CN111040028B - 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用 - Google Patents

能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111040028B
CN111040028B CN201911369828.3A CN201911369828A CN111040028B CN 111040028 B CN111040028 B CN 111040028B CN 201911369828 A CN201911369828 A CN 201911369828A CN 111040028 B CN111040028 B CN 111040028B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bcl2
codon
gene
mutated
pmigr1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911369828.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111040028A (zh
Inventor
王彦刈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Dianzi University
Original Assignee
Hangzhou Dianzi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Dianzi University filed Critical Hangzhou Dianzi University
Priority to CN201911369828.3A priority Critical patent/CN111040028B/zh
Publication of CN111040028A publication Critical patent/CN111040028A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111040028B publication Critical patent/CN111040028B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用。本发明Bcl2突变体为在小鼠Bcl2基因的第190位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，或人Bcl2基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA。本发明通过突变第568位(人Bcl2基因为577位)碱基，使G变为T，把该经过突变的磷酸化Bcl2与目的重组蛋白基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以促进大于4.3kb的目的重组蛋白基因的表达。

Description

能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体及应用。
背景技术
Bcl2基因是一个能抗细胞凋亡的基因，目前被用于基因治疗的体内筛选和生物制药中增加重组蛋白表达等。经研究发现，当把小鼠Bcl2的第69位的苏氨酸(T)、第70和84位(人Bcl2为第87位)的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)(这三个位点氨基酸突变为谷氨酸的小鼠Bcl2为Bcl2T69E/S70E/S84E，人的Bcl2为Bcl2T69E/S70E/S87E)，模拟在这三个位点磷酸化，就可显著提高Bcl2的抗凋亡能力，因此磷酸化的Bcl2蛋白也被应用于增加重组蛋白的表达量。但是对于目的重组蛋白基因比较大的(大于4.3kb，比如凝血因子VIII基因)基因，因为mRNA不稳定的原因，表达量比较低，影响了工业化生产这种大小的重组蛋白质。对于这种蛋白质，即使把其基因与模拟磷酸化的Bcl2构建在同一表达质粒进行共表达也对促进其表达效果不明显。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体。
本发明提供的技术方案：
本发明Bcl2突变体为在小鼠Bcl2基因的第190位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，或人Bcl2基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA。
即在小鼠Bcl2基因的第568位碱基(人Bcl2相应的为577位)，野生型的为G，只要把其突变为T，从而使得190位密码子(人相应为193位密码子)由GGA变为终止密码子TGA，也就是把Bcl2从189位(人为192位)后切除其尾巴，即可使Bcl2获得促进大于4.3kb基因表达的能力。当该Bcl2突变体与大于4.3kb目的基因构建于同一表达质粒共表达时，就可大大促进目的基因的表达。
作为优选，本发明Bcl2突变体还包括小鼠Bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(T)突变为谷氨酸残基(E)、第70位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)、第84位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)；或人Bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(T)突变为谷氨酸残基(E)、第70位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)、第87位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)。
本发明的另一个目的是将上述新型Bcl2突变体和目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。上述目的基因大于4.3kb。
作为优选，新型Bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site,IRES)下游，把目的基因连接在IRES上游。
所述的大于4.3kb目的基因包括B区域删除的凝血因子八(BDD FVIII)、全长凝血因子八(FVIII)。
本发明的有益效果是：
本发明通过突变第568位(人Bcl2基因为577位)碱基，使G变为T，把该经过突变的磷酸化Bcl2与目的重组蛋白基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以促进大于4.3kb的目的重组蛋白基因的表达。
附图说明
图1A为构建有GFP-BDD FVIII或者BDD FVIII或者FVIII基因和小鼠Bcl2或人Bcl2(标记为hBcl2)突变体基因的逆转录病毒载体质粒示意图。
图1B为仅构建有BDD FVIII或者FVIII基因的逆转录病毒载体质粒示意图。
图2在HEK293细胞转染pMigR1-△Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII和pMigR1-Bcl2WT-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的GFP荧光显微图。其中图2A、图2B分别为转染pMigR1-△Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图；图2C、图2D分别为转染pMigR1-Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图；图2E、图2F分别为转染pMigR1-Bcl2WT-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图。从图中可以看出，转染pMigR1-△Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII的细胞中GFP阳性细胞最多并且荧光强度最强，而转染pMigR1-Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII和pMigR1-Bcl2WT-GFP-BDD FVIII的细胞中GFP阳性细胞和荧光强度显著减低了。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的分析。
实施例1：点突变Bcl2
小鼠Bcl2 cDNA和人Bcl2 cDNA分别克隆于pMigR1质粒的Nco I和Sal I之间，即在内部核糖体进入位点(IRES)下游，见图1。利用点突变试剂盒(Transformer,CLONTECH)，把第568位(人Bcl2为第577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA。通过对cDNA测序进行验证突变点，验证正确无误后，即得到所需要的去掉尾部47个氨基酸残基的突变Bcl2(△Bcl2)的基因序列，包含有该△Bcl2质粒为pMigR1-△Bcl2(包含人△Bcl2的质粒为pMigR1-△hBcl2)。再通过同样的方法把对应于第69位的苏氨酸残基T密码子和第70位、84位(人Bcl2对应的为第87位)的丝氨酸残基S密码子突变成谷氨酸残基E密码子，每个突变点通过对cDNA测序进行验证，验证正确无误后，即得到所需要的T69E/S70E/S84E(人Bcl2为T69E/S70E/S87E)并去掉尾部47个氨基酸残基的模拟磷酸化的突变小鼠Bcl2(△Bcl2EEE)和突变人Bcl2(△hBcl2EEE)的基因序列，包含有该△Bcl2EEE和△hBcl2EEE质粒分别为pMigR1-△Bcl2EEE和pMigR1-△hBcl2EEE。以没有去尾部氨基酸残基的野生型小鼠Bcl2(Bcl2WT)和人Bcl2(hBcl2WT)和模拟磷酸化的突变小鼠Bcl2(Bcl2EEE)和人Bcl2(hBcl2EEE)构建的pMigR1-Bcl2WT、pMigR1-hBcl2WT和pMigR1-Bcl2EEE、pMigR1-hBcl2EEE作为对照质粒。
实施例2：构建含有上述点突变小鼠Bcl2和大于4.3kb基因的双顺反子逆转录病毒表达载体
取pMigR1质粒进行BglII/SalI酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯pMigR1酶切片段；合成5’GATCTCTCGAGGCGGCCGCCAATTGG3’和5’TCGACCAATTGGCGGCCGCCTCGAGA3’，退火后与pMigR1酶切片段进行连接，以导入多克隆酶切位点BglII-XhoI-NotI-MunI-SalI，连接好后转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即得pMigR1-△GFP质粒。
以pMigR1质粒为模板，PCR扩增GFP基因，在5’端引物中引入BglII酶切位点和Kozak序列GCCACC，在3’端引物中保留SalI酶切位点。PCR后提纯PCR产物，然后用BglII/SalI进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯GFP片段。另以HSQ/AvrII/RENEO质粒为模板，PCR扩增B区域删除的凝血因子八(BDD FVIII)基因，5’端引物保留XhoI酶切位点，3’端引物引入MunI酶切位点。PCR后提纯PCR产物，然后用XhoI/MunI进行酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯BDD FVIII片段。全长人凝血因子八(FVIII)通过合成获得，两端引入XhoI/MunI酶切位点，用XhoI/MunI酶切，酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯FVIII片段。pMigR1-△Bcl2EEE、pMigR1-Bcl2EEE和pMigR1-Bcl2WT用BglII/EcoRI和XhoI/EcoRI切开多克隆酶切位点，pMigR1-△hBcl2EEE、pMigR1-hBcl2EEE和pMigR1-hBcl2WT用XhoI/EcoRI切开多克隆酶切位点，pMigR1-△GFP用XhoI/MunI切开多克隆酶切位点，琼脂糖胶电泳进行分离纯化。把上述分离纯化好的GFP基因片段、BDD FVIII基因片段分别与BglII/EcoRI切开的三个质粒片段放在一起进行连接反应；另把BDD FVIII或FVIII基因片段分别与XhoI/EcoRI切开的六个质粒片段以及XhoI/MunI切开的pMigR1-△GFP质粒片段放在一起进行连接反应。连接好后转化大肠杆菌JM109，在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养，对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养，然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确，验证后即得pMigR1-△Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII、pMigR1-△Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-△Bcl2EEE-FVIII、pMigR1-△hBcl2EEE-FVIII逆转录病毒表达载体质粒以及对照pMigR1-Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-FVIII和pMigR1-Bcl2WT-GFP-BDDFVIII、pMigR1-Bcl2WT-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2WT-FVIII、pMigR1-hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2WT-FVIII逆转录病毒表达载体质粒(见图1A)和pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒(见图1B)，其中目的基因大小均超过4.3kb。
实施例3：转染HEK293细胞并表达大于5kb的融合基因GFP
取二块六孔细胞培养板，在其中九孔中进行人胚肾来源的HEK293细胞培养，具体培养基为DMEM添加15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70-80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的DMEM培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的DMEM培养基，放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pMigR1-△Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-GFP-BDD FVIII和pMigR1-Bcl2WT-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI-MEM培养基中，混匀；另取3个1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的OPTI-MEM培养基，然后在每管OPTI-MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI-MEM溶液与溶有脂质体的OPTI-MEM溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种DNA质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的DNA脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养24小时，再换新鲜完全培养基2.5毫升/孔，培养24小时后上荧光显微镜观察GFP蛋白表达量。GFP表达量见附图2，图中显示，经过了第568位(人Bcl2为第577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA后，△Bcl2EEE与连接了BDD FVIII基因的GFP在一个mRNA链共表达后，能极大促进该GFP的表达。
实施例4转染HEK293细胞并表达BDD FVIII和FVIII基因
取四块六孔细胞培养板，进行人胚肾来源的HEK293细胞培养，具体培养基为DMEM添加15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中，在37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中培养，等到细胞在培养皿中70-80％汇合(confluent)后，用仅含有5％胎牛血清的DMEM培养基洗两遍，然后每孔加入2毫升仅含5％胎牛血清的DMEM培养基，放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pMigR1-△Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-BDD FVIII和pMigR1-Bcl2WT-BDD FVIII、pMigR1-△hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2WT-FVIII、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克，分别溶解于装于3个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI-MEM培养基中，混匀；另取3个1.5毫升的eppendof管，每管加750微升的OPTI-MEM培养基，然后在每管OPTI-MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升，混匀。室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI-MEM溶液与溶有脂质体的OPTI-MEM溶液混合在一起，混匀，室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞，每三孔重复转染一种DNA质粒，即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的DNA脂质体混合液500微升，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中进行培养。六小时后，每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升，继续培养48小时，取上清液，用Coatest FVIII试剂盒(Chromogenix)根据试剂盒操作说明书来测试不同细胞上清液中的FVIII含量。结果如下：转染pMigR1-△Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2WT-BDD FVIII、pMigR1-△hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2WT-FVIII、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-△GFP-FVIII的细胞上清液中的FVIII含量分别为85.31±28.65mU/ml、37.57±8.59mU/ml、29.98±6.32mU/ml、13.93±3.22mU/ml、5.48±1.26mU/ml、3.80±0.84mU/ml、2.11±0.57mU/ml、0.84±0.28mU/ml。从结果可知，经过了第568位(人Bcl2为第577位)核苷酸G突变成T，使对应于第190位(人Bcl2相应为193位密码子)的甘氨酸残基密码子GGA换成终止密码子TGA后，与目的基因BDD FVIII或FVIII在一个mRNA链共表达后，不管是小鼠△Bcl2EEE还是人△hBcl2EEE均能显著促进该目的基因的表达(pMigR1-△Bcl2EEE-BDDFVIII与pMigR1-Bcl2EEE-BDD FVIII、pMigR1-Bcl2WT-BDD FVIII和pMigR1-△GFP-BDD FVIII相比，p<0.05；pMigR1-△hBcl2EEE-FVIII与pMigR1-hBcl2EEE-FVIII、pMigR1-hBcl2WT-FVIII和pMigR1-△GFP-FVIII相比，p<0.01)。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
序列表
1、第568位碱基G突变为T的小鼠Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.1：
ATGGCGCAAGCCGGGAGAACAGGGTATGATAACCGGGAGATCGTGATGAAGTACATACATTATAAGCTGTCACAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGATGCGGACGCGGCGCCCCTGGGGGCTGCCCCCACCCCTGGCATCTTCTCCTTCCAGCCTGAGAGCAACCCAATGCCCGCTGTGCACCGGGACATGGCTGCCAGGACGTCTCCTCTCAGGCCCCTCGTTGCCACCGCTGGGCCTGCGCTCAGCCCTGTGCCACCTGtGGTCCATCTGACCCTCCGCCGGGCTGGGGATGACTTCTCTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCGCAGAGATGTCCAGTCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGAGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAACTCTTCAGGGATGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACAGGgAGATGTCACCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCATCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTATATGGCCCCAGCATGCGACCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACCCTGCTCAGCCTGGCCCTGGTCGGGGCCTGCATCACTCTGGGTGCATACCTGGGCCACAAGTGA
2、第568位碱基G突变为T和第69、70、84位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的小鼠Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.2：
ATGGCGCAAGCCGGGAGAACAGGGTATGATAACCGGGAGATCGTGATGAAGTACATACATTATAAGCTGTCACAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGATGCGGACGCGGCGCCCCTGGGGGCTGCCCCCACCCCTGGCATCTTCTCCTTCCAGCCTGAGAGCAACCCAATGCCCGCTGTGCACCGGGACATGGCTGCCAGGGAGGAACCTCTCAGGCCCCTCGTTGCCACCGCTGGGCCTGCGCTCGAACCTGTGCCACCTGTGGTCCATCTGACCCTCCGCCGGGCTGGGGATGACTTCTCTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCGCAGAGATGTCCAGTCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGAGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAACTCTTCAGGGATGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTCACCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCATCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTATATGGCCCCAGCATGCGACCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACCCTGCTCAGCCTGGCCCTGGTCGGGGCCTGCATCACTCTGGGTGCATACCTGGGCCACAAGTGA
3、第577位碱基G突变为T的人Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.3：
ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGACCTCGCCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCAGCCCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
4、第577位碱基G突变为T和第69、70、87位氨基酸残基突变为谷氨酸残基的人Bcl2突变体序列，如SIQ ID NO.4：
ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGGAGGAACCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCGAACCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGATGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
序列表
<110> 杭州电子科技大学
<120> 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用
<130> 1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
atggcgcaag ccgggagaac agggtatgat aaccgggaga tcgtgatgaa gtacatacat 60
tataagctgt cacagagggg ctacgagtgg gatgctggag atgcggacgc ggcgcccctg 120
ggggctgccc ccacccctgg catcttctcc ttccagcctg agagcaaccc aatgcccgct 180
gtgcaccggg acatggctgc caggacgtct cctctcaggc ccctcgttgc caccgctggg 240
cctgcgctca gccctgtgcc acctgtggtc catctgaccc tccgccgggc tggggatgac 300
ttctctcgtc gctaccgtcg tgacttcgca gagatgtcca gtcagctgca cctgacgccc 360
ttcaccgcga ggggacgctt tgccacggtg gtggaggaac tcttcaggga tggggtgaac 420
tgggggagga ttgtggcctt ctttgagttc ggtggggtca tgtgtgtgga gagcgtcaac 480
agggagatgt cacccctggt ggacaacatc gccctgtgga tgactgagta cctgaaccgg 540
catctgcaca cctggatcca ggataactga ggctgggatg cctttgtgga actatatggc 600
cccagcatgc gacctctgtt tgatttctcc tggctgtctc tgaagaccct gctcagcctg 660
gccctggtcg gggcctgcat cactctgggt gcatacctgg gccacaagtg a 711
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
atggcgcaag ccgggagaac agggtatgat aaccgggaga tcgtgatgaa gtacatacat 60
tataagctgt cacagagggg ctacgagtgg gatgctggag atgcggacgc ggcgcccctg 120
ggggctgccc ccacccctgg catcttctcc ttccagcctg agagcaaccc aatgcccgct 180
gtgcaccggg acatggctgc cagggaggaa cctctcaggc ccctcgttgc caccgctggg 240
cctgcgctcg aacctgtgcc acctgtggtc catctgaccc tccgccgggc tggggatgac 300
ttctctcgtc gctaccgtcg tgacttcgca gagatgtcca gtcagctgca cctgacgccc 360
ttcaccgcga ggggacgctt tgccacggtg gtggaggaac tcttcaggga tggggtgaac 420
tgggggagga ttgtggcctt ctttgagttc ggtggggtca tgtgtgtgga gagcgtcaac 480
agggagatgt cacccctggt ggacaacatc gccctgtgga tgactgagta cctgaaccgg 540
catctgcaca cctggatcca ggataactga ggctgggatg cctttgtgga actatatggc 600
cccagcatgc gacctctgtt tgatttctcc tggctgtctc tgaagaccct gctcagcctg 660
gccctggtcg gggcctgcat cactctgggt gcatacctgg gccacaagtg a 711
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
atggcgcacg ctgggagaac agggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccggg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataactgag gctgggatgc ctttgtggaa 600
ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctggg ccacaagtga 720
<210> 4
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
atggcgcacg ctgggagaac agggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccggg acccggtcgc cagggaggaa ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcga accggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataactgag gctgggatgc ctttgtggaa 600
ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctggg ccacaagtga 720

Claims (6)

1.能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体，其特征在于在小鼠Bcl2基因的第190位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，第69位的苏氨酸残基（T）密码子ACC突变为谷氨酸残基（E）密码子GAG，第70位的丝氨酸残基（S）密码子TCG突变为谷氨酸残基（E）密码子GAA，第84位的丝氨酸残基（S）密码子AGC突变为谷氨酸残基（E）密码子GAA。
2.能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体，其特征在于人Bcl2基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，第69位的苏氨酸残基（T）密码子ACC突变为谷氨酸残基（E）密码子GAG，第70位的丝氨酸残基（S）密码子TCG突变为谷氨酸残基（E）密码子GAA，第87位的丝氨酸残基（S）密码子AGC突变为谷氨酸残基（E）密码子GAA。
3.权利要求1-2任一所述的Bcl2突变体和目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于目的基因大于4.3kb。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于Bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点IRES下游，目的基因连接在IRES上游。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于大于4.3kb目的基因包括B区域删除的凝血因子八BDD FVIII、全长凝血因子八FVIII。
CN201911369828.3A 2019-12-26 2019-12-26 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用 Active CN111040028B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911369828.3A CN111040028B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911369828.3A CN111040028B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111040028A CN111040028A (zh) 2020-04-21
CN111040028B true CN111040028B (zh) 2021-06-01

Family

ID=70238988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911369828.3A Active CN111040028B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111040028B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329777A (zh) * 2011-07-22 2012-01-25 广州医学院第二附属医院 一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型及其建立方法
CN102337297A (zh) * 2011-10-21 2012-02-01 南京医科大学 一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用
CN106480090A (zh) * 2016-10-08 2017-03-08 杭州电子科技大学 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体系统及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7537930B2 (en) * 2004-07-23 2009-05-26 Immunomedics, Inc. Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7608425B2 (en) * 2004-07-23 2009-10-27 Immunomedics, Inc. Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329777A (zh) * 2011-07-22 2012-01-25 广州医学院第二附属医院 一种抗凋亡高效表达hVEGF165细胞模型及其建立方法
CN102337297A (zh) * 2011-10-21 2012-02-01 南京医科大学 一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用
CN106480090A (zh) * 2016-10-08 2017-03-08 杭州电子科技大学 一种促进细胞移植和基因表达的转基因载体系统及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bcl-2蛋白突变体（模拟磷酸化）的纯化和核磁研究;范玉丹;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180415;全文 *
Expression and Solution NMR Study of Multi-site Phosphomimetic Mutant BCL-2 Protein;Ting Song，等;《protein and peptide letters》;20190704;第26卷(第6期);全文 *
In vivo selection with lentiviral expression of Bcl2T69A/S70A/S87A mutant in hematopoietic stem cell-transplanted mice;Yan-Yi Wang，等;《gene therapy》;20180309;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111040028A (zh) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115651927B (zh) 编辑rna的方法和组合物
JP2023156355A (ja) 細胞または生物のゲノムへのＤＮＡ配列の標的化組み込みのためのＣａｓ９レトロウイルスインテグラーゼおよびＣａｓ９レコンビナーゼ系
ES2629509T3 (es) Integración específica de sitio
AU2003298574B2 (en) Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
CN113939591A (zh) 编辑rna的方法和组合物
CN113286880A (zh) 调控基因组的方法和组合物
EP2690177B1 (en) Protein with recombinase activity for site-specific DNA-recombination
EP3089760B1 (en) Construct and sequence for enhanced gene expression
KR20180127339A (ko) 복제 트랜스포존 시스템
KR20230129230A (ko) Bcl11a의 표적화를 위한 조성물 및 방법
EP3041940B1 (en) Rna based method to obtain stably integrated retroviral vectors
JP2020527938A (ja) デザイナーｄｎａ組換え酵素を利用したゲノムを遺伝的に改変するための方法及び手段
Zhang et al. Rapid assembly of customized TALENs into multiple delivery systems
CN111040028B (zh) 能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用
CN115698301A (zh) 活性dna转座子系统及其使用方法
CN114990093A (zh) 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d
CN110551763B (zh) CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用
CN108949756B (zh) 一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体
CN113549650A (zh) 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用
CN105695509B (zh) 一种获得高纯度心肌细胞的方法
EP4353821A1 (en) Transposase mutant with enhanced efficiency of gene transfer
JP2004141025A (ja) 細胞発現用合成ｄｎａ断片及び作成方法
Moskalev et al. Genetic updating and marks of cellular lines
CN114480392A (zh) 一种用于真核基因表达的启动子及其载体和应用
JP3376412B2 (ja) 活性型リボザイムの選択方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant