluyeron en un gráfico de puntos de FSC de la anchura frente a la superficie. El procedimiento de clasificación para las células vivas era una combinación de los dos gráficos de puntos.
5.
Generación de las células hospedadoras para IES
La transfección de la línea celular parental que expresa el pRY17 con el vector vacío pRY37, que comprende la segunda secuencia génica codificante de interés, a saber, el gen marcador de selección, se realizó con el sistema de CHO FreeStyleTM MAX (Invitrogen). Con esta finalidad, 24 h antes de la retransfección para el ICMR, una línea celular seleccionada por estar transfectada con pRY17 (11A7) se inoculó primero en el medio de expresión de CHO con FreeStyleTM a 5 × 105 células/ml en un matraz para agitación de 125 ml. El día de la transfección, aproximadamente 3 × 107 células a una concentración de 1 × 106 células/ml se cotransfectaron con 33,75 μg del plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 3,75 μg de pRY37 (9:1) con el reactivo FreeStyleTM MAX en un matraz para agitación de 125 ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la transfección, se sembraron las células en placas de 48 pocillos que contenían medio propietario definido químicamente complementado con MSX a 25 μM y puromicina a 7 μg/ml. Tres semanas después de la siembra en la placa, el medio de cada pocillo que contiene células viables se cribó por la producción de anticuerpos en un ForteBio con el uso del biosensor de proteína A. El medio de las líneas celulares sin ningún anticuerpo detectable se avanzó a matraces para agitación de 125 ml que contenían el medio CD para CHO suplementado con MSX a 25 μM y puromicina a 1 μg/ml.
6.
Generación de líneas celulares procedentes del hospedador 10E9
Los experimentos de ICMR se dividen en 3 «rondas» independientes y a ellas se hace referencia aquí y más adelante en el apartado de resultados que viene a continuación (las rondas se definen en la figura 6).
En las rondas 1 y 2, la transfección de la célula hospedadora para IES 10E9 con el vector orientador para IES, pRY21, se llevó a cabo con el sistema de FreeStyleTM MAX para CHO (Invitrogen). Con esta finalidad, 24 h antes de la retransfección para ICMR, se inocularon primero las células hospedadoras para IES 10E9 a una concentración de 5 × 105 células/ml en un matraz para agitación de 125 ml que contenía el medio de expresión para CHO FreeStyleTM (Invitrogen) suplementado con MSX a 25 µM y puromicina a 1 µg/ml. El día de la transfección, aproximadamente 3 × 107 células a una concentración de 1 × 106 células/ml se cotransfectaron con 33,75 µg del plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 3,75 µg de pRY21 (9:1) con el reactivo FreeStyleTM MAX en un matraz para agitación de 125 ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, se recuperaron las células en un matraz para agitación de 125 ml que contenía 30 ml del medio de expresión para CHO FreeStyleTM (Invitrogen) suplementado con MSX a 25 µM. A las 48 h del ICMR, los transfectantes de la ronda 1 se sembraron en placas de 48 pocillos que contenían el medio propietario definido químicamente suplementado con MSX a 25 µM, higromicina a 400 µg/ml (selección positiva) y ganciclovir a 3 µM (selección negativa). Cuatro semanas después, la concentración de Acm en el medio de los pocillos que contienen focos visibles se determinó en un ForteBio Octect con un biosensor de proteína A. Las células que secretaban el Acm en el medio se expandieron y se mantuvieron en matraces para agitación que contenían el medio CD para CHO suplementado con higromicina a 200 µg/ml y MSX a 25 µM. Estos conjuntos de células se evaluaron además por la productividad de anticuerpos en un análisis en matraces en agitación por lotes (tal y como está descrito más arriba). Para el análisis de la estabilidad, se retiró la MSX del subcultivo para la situación especificada en la figura 6.
Después de la recuperación durante 48 h en matraces para agitación, los transfectantes de la ronda 2 se inocularon a una concentración de 5 × 105 células/ml en un matraz para agitación de 125 ml que contenía el medio CD para CHO suplementado con higromicina a 400 µg/ml (selección positiva). A esto le siguió la adición de ganciclovir a 3 µM 5 días después, como selección negativa. A las células se les dieron pases ininterrumpidamente cada 3-4 días en el mismo medio durante 3 semanas en el mismo matraz en agitación. Las células supervivientes se clonaron una a una con el FACS Aria II en placas de 96 pocillos que contenían el medio propietario definido químicamente suplementado con higromicina a 400 µg/ml y ganciclovir a 3 µM. Tres semanas después, la concentración del Acm en el medio de los pocillos con un crecimiento celular visible se determinó en un ForteBio Octect con un biosensor de proteína A. Los clones que secretaban el Acm en el medio de cultivo se expandieron y se mantuvieron en matraces en agitación que contenían el CD para CHO suplementado con higromicina a 200 µg/ml y MSX a 25 µM.
Estos clones se evaluaron además por la productividad de anticuerpos en un análisis en matraces en agitación por lotes (tal y como está descrito más arriba). Para el análisis de la estabilidad, se retiró la MSX del subcultivo para las situaciones que están especificadas en la figura 6.
Para las transfecciones de la ronda 3, se cotransfectaron 1 × 107 células hospedadoras para IES 10E9 mediante electroporación con 45 µg del plásmido pOG44 (Invitrogen, gb:X52327) y 5 µg de pRY21 a 900 µF y 300 V. Después de la transfección, se inocularon las células en un matraz T-75 que contenía 20 ml del medio propietario definido químicamente. Al cabo de 48 h, se le añadió al medio higromicina a 200 µg/ml o bien a 400 µg/ml, y luego se le añadió gangiclovir a 3 µM 6 días después. En algunos casos (tal y como se describe en la leyenda de la figura 6), se le añadió MSX a 25 µM junto con la selección por higromicina. En todas las condiciones de transfección analizadas, se seleccionaron las células durante 3 semanas en estas condiciones. Durante este periodo, el medio acondicionado en el matraz T-75 se cambió por medio recién preparado que contenía el fármaco para la selección positiva y para la negativa cada 3-4 días. Una vez alcanzada la viabilidad ≥90%, las células se clonaron de una en una con un FACS Aria II en placas de 96 pocillos que contenían el mismo medio propietario definido químicamente que está descrito más arriba suplementado con higromicina a 200 µl/ml o bien a 400 µg/ml, con o sin 25 µM de MSX (tal y como está descrito en la leyenda de la figura 6). La concentración de anticuerpo en el medio acondicionado, recogido de los pocillos que contienen células visibles en crecimiento, se determinó en un ForteBio Octect con un biosensor de proteína A. Las líneas celulares clonales seleccionadas se expandieron y se subcultivaron en matraces para agitación de 125 ml que contienen el medio CD para CHO suplementado con higromicina a 200 µg/ml y MSX a 25 µM. Estos clones se evaluaron además por la productividad del anticuerpo en el análisis en matraces en agitación por lotes (tal y como está descrito más arriba). Para el análisis de la estabilidad, se retiraron la higromicina y la MSX del subcultivo para la situación especificada en la leyenda de la figura 6.
7. Análisis de los datos
La integral con el tiempo del área bajo la curva de crecimiento (la integral con el tiempo de la concentración de células viables (IVC, por su nombre en inglés); 106 células día/ml) se calculó con el método descrito por Renard et al. (Renard et al., 1988, Biotechnology Letters, 10: 91-96).
en donde Xv0 = concentración de células viables en la primera muestra (106/ml), Xv1 = concentración de células viables en la segunda muestra (106/ml), t0 = tiempo transcurrido en la primera muestra (día), t1 = tiempo transcurrido en la segunda muestra (día).
8.
Paseo cromosómico
Se utilizó el kit DNA Walking SpeedUpTM II de Seegene de acuerdo con las instrucciones del fabricante para proporcionar los datos de las secuencias flanqueantes del genoma en 3'. Se utilizaron cebadores específicos del gen de la β-lactamasa (bla), específicos de bla en el lado 3' del esquema del vector pRY17 integrado linealmente (bla R, figura 3) en 11A7, la línea celular de GS-CHOK1SV, TSP1fwd (SEQ ID n.º 4), TSP2fwd (SEQ ID n.º 5) y TSP3fwd (SEQ ID n.º 6).
9.
Secuenciación del genoma del hospedador 10E9
Se fragmentó el ADN genómico de 10E9 y se preparó una genoteca de extremos pareados idóneos para la plataforma de secuenciación HiSeq con el kit de preparación de muestras de ADN TrueSeq, siguiendo las instrucciones del fabricante. La genoteca generada estaba dentro del margen de tamaños esperado de 300 pb a 500 pb. El análisis de control de calidad de la genoteca generada utilizando un bioanalizador Agilent 2100 indicó que la genoteca tenía una calidad aceptable, que contenía el tamaño y rendimiento de fragmentos esperado, para un procesamiento de muestras continuo. La genoteca generada se utilizó en el sistema cBot System para la generación de agrupamientos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las celdas de flujo que contienen los agrupamientos amplificados se secuenciaron por secuenciación de extremos pareados de 2 × 100 pb en un Hi-Seq 2000. Las lecturas se mapean en los contigs de CHO-K1 (Xu X. et al. 2011, Nature Biotechnol. 29: 735-742) con el alineador basado en el algoritmo de Burrows-Wheeler (BWA) (Li H. y Durbin R. 2009, 25: 1754-1760).
B) Resultados
Fase I: Generación de las líneas celulares que expresan el Acm parental
El objetivo de la fase I era generar una línea celular GS-CHOK1SV que expresa el Acm con gran producción, que muestra unas características de crecimiento favorables con una productividad estable, que contiene solo un locus de integración y el menor número posible de vectores integrados en este locus. Se diseñó un «vector de genes doble» Lonza GS modificado, pRY17 (figura 1), que codifica el Acm quimérico, el cB72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1: 499-505). En el pRY17, las secuencias de recombinación F5 mutante y F de tipo silvestre de 48 pb flanquean las
unidades de transcripción de HC y LC del Acm. Las secuencias de recombinación F5 y F, aunque son funcionalmente equivalentes, muestran una actividad de recombinación cruzada mínima que, por lo tanto, permite un ICMR eficaz y direccional, catalizado por la recombinasa FLP (Schlake y Bode, 1994, Biochemistry 33: 1274612751). Las líneas celulares de GS-CHOK1SV iniciales procedentes de una transfección con pRY17 no transcriben
o traducen de manera eficaz el gen de resistencia a la higromicina, ya que no hay un codón de metionina iniciador ni un promotor inmediatamente delante de este gen híbrido.
Es importante señalar que el gen de GS procedente del vector se colocó fuera del casete intercambiable para que quede retenido en el genoma de las líneas celulares resultantes después del ICMR. Al hacerlo así, se evitó cualquier posible perturbación del metabolismo de la glutamina en cualquier línea celular derivada; se seleccionaron las líneas celulares de GS-CHOK1SV parentales en el medio sin glutamina y con sulfoximina de metionina (MSX) a 50 µM, en presencia de la expresión de la glutamina sintetasa endógena, así como de la procedente del vector. Se colocaron un gen de la higromicina B fosfotransferasa sin la metionina iniciadora de la traducción (-ATG) y sin promotor entre la secuencia codificante del conector (Lnk) y la secuencia de recombinación F (figura 1). Los vectores utilizados para el ICMR en la segunda fase de este estudio contienen el promotor temprano de SV40 y la metionina iniciadora (ATG) necesaria para expresar resistencia a la higromicina. Sólo se crea un gen de resistencia a la higromicina totalmente funcional cuando se produce la recombinación con la secuencia de recombinación F de tipo silvestre en el genoma (figura 1).
El vector pRY17 que contiene las secuencias de recombinación de FRT se introdujo en las células CHOK1SV mediante un procedimiento de desarrollo de líneas celulares convencional, seguido de un cribado intensivo realizado en las etapas clave del proceso para garantizar que aislamos líneas celulares con la mejor combinación de crecimiento y productividad. Adicionalmente, la proteína cB72.3 procedente de las líneas celulares elegidas tiene que mostrar unas características de calidad del producto similares a las de una preparación procedente de una línea de células GS-CHOK1SV anterior (Birch y Racher, 2006, Adv. Drug. Deliv. Rev. 58; 671-685). El número de copias de los genes de HC y LC de las líneas celulares candidatas se prefiere que esté cercano el uno al otro. Con este fin, se llevaron a cabo tres electroporaciones independientes y cada una con 50 µg del pRY17 linealizado y 1 × 107 células CHOK1SV. Los transfectantes de las tres electroporaciones se seleccionaron en el medio que contenía MSX a 50 µM y se cribaron aproximadamente 1500 conjuntos de células supervivientes por la producción de anticuerpos a las 3 semanas de la transfección. Finalmente, se evaluaron 79 clones en total mediante el matraz en agitación por lotes a día 7 y se determinó la concentración del Acm cB72.3 en los 79 clones. Todas las líneas celulares procedentes de ICMR se mantuvieron en el medio que contenía MSX a 25 µM, excepto donde se menciona. De los 79 clones evaluados, se seleccionaron 38 para más análisis en cultivo con matraces en agitación por lotes alimentados. Se seleccionaron los 6 mejores clones entre los que mejor funcionaban sobre la base de las características de productividad y de crecimiento (tabla 1) para la caracterización genética (véanse los métodos).
Tabla 1: Crecimiento y producción de anticuerpos de las 6 mejores líneas celulares clonales de la fase 1 en el matraz en agitación por lotes y por lotes alimentados (n = 2).
Línea celular
Lote Lote alimentado
Concentración del producto (mg/l) – día 7
Estimación de la IVC (106 células día/ml) Concentración del producto (mg/l) – día 14 Tasa de producción específica (pg/célula.día) Densidad de células máxima (106 células/ml)
1G11
637,73 73,55 3385 47,3 9,00
6B5
273,73 97,89 2029 21,2 13,40
8F10
427,41 125,46 2976 25,0 15,32
11A7
457,88 149,6 3570 25,1 19,13
14D11
378,83 86,32 3251 39,2 10,33
18C11
480,27 90,45 2953 35,0 11,05
Para investigar el sitio de integración del pRY17 en el genoma de CKOK1SV, los cromosomas metafásicos de los 6 clones se prepararon y se sondearon con el pRY17 marcado con DIG (no se muestran los datos). Los clones 1G11, 6B5, 8F10, 14D11 y 11A7 parecen tener sólo un locus de integración en la región telomérica de un cromosoma individual. El clon 18C11, por otra parte, parece tener dos sitios de integración diferentes y, por lo tanto, no se seleccionó para más estudios. Para determinar el número de copias de los genes en cada una de las líneas celulares, se preparó el ADN genómico tratado con ultrasonidos a partir de células que crecen activamente. Para el análisis por qPCR, se incluyó la GAPDH como control endógeno y el ADN de la célula hospedadora se «enriqueció»
en el pRY17 como control positivo. El número de copias de los genes por célula tanto para HC como para LC se calculó como la razón del promedio de copias por el promedio de las copias de GAPDH. Tal y como se muestra en la tabla 2, entre los 5 clones analizados, el 11A7 tiene el número de copias génicas de HC y LC más bajo. El análisis por transferencia Southern del ADN genómico reveló que tanto HC como LC se pueden detectar en los 5 clones, y que la intensidad de las bandas refleja el número de copias de los genes determinado por qPCR (no se muestran los datos).
Tabla 2: Análisis por qPCR de las copias de los genes de la HC y de la LC de cB72.3 en 5 de las 6 líneas celulares clonales
Línea celular
Promedio de copias de HC/célula Promedio de copias de LC/célula
1G11
15,58 13,95
6B5
44,46 47,91
8F10
40,46 38,41
11A7
6,57 3,57
14D1
9,75 9,31
De los 5 clones seleccionados que entraron en el presente estudio de estabilidad (tabla 3), el 11A7 mantenía una
10 productividad similar a lo largo de 7 meses (220 generaciones), mientras que otros clones mostraban una pérdida de productividad gradual durante los primeros 3 meses del estudio (80 generaciones). En conjunto, el 11A7 no solo era una de las mejores combinaciones de perfiles de buen crecimiento y productividad, sino que también tenía el número de copias de genes más bajo con un solo sitio de integración. También muy importante, el 11A7 es el clon más estable entre los 6 en términos de productividad. Lo más importante es que la calidad del producto era
15 comparable después de 220 generaciones. El 11A7 se eligió como el clon parental para la primera ronda de ICMR: fase II.
Tabla 3: Análisis de la estabilidad de las 5 mejores líneas celulares clonales para IES. Las 5 mejores líneas celulares clonales para IES se cultivaron ininterrumpidamente en matraces para agitación durante un número diferente de generaciones en presencia de MSX. Una vez alcanzados los diferentes números de generaciones que se indican, se analizó la producción de anticuerpos (n = 2) de las 5 líneas celulares clonales para IES en el matraz en agitación por lotes alimentados.
Producción de anticuerpos (mg/l) a un número de generaciones dado
Líneacelular
10 40 80 100 120 140 160 180 200 220
1G11
2809,00 2977,00 2675,86 2553,18 2464,09 2047,00 - - - -
11A7
2946,00 2776,82 2546,47 2464,99 2395,90 2421,00 2425,00 2498,00 2496,00 2676,00
6B5
1548,00 1791,94 1580,33 - - - - - - -
8F10
2433,00 2593,00 2760,20 - - - - - - -
14D11
2629,00 2521,08 2358,44 - - - - - - -
Fase II: Generación de células hospedadoras para IES
Aunque es totalmente posible diseñar un vector orientador que pudiera intercambiar las unidades de transcripción del Acm originales en 11A7 por las de un nuevo Acm, se prefiere que el original se escinda completamente del genoma. Para hacerlo, se diseñó un vector orientador vacío adicional, pRY37 (figura 2) que no codifica los genes del Acm. En su lugar, codifica marcadores de selección positivos y negativos, puromicina acetiltransferasa (PAC) y timidina cinasa (TK), respectivamente, y estas estaban flanqueadas por las secuencias de recombinación F y F5 en la misma orientación que en el pRY17 (figura 1). Después del ICMR, estos marcadores se espera que coloquen el Acm original cB72.3 en el mismo locus del genoma original de 11A7. Se necesita la PAC para seleccionar las líneas celulares que se han sometido al ICMR con el pRY37. La TK convierte el profármaco ganciclovir en un análogo nucleotídico fosforilado y tóxico (Wood y Crumpacker, 1996, New England Journal of Medicine 335, páginas 721 a 729). Esto es importante para aplicar la selección negativa más tarde en la fase III: la selección con ganciclovir enriquece en el conjunto de ICMR las células que se han sometido a un ICMR legítimo, al acabar con las que no lo han tenido.
De los conjuntos de líneas celulares supervivientes que eran negativas para la expresión de Acm, una línea celular, la 136-A4, se eligió para caracterizarla más mediante el análisis de transferencia Southern (no se muestran los datos). Se confirmó la presencia de TK en el genoma de 136-A4. El mapeo de restricción indicó la presencia de solo dos copias de pRY37 en el «punto caliente» y se confirmó mediante la posterior secuenciación del genoma del clon hijo 10E9. El número de copias es sustancialmente más bajo que el de pRY17 hallado en la 11A7 (tabla 2). Para obtener un hospedador para IES homogéneo, clonamos una única célula de 136-A4 mediante el uso del FACS Aria II y obtuvimos el perfil del crecimiento de 26 derivados clonales. Entre estos, dos derivados clonales con los mejores perfiles de crecimiento, 10E9 y 8C8, se seleccionaron para caracterizarlos más mediante el análisis de transferencia Northern. El análisis de transferencia Northern del ARN de estos clones hijos confirmó la ausencia de los ARNm de HC y LC del cB72.3 (no se muestran los datos). En conjunto, estos resultados muestran que 10E9 es una línea celular hospedadora candidata que es idónea para ICMR para los análisis en la fase III.
Fase III: ICMR con el vector orientador del Acm Myo
Para demostrar la utilidad de una nueva línea celular hospedadora para IES 10E9, se diseñó un vector orientador, el pRY21 (figura 3). Este vector contiene los genes de HC y LC para el Acm Myo, flanqueados por las secuencias de recombinación F y F5 en la misma orientación en la que se hallan en los dos vectores pRY17 (fase I) y pRY37 (fase II). También contiene un promotor temprano de SV40 (SV40E) delante de un codón de inicio de metionina fusionado en fase con la secuencia de recombinación F (ATG + F). Cuando se produce un ICMR legítimo, la secuencia ATG + F se coloca en fase con el gen de la higromicina B fosfotransferasa que carece del codón de inicio de la traducción para metionina (-ATG) y que no tiene promotor. Se realizaron tres rondas de cotransfección de las células 10E9 con pRY21 y pOG44. En las primeras dos rondas, las células se transfectaron con el sistema para CHO FreeStyleTM MAX, mientras que, en la ronda 3, las células se transfectaron por electroporación. Además, se coseleccionó la ronda 1 con ganciclovir e higromicina como conjuntos; de forma secuencial, se seleccionó la ronda 2 primero con 400 µg/ml de higromicina y luego con ganciclovir como conjuntos, y entonces se clonó posteriormente una única célula mediante el FACS Aria II; de forma secuencial, se seleccionó la ronda 3 primero con 200 o 400 µg/ml de higromicina y luego con ganciclovir como conjuntos, y entonces se clonó posteriormente una única célula mediante el FACS Aria II (figura 6). En la ronda 3, la MSX estaba ausente del medio de cultivo en dos de las situaciones analizadas.
Los datos de productividad obtenidos de diferentes conjuntos en la ronda 1 son similares, lo que sugiere que los miembros de la línea celular de cada conjunto es probable que tengan productividades parecidas. El margen de productividad de los conjuntos es mucho más estrecho que el de las líneas celulares clonales o no clonales procedentes de un proceso de integración aleatoria (figura 6). Cuando se comparan las líneas celulares clonales aisladas en diferentes condiciones de selección a partir de las rondas 2 y 3, parece que las líneas celulares clonales con la mayor producción residen en el grupo seleccionado en ausencia de MSX en comparación con las que recibieron la MSX. En las líneas celulares cultivadas en ausencia de MSX, parecía haber una diferencia de productividad obtenida con diferentes concentraciones de higromicina en el medio selectivo que no aparecía cuando la MSX estaba presente en el medio.
Inicialmente, en la fase I, se aisló una línea celular muy estable de GS-CHOK1SV, la 11A7, que es estable incluso después 220 generaciones. Este rasgo de estabilidad podría heredarse en las líneas celulares derivadas que se generaron por ICMR en la fase III. Por consiguiente, se evaluaron 3 conjuntos de células de la ronda 1 de la fase III en un estudio de la estabilidad extenso en dos situaciones diferentes (tabla 4).
Tabla 4: Ronda 1: se expandieron tres líneas celulares seleccionadas en matraces para agitación y se cultivaron ininterrumpidamente en dos situaciones diferentes; + higromicina / + MSX (+/+) o – MSX / + higromicina (–/+). En diferentes momentos temporales, se pusieron en marcha cultivos en matraces en agitación por lotes alimentados por duplicado a partir de los cultivos continuos de las 3 líneas celulares para IES en las dos condiciones, y se determinó la concentración del Acm Myo en el medio al cabo de 14 días.
Número de generaciones
Concentración del anticuerpo (mg/l) en los cultivos por lotes alimentados de las líneas celulares
70C2
72A3 74B5
(+) / (+)
(-) / (+) (+) / (+) (-) / (+) (+) / (+) (-) / (+)
10
1240 1140 1510 1430 1310 1170
40
1070 1140 1400 1250 1370 1190
70
1100 1170 1400 1200 1370 1240
100
1030 1270 1700 1490 1700 1400
Independientemente de las condiciones, los tres conjuntos analizados cumplían los criterios de una línea celular estable. Además, un total de 12 líneas celulares clonales, 6 de cada una de las rondas 2 y 3, en el mismo tipo de estudio de la estabilidad (tablas 5 y 6, respectivamente). Se encontró que las 12 líneas celulares clonales conservaban el rasgo de estabilidad sometidas a la selección. Era interesante que las 6 líneas celulares clonales de
10 la ronda 3 (tabla 4) eran estables incluso sin la presencia de ningún agente selectivo. Esto tiene profundas implicaciones para fabricar sustancias biofarmacéuticas.
Tabla 5: Ronda 2: Se cultivaron ininterrumpidamente seis clones de una única célula en dos condiciones diferentes: + higromicina / + MSX (+/+) o – MSX / – higromicina (–
/–), y se analizaron periódicamente mediante el cultivo por lotes alimentados como se describió para la ronda 1 (tabla 4).
Número de generaciones
Concentración de anticuerpo (mg/l) en los cultivos por lotes alimentados de clones celulares
11F6
11F11 12C3 13F7 13G8 15E9
(+) / (+)
(-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-)
10
1470 1390 1920 1860 1480 1360 1960 1870 2020 2020 2150 2100
40
1300 1420 1870 1680 1770 1590 1850 1860 1940 2010 2020 2100
70
1350 1350 1870 1650 1770 1600 1850 1760 1840 1890 2060 2060
100
1200 1580 2180 1930 2160 1790 2094 1950 1970 2020 2500 2360
Tabla 6: Ronda 3: Se cultivaron ininterrumpidamente seis clones de una única célula en dos condiciones diferentes; – MSX / + higromicina (–/ +) o – MSX / – higromicina (–/–), y se analizaron periódicamente mediante el cultivo por lotes alimentados tal y como está descrito para la ronda 1 (tabla 4).
Número de generaciones
Concentración de anticuerpos (mg/l) en los cultivos por lotes alimentados de clones celulares
2H4
4H7 A5B8 A7D5 A8A10 A8G1
(+) / (+)
(-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) / (+) (-) / (-) (+) (+) (-) / (-)
10
2400,0 2400,0 2200,0 2400,0 1900,0 2100,0 2200,0 2300,0 1300,0 1400,0 1400,0 1500,0
40
2460,0 2440,0 2330,0 2240,0 2100,0 2070,0 2320,0 2320,0 1580,0 1570,0 1490,0 1500,0
70
2080,0 2150,0 1980,0 2070,0 1910,0 1930,0 1990,0 2120,0 1490,0 1610,0 1360,0 1380,0
100
2389,0 2359,0 2655,0 2510,0 2215,5 2276,5 2343,0 2536,0 1760,0 2009,0 1637,5 1656,5
130
2477,5 1937,5 3401,0 2505,0 2392,0 1970,0 2496,0 2311,0 1760,0 1870,0 1552,0 1029,0
Caracterización de las secuencias genómicas que flanquean la secuencia flanqueante en 3' del «punto caliente»
La secuencia flanqueante en 3' de 500 pb (SEQ ID n.º 7) procedente del paseo cromosómico con Seegene de bla R (figura 3) se utilizó para una búsqueda con BLAST de los contigs del proyecto de secuenciación de un genoma de CHO-K1 (Xu X. et al., 2011, Nature Biotechnol. 29: 735-742), disponible al público en el banco de datos del NCBI. Una única región localizada en el scaffold genómico sin colocar, el scaffold1492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1) se encontró en la hebra menos de 1760466 a 1760965. La secuencia de 500 pb (SEQ ID n.º 7) se extendió a 2000 pb (SEQ ID n.º 8) basándose en un mapeo de alta cobertura de las lecturas de 10E9 sobre el scaffold1492 (no se muestran los datos).
La secuencia flanqueante en 3', identificada por el paseo cromosómico con Seegene (véanse los métodos) se utilizó para la búsqueda con BLAST de los contigs del proyecto de secuenciación de un genoma de CHO-K1 (Xu X. et al. 2011, Nature Biotechnol. 29: 735-742), disponible al público en el banco de datos del NCBI. Con el uso de estos datos y los datos de secuencia del genoma por HiSeq de Illumina obtenidos de 10E9, la línea de células hospedadoras para IES, se encontró una única región localizada en el scaffold genómico sin colocar, el scaffold1492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Se encontró que estaba localizada dentro de un gen de Fer1L4 predicho (el 4 parecido a fer-1) (ID del gen en el NCBI: 100755848) en el scaffold1492 sobre la hebra menos (número de nucleótidos del scaffold1492 desde el 1.746.191 al 1.781.992; 35.802 nucleótidos en total). La secuencia flanqueante en 5' aparece localizada entre los exones 39 y 40, mientras que la secuencia flanqueante en 3' aparece localizada entre los exones 28 y 29 (véase la figura 7).
Secuencia flanqueante en 5'
Las lecturas de Illumina del ADN genómico de 10E9 se mapearon sobre pRY17 (SEQ ID n.º 1) mediante el alineador basado en el algoritmo de Burrows-Wheeler (BWA). Mediante la inspección del mapeo, se halló que muchas lecturas sin parear (flechas negras en la figura 8) se mapearon en el extremo en 5' de una porción en 3' de la HC del cB72.3. Este análisis sugiere que al menos un fragmento de la HC del cB72.3 (con una deleción de 214 pb en el extremo 5') permanece en el «punto caliente» de 10E9. El análisis de transferencia Northern (no se muestran los datos) mostró que no había ARNm de LC ni de HC del cB72.3 en las células 10E9, lo que sugiere que la HC truncada del cB72.3 no es funcional. A continuación, las lecturas pareadas equivalentes se utilizaron para una búsqueda con BLAST de los contigs de un proyecto de secuenciación del genoma de CHO-K1 (Xu X. et al., 2011, Nature Biotechnol. 29: 735742). Todos ellos se alinearon en la misma localización (1750048-1750183) sobre un scaffold genómico sin colocar, el scaffold1492 (número de acceso, JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Esto permitió extender la secuencia flanqueante en 5' hasta un máximo de 822 pb (SEQ ID n.º 9).
Ejemplo 2:
A) Materiales y métodos
1. Transferencia Southern
De 5 a 10 µg de ADN genómico, aislado de los pases 2 y 4 de cada clon y purificado con el kit para sangre y cultivos celulares DNA Maxi de QIAGEN (Qiagen), se digirieron con una o varias endonucleasas de restricción durante 15 h a 37°C. El ADN digerido se extrajo dos veces con un volumen igual de una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, pH 8,0 (1:1 v/v) seguido de cloroformo solo, y se precipitó con etanol antes de la electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v) migrada en el tampón TBE a 0,5× (TBE a 50×: Lonza) o bien TAE a 1× (Tris a 40 mM, pH 7,7, EDTA a 2,5 mM). El gel se transfirió a una membrana de Hybond-N (Amersham) mediante el uso de un multiplicador de vacío esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Appligene, Pharmacia). Las membranas de Hybond-N se fijaron al UV, se prehibridaron en tampón de hibridación que contenía la solución de Denhardt a 5× preparada a partir de una solución madre a 50× (Sigma), SSC a 6× (SSC a 1×: cloruro de sodio a 0,15 M, citrato de sodio a 15 mM) y SDS al 10% (p/v), o se prehibridaron solo en tampón Rapid-hyb (GE Healthcare).
La sonda de TK se generó por PCR con la siguiente pareja de cebadores:
El vector pRY37 se utilizó como molde para la PCR generadora de la sonda, y las condiciones del ciclado fueron: 15 ng de molde/50 µl de reacción; ADN polimerasa Taq (Roche); 94°C, 2 min, 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 55°C durante 1 min y 72°C durante 30 s, extensión final a 72°C durante 7 min. Se marcaron 25 ng del producto de la PCR con [γ-32P] dCTP (111 TBq/mmol, Perkin Elmer) con el uso del kit Megaprime y se purificaron en una columna de traslado de mella (Amersham). Se realizaron las hibridaciones en el mismo tampón de prehibridación durante 2 a 20 h a 65°C. Después de la hibridación, se lavaron las membranas con un rigor final de SSC a 0,1×, SDS al 0,1% (p/v) a 65°C. Se expusieron las transferencias a una pantalla Phosphor de almacenamiento (Bio-Rad); las pantallas expuestas se convirtieron en imágenes con un sistema personal Molecular Imager (PMI) de Bio-Rad.
2.
Mapeo y alineamiento
Las lecturas de extremos pareados en el formato FASTQ son la entrada para mapear sobre genomas de referencia. Las secuencias del vector y el ensamblaje de CHOK1SV se indexan como referencias sobre las que mapear. Las lecturas de extremos pareados se alinean con las referencias con Bowtie2 (Langmead B y Salzberg S L, 2012, Nature Methods, 9 (4), 357-9) con los parámetros por defecto (-D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00) para el alineamiento local muy rápido. La cobertura se normaliza como la <cobertura bruta>× 500M/<número de lecturas> para hacer comparables las diferentes muestras.
3.
Identificación de los sitios de integración
Las lecturas pareadas 2 × 100 de la cepa hospedadora para IES 10E9 se secuenciaron con el Hi-Seq 2000 de Illumina a una cobertura media de 40×. Las lecturas de secuencia se mapearon sobre el vector pRY17 que es el primer vector integrado en el genoma de CHOK1SV. Las lecturas que cubren los sitios de integración se denominan lecturas quiméricas porque contienen la secuencia que mapea tanto el genoma de CHOK1SV como la secuencia del vector integrado. Ya que el mapeo se realiza por alineamiento local, las lecturas quiméricas tienen características de concordancia parcial con las secuencias del vector con colas protuberantes que podían mapearse sobre la secuencia genómica. Además de las lecturas quiméricas, hay otras lecturas en las que un extremo de una lectura pareada se mapea totalmente sobre la secuencia del vector y el otro extremo se mapea en la secuencia genómica. Estas lecturas pareadas se denominan lecturas pareadas discordantes. Las secuencias de las colas protuberantes y las lecturas sin mapear de las lecturas pareadas discordantes se recogen y utilizan para buscarlas en al ensamblaje del genoma de CHOK1SV con el uso de BLAST para identificar la secuencia flanqueante de los sitios de integración sobre la base de la similitud de las secuencias.
4.
Zona de integración
La estructura de la zona de integración (secuencias exógenas introducidas en el punto caliente que contiene los sitios de recombinación para la integración de los casetes de expresión con los genes de interés por ICMR) se basó en los datos del análisis de transferencia Southern y los datos del análisis de resecuenciación de todo el genoma (WGRS, por su nombre en inglés) de la línea celular 10E9 (figura 9). Las lecturas procedentes de 10E9 se mapearon sobre la secuencia del vector con el mismo algoritmo que se utilizó para mapear los sitios de integración. Las lecturas quiméricas también se observan en los sitios de duplicación, deleción o inserción. Las correcciones de la posible secuencia de la zona de integración se hicieron sobre la base del estudio detallado de los sitios donde surgen las lecturas quiméricas.
5.
Cuantificación del análisis de RNA-seq
La plantilla utilizada para mapear las lecturas se construyó con un modelo de «una copia» de la zona de integración procedente de la resecuenciación de todo el genoma (WGRS, véase más arriba). Las lecturas de secuenciación de RNA-seq se mapearon sobre la plantilla con BWA utilizando los parámetros por defecto. El número de lecturas sobre LC y HC se normalizó a la medida RPKM, lecturas por kilobase de transcriptoma por millones de lecturas mapeadas, mediante la fórmula siguiente:
Número de lecturas solapantes por los exonesRPKM  número total de lecturas mapeadas longitud total de todos los exones
x
10 10
El número de lecturas solapantes con los exones se obtiene para cada intervalo con el programa informático bedtools (Quinlan A R y Hall I M, 2010, Bioinformatics. 26, 6, págs. 841-842) como el comando siguiente:
bedtools coverage -abam <fichero en formato bam> -b <intervalos en formato bed>.
B) Resultados
Estructura de la zona de integración en la célula hospedadora para IES 10E9
Un modelo de la estructura de la zona de integración dentro del punto caliente de Fer1L4 se infirió de los acontecimientos de ICMR esperados que se producen durante la creación de la línea celular 10E9 a partir de la 11A7 con el uso del vector orientador vacío pRY37 (figura 4). Este modelo se denomina el modelo de «copia única» y era coherente con los datos de WGRS de la línea celular 10E9 (figura 9A). Sin embargo, los datos de transferencia Southern sugirieron que el modelo realmente debe contener dos copias (figura 9B). Este modelo de «dos copias» se refinó sobre la base de los datos y se utilizó para ayudar a interpretar las líneas celulares productoras de Acm obtenidas por ICMR en el hospedador 10E9. El modelo de «dos copias» nos permite explicar por qué se pueden incorporar tanto una como dos copias de las unidades de transcripción del anticuerpo en la zona de integración mediante ICMR con el vector orientador pRY21.
Secuencias flanqueantes en las líneas celulares obtenidas por ICMR
Se crearon por ICMR (con el uso del vector orientador pRY21) cuatro líneas celulares recombinantes procedentes de 10E9 que expresan un anticuerpo monoclonal antimiostatina (Myo), y se determinaron las secuencias flanqueantes en 5' y 3' en cada una, con la utilización de los métodos descritos previamente. Durante el proceso de ICMR, se produce una reorganización genómica repetible que genera una nueva secuencia flanqueante en 3' en las líneas celulares derivadas (figura 10). La secuencia flanqueante en 5' en las líneas celulares derivadas por ICMR es la misma que la de 10E9, con el sitio de integración en el nucleótido 1750049 (sobre el scaffold sin colocar de CHO-K1 denominado Scaffold1492, con número de acceso JH000254.1, idéntico a NW_003613833.1). Sin embargo, las secuencias flanqueantes en 3' son ahora diferentes: mientras que el sitio de integración en 3' en la línea celular hospedadora para IES 10E9 está en el nucleótido 1760965, en todas las líneas celulares derivadas por ICMR se encuentra ahora en el nucleótido 1435427 (en el scaffold arriba mencionado, figura 10).
Estimación del número de copias del casete integrado en las líneas celulares generadas por ICMR
Las lecturas de secuenciación de cada uno de sus genomas se mapearon sobre un modelo en el que había una copia integrada en el punto caliente. El número de copias de Myo se dedujo del promedio de la cobertura sobre la región de LC y HC. El promedio de la cobertura para estas cuatro líneas celulares fue 41, 34, 18, 27 sobre región LC y 32, 27, 14, 19 sobre la región HC, respectivamente. Los datos de la cobertura indican que en los grandes productores debe haber al menos una copia más de HC y LC (tabla 7). Los datos de la cobertura se muestran gráficamente en la figura 11.
Tabla 7: Cobertura de las lecturas de secuencia y tasa de producción específica (qP) de las líneas celulares por ICMR productoras de Myo. El número de copias se indica entre paréntesis junto al valor de la cobertura.
Línea celular
qP pg/(célula.día) Cobertura
LC
HC
1
20 41 (2) 32 (2)
2
19 34 (2) 27 (2)
3
10,2 18 (1) 14 (1)
4
10 27 (1) 19 (1)
Basándose en esta observación, se generó un nuevo modelo de locus tras el ICMR en el que se incluyó una copia adicional de Myo. Esto se consiguió mediante la inserción de otra copia del fragmento que abarca desde el comienzo del primer sitio wFRT hasta el comienzo del segundo sitio wFRT (ambos señalados por asteriscos en la figura 11) justo antes del comienzo del segundo wFRT. Mediante el uso de este modelo de «dos copias», pudimos explicar completamente del número de lecturas observadas en las líneas celulares con qP elevado cuando se remapean sobre él.
Se obtuvieron más pruebas para un modelo de «dos copias» en las líneas celulares productoras de Myo con qP alto a partir de los datos de RNA-Seq de cada línea celular. Las lecturas de secuenciación de RNA-Seq del ARN procedente de cada línea celular con Myo se mapearon sobre el modelo original de «una copia» (figura 12) mediante el uso de BWA (Li H y Durbin R. 2009., Bioinformatics, 25: 1754-60) ejecutado con los parámetros por defecto. El número de copias de Myo se dedujo al calcular los valores de RPKM (Mortazavi et al., (2008), Nature Methods 5, 621-628) para las regiones de LC y HC. Los valores de RPKM son 43.135, 40.059, 23.204, 29.334 en la región de LC y 38.572, 32.384, 17.878, 20.751 en la región de HC, respectivamente. Estos datos también confirman el modelo de «dos copias» propuesto para los grandes productores y se obtuvieron de la secuenciación de todo el genoma.
Listado de Secuencias
<110> Lonza Biologies plc Pfizer Inc.
<120> Integración específica de sitio
<130> 204381 WO
<160> 11
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 12566
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> vector
<400> 1
<210> 2
<211> 5112
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> vector
<400> 2
<210> 3
<211> 9097
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> vector
<400> 3
5
<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> cebador
<400> 4
tcagtgaggc acctatctca g
21
10
<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 5
cgttcatcca tagttgcctg act 23 5 <210> 6
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> cebador
<400> 6 gggagggctt accatctggc c 21
<210> 7
<211> 500 15 <212> ADN
<213> Ovario de hámster chino
<400> 7
<210> 8 20 <211> 2000
<212> ADN
<213> Ovario de hámster chino
<400> 8
<210> 9
<211> 822
<212> ADN
<213> Ovario de hámster chino
<400> 9
5
<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> cebador
<400> 10
agatcaccat gggcatgcct tac
23
10
<210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
15
<220> <223> cebador
<400> 11
aacacgttgt acaggtcgcc gtt
23

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una célula hospedadora para integración específica de sitio (IES) que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, en donde una secuencia nucleotídica exógena está integrada en dicho gen de Fer1L4 y en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos dos sitios diana de recombinación.
  2. 2.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende una secuencia génica codificante de interés.
  3. 3.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los al menos dos sitios diana de recombinación flanquean la secuencia génica codificante de interés.
  4. 4.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde la secuencia génica codificante de interés comprende uno o varios de un gen que codifica un marcador de selección, una proteína detectable, un anticuerpo, un antígeno peptídico, una enzima, una hormona, un factor de crecimiento, un receptor, una proteína de fusión u otra proteína biológicamente activa.
  5. 5.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sitio diana de recombinación es un sitio FRT o un sitio lox.
  6. 6.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el marcador de selección es un marcador de selección basado en la GS, un marcador de selección para la higromicina, un marcador de selección para la puromicina o un marcador de selección basado en la timidina cinasa.
  7. 7.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula hospedadora es una célula de ratón, una célula de humano o una célula hospedadora CHO, una célula hospedadora CHOK1 o una célula hospedadora CHOK1SV.
  8. 8.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica del gen de Fer1L4 que flanquea la secuencia nucleotídica exógena integrada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%.
  9. 9.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia nucleotídica exógena remplaza una porción del gen de Fer1L4.
  10. 10.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula hospedadora comprende un sitio FRT que es un sitio FRT de tipo silvestre o un sitio FRT mutante.
  11. 11.
    La célula hospedadora para IES de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los sitios diana de recombinación comprenden al menos un sitio FRT de tipo silvestre y al menos un sitio FRT mutante.
  12. 12.
    Un método para producir una célula hospedadora para IES que comprende las etapas de
    a) dar a conocer una célula que comprende un gen de Fer1L4 endógeno, en donde una secuencia nucleotídica exógena está integrada en dicho gen de Fer1L4, y en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos dos sitios diana de recombinación que flanquean al menos una primera secuencia génica codificante de interés; posteriormente
    b) transfectar las células dadas a conocer en la etapa a) con un vector que comprende un primer casete intercambiable, en donde el casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes, que flanquean al menos una segunda secuencia génica codificante de interés, a saber, un gen marcador de selección, posteriormente
    c) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio y, posteriormente
    d) seleccionar células transfectadas que expresan la segunda secuencia génica codificante de interés, preferiblemente el gen marcador de selección, para obtener la célula hospedadora para IES que comprende el primer casete intercambiable integrado de forma estable en su genoma.
  13. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que además comprende i) transfectar la célula hospedadora para IES con un vector que comprende al menos un segundo casete intercambiable, en donde dicho casete comprende al menos dos sitios diana de recombinación concordantes que flanquean al menos una tercera secuencia génica codificante de interés y al menos un marcador de selección, ii) efectuar un intercambio de casete mediado por recombinación específica de sitio para obtener una célula hospedadora para IES que comprende la tercera secuencia génica codificante de interés, iii) permitir que la célula hospedadora para IES obtenida en la etapa ii) exprese la tercera secuencia génica codificante de interés y iv) recuperar el producto de la tercera secuencia génica codificante de interés.
  14. 14.
    Uso de una molécula polinucleotídica aislada que comprende al menos una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se presentan en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40% para producir líneas celulares que muestran una estimulación de la expresión recombinante.
  15. 15.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el polinucleótido está contenido en un vector.
  16. 16.
    Una célula hospedadora, en donde la célula hospedadora comprende una molécula polinucleotídica que comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se presentan en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%, o un vector que contiene dicha molécula polinucleotídica y una secuencia génica codificante exógena de interés dentro de, o adyacente a, la molécula polinucleotídica o el vector que contiene dicho polinucleótido.
  17. 17.
    Un método para producir una célula o línea celular, en particular una célula o línea celular de gran producción con una elevada estabilidad de producción, en donde una secuencia de nucleótidos de Fer1L4 está integrada en un vector que comprende al menos una secuencia génica codificante de interés, en donde el vector se transfecta posteriormente de forma estable en una célula o línea celular, y en donde se seleccionan y obtienen posteriormente las células o líneas celulares transfectadas de forma estable.
  18. 18.
    El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la secuencia de nucleótidos de Fer1L4 es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que se presentan en las SEQ ID n.os 7, 8, 9 y las secuencias homólogas de las mismas con una homología de al menos el 40%.
  19. 19.
    Un método para producir un producto de una secuencia génica codificante de interés que comprende el cultivo de una célula o línea celular hospedadora producida de acuerdo con el método de las reivindicaciones 12 o 17 en un medio idóneo, y la recuperación del producto a partir de ellas.
  20. 20.
    Un método para producir una célula hospedadora para IES, en donde el método comprende la introducción de una secuencia nucleotídica exógena en un gen de Fer1L4 endógeno en una célula, en donde la secuencia nucleotídica exógena comprende al menos una secuencia génica codificante de interés y/o al menos dos sitios diana de recombinación.
  21. 21.
    El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la secuencia nucleotídica exógena se introduce por recombinación homóloga entre el gen de Fer1L4 y un polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende
    a) una primera secuencia de nucleótidos homóloga a una primera porción del gen de Fer1L4,
    b) la secuencia nucleotídica exógena, y
    c) una segunda secuencia de nucleótidos homóloga a una segunda porción del gen de Fer1L4.
  22. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la introducción de la secuencia nucleotídica exógena está facilitada por el uso de un vector vírico (p. ej., un vector dependovírico que interviene en la recombinación homóloga) o una nucleasa exógena (p. ej., una nucleasa con dedos de cinc, una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, o una meganucleasa manipulada genéticamente).
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